UNIVERSIDAD DE SAN MARTÍN DE PORRES FACULTAD DE MEDICINA HUMANA CURSO DE QUÍMICA BIOLÓGICA
PRÁCTICA Nº 12 AMINOÀCIDOS Y PROTEÌNAS
Alumnos: Diego Gómez Wong Mónica Alexandra López Murga Jorge Luis Gálvez Díaz Grupo: 07L Hora: 10:00 – 12:00
LIMA-PERÚ 2008
I. INTR INTRO ODUCCI UCCIÓN ÓN:: Los aminoácidos son compuestos de bajo peso molecular y de alta polaridad, que poseen simultáneamente carácter ácido y básico. En la naturaleza, los amin aminoá oáci cido doss se encu encuen entr tran an libre libress o form forman ando do part parte e de las las prot proteí eína nass (poliaminácidos), de las cuales podemos obtenerlos por hidrólisis. Un amino aminoáci ácido, do, químic químicame amente nte,, es una molécu molécula la que contie contiene ne un grupo grupo carb carbox oxilo ilo (-COO (-COOH) H) y un grup grupo o amin amino o (-NH (-NH2) libres. Por lo general, son insolubles en solventes orgánicos (como éter o benceno), pero solubles en agua, álcalis diluidos, o ácidos diluidos.
AMINO
ÁCIDO CARBOXILO
Los Los α-am α-amin inoá oáci cido doss natu natura rale less de orig origen en anim animal al o vege vegeta tal,l, o los los que que se obtien obtienen en por por hidról hidrólisis isis enzimá enzimátic tico o o ácida ácida de proteí proteínas nas o péptid péptidos, os, son son óptimamente activas (excepto la Glicina), y por su configuración pertenecen a la serie serie L. Las rotac rotacion iones es especí específic ficas as son const constant antes es valios valiosas as para para su identificación. Se pueden clasificar por su naturaleza de sus “Restos aminoácido” (-R): Aminoácidos No Polares Neutros: Llamados también aminoácidos apolares. Presentan radicales de hidrocarbonatos apolares o hidrocarbonatos modificados, excepto la glicina. Son radicales hidrófobos. Encontramos: Glicina: H-CH (NH2)-COOH Alanina: CH3-CH (NH2)-COOH Leucina: CH3 (CH3)-CH2-CH (NH2)-COOH Valina: CH3-CH (CH3) – CH (NH2)-COOH Isoleucina: CH3-CH2-CH (CH3)-CH (NH2)-COOH Prolina: - CH2-CH2-CH2 - Ligado a un grupo amino o un carbono α Fenilalanina: C6H5-CH2-CH (NH2)-COOH Triptofano: R aromático-CH (NH2)-COOH Metionina: CH3-S-CH2-CH2-CH (NH2)-COOH
Aminoácidos Polares Neutros: Presentan radicales que tienen a formar puentes de Hidrógeno. Serina: OH-CH2-CH (NH2)-COOH Treonina: OH-CH (CH3)-CH (NH2)-COOH
Cisteina: SH-CH2-CH (NH2)-COOH Tirosina: OH-C6H4-CH2-CH (NH2)-COOH Asparagina: NH2-CO-CH2-CH (NH2)-COOH Glutamina: NH2-CO-CH2-CH2-CH (NH2)-COOH
Aminoácidos Básicos: Presentan radicales con grupo carboxílico. Son hidrófilos. Ácido Aspártico: HCOO-CH2-CH (NH2)-COOH Ácido Glutámico: HCOO-CH2-CH2-CH (NH2)-COOH Aminoácidos Ácidos: Presentan radicales con un grupo amino. Son hidrófilos. Arginina: HN=C(NH2)-NH-CH2-CH2-CH2- CH (NH2)- COOH Lisina: NH2-CH2-CH2-CH2-CH2- CH (NH2)- COOH Histidina: H-(C3H2N2)-CH2- CH (NH2)- COOH
Para la IONIZACIÓN DE AMINOÁCIDOS: Los aminoácidos forman una sal interna debido a la transferencia de un protón del grupo carboxilo carboxilo ácido al grupo amino amino básico básico. La estructura carboxilato de amonio resultante se conoce como el zwitterion. CH3CH(NH2)CO2H
CH3CH(NH3)+CO2-
Otro punto importante es conocer qué es el PUNTO ISOELÉCTRICO (pI):
Es el pH al que una sustancia anfótera tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminoácidos y también en las proteínas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. Para calcularlo se deben utilizar los pKa. pKa.
