Análisis de la proteína de la la clara de huevo
ANALISIS DE LA PROTEINA PROTEINA DE LA CLARA DE HUEVO FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS , PROGRAMA DE Q UÍMICA UÍMICA, UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI
.
Jackeline Montero
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Victoria Arredondo
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Aracely Angulo
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Yamileth Orozco
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Resumen
Se estudió el comportamiento de las proteínas que se encuentran presentes en la clara del huevo, cuando se sometió una solución de clara a diferentes condiciones condiciones físico-químicas entre entre ellas la temperatura, temperatura, Acetona, ácido Nítrico, Nítrico, ácido Clorhídrico se presentó la desnaturalización debido a cambios en la estructura y enlaces débiles entres los aminoácidos que conforma la proteína; Sin embargo cuando la disolución de la clara se somete a soluciones salinas y de NaOH 0,5 M se observó un aumento en la solubilidad. solubilidad. También se efectuó una solubilización reversible con el sulfato de amonio y la solubilización irreversible con el ácido tricloroacético. Además, se efectuaron la reacción xantoproteica la cual fue positiva por lo tanto confirmo la presencia de grupos fenólicos en las proteínas que constituyen la clara de Huevo. La reacción de Biuret fue positiva confirmando la presencia de proteínas solubles. Generalmente Generalmente se observó que las proteínas de la clara del huevo son muy sensibles a la desnaturalización cuando se cambian sus condiciones de pH, de temperatura y de concentración iónica en el medio.
Palabras Clave: Proteínas, Proteínas,
Desnaturalización, Reacción Xantoproteíca, Reacción de biuret
I. INTRODUCCIÓN
Las proteínas no son únicamente polipéptidos, son polipéptidos con una secuencia de aminoácidos propia. Si se altera la secuencia de aminoácidos de una proteína, pueden producirse anomalías funcionales y enfermedades. La composición de la clara y la yema de huevo de gallina tanto del punto de vista cuantitativo como cualitativo en % peso es:
Clara de Huevo: 88% Agua, 11% Proteínas y 0.2% Grasa. Yema de Huevo: 48% Agua, 17,5% Proteínas, 32.5% Grasas. Las proteínas de la clara son: Ovoalbúmina, con albúmina, Flavoproteína, Ovomucoide, Avidina, Ovomucina, Cistatina, Cistatina, Lisozima. Lisozima. La mayor parte de las proteínas presentes en la clara de Huevo son la Ovoalbúmina. 1
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Análisis de la proteína de la clara de huevo La albúmina es una proteína muy estable, de carácter ácido pI =4.8. Esta formada por una única cadena poli peptídica, de 582 aminoácidos. En cuanto a su composición de aminoácidos tiene alto contenido de aminoácidos cargados Aspártico, Glutámico, Lisina y Arginina, así como de Cisteína de las que posee 35, formando puentes disulfuro. Así mismo tiene un bajo contenido de metionina y triptófano. 2 Los 17 puentes disulfuro son la base de la estructura única de la molécula de albúmina, de su organización en nueve bucles agrupados en tres dominios I, II y III. 2
Figura 2. Desnaturalización de la proteína 3
Figura 1. Esquema de la disposición en bluqes de la albúmina y principales sitios de unión de los ligandos. 2
Determinación del grado de hidrólisis. Para el seguimiento y control de la hidrólisis de proteínas es necesario evaluar el grado de hidrólisis, DH, que se define:
La desnaturalización de una proteína es la alteración de su estructura secundaria, terciaria, o cuaternaria, dejando intacta la estructura primaria, el resultado de esto es que la proteína nativa (Como se encuentra en la célula) pierde su actividad biológica. En algunos casos el proceso de desnaturalización es reversible. La desnaturalización de las proteínas ocurre cuando se expone al calor, la luz ultravioleta, los ácidos, las bases, los disolventes orgánicos y las sales de los metales pesados. Estos agentes alteran la fuerza de dispersión, los enlaces de hidrógeno y los enlaces iónicos. En la siguiente figura 2 se ilustra el proceso de desnaturalización: Los enlaces disulfuro se rompen por la acción del agente reductor. 3
