SADRŽAJ POGLAVLJE 1: SISTEMETIKA I NAZIVLJE KVASACA .................................... 1 1.1. UVOD ..................................................................................................................................................... 1 1.2. TAKSONOMIJA KVASACA .............................................................................................................. 2 1.2.1. Askomicetni kvasci .......................................................................................................................... 3 1.2.2. Bazidiomicetni kvasci ...................................................................................................................... 4 1.3. KVASCI OD POSEBNOG ZNAČENJA ............................................................................................. 6 1.3.1. Rod Saccharomyces ......................................................................................................................... 8 1.3.2. Rod Kluyveromyces ......................................................................................................................... 9 1.3.3. Rod Candida .................................................................................................................................... 9 1.3.4. Ostali kvasci od posebnog značenja............................................................................................... 10 1.3.5. Kvasci uzročnici kvarenja .............................................................................................................. 13 1.3.6. Patogeni kvasci .............................................................................................................................. 14 1.4. ZBIRKE KVASACA U SVIJETU ..................................................................................................... 14 LITERATURA ........................................................................................................................................... 16
POGLAVLJE 2: GENETIKA KVASACA I PRIMJENA GENETIČKIH ISTRAŽIVANJA U OPLEMENJIVANJU INDUSTRIJSKIH SOJEVA KVASACA ............................................................................................................................ 19 2.1. UVOD ................................................................................................................................................... 19 2.2. STRUKTURA GENOMA I ŽIVOTNI CIKLUS KVASCA ............................................................ 21 2.2.1. Genom kvasca Saccharomyces cerevisiae ..................................................................................... 21 2.2.2. Genetička nomenklatura ................................................................................................................ 22 2.2.3. Stanični ciklus ................................................................................................................................ 23 2.2.4. Sporulacija kvasca i nastanak haploidnih askospora...................................................................... 24 2.2.5. Analiza askospora i konstrukcija sojeva klasičnim križanjem ....................................................... 24 2.2.6. Konjugacija i homotalizam ............................................................................................................ 26 2.2.7. Genetičko inženjerstvo i ciljane genetičke manipulacije u kvascu ................................................ 27 2.3. PRIMJENA GENETIČKOG INŽENJERSTVA U POBOLJŠANJU SVOJSTAVA PEKARSKOG, VINSKOG I PIVSKOG KVASCA ................................................................................ 28 2.3.1. Struktura genoma i klasifikacija pekarskih, vinskih i pivskih kvasaca .......................................... 28 i pivskog kvasca ....................................................................................................................................... 29 2.3.3. Prednosti i ograničenja genetičkog inženjerstva u oplemenjivanju industrijskih kvasaca ............. 29 2.3.4. Strategije i primjeri poboljšanja pekarskih, vinskih i pivskih kvasaca metodama genetičkog inženjerstva .............................................................................................................................................. 30 2.3.4.1. Sprječavanje represije glukozom ........................................................................................ 30 2.3.4.2. Asimilacija rafinoze, melibioze i maltotrioze ..................................................................... 32 2.3.4.3. Hidroliza škroba i dekstrina ............................................................................................... 32 2.3.4.4. Hidroliza β-glukana, pektina i ksilana ............................................................................... 33 2.3.4.5. Korištenje izvora dušika ...................................................................................................... 33 2.3.4.6. Flokulacija vinskih i pivskih kvasaca ................................................................................. 34 2.3.4.7. Smanjenje proizvodnje diacetila ......................................................................................... 34 2.3.4.8. Optimizacija proizvodnje spojeva koji sadrže sumpor ..................................................... 35 2.3.4.8.1. Sulfiti ............................................................................................................................. 36 2.3.4.8.2. Vodikov sulfid ............................................................................................................... 36 2.3.4.8.3. Dimetil sulfid ................................................................................................................. 37 2.3.4.9. Biosinteza glicerola .............................................................................................................. 38
2.3.4.10. Smanjenje kiselosti vina .................................................................................................... 39 2.3.4.11. Povećanje tolerancije na zamrzavanje i odmrzavanje .................................................... 39 LITERATURA ........................................................................................................................................... 40
POGLAVLJE 3: PROIZVODNJA PIVA .............................................................. 41 3.1. UVOD ................................................................................................................................................... 41 3.2. DEFINICIJA PIVA ............................................................................................................................. 42 3.3. TIPOVI I VRSTE PIVA ..................................................................................................................... 42 3.3.1. Podjela piva prema vrsti kvasca i načinu fermentacije .................................................................. 42 3.3.2. Podjela piva prema masenom udjelu ekstrakta u sladovini ........................................................... 43 3.3.3. Podjela piva prema glavnoj sirovini za proizvodnju sladovine ...................................................... 43 3.3.4. Podjela piva prema boji ................................................................................................................. 44 3.3.5. Podjela piva prema volumnom udjelu alkohola ............................................................................. 44 3.4. PROIZVODNJA PIVA ....................................................................................................................... 44 3.4.1. Proizvodnja sladovine .................................................................................................................... 46 3.4.1.1. Sirovine za proizvodnju sladovine ...................................................................................... 46 3.4.1.2. Varionica i proizvodnja sladovine ...................................................................................... 51 3.4.1.3. Praktično izvođenje ukomljavanja i hidrolize ................................................................... 54 3.4.1.4. Izdvajanje sladovine iz slatke komine ................................................................................ 59 3.4.1.5. Kuhanje sladovine ................................................................................................................ 59 3.4.1.6. Hlađenje, bistrenje i aeracija sladovine ............................................................................. 61 3.5. FERMENTACIJA SLADOVINE – GLAVNO VRENJE ................................................................ 62 3.5.1. Čista kultura kvasaca ..................................................................................................................... 62 3.5.1.1. Umnožavanje čiste kulture .................................................................................................. 63 3.5.2. Biokemijske promjene tijekom fermentacije sladovine ................................................................. 66 3.5.2.1. Alkoholna fermentacija ....................................................................................................... 67 3.6. VOĐENJE GLAVNOG VRENJA I DOVIRANJA .......................................................................... 72 3.6.1. Klasični postupak glavnog vrenja piva .......................................................................................... 72 3.6.2. Klasično naknadno vrenje (doviranje) mladog piva ...................................................................... 75 3.6.3. Vrenje i doviranje piva u cilindrično-konusnim fermentorima ...................................................... 75 3.6.3.1. Konstrukcija, veličina i postavljanje CKF-a ................................................................... 75 3.6.3.2. Izdvajanje i čuvanje kvasca za ponovno nacjepljivanje ................................................... 80 3.7. DORADA PIVA ................................................................................................................................... 80 3.7.1. Filtracija ......................................................................................................................................... 80 3.7.2. Centrifugiranje ............................................................................................................................... 81 3.7.3. Stabilizacija piva ............................................................................................................................ 82 3.7.3.1. Koloidna stabilizacija piva .................................................................................................. 83 3.7.3.2. Biološka stabilizacija ............................................................................................................ 83 3.7.4. Nestabilnost okusa ......................................................................................................................... 84 3.7.5. Korekcija udjela nekih sastojaka piva ............................................................................................ 85 3.7.6. Tlačni tankovi ................................................................................................................................ 86 3.8. MIKROBIOLOŠKI NADZOR PROIZVODNJE PIVA .................................................................. 86 3.8.1. Divlji kvasci ................................................................................................................................... 87 3.8.2. Bakterijski kontaminanti piva ........................................................................................................ 88 3.8.2.1. Gram-pozitivne bakterije .................................................................................................... 88 3.8.2.2. Gram- negativne bakterije .................................................................................................. 89 3.8.3. Sporogene bakterije ....................................................................................................................... 90 3.8.4. Cilj i provedba mikrobiološkog nadzora ........................................................................................ 91 3.8.5. Uklanjanje nepoželjnih mikroorganizama, čišćenje i dezinfekcija ................................................ 91
LITERATURA ........................................................................................................................................... 93
POGLAVLJE 4: PROIZVODNJA VINA.............................................................. 94 4.1. UVOD ................................................................................................................................................... 94 4.2. VRSTE I KULTIVARI VINOVE LOZE .......................................................................................... 94 4.3. KEMIJSKI SASTAV MOŠTA I VINA ............................................................................................. 95 4.3.1.Voda................................................................................................................................................ 95 4.3.2. Etanol ............................................................................................................................................. 95 4.3.3. Metanol .......................................................................................................................................... 96 4.3.4. Viši alkoholi................................................................................................................................... 96 4.3.5. Alkoholi s više hidroksilnih skupina .............................................................................................. 96 4.3.6. Ugljikohidrati ................................................................................................................................. 97 4.3.7. Kiseline .......................................................................................................................................... 97 4.3.8. Aldehidi ......................................................................................................................................... 98 4.3.9. Esteri .............................................................................................................................................. 98 4.3.10. Fenoli ........................................................................................................................................... 98 4.3.11. Aromatski spojevi ........................................................................................................................ 99 4.3.11.1. Aromatski spojevi iz grožđa .............................................................................................. 99 4.3.11.2. Aromatski spojevi nastali tijekom alkoholne fermentacije .......................................... 100 4.3.11.3. Aromatski spojevi nastali tijekom dozrijevanja i starenja vina ................................... 100 4.3.12. Vitamini ..................................................................................................................................... 100 4.3.13. Minerali...................................................................................................................................... 100 4.4. POSTUPCI PROIZVODNJE VINA ............................................................................................... 101 4.4.1. Muljanje i runjenje grožđa ........................................................................................................... 102 4.4.2. Maceracija grožđa ........................................................................................................................ 103 4.4.3. Prešanje grožđa ............................................................................................................................ 103 4.4.4. Bistrenje mošta ............................................................................................................................ 105 4.4.5. Postuci pojačavanja/doslađivanja, otkiseljavanja i dokiseljavanja .............................................. 105 4.4.6. Sumporni dioksid u vinarstvu ...................................................................................................... 106 4.4.6.1. Dodavanje sumpornog dioksida ........................................................................................ 107 4.4.7. Bistrenje i bistrila ......................................................................................................................... 108 4.4.7.1. Način djelovanja bistrila.................................................................................................... 108 4.4.8. Filtracija vina ............................................................................................................................... 109 4.4.8.1. Naplavna filtracija ............................................................................................................. 110 4.4.8.2. Filteri s okvirima (pločasti filteri) ..................................................................................... 110 4.4.8.3 Filteri s membranama ........................................................................................................ 111 4.4.8.4. Tangencijalna filtracija (cross flow filtracija) ................................................................. 111 4.4.8.5. Vakuum filtri ...................................................................................................................... 112 4.4.8.6. Centrifuge ........................................................................................................................... 112 4.5. ALKOHOLNA FERMENTACIJA .................................................................................................. 112 4.5.1. Kvasci .......................................................................................................................................... 113 4.5.1.1. Porijeklo vinskih kvasaca .................................................................................................. 113 4.5.2. Mliječno-kisele bakterije (MKB) ................................................................................................. 114 4.5.3. Bakteriofagi ................................................................................................................................. 114 4.5.4. Octene bakterije ........................................................................................................................... 114 4.5.6. Plijesni ......................................................................................................................................... 115 4.5.7. Spontana i inducirana (kontrolirana) alkoholna fermentacija ..................................................... 115 4.5.8. Metabolizam kvasaca ................................................................................................................... 116 4.5.8.1 Alkoholna fermentacija ...................................................................................................... 116 4.5.8.2. Sekundarni produkti metabolizma šećera ....................................................................... 117 4.5.8.3. Metabolizam dušika ........................................................................................................... 117 4.5.8.4. Metabolizam sumpora ....................................................................................................... 118 4.6. MALOLAKTIČKA FERMENTACIJA .......................................................................................... 118
4.6.1. Biokemizam malolaktičke fermentacije ....................................................................................... 119 4.6.2. Čimbenici malolaktičke fermentacije .......................................................................................... 120 4.6.3. Utjecaji malolaktičke fermentacije na vino.................................................................................. 120 4.7. POSTUPCI STABILIZACIJE I DOZRIJEVANJA VINA ........................................................... 121 4.7.1. Stabilizacija vina na tartarate ....................................................................................................... 121 4.7.2. Stabilizacija vina na bjelančevine ............................................................................................... 122 4.7.3. Stabilizacija vina na polisaharide ................................................................................................. 122 4.7.4. Stabilizacija vina na metale ......................................................................................................... 122 4.8. PRETOK I DOZRIJEVANJE VINA ............................................................................................... 123 4.8.1. Dolijevanje posuda ...................................................................................................................... 123 4.8.2. Pretok vina ................................................................................................................................... 123 4.8.3. Dozrijevanje vina ......................................................................................................................... 123 4.8.4. Promjena boje .............................................................................................................................. 124 4.8.5. Promjena okusa ............................................................................................................................ 124 4.8.6. Promjena mirisa ........................................................................................................................... 124 4.8.7. Čimbenici koji utječu na dozrijevanje vina u boci ....................................................................... 124 4.8.8. Dozrijevanje u drvenom posuđu .................................................................................................. 125 4.9. PUNJENJE VINA U BOCE ............................................................................................................. 125 4.10. TEHNOLOGIJA PROIZVODNJE BIJELIH VINA ................................................................... 126 4.10.1. Hiperoksidacija .......................................................................................................................... 127 4.10.2. Hiperredukcija ........................................................................................................................... 127 4.10.3. Njega vina na kvascu (sur lie) .................................................................................................... 127 4.11. TEHNOLOGIJA PROIZVODNJE CRNIH VINA ...................................................................... 128 4.11.1. Mikrooksidacija ......................................................................................................................... 129 4.11.2. Karbonska maceracija ................................................................................................................ 129 4.12. MANE I BOLESTI VINA ............................................................................................................... 130 4.12.1. Mikroorganizmi uzročnici kvarenja ........................................................................................... 130 4.12.1.1. Octene bakterije ............................................................................................................... 130 4.12.1.2. Mliječno kisele bakterije (MKB) .................................................................................... 131 4.12.1.3. Kvasci ................................................................................................................................ 131 4.12.2. Prisutnost teških metala ............................................................................................................. 132 4.12.3. Negativan utjecaj čepa - “Cork taint” ........................................................................................ 132 4.13. SPECIJALNA VINA ....................................................................................................................... 133 4.13.1. Slatka vina ................................................................................................................................. 133 4.13.1.1. Vina od grožda napadnutog s plemenitom plijesni ....................................................... 133 4.13.1.2. Slatka vina od grožda koje nije napadnuto s plemenitom plijesni ............................... 134 4.13.2. Likerska vina ............................................................................................................................. 135 4.13.3. Aromatizirana vina .................................................................................................................... 136 4.13.4. Pjenušava vina ........................................................................................................................... 137 4.13.4.1. Autoliza kvasaca ............................................................................................................... 138 LITERATURA ......................................................................................................................................... 138
POGLAVLJE 5: PROIZVODNJA ETILNOG ALKOHOLA .............................. 140 5.1. UVOD ................................................................................................................................................. 140 5.2. ALKOHOLNA FERMENTACIJA .................................................................................................. 141 5.2.1. Kvasci u proizvodnji etanola ....................................................................................................... 142 5.2.2. Sirovine u proizvodnji etanola ..................................................................................................... 143 5.2.3. Proračun alkoholne fermentacije ................................................................................................. 143
5.3. PROIZVODNJA ALKOHOLA U POGONU ................................................................................. 145 5.3.1. Proizvodnja alkohola na melasi .................................................................................................. 145 5.3.1.1. Tehnološki postupci .......................................................................................................... 145 5.3.1.2. Proizvodnja alkohola po fazama ...................................................................................... 146 5.3.1.3. Priprema supstrata ........................................................................................................... 148 5.3.1.4 Priprema laboratorijske čiste kulture .............................................................................. 149 5.3.1.5. Uzgoj pogonskog inokuluma ............................................................................................ 150 5.3.1.6. Alkoholna fermentacija-Glavno vrenje ............................................................................ 150 5.3.1.7. Separacija komine .............................................................................................................. 153 5.3.1.8. Proizvodnja suhog neaktivnog kvasca ............................................................................. 155 5.3.1.9. Kontinuirana fermentacija ............................................................................................... 156 5.3.1.9.1. Vođenje biotehnološkog procesa kontinuirane fermentacije .................................. 158 5.3.2. Izdvajanje alkohola iz prevrele komine: destilacija i rektifikacija ............................................... 159 5.3.2.1. Proizvodnja bezvodnog alkohola ..................................................................................... 161 5.4. PROIZVODNJA ALKOHOLA NA ŠKROBNIM SIROVINAMA .............................................. 162 5.4.1. Priprema supstrata u proizvodnji alkohola iz žitarica (kukuruza) ................................................ 163 5.4.2. Fermentacija ................................................................................................................................ 165 5.4.3. Izdvajanje proizvoda .................................................................................................................... 166 5.5. PROIZVODNJA ALKOHOLA IZ LIGNOCELULOZNIH MATERIJALA ........................... 166 5.5.1. Hidroliza LCM ............................................................................................................................. 167 5.5.2. Fermentacija ................................................................................................................................ 168 5.6. NOVOSTI U PROIZVODNJI ALKOHOLA ZA GORIVO .......................................................... 168 5.6.1. Stanje i predviđanja u proizvodnji alkohola za gorivo (bio-etanola) ........................................... 168 5.6.2. Prikaz proizvodnje bio-etanola na različitim sirovinama ........................................................ 170 LITERATURA ......................................................................................................................................... 171
POGLAVLJE 6: PROIZVODNJA JAKIH ALKOHOLNIH PIĆA ....................... 173 6.1. UVOD ................................................................................................................................................. 173 6.2. DEFINICIJA I PODJELA JAKIH ALKOHOLNIH PIĆA .......................................................... 174 6.3. PRIRODNA JAKA ALKOHOLNA PIĆA ...................................................................................... 174 6.3.1. Voćne rakije ................................................................................................................................. 175 6.3.1.1. Opis procesa proizvodnje voćnih rakija ........................................................................... 176 6.3.1.1.1. Vinjak .......................................................................................................................... 179 6.3.1.1.2. Šljivovica .................................................................................................................... 180 6.3.1.1.3. Rakija od krušaka ..................................................................................................... 183 6.3.1.1.4. Rakija od jabuka ........................................................................................................ 184 6.3.2. Žitne rakije .................................................................................................................................. 186 6.3.2.1. Viski ..................................................................................................................................... 186 6.3.2.2. Vodka .................................................................................................................................. 189 6.3.2.3. Genever i gin ....................................................................................................................... 190 6.3.3. Šećerne rakije............................................................................................................................... 191 6.3.3.1. Rum .................................................................................................................................... 191 6.3.3.2. Arrack ................................................................................................................................ 193 6.4. PROIZVODNJA AROMATIZIRANIH RAKIJA I LIKERA ...................................................... 194 6.4.1.Travarica ....................................................................................................................................... 194 6.4.2. Komovica ..................................................................................................................................... 194 6.4.3. Komovica s kupinom ili ribizlom ................................................................................................ 195 6.4.4. Ostale aromatizirane rakije .......................................................................................................... 195 6.4.5. Likeri ........................................................................................................................................... 196 6.4.5.1. Slatki likeri ......................................................................................................................... 196 6.4.5.2. Gorki likeri ......................................................................................................................... 197
6.4.5.3. Specijalni likeri ................................................................................................................... 197 6.5. OSTALE SIROVINE U PROIZVODNJI JAKIH ALKOHOLNIH PIĆA ................................. 198 6.5.1. Alkohol ........................................................................................................................................ 198 6.5.2. Destilati prevrelih voćnih komina ................................................................................................ 198 6.5.3. Destilati neprevrelog (maceriranog) voća .................................................................................... 198 6.5.4. Macerati aromatskog bilja........................................................................................................... 199 6.5.5. Destilati aromatskog bilja ............................................................................................................ 199 6.5.6. Eterična ulja i esencije ................................................................................................................ 199 6.5.7. Alkoholizirani voćni sokovi ......................................................................................................... 199 6.5.8. Voda............................................................................................................................................. 199 6.5.9. Sredstva za slađenje ..................................................................................................................... 200 6.5.10. Sredstva za bojenje .................................................................................................................... 200 6.5.11. Aromatsko i ljekovito bilje ........................................................................................................ 201 6.5.12. Voće, voćni sokovi i plodovi ..................................................................................................... 203 6.5.13. Eterična ulja ............................................................................................................................... 203 6.5.14. Sintetski aromatici ..................................................................................................................... 203 6.6. Sastavljanje jakih alkoholnih pića ................................................................................................... 204 LITERATURA ......................................................................................................................................... 205