pI: pK1 + pK2 2 La Ninhidrina nos permite reconocer o detectar los α-aminoácidos. Cuando existe presencia de α-aminoácidos en una solución, al añadir unas gotas de solución alcohólica Ninhidrina (o hidrato de tricetohidrindeno) al 0,25% se producirá una coloración violeta. Tambié También n podre podremos mos recono reconocer cer los amino aminoáci ácidos dos en soluc solución ión alcohó alcohólic lica a o acuosa, utilizando tricloruro férrico, con la cual el color de la solución sería rojizo. Para Para los rest restos os amin aminoá oáci cido doss de los los dife difere rent ntes es amin aminoá oáci cido doss se pued pueden en detectar mediante diferentes pruebas. Por ejemplo: Para los Aminoá Aminoácid cidos os Aromát Aromático icos, s, podemo podemoss utiliza utilizarr ácido ácido nítric nítrico o Para (HNO3), dándonos derivados nitrados (reacción Xantoproteica). Para aminoácidos azufrados en medio alcalino, usamos sales del plomo, las cuales formaran un precipitado negro (PbS). aminoácidos con resto indólico, utilizaremos el p En dimetilaminobenzaldehido o el ácido glicólico produciendo productos coloreados. para aminoá aminoácid cidos os fenólic fenólicos, os, nitrat nitrato o mercúr mercúrico ico-me -mercu rcurio rioso so del Y para reactivo de Millón para dar coloración rojo salmón… Ahora culminando con la parte de aminoácidos, es tiempo de empezar con las proteínas, del griego poton que significa primero. Las proteínas son macromoléculas de masa molecular elevada, formadas por cadenas lineales de aminoácidos unidos mediante enlace peptídico. Por ello pueden ser llamados polímeros de aminoácidos. Compuestas por Carbono (C), Hidrógeno (H), Oxígeno (O) y Nitrógeno (N) sino éste éste último último el eleme elemento nto caract caracterí erísti stico. co. Tambié También n contie contienen nen azufre azufre,, fósfor fósforo, o, hierro, etc. Son Son de vita vitall impo import rtan anci cia a para para el func funcio iona nami mien ento to de las las célu célula lass y de su estructura. También son muy abundantes. Cumple Cumplen n tambié también n funció función n de catáli catálisis sis enzimá enzimátic tico, o, funcio funciones nes contrá contrácti ctiles les posibilitando así el movimiento; protección inmunitaria, etc. Podría señalarse que, “no existe vida sin proteínas”. Las proteínas son moléculas anfóteras, anfóteras, es decir, decir, según el número relativo de grupos carboxilo y aminos libres, en solución darán reacción ácido o alcalina. En otras otras palabr palabras, as, alguna algunass molécu moléculas las se cargar cargarán án positiv positivame amente nte y otras otras negativamente.
El pH al cual una proteína determinada es eléctricamente neutra se conoce como punto isoeléctrico. Todas las proteínas son menos solubles cuando se encuentran en su punto isoeléctrico. Ahora conociendo sobre la COAGULACIÓN DE PROTEÍNAS: Las proteínas debido al gran tamaño de sus moléculas forman con el agua soluciones coloidales. Estas soluciones pueden precipitar con formación de coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los 70°C. o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, etc. La coag coagula ulaci ción ón de prot proteí eína nass es un proc proces eso o irre irreve vers rsib ible le y se debe debe a su desnaturalización por los agentes indicados, que al actuar sobre la proteína la desordenan por la destrucción de su estructura terciaria y cuaternaria.
En enlace peptídico presente en una proteína puede ser reconocido por la reacción de Biuret da una coloración violeta característica.
III.- PARTE EXPERIMENTAL: A. REAC REACTI TIVO VOS S
Ninhidrina. Tirosina. Triptofano. cisteína. Ácido Glutámico. Albúmina. Cabello (queratina).