Contenido de proteína soluble es el factor más importante para fisicoquímica de la proteína ya que de aquí se dan propiedades y correlaciones con propiedades funcionales tales como emulsibilidad, formación de espuma y la gelificación. Hamid-Samimi y Swartzel (1985) menciona que el 5% de pérdida de proteína soluble puede ser el límite máximo para producir un producto funcionalmente aceptable. 4
DH = nº enlaces peptídicos hidrolizados x 100 nº total enlaces peptídicos Los diferentes métodos utilizados para medir el DH se basan fundamentalmente en: 1) la determinación de nitrógeno soluble tras precipitar la proteína con ácido tricloroacético. 2) la determinación de los grupos α-amino libres. 3) la valoración del protón liberado tras la ruptura de un enlace peptídico a determinados pHs. 5
La reacción xantoproteica es una prueba funcional para determinar la presencia de proteínas y la reacción de biuret se da cuando la proteínas reacciones con los iones sulfato de cobre por medio de los pares de electrones libres del Nitrogéno que se encuentran presente en los aminoácidos. 3
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En este trabajo los principales objetivos son determinar el efecto de la temperatura, los solventes orgánicos, la concentración salina, los pH extremos y los iones metálicos pesados sobre la estabilidad de las proteínas de la clara del huevo. Además de analizar cuando ocurre insolubilización reversible e irreversible; y también aplicar la reacción xantoproteíca y la reacción de Biuret . II. MÉTODO
1. Coagulación de una proteína:
Se colocaron 7 tubos de ensayo en una gradilla y se enumeraron. Se separó 5 ml de la clara de huevo en el tubo de ensayo 1, al resto se agregó agua, se agitó y se completó a 100 ml y se filtra. A cada tubo se numeró de 2 a 3 mL de la solución de albúmina.
Tubo No. 1: Se calentó suavemente y poco a poco en un baño de agua, controlando la temperatura mediante un termómetro colocado en el interior del tubo. Se determinó la temperatura a la cual se insolubiliza la proteína. Tubo No. 2: Se agregaron 2 ml de acetona. Se dejó en reposo y se observó lo que pasaba al cabo de algunos minutos. Tubo No. 3: Se adicionó 1 ml de HCl 9 N. Se observó lo que pasaba. Tubo No. 4: Se adicionó 2 ml de NaCl al 20 %. Se observó lo que pasaba. Tubo No. 5: Se adicionó 2 ml de HNO3 al 20%. Se observó lo que pasaba.
Análisis de la proteína de la clara de huevo 2. Precipitación de la proteína por iones metálicos pesados: En un tubo de ensayo se adicionó 3 ml de la solución de albúmina, y se adicionó 1 ml de acetato de plomo 0.005 M. Se observó lo que pasaba. Posteriormente se adicionó 1mL de Ácido Etilendiamintetracético 0,05 M. Se agitó y se observaron los cambios. 3. Insolubilización reversible:
Tubo No. 6: Se adicionó 4 ml de NaOH 5 M. Se observó lo que pasaba. Tubo No. 7: Control
e
En un tubo de ensayo se adicionaron 5 ml de la solución de albúmina, se agregaron en porciones pequeñas y agitando para que se disuelva bien, 2.36 g de Sulfato de Amonio. Se observaron los cambios. En otro tubo de ensayo, se adicionaron 5 ml de la solución de albúmina y añada 1 ml de ácido Triicloroacético al 50 %. Se observaron los cambios. Se centrifugaron las suspensiones de ambos tubos a 3000 r.p.m., durante 10 minutos. Se separó el sobrenadante de ambos tubos por decantación, se desechó y se conservó el sedimento de ambos tubos. A cada tubo se adicionó 4 mL y se agitó bien. Se observaron los resultados. 4.
Reacción xantoproteíca:
Se colocó en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de albúmina y agregó 3 ml de ácido nítrico al 20 %. Se observaron los cambios. Se calentó en un baño de agua por algunos minutos. Se observaron los cambios. Se enfrió el tubo y posteriormente se adicionaron 3 ml de Hidróxido de Amonio. Se observaron los resultados. 5.
reversible
Reacción de Biuret:
Se adicionó en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de albúmina. Se adicionó el mismo volumen de Hidróxido de Sodio 5 M, y 5 gotas de sulfato Cúprico 0.1 M. Se observaron los cambios.