POGLAVLJE 7: PROIZVODNJA PEKARSKOG KVASCA ............................. 206 7.1. UVOD ................................................................................................................................................. 206 7.2. PROIZVODNI PROCES – OPĆE POSTAVKE ............................................................................ 207 7.3. VRSTE I SOJEVI KVASACA U PROIZVODNJI ......................................................................... 208 7.4. PRINCIPI AEROBNOG UZGOJA KVAŠČEVE BIOMASE ...................................................... 208 7.4.1. Brzina rasta .................................................................................................................................. 208 7.4.2. Potreba kisika i aeracija ............................................................................................................... 210 7.4.3. Fermentativni metabolizam u aerobnim uvjetima ........................................................................ 212 7.5. HRANJIVI SUPSTRAT .................................................................................................................... 213 7.5.1. Izvori ugljika ................................................................................................................................ 213 7.5.2. Izvori dušika i fosfora .................................................................................................................. 213 7.5.3. Ostali elementi (minerali) ............................................................................................................ 214 7.5.4. Tvari rasta .................................................................................................................................... 215 7.5.5. Alternativni izvori ugljika i energije ............................................................................................ 215 7.6. UVJETI OKOLINE .......................................................................................................................... 216 7.6.1. Temperatura ................................................................................................................................. 216 7.6.2. Koncentracija H+ (pH) ................................................................................................................ 216 7.6.3 Koncentracija kvaščevih stanica ................................................................................................... 216 7.6.4 Prinos kvasca po utrošenom supstratu .......................................................................................... 216 7.6.5. Toplina – odvođenje topline ........................................................................................................ 217 7.6.6. Periodičnost i pupanje .................................................................................................................. 217 7.7. PROIZVODNJA KVASCA U POGONU ........................................................................................ 218 7.7.1. Priprema hranjive podloge .......................................................................................................... 218 7.7.2. Faze uzgoja .................................................................................................................................. 219 7.7.3. Bioreaktori u pogonu ................................................................................................................... 219 7.7.4. Proizvodnja kvaščeve biomase po fazama .................................................................................. 220 7.7.4.1. Proizvodnja pogonskog inokuluma .................................................................................. 220 7.7.4.2. Proizvodnja matičnog kvasca ............................................................................................ 221 7.7.4.3. Proizvodnja prodajnog kvasca .......................................................................................... 222 7.7.5. Izdvajanje i filtracija kvaščeve biomase ...................................................................................... 225
7.7.6. Miješanje, oblikovanje i pakiranje svježeg kvasca ...................................................................... 226 7.7.7. Transport kvasca .......................................................................................................................... 226 7.7.8. Trajnost svježeg kvasca ............................................................................................................... 227 7.8. SUHI AKTIVNI KVASAC ............................................................................................................... 227 7.8.1. Opće postavke proizvodnje suhog aktivnog kvasca ..................................................................... 228 7.8.2. Sojevi kvasca S. cerevisiae .......................................................................................................... 228 7.8.3. Uzgoj kvasca i kemijski sastav .................................................................................................... 228 7.8.4. Zaštita i oblikovanje..................................................................................................................... 228 7.8.5. Sušenje ......................................................................................................................................... 229 7.8.5.1 Postupci sušenja .................................................................................................................. 230 7.8.5.2 Pakiranje SAK-a ................................................................................................................. 232 7.8.5.3 Aktivnost suhog aktivnog kvasca ....................................................................................... 233 7.8.6. Mjerenje fermentacijske aktivnosti .............................................................................................. 233 LITERATURA ......................................................................................................................................... 235
POGLAVLJE 8: PRIMJENA KVASACA U PEKARSTVU ............................. 237 8.1. UVOD ................................................................................................................................................. 237 8.2. OBLICI PEKARSKOG KVASCA .................................................................................................. 238 8.2.1. Svježi pekarski kvasac ................................................................................................................. 238 8.2.2. Tekući kvasac-kvaščevo mlijeko ................................................................................................. 240 8.2.3. Suhi aktivni kvasac (SAK)........................................................................................................... 241 8.2.4. Namjenski kvasci ........................................................................................................................ 243 8.2.4.1. Kvasci za slatka tijesta-osmotolerantni kvasci ................................................................ 243 8.2.4.2 Kvasci za smrznuta tijesta .................................................................................................. 243 8.2.4.3.Ostali namjenski kvasci ...................................................................................................... 244 8.3. FERMENTACIJA ŠEĆERA U TIJESTU ...................................................................................... 244 8.3.1. Utjecaj uvjeta okoline na dizanje tijesta ...................................................................................... 247 8.3.1.1. Temperatura ....................................................................................................................... 247 8.3.1.2. pH vrijednost ...................................................................................................................... 248 8.3.2. Osmotski tlak ............................................................................................................................... 249 8.3.3. Fermentacijska aktivnost kvasca u smrznutom tijestu ................................................................ 250 8.3.3.1. Vrste kvasaca za smrzavanje ............................................................................................ 251 8.3.3.2. Priprema i fermentacija tijesta prije zamrzavanja ......................................................... 252 8.3.3.3. Postupak zamrzavanja tijesta ........................................................................................... 252 8.3.3.4. Uvjeti skladištenja smrznutog tijesta ............................................................................... 254 8.3.3.5.Odmrzavanje smrznutog tijesta ......................................................................................... 254 8.4. OKUS I MIRIS KRUHA .................................................................................................................. 255 8.4.1. Primjena kiselih startera u proizvodnji kruha .............................................................................. 256 8.4.1.1. Spontana fermentacija. ...................................................................................................... 257 8.4.1.2. Reciklacija kiselog tijesta .................................................................................................. 258 8.4.1.3. Upotreba startera definiranog mikrobnog sastava ........................................................ 258 LITERATURA ......................................................................................................................................... 262
POGLAVLJE 9: PREHRAMBENI I KRMNI KVASAC ...................................... 264 9.1. UVOD ................................................................................................................................................. 264 9.2. SASTAV KVAŠČEVE BIOMASE .................................................................................................. 265 9.2.1. Proteini kvasca ............................................................................................................................. 266 9.2.2. Vitamini ....................................................................................................................................... 267 9.2.3. Minerali....................................................................................................................................... 268
9.2.4. Lipidi ........................................................................................................................................... 273 9.2.5. Ugljikohidrati ............................................................................................................................... 273 9.3. PROIZVODNJA PREHRAMBENOG I KRMNOG KVASCA ................................................... 273 9.3.1. Proizvodnja prehrambenog kvasca .............................................................................................. 274 9.3.1.1. Proizvodnja na sirutki ....................................................................................................... 275 9.3.1.2. Specifikacija kvalitete prehrambenog kvasca ................................................................. 277 9.3.2. Proizvodnja krmnog kvasca ......................................................................................................... 278 9.3.2.1. Proizvodnja krmnog kvasca na sulfitnoj lužini ............................................................... 278 9.3.2.2. Proizvodnja krmnog kvasca na polisaharidnim sirovinama .......................................... 280 9.3.2.3. Proizvodnje kvasaca na metanolu .................................................................................... 281 9.3.2.4. Proizvodnja kvasaca na n-alkanima ................................................................................. 281 9.3.2.5. Proizvodnja lipidnih kvasaca ........................................................................................... 282 LITERATURA ......................................................................................................................................... 283
POGLAVLJE 10: PROIZVODI IZ KVASCA ..................................................... 286 10.1. UVOD ............................................................................................................................................... 286 10.2. PROIZVODI ZA POBOLJŠANJE OKUSA I MIRISA ............................................................... 287 10.2.1. Kvaščev ekstrakt ........................................................................................................................ 287 10.2.1.1 Autoliza .............................................................................................................................. 288 10.2.1.2 Plazmoliza .......................................................................................................................... 290 10.2.1.3.Kiselinska hidroliza ........................................................................................................... 291 10.2.2. Autolizati ................................................................................................................................... 292 10.2.3. Poboljšivači okusa i mirisa ....................................................................................................... 292 10.2.4. Nukleotidi u funkcionalnim proizvodima .................................................................................. 295 10.2.4.1. Prehrambeni izvori nukleotida ....................................................................................... 296 10.2.5.1. Proteinski preparati kvasca ............................................................................................ 296 10.3. ENZIMI IZ KVASCA ..................................................................................................................... 298 10.3.1. Invertaza (β-D-fruktofuranozid fruktohidrolaza) ....................................................................... 298 10.3.2. Laktaza ....................................................................................................................................... 299 10.3.3. Proteolitički enzimi .................................................................................................................... 300 10.3.4. Melibiaza (α-galaktozidaza) ...................................................................................................... 300 10.3.5. Alkoholna dehidrogenaza ......................................................................................................... 301 10.3.6. Lipaza ....................................................................................................................................... 301 10.3.7. Ostali enzimi ............................................................................................................................. 301 10.4. BOJILA: tvari za bojanje prehrambenih proizvoda .................................................................... 302 10.5. FARMACEUTSKI I KOZMETIČKI PROIZVODI ................................................................. 303 10.5.1. Kožni respiracijski faktor ........................................................................................................... 303 10.5.2. Glukan........................................................................................................................................ 303 10.5.3. Koenzim A-sintetizirajući proteinski kompleks (CoA-SPC) ..................................................... 305 10.5.4. Biosinteza S-adenozil L-metionina (SAMe) .............................................................................. 305 10.5.5. Proizvodi iz kvasca dobiveni tehnologijom rekombinantne DNA ............................................. 306 10.5.5.1. Hormoni inzulin, glukagon i somatropin ....................................................................... 309 10.5.5.2. Interferoni ....................................................................................................................... 310 10.5.5.3. Granulocitni makrofag (GM) ......................................................................................... 311 10.5.5.4. Vakcina za hepatitis-B (HBV) ......................................................................................... 311 10.5.5.5. Hirudin ............................................................................................................................. 312 10.5.5.6. Becaplermin (derivirani faktor rasta krvnih pločica) .................................................. 313 10.5.5.7. Oksidaza mokraćne kiseline ............................................................................................ 313 LITERATURA ......................................................................................................................................... 313
Poglavlje 1: SISTEMETIKA I NAZIVLJE KVASACA Slobodan Grba i Sandi Orlić
1.1. UVOD Pod pojmom sistematika, podrazumijeva se izučavanje klasifikacije živih bića i njihovih oblika te je općenito sinonim za taksonomiju, koja je stoljećima opisivala i objašnjavala različitost morfoloških oblika živih bića te njihove sastavne dijelove. Unatoč tome, povezanost i evolucija živih organizama time nije u potpunosti razjašnjena. Nakon sekvencioniranja cjelokupnog genoma kvasca Saccharomyces cerevisiae 1996. godine, kao i mnogih drugih mikroorganizama, metodama molekularne biologije i bioinformatike razrađuju se spoznaje o evoluciji i različitosti živih organizama. Isto tako su biotehnolozi, koji koriste kvasce kao proizvodne mikroorganizme, zainteresirani za sličnosti i razlike tih kvasaca, te njihova fiziološka i biokemijska svojstva. Norme u taksonomiji kvasaca i ostalih gljiva spadaju pod Međunarodnu Botaničku Nomenklaturu (Inernational Code of Botanical Nomenclature). Posljednja verzija te nomenklature prihvaćena je na 15. Međunarodnom botaničkom kongresu u Yokohami 1993. godine u Japanu (Greuter i sur., 1993). Sistemetika kvasaca se počela ozbiljno izučavati početkom 19. stoljeća kada je utvrđeno da je kvasac živi organizam i kada je svrstan u gljive. Meyen (1838.) tim mikroorganizmima, po latinskoj nomenklaturi, daje naziv Saccharomyces (gljive koje koriste šećere), uključujući u taj rod tri vrste: S. vini, S. cerevisiae, S. pomorum. Krajem 19. stoljeća Hansen uvodi metode za izolaciju čistih kultura kvasaca te daje veliki poticaj razvoju sistematike kvasaca (Hansen, 1904). Sistematiku je zasnivao na osobnim opažanjima (mjesto izolacije, tip fermentacije, oblici spora i dr.). Do kraja 19. stoljeća u literaturi je bilo opisano preko 200 vrsta, od kojih 90 vrijede još i danas. Kasnije je Guillermond (1928) razvio sistematsku shemu identifikacije kvasaca pomoću dihotomnog ključa i uveo 22 roda kvasaca. Kriterij se zasnivao na izgledu vegetativnih stanica, prisustvu, odsustvu, broju i izgledu askospora te sposobnosti asimilacije određenih šećera. Slijedili su brojni pokušaji sistematike, međutim nepotpuni. Cjelokupna klasifikacija kvasaca objavljena je u izdanjima: Lodder i Kreger-van Rij (1952), Lodder (1970), Kreger van Rij (1984). U prvoj sustavnoj taksonomiji kvasaca (Lodder i Kregervan Rij, 1952) opisano je 164 vrsta i 29 rodova kvasaca. U drugom izdanju (Lodder, 1970) opisano je 349 vrsta i 39 rodova kvasaca. Ta knjiga je bila jako cijenjena i naveliko korištena, jer je na praktičan način opisivala karakteristike pojedinih kvasaca, što je za biotehnologe bilo od izuzetne važnosti. Od tada je otkriven velik broj novih vrsta. Kasniji razvoj taksonomije zahtijevao je korištenje novih kriterija i znanstvenih spoznaja za opisivanje i klasifikaciju kvasaca. Na temelju tih novih spoznaja promijenio se naziv nekih vrsta, što se odnosi i na neke važne industrijski primjenjive kvasce. Treće izdanje, (Kreger-van Rij, 1984) sadržavalo je opis 500 vrsta i 60 rodova kvasaca. U taksonomiji kvasaca mogu se razlikovati tri perioda: prvi period obuhvaća razdoblje do 1960. godine. Identifikacija i sistematika kvasaca se zasnivala na testovima asimilacije i fermentacije šećera, asimilacije dušika, potrebe za tvarima rasta, temperaturi rasta, otpornosti prema cikloheksimidu, itd. Drugo razdoblje obuhvaća period od 1960. do 2000. godine. U tome se periodu značajno razvija sistematika mikroorganizama, te upotreba novih metoda identifikacije. Prvenstveno se to odnosi na uporabu elektoronskog mikroskopa i metode određivanja biokemijskih karakteristika (sastav ugljikohidrata i magnetska rezonancija stanične stijenke, broj izoprenskih jedinca koenzima Q,
1
citokroma, sastav masnih kiselina i slika izoenzima, sadržaj G+C koji je kod većine askomiceta ispod 50, a bazidiomiceta iznad 50 %, DNA hibridizacija, lančana reakcija polimerazom, restrikcijska analiza mitohondrijske DNA, gel elektroforeza u pulsirajućem polju, analiza pokretljivosti hibridne DNA, gel elektroforeza u denaturirajućem gradijentu, lančana reakcija polimerazom s nasumično izabranim klicama, DNA/DNA optička reasocijacija). Treći period sistematike kvasaca započinje objavom potpune sekvencije kvasca Saccharomyces cerevisiae (Gofeau i sur., 1996). Do 2003. godine identificirano je oko 750 vrsta kvasaca (Boekhout i Robert, 2003). Kako kvasci imaju veliku primjenu u biotehnologiji, sekvencioniran je značajan broj kvasaca (Dujon, 2005). Razvojem znanosti, saznanja o taksonomiji kvasaca su u mnogočemu napredovala. Danas, postoje dvije nove prihvaćene klasifikacije kvasaca: Kurtzman i Fell (1998) te Barnett, Payne i Yarow (2000). Biotehnolozi i mikolozi radije prihvaćaju onu predloženu od Kurtzman i Fella (1998). Razlika između ova dva izdanja je u pristupu autora. U izdanju Kurtzman i Fella (IV izdanje), što predstavlja nastavak nizozemske škole identifikacije, kvasci su sistematizirani i opisani po grupama filogenetski (askomiceteteleomorfne i anamorfne vrste; bazidiomicete-teleomorfne i anamorfne vrste i Prototheca - alge slične kvascima). U izdanjima Barnetta i sur. (2000, III izdanje) kvasci su samo opisani abecednim redom te su opisane njihove morfološke i fiziološke karakteristike. U daljnem tekstu obrađivati će se samo podaci vezani uz Kurtzman i Fell-a (1998), gdje jeopisano je 94 rodova i preko 700 vrsta kvasaca.
1.2. TAKSONOMIJA KVASACA Svi organizmi koji pripadaju grupi gljiva svrstani su u četiri (4) razreda: Phycomycetes (Zygomycetes), Ascomycetes, Deuteromycetes (Fungi imperfecti) i Basidiomycetes. Ta je klasifikacija učinjena prema karakteristikama vegetativnog rasta i prirodi spora, ako nastaju. Kvasce se može definirati kao askomicetne i bazidiomicetne gljive, koje se mogu razmnožavati vegetativno pupanjem ili cijepanjem (fisijom), sa ili bez stvaranja hifa ili pseudohifa i one koje imaju seksualni oblik koji se ne nalazi u plodnom tijelu. Neki se kvasci mogu razmnožavati seksualno, što dovodi do izmjene generacija s karakterisitičnim stanicama u kojima se odvija mejoza. Kod askomiceta se ta tvorevina naziva askus, gdje se stvaraju askospore, dok se kod bazidiomiceta, mjesto gdje se odvija mejoza zove bazidija, izvan koje nastaju bazidiospore. Aseksualni oblici kvasaca zovu se i nesavršeni (imperfect) ili anamorfni (npr. Cryptococcus neofommans, Candida utilis) kvasci, a seksualni oblici se nazivaju savršeni oblici (perfect) ili teleomorfni (Filobasidiela neoformans, Picia jadinii). Kombinacija oba oblika kod jedne vrste se naziva holomorfnost i u tom slučaju kvasac nosi ime po seksualnom obliku. Molekularne metode su pokazale da se askomicetni kvasci razlikuju od filamentoznih Ascomycetes (Kurtzman i Robnett, 2003), dok bazidiomicetni kvasci pripadaju u tri razreda Basidiomycetes (Urediniomycetes, Ustilaginomycetes, Hymenomycetes) (Fell i sur., 2000). Industrijski najinteresantniji kvasci svrstani su u razred Ascomycetes, a samo neki u Basidiomycetes. Zato će u ovom poglavlju biti detaljnije opisani ti razredi. Gljive iz razreda Phycomycetes, koje u određenim uvjetima pokazuju morfologiju kvasaca, rastu filamentozno pa ovdje neće biti opisane. Osnovna podjela kvasaca prikazana je u tablici 1.1.
2
Tablica 1.1. Djelomična klasifikacija industrijskih kvasaca Divizija Poddivizija Razred: Red: Porodica:
EUMYKOTA Asomycotina
Basidiomycotina Deuteromycotina
Hemiascomycetes Endomycetales Ustilaginales Sacharomycetaceae Filobasidiaceae Spermophthoraceae (oblikuje Taliospore)
Blastomycetes Cryptococcaceae Sporobolomycetaceae
1.2.1. Askomicetni kvasci Askomicetni kvasci su podijeljeni u tri razreda: Arciascomycetes, Hemiascomycetes i Euascomycetes. Karakterisitka je hemiaskomikota da im se askus ne nalazi u askokarpu, dok se kod euaskomikota nalazi unutar njega. Prijašnje su se klasifikacije unutar ove grupe zasnivale na tipu vegetatinog rasta, poliploidnosti i morfologiji askospora. U poslijednjih nekoliko godina klasifikacija kvasaca, ali i ostalih organizama, je vrlo promijenjena uvođenjem filogenetskih analiza molekularnih sekvencija. Većina se podataka, za sada, zasniva na sekvencijama rRNA gena (Kurtzman, 1994). Međutim, na osnovi filogenetskih analiza pretpostavlja se da kvasac Schizosaccharomyces pombe ne spada u razred Hemiascomycetes, koji obuhvaća najznačajnije kvasce u biotehnologiji, nego u razred Arciascomycetes. Klasifikacija i karakteristike askomicetnih kvasaca prikazani su u tablicama 1.2. i 1.3. Tablica 1.2. Klasifikacija askomicetnih kvasaca Ascomycota Razred: „Arciascomycetes“ Red: Schizosaccharomycetales Porodica: Schizoaccharomycetaceae Rod: Schizosaccharomyces Red: Taphrinales Porodica: Taphrinaceae Rod: Taphrina; Lalaria (anamorf Taphrina) Red: Protomycetales Porodica: Protomycetaceae Rod: Protomyces; Saitoella (anamorfni rod) Red: Pneumocystidiales Porodica: Pneumocytidiaceae Rod: Pneumocystis Razred: Euascomycetes Rod: Oosporidium Razred: Hemiascomycetes Red: Saccharomycetales
3
Porodica: Ascoideaceae Rod: Ascoidea Porodica: Cephaloascaceae Rod: Cephaloascus Porodica: Dipodascaceae Rod: Dispodascus; Galactomyces; Sporopachydermia; Stephanoascs; Wickerhamiella; Yarrowia; Zygoascus Porodica: Endomycetaceae Rod: Endomyces; Helicogonium; Myriogonium; Phialoascus; Trichomonascus Porodica: Eremotheciaceae Rod: Eremothecium; Coccidiascus Porodica: Lipomycetaceae Rod: Babjevia; Dipodascopsis; Lipomyces; Zygozyma Porodica: Metschnikowiaceae Rod: Clavispora; Metschnikowia Porodica: Saccharomycetaceae Rod: Saccharomyces; Kluyveromyces; Citeromyces; Pichia; Debaromyces; Dekkera; Lodderomyces; Pachysolen; Saturniaspora; Torulaspora; Zygosaccharomyces Porodica: Saccharomycodaceae Rod: Hanseniaspora; Nadsonia; Saccharomycodes; Wickerhamia Porodica: Saccharomycopsidaceae Rod: Ambrosiozyma; Saccharomycopsis Porodica: Candidaceae Rod: Aciculoconidium; Arxula; Blastobotrys; Botryzyma; Brettanomyces; Candida; Geotrichum; Kloeckera; Mxyozyma; Schizoblastosporium; Sympodiomyces; Trigonopsis
1.2.2. Bazidiomicetni kvasci Krajem 19. stoljeća Brefeld je prvi opisao klijanje bazidiospora heterobazidiomiceta. Taj razred obuhvaća rodove s odvojenim bazidijama, koje vrlo često proizlaze iz probazidija (teliospora). Međutim, klijanje bazidiospora odvija se pomoću blastokonidija ili konidija. U sistemtici Kreger van Rij-a (1984) taj je razred podijeljen u pet grupa: Sporobolomycetaceae, Cryptococcaceae, Filobasediaceae, kvasci koji tvore teliospore i kvasci koji tvore tramele (rod Tramellales). Današnja sistematika baziomicetnih kvasca prikazana je u tablici 1.3.
4
Tablica 1.3. Sistematika bazidiomicetnih kvasaca (Kurtzman i Fell, 1998) Teleomorfni rodovi Razred: Ustilaginales Porodia: Ustilaginaceae Rod: Microbotryum, Schizonella, Sorosporium, Sphacelotheca, Sporisorium, Ustilago, Ustilentyloma Razred: Sporidiales Porodica: Sporidiobolaceae Rod: Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Erythrobasidium, Kondoa, Sakaguchia Razred: Platygloeales Porodica: Cystobasidiaceae Rod: Colacoglea, Cytobasidium, Kriegeria, Mycogloea, Occultifer, Tijabodasia Raazred: Septobsidiales Porodica: Septobasidiaceae Rod: Auriculoscypha, Coccidiodiacyton, Ordonia, Septobasidium Razred: Atractiellales Porodica: Chinosphaeraceae Rod: Chinosphera, Stilbum Porodica: Atractogloeaceae Rod: Atractogloea Razred: Agaricostibales Porodica: Agaricostibaceae Rod: Agaricosilbum Razred: Graphiolales Porodica: Graphiolaceae Rod: Graphioloa Razred: Cryptobasidiale Porodica: Cryptobasidiaceae Rod: Conyodyctum, Cryptobasidium Porodica: Microstromaceae Rod: Microstroma Razred: Exobasidiales Porodica: Exobasidiaceae Rod: Brachybasidium, Dicellomyces, Exobasidellum, Exobasidium, Laurobasidium Razred: Tremellales Porodica: Sirobasidiaceae Rod: Fibulobasidium, Sirobasidium Porodica: Tremellaceae
5
Rod: Bullromyces, Itersonilia, Holtermannia, Phyllogloea, Sirotrema, Tremella, Trimorphomyces Razred: Filobasidiales Porodica: Filobasediaceae Rod: Cystofilobasidium, Filobasidiella, Filobasidium, Mrakia, Xanthophylomyces Porodica: Syzygosporaceae Rod: Christiansenia, Syzygospora Anamorfni rodovi Porodica: Sporobolomycetaceae Rod: Bensingtonia, Kurtzmanomyces, Rhodotorula, Sporobolomyces, Sterigmatomyces Porodica: Cryptococcaceae Rod: Bullera, Cryptococcus, Fellomyces, Kockovaella, Phaffia, Trichosporon, Tsuchiyaea, Udeniomyces, Hylodendron, Moniliella
1.3. KVASCI OD POSEBNOG ZNAČENJA Kvasci su izuzetno korisni mikroorganizmi za biotehnološku proizvodnju. Međutim, od 100 rodova kvasaca opisanih u zadnjoj klasifikaciji u industrijskoj praksi se primjenjuje samo dvadesetak. Zbog velike ekonomske važnosti ovi kvasci su svrstani u grupe prema industrijskoj primjeni i njihovim fiziološkim karakteristikama (Tablica 1.4). Tablica 1.4. Kvasci od posebnog značaja Rod kvasca Candida spp. Cryptococcus spp. Debaromyces spp. Kluyveromyces spp. Metschnikowia spp. Phaffia spp. Pichia spp. Rhodotorula spp. Saccharomyces spp. Schizosaccharomyces spp. Schwanniomyces spp. Yarrowia spp. Zygosaccharomyces s Torulospora
Primjena
Proizvodnja mikrobne biomase, proteina, vitamina, limunske kiseline; neki sojevi su i uzročnici kvarenja Biološki preparati protiv plijesni na voću nakon berbe; neki sojevi su i uzročnici kvarenja Biološki preparati protiv plijesni na voću nakon berbe; neki sojevi su i uzročnici kvarenja Fermentacija laktoze iz sirutke za proizvodnju etanola; izvor enzima (beta-galaktozidaze, pektinaze, lipaze) Biološki preparati protiv plijesni na voću nakon berbe; neki sojevi su i uzročnici kvarenja Koristi se za proizvodnju boje astaksantina Proizvodnja etanola i mikrobne ,proizvodnja novih lijekova i heterolognih proteina, proizvodnja etanola Izvor enzima (lipaze); neki sojevi su i uzročnici kvarenja Pekarski, pivski i vinski kvasac; izvor tvari okusa i enzima, te faktora rasta u ljudskoj prehrani i stočarstvu U tradicionalnim afričkim pićima, pivu, rumu; u procesima biološkog otkiseljavanja Proizvodnja proteinske mikrobne biomasae Proizvodnja mikrobne biomase; u proizvodnji limunske kiseline i lipaza Proizvodnja soja umaka; neki kvasci su uzročnici kvarenja Proizvodnja osmotolerantnog pekarskog kvasca, primjena u kiselim tijestima za pekarstvo
6
Industrijski najznačajniji rod je Saccharomyces, a slijede rodovi Kluyveromyces, Candida, Torulospora, Pichia, Yarovia i dr.. Razvojem sistematike mnogi kvasci od posebnog značaja su mijenali svoja imena vrsta i rodova, što je prikazano u tablici 1.5. Tablica 1.5. Razvoj roda Saccharomyces tijekom klasifikacija 1952., 1970., 1984 i 1998. 1952. 1970. 1984. 1998. S. cerevisiae S. cerevisiae var. ellipsoideus S. vini S. bayanus S. pasteurianus S. oviformis S. chevalieri S. mangimi S. fructum S. uvarum S. carlasbergensis S. logos
Rod Saccharomyces S. cerevisiae
S. bayanus
S. cavalieri S. paradoxus S. uvarum
S. cerevisiae S. cerevisiae
S. aceti S. capensis S. coreanus S. diastaticus S. globosus S. heterogenicus S. hienipiensis S. inusitatus S. italicus S. norbensis S. oleaceus S. oleaginosus S. prostoservodii
S. bayanus S. pasteurianus
S. dairensis S. exiguus S. kluyveri S. telluris S. unisporus
S. dairensis S. exiguus S. kluyveri S. telluris S. unisporus S. servazzii
S. dairensis S. exiguus S. kluyveri
S. transvaalensis
Pachytichospora transvaalensis
S. transvaalensis
S. unisporus S. servazzii S. barnetti S. spencerorum S. rossinni S. castellii
Rod Torulaspora S. delbruckii S. fermentii S. incospicus S. roseii S. saitoanus S. vafer S. pretoriensis S. kloeckerianus
T. delbruckii
T. pretoriensis T. globosa
Rod Zygosacharomyces S. bailii S. bisporus S. amurcae S. cidri S. montanus S. eupaguceus S. florentinus S. microellipsodes S. mrakii S. rouxi
Z. bailii Z. bisporus Z. cidri Z. fermentati Z. florentinus Z. microelipsoideus Z. mrakii Z. rouxi
7
Iz tablice 1.5 se jasno vidi da je tijekom razvoja sistematike došlo do značajnih promjena u razvrstavanju i nazivlju mnogih industrijski važnih kvasaca. Također se vidi da su prvih 13 vrsta kvasaca roda Saccharomyces, koji su prije bili karakterizirani kao pojedinačne vrste uglavnom po fiziološkim i morfološkim karakteristikama, prema Kregeru van Riju (1984) svrstani u jednu vrstu S. cerevisiae, uglavnom po genetičkim karakteristikama. Ipak, po novoj klasifikaciji navedena je vrsta podijeljena u četiri nove vrste (S. cerevisiae, S. bayanus, S. paradoxus i S. pastorianus). S druge strane, kvasci S. lactis, S. fragilis i S. marxianus su svrstani već 1970 u rod Kluyveromyces, uglavnom prema sporogenim karakteristikama. Međutim, može se slobodno reći da i pored svih novih spoznaja, pogotovo o genetici kvasaca, klasifikacija kvasaca nije dovršena, jer još uvijek postoje proturječna mišljenja o pojedinim čimbenicima koji utječu na nazivlje kvasaca (Broah i sur 1997; Nguyen i Gaillardian, 2005).