NaOH. HNO3. H2SO4(concentrado) Acetato de plomo. N,N-dimetil Amino benzaldehído. Cloroformo. Sulfato de cobre
B. MATE MATERI RIAL ALES ES
Tubos de ensayo y gradilla. Hornilla eléctrica. Baño maría. Bagueta. Pipeta. Mechero
C. PROCEDIMIENTOS RECONOCIMIENTO DE LOS ALFA AMINOÁCIDOS Colocamos en 5 tubos de ensalllo 1ml de Triptofano, albúmina, cistina, tirosina, ácido glutámico, uno para cada tubo. − Adicionamos 3 gotas de ninhidrina con mucho cuidado puesto que es cancerígeno. − Por último llevamos los tubos al bañomaría para luego retirar y obserbar lo que ocurre. −
RECONOCIMIENTO DE RESTO AROMÁTICO − − − −
Llenamos 2 tubos de ensayo con Albúmina y tirosina cada uno. Añadimos 0,5 ml de HNO3. Llevamos al baño maría un promedio de 7 minutos; dejamos enfriar. Añadir con mucho cuidado 0,5 ml de NAOH y anotar los resultados.
RECONOCIMIENTO DEL RESTO AZUFRADO En 2 tubos de ensayo colocar cisterna y albúmina. − Luego añadimos 0,5ml de NAOH al 30%, añadimos también 2 gotas de acetato de plomo al 10%. − Los llevamos al bañomaría por siete minutos, dejamos enfriar y observar. −
RECONOCIMIENTO DE RESTOS INDÓLICOS En dos tubos de ensayo colocar 2 ml de albúmina y Cisteína. − Acontinuación añadimos 0,5 ml de solución de ácido glicólico, mezclar bien. − Luego añadir cuidadosamente por las paredes del tubo 1ml de H2SO4 (concentrado). − Colocamos los tubos de ensayo en la gradilla y dejar reposar por 5min, sin agitar. − Observar y anotar resultados. −
PRUEBA DE MILLÓN -
En 2 tubo tuboss de ensa ensayo yo colo colocar car muestr muestras as de de albúm albúmina ina y tirosi tirosina. na. Luego Luego añadi añadimos mos 0,5m 0,5mll de react reactivo ivo de de Millón Millón,, y lo lleva llevamos mos al al baño baño maría por 5 minutos. Reti Retira rar, r, enfr enfria iarr y obse observ rvar ar..
REACCIÓN DE BIURET -
Cogemo Cogemoss un un tubo tubo de de ensa ensayo yo y poner poner 3cc 3cc de albú albúmin mina a de de huev huevo. o. Añadim Añadimos os 2cc 2cc de de soluc solución ión de hidr hidróxi óxido do de de sódic sódico o al 20%. 20%.
-
A contin continuac uación ión 4 ó 5 gota gotass de soluc solución ión de de sulfat sulfato o cúpric cúprico, o, diluid diluido o al 1 %. Observ Observamo amoss si aparece aparece la colorac coloración ión viole violeta ta grisáce grisácea a caracte caracterís rístic tica. a.
COAGULACIÓN DE PROTEÍNAS -
En un tubo tubo de de ensay ensayo o coloca colocamos mos una una peque pequeña ña cant cantida idad d de clar clara a de huevo. Luego Luego añad añadimo imoss 5 gotas gotas de de ácido ácido acétic acético o y calen calentam tamos os el tubo tubo a la la llama de mechero.
NATURALEZA ANFÓTERA DE LAS PROTEÍNAS -
-
Prepar Preparar ar cuatro cuatro tubos tubos de prueba prueba con lo siguie siguiente nte:: 1° tubo: Una gota de HCl 0,1M + 1gota de anaranjado de metilo+ 2ml de Agua. 2° tubo: Una gota de HCl 0,1M + 1gota de anaranjado de metilo+ 2ml de Agua. 3° tubo: Una gota de NaOH 0,1M + 1gota de fennolftaleína+ 2ml de Agua. 4° tubo: Una gota de NaOH 0,1M + 1gota de fennolftaleína+ 2ml de Agua. Añadim Añadimos os al al 1° y al al 3° tubo tubo 3ml 3ml de albúmi albúmina, na, agitar agitar y observ observar. ar. Al 2° 2° y 4° 4° tubo tubo 3ml 3ml de de Agua Agua,, agit agitar ar y obse observ rvar ar.. Expl Explic icar ar los los res resul ulta tado doss obs obser erva vado dos. s.