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III. RESULTADOS Y ANALISIS DE
RESULTADOS Coagulación de proteínas: Tabla 1. Resultados coagulación de la proteína Tubo de ensayo Observaciones La temperatura formación suspensión blanca fue de 62 Calor °C Se forma una suspensión Acetona color blanco Se forma una suspensión HCl 9N color blanco No se forma nada visible NaCl 20% (Translúcido) Se forma una suspensión HNO3 20% color blanco No se forma nada visible NaOH 5M (Translúcido) Control: sólo Solución Translúcida con solución de ligeramente turbia clara
Figura 4: Coagulación de la proteína
En ésta práctica se trabajó con la clara de huevo, puesto que allí la proteína se encuentra con agua. Con la yema de huevo es muy difícil trabajar ya que en ella se encuentra grasa que pueden causar interferencias en las propiedades de las proteínas. Antes de iniciar con la pruebas se verificó que la clara quedará muy bien separada de la yema para evitar cualquier contaminación con otra proteínas.
Análisis de la proteína de la clara de huevo En esta sección experimental, se preparó una solución de clara y se observó el comportamiento de la proteína frente ácidos como el ácido nítrico al 20%, ácido clorhídrico y solventes orgánicos como la acetona muy similar ya que se presentó la coagulación de la proteína, es decir que al agregar el agente desnaturalizante la proteína pierde sus estructuras secundaria y terciaria y luego, como un mecanismo de defensa y para su destrucción se coagula formando una suspensión blanca. Para analizar mejor lo que ocurre al agregar los agentes desnaturalizantes se debe tener en cuenta la siguiente tabla: Tabla 2. Puntos isoeléctricos proteínas de la clara del huevo2 Proteína Punto isoeléctrico Ovoalbúmina 4,5 Conalbúmina 6,1 Ovomucoide 4,1 Lisozima 10,7 Ovomucina 4,5 – 5,0 Avidina 9,5 Cistatina 5,1
Al observar la tabla 7 y debido a que el cambio en el pH modifica el punto isoeléctrico, se comprende como al agregar un ácido a la clara del huevo la cual tiene un pH normal de 7,6 – 7,9 el pH disminuye a tal punto que la proteína precipita. Este comportamiento se le llama precipitación de la proteína por adición de cationes o aniones, dónde al adicionar a las proteínas el ácido, se disminuye el pH dejando a la proteína por debajo de su punto isoeléctrico y con carga positiva, para luego reaccionar con los aniones del ácido originando un producto insoluble que precipita.6 La acetona genera un cambio en el entorno de la proteína pero no es capaz de romper los enlaces covalentes en la cadena polipeptídica, solo rompe la uniones relativamente débiles como las fuerza de vander waals y las interacciones hidrofóbicas, por lo que se mantiene, en última instancia, la estructura primaria7 Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las proteínas globulares. Facultad de Ciencias Básicas |4
Análisis de la proteína de la clara de huevo A baja concentración, las sales incrementan la solubilidad de muchas proteínas, fenómeno que recibe el nombre de solubilización por salado. Las sales de los iones divalentes, MgCl 2 y el (NH4)2SO4, son mucho más eficaces en la solubilización de las proteínas que las sales de iones monovalentes, NaCl, NH 4Cl y KCl. La capacidad de las sales neutras para influir en la solubilidad de las proteínas está en función de su fuerza iónica, que constituye una medida, tanto de la concentración como del número de las cargas eléctricas existentes en los cationes y los aniones aportados por la sal. Este fenómeno denominado Salting in se observó cuando se agregó el NaCl a la proteína ya que se observó cómo mejoro su solubilidad al agregar la sal. Este mismo fenómeno se observó con la solución de Hidróxido de Sodio 5M por lo tanto las bases muy diluidas mejoran la solubilidad y no generan una desnaturalización irreversible.2 La desnaturalización de proteína por acción del calor es un proceso irreversible debido a que un aumento inusual de la proteína provoca mutación en la proteína y de esta forma y de esta forma una pérdida de su estabilidad y actividad. A una temperatura norma de hasta 37°C la proteína conserva su estabilidad y forma activa, sin embargo cuando esta temperatura aumenta por encima de los 40°C o 50°C, la proteína se vuelve inestable e inactiva. El calentamiento de la disolución de la proteína causa un incremento en la energía de vibración y rotación que pueden rebasar el delicado equilibrio de interacciones débiles que estabilizan la conformación plegada funcional. Las temperaturas elevadas causan la inactivación irreversible por medio de cambios covalentes. 8
Solución clara con acetato de plomo 0,005 M Solución clara + acetato de plomo + AEDT
Se forma una suspensión blanca Se precipitan sales y el sobrenadante es transparente
Figura 5. Solución de albúmina con Acetato de plomo.