1.3.1. Rod Saccharomyces Kvasci iz ovog roda su vjerojatno najstariji komercijalno upotrebljavani mikroorganizmi i vrlo se često upotrebljavaju u proizvodnji hrane i pića. Najpoznatiji kvasac iz roda Saccharomyces je vrsta S. cerevisiae, čiji sojevi se danas upotrebljavaju u proizvodnji vina, piva, kruha i jakih alkoholnih pića. Njegovo svojstvo visoke fermentacijske aktivnosti i dobro podnošenje različitih ekstremnih uvjeta okoline, prisutnih u industrijskim pogonima, dovelo je do selekcije nekoliko stotina sojeva ovog kvasca s poznatim karakteristikama. U zadnjih nekoliko decenija S. cerevisiae se koristi za proizvodnju lijekova (inzulin i dr). Vrsta S. cerevisiae uključena je u grupu Saccharomyes sensu stricto kvasaca (VauganMartini i Martini, 1998). Ova grupa se sastoji od osam vrsta: S. bayanus, S. cerevisiae, S. pastorianus (asocirane s fermentacijskim procesima), S. arboricolus, S. cariocanus, S. kudariavzevii, S. mikatae i S. paradoxus (izolirane iz prirodnih staništa). Porijeklo kvasaca u fermentacijskim procesima još uvijek je nepoznato pa postoje brojne teorije. Neki istraživači su mišljenja da se ti mikroorganizmi nalaze na površini voća ili žitarica te u vrijeme fermentacijkih procesa prelazi u hranjivu podlogu, dok neki tvrde da je S . cerevisiae „udomljena“ vrsta koja je prisutna samo tamo gdje je zabilježeno djelovanje čovjeka. Prema najnovijim spoznajama točne su obje pretpostavke. Kriofilna vrsta S. bayanus izolirana je iz prirodne okoline samo u hladnim predjelima Europe i takoder je povezana s fermentacijskim procesima. Tipski soj ove vrste (CBS 380), koji je izoliran iz piva, nedavno je opisan kao hibrid i također sadrži dio jezgrinog genoma S. cerevisiae, što ukazuje na mogućnost ponovnog uspostavljanja vrste S. uvarum kao samostalne vrste ili varijeteta S. bayanus (Nguyen i Gaillardian, 2005). Naime, S. uvarum je prema fiziološkim karakteristikama bitno različit od kvasca S.cerevisiae i naziva se kvascem donjeg vrenja jer ima značajno svojstvo koagulacije i taloženja, pa na kraju fermentacije piva sjeda na dno fermentacijske posude. Slično tome, S. pastorianus (sinonim S. carlsbegiensis) je kvasac visoke fermentacijske aktivnosti pri nižim temperaturama, odgovoran za proizvodnju lager piva, iako je bio izoliran iz mošta i vina. Istraživanja su potvrdila da je ta vrsta prirodni hibrid kvasaca S. cerevisiae i S. bayanus (Yamagish i Ogata, 1998), pri čemu mitohondrijska DNA potječe isključivo iz S. cerevisiae (Piskur i sur., 1998). Divlja vrsta kvasca S. paradoxus, vrlo srodna sa S. cerevisiae, na osnovi filogenetskih analiza, proširena je po cijeloj hemisferi. Do sada su utvrđene europske, azijske i sjeverno američke populacije. Ipak, nedavno je utvrđeno da navedena vrsta predstavlja
8
dominantnu vrstu na vinogradarskom položaju Jazbina, Zagrebačkog vinogorja (Redžepovic i sur., 2002). Ostale četiri vrste ovog roda, S. cariocanus, prvi put izoliran u Brazilu, S. mikatae i S. kudriavzevii, izolirani u Japanu i S. arobricolus izoliran u Kini, do sada su pronađeni samo u prirodnim staništima. I pored toga, ima jako malo njihovih izolata (tek 2-3 svake vrste). Vrste iz roda Saccharomyces posjeduju vrlo značajne fiziološke tkarakteristike koje im omogućuju primjenu u biotehnološkim procesima jer brzo fermentiraju šećere u prisustvu i odsustvu kisika, kako bi proizvele etanol. To svojstvo im omogućuje da se prilagode na supstrate bogate šećerom i izvrše alkoholnu fermentaciju. Proces selekcije kvasaca ove grupe star je koliko i civilizacija (Mortimer i sur., 1994).
1.3.2. Rod Kluyveromyces Taksonomija roda Kluyveromyces značajno se mijenjala. Tako je K. lactis najprije opisan kao S. lactis na osnovu svojstva da može koristiti laktozu kao izvor ugljika. Kasnije je na osnovu fizioloških kriterija, kao npr. petit negativan način rasta, Crabtree efekt i nemogućnost rasta u anaerobnim uvjetima, odvojen od roda Saccharomyces i svrstan u novi rod Kluyveromyces. Kvasci ovog roda stvaraju spore nalik bubregu, sferi ili kugli. Po najnovijoj klasifikaciji (Kurtzman i Fell, 1998) ovaj rod obuhvaća 16 vrsta, od kojih su najznačajnije K. marxianus i K. lactis. Genom K. lactis je potpuno sekvencioniran što omogućuje daljnja istraživanja kako na filogentskom planu tako i u različitim biotehnološkim primjenama. Ta vrsta se koristi zbog svoje sposobnosti sinteze velikih količina enzima u proizvodnji laktaze (β-galaktozidaza). Vrste K. lactis i K marxianus, uz S. cerevisiae, imaju tzv. GRAS status sigurnih mikroorganizama (gennerally regarded as safe), pa se ti kvasci koriste u mnogim biotehnološkim procesima, koji se koriste u proizvodnji mikrobnih proteina. Kvasci iz roda Kluyveromyces dobro fermentiraju laktozu i zato se primjenjuju u proizvodnji alkohola i kvaščeve biomase iz sirutke, važnog nuzproizvoda u mljekarskoj industriji. Pri tome se znatno smanjuje BPK (Biološka potreba kisika) sirutke (do 90 %) pa se ponekad ovaj biotehnološki proces koristi kao prva faza obrade otpadnih voda mljekarske industrije. Neki kvasci ovog roda mogu metabolizirati inulin pa su interesantni za proizvodnju alkohola i kvaščeve biomase iz biljaka koje imaju rezervni ugljikohidrat inulin (slatki krumpir, kasava i jeruzalemska artičoka). Kako neki kvasci iz ovog roda posjeduju β-galaktozidaznu i inulaznu aktivnost koriste se i u proizvodnji enzima β–galaktozidaze i inulinaze. Invertaza iz K. marxianus koristi se u proizvodnji bombona i džemova, dok se β-galaktozidaza (laktaza) iz K. marxianus ili K. lactis primjenjuje za proizvodnju prehrambenih slatkih sirupa iz sirutke.
1.3.3. Rod Candida Rod Candida predstavlja vrlo heterogen skup različitih vrsta koje su se tijekom godina vrlo često mijenjale. Neke od vrsta koje se danas ubrajaju u rod Candida u prošlosti su pripadali rodovima Torula, Torulospora i Torulopsis. Kvasci iz roda Candida se često koriste u industriji, a najčešće kvasac C. utilis. Ova se vrsta najviše upotrebljava za proizvodnju kvaščeve biomase, koja se koristi u prehrani stoke. Međutim, ako se umnožava na kvalitetnim supstratima njezina biomasa se može koristiti i za prehrambene namjene. Svojstvo ovog kvasca da dobro raste na jeftinim otpadnim supstratima daje mu
9
prednost pred ostalim kvascima u industrijskoj proizvodnji mikrobnih proteina (vidi poglavlje 9: proizvodnja prehrambenog i krmnog kvasca). C. utilis ne zatjeva dodatak vitamina, može upotrebljavati amonijski i nitratni izvor dušika, različite izvore ugljika (uključujući i celobiozu i D-ksilozu) i raste na temperaturama od 30-37 oC. Tako se industrijski nusprodukti, kao što su sulfitna lužina i hidrolizati drveta često upotrebljavaju za uzgoj mikrobnih proteina pomoću C. utilis. Ova je vrsta prije bila poznata u literaturi kao kvasac Torulopsis utilis. Seksualni oblik tog kvasca je nazvan Pichia jadinii (Peppler i Stone, 1976). Osim C. utilis, u industrijskoj praksi se često koriste i drugi kvasci iz ovo roda, kao što su: C. kefyr u mliječnoj industriji; C. muilleri i C crusei u kiselim tijestima za pekarstvo; C. lipolytica u razgradnji ugljikovodika; C. shekate za fermentaciju pentoza (najčešće ksiloze) u proizvodnji bio-etanola za gorivo; C. boidinii i C metanillica u biosintezi mikrobnih proteina na metanolu; C. famata u biosintezi riboflavina.
1.3.4. Ostali kvasci od posebnog značenja Yarrowia lipolyica: Kvasac Yarrowia lipolytica se upotebljava u industriji od kasnih šesdesetih godina 20. stoljeća. Najviše se koristi u proizvodnji limunske kiseline iz ulja repice. Osim toga primjenjuje se u proizvodnji jednostaničnih proteina iz ravnolančanih parafina te heterolognih proteina (Madzak i sur., 2003). Y. lipolytica je obligatan aerob, koji se lako izolira iz različitih prehrambenih proizvoda, ponajviše sira i suhomesnatih proizvoda. Ova haplodiplobiontska, askomicetna vrsta je dimorfna i razlikuje se zbog stadija s pseudomicelijem i pravim septiranim micelijem. Upotrebljava ravnolančane ugljikovodike i različite masti kao izvore ugljika, što se koristi u različitm biotehnološkim procesima. Sojevi koji se koriste u prozvodnji limunske kiseline imaju GRAS status (generally recognized as safe) organizma. Phaffia rhodozyma: Ovaj pigmentirani, fermentativni kvasac ima značajnu primjenu u biotehnološkoj proizvodnji karotenoidnih pigmenata (najvećim dijelom astaksantin), koji daju narančasto do ružičastu boju mesu lososa i nekih školjkaša tijekom umjetnog uzgoja. Tako se hranjenjem određenih riba s dodatkom preporučenih količina kvaščeve biomase dobiva meso ljepše boje. Biosinteza astaksantina s divljim sojevima kvasca je relativno niska (oko 250 µg/g). Ipak, metodama genetičkog inženjerstva kod novih sojeva ovog kvasca poboljšan je prinos pigmenta na 1500 µg/g, pa čak i do 3000 µg/g. S ovakim prinosom ekonomski je isplativa uporaba ovog kvasca u proizvodnji astaksantina na melasi. Način uzgoja je vrlo bitan za visok prinos. Preporučuje se šaržni uzgoj u potpuno aerobnim uvjetima, s niskom koncentracijom supstrata (1,5 %), pri temperaturi od 22oC. Uporaba celobioze također je moguća, ali proces nije ekonomičan u odnosu na proizvodnju na melasi. Kako je cijena sintetskog astaksantina vrlo visoka (oko 2000 Eura/kg), biotehnološka proizvodnja ovog pigmenta postaje sve interesantnija (Ramirez i sur., 2006). Osmotolerantni kvasci: Osmotolerantni kvasci su posebno interesantni u fermentaciji slatkih tijesta. Tu se nalaze kvasci iz rodova Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Torulospora, Hansenula, Debaromyces i Candida. Kvasci iz roda Zigosaccharomyces (Z. bailii, Z. bisporus, Z. fermenti, Z. rouxi) su vrlo interesantni osmotolerantni kvasci koji mogu rasti na supstratima koji sadrže i do 60 % šećera, pa su ovi kvasci česti kontaminanti različitih voćnih sokova i sirupa. Među njima su osmotski najtolerantniji Z. rouxii, Z. bailii i Z. bisporum. Tako npr. Z. rouxii kontaminira med. Rod Torulospora posjeduje interesantne osmotolerantne kvasce. Najinteresantnija vrsta ovog roda je kvasac T. delbrueckii, koja po novoj sistemetici uključuje prijašnje kvasce iz
10
roda Saccharomyes i to S. rosei, S. vafe i S. incospicua. Ovaj kvasac se koristi u Japanu za proizvodnju pekarskog kvasca koji se primjenjuje u fermentaciji slatkih tijesta. Nedostatak ove vrste kvasca je mala veličina stanica što stvara tehnološke poteškoće pri izdvajanju kvaščeve biomase separacijom i filtracijom iz komine nakon uzgoja. Zato je učinjen diploidan oblik ovog kvasca pomoću fuzije protoplasta, čije su stanice znatno veće pa je izdvajanje tog kvasca iz komina učinkovitije (Hernandez-Lopez i sur., 2007). Osim fermentativnih karakteristika u slatkom tijestu, ovaj kvasac posjeduje i vrlo dobra kriorezistentna svojstva tijekom zamrzavanja tijesta. Rodovi Pichia i Candida su također interesantni osmotolerantni kvasci. U fermentaciji pentoznih šećera, naročito ksiloze interesantni su kvasci iz roda Pichia, a najinteresantniji je kvasac P. stipitis. S druge strane, P. farinosa tolerira visoke koncentracije NaCl-a (Onishi, 1990). Ima nekoliko kvasaca iz roda Candida koji su osmotolerantni, kao što su Candida bombi, Candida bombicola, Candida lactis-condensis i Candida magnoliae. Normalno su izolirani iz sokova i pčelinjih proizvoda, dok je C. lactis-condensis, izoliran iz kondenziranog mlijeka. Prema novoj sistematici ove vrste Candida spp. su svrstane u rod Torulopsis. Probiotički kvasci: U novije doba kvasci se sve više koriste kao probiotici. Prema definiciji probiotik je jedna ili više kultura živih mikroroganizama koji, primjenjeni u ljudi i životinja, djeluju korisno na domaćina, poboljšavajući svojstva autohtone mikroflore probavnog sustava domaćina (Šušković, 1996). Dokazano je da efikasno utječu na smanjenje pojave diareje, oboljenja od raka, stimuliranje imunog sustava, smanjenje kolesterola itd. Kao probiotici naročito se primjenjuju mliječno kisele bakterije, koje se koriste u prozvodnji jogurta i drugih mliječno kiselih napitaka, dok je uporaba kvasaca kao probiotika tek na početku. Postoji dosta studija o primjeni živih kvasaca (pivski, pekarski i prehrambeni) kao aditiva u prehrani goveda, svinja i peradi, gdje je zabilježeno poboljšanje zdravstvenog stanja životinja (Dawson, 2002). Nedavno je kvasac S. boulardii utvrđen kao mogući probiotik, koji je izoliran 1984. godine iz tropskog voća. Nešto kasnije utvrđeno je pozitvno djelovanje tog kvasca na različite uzročnike diareje, na Chronovu bolest i gastroenteritis (Sullivan i Nord, 2002). Međutim, još uvijek nije objašnjen mehanizam na koji ovaj kvasac tako uspješno pomaže u liječenju diareje. Pretpostavlja se da stimulira enzimatske aktivnosti na mukozi crijeva. Ovaj kvasac (ili varijetet po novoj klasifikaciji) podnosi vrlo niski pH od 2,5, žučne soli i vrlo se dobro prihvaća na epitelne stanice (Van der Aa Kuhle i sur., 2005). Osim kvasaca iz roda Saccharomyces i neke druge vrste kvasaca se istražuju kao potencijalni probiotici, kao što su: Debaromyces hansenii, K. marxianus, Yarrovia lipolytica, I. orientalis, koji se najčešće nalaze u jogurtima i siru. Također je potrebno spomenuti i kvasce K. marxianus,, S. cerevisiae, Zygosaccharomyces spp. i C. kefyr, koji se nalaze u zrncima kefira i kumisa, kao potencijalne probiotičke kulture. Metanofilni kvasci: Nakon otkrića, da pojedini kvasci mogu koristiti metanol kao jedini izvor ugljika u hranjivoj podlozi, interes za njima sve više raste zbog jeftine proizvodnje jednostaničnih (mikrobnih) proteina, koji se koriste za krmivo. Sahm (1977) je utvrdio 26 različitih vrsta kvasaca koji mogu metabolizirati metanol. Najznačajniji metanolotrofni kvasci su Pichia pastoris i Hansenula polymorpha. Osim njih, tu spadaju i Pichia pinus te Candida boidinii, Candida sonorensis i Candida mettanolica. U temeljnim se istražvanjima koriste kao model organizmi u istraživanju homeostaze perioksoma te asimilacije nitrata (Van der Klei i Veenhuis, 2002). Kada se ovi mikroorganizmi uzgajaju na metanolu, kao izvoru ugljika, stanice proizvode mikrotijela (peroksisome) koja sadrže enzime odgovorne za metabolizam metanola i to alkohol oksidazu, dihidroksiaceton sintazu i katalazu. Ova karakteristika je značajna za proizvodnju heterolognih proteina, kao što su: hepatitis B-vakcina, hormon inzulin, tumorski faktor nekroze, te u prozvodnji
11
želatine i drugih terapeutičkih proteina (Meyen i sur, 2008). Glavni nedostatak ovih kvasaca je prilično spori rast na metanolu. U te svrhe najčešće se primjenjuju P. pastoris i P. angusta a rijeđe H. polymorpha. Kvasci koji sintetiziraju riboflavin: Gotovo svi kvasci za svoj rast sinteitiziraju određene količine riboflavina (vitamin B2). Svojstvo sinteze većih količina ovog vitamina prvi je put utvrđeno kod vrsta Eremothecium (Ashbya) gossypii i Eremothecium ashbyi. Tijekom stacionarne faze rasta vakuole postaju žute pa se u nekim vakuolama mogu primjetiti kristali riboflavina. Na taj se način dugo proizvodio riboflavin za prehranu životinja. Nešto kasnije, istraživači su genetičkim modifikcijama i fuzijom protoplasta uspjeli dobiti sojeve kvasca Candida famata koji mogu sintetizirati i do 20 g/L riboflavina (Voronovsky i sur., 2002), pa se riboflavin proizvodi industrijski uglavnom sa sojevima kvasca C. famata. Amilolitički kvasci: Kvasci Saccharomyces diastaticus, Schwanniomyces accidentali, Sassharomycopsis fibuliger i Saccharomycopsis capsularis. mogu hidrolizirati škrob. Međutim, potrebno je istaknuti, da svojstvo hidrolize škroba nije značajna karakteristika većine industrijski važnih kvasaca, jer nemaju amilolitičku aktivnost. Kako je škrob vrlo važna sirovina u biotehnološkim procesima amilolitička aktivnost kod nekih kvasaca je vrlo interesantna, jer se škrob mora prethodno hidrolizirati do fermentabilnih šećera (glukoza, maltoza). Tako se kvasac Schwanniomyces (Endomycopsis) fibuliger primjenjuje u proizvodnji mikrobnih proteina na otpadnim škrobnim vodama zajedno s kvascem Candida utilis (Symba proces). Stoga se kvasci iz roda Schwanniomyces koriste za proizvodnju mikrobnih proteina na škrobnim sirovinama (Touzi i sur., 2004). Kvasci koji rastu na ugljikovodicima: Utvrđen je veliki broj kvasaca koji mogu rasti na ugljikovodicima kao jedinom izvoru ugljika i energije. Još 1973. godine Bos i de Bruyn su utvdili 114 vrsta i varijeteta kvasaca koji mogu rasti na ugljikovodicima. Ti kvasci pripadaju rodovima Candida, Debaromyces, Yarowia , Rhodotorula, Metschnikowia, Schwanomyces, Lodderomyces, Clavispora, Pichia,, Stephanococcus, Rhodosporidum, Sporobolomyces, Sporidiobolus i Trichosporon. Kvasci iz ovih rodova uglavnom koriste n-alkane i n-alkene, pri čemu je brzina rasta različita. Najbrži rast na ugljikovodicima imaju kvasci C. maltosa, C. lipolytica i C. tropicalis. Industrijska primjena ovih kvasaca je vrlo slaba iako postoji veliki potencijal u razgradnji alkana iz nafte. Razlog tome je loša kvaliteta proizvedene kvaščeve biomase. Naime, nakon uzgoja te izdvajanja i pranja kvaščeve biomase zaostaju na biomasi vezane tvari nepoželjne za prehranu životinja. Međutim, ovi se kvasci mogu uspješno upotrebljavati u mikrobnoj oksidaciji ulja iz okoliša i otpadnih voda pri obradi otpadnih voda. Kvasci koji metaboliziraju aromatske spojeve: Ovu interesantnu karakteristiku imaju mnogi kvasci. Tako neki kvasci iz rodova Pichia, Hansenula, Rhodotorula, Trichosporon i Candida mogu razgraditi i metabolizirati različite aromatske spojeve. Prema novim spoznajama kvasac Trichosporon cutaneum je najinteresantniji u razgradnji aromatskih spojeva. Izoliran je iz otpadnog mulja u pogonu za obradu otpadnih voda. Danas se taj kvasac primjenjuje u mnogim procesima za obradu otpadnih voda kemijske industrije, pogotovo tamo gdje se koriste aromatski spojevi (Chtourou i sur., 2004). Sinteza izvanstaničnih polisaharida: Veliki broj mikrobnih vrsta može sintetizirati izvanstanične polisaharide. Većina polisaharida koji imaju značajniju primjenu u industriji (npr. ksantan guma, dekstran) sinteitiziraju bakterije, ali neke polimere mogu sintetizirati i kvasci. Prednost kvaščevih polisaharda je u tome jer su oni nešto stabilniji i drugačije se fizikalno ponašaju u otopini. Neke vrste kvasaca iz rodova Pichia i Hansenula sintetiziraju značajne količine vanstaničnih fosfomanana iz glukoze u aerobnim uvjetima. Osim toga Aureobasidium pullulans može sintetizirati pululan.
12
Pululan predstavlja linearne polimere koji se sastoje od α 1,6 vezanih maltotrioza, s molekulskom masom od 1x104 do 4x105. Ovaj se polimer može upotrebljavati u materijalima za pakiranje hrane i kao flokulant u hidrometalurškim procesima. Također se koristi u farmaceutskoj industriji i u proizvodnji specijalinh tkanina (vlakana).
1.3.5. Kvasci uzročnici kvarenja Tijekom posljednih godina, štete nastale djelovanjem nekih kvasaca u poljoprivredno prehrambenom lancu, značajno su se povećale. Naime, potrošači zahtijevaju manje obrađene namirnice koje su zbog toga lakše podložne kvarenju. Kvasci, kao uzročnici kvarenja, prisutni su tijekom proizvodnje mesnih proizvoda, sireva, fermentiranih pića, sokova, vina i piva. Štete uzrokovane kvascima mogu se lagano predvidjeti, jer se obično događaju u proizvodima gdje je bakterijski rast ili usporen ili zaustvljen. Bez te kompeticije, kvasci će se razvijati i uzrokovati kvarenje. Proizvodi visoke kiselosti, niskog pH, s visokim masenim udjelom šećera (obično više od 10 %) ili soli (obično više od 5 % NaCl), kao i proizvodi koji se konzerviraju sa slabim organskim kiselinama (npr. sorbinska, benzojeva i octena) su podložniji kvarenju sa kvascima. Tipični simptomi kvarenja namirnica su: stvaranje plina, sluzavost i loš miris (sinteza etil-fenola). Najznačajniji prozvodi koje kvasci kvare obuhvaćaju: voće, voćne sokove, voćna pića, voćnu pulpu, koncentrate voćnih sokova, gazirana pića, salate s kiselim dresingom, šećerne sirupe, konditorske proizvode, alkoholna pića, slane i kisele umake, fermentirane mliječne i mesne proizvode, silažu i sjenažu (Deak i Beuchat, 1996). Osim toga, neki kvasci iz rodova Cryptococcus i Rhodotorula koji rastu i razvijaju se bolje od bakterija na temperaturama ispod nule, mogu pokvariti smrznuta mesa, piletinu te plodove mora. Na nekim namirnicama s visokim udjelom masti i niskom aktivnošću vode kao npr. margarin i maslac, mogu se razvijati sojevi vrste Yarrowia lipolytica. Iako različite vrste kvasaca kvare namirnice različitog podrijetla, neka se pravila mogu utvrditi. Tako Z. rouxii najčešće kvari namirnice s visokom koncentracijom šećera, D. hansenii, slane mesne proizvode, Z. bailii, proizvode konzervirane sa slabim organskim kiselinama, Y. lipolytica, proizvode s viskom koncentracijom masti, S. cerevisiae uzrokuje refermentacije, B. bruxellensis sintezu štetnih fenola (Orlić, 2005). Treba naglasiti da se broj vrsta koje uzrokuju kvarenje namirnica stalno povećava. Tako, tijekom biotehnoloških procesa proizvodnje piva i pekarskog kvasca kontaminirajuće kvasce nazivaju divljim kvascima. Ovi kvasci ne pripadaju čistim kulturama koje se koriste u biotehnološkim procesima i mogu uzrokovati značajne štete. Najčešći kontaminanti u ovim procesima su različiti sojevi vrsta S. cerevisiae i S. bayanus, nepoznatih tehnoloških svojstava. S druge strane, u proizvodnji pekarskog kvasca najčešći kontaminanti su vrste iz roda Candida i Torulopsis. Nepoželjni su jer mogu značajno smanjiti fermentacijsku aktivnost pekarskog kvasca kao proizvoda. Kontrola rasta i aktivnosti kvasaca koji uzrokuju kvarenje zahtijeva vrlo dobro shvaćanje njihove fiziologije, biokemije i genetike. Nažalost, vrlo su mala saznanja za neke vrste iz roda Sacharomyes. Čimbenici koji utječu na njihov rast i razvoj od velikog su značaja u kontroli i osiguranju kakvoće namirnica. Za većinu kvasaca, granice rasta i preživljavanja i kinetika inaktivacije za osnovne tehnološke parametre kao što su npr. temperatura, pH, koncentracija šećera i soli, nisu dobro definirane i zahtjevaju pažljiva i sustavna istraživnja (Betts et al., 1999). Međutim, razvojem novih tehnologija u proizovodnji hrane i pića pronađene su potrebne informacije za sigurnu i kontroliranu proizvodnju. Ipak, prva linija obrane u kontroli kvarenja namirnica je prevencija kontaminacije. Stoga je neophodno poznavati sve nepoželjne kvasce i one koji pod određenim uvjetima mogu izazvati nepoželjne pojave.