IV.- RESULTADOS:
RECONOCIMIENTO DE ALFA AMINOÁCIDOS
Ninhidrina + baño maría Coloración
Triptofano
Albúmina
Cistina
Tirosina
Ác. Glutamínico
+
+
+
+
+
Violeta
violeta
violeta
violeta
violeta
RECONOCIMIENTO RECONOCIMIENTO DE RESTO AROMÁTICO
Albúmina
Tirosina
Cabello + H2O
HNO3 (Coloración)
+ (Amarillo)
+ (Amarillo)
+ (Amarillo)
+ NaOH (Coloración)
+ (Naranja)
+ (Naranja)
+ (Naranja)
RESTO AZUFRADO
NaOH + Acetato de Pb
Cistina
Albúmina
Precipitado Negro
Precipitado Negro
RESTOS INDÓLICOS
Rvo. N,N - dimetilaminobenzaldehido
Triptofano + (morado)
PRUEBA DE MILLÓN Rvo. Millón / Baño maría
Tirosina + (rojo)
Albúmina + (rojo)
Proteina + (morado)
RESTO AZUFRADO
NaOH + Acetato de Pb
Cistina
Albúmina
Precipitado Negro
Precipitado Negro
RESTOS INDÓLICOS
Rvo. N,N - dimetilaminobenzaldehido
Triptofano + (morado)
PRUEBA DE MILLÓN Rvo. Millón / Baño maría
Tirosina + (rojo)
Albúmina + (rojo)
REACCIÓN DE BIURET Albúmina Clara de Huevo + NaOH (solución) + CuSO4
+ (morado)
COAGULACIÓN DE PROTEÍNAS
Calor Ácido Cloroformo Base NaOH Acetato de Pb CuSO4
Clara de Huevo+ Ác. Acético+Albúmina + + + + + + +
Proteina + (morado)
REACCIÓN DE BIURET Albúmina Clara de Huevo + NaOH (solución) + CuSO4
+ (morado)
COAGULACIÓN DE PROTEÍNAS
Calor Ácido Cloroformo Base NaOH Acetato de Pb CuSO4
Clara de Huevo+ Ác. Acético+Albúmina + + + + + + +
NATURALEZA ANFÓTERA DE LAS PROTEÍNAS
Tubo 1 HCl + anaranjado de metilo Tubo 2 HCl + anaranjado de metilo Tubo 3 NaOH + Fenolftaleína Tubo 4 NaOH + Fenolftaleína
Albúmina Amarillo (ácido) Amarillo (ácido) Descoloración (base) Descoloración (base)
SAPONIFICACIÓN Grasa derretida NaOH + H2O
positivo
NATURALEZA ANFÓTERA DE LAS PROTEÍNAS Albúmina Amarillo (ácido) Amarillo (ácido) Descoloración (base) Descoloración (base)
Tubo 1 HCl + anaranjado de metilo Tubo 2 HCl + anaranjado de metilo Tubo 3 NaOH + Fenolftaleína Tubo 4 NaOH + Fenolftaleína
SAPONIFICACIÓN Grasa derretida NaOH + H2O
positivo
TINCIÓN DE SUDÁN III Tinción de Sudán III Azul de metileno
Aceite
Colorante
Tiñe
Lipofílico
No tiñe
Lipofóbico
SOLUBILIDAD Agua Cloroformo Etanol
Aceite Inmisible Misible (apolar) Inmisible,
V.- DISCUSIONES: Alguno noss ácid ácidos os gras grasos os poli poliin insa satu tura rado doss (lino (linole leic ico, o, lino linolé léni nico co y Algu araquidónico) no pueden ser sintetizados por los animales superiores (incluido el hombre), y como su función biológica es fundamental, deben ser suministrados en la dieta.
VI.- CONCLUSIONES: Durante el experimento en el que utilizamos el reactivo de Nihidrina, pudimos observar que todos los contenidos de los tubos de ensayo camb ambiaba iaban n su color lor a uno uno vio violeta leta debid ebido o a que que éstos tos son son αaminoácidos. Gracias a la presencia de la fenolftaleína y anaranjado de metilo pudimos confirmar la capacidad anfótera que tienen los aminoácidos, ya que con la feno fenolf lfta tale leín ína a se compo omport rtó ó como omo bas base y con con el anaranjado de metilo como ácido. Confirmamos que el reactivo de millón detecta restos fenólicos en amin aminoá oáci cido dos, s, el reac reactiv tivo o de Ácid Ácido o Glic Glicól ólic ico o dete detect cta a a los los rest restos os indólicos y el acetato de plomo, a los restos azufrados. En el experimento de solubilidad de los lípidos, se podrá observar que el aceite se ha disuelto en el éter y no en el agua ya que éste subirá debido a su menor densidad.
VII.- CUESTIONARIO: 1. Escriba el nombre y la estructura de 6 de los aminoácidos esenciales.