Precipitación de la proteína por iones metálicos pesados:
Figura 6. Solución de albúmina con Acetato de plomo+EDTA vs Control
Tabla 3. Resultados reacción con acetato de plomo
Por otra parte, se realizó el procedimiento de mezcla la solución proteica con acetato de plomo y se observó al agregar este, la formación de la suspensión color blanco como muestra la figura 3.
Tubo de ensayo
Observaciones
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Análisis de la proteína de la clara de huevo Los Metales pesados, tales como el plomo (Pb) y el mercurio (Hg), precipitan a las proteínas y, por lo tanto las inactivan perdiendo su eficacia o función. Luego, al agregar el EDTA (ácido etilendiamino tetracético) el cual es un agente quelante, este atrapa al metal Pb y forma un quelato, que permite que la proteína vuelva a solubilizarse en el medio como muestra la figura 6 en donde se aprecia este fenómeno y se obtiene una solución translúcida nuevamente. 6 CO CH 2
O O
O
OC
CO
CH 2 N H2C
CH 2 O
N
CH 2
CH 2
CO
Figura 7. Complejo del Pb con EDTA Insolubilización reversible e irreversible: Tabla 4. Resultados insolubilización reversible e irreversible
Tubo de ensayo Solución albúmina clara + sulfato de amonio Solución albúmina clara + ácido tricloroacé tico
Figura 7. Solución de albumina + sulfato de Amonio-Solución de albumina + acido tricloroacético
Centrifugaci ón y dilución Observaciones del sedimento en agua
Se forma una suspensión color blanco
La suspensión blanca se solubiliza y desaparece
Se forma una suspensión color blanco
La suspensión blanca no desaparece
Figura 8. Control-Solución de albumina + ácido tricloroacético - Solución de albumina + sulfato de Amonio-
La solubilización reversible ocurre cuando se le agrega a la proteína sulfato de amonio que es una sal y como al agregar esta ocurre “precipitación salina” como se mencionó
anteriormente la proteína precipita.
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Luego por centrifugación a 3000 r.p.m durante 10 minutos se favorece aún más la precipitación y la desnaturalización. Es importante destacar que en esta parte del proceso la única proteína que precipitó fue la ovoalbúmina ya que se requiere de una solución saturada de la sal sulfato para lograr esto, mientras que las otras proteínas precipitan cuando la concentración de la sal es 50%(m/V). 4 Al agregar el ácido tricloroacético ocurre un descenso del pH por debajo el punto isoeléctrico y hace que estas proteínas precipiten formando la suspensión blanca. Posteriormente, ambos sólidos se diluyen con agua y se observa que el sólido tratado con la sal es soluble mientras que el tratado con ácido no. Se cree que esto ocurre debido a que es posible renaturalizar una proteína quitando el agente desnaturalizante, en el caso de la sal al agregar agua nuevamente al precipitado se disminuye nuevamente la fuerza iónica y las proteínas comienzan a tomar sus formas estructurales superiores. Mientras que con el residuo ácido no ocurre lo mismo porque ya se ha formado un nuevo producto insoluble entre el anión del ácido y las proteínas, y por lo tanto el precipitado final permanece.