13
1.3.6. Patogeni kvasci Za razliku od bakterija, virusa i nekih filamentoznih gljiva, kvasci su rijeđe povezani s bolestima kod ljudi. Ljudi u prehrani konzumiraju određene količine kvaščeve biomase u velikom broju namirnica (kruh, sir, meso, povrće, voće, vino, pivo) bez ikakvog utjecaja na njihovo zdravlje. Ipak, nužno je prisjetiti se da neke bakterije (kao npr. E. coli) prije 25 godina nisu bile tako opasne za ljudsko zdravlje, dok danas predstavljalju patogene mikroorganizme visokog rizika. Vrlo je malo podataka o kvascima kao patogenim mikroorganizmima (Doyle i sur., 2006; Linton i sur., 2007). U usporedbi s ostalim patogenim mikroorganizmima, kvasci nisu agresivni patogeni, ali ipak mogu uzrokovati neke bolesti kod čovjeka (Hazen i Howell, 2003). Candida albicans (Calderone, 2002) i Cryptococcus neoformans (Casadavell i Perfect, 1999) su najpoznatiji patogeni kvasci za čovjeka, koji uzrokuju kožne, respiracijske probleme, sistemske infekcije i probleme vezane uz živčani sustav. C. albicans, odgovorna za tzv. kandidozu je najčešći patogeni kvasac. Uzrokuje različita oboljenja kao što su: ovalna mukozna membrana na ustima, zadebljanje pod noktima, primarni agens bronhitisa, te infekciju vagine. Cr. neoformans uzrokuje bolest kriptokozu, koja je atipična, a manifestira se kao glavobolja, vrtoglavica, pospanost ili konfuzija. Uglavnom, bolest je češća kod ljudi slabijeg imuniteta (HIVpozitivni i dr.), a također se pojavljuje i kod životinja. Kvasci iz roda Trichosporon takoder mogu biti patogeni. Najčešći je T. cutaneum koji uzrokuje prhut (bijelo šarenilo), površinsku infekciju i invanzivnu trihosporonozu, koja se proširuje progresivno, uključujući različite organe, kao što su pluća, bubrezi i slezena. Ove bolesti su vrlo rijetke kod ljudi normalnog imuniteta. Broj patogenih kvasaca se povećava (Georgev, 2003). Krvne infekcije su najznačajnije patološke promjene koje mogu uzrokovati kvasci. Kvasci, putem krvožilnog sustava mogu napasti skoro svaki organ u ljudskom tijelu, često s fatalnim posljedicama. Također se mogu nastaniti na koži, ušnoj šupljini, vagini i analnoj regiji (Hazen i Howell, 2003). Osim prethodno opisanih kvasaca i neke druge vrste mogu predstavljati potencijalnu opasnost za čovjeka, kao što su neke vrste iz roda Rhodotrula te kvasci Pichia anomala, Issatchnekia orientalis i Kluuyveromyces marxianus (Kremery i sur., 1999). Osim toga i najviše korišteni kvasac S. cerevisiae, takoder spada u skupinu oportunističnih patogena. U posljednjih pedesetak godina često je bio uzročnik različitih fungemija, vaginitisa i infekcija organa (Llanos i sur., 2004). Svi patogeni sojevi kvasca S. cerevisiae rastu na 42 oC, proizvode proteinaze i stvaraju pseudohife. S druge strane, kvasac S. boulardii, koji se upotrebljava kao bioterapeutski i probiotski kvasac, smatra se varijetetom S. cerevisiae (Van der Aa Kuhle i Jaspersen, 2003). Nažalost, njegova prečesta primjena kao bioterapeuskog i probiotskog proizvoda može uzrokovati pojave «fungemija» (Cassone i sur., 2003). Iako su čimbenici koji pogoduju infekcijama s kvascima uglavnom poznati, potrebna su detaljnija istraživanja da se utvrdi način i veza kvasaca i patogenosti kod čovjeka (Eaton, 2004).Veza između pojavljivanja znakova bolesti i kvasaca bila je utvrđena uglavnom na osnovi prehrane. Kad se pacijentima nije davala hrana s kvascima, simptomi bi nestali, ali bi se i vratili kad bi se u prehranu ponovno uvrstile namirnice s kvascima.
1.4. ZBIRKE KVASACA U SVIJETU Sve veći interes za izolacijom, identifikacijom i karakterizacijom kvasaca, pogotovo iz biotehnološke industrije, doveo je do povećanja izolata koji se pohranjuju u različitm kolekcijama u svijetu. Većina tih zbirki dostavlja na zahtjev (zamolbu) naručiocu tražene
14
izolate kvasaca (uz naplatu ili zamjenu, ovisno o kolekciji) radi promicanja istraživanja u svijetu. U tablici 1.7. su navedene samo najznačajnije svjetske zbirke kvasaca. Tablica 1.7. Poznate zbirke kvasaca u svijetu Drzava Oznaka zbirke Web stranica Armenija RCDM http://wdcm.nig.ac.jp/catalogue/rcdm/rcdm.htm l Belgija MUCL http://www.belspo.be/bccm Brazil CCT http://www.cct.org.br Francuska CLIB http://www.inra.fr/Internet/ Kina CGMCC http://www1.im.ac.cn/typecc/junzhong/en.html YM http://www.ynst.net.cn/kyjg/kydw/dw15/index. html Madarska NCAIM http://ncaim.kee.hu Italija DBVPG http://www.agr.unipg.it/dbvpg/ Japan IFO http://www.ifo.or.jp/index_e.html JCM http://www.jcm.riken.jp/JCM/catalogue.html Nizozemska CBS http://www.cbs.knaw.nl/index.htm Njemacka DSMZ http://www.dsmz.de Portugal PYCC http://www.igc.gulbenkian.pt/ Rusija VKM http://vkm.ru Slovacka CCY http://chem.sk/activities/yeast/ccy/ Slovenija ZIM http://bf.uni-lj.si/zt/biotech/chair/CIM.htm Spanjolska CECT http://www.uv.ess/cect/ Tajvan BCRC http://www.bcrc.firdi.org.tw/bcrc/indexe.htm Velika NCYC http://www.ncyc.co.uk Britanija SAD ATCC http://www.atcc.org NRRL http://wdcm.nig.ac.jp/wdcm1999/a_kurtzman.htm l Phaff http://www.phaffcollection.org/home.asp Podaci su preuzeti iz WFCC-MIRCEN
15
LITERATURA Barnett,J.A., Payne,R.W. and Yarrow,D. (2000). Yeasts: Characteristics and Identification. Cambridge University Press. Berbee,M.L. and Taylor,W. (2001). Systematics and Evolution, In: The Mycota VIIB, Ed. By McLaughin, McLaughin i Lemke; Springer Berlin. Betts,G.D., Linton,P. and Betteridge, R..J. (1999). Food spoilage yeasts: effects of pH, NaCl and temperature on growth. Food Control 10, 27-33 Boekhout,T. and Robert,V. (2003). «Yeast in Food».Yeast biodiversity, 1-15. Bos,P. and DeBruyn,J.C. (1973). The significance of hydrocarbon assimilation in yeast identification. Antonie van Leeuwenhoek 39(1), 99-107 Broach, J.R., Pringle,J.R. and Jones,E.W. (1997). The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics.. CSHL Press. Calderone,R.A. (2002). Candida and Candidiasis, ASM, SAD Casadevall,A. and Perfect, J.R. (1999). Cryptococcus neoformans . Mycopathologia, Springer Netherlands 147(1), 59-60. Cassone,M., Serra,P., Mondello,F., Giolamo,A., Scafetti,S., Pistella,E. and Venditti,M. (2003). Outbreak of Saccharomyces cerevisiae subtype boulardii fungemia in patients neighbouring those treated with a probiotic preparation of the organism. J Clin Micrbiol 41, 5340-43 Cavalieri,D., McGovern,P.E., Hart,D.L., Mortimer,R. and Polsinelli,M. (2003). S. cerevisiae fermentation in ancient wine. J.Mol. Evol. 57, 226-232. Chtourou,M.., Ammar,E., Nasri,M. and Medhioub,K. (2004). Trichosporon cutaneum able to use low molecular weight phenolic compounds: application to olive mill waste water treatment. J. Chem. Technol Biotechnol. 79, 869-878. Deak,T. (1995). Metods for the rapid detection and identification of yeasts in foods.Trends in Food Sci. Technol. 6(9), 187-292. Deak,T. and Beuchtat, L.R. (1996). Handbook of food spoilage yeast. CRC, USA Dawson,K.A. (2002). Not just bread and beer: new applications of yeast products in human health and nutrition. U: Lyons, T.P., Jaques F.A. (ed). Nutritional biotechnology in the food and feed industry. Notthingham University Press, Notthingham, UK . Doyle,T.C, Nawotka,K.A., Purchio,F., Akin,A.R.., Francis,K.P. and Contag,P.R. (2006). Expresion of firely luciferase in Candida albicans and its use in the selection of stable transformans. Microbial Phatogenesis 40(2), 69-81 Druvefors,U., Jonsson,N., Boysen,M.E.and Schnurer, J.(2002). Efficacy of the biocontrol yeast Pichia anomala during long-term storage of moist feed grain under different oxygen and carbon dioxide regimens. FEMS Yeast Research 2, 389-394. Dujon,B. (2005). Hemiascomycetous yeasts at the forefront of comparative genomics. Curr. Opin. Genet. Dev. 15, 614-620. Eaton,T.K. (2004). Moulds, yeasts, ascospores, basidiospores, algae and lichnes: toxic and allergic reactions. J. Nutr. Environ. Med. 14, 187-201. Fell,J.W., Boekhout,T., Fonseca,A., Scorzetti,G. and Statzell-Tallman,A. (2000). Biodiversity and systematic of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 1351-13711. Gellissen,G., Weydemann,U., Strasser,A.W., Piontek, M., Janowicz, Z.A. and Hollenberg, C.P. (1992). Progress in developing methylotrophic yeasts as expression systems. Trends Biotechnol. 10, 413417. Greuter,W. (1993). International code of botanical nomenclature. International Botanical Congress, Yokohama (Japan). Goffeau,A.,Bussey, H., Davis,R.W., Dujon,B., Feldmann,H., Galibert,F., Hoheisel,J.D., Jaeq, C., Johnson,M., Louis,E.J., Mewers,H.W., Murakami,Y., Philippsen,P.,Tettelin,H. and Oliver, S.G. (1996). Life with 6000 genes. Science 274, 563-587. Guilliermond,A. (1928). Clef Dichtotomique pour la Determinasion des Levures. Paris: Librarie de Francois. Hansen,E.C. (1904). Grundlinien zur systematic dre Saccaromyceten. Centralblatt fur Bacteriol., Parasitenkunda und Infektion Krankheiten, Zweite Ableitung, 12, 529-538. Hazen,K.C. and Howell,S.A. (2003). Candida, Cryptococcus and other yeasts of medical importance. In: Murray et al.(8thed) Manual of clinical microbiolgy, 1693-1711, ASM Press, Washington DC .
16
Hernandez-Lopez,M.A., Pallotti,C., Andreu,P., Aguilera,J., Prieto, J.A. and Rande,G,F. (2007). Characterization of Torulaspora delbruecki diploid strain with opzomized performance in sweet and frozen sweet dough. J. Food. Microbiol. 116(1), 103-110. Hocking,A.D. (2003). Foodborne microorganisms of public health significance, NSW, Sydney. Kitamoto,H.K, Ohmomo,S., Amaha,K., Nishikawa,T. and Limura,Y. (1998). Construction of Kluyveromyces lactis killer strain defective in growth on lactic acid as a silage aditive. Biotechnol.Lett. 20(8), 725-728. Kurtzman,C.P. (1994). Molecular taxonomy of the yeasts. Yeasts 10, 1727-1740. Kurtzman,C.P. and Fell,J.W. (1998). The Yeast. A taxonomy study, fourth edition,Amsterdam: Elsvier Publishers. Kurtzman,C.P.and Robnett,C.J. (2003). Phylogenetic relationships among yeasts of » complex» determined from multigene sequence analyses. Fed. Eur.Microbiol. Soc. Yeast research 3, 417-432. Kutzing,F.T. (1949). Species Algarum. Leipzig: Brockhaus. Klaenhammer,T. (2001). Probiotics and prebiotics. In: Doyle,M.P., Beuchat,L.R., Montville, T.J. (2001). Food microbiology, fundamentals and frontiers, 2nd edn., American Society for Microbiology, SAD. Kremery,V., Krupova,I., Denning,D.W. (1999.) Invasive yeast infections other than Candida spp. in acute leukemia. J. Hosp. Infect. 41, 181-194 . Kreger-van Rij,N.J.W. (1984). The Yeast. A taxonomy study, third edition, Amsterdam, Elsvier Science Publishers. Linton,C.J., Borman,A.M., Cheung,G., Holmes,A.D., Szekely,A., Palmer,M.D., Bridge,P.D., Campbell,C.K., and Johnson,E.M. (2007). Molecular identification of unusual phatogenic yeast isolates by large ribosomal subunits gene sequencing: 2 years experience at the United Kingdom Mycology reference laboratory. J.Clin. Microbiol. 45(4), 1152-11158 Llanos,R., Querol,A.,Planes, A.M.,Fernandez-Espinal, M.T. (2004). Molecular characterization of clinical Saccharomyces cerevisiae isolates and their association with non-clinical strains. Syst. Appl. Microbiol. 27, 427-435. Lodder,J. (1970). The Yeast. A taxonomy study, sec. edition. Amsterdam: North-Hollan Publishing Company. Lodder,J. and Kreger-van Rij,N.J.W. (1952). The Yeast. A taxonomy study, Amsterdam: North- Hollan Publishing Company. Meyen,J. (1838). Jahresbericht uber die Resultate der Arbeiten im Felde der physiological Botanic von dem Jahre 1837. Arch. Naturgeselschaft, zweiter Band 4, 1-186. Meyer,H.P., Brass,J., Klein,J, Wenger,J. and Mommers,R. (2008). An emmerging star for therapeutic and catalytic protein production. Bioprocess int.TWA, 10-21. McFarland,L.V. and Bernasconi,P. (1993). Saccharomyces boulardii: a review of an innovative biotherapeutic agent. Microb. Ecol. Helath. Dis. 6, 157-171 Madzak,C., Gaillardin,C., Beckerich, J.M.(2004). Heterologus protein expression and secretion in the nonconventional yeast Yarrowia lipolytica. J. Biotech . 109, 63-84. Mortimer,R.K. (2000). Evolution and variation of the yeast (Saccharomyces) genome. Genome Research 4, 403-409. Naumov,G.I. (1996). Genetic identification of biological species in the Saccharomyces sensu stricto complex. J. Indust. Microbiology 17, 295-302. Nguyen,H-V.and Gaillardin,C.(2005.) Evolutionary relationships between the former species Saccharomyces uvarum and the hybrids Saccharomyces bayanus and Saccharomyces pastorianus: Reinstatement as a distinct species. FEMS Yeast Research 5(4-5), 471-483. Nokelainen,M., Tu,H., Vuorela,A., Notbohm,H., Kivirikko,K.I.and Myllyharju,J. (2001). High level production of human type I collagen in the yeast Pichia pastoris. Yeast 18, 797-806. Orlić,S. (2005) Podrijeklo i identifikacija Brettanomyces spp. u vinu. Doktorska disertacija, Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu. Orlić,S., Pogačić,M., Jeromel,A., Karoglan,M., Kozina,B., Iacumin,L., Redžepović,S. (2008). Determination of killer character of wine yeast isolated from Istra. J. Cent. Eur. Agriculture 9 (1), 95-100. Ramirez,J., Obledo,N., Arellano,M. and Herrera,E, (2006). Astaxanthin production by Phaffia rhodozyma in a fed-batch culture uaing a low cost medium feeding. e-Gnosis 4(5), 1-9. Redžepović,S., Orlić,S., Sikora,S., Majdak,A., Pretorius,I.S. (2002) Identification and charaterization of of Saccharomyces paradoxus and Saccharomyces cerevisae strains isolated from Croatian vineyards. Lett. Appl. Microbiol. 35, 305-310 Rokas,A., Williams,B.L., King,N and Caroll,S.B. (2003). Genoma–scale approaches to resolving inconquerence i molecularphylogenies. Nature 425, 798-804.
17
Sham,H. (1977). Metabolism of methanol by yeast. In: Ghose,T.H., Fiechter,A and Blake brough,N.(eds.). Advances in Biochemican Engineering ,77-103. Springer, Berlin. Spadaro,D., Gullino,M.L. (2004). State of the art and future perspectives of biological control of postharvest fruit diseases. Int. J. Food Microbiol. 91, 185-194. Sullivan,A.and Nord,C.E. (2002): The place of probiotics in human intestinal infections. Int. J. Antimicrob. Agents 20, 313-319 . Šušković, J. (1996). Rast i probiotičko djelovanje bakterija mliječne kiseline, Disertacija, Prehrambenobiotehnološki fakultet, Sveučilišta u Zagrebu Touzi,A., Prebios,J.P., Moulin, G., Deschamps,F and Galzy,P. (2004). Production of food yeast from starchy substrates. Appl.Microbiol. Biotechnol. 15(4), 232-236. Van der Aa Kuhle,A., Skovgaard,K.and Jespersen,L. (2005). In vitro screening of probiotic propeties of Saccharomyces cerevisiae var. boulardii and food borne Saccharomyces cerevisiae strains. Int. J. Food Microbiol. 101, 29-40. Van der Klei,I..J.and Veenhuis,M. (2002). Peroxisomes: felxible and dynamic organelles. Curr Opin. Cell Biol. 14, 500-505 Van der Aa Kuhle,A. and Jespersen,L. (2003). The taxonomic position of Saccharomyces boulardii as evaluated by sequence analysis of D1/D2 domain 26SrDNA, the ITS1-5.85-ITS2 region and mitochondrial cytochrome oxidase II gene. Syst. Appl. Microbiol. 26, 564-571.. Vaughan-Martini,A.E. and Martini,A..(1998). Saccharomyces Genus Meyen ex Reess. In: Kurtzman,C.P.and Fell,J.W.,ed. The Yeast. A taxonomy study, Amsterdam: Elsvier Publishers.pp 358-371. Voronovsky,A.A., Abbas,C.A., Fayura,L.R., Kshanovska,B.V., Dmytruk,K.V., Sybirna,K.A. and Sibirny,A.A. (2002). Development of transformation systam for the flavinogenic yeast Candida famata. FEMS Yeast Research 2(3), 381-388. Wheeler,R.T., Kupiec,M., Magnelli,P., Abeijon,C. and Fink,G.R. (2003). Saccharomyces cerevisiae mutant with increased virulence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 2786-277.. Yamagishi,H. and Ogata,T. (1999). Chromosomal structuras of bottom fermenting yeast. Syst. Appl. Microbiology. 22, 341-353.
18
Poglavlje 2: GENETIKA KVASACA I PRIMJENA GENETIČKIH ISTRAŽIVANJA U OPLEMENJIVANJU INDUSTRIJSKIH SOJEVA KVASACA Ivan-Krešimir Svetec i Zoran Zgaga
2.1. UVOD Široka upotreba u tradicionalnim biotehnologijama – proizvodnji vina, piva, alkoholnih pića i pekarskog kvasca učinila je kvasac (Slika 2.1) vrlo zanimljivim, jeftinim i lako dostupnim mikroorganizmom i za temeljna znanstvena istraživanja. Tako su se za istraživanja osnovnih biokemijskih procesa koristile stanice kvaščeve biomase pa je i termin „enzim“ izveden iz grčkih riječi en zymon, što znači „u kvascu“, a istraživanja na stanicama kvasca u temeljima su razvoja mikrobiologije. Tako su prve studije koje upućuju da alkoholnu fermentaciju uzrokuju mikroorganizmi objavljene još četrdesetih godina 19. stoljeća, što je Luis Pasteur i dokazao dvadesetak godina kasnije. Metodu za dobivanje čiste kulture kvasca – temeljnog mikrobiološkog postupka, razvio je Emil Christian Hansen krajem istog stoljeća a ta je metoda omogućila korištenje čistih starter kultura bez kojih bi danas bila nezamisliva industrijska mikrobiologija. A
B
Slika 2.1. Stanice kvasca Saccharomyces cerevisiae koje se razmnožavaju pupanjem fotografirane pod svjetlosnim mikroskopom (A) i presjek stanice (B). Zanimljivo je, međutim, da je genetika dosta dugo zaobilazila kvasac kao pogodni eksperimentalni model jer je najprije bila okrenuta višim organizmima kao što su grašak i vinska mušica, a kasnije mikroorganizmima kao što je plijesan Neurospora crassa ili bakterije Streptococcus pneumoniae i Escherichia coli. Osnovni razlog zbog kojeg se kvasac činio nepogodnim za genetička istraživanja proizlazi iz karakteristika životnog ciklusa prirodnih izolata kvasaca kod kojih nakon sporulacije haploidna faza traje vrlo kratko – tek par staničnih dioba. Nakon toga dvije stanice suprotnog tipa 19
parenja međusobno se spoje (konjugiraju) dajući jednu diploidnu stanicu, s dvostrukim setom kromosoma, po jednim od svakog roditelja. Takve su stanice sada stabilnije, lakše toleriraju mutacije i druge tipove genetičkih promjena jer za svaki gen imaju još jednu, „rezervnu“ kopiju. Međutim, kod diploida je puno teže izolirati odgovarajuće mutante jer postoji vrlo mala vjerojatnost da će se istovremeno inaktivirati obje kopije nekog gena potrebnog, recimo, za biosintezu triptofana. S obzirom da prvi korak u genetičkim istraživanjima obično predstavlja izolacija odgovarajućeg mutanta ova je okolnost obeshrabrivala mikrobiologe da se pozabave genetikom kvasca. Tek četrdesetih godina prošlog stoljeća uspjelo je istraživačima iz Carlsbergovog laboratorija u Danskoj izolirati sojeve kvasca koji su se mogli razmnožavati kao stabilni haploidi. Takvi su sojevi (za koje se kasnije ustanovilo da su slučajno nosili mutaciju u jednom genu potrebnom za izmjenu tipa parenja) sada bili pogodni za jednostavnu izolaciju mutanata, a dva soja suprotnih tipova parenja (a i α) mogla su se kontrolirano križati. Ovo slučajno otkriće dovelo je do naglog razvoja genetike kvasca tako da je već sedamdesetih godina kvasac sustigao bakteriju E. coli kao, do tada, najpogodniji organizam za genetička istraživanja. Ta se pozicija još više učvrstila početkom 80-ih godina prošlog stoljeća kada su se na kvascu počele primjenjivati tehnike genetičkog inženjerstva, da bi petnaestak godina kasnije već cijeli genom kvasca bio u potpunosti sekvenciran. Kvasac je eukariotski organizam koji je danas najbolje genetički i fiziološki karakteriziran tako da još uvijek predstavlja važan model u temeljnim istraživanjima, a primjena rekombinantne DNA (rDNA) tehnologije – genetičkog inženjerstva, omogućila je korištenje kvasca kao domaćina za proizvodnju stranih (heterolognih) proteina i metabolita. Uz S. cerevisiae danas se za ekspresiju heterolognih proteina koriste i drugi kvasci, ponajprije Pichia pastoris ili u manjoj mjeri, Kluyveromyces lactis. Na koji način i u kojoj mjeri poznavanje temeljnih procesa u kvaščevoj stanici može danas doprinijeti unaprjeđenju klasičnih biotehnoloških procesa? Kruh, vino i pivo proizvode se već tisućama godina ali znanja o organizmima i metaboličkim putovima koji uzrokuju dizanje tijesta i proizvodnju alkohola počela su se akumulirati relativno nedavno. Od intuitivnih i na iskustvu zasnovanih postupaka sa stanicama kvasca počelo se sustavno provoditi pročišćavanje, selekcioniranje i oplemenjivanje industrijskih sojeva Štoviše, danas je uobičajeno da proizvođači pekarskih proizvoda, vina i piva posjeduju vlastite sojeve kvasca čime garantiraju kvalitetu gotovog proizvoda. Osim toga, u skladu sa zahtjevima tržišta, postoji stalna potreba za poboljšavanjem proizvodnih svojstava industrijski kvasaca, kako zbog što boljeg iskorištenja proizvodnog procesa, a da se pri tom ne smanji kvaliteta proizvoda, tako i zbog podizanja kvalitete proizvoda i zadovoljavanja potreba potrošača. Stoga se kvasci koji se koriste u proizvodnji kruha, vina i piva stalno genetički mijenjanju, iako potrošači najčešće toga nisu svjesni. Industrijski kvasci sve se više razlikuju od svojih prirodnih srodnika jer su najprije selekcionirani u uvjetima proizvodnog procesa, a onda ih je čovjek više ili manje precizno mijenjao u cilju poboljšavanja njihovih proizvodnih karakteristika. U tu svrhu koriste se metode klasične genetike koje uključuju sporulaciju i analizu tetrada mikromanipulacijom te kontrolirano križanje stanica kvasca, ali i nasumična mutageneza i fuzija protoplasta. Međutim, zbog specifične genetičke strukture industrijskih sojeva ovi su postupci često neučinkoviti, dugotrajni i nesigurni. Zbog toga se i ovdje s velikim očekivanjem gleda na poboljšanje genetičkih svojstava primjenom genetičkog inženjerstva, bez obzira na neke neočekivane probleme koji se javljaju kada se rad s laboratorijskim sojevima nastoji primijeniti na industrijske sojeve kvasca. Glavnu prepreku u tom smjeru još uvijek čine zakonski propisi koji znatno otežavaju korištenje genetički modificiranih organizama (uključujući i mikroorganizme) u prehrambenoj industriji. Takav restriktivni stav odražava nepovjerenje potrošača prema primjeni
20
genetički modificiranih mikroorganizama u proizvodnji hrane i pića, naročito na europskom tržištu. Zbog toga, iako već postoje mnogi primjeri uspješne primjene genetičkog inženjerstva u poboljšanju proizvodnih sojeva pekarskih, vinskih i pivskih kvasaca, velika većina tih sojeva nikada nije komercijalizirana. U slijedećim poglavljima je najprije u najkraćim crtama opisana struktura genoma i životni ciklus laboratorijskog soja kvasca Saccharomyces cerevisiae kao i tehnike koje danas stoje na raspolaganju za unošenje promjena u genom kvasca (Pregledi: Broach et al.,1997., Madhani, 2007., Svetec i Zgaga, 2007.). Nakon toga, nizom najnovijih primjera, opisana je primjena tih postupaka u unaprjeđenju genetičkih karakteristika pekarskog, pivskog i vinskog kvasca.