Aminoácidos
Valina
Leucina
Estructura linealradical R-CH(NH2)-CO2H
Estructura completa
Isoleucina
Fenilalanina
Treonina
Lisina
Cisterna
Metionina
PhCH2
2. Escriba Escriba la reacció reacción n entre la la fenilalani fenilalanina na y la ninhidrin ninhidrinaa
3. ¿Qué aminoá aminoácidos cidos se se puede puede encontrar encontrar en en la albúmina albúmina de huevo huevo? ? La ovoalbúmin ovoalbúmina a contiene contiene aminoácidos aminoácidos esencial esenciales es como : Leucina, Leucina, isoleucina, lisina, fenilalanina, fenilalanina, treonina, treonina, triptófano y valina. valina. 4. ¿Cómo se investiga investiga la la estructur estructuraa primaria primaria de una una proteína proteína? ? Si la estructura primaria es la secuencia de aminoácidos de la proteína, nos indicará qué aminoácidos componen su cadena polipeptídica y el orden en que dichos aminoácidos se encuentran. La función de una proteína depende de su secuencia y de la forma que ésta adopte. 5. ¿Qué aplicac aplicación ión tiene tiene el concepto concepto del del punto isoelé isoeléctric ctrico? o? Determinar el pH de un aminoácido ido que se presenta casi exclusivamente en forma de Zwitterion, es decir con las formas iónicas positivas y negativas en iguales proporciones. En el punto isoélectrico las las prot proteí eína nass prec precip ipita itan, n, se sepa separa ran n de sus sus mezc mezcla lass y se pued pueden en purificar. 6. ¿Qué fuerzas fuerzas intermo intermolecul leculares ares son son responsab responsables les de las estructur estructuras as 2°, 3° Y 4° de las proteínas? Para la estructura 2° el responsable son los puentes de hidrógeno; para la estructura 3°, el enlace salino, puentes de hidrógeno, interacción hidrofóbica, enlace disulfuro, interacciones de Van Der Waals. Y para para la estr estruc uctu tura ra 4° son son las las fuer fuerza zass elec electro trost stát átic icas as débi débile less no covalentes. 7.
¿Cuáles son las aplicaciones de la electroforesis? La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) sobre la base de su tamaño molecular y carga eléctrica. Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida (fibras cruzadas, como una malla). Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la
malla, por la que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.
8. Describa Describa algunas algunas de las las propiedade propiedadess biológicas biológicas de las proteín proteínas. as. Especificidad: Cada proteína podrá reaccionar químicamente con una sustancia específica, debido a la configuración externa de la molécula. Una alteración del plegamiento produce un cambio en la forma que afec afecta ta su supe superfi rfici cie. e. Para Para que que una una reac reacci ción ón teng tenga a luga lugarr el acoplamiento entre la sustancia reaccionante y la proteína debe ser perfecto, para que los átomos de ambas moléculas estén lo suficientemente cerca que les permita reaccionar. Las proteínas solu solubl bles es jueg juegan an un pape papell muy muy impo import rtan ante te en las las reac reacci cion ones es bioquímicas a nivel celular, por lo que cualquier cambio en su conformación puede alterar los procesos metabólicos. Desnaturalización: Es la destrucción de la estructura terciaria de una proteína, en la que que pasa pasa de una una form forma a pleg plegad ada a o enro enrosc scad ada a a una una form forma a opuesta, por rompimiento de enlaces de hidrógeno. En la proteína desnaturalizada ocurren cambios estructurales que afectan sus prop propie ieda dade dess biol biológ ógic icas as,, como como la horm hormon onal al,, enzi enzimá mátic ticas as y la actividad inmunológica. Es generalmente un proceso irreversible, fuertemente endotérmico, que produce un desorden del sistema. Los principales agentes desnaturalizantes son: a) Altas temperaturas, provocan la coagulación. Ej. Huevo cocido. b) Cambios bruscos de pH.
Solubilidad: Las proteínas globulares son solubles en agua, debido a que sus radicales polares o hidrófilos se sitúan hacia el exterior, formando puentes de hidrógeno con el agua, constituyendo una capa de solvatación. Esta solubilidad varía dependiendo del tamaño, de la forma, de la disposición de los radicales y del pH. 9. ¿Qué aminoá aminoácidos cidos rendir rendiráá la hidrólisis hidrólisis ácida ácida del siguiente siguiente péptido? péptido?
Rendiría la Valina, la Fenilalanina y la Leucina.
BIBLIOGRAFÌA DIRECCIONES ELECTRÒNICAS
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