Figura 9. Control- Solución de albumina + sulfato de Amonio+ Agua -Solución de albumina + ácido tricloroacético + Agua
Análisis de la proteína de la clara de huevo Reacción Xantoproteica
Figura 10. Proceso reacción xantoproteíca. Izquierdo adicion de ácido Nitrico- Derecho Calentamiento
En la reacción xantoproteica se utilizó para determinar la presencia o no de proteínas en una en la clara del huevo. Esta reacción fue positiva debido a la presencia de un grupo fenilo en la molécula proteica. Los complejos de la molécula proteica que son de importancia en esta reacción son la tirosina y el triptófano. La fenilalanina no reacciona en las condiciones que se realiza en el laboratorio. La reacción xantoproteica a su vez se puede catalogar con una sustitución electrofilica aromática debido a que al tratar un compuesto con ácido nítrico y calor se produce una nitración del anillo aromático que se manifiesta en un compuesto color amarillo. 7
Figura 11. Reacción Xantoproteica Vs Control
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Análisis de la proteína de la clara de huevo IV. CONCLUSIONES
Figura 11. Reacción Xantoproteíca Reacción de Biuret:
Figura 12. Prueba de Biuret positiva.
El método de biuret fue la prueba simple y la por medio de la cual fue posible confirmar la presencia de proteínas solubles en la clara del huevo. Las proteínas que contienen dos o más enlaces peptídicos forman un complejo purpura violeta con las sales de cobre II como el que se observa en la figura 12, es posible que este color se deba a la formación de un ión coordinado tetra cúprico con dos grupos amida adyacentes como se observa en la figura 13.9 El desarrollo de color es diferente para cada proteína y su intensidad se puede determinar espectroscópicamente a 540 nm
Las proteínas en la clara del huevo pueden desnaturalizarse con mucha facilidad, tan solo por agitación; también lo hacen por calor, por diferencias del pH, por aumento de la fuerza iónica y por iones metálicos pesados. La proteína del huevo se mantiene estable y activa a temperaturas menores de 37°C por lo tanto es la temperatura ideal para la cocción de un huevo. La desnaturalización puede ser reversible e irreversible, este efecto es un comportamiento versátil de las proteínas y de que sea reversible o no depende del medio en que se encuentre la proteína y de su estructura conformacional. Se puede separar una proteína mediante precipitación salina con sulfato de amonio o mediante centrifugación diferencial. La reacción xantoproteica fue positiva para la clara de huevo confirmando la presencia aminoácidos aromáticos en la proteína del huevo. La prueba de Biuret fue positiva para la clara de huevo por lo tanto se confirmó la presencia de proteínas solubles. Esta técnica fue cualitativa sin embargo la intensidad del compuesto coloreado formado permite la cuantificación de proteína por métodos espectrofotométricos. Los metales pesado son causantes de la desnaturalización de las proteínas sin embargo es una reacción reversible gracias a que el EDTA secuestra el metal dejando la proteína libre nuevamente. V. REFERENCIAS
1.
Javier, H. ESTUDIO SOBRE LA DESNATURALIZACIÓN DE
PROTEÍNAS Y DETERMINACIÓN DE ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS Revista Innovación y Experencias Educativas. [Online],
Figura 13. Formación del complejo proteína y Cobre II.
2010.
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Análisis de la proteína de la clara de huevo 2.
Teijón, J. M., Fundamentos de bioquímica estructural .
Tébar: 2006. 3.
Química Orgánica. Euned.
4.
Wu, L.; Zhao, W.; Yang, R.; Chen, X., Effects of pulsed
electric fields processing on stability of egg white proteins. Journal of Food Engineering 2014, 139 (0), 13-18.
5.
GUADIX , A. G. U., E. M.; PÁEZ -DUEÑAS , M. P.;
GONZÁLEZ -TELLO , P. Y CAMACHO , F., Technological processes and methods of control in the hydrolysis of proteins. Ars Pharmaceutica 2000, 41:1, 79- 89. 6.
Mora, S. Q., Manual de experimentos de laboratorio para
bioquímica. Euned.
7.
Bioquímica: la Ciencia de la Vida. Euned.
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procesos metabólicos. Reverté: 2007.
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V, N. B.; C, G. L.; R, C. H. H., Química de Alimentos:
Manual de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica: 2003.
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