2.2. STRUKTURA GENOMA I ŽIVOTNI CIKLUS KVASCA 2.2.1. Genom kvasca Saccharomyces cerevisiae Kada se govori o genetičkom materijalu nekog eukariotskog organizma obično se misli na gene linearno poredane duž pojedinačnih kromosoma. Pojam „genom“ nešto je širi pojam jer uz sve gene obuhvaća i one dijelove kromosoma koji nemaju kodirajuću ulogu (na primjer, centromere ili regije između dva gena), ali i način na koji je sav taj genetički materijal organiziran. Tako kod analize genoma nije važan samo kodirajući potencijal pojedinih gena nego i njihov položaj i redoslijed na kromosomu, zajedno s regijama važnim za regulaciju njihove ekspresije. Pojam „genom“ u širem smislu proteže se i na genetičke elemente koji se ne nalaze unutar jezgre, kao što je mitohondrijska DNA ili DNA plazmida – malih kružnih molekula koje se samostalno repliciraju u stanici. Tek se je 90-ih godina prošlog stoljeća tehnologija molekularne genetike dovoljno razvila da bi se počelo razmišljati o mogućnosti da se u potpunosti opiše („pročita“) genom nekog organizma, odnosno da se odredi redoslijed svih nukleotida u cjelokupnom genetičkom materijalu. Zanimljivo je da je kvasac bio tek drugi živi organizam s potpuno određenom strukturom genoma, odmah iza znatno jednostavnije bakterije Haemophilus influenzae. Projekt sekvenciranja genoma kvasca trajao je od 1989. do 1996. godine i angažirao je više od tisuću istraživača na tri kontinenta, uz vodeću ulogu Europske unije (Dujon, 1996). Iskustva dobivena tijekom provođenja ovog projekta znatno su unaprijedila postupak sekvenciranja genoma, tako da bi se danas sličan projekt proveo za dva do tri mjeseca u jednom od specijaliziranih centara. Ukupna veličina haploidnog genoma kvasca je oko 1,2 x 107 pb (parova baza) što je otprilike tri puta više od genoma bakterije E. coli (oko 4 x 106 pb) ali i više nego 200 puta manje od ljudskog genoma (oko 3 x 109 pb). Ova količina DNA organizirana je u 16 kromosoma koji se nalaze unutar stanične jezgre. Kromosomi kvasca razlikuju se od tipičnih kromosoma viših eukariota po tome što su znatno manji i sadrže vrlo malo nekodirajuće DNA, pa nemaju pravog heterokromatina – velikih dijelova kromosoma koji ne sadrže aktivne gene. Najmanji je kromosom I, a sadrži oko 240 kb (kb - kilobaza je 1000 parova baza), dok su najveći kromosomi IV (oko1530 kb) i kromosom XII. Kromosom XII sadrži višestruko ponovljene gene za ribosomalnu RNA. Dužina jedne jedinice ponavljanja koja kodira za sve četiri rRNA molekule koje ulaze u sastav kvaščevih ribosoma je 9,1 kb, a nalazi se ponovljena oko 100 do 200 puta, s tim da se broj ponavljanja može mijenjati i tijekom klonalnog rasta. Zbog toga veličina kromosoma XII varira i između pojedinih izolata istog soja. Geni su vrlo gusto raspoređeni, tako da na intergene regije otpada samo oko 22% kromosomske DNA. Genom sadrži i pedesetak kopija transpozona Ty (pokretni genetički element) veličine oko 6,1 kb, kao i stotinjak “-elemenata” veličine 0,34 kb koji ostaju u DNA nakon transpozicije (izrezivanja, premještanja transpozona) Ty elementa. 21
Telomere koje se nalaze na krajevima kromosoma (ukupno 32, na krajevima 16 kromosoma) imaju međusobno sličnu građu, kao i 16 centromera koje osiguravaju pravilno odvajanje kromatida prilikom diobe stanica. Veći broj ishodišta replikacije nalazi se na svakom kromosomu na međusobnoj udaljenosti od oko 40 kb (www.yeastgenome.org). Pravilna i koordinirana aktivacija ovih ishodišta tijekom S-faze nužna je kako bi se cijeli kromosom replicirao prije mitoze. Na kromosome otpada manje od 80 % od ukupne količine stanične DNA, dok 15 - 20 % DNA otpada na mitohondrije jer kvasac sadrži 30 - 40 kopija mitohondrijskog genoma veličine oko 85 kb. Većina prirodnih, industrijskih i laboratorijskih sojeva kvasaca sadrži još i plazmid 2 (6,3 kb ) koji se u stanici nalazi u 50 – 100 kopija i koji se samostalno replicira predstavljajući manje od 5% ukupne DNA. Postoje i izolati bez 2 plazmida, kao i sojevi bez mitohondrija (0 sojevi). U stanici mogu biti prisutni i neki drugi genetički elementi kao što su unutarstanični dvolančani RNA virusi koji se prenose samo fuzijom stanica, a nazivaju se "killer faktori". Sojevi kvasca koji sadrže killer faktor K1 imaju dvije različite vrste dvolančanih RNA molekula od kojih jedna kodira za toksin koji se izlučuje u okoliš ali i za imunitet stanice na taj isti toksin, a druga za replikaciju i pakiranje genoma. Uz ove gene, za održavanje killer faktora u stanici potrebni su i neki geni koji se nalaze u kromosomalnoj DNA. Infekcija bioreaktora “divljim” kvascima koji posjeduju killer faktor dovodi do velikih gubitaka jer uzrokuje lizu proizvodnog soja kvasca. Premda bi se moglo pretpostaviti da se iz kompletne nukleotidne sekvence nekog genoma jednostavno može odrediti položaj i struktura svakog gena, stvarna je situacija znatno složenija , tako da se do danas još ne može odgovoriti na jednostavno pitanje – koliko kvasac ima. Naime, bioinformatičkom analizom ustanovljeno je da se može predvidjeti postojanje najviše 6607 gena odnosno, bolje rečeno „otvorenih okvira čitanja“ (ORF, od engleskog Open Reading Frame – dio DNA od start do stop kodona). Da bi se utvrdilo da neki ORF stvarno predstavlja gen, potrebno je dokazati da se on u stanici zaista eksprimira, a poželjno je i barem približno otkriti ulogu odgovarajućeg proteina u stanici. Tako je do danas sa sigurnošću utvrđeno postojanje samo oko 5800 gena, a pretpostavlja se da bi stvaran broj mogao biti oko 6000. Svakom ORF-u u kvaščevu genomu pridružena je šifra iz koje se može jednoznačno odrediti položaj tog ORF-a na nekom od 16 kromosoma. Zanimljivo je da je od ukupnog broja karakteriziranih gena samo otprilike 20-tak % kodira za enzime uključene u metaboličke procese biosinteze i razgradnje staničnih međuprodukata dok su drugi uključeni u različite regulatorne i signalne procese, izgradnju stanice i biosintezu proteina (www.yeastgenome.org).
2.2.2. Genetička nomenklatura U razvoju genetike uvijek su važnu ulogu imali odabrani eksperimentalni organizmi, podesni za davanje odgovora na točno određena, specifična pitanja. Ključnu ulogu imala je izolacija odgovarajućih mutanata, na primjer, u nekom biosintetskom putu. Na žalost, takvi su se mutanti imenovali na različiti način kod različitih organizama tako da ne postoji jedinstvena genetička nomenklatura. Kod kvasca je prihvaćeno, uz rijetke izuzetke, da se gen označava pomoću tri slova i jednog broja (podcrtani ili u kurzivu), s tim da se dominantni alel tog gena označava velikim, a recesivni malim slovima (Broach et al., 1997). Tako se gen koji kodira za funkcionalni enzim orotidin-5'-fosfat dekarboksilazu označava URA3, a nefunkcionalni, recesivni alel s ura3. Različitim mutiranim alelima može se još dodati broj koji ih točno identificira kao, na primjer, ura352. Ovaj gen, odnosno njegov točan položaj u genomu – lokus, ima sistematsku oznaku 22
YEL021W iz koje se prema prihvaćenim konvencijama može zaključiti da se radi o genu
koji se nalazi na petom kromosomu (E), na lijevoj ruci tog kromosoma (L), kao 21. gen počevši od centromere (021), a da je kodirajući lanac „gornji“ lanac (W). Stanice koje same sintetiziraju uracil pa mogu rasti bez uracila dodanog u podlogu označiti ćemo kao Ura+, a one koje ne mogu, kao Ura-. Ura- stanice mogu biti mutirane u genu URA3 ali i u bilo kojem drugom od ukupno sedam gena potrebnih za sintezu uridin-5'-trifosfata. Proteini se mogu označavati i prema nazivima odgovarajućih gena, bez kurziva, s prvim velikim slovom, a kao sufiks može se dodati slovo „p“. U slučaju orotidin-5'-fosfat dekarboksilaze to bi bilo Ura3 ili Ura3p. Posebna nomenklatura primjenjuje se za tipove parenja gdje se alel za tip parenja „a“ označava s MATa, a alel za tip parenja „α“ s MATα. Kod nekih kvasaca primjenjuju se ista pravila kao kod S. cerevisiae ali, na primjer, ura4+ označava dominantni, a ura4- recesivni alel gena koji kodira za orotidine-5'-fosfat dekarboksilazu kod kvasca Schisosaccharomyces pombe.
2.2.3. Stanični ciklus Stanični ciklusi bakterija (prokariota) i kvasaca (eukariota) znatno se razlikuju po mnogim karakteristikama. Tako npr., bakterijske kulture u eksponencionalnoj fazi rasta neprestano sintetiziraju stanične komponente, uključujući i genetički materijal, kako bi se što prije podijelile. Tako je moguće da, na primjer, stanica E. coli ima generacijsko vrijeme od oko 20 minuta, premda je za replikaciju cijelog kromosoma potrebno 40 minuta. Naime, nova replikacija započinje prije nego li je prethodna završila, tako da stanice zapravo uvijek sadrže kromosome koji su već djelomično udvostručeni. U eukariota, koji imaju genetički materijal pohranjen u jezgri u obliku više linearnih kromosoma, replikacija genetičkog materijala i stanična dioba strogo su vremenski odijeljeni procesi. Neposredno nakon diobe i odvajanja pupa od stanice majke ( Slika 2.1) obje stanice nalaze se u G1 fazi staničnog ciklusa, gdje se svaki kromosom sastoji od jedne jedine kromatide. U povoljnim uvjetima za rast stanice nastavljaju s intenzivnom metaboličkom aktivnošću koja rezultira povećanjem stanične mase i prelaskom u slijedeću fazu, u kojoj se sintetizira DNA i repliciraju kromosomi (S faza). Kada završi replikacija svaki kromosom sastoji se od dvije identične DNA molekule – dvije sestrinske kromatide, a ta se faza naziva G2 faza. Sada je stanica spremna za diobu kod koje je ključno da se genetički materijal pravilno raspodijeli u dvije nove jezgre, tako da od svakog kromosoma po jedna sestrinska kromatida segregira na suprotnu stranu stanice. Taj se proces naziva mitoza, odnosno M faza staničnog ciklusa i rezultira nastajanjem dviju stanica u G1 fazi. Pri tome kod kvasca razlikujemo stanicu majku i stanicu kćer. Ove se faze mogu pratiti pod svjetlosnim mikroskopom – stanice u G1 fazi su najprije male i okrugle da bi im se kasnije povećao volumen, dok S fazu karakterizira izbijanje pupa. U G2 fazi pup je već dobro razvijen, ali još ne sadrži genetički materijal. Genetički materijal ulazi u pup tek tijekom mitoze nakon čega se stanice odvajaju. Ukupno trajanje staničnog ciklusa kvasca jednako je generacijskom vremenu i u optimalnim uvjetima iznosi oko 90 minuta. Obično se lako može prepoznati stanica kćer koja nastaje iz pupa, jer je manja od stanice majke. Zanimljivo je da se stanica kvasca može podijeliti-pupati ograničeni broj puta (oko 30 puta, za većinu sojeva) nakon čega umire. Zbog toga se mutanti kvasca s povećanim ili smanjenim brojem staničnih dioba koriste kao model za izučavanje procesa starenja. Stanični ciklus jednak je za sve tipove stanica – haploide, diploide, pa i sojeve s većim brojem kromosoma koji se često susreću u industrijskim procesima. Zanimljivo je, međutim, da kod haploida novi pup nastaje u neposrednoj blizini prethodnog pupa (aksijalno), dok kod diploida nastaje na suprotnoj strani stanice (bipolarno). 23
U nepovoljnim uvjetima stanice kvasca iz G1 faze ulaze u fazu sa znatno smanjenom metaboličkom aktivnošću koja se naziva G0 faza. Nepovoljni uvjeti, nedostatak izvora dušika kod diploida ili nedostatak izvora ugljika kod haploida mogu dovesti do pseudohifalnog odnosno filamentoznog rasta koji podsjeća na plijesni. Pri takvom rastu stanice razgrađuju pektin što im omogućava urastanje u podlogu i predstavlja važnu prilagodbu za rast kvasca u prirodnom okolišu.
2.2.4. Sporulacija kvasca i nastanak haploidnih askospora I dok su laboratorijski sojevi kvasaca često haploidi, a industrijski triploidi, kvasac izoliran iz prirodnog staništa biti će, vjerojatno, diploid, s dvije kopije svakog pojedinačnog kromosoma. Takvi diploidi mogu za neki gen sadržavati dvije iste kopije (alela) i onda se nazivaju homozigoti, ili dvije različite, i tada se nazivaju heterozigotima za navedeno svojstvo. Izuzetak je gen MAT, koji određuje tip parenja kvasca i kod kojeg uvijek imamo dva različita alela: MATa i MATα. Naime, svaki diploid nastao je križanjem (konjugacijom) dviju haploidnih roditeljskih stanica koje moraju biti različitog tipa parenja (Slika.2.2). Diploidi imaju jedinstvenu sposobnost da se u određenim uvjetima podijele mejotičkom, a ne mitotičkom diobom tako da će iz jedne diploidne nastati četiri haploidne stanice. U diploidnoj stanici prije mejotičke diobe svaki je kromosom već repliciran, a nastale sestrinske kromatide drže se međusobno u području koje se naziva centromera. S obzirom da je svaki od šesnaest različitih kromosoma prisutan u dvije (roditeljske) kopije ukupno su za svaki kromosom prisutne četiri kromatide. Nakon mejoze svaka od te četiri kromatide završiti će u različitoj haploidnoj stanici – spori. Četiri spore nastale jednom mejotičkom diobom nalaze se jedna kraj druge unutar polisaharidne ovojnice koja se naziva ascus pa je zbog toga kvasac i svrstan u razred Ascomycotina. Askospore su otpornije na nepovoljne uvjete u okolišu od vegetativnih stanica i tek će u povoljnim uvjetima doći do razgradnje askusa, oslobađanja spora i njihova klijanja. Do sporulacije može doći samo u određenim uvjetima, u nedostatku izvora dušika i u prisutnosti nefermentabilnog izvora ugljika kao što je acetat. Glukoza inhibira sporulaciju a većina sojeva najbolje sporulira uz jaku aeraciju na prijelazu iz kasne logaritamske u stacionarnu fazu rasta. Tijekom sporulacije inducira se ekspresija oko 120 gena što ukazuje na složenost ovog procesa, a efikasnost sporulacije varira između različitih sojeva od 1-2 % pa do gotovo 100%. Osim toga, često se mogu uočiti i askusi u kojima su prisutne samo dvije ili tri spore. Vrlo su rijetki sojevi kod kojih dolazi do sporulacije odmah nakon prebacivanja na sporulacijsku podlogu i u tom se slučaju prvi askusi pojavljuju već nakon 12-14 sati. Uobičajeno je da sporulacija teče asinhrono, kroz nekoliko dana. Za laboratorijske sojeve optimalna temperatura za sporulaciju je 28 -30° C iako je primijećeno da mnogi industrijski sojevi, pa i neki prirodni izolati, bolje sporuliraju na nešto nižoj temperaturi.
2.2.5. Analiza askospora i konstrukcija sojeva klasičnim križanjem Za genetičare je sporulacija i analiza nastalih spora neobično važna. Naime, prilikom izdvajanja 16 različitih kromatida u svaku pojedinačnu sporu doći će do miješanja – rekombinacije kromatida porijeklom od različitih roditelja. Štoviše, tijekom prve faze mejoze (profaza I) homologni kromosomi će se pronaći i međusobno spariti što će omogućiti fizičku rekombinaciju između molekula DNA tako da će svaka kromatida nakon mejoze biti zapravo mozaik sastavljen od roditeljskih kromatida. Na taj način postiže se intenzivno miješanje roditeljskih svojstava tako da su sve četiri nastale spore 24
međusobno genetički različite. Pravi izazov za svakog genetičara je pronalaženje i izolacija najzanimljivijeg genotipa između velikog broja nastalih kombinacija. Razrađeni su posebni eksperimentalni postupci koji omogućavaju selektivnu izolaciju kolonija nastalih od haploidnih produkata mejoze nakon čega slijedi analiza njihovih genetičkih, fizioloških ili tehnoloških svojstava. Vrlo često izbor odgovarajućeg izolata nije moguće postići u jednom koraku nego se u nekoliko ciklusa vrši izdvajanje izabranih sojeva, njihovo međusobno križanje i ponovo, analiza spora. Taj je pristup u osnovi isti kao i kod genetičkog oplemenjivanja viših biljaka i životinja samo što znatno kraće traje, a koriste se postupci mikrobne genetike (Svetec i Zgaga, 2007). Isto tako, da bi se povećala genetička varijabilnost populacije, u genom se mogu uvoditi nasumične mutacije pomoću, recimo, ultraljubičastog svjetla ili metil metansulfonata (MMS). Takav postupak može dovesti do poboljšanja nekih svojstava, ali i uvesti neke neželjene mutacije u kvaščev genom.
Slika 2.2 Životni ciklus kvasca Saccharomyces cerevisiae. Kvasac S. ceresvisiae može se razmnožavati pupanjem u diploidnom ili haploidnom obliku. Haploidne stanice iskazuju α ili a-tip parenja dok su diplpoidne stanice a/α tipa parenja. Diploidni i haploidni stanični ciklus međusobno su povezani seksualnim ciklusom jer, u odgovarajućim uvjetima, diploidna stanica može ući u mejozu i sporulirati. Kao rezultat sporulacije nastaju četiri haploidne spore od kojih su dvije α, a dvije a-tipa parenja. Svaka od ovih spora, nakon germinacije, može ući u haploidni stanični ciklus, ili može konjugirati s drugom haploidnom stanicom suprotnog tipa parenja dajući ponovno diploidnu stanicu a/α tipa parenja. Križanje odabranih sojeva kvasca i selekcija njihovog mejotskog potomstva ima, na žalost, dosta ograničenu uporabu u industrijskoj mikrobiologiji. Naime, zbog svoje genetičke konstitucije
25
industrijski sojevi ne mogu se neposredno križati, vrlo često slabo sporuliraju, a nastale spore pokazuju nisku vijabilnost. Osim toga, poželjna svojstva obično ovise o prisutnosti većeg broja odabranih gena u stanici koji mogu nezavisno segregirati tijekom mejoze, tako da niti jedna nastala askospora nema zadovoljavajuće genetičke karakteristike. Kako bi se ipak omogućila izmjena genetičkog materijala između stanica kvasca koje se ne mogu križati stanična stjenka može se ukloniti enzimskom razgradnjom, a nastali protoplasti se fuzioniraju u otopini polietilenglikola. Štoviše, ova metoda omogućava izmjenu genetičkog materijala između različitih vrsta kvasaca koji se u prirodi ne mogu križati niti stvarati mejotičko potomstvo.
2.2.6. Konjugacija i homotalizam Sporulacijom diploidnog soja kvasca nastaju četiri haploidne stanice-spore, dvije a-tipa parenja, a dvije α-tipa parenja. Genetički, stanice različitih tipova parenja razlikuju se u strukturi lokusa MAT, koji kodira za regulatorne proteine, a može nositi informaciju MATa ili MATα. Ti regulatorni proteini biti će odgovorni za sintezu dvaju različitih signalnih polipeptida (fermomona) koji se izlučuju u podlogu: α-faktora (13 aminokiselina) ili a-faktora (12 aminokiselina, od kojih je C-terminalni cistein naknadno kovalentno modificiran). Osim toga, sintetiziraju se i različiti receptorski proteini koji se uklapaju u staničnu membranu: Ste2 u stanicama a-tipa parenja, koji specifično veže αfaktor, ili Ste3 u stanicama α-tipa parenja, koji specifično veže a-faktor (Madhani, 2007). Inaktivacija ovih receptora dovodi do sterilnosti – nemogućnosti križanja, slično kao i mutacije u dvadesetak drugih gena specifično potrebnih za konjugaciju. Vezanje feromona na receptor zapravo omogućava stanici kvasca da „osjeti“ blizinu stanice suprotnog tipa parenja što će dovesti do cijelog niza promjena u fiziologiji stanice i omogućiti konjugaciju. Među ostalim, doći će do zaustavljanja staničnog ciklusa u G1 fazi, ali i do promjene u morfologiji – izduživanja u smjeru najveće koncentracije feromona, odnosno, u smjeru stanice suprotnog tipa parenja. Nakon stvaranja fizičkog kontakta između a- i α-stanice doći će do razgradnje stanične stjenke na mjestu dodira i nakon toga, do fuzije membrana. Vrlo brzo doći će i do kariogamije – spajanja jezgara i nastanka diploidne zigote koja će se dalje vegetativno dijeliti pupanjem. Diploidna stanica više se ne može križati, ali može, za razliku od haploida, sporulirati. Laboratorijski haploidni sojevi diploidizirati će se tek kada ih pomiješamo sa nekim drugim sojem, ali suprotnog tipa parenja. Nasuprot tome, haploidni izolati iz prirode, bilo da su a- ili α–tipa parenja, najčešće će vrlo brzo spontano preći u diploid a/α tipa parenja. Ova pojava naziva se homotalizam, a susreće se i kod nekih drugih gljiva. Uzrok toj pojavi je u sposobnosti homotaličnih sojeva kvasca da mijenjaju tip parenja tijekom vegetativnog rasta. Do promjene tipa parenja dolazi samo kod haploida u G1 fazi i to samo u stanici majci; stanica koja potječe od pupa promijeniti će tip parenja tek nakon druge diobe. U svakom slučaju, promjena tipa parenja dovodi do toga da se stanice različitog tipa parenja, ali zajedničkog porijekla, nađu u neposrednoj blizini što omogućava njihovu „komunikaciju“ pomoću feromona, zaustavljanje staničnog ciklusa i konačno, konjugaciju kojom nastaje diploid. Molekularna osnova promjene tipa parenja vrlo je složena. Naime, informacija koja određuje a ili tip parenja ne nalazi se samo u MAT lokusu kromosoma III kvasca, nego i u još dva lokusa na tom istom kromosomu, samo u stanju u kojem ne dolazi do njihove ekspresije. Lijevo od MAT nalazi se HML, a desno HMLa, ispred kojih su tzv. "silencer" sekvence (prigušivači) koji ne dozvoljavaju njihovu ekspresiju. Za promjenu tipa parenja odlučujuća je ekspresija gena HO, čiji je produkt specifična nukleaza koja inducira dvolančani lom u MAT lokusu, ali ne i u lokusima HML i HMR koji su zaštićeni 26
strukturom kromatina. Heterotalični, laboratorijski sojevi kvasca zapravo su mutanti u genu HO pa zato ne mijenjaju tip parenja. U homotaličnih sojeva vrlo složena regulacija osigurava ekspresiju Ho nukleaze u G1 fazi stanice majke, ali ne i stanice kćeri. Dio MAT lokusa koji se degradira nakon uvođenja loma popravlja se prema uputi za suprotni tip parenja koja se nalazi u lokusima HML ili HMLa u procesu koji predstavlja specifičan slučaj rekombinacijskog popravka dvolančanog loma. Naime, posebni mehanizmi osiguravaju da se gotovo uvijek lom u alelu MATa popravlja prema lokusu HML , a lom u alelu MAT prema lokusu HMRa uzrokukući promjenu tipa parenja (Haber, 1998).
2.2.7. Genetičko inženjerstvo i ciljane genetičke manipulacije u kvascu Još 1978. godine nezavisnim istraživanjima u dva laboratorija uspješno je promijenjen genotip kvasca uvođenjem strane DNA postupkom koji se naziva genetička transformacija. U jednom slučaju korišten je umjetno konstruiran plazmid koji je sadržavao ishodište replikacije kvaščevog plazmida 2μ, pa se je mogao samostalno replicirati u stanici, a u drugom plazmid koji nije imao ishodište replikacije. Transformacija takvim plazmidom postiže se tek nakon ugradnje strane DNA u neki od kromosoma kvasca genetičkom rekombinacijom. Dva tipa transformirajućih molekula („vektora“), replikativni i ne-replikativni koriste se i danas za genetičke manipulacije, a ovi rezultati označili su početak primjene genetičkog inženjerstva u stanicama eukariota. Prvi problem s kojim se susrećemo prilikom transformacije kvasca je uvođenje strane DNA u stanicu (Svetec i Zgaga, 2007). U prvim eksperimentima korištena su prethodna iskustva protoplastiranja stanica kvasaca enzimskom razgradnjom stanične stjenke. U takve stanice („sferoplaste“) moguće je unijeti DNA kroz membranu u prisutnosti polietilen glikola. Ova metoda koristi se i danas, ali zahtijeva dosta opreza u radu jer su sferoplasti vrlo osjetljivi na razlike u osmotskom tlaku. Češće se koristi postupak u kojem se propusnost membrane i ulazak DNA postiže tretiranjem stanica litij acetatom, a može se koristiti i elektroporacija – izlaganje stanica kratkom impulsu struje vrlo visokog napona (oko 1700 V). Premda se sam mehanizam ulaska DNA u stanicu još dobro ne razumije ovi su postupci u rutinskoj upotrebi kod kvasca S. cerevisiae, ali za uspješnu transformaciju drugih kvasaca često je potrebno izvršiti značajne modifikacije u provođenju eksperimenata. Efikasnost transformacije ovisi u velikoj mjeri o tipu transformirajuće DNA i stotinjak puta je viša za replikativne vektore. U konstrukciji replikativnih vektora postignut je veliki napredak kada je izolirana sekvencija koja predstavlja ishodište replikacije kvaščeva kromosoma (ARS1) i posebno, nakon dodatka kvaščeve centromerne sekvence. Centromera je znatno stabilizirala takav umjetno konstruirani plazmid koji se replicira samo u S-fazi, nalazi se u 1-2 kopije u stanici i stabilno se nasljeđuje u stanicu kćer a označava se s yCp, od „yeast Centromeric plasmid“. Zanimljivo je napomenuti da se za ekspresiju stranih gena u kvasca još uvijek često koriste plazmidi s ishodištem replikacije plazmida 2μ, (označavaju se sa yEp, od „yeast Episomal plasmid“) jer se takvi vektori u stanici kvasca nalaze u 50-tak kopija, pa se može postići vrlo visoka i stabilna proizvodnja stranog proteina. Konačno, postoje i linearni vektori koji uz ishodište replikacije i centromeru sadrže i završetke eukariotskih kromosoma – telomere. Takvi se vektori nazvaju YAC, od „Yeast Artificial Chromosome“ jer se u stanici uistinu ponašaju kao 17. kromosom kvasca. Međutim, ovakvi vektori za sada nisu našli upotrebu u biotehnološkoj proizvodnji. Ako se primjenom replikativnih vektora u stanicu jednostavno može uvesti i kontrolirano eksprimirati bilo koji gen, čemu onda koriste ne-replikativni vektori koji transformiraju stanicu s niskom efikasnošću, tek nakon integracije u genom domaćina? Prvi je razlog u tome što je DNA integrirana u kromosom ipak stabilnija od ekstrakromosomalnih 27
plazmida, pravilno se nasljeđuje i može se jednostavnim križanjem uvoditi u druge sojeve. Drugi je razlog u tome što se korištenjem takvog tipa vektora mogu u samom genomu kvasca vršiti ciljane genetičke promjene, odnosno modifikacije genoma kvasca u točno željenom smjeru. Ustanovljeno je, naime, da strana DNA uvedena u kvaščevu stanicu pronalazi slične – homologne sekvencije i u njih se integrira procesom homologne integracije. Alternativno, umjesto da se jednostavno integrira, strana DNA može u jednom koraku „izbaciti“ i zamijeniti homolognu sekvenciju u kromosomu kvasca. Ovakav postupak jednog će se dana koristiti u medicini za zamjenu mutiranih gena ispravnim, ali se već danas takva „genska terapija“ rutinski koristi da bi se u genomu kvasca izvršila bilo koja genetička modifikacija. Na primjer, inaktivacijom ili pojačanom ekspresijom nekog gena mogu se vršiti ciljane promjene u metabolizmu stanice. Odabrani gen može se staviti pod kontrolu specifičnog promotora tako da samo dodatkom specifičnog induktora u podlogu dođe do njegove ekspresije ili se dodatkom odabranih signalnih sekvenci može pojačati sekrecija željenog proteina. Bilo koji gen, iz kvasca, ili iz nekog drugog organizma (tada se naziva „transgen“) može se in vitro („u epruveti“) izmijeniti na točno željeni način i nakon toga uvesti u stanicu kvasca S. cerevisiae u točno određenu lokaciju.
2.3. PRIMJENA GENETIČKOG INŽENJERSTVA U POBOLJŠANJU SVOJSTAVA PEKARSKOG, VINSKOG I PIVSKOG KVASCA Iako primjena genetičkog inženjerstva u klasičnim biotehnološkim postupcima, uključujući i postupke na bazi kvasca, još nije u potpunost iskoristila mogućnosti koje su se otvorile nema sumnje da će u skoroj budućnosti i na tom području doći do velikih promjena. Naime, potencijali ove tehnologije, zajedno sa drugim danas dostupnim postupcima, toliko su veliki da je teško zamisliti da neće naći svoju primjenu. Uz genom laboratorijskog soja kvasca do sada je (djelomično) sekvencirano i 40-tak drugih sojeva kvasca S. cerevisiae, uključujući 7 vinskih kvasaca. Tehnologijom tzv. DNA-mikropolja (DNA-microarray ili „DNA-čipovi“) može se uspoređivati ekspresija svih gena kvasca između dva različita soja, ili u različitim uvjetima uzgoja. Na taj se način može odrediti, na primjer, na koji se način određeni sastav aromatskih komponenti može vezati uz specifični genotip kvasca. Takve tehnike otvaraju mogućnost da se konstruiraju sojevi kvasca specijalno dizajnirani za pojedinu sortu grožđa ili za tip vina koje se želi dobiti. Neki primjeri ciljanih genetičkih intervencija u industrijskih kvasaca prikazani su u nastavku.
2.3.1. Struktura genoma i klasifikacija pekarskih, vinskih i pivskih kvasaca Na temelju najnovije klasifikacije (Kurtzman i Fell, 1998) svi pekarski, vinski i pivski kvasci spadaju u skupinu Saccharomyces sensu stricto u koju spadaju vrste S. cerevisiae, S. pastorianus (S. uvarum), S.paradoxus i S. bayanus. Naime, pekarski kvasac, mnoge vinske starter kulture i kvasci gornjeg vrenja piva (ale) spadaju u vrstu Saccharomyces cerevisiae. Pored vrste S. cerevisiae, u vinske kvasce spada i Saccharomyces bayanus a kvasci doljnjeg vrenja piva poznati su pod nazivom Saccharomyces carlsbergensis (Saccharomyces uvarum) koji je kasnije svrstan u kvasac Saccharomyces pastorianus. Međutim, pivski kvasac donjeg vrenja, koji ima dobro izraženo svojstvo flokulacije, naziva se u praksi i literaturi najčešće S. uvarum (poglavlje 3: Proizvodnja piva; Nguyen i Gaillardin, 2005). Kvasci gornjeg vrenja piva uglavnom su poliploidi, jako srodni laboratorijskom soju kvasca Saccharomyces cerevisiae dok je kvasac doljnjeg vrenja piva
28
(Saccharomyces uvarum) prirodni aloploid („hibrid“) nastao križanjem S. cerevisiae i neke druge vrste kvasca. Istraživanja koja su provedena s ciljem da se otkrije koja je ta druga vrsta kvasca dala su kontradiktorne rezultate. Naime, dio rezultata ukazivao je na Saccharomyces monascencis, a dio S. bayanus. Daljnja istraživanja pokazala su da su S. pastorianus (S. carlsbergensis) i S. monascencis zapravo hibridi koji već sadrže dijelove genoma S. cerevisiae te da postoji više sojeva S. bayanus od koji neki sadrže, a neki ne sadrže dijelove genoma S cerevisiae (Joubert i sur., 2000). U skladu s tim utvrđeno je da genom S. pastorianus sadrži tri tipa kromosoma. Naime, neki kromosomi potječu iz S. cerevisiae, neki potječu iz neke druge vrste koja nije S. cerevisiae, a neki su mozaički hibrid prethodna dva tipa kromosoma.
2.3.2. Potrebe za poboljšanjem proizvodnih svojstava pekarskog, vinskog i pivskog kvasca Poboljšavanje industrijskih sojeva kvasca provodi se zbog što boljeg iskorištenja sirovine, odnosno što potpunije i brže potrošnje nutrienata iz podloge, ubrzanja, pojednostavljenja i pojeftinjenja proizvodnog procesa, održavanja ili podizanja kvalitete gotovog proizvoda te proširenja asortimana odnosno razvoja novih proizvoda (Donalies i sur., 2008). Jedna od najvećih prepreka boljem iskorištenju supstrata iz industrijskih podloga je „represija glukozom“, odnosno pojava da kvasci, u prisutnosti različitih fermentabilnih šećera najprije asimiliraju glukozu. Zbog ovog fenomena cijeli proizvodni proces traje značajno duže jer kvasci počinju koristiti ostale fermentabilne šećere tek nakon što potroše glukozu. Stoga je bitan zahtjev za poboljšavanje industrijskih sojeva kvasca otklanjanje represije glukozom, odnosno konstrukcija sojeva kvasca koji će simultano koristiti sve raspoložive fermentabilne šećere. Veliko poboljšanje u iskorištenju industrijskih podloga može se postići i konstrukcijom sojeva koji mogu učinkovito asimilirati druge izvore ugljika kao što su rafinoza, melibioza, maltotrioza, dekstrini i škrob. U svrhu olakšavanja filtracije vina i piva bilo bi poželjno da kvasci mogu razgrađivati i polimere kao što su β-glukan, pektin i ksilan. Za dobro iskorištenje nutrienata iz podloge, osim asimilacije izvora ugljika, važan je zahtjev da kvasci dobro asimiliraju i raspoložive izvore dušika kao što su neke aminokiseline. U svrhu lakšeg odvajanja biomase kvasca iz vina i piva poželjno je da kvasci flokuliraju te da flokulacija započinje u točno određenoj fazi proizvodnog procesa. Sa stanovišta kvalitete, postoji potreba da kvasci proizvode veće količine komponenti koji poboljšavaju organoleptička svojstva, te da se smanji ili spriječi proizvodnja spojeva koji imaju loš utjecaj na karakteristike gotovog proizvoda. Osim toga, neki industrijski kvasci moraju biti i rezistentni na različite vrste stresa. Tako na primjer, pri proizvodnji suhog aktivnog kvasca te zamrznutih i slatkih peciva, pored ostalih proizvodnih svojstava, kvasac mora biti što otporniji na dehidrataciju, zamrzavanje i visoke koncentracije šećera.
2.3.3. Prednosti i ograničenja genetičkog inženjerstva u oplemenjivanju industrijskih kvasaca Tehnologija rekombinantne DNA, popularnog naziva genetičko inženjerstvo, omogućava ciljano unošenje preciznih promjena u genom kvasca. Ove promjene mogu uključivati uklanjanje ili inaktivaciju pojedinih kvaščevih gena kao i ugradnju gena iz srodnih ili nesrodnih organizama u kvaščev genom. Osim toga, moguće je pojačati ili smanjiti aktivnost jednog ili više gena, bilo na nivou transkripcije ili na nivou aktivnosti proteina.
29
Stoga primjena genetičkog inženjerstva uz korištenje akumuliranih znanja o ulogama pojedinih gena i metaboličkim putovima omogućava provođenje metaboličkog inženjerstva, a to otvara velike mogućnosti za poboljšavanje proizvodnih svojstava industrijskih kvasaca. (Nevoigt, 2008) Unatoč uhodanim tehnikama i dobro razrađenim strategijama, primjena genetičkog inženjerstva na industrijskim sojevima susreće se s nekim problemima i ograničenjima. Naime, metode genetičkog inženjerstva iznimno se uspješno primjenjuju na laboratorijskim sojevima kvasca Saccharomyces cerevisiae jer su oni već unaprijed dobro okarakterizirani i inače se koriste u znanstvenim istraživanjima. Na njima se rutinski primjenjuje nekoliko metoda transformacije, gotovo uvijek su heterotalični ( koji ne mijenjaju tip parenja ) haploidi ili diploidi koji imaju odgovarajuće genetičke biljege („markere“). Genetički obilježeni sojevi najčešće su auksotrofni mutanti a to znači da ne mogu rasti na podlozi u kojoj nedostaje jedna ili više tvari rasta jer im je inaktiviran ili uklonjen točno određeni gen neophodan za biosintezu neke tvari rasta (najčešće za aminokiseline leucin, histidin, arginin, triptofan, lizin, metionin te nukleinske baze uracil i adenin). Postojanje ovakvih biljega značajno olakšava konstrukciju sojeva metodama genetičkog inženjerstva jer se upravo ti geni mogu koristiti za selekciju transformanata. U praktičnom radu to znači da se pri transformaciji soja kojem nedostaje gen LEU2 (jedan od gena neophodnih za biosintezu leucina), transformirajućom DNA koja sadrži gen LEU2, transformanti mogu selekcionirati na podlozi bez leucina. Nasuprot laboratorijskim sojevima, mnogi industrijski sojevi su homotalični, poliploidni, aneuploidni ili čak aloploidni te jako slabo ili čak uopće ne sporuliraju, a imaju i nisku viabilnost spora. Poliploidnost industrijskih sojeva može značajno otežati primjenu metoda genetičkog inženjerstva jer je u svrhu izmjene nekog svojstva često potrebno modificirati sve kopije odgovarajućeg gena. Dodatni je problem i to što je industrijske sojeve teže transformirati i postići preciznu ugradnju transformirajuće DNA u kvaščev genom. Osim toga industrijski kvasci najčešće nisu auksotrofni mutanti pa se za selekciju transformanata koriste dominantni genetički biljezi kao što su geni odgovorni za rezistenciju na antibiotike (Akada, 2002). Druga je mogućnost da se kao genetički biljezi koriste geni koji omogućavaju korištenje izvora ugljika koje kvasci inače ne mogu koristiti (na primjer škrob). Metode genetičkog inženjerstva jednostavnije se provode na laboratorijskim nego na industrijskim sojevima. Zbog toga se ispravnost strategije za poboljšanje industrijskih sojeva, u pravilu, najprije eksperimentalno provjeri na laboratorijskim sojevima. Međutim, zbog genetičkih razlika između laboratorijskih i industrijskih sojeva kao i zbog razlika u laboratorijskim i industrijskim uvjetima uzgoja čak i kada se neka strategija pokaže ispravna na laboratorijskom soju, može se dogoditi da ona nije prikladna i za industrijski soj. Unatoč svim poteškoćama u radu s industrijskim sojevima kvasaca ipak već postoji niz primjera uspješne primjene metoda genetičkog inženjerstva u poboljšanju proizvodnih svojstava pekarskih, vinskih i pivskih kvasaca.
2.3.4. Strategije i primjeri poboljšanja pekarskih, vinskih i pivskih kvasaca metodama genetičkog inženjerstva 2.3.4.1. Sprječavanje represije glukozom Represija glukozom je pojava da prisutnost glukoze, čak i u jako malim koncentracijama, sprječava asimilaciju drugih fermentabilnih šećera kao što su saharoza, maltoza i galaktoza. Zbog toga kvasci počinju trošiti ostale izvore ugljika tek kada potroše glukozu što rezultira sporijim rastom kvasaca i produljenjem proizvodnog procesa. Represija 30
glukozom posebno je nepoželjna u pekarstvu i pivarstvu te pri uzgoju kvasca na melasi. Naime, najzastupljeniji šećer u tijestu i sladovini je maltoza, a u melasi saharoza ali je, u prvim fazama fermentacije, njihova asimilacija spriječena prisutnošću male količine glukoze (Donalies i sur., 2008). Iako je postignut veliki napredak u razumijevanju represije glukozom na molekularnom nivou, cijeli mehanizam još nije potpuno razjašnjen. Općenito se smatra da represija glukozom djeluje na nivou transkripcije, odnosno da prisutnost glukoze uzrokuje vezanje regulatornih proteina (represora) na regulatorne dijelove gena koji su odgovorni za korištenje drugih fermentabilnih šećera i tako sprječavaju njihovu ekspresiju. Proteinski kompleks koji uzrokuje represiju glukozom sastoji se od najmanje tri proteina, i to Mig1, Ssn6 i Tup1, za koje kodiraju geni MIG1, SSN6 i TUP1. Za vezanje cijelog kompleksa na DNA odgovoran je protein Mig1 koji prepoznaje GC-bogatu regiju DNA koja se nalazi u promotorima nekoliko gena čija je ekspresija spriječena prisutnošću glukoze (glukozaregulirani geni), a to su geni odgovorni za asimilaciju saharoze (gen SUC2), maltoze (geni MALR, MALS i MALT) i galaktoze (geni GAL1, GAL3, GAL4 i GAL5) (Klein i sur., 1998). Na temelju toga zaključeno je da bi se represija glukozom mogla spriječiti inaktivacijom ili uklanjanjem gena MIG1 iz kvaščevog genoma. Gen SUC2 kodira za enzim invertazu koji se izlučuje iz stanice te saharozu hidrolizira na glukozu i fruktozu. Inaktivacija gena MIG1 rezultirala je sprječavanjem represije glukozom gena SUC2, kako u laboratorijskim tako i u industrijskim sojevima, čime je vrijeme potrebno za početak asimilacije saharoze u prisutnosti glukoze značajno skraćeno (Klein i sur., 1998). Osim toga, utvrđeno je da i ekspresija gena MIG2 utječe na aktivnost gena SUC2 te da kvasci kojima nedostaju oba gena, MIG1 i MIG2, još bolje iskorištavaju saharozu, čak i pri jako velikim koncentracijama glukoze. Maltoza je najzastupljeniji fermentabilni šećer u sladovini i tijestu. Ovaj disaharid transportira se u stanicu aktivnim transportom pomoću maltoza permeaze te se djelovanjem maltaze hidrolizira na dvije molekule glukoze. Tri gena odgovorna za metaboliziranje maltoze (MAL-geni) nalaze se u takozvanom MAL-lokusu, a to su MALR, MALT i MALS. Gen MALR kodira za regulatorni protein koji aktivira gene MALT i MALS, gen MALT kodira za maltoza permeazu, a gen MALS za enzim maltazu. Inaktivacijom gena MIG1 spriječena je represija MAL-gena glukozom samo u laboratorijskim sojevima dok je, u nekoliko industrijskih poliploidnih sojeva, represija glukozom spriječena samo za korištenje saharoze, ali ne i maltoze. Osnovna razlika u regulaciji gena SUC2 i MAL-gena je u tome što korištenje saharoze ne zahtjeva aktivaciju gena SUC2 prisutnošću saharoze dok MAL-geni zahtijevaju i prisutnost maltoze kao induktora. S druge strane, dokazano je da inaktivacija gena MIG1, čak i u poliploidnim sojevima, rezultira jačom ekspresijom gena gena MALS i MALT pa se čini da je u ovim sojevima aktivnost proteina maltoza permeaze inhibirana glukozom. Međutim, još uvijek nije jasno zašto inaktivacija gena MIG1 ima različiti učinak u laboratorijskim i industrijskim sojevima (Ostergaard i sur, 2000). Čini se da je jedina razlika u tome što su industrijski sojevi poliploidi pa sadrže više različitih MAL-lokusa, dok laboratorijski sojevi sadrže samo jedan. Kao strategija za otklanjanje represije glukozom MAL-gena predloženo je da se geni MALS i MALT stave pod regulaciju jačeg promotora što bi rezultiralo njihovom pojačanom ekspresijom. Galaktoza je prisutna u melasi i sirutki, a u stanicu kvasca ulazi zahvaljujući galaktozapermeazi za koju kodira gen GAL2 te se kasnije konvertira u glukoza-6-fosfat (Leloirov put) pomoću enzima za koje kodiraju geni GAL1, GAL7, GAL10 i GAL5, a za regulaciju ekspresije ovih gena odgovorna su najmanje tri regulatorna proteina, i to Gal3, Gal4, i Gal80. Slično regulaciji MAL-gena, asimilacija galaktoze sprječava se prisutnošću glukoze i aktivira prisutnošću galaktoze u odsutnosti glukoze. Geni GAL1, GAL3, GAL4 i
31
GAL5 reprimirani su u prisutnosti glukoze posredovanjem proteina Mig1. Protein Gal4 je odgovoran za aktivaciju transkripcije GAL-gena u prisustvu galaktoze, a protein Gal80 sprječava djelovanje proteina Gal4, odnosno aktivaciju GAL-gena, u odsutnosti galaktoze. Sa stanovišta iskorištenja galaktoze u industrijskim podlogama postoje dva problema, a to su represija glukozom i jako sporo metaboliziranje galaktoze (bitno sporije od asimilacije glukoze), čak i u potpunoj odsutnosti glukoze. Inaktivacija gena MIG1 rezultira samo blagim uklanjanjem represije glukozom ali inaktivacija gena MIG1 i GAL80 rezultira stalnom ekspresijom GAL-gena neovisno o prisutnosti glukoze. Osim toga, problem spore asimilacije galaktoze, čak i kad nema represije glukozom, riješen je pojačanom ekspresijom gena PMG2 čime je protočnost Leloirovog puta povećana za 70 % (Bro i sur., 2005). Nedavno je predloženo da u represiji glukozom posreduju inozitol i fosfatidil inozitol jer povećana količina fosfatidil inozitola može uzrokovati fosforilaciju proteina Mig1 što uzrokuje njegovu translokaciju u citoplazmu uzrokujući represiju glukozom (Chi i sur., 2004). Ovaj mehanizam još nije potpuno razjašnjen, ali možda može pružiti nove mogućnosti u sprječavanju represije glukozom, odnosno bolju asimilaciju ostalih fermentabilnih šećera. 2.3.4.2. Asimilacija rafinoze, melibioze i maltotrioze Industrijske podloge često sadrže oligosaharide rafinozu, melibiozu i maltotriozu koje kvasci jako slabo ili uopće ne mogu koristiti kao izvor ugljika. Tako na primjer, trisaharid rafinoza može činiti do 8 % svih šećera u melasi, a maltotrioza 15 do 20 % svih šećera u sladovini. Rafinoza se djelovanjem invertaze (protein Suc2) cijepa na melibiozu i fruktozu, a cijepanjem melibioze pomoću melibiaze, za koju kodira gen MEL1, nastaje glukoza i galaktoza. Međutim, iako se gen MEL1 nalazi u genomu kvasca Saccharomyces pastorianus (kvasci doljnjeg vrenja piva) većina pekarskih kvasaca (Saccharomyces cerevisiae) ovaj gen nemaju. Osim toga, gen MEL1 također je inhibiran prisutnošću glukoze. Stoga je pekarski kvasac koji učinkovito metabolizira melibiozu konstruiran ugradnjom gena MEL1 u genom kvasca S. cerevisiae, a represija glukozom spriječena je inaktivacijom gena MIG1 i GAL80.(Rønnow i sur., 1999) Maltotriozu kvasci počinju koristiti tek u kasnijim fazama fermentacije sladovine, a pojačana ekspresija jednog od gena koji kodiraju za protein koji omogućuju njen ulazak u stanicu rezultirala je značajnim povećanjem potrošnje maltotrioze. 2.3.4.3. Hidroliza škroba i dekstrina Škrob je najzastupljeniji ugljikohidrat u tijestu, a sastoji se od amiloze (molekule glukoze povezane α-1,4 glikozidnim vezama) i amilopektina koji osim α-1,4, sadrži i α-1,6 glikozidne veze. U sladu prilikom proizvodnje sladovine dekstrini nastaju djelomičnom hidrolizom škroba djelovanjem amilaza iz sjemena žitarica, u sladovini čine oko 25 % svih ugljikohidrata, a njihova prisutnost u pivu važna je zbog punoće okusa. S druge strane, potpunija hidroliza dekstrina neophodna je pri proizvodnji niskokaloričnog piva. Međutim, pekarski i pivski kvasci ne proizvode enzime kao što su α-amilaza (cijepa α-1,4 glikozidnu vezu) i izoamilaza (cijepa α-1,6 glikozidne veze) (Ostergaard i sur., 2000), pa se za potpuno ošećerenje često dodaju enzimski preparati α-amilaze. Tako se u proizvodnji niskokaloričnog piva dodaje amiloglukozidaza iz plijesni Aspergillus niger. Klasičnim genetičkim metodama najprije je konstruiran hibrid između pivskog kvasca i kvasca Saccharomyces diastaticus koji proizvodi i izlučuje amiloglukozidazu u okolni medij. Međutim, dobiveni hibridi naslijedili su i gen POF1 iz S. diastaticus koji je
32
odgovoran za dekarboksilaciju ferulične kiseline uzrokujući pojavu nepoželjne arome (fenolni miris). Zbog toga je odlučeno da se samo gen za amiloglukozidazu iz S. diastaticus (gen STA2) metodama genetičkog inženjerstva ugradi u genom pivskog kvasca te je ovako dobiven pivski kvasac koji ima amilolitičku aktivnost. Na žalosti, glukoamilaza za koju kodira gen STA2 ima samo α-1,4, ali ne i α-1,6 glikozidaznu aktivnost. Zbog toga je u daljnjim istraživanjima u pivskom kvascu eksprimirana amilaza iz plijesni Aspergillus niger koja ima obje aktivnosti. Međutim, nedostatak amiloglukozidaze iz Aspergillus niger je njena visoka termostabilnost te ona ostaje aktivna i nakon pasterizacije te pivo tijekom skladištenja može postati slatko zbog naknadne razgradnje dekstrina. Zgog toga je konačno konstruiran i pivski kvasac koji sadrži gen GAM1 iz kvasca Schwanniomyces occidentalis koji kodira za amiloglukozidazu koja se može inaktivirati pasterizacijom (Donalies i sur., 2008). Ovaj primjer ilustrira dio problema s kojim se susreću industrijski mikrobiolozi u oplemenjivanju proizvodnih sojeva primjenom genetičkog inženjerstva. Pekarski kvasci koji mogu razgrađivati škrob konstruirani su sličnom strategijom, a konstruiran je i amilolitički pivski kvasac S. pastorianus koji zahvaljujući genu za αamilazu iz Saccharomycopsis fibuligera može koristiti škrob kao jedini izvor ugljika (Nieto i sur., 1999). 2.3.4.4. Hidroliza β-glukana, pektina i ksilana Stjenka stanica ječma sadrži polisaharid β-glukan koji otežava filtraciju stvaranjem gela, a može uzrokovati i zamućenje piva. Ovaj polisaharid hidrolizira endo-β-glukanaza iz ječma ali ona je izrazito termolabilna te brzo gubi aktivnost tako da hidroliza β-glukana nikad nije potpuna. Zaostali β-glukan može se hidrolizirati dodatkom β-glukanaze iz nekog drugog organizma, ali bi se mogao hidrolizirati i ekspresijom odgovarajućeg gena u pivskom kvascu. Zbog toga je u kvascu eksprimirana β-glukanaza iz bakterije Bacillus subtilis, ali se jako mali dio sintetiziranog enzima izlučivao van stanice, u podlogu. Da bi se povećala sekrecija enzima u medij ovaj gen za β-glukanazu dalje je fuzioniran s regulatornim i signalnim dijelom gena za α-faktor koji kvasci izlučuju u okolinu. Ovakav hibridni protein zadržao je enzimsku aktivnost i izlučivao se van stanice što je rezultiralo i smanjenjem količine β-glukana u sladovini tijekom fermentacije (Donalies i sur., 2008). Pored ovog primjera konstruirano je još nekoliko pivskih kvasaca koji uspješno hidroliziraju glukan i tako olakšavaju filtraciju piva i sprječavaju zamućenje gotovog proizvoda. Polisaharidi pektin, ksilan i glukan otežavaju bistrenje vina, a potječu iz grožđa ili nastaju djelovanjem mikroorganizama pa se zbog toga u mošt često dodaju enzimi koji hidroliziraju ove polisaharide, ali konstruirani su i vinski kvasci koji proizvode odgovarajuće hidrolitičke enzime. 2.3.4.5. Korištenje izvora dušika Problem u iskorištenju izvora dušika pri proizvodnji piva proizlazi iz činjenice da je najzastupljenija aminokiselina u sladovini prolin, a upravo nju kvasac gotovo uopće ne asimilira tijekom fermentacije. Za ulazak prolina u stanicu kvasca odgovorna je prolinpermeaza za koju kodira gen PUT4. Ciljana modifikacija ovog gena rezultirala je većom stabilnošću prolin-permeaze te je tako konstruiran pivski kvasac koji uspješno asimilira prolin, bez ikakvog negativnog utjecaja na kvalitetu piva. Što bolje iskorištenje izvora dušika važno je i u vinarstvu jer u moštu, u usporedbi s izvorima ugljika, postoji manjak izvora dušika. Najzastupljenije aminokiseline u moštu su prolin i arginin (čine 30 do 65 % svih aminokiselina) ali ih kvasci jako neučinkovito asimiliraju tijekom fermentacije.
33
Značajno poboljšanje u asimilaciji ovih aminokiselina, te veća proizvodnja biomase i ugljičnog dioksida postignuta je uklanjanjem kvaščevog gena URE2 koji kodira za represor gena PUT1 (prolin permeaza) i PUT2 (pirolin-5-karboksilat dehidrogenaza) (Salmon i Barre, 1998). 2.3.4.6. Flokulacija vinskih i pivskih kvasaca Flokulacija je reverzibilna agregacija stanica kvasca pri čemu nastaju flokule (pahulje), a poželjna je u vinarstvu i pivarstvu jer olakšava odvajanje biomase kvasca iz proizvoda. Međutim, mnogi industrijski sojevi kvasca nedovoljno ili čak uopće ne flokuliraju. Osim toga, jako je važno da flokulacija započne u točno određenoj fazi fermentacije jer prekasna flokulacija otežava uklanjanje biomase, dok prerana flokulacija uzrokuje raniji prekid fermentacije što rezultira lošom aromom. Zna se da flokulacija pivskih kvasaca započinje ulaskom u stacionarnu fazu rasta premda sam proces flokulacije još nije potpuno razjašnjen. Poznato je da na započinjanje flokulacije utječu mnogi vanjski faktori kao što su koncentracija etanola, temperatura, pH, osmotski stres, dostupnost nutrienata, faza rasta i gustoća stanica te kalcijevi i cinkovi ioni. Geni koji utječu na flokulaciju kvasca nazivaju se FLO-geni, a kodiraju za membranske glikoproteine koji su poznati pod nazivom flokulini. Neflokulirajući vinski, pivski i laboratorijski kvasci nakon ugradnje gena FLO1 i FLO5 dobivaju sposobnost flokulacije. Međutim, stalna ekspresija gena FLO1 rezultirala je preranom flokulacijom pa je ekspresiju ovog gena bilo potrebno regulirati tako da započne tek u stacionarnoj fazi rasta. Zbog toga je regulatorna regija gena FLO1 zamijenjena regulatornom regijom gena HSP30, jer je prethodno utvrđeno da se taj gen eksprimira samo u stacionarnoj fazi tijekom vinske fermentacije. Na ovaj način konstruiran je laboratorijski soj kvasca koji flokulira na kraju fermentacije, ali još nije potvrđeno da li je ova strategija uspješna i u industrijskim uvjetima (Donalies, 2008). 2.3.4.7. Smanjenje proizvodnje diacetila Prisutnost diacetila nepoželjna je u pivu jer čak i u jako niskim koncentracijama uzrokuje aromu po maslacu. Ovaj diketon nastaje neenzimskom oksidativnom dekarboksilacijom α-acetolaktata (međuprodukta u biosintezi valina; Sl. 2.3), a njegova prisutnost u mladom pivu glavni je razlog dugotrajne sekundarne fermentacije pri proizvodnji lager piva jer se on tada metabolizira do acetoina i 2,3-butandiola. Zbog toga postoji potreba za smanjenjem biosinteze diacetila jer bi to omogućilo skraćenje procesa proizvodnje lager piva. Strategija za smanjenje koncentracije diacetila osniva se na činjenici da postoje bakterijski geni koji kodiraju za acetolaktat dekarboksilazu (ALDK). Ovaj enzim katalizira dekarboksilaciju α-acetolaktata u acetoin i tako sprječava oksidativnu dekarboksilaciju u diacetil (Sl. 1). Stoga se enzimski preparat bakterijske ALDK dodavao u sladovinu, ali to je bilo preskupo. Zbog toga je gen za ALDK iz različitih bakterija (Enterobacter aerogenes, Klebsiella terrigena, Lactococcus lactis i Acetobacter aceti) ugrađen u genom kvasca što je značajno smanjilo proizvodnju diacetila te je s tog stanovišta sekundarna fermentacija postala nepotrebna. Nedostatak ove strategije je u tome što kvasci koji eksprimiraju ALDC, zbog nedostatka α-acetolaktata u stanici, postaju auksotrofi za valin, leucin i izoleucin pa unatoč prisutnosti ovih aminokiselina u podlozi znatno slabije rastu. Zbog toga je gen za ALDC fuzioniran sa dijelom gena goji kodira za α-faktor pa se nastali fuzionirani protein izlučivao van stanice i u podlozi dekarboksilirao α-acetoacetat u acetoin. Ovim pristupom postignuto je značajno
34
smanjenje koncentracije diacetila, a kvaščevi sojevi nisu bili auksotrofi za valin, leucin i izoleucin (Donalies, 2008).
Slika 2.3. Tvorba diacetila u kvasca Saccharomyces cerevisiae Diacetil nastaje neenzimskom oksidativnom dekarboksilacijom α-acetolaktata, a to se pože sprječiti ekspresijom acetolaktat dekarboksilaze (ALDK) koja α-acetolaktat prevodi u acetoin. Prikazani su geni čijom ekspresijom nastaju enzimi koji kataliziraju odgovarajuće biokemijske reakcije. Bilo je i pokušaja da se biosinteza diacetila smanji bez upotrebe bakterijskih gena. U tu svrhu iz genoma kvasca uklonjen je gen ILV2 koji kodira za acetolaktat sintazu pa ne nastaje α-acetolaktat (Sl. 2.3) ali je i takav kvasac auksotrof za valin, leucin i izoleucin. U cilju da se smanji proizvodnja α-acetolaktata, koji se konvertira u diacetil, a da pritom kvasci ne postanu auksotrofni mutanti konstruirano je i selekcionirano nekoliko sojeva koji imaju istovremeno smanjenu aktivnost gena ILV2 ali i dobra pivarska svojstva. Osim toga, količina diacetila u pivu mogla bi se smanjiti učinkovitijom konverzijom αacetolaktata u α,β-dihidroksiizovalerat i α-ketoizovalerat jer bi se tada sprječila akumulacija i spontana konverzija α-acetolaktata u diacetil (Sl.2.3). S tom svrhom pojačana je ekspresija kvaščevih gena ILV3 i ILV5 te je ustanovljeno da pojačana ekspresija gena ILV5 koji kodira za reduktoizomerazu zaista rezultira smanjenom proizvodnjom diacetila (Mithieux i Weiss, 1995). 2.3.4.8. Optimizacija proizvodnje spojeva koji sadrže sumpor U vinu i pivu postoji nekoliko hlapivih sumpornih spojeva koji su jako reaktivni i već u jako malim koncentracijama značajno utječu na aromu. Stoga je optimizacija njihove
35
proizvodnje tijekom fermentacije i koncentracije u vinu i pivu iznimno važna za karakteristike i kvalitetu gotovih proizvoda. 2.3.4.8.1. Sulfiti U metabolizmu kvasca Saccharomyces cerevisiae sulfiti nastaju kao međuprodukt asimilacijske redukcije sulfata u sulfid koji je potreban za sintezu aminokiselina metionina i cisteina (Sl. 2.4). Prisutnost sulfita u pivu je poželjna zbog njihovog antioksidativnog djelovanja. Naime, prisutnost sulfita sprječava oksidativne reakcije tijekom skladištenja i nastajanje karbonila neugodne arome kao što je trans-2-nonenal. Osim toga, sulfiti stabiliziraju aromu piva tvorbom adukata s karbonilima jer sulfitkarbonil kompleksi imaju znatno manji utjecaj na aromu od slobodnih karbonila. U svrhu poboljšanja stabilnosti arome razvijene su različite strategije za povećanje proizvodnje sulfita. Tako je, na primjer, pokazano da pojačana ekspresija kvaščevog gena MET14 i inaktivacija gena MET5 (Sl 2.4) rezultira povećanom proizvodnjom sulfita. Povećanom akumulacijom sulfita rezultirala je i inaktivacija gena MET10 koji kodira za podjedinicu sulfit reduktaze (Sl. 2.4). Međutim, nedostatak ovog pristupa je u tome da akumulacija sulfita počinje prerano pa oni stvaraju komplekse sa karbonilima sprječavajući njihovu redukciju u odgovarajuće alkohole i tako imaju negativan utjecaj na aromu piva. Upravo ova pojava je razlog zbog kojeg neki pivari preferiraju kvasce koji proizvode malo sulfita. Zbog toga je razvijena i potpuno suprotna strategija koja se osniva na sprječavanju nastanka sulfita inaktivacijom kvaščevog gena MET14, te naknadnim dodavanjem sulfita prije punjenja u boce. Interesantno je da je pivo proizvedeno upotrebom ovog soja kvasca pokazalo ubrzano dozrijevanje što može biti dovoljna kompenzacija za potrebu dodavanja sulfita prije punjenja. Osim toga konstruiran je kvasac koji počinje akumulirati sulfite samo na kraju fermentacije, u stacionarnoj fazi rasta. To je postignuto tako da je gen MET14 (Sl. 2.4) stavljen pod kontrolu regulatornog dijela gena HSP26 za kojeg je prethodno utvrđeno da se pojačano eksprimira tijekom fermentacije i to samo u stacionarnoj fazi rasta. Sulfiti imaju važnu ulogu i u proizvodnji vina. Naime, ti spojevi se vrlo često dodaju u mošt da bi se spriječio rast neželjenih mikroorganizama. Međutim, rast nekih sojeva kvasca inhibiran je prisutnošću sulfita pa je jedan od ciljeva genetičke optimizacije vinskih kvasaca povećati njihovu rezistenciju na sulfite. Tako je utvrđeno da je razina rezistencije kvasca S. cerevisiae na sulfite određena ekspresijom gena SSU1 koji kodira za sulfitnu «pumpu», što omogućava izbacivanje sulfita van stanice. Na temelju ovih znanja konstruiran je kvasac koji istovremeno pokazuje veću rezistenciju i proizvodi više sulfita. To je postignuto pojačanom ekspresijom dvaju kvaščevih gena, i to MET14, čime se povećava proizvodnja sulfita u stanici i SSU1, što povećava rezistenciju stanica na sulfite jer omogućava njihov transport van stanice (Donalies, 2008). 2.3.4.8.2. Vodikov sulfid Vodikov sulfid (H2S) već u malim koncentracijama negativno utječe na karakteristike vina i piva, a nastaje iz sulfata, sulfita, sumpora i cisteina tijekom fermentacije. Ovaj spoj stanica kvasca proizvodi u nedostatku dušika i pantotenata (vitamin B5). Koncentracija vodikovog sulfida opada starenjem piva pa bi upotreba kvasaca koji proizvode manje vodikovog sulfida mogla skratiti vrijeme potrebno za proizvodnju piva. Zbog toga je konstruirano nekoliko sojeva kvasca koji proizvode manje vodikovog sulfida. Jedan od takvih sojeva pivskog kvasca konstruiran je pojačanom ekspresijom kvaščevog gena STR4 koji kodira za cistationin sintazu. Na ovaj način smanjena je tvorba vodikovog
36
sulfida jer se time veći dio homocisteina prevodi u cistein (Sl. 2.4). Većim smanjenjem koncentracije vodikovog sulfida u pivu postignuta je pojačana ekspresija gena MET25 koji kodira za homocistein sintazu kao i inaktivacija gena MET10 koji kodira za sulfit reduktazu (Dequin, 2001). Opisane strategije za smanjenje proizvodnje vodikovog sulfida mogu se primijeniti i na vinskim kvascima.
Slika 2.4. Biosinteza aminokiselina metionina i cisteina. Asimilacijskom redukcijom sulfata, preko adenozil fosfosulfata (APS) i fosfoadenozilfosfosulfata (PAPS), do sulfita nastaje sulfid koji je potreban za sintezu metionina i cisteina. Prikazani su geni čijom ekspresijom nastaju enzimi koji kataliziraju odgovarajuće biokemijske reakcije. Geni SUL1 i SUL2 kodiraju za sulfat-permeazu, a SSU1 za sulfitnu pumpu. 2.3.4.8.3. Dimetil sulfid Dimetil sulfid (DMS) je još jedan spoj sumpora koji negativno utječe na organoleptička svojstva piva, osobito lager tipa. DMS nastaje termičkom degradacijom S-metil metionina tijekom pripreme sladovine ili enzimatskom redukcijom dimetil sulfoksida (DMSO) tijekom fermentacije. Utvrđeno je da inaktivacija kvaščevog gena MRX1 rezultira nemogućnošću redukcije DMSO te pivo proizvedeno pomoću kvasaca kojima je ovaj gen inaktiviran sadrži manju količinu DMS (Dequin, 2001).
37
2.3.4.9. Biosinteza glicerola Glicerol pozitivno utječe na organoleptička svojstva vina jer poboljšava viskoznost, slatkoću, konzistenciju i ukupnu aromu vina. Osim toga, pojačana proizvodnja glicerola tijekom fermentacije omogućava proizvodnju alkoholnih pića sa smanjenim sadržajem etanola jer se povećanjem proizvodnje glicerola istodobno smanjuje biosinteza etanola (Sl. 2.5). Zahtjev potrošača za vinom i pivom sa smanjenom koncentracijom etanola je u stalnom porastu, kako zbog utjecaja etanola na zdravlje, tako i zbog sve strožih zakona o sigurnosti u prometu.
Slika 2.5. Biosinteza glicerola, acetata i etanola Geni GPD1 i GPD2 su izogeni koji kodiraju za dvije glicerol-3-fosfat dehidrogenaze, geni GPP1 i GPP2 izogeni koji kodiraju za dvije glicerol-3-fosfataze. Geni ALD2, ALD3 i ALD6 odgovorni su za konverziju acetaldehida u acetat, a FPS1 kodira za membranski protein koji olakšava transport glicerola kroz staničnu membranu. U kvascu S. cerevisiae glicerol nastaje redukcijom dihidroksiaceton fosfata djelovanjem enzima glicerol-3-fosfat dehidrogenaze (GPDH) i glicerol-3-fosfataze (GPP) s tim da za GPDH kodiraju izogeni GPD1 i GPD2, a za GPP izogeni GPP1 i GPP2 (Sl. 2.5). Povećana proizvodnja glicerola postignuta je pojačanom sintezom GPDH, odnosno pojačanom ekspresijom kvaščevih gena GPD1 i GPD2. Osim toga, akumulacija glicerola u podlozi može se dodatno povećati stalnom ekspresijom gena FPS1 koji kodira za membranski protein koji omogućava difuziju glicerola kroz staničnu membranu Međutim, mana ovakvog pristupa je u tome, da pojačana proizvodnja glicerola rezultira i pojačanom proizvodnjom nepoželjnih spojeva kao što su acetat, 2,3-butandiol, sukcinat, diacetil i acetoin. Pri tome je najveći nedostatak vinskih kvasaca povećana proizvodnja acetata koja se može umanjiti inaktivacijom kvaščevog gena ALD6 (Dequin, 2001).
38
2.3.4.10. Smanjenje kiselosti vina Kiselost je izrazito važna karakteristika vina, a najzastupljenije kiseline u vinu su vinska i jabučna kiselina. Također je poznato da mošt grožđa iz hladnijih krajeva često sadrži jako visoke koncentaracije jabučne kiseline. Jedan od načina za smanjenje kiselosti vina je jabučno-mliječno kisela fermentacija koju provode bakterije mliječne kiseline kao što je Oenococcus oeni . Ovom fermentacijom L-jabučna kiselina dekarboksilira se u L(+)mliječnu kiselinu i ugljični dioksid, što uzrokuje smanjenje ukupne kiselosti jer mliječna kiselina ima blaži okus od jabučne kiseline. Međutim, ovaj način smanjivanja kiselosti vina često je nepouzdan jer prisutnost sulfita u vinu može inhibirati rast bakterija mliječne kiseline. Kvasac S. cerevisiae može provoditi fermentaciju pri čemu se malat djelovanjem maličnog enzima dekarboksilira do piruvata koji se potom prevodi do etanola i ugljičnog dioksida. Međutim, ovaj proces je jako neučinkovit jer kvasac S. cerevisiae nema malatpermeazu pa malat u stanicu kvasca ulazi samo difuzijom. S druge strane, Schizosaccharomyces pombe ima malat-permeazu te učinkovito asimilira i prevodi malat do etanola i ugljičnog dioksida, ali istovremeno uzrokuje i lošu aromu vina. U svrhu konstrukcije vinskih kvasaca koji istovremeno provode fermentaciju i razgrađuju malat, geni za razgradnju malata (malolaktični geni) iz bakterija Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii, i O. oeni eksprimirani su u kvascu S. cerevisiae. Međutim, učinkovita malolaktična fermentacija u ovim sojevima postignuta je tek uz ekspresiju gena mae1 iz kvasca S. pombe koji kodira za malat-permeazu. Kvasac S. cerevisiae koji uspješno razgrađuje malat i istodobno proizvodi veću količinu etanola, jer malat prevodi u etanol, konstruiran je ekspresijom gena mae1+ (kodira za malat-permeazu) i mae2+ (kodira za malični enzim) iz S. pombe. Prvi vinski kvasac izmijenjen metodama genetičkog inženjerstva koji je komercijaliziran i kojeg ja FDA (Food and Drug Administration) u Sjedinjenim Državama proglasila sigurnim za ljudsku konzumaciju učinkovito razgrađuje malat u moštu grožđa Chardonnay. Ovaj kvasac konstruiran je ugradnjom malolaktičnog gena mleA iz O. oeni i gena za malat-permeazu iz S. pombe (mae1+) u lokus URA3 u genomu vinskog kvasca S. cerevisiae (Husnik i sur., 2006). 2.3.4.11. Povećanje tolerancije na zamrzavanje i odmrzavanje Za mnoge industrijske kvasce važno je da su rezistentni na različite vrste stresa kao što su oksidativni ili osmotski stres te promjene temperature. U pekarskoj industriji sve više se koriste gotova zamrznuta tijesta pa se javlja potreba da pekarski kvasac bude otporan na zamrzavanje i odmrzavanje te da pri tome zadrži sposobnost dizanja kruha. Jedna od strategija za konstrukciju kriorezistentnog kvasca osniva se na povećanju koncentracije glicerola u stanici što se postiže inaktivacijom gena FPS1 (Sl. 2.5) koji kodira za membranski protein odgovoran za difuziju glicerola u okolinu stanice (Izawa i sur., 2004). Ovaj soj kvasca zadržao je sposobnost dizanja kruha čak i pri dužem skladištenju u zamrznutom stanju. Utvrđeno je da osim glicerola, krioprotektivna svojstva imaju i neke aminokiseline kao što su prolin, arginin i glutamat. Konstrukcija soja koji proizvodi veću količinu prolina osnivala se na pojačanoj ekspresiji gena PRO1 i PRO2. Kvasac kojem je uklonjen gen CAR1 (kodira za enzim potreban za razgradnju arginina) u stanici nakuplja arginin i glutamat te pokazuje veću sposobnost nadizanja tijesta tijekom pripreme kruha od zamrznutog tijesta. Povećanu vijabilnost tijekom zamrzavanja i dobra pekarska svojstva pokazao je i kvasac u čiji genom je ugrađen gen GS-5 iz polarne ribe Myxocephalus aenaeus. Jedan od najnovijih pristupa za povećanje kriorezistencije
39
pekarskog kvasca osniva se na povećanju koncentracije nezasićenih masnih kiselina u stanici. Tako je pojačana ekspresija dvaju gena iz suncokreta (FAD2-1 i FAD2-3) koji kodiraju za dvije različite desaturaze rezultirala povećanjem udjela dienskih masnih kiselina i većom rezistencijom na zamrzavanje (Rodríguez-Vargas i sur., 2007).
LITERATURA Akada, R. (2002). Genetically modified industrial yeast ready for application. J. Biosci. Bioeng.. 94(6), 536-544. Bro,C., Knudsen,S., Regenberg,B., Olsson,L., Nielsen,J. (2005). Improvement of galactose uptake in Saccharomyces cerevisiae through overexpression of phosphoglucomutase: example of transcript analysis as a tool in inverse metabolic engineering. Appl Environ Microbiol. 71(11), 6465-6472. Broach,J.R.., Pringle, J.R. and Jones,E.W. (1997). The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics. CSHL Press. Chi,Z.M., Li, J.F., Wang.X.H. and Yao,S.M. (2004). Inositol and phosphatidylinositol mediated glucose derepression, gene expression and invertase secretion in yeasts. Acta Biochim Biophys. Sin. 36(7), 443-449. Dequin,S. (2001). The potential of genetic engineering for improving brewing, wine-making and baking yeasts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56(5-6), 577-588. Donalies,U.E., Nguyen,H.T., Stahl,U.and Nevoigt,E. (2008). Improvement of Saccharomyces yeast strains used in brewing, wine making and baking. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 111, 67-98. Dujon,B. (1996). The yeast genome project: what did we learn? Trends Genet. 12, 263-270. Haber,J.E. (1998). Mating-type gene switching in Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Genet. 32, 561599. Husnik,J.I., Volschenk,H, Bauer,J., Colavizza,D., Luo,Z., van Vuuren,H.J. (2006). Metabolic engineering of malolactic wine yeast. Metab Eng. 8(4), 315-323. Izawa,S., Ikeda,K., Maeta,K., Inoue,Y. (2004). Deficiency in the glycerol channel Fps1p confers increased freeze tolerance to yeast cells: application of the fps1delta mutant to frozen dough technology. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66(3), 303-305. Joubert,R., Brignon,P., Lehmann,C., Monribot,C., Gendre,F., Boucherie,H. (2000). Two-dimensional gel analysis of the proteome of lager brewing yeasts. Yeast. 16(6), 511-522. Klein,C., Olsson,L., Nielsen,J. (1998). Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology. 144(Pt 1), 13-24. Madhani,H. (2007). From a to α. Yeast as a Model for Cellular differentiation.CSHL Press. Mithieux,S.M., Weiss,A.S. (1995). Tandem integration of multiple ILV5 copies and elevated transcription in polyploid yeast. Yeast. 11(4), 311-316. Nevoigt,E. (2008). Progress in metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72(3), 379-412. Nguyen,H-V. and Gaillardin,C.(2005). Evolutionary relationships between the former species Saccharomyces uvarum and the hybrids Saccharomyces bayanus and Saccharomyces pastorianus: Reinstatement as a distinct species. FEMS Yeast Research 5(4-5), 471-483. Nieto,A., Prieto,J.A., Sanz,P. (1999). Stable high-copy-number integration of Aspergillus oryzae alphaAMYLASE cDNA in an industrial baker's yeast strain. Biotechnol Prog. 15(3), 459-466. Ostergaard,S., Olsson,L., Nielsen,J. (2000). Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mo.l Biol. Rev. 64(1),34-50. Rodríguez-Vargas,S., Sánchez-García,A., Martínez-Rivas,J.M., Prieto,J.A., Randez-Gil,F. (2007). Fluidization of membrane lipids enhances the tolerance of Saccharomyces cerevisiae to freezing and salt stress. Appl. Environ. Microbiol. 73(1),110-116. Rønnow,B., Olsson,L., Nielsen,J., Mikkelsen,J.D. (1999). Derepression of galactose metabolism in melibiase producing bakers' and distillers' yeast. J. Biotechnol. 72(1-2),213-228. Salmon,J.M., Barre,P.(1998). Improvement of nitrogen assimilation and fermentation kinetics under enological conditions by derepression of alternative nitrogen-assimilatory pathways in an industrial Saccharomyces cerevisiae strain. Appl Environ. Microbiol. 64(10),3831-3837. Svetec,I.K. i Zgaga,Z.( 2007). Kvasac Saccharomyces cerevisiae. U: Metode u molekularnoj biologiji, Ur:.Ambriović-Ristov A., Inst. R. Bošković, Zagreb. www.yeastgenome.org
40
Poglavlje 3: PROIZVODNJA PIVA Vladimir Marić
3.1. UVOD Pivo se proizvodi više od 5.000 godina. O njegovom pronalasku postoje brojne legende koje uključuju egipatskog boga Osirisa, aztečko božanstvo Tlaloca, nordijskog boga Odina i kralja Alreka. Pronalazak piva vjerojatnije nije genijalno djelo pojedinca, nego posljedica slučaja. Kako se to dogodilo može se samo nagađati. Tako, zapisi na glinenim pločicama potvrđuju da su Sumerani, stanovnici Mezopotamije, preko 40 % svojih žitarica pretvarali prvo u kruh, a zatim od njega proizvodili pivo. Egipćani su također takve hljepčiće kruha koristili za proizvodnju piva, a seljaci s Nila to čine još i danas. Tisuće godina poslije, vjerojatno u doba Kristova rođenja, pivo se počelo proizvoditi i na sjeveru Europe, gdje se nije uzgajala vinova loza. Prema zapisima rimskih pisaca, Gali koji su nastanjivali područje današnje Francuske i dijela Njemačke, poznavali su piće od ječma. Germani su pili medovinu koju su začinjali hmeljem, pa su se stoga ta dva pića, pivo i medovina, često smatrala istim pićem. Piva proizvedena u davna vremena su se bitno razlikovala od današnjih. Ona su bila mutna i podložna kvarenju. Tako se je u Babilonu pivo moralo piti kroz slamku, jer su po njegovoj površini plivali dijelovi zrna žitarica, a pjene uglavnom nije bilo. Mnogo kasnije, u carstvu Karla Velikog, proizvodnja piva se razvila do razine proizvodnje vina. Tada se pivo proizvodilo u samostanima, čije su pivovare postale nositeljem napretka proizvodnje piva. U to se vrijeme, između šestog i sedmog stoljeća, istovremeno s početkom primjene hmelja, počinje koristit riječ pivo (birra, bier, beer, bière). Hmelj, koji su Germani koristili kao začin u pripravljanju medovine, pokazao se kao vrlo dobar dodatak pivu. Zamijenio je “grut“, što je mješavina više aromatičnih trava. Svaka je pivovara imalo pravo na proizvodnju vlastitog gruta, pa ga je strogo čuvala i borila se protiv upotrebe hmelja. Krajem srednjeg vijeka, hmelj se ipak uspio probiti zbog važnih tehnoloških prednosti, kao što su taloženje bjelančevina, bistrenje piva, ugodna gorčina i suzbijanje rasta štetnih mikroorganizama. Zbog toga pivo postaje mnogo bolje piće, puno sličnije današnjem pivu. Tadašnja se proizvodnja piva nije temeljila na znanstvenim činjenicama, pa su bile potrebne tisuće godina za njeno usavršavanje. Sve do polovice 19. stoljeća proizvodnja piva je bila čisto zanatsko umijeće, jer pivari nisu gotovo ništa znali o uzrocima i posljedicama promjena koje su događale tijekom proizvodnje i čuvanja piva ( Enari, 2000). Znanstvenu osnovu pivarstva čine kemija, biokemija i mikrobiologija, koje se počinju primjenjivati pri izučavanju sirovina (ječam, slad, hmelj, voda) i tehnoloških postupaka slađenja ječma, kuhanja sladovine, alkoholnog vrenja, doviranja i dozrijevanja piva. Istraživanje uloge kvasca u vrenju je započelo u 19. stoljeću, kada je Pasteur otkrio da su uzročnici vrenja kvasci. Nedugo zatim je Hansen prvi izolirao pojedine stanice pivskog kvasca. Tada počinje proizvodnja «čiste kulture« koja se počela koristiti širom svijeta. Industrijski razvoj proizvodnje piva započinje tek krajem 19. stoljeća i posljedica je općeg razvoja znanosti i tehnologije.Tako je 1886. godine u Britaniji osnovan The Laboratory Club, preteča današnjeg Instituta za pivarstvo (The Institute of Brewing, Reding). Nijemci su 1865. u Weihenstephanu započeli s tečajevima za pivare iz kojih je 1895. nastala Visoka škola za poljoprivredu i pivarstvo, koja je 1930. kao fakultet ušla u sastav Tehničkog sveučilišta u Muenchenu. U Danskoj je J.C. Jacobson, utemeljitelj
41
Carlsberg pivovare, osnovao Carlsberg Laboratory 1875. g. s namjerom znanstvene osnove slađenja ječma, varenja i vrenja piva ( Enari, 2000).
da istraži
3.2. DEFINICIJA PIVA Pivo je pjenušavo i osvježavajuće piće, koje sadrži mali, srednji ili visoki udjel alkohola, ima karakterističan pun ili "prazniji" okus po sladu i manje ili jače izraženu gorčinu i specifičnu aromu po hmelju. Dobiva se fermentacijom pivske hmeljene sladovine pomoću pivskog kvasca.
3.3. TIPOVI I VRSTE PIVA Oko 80 % svjetskih piva pripada svjetlom tipu piva, a samo 20 % pripada ostalim tipovima. U nekim zemljama (Belgiji i Nizozemskoj) pije se više stotina vrsta piva, a u nas ih ima nekoliko desetaka. Stoga se postavlja pitanje kako je moguće samo od slada, neslađenih sirovina, vode i hmelja proizvesti toliko različitih tipova i vrsta piva. Ipak, ovisno o tvrdoći vode, kvaliteti i vrsti slada te neslađenih sirovina (ječam, kukuruz , riža, pšenica ) i hmelja (gorke i aromatične sorte), primijenjenom tehnološkom postupku dobivanja pivske sladovine, vrsti kvasca (kvasci gornjeg i donjeg vrenja, „divlji kvasci”) i postupku vrenja sladovine, doviranja, dozrijevanja i dorade mladog piva moguće je dobiti mnogo različitih tipova i vrsti piva s tisuću okusa i mirisa (Beazly, 1994; Jachson, 1998, 2000; Marić i Nadvornik, 1985).
3.3.1. Podjela piva prema vrsti kvasca i načinu fermentacije Lager piva ili “piva donjeg vrenja” dobivaju se vrenjem pivske sladovine pomoću sojeva kvasca Saccharomyces uvarum. Vrenje započinje pri 9 - 18 °C, a završava pri 6 8 °C i naziva se hladnim vrenjem. Mlado pivo odležava pri 0 do 1°C, od jedan do tri ili više tjedana. Lager pivo se pije ohlađeno na 5 - 14 ºC a natočeno u čašu daje bogatu i trajnu pjenu, punog je okusa zbog relativno velikog udjela neprevrelog ekstrakta. Ima izraženu gorčinu i aromu po hmelju. Naziv lager se više koristi u Češkoj, Austriji i Švicarskoj nego u Njemačkoj. Izvorno tamnosmeđe minhensko lager pivo Nijemci naručuju kao Dunkel. U mnogim se zemljama jako lager pivo naziva Bock, a posebno jako Doppel Bock. Vrste lager piva se u osnovi razlikuju prema tvrdoći vode te razgrađenosti i boji slada za pripremu sladovine. U nas se uglavnom proizvode standardna piva donjeg vrenja (Ožujsko, Karlovačko, Pan, Osječko, Zlatorog,, Staročeško, Favorit) koja čine oko 90 % domaće proizvodnje i potrošnje piva. Drugi tip piva je “pivo gornjeg vrenja"( "ale"u Engleskoj ili “Altbier» u Njemačkoj). Za alkoholno vrenje se koristi pivski kvasac vrste Saccharomyces cerevisiae. Vrenje započinje pri višoj temperaturi sladovine (10 °C) i završava na 25 °C, pa se takvo vrenje naziva “toplo vrenje”. Na kraju vrenja kvasac ispliva na površinu, pa se proizvod naziva pivom “gornjeg vrenja”. Mlado pivo odležava i dozrijeva pri 20 °C; kraće od lager piva, osim Altbier-a koji odležava na 0-8 oC. Pije se toplo (20 °C), a neke vrste ovog tipa piva natočene u čašu, stvaraju minimalnu i nestabilnu pjenu, dok druge tvore gustu, visoku i stabilnu pjenu. Praznijeg su okusa u usporedbi s lager pivom, pa su neke vrste po okusu sličnije vinu nego pivu. U svijetu su poznate vrste ale piva: Mild, Bitter, Pale ale, Brown ale, Old ale, Barley wine, Scottish ale, Irisch ale, Belgian ale. Posebna skupina ovih piva su crna britanska piva porter i stout (Guinness), koja imaju izuzetnu
42
punoću, sladnu aromu, gustu i stabilnu pjenu. Afričko pivo je treći tip piva, koje se proizvodi s kvascem Schizosaccharomyces pombe, koji je prilagođen klimatskim uvjetima (30– 40°C), a proizvodi se u Africi od prosenog slada. Četvrti tip piva su “spontano prevrela piva”, koja se proizvode pomoću "divljih" kvasaca, koji u sladovinu dospijevaju iz prirodnog okoliša. Iako ovakav način proizvodnje piva spada u daleku povijest, neki industrijski proizvođači piva u Belgiji (dolina rijeke Zenne) koriste ovaj postupak za proizvodnju čuvenih Lambic piva, koja sadrže više neprevrelog ekstrakta i hlapljivih sastojaka, koji im daju poseban bouquet (vinski, voćni ). Najpoznatije vrste su: Gueuze, Faro i voćna piva (sa dodatkom voća, npr. trešnje - Kriek).
3.3.2. Podjela piva prema masenom udjelu ekstrakta u sladovini Obzirom na maseni udjel suhe tvari u sladovini prije početka vrenja, postoje ovi tipovi piva: Slaba ili laka, imaju malen udjel alkohola i neprevrelog ekstrakt. Standardna, obično sadrže 10 – 12 % ekstrakta u sladovini, pa je udjel alkohola u njima od 3,5 do 5,5 vol. %, koja su u Njemačkoj i Austriji obično nazivaju "točivo pivo", a drugdje "stolno pivo", slično stolnim vinima. Većina naših piva pripada ovoj skupini. Specijalna se piva proizvode iz sladovine s više od 12 % ekstrakta, pa sadrže više neprevrelog ekstrakta i nazivaju se „puna piva”. Najčešće se pakiraju u male, luksuzne boce i slična su „kvalitetnim vinima”. Zbog smanjene potrošnje piva tijekom zime, neke naše pivovare proizvode takozvana blagdanska ili zimska piva, koje pripadaju ovom tipu piva. Dvostruko sladna piva se proizvode od sladovine s 18 – 22 % ekstrakta i nazivaju se "jakim" pivima. U Njemačkoj i Austriji se nazivaju Bock, Stark ili Festbier, a smatraju se „čuvenim” poput „čuvenih vina”. U nas postoji samo jedna domaća vrsta ovog tipa piva (Tomislav). Ječmena vina sadrže volumni udjel alkohola kao i vina (preko 10 %vol.). Zbog velikog udjela neprevrelog ekstrakta izrazito su punog okusa, pa se često piju kao desertno piće.
3.3.3. Podjela piva prema glavnoj sirovini za proizvodnju sladovine Ječmeni slad je osnovna sirovina za većinu lager i ale piva, ali se u mnogim zemljama može djelomično zamijeniti neslađenim sirovinama, što mora biti označeno na etiketi piva. Zamjenom najmanje 50 % ječmenog s pšeničnim sladom dobiva se pšenično ili tzv. Bijelo pivo (njemačka Weizenbier i Weissbier). Tradicionalna europska pšenična piva su piva gornjeg vrenja, koja kratko odležavaju. Pjena im je skoro bijela u usporedbi s pjenom piva gornjeg vrenja od ječmenog slada. Tome svakako pridonosi i visok udjel mliječne kiseline u tipu piva Berliner Weisse. U Europi se može naći i tzv. raženo pivo proizvedeno od raženog slada, koji pivu daje vrlo svojstven okus, koji nije prihvatljiv za mnoge potrošače. Zato raž nije prihvaćena sirovina za pivo. Kako je već spomenuto za proizvodnju tradicijskog afričkog piva koristi se proseni slad.
43
3.3.4. Podjela piva prema boji U osnovi piva mogu biti: svijetla, žuta. crvena, tamna i crna, ali se zapravo radi o različitim nijansama žute, crvene, crveno smeđe i crne boje. Češko ili plzensko pivo je svjetložute do svjetlozlatne boje. Bečko je zlatnožuto, dortmundsko crvenkasto, a bavarsko smeđe. Tipične su vrste vrlo tamnog piva porter i stout. Naše pivovare sve rjeđe proizvode tamna piva, koja su bila varijante engleskog portera proizvedenog donjim, a ne gornjim vrenjem. Najpoznatije stout pivo je Guinness. Crna su piva zaista crna s okusom gorke čokolade ili "suhog" karamela. Hranjiva su, vrlo ukusna i preporučljiva u malim količinama prije spavanja.
3.3.5. Podjela piva prema volumnom udjelu alkohola Ova podjela uglavnom služi za određivanje posebnog poreza na pivo, pa na etiketi mora biti naznačen volumni udjel alkohola u pivu. Piva sadrže uglavnom od 0,5 do 10 % vol. alkohola, a rijetko i više, pa se prema tome dijele na: Bezalkoholna piva koja sadrže do 0,5 vol. % alkohola. Iznimka su islamske zemlje, gdje bezalkoholno pivo ne smije sadržavati nimalo alkohola. Lagana piva, sadrže ispod 3,5 vol. % alkohola. Standardna lager piva i piva gornjeg vrenja (ale) sadrže 3,5 -5,5 vol. % alkohola. Jaka piva više od 5,5 vol. % alkohola. Najčešći udio alkohola u tom pivu je 5,5 – 7 %vol. Ječmena vina imaju udjel alkohola kao vina (> 10 vol %).
3.4. PROIZVODNJA PIVA Proizvodnja piva je složeni proces prikazan na slici 3.1. i opisan je u mnogim knjigama i udžbenicime (Maljcev 1964; Feitman i sur., 1966; Semiz, 1979; Hough i sur., 1982; Schuster i sur., 1988; Štefanić i Marić 1989; Hough, 1998). Proizvodnja piva se sastoji od nekoliko tehnoloških faza, a to su: 1. Prijem i skladištenje sirovina 2. Proizvodnja sladovine 3. Bistrenje sladovine i aeracija 4. Glavno vrenje sladovine 5. Naknadno vrenje (dozrijevanje) mladog piva 6. Dorada i punjenje piva u ambalažu 7. Pasterizacija i skladištenje Kratak opis proizvodnje piva: Za proizvodnju piva osnovne sirovine su slad, voda, hmelj i kvasac. Proizvodnja piva započinje s usitnjavanjem (drobljenje ili meljava) slada i neslađenih žitarica (slika 3.1) Nakon toga se s dodatkom vode vrši ukomljavanje sladne prekrupe i usitnjenih neslađenih sirovina. Zatim slijedi klajsterizacija (prevođenje škroba u vodotopivi oblik, tzv. škrobni ljepak) ukomljenih sirovina zagrijavanjem i hidroliza škroba pomoću amilolitičkih enzima iz slada pri optimalnim temperaturama i pH vrijednostima, te ekstrakcija proizvoda hidrolize. Ako u komu osim slada ima i neslađenih sirovina (iznad 20 %) tada se za efikasno ošećerenje dodaju čisti amilolitički enzimi, najčešće termostabilna α-amilaza te glukoamilaza i β-amilaza. Ošećerena komina se filtrira (cijedi) i kuha s dodatkom hmelja. Prokuhana sladovina se bistri, pri čemu zaostaje topli talog. Izbistrena sladovina se hladi na temperaturu fermentacije i
44
aerira sa zrakom, da se zasiti s kisikom. Aerirana sladovina se zatim prepumpa u fermentor, gdje se inokulira s kvaščevom biomasom, uzgojenom u propagatorskoj stanici. Kvasac prevodi fermentabilne šećere u etanol i nuzproizvode alkoholnog vrenja.
Slika 3.1. Shematski prikaz proizvodnje piva 45
Nakon glavnog vrenja veći dio kvasca se izdvaja za ponovno nacjepljivanje drugih fermentora u glavnom vrenju, dok preostali dio kvaščeve biomase služi za naknadno vrenje. Tijekom naknadnog vrenja pri nižim temperaturama mlado pivo dozrijeva i zasićuje se s ugljičnim dioksidom. Nakon dovršenog vrenja pivo se stabilizira sa sredstvima za bistrenje i filtrira. Prije otakanja u ambalažu obavlja se protočna pasterizacija, ili se ambalažirano pivo pasterizira u tunelskim pasterizatorima i skladišti u posebnim prostorijama. Višak kvasca, nakon glavnog i naknadnog vrenja, može se upotrebiti za proizvodnju suhog neaktivnog kvasca ili proizvoda iz kvaščeve biomase kao što su kvaščevi ekstrakti, nukleotidi, proteinski koncentrati i dr.
3.4.1. Proizvodnja sladovine Za proizvodnju sladovine koristi se uglavnom ječmeni slad ili slad drugih žitarica (tablice 3.1 i 3.2). Osim slada koriste se i druge sirovine te pomoćne tehnološke tvari, što je regulirano državnim pravilnicima (tablica 3.3). No, bez obzira na to, korištenje različitih sirovina i pomoćnih tehnoloških sredstava se temelji na dokazanim znanstvenim spoznajama iz kojih proizlaze ove praktične prednosti: - povećanje ekonomike procesa zbog zamjene dijela slada s neslađenim sirovinama, - mogućnost upotrebe nekada neupotrebljivih sirovina za proizvodnju sladovine, -korigiranje pogrešaka koje se događaju tijekom tehnološkog procesa. 3.4.1.1. Sirovine za proizvodnju sladovine Slad, isklijalo i osušeno zrno ječma, je osnovna sirovina za proizvodnju sladovine. Dobiva se postupkom sladovanja iz ječma i pšenice, iako se, barem teorijski, može dobiti i iz svih ostalih žitarica (Gaćeša, 1979; Leskošek, 2002). Tijekom sladovanja, u fazi klijanja sintetiziraju se enzimi, bitni za hidrolizu škroba do fermentabilnih šećera, koje kvasci mogu prevreti u alkohol. Kada u zrnu ima dovoljno enzima, odnosno kada je zrno dovoljno «razgrađeno», klijanje se prekida. Zeleni slad se suši, a ovisno o temperaturi sušenja, dobiva više ili manje tamnu boju (Marić, 2000). Modificirano zrno slada prikazano je na slici 3.2.
Slika 3.2. Modificirano zrno slada (Levris i Yang, 1995)
46
Modifikacija ječmenog zrna u slad je posljedica ovih procesa: 1.Ulaz vode; 2.Oslobađanje giberelina koji stimuliraju aleuronski sloj; 3. Stimulirani aleuron sintetizira i oslobađa enzime koji modificiraju zrno; 4. β-glukanaze otapaju β-glukan stanične stjenke; 5. Proteaze i peptidaze djelomično razgrađuju proteine; 6. α-amilaze cijepaju oslobođeni škrob; 6a. Oslobađa se latentna β-amilaza; 7. Proizvodi hidrolize služe kao hrana za embrio; 8. Zbog rasta korjenčića i klice dolazi do gubitka suhe tvari zrna; 9. Količina ekstrakta u hladnoj vodi (EHV) je pokazatelj modifikacije zrna; 10. Fizička modificiranost se očituje u povećanju prhkosti zrna i smanjenju viskoznosti sladovine i piva. 11. Kolbachov broj. 12 Aktivnost enzima zrna. Ovisno o temperaturi klijanja i sušenja na raspolaganju su različite vrste slada (tablica 3.1.) Za korekciju boje svijetlih i tamnih piva najčešće se koriste karamelni sladovi (tablica 3.2). Tablica 3.1. Pokazatelji kakvoće osnovnih tipova pivskog slada (Schuster i sur., 1990) Pokazatelj kakvoće TIP SLADA Plsenski "Normalni" Bečki Minhenski Pšenični Ekstrakt (%) u s. tv. 81,5 81,0 80,9 80,0 85,0 Boja (EBC j.) 2,8 3,3 7,1 15,0 3,5 Boja nakon kuhanja, EBC j 4,8 5,8 11,5 21,0 5,0 Proteini (%) 10,2 10,8 11,0 11,5 11,5 Kolbachov broj (%) 40,0 42,0 44,4 38,0 38,5 pH 5,9 5,9 5,6 5,6 6,1 Viskoznost (mPaS) 1,54 1,55 1,57 1,57 1,60 Dijastatska snaga, WKJ 240 260 215 140 250 Alfa-amilaza (ASBC) 40 45 40 30 50 Kod svijetlih lager piva poboljšavaju intenzitet boje, stabilnost pjene, aromu i punoću okusa. Za proizvodnju svijetlih piva u usipak se dodaje 3-5 % svijetlog karamelnog slada, a za tamno pivo se dodaje do 10 % svijetlog ili tamnog karamelnog slada. Usitnjeni karamelni slad se ukomljava i hidrolizira zajedno sa sladnim usipkom. U pivarstvu se predlaže upotreba sladova dva intenziteta obojenosti, i to: 1. slad s bojom od 15 EBC (European Brewery Convention) jedinica za "jaču" boju piva (minhenski npr.). 2. slad s bojom 20 EBC jedinica za pojačanje sladne arome piva (kulmbaški npr.). Tipična boja jače obojenih, tamnih, jako tamnih i crnih piva se postiže pomoću tamnih sladova smeđe, čokoladne i crne boje, koji se dobivaju prženjem svijetlih tipova slada pri 220 - 230 °C. Prženi ječam se također koristi za bojanje. U Njemačkoj nije dozvoljen, a u Engleskoj se koristi za pripravu Stout i Porter piva. Usipak za proizvodnju jako obojenih piva obično sadrži 1-2 % slada za bojenje. Najvažnije svojstvo slada za bojenje je njegova moć obojenja, pa njihova boja iznosi od 1300 -1600 EBC jedinica, koja je nekoliko stotina puta veća od boje svijetlog slada te različitih tipova karamelnog slada (tablica 3.2). Kada je pivo proizvedeno od svijetlog slada s malim dodatkom tamno obojenog slada, ono bojom sliči na tamno a okusom više na svijetlo pivo. U Njemačkoj se zbog toga slad za bojenje (do 2 %) koristi samo onda kada se želi poboljšati pivo od svijetlog slada. Engleski recepti preporučaju i 10 % dodatka slada za bojenje, pa se prema tome tamna piva mogu proizvoditi i od svijetlog slada. Ipak, ako se želi proizvesti izvorno tamno pivo treba koristiti tamni slad. Naravno dolaze u obzir i kombinacije slada za bojenje i karamelnog slada.
47
Tablica 3.2. Usporedba osnovnih pokazatelja kakvoće standardnog svijetlog slada s različitim tipovima karamelnog slada i slada za bojenje (Schuster i sur., 1988) TIP I VRSTA EBC KARAMELNI TAMNI SLADA Pokazatelj kakvoće Svijetli Pils Svijetli Minhenski za bojenje Voda % 5,2 8,4 8,4 8,7 7,7 Ekstrakt % 80,8 77,9 77,3 75,9 70,4 Kolbachov broj % 39,8 33,5 32,2 31,5 28,9 pH 5,9 5,75 5,48 5,3 5,07 Boja (EBC jed.)
3,3
4,4
22,5
126
1450
U proizvodnji piva se ponekad primjenjuju i tzv. specijalni sladovi. To su svijetli i obojeni sladovi proizvedeni iz drugih žitarica, prvenstveno pšenice, riže, tritikalija, zobi, sirka, prosa. Od ovih se žitarica, uz stanovite poteškoće, mogu proizvesti sladovi različite boje, kao i od ječma. Njihove prednosti za pivare uključuju poboljšanu stabilnost pjene (pšenica), visok stupanj topivog dušika, uključujući alfa-amino dušik (tritikalije) i niski sadržaj tanina (golozrne žitarice). Neke žitarice (zob) se koriste kao tradicionalni sastojak usipka za specijalne vrste piva ili zbog ekonomičnosti proizvodnje (sirak). Najzanimljiviju grupu specijalnih sladova čine različito nazvani, ali srodni sladovi kao kiseli, proteolitički, enzimski, aromatski ili "Bruemalt" sladovi. Najpoznatiji su kiseli sladovi, koji se dobivaju "pirjanjem" tamnih ili svijetlih sladova, ako se suše u visokom sloju, gdje se uspostavlja vlažna i topla atmosfera, koja u prvih nekoliko sati sušenja pomaže rast i metabolizam bakterija mliječne kiseline (laktobacila) i ostalih bakterija koje proizvode kiseline. Te se bakterije nalaze na sladu kao svom prirodnom staništu. Od takvih sladova se dobiva sladovina nešto niže pH vrijednosti (oko 5,6) nego kad se slad suši u gomili uobičajene visine (pH oko 5,9), pa ju ne treba zakiseljavati. Pivska sladovina se može dobiti samo od jedne vrsta slada, ali se u pivarstvu zbog postizavanja svojstvenog okusa, mirisa i boje piva, često koriste smjese različitih sladova Zamjenske sirovine. U većini zemalja je dopuštena zamjena dijela slada s neslađenim žitaricama i šećerima. Stoga se svugdje gdje je to zakonski dozvoljeno, slad nastoji zamijeniti neslađenim sirovinama, jer se tako smanjuju proizvodni troškovi. Međutim, takve sirovine ne mogu potpuno zamijeniti slad jer ne sadrže sve potrebne litičke enzime. Kao zamjenske sirovine najčešće se koriste: neslađene žitarice, druge škrobne sirovine (kukuruzna krupica, riža i tehnički škrob), šećerne sirovine, žitni sirupi (ekstrakti) i sladni ekstrakt Neslađene sirovine se razlikuju po kemijskom sastavu (tablica 3.). Njihov škrob nije topljiv u vodi jer se nalazi u škrobnim zrncima koja su obavijena čvrstom ovojnicom. Zbog toga je proizvodnja sladovine iz neslađenih žitarica složenija nego od slada. Tablica 3.3. Prosječni kemijski sastav žitarica (%/s.tv.) (Marić, 1995) Škrob i Ostalo Žitarica Celuloza drugi UH Lipidi bez N Proteini Ječam 5,7 71 2,5 4,0 11,8 Pšenica 2,9 76 2,0 2,8 14,5 Raž 2,4 74 2,0 5,8 13,5 Zob 12,4 61 6,1 2,4 13,4 Kukuruz 4,2 70 5,8 7,6 11,6 Riža 2,3 81 0,5 9,0
Pepeo 3,1 2,2 2,4 3,5 1,2 0,4
48
Neslađeni ječam i pšenica mogu se koristiti u obliku brašna ili krupica, ali ne bi trebali premašivati 30 % ukupnog usipka. Ječam je dobar kao zamjena za slad u proizvodnji jakih piva. Temperatura klajsterizacije ječmenog škroba je 60 - 80 °C, pa ukomljavanje ječma također započinje kuhanjem u kotlu za kominu. Zbog tvrdoće ječmenog zrna i očuvanja pljevice, preporuča se močiti ječam prije meljave 20 min u toploj vodi (40 do 45 °C). Pšenica se dobro prerađuje kada je grubo usitnjena, kao za pipravu graham kruha. Pšenično zrno nema pljevicu, sadrži više proteina, koji su netopivi. Zbog višeg sadržaja β – glukana mogući su problemi s viskoznošću i cijeđenjem sladovine. Kukuruzna krupica se u mnogim zemljama često koristi kao zamjena za slad. Temperatura klajsterizacije kukuruznog škroba je 65 – 75 ºC. Proteini iz kukuruza su netopivi, a udjel je niži nego u sladu, baš kao i udjel enzima β-amilaze. Može se zamijeniti do 50 % slada s pivarskom kukuruznom krupicom, pri čemu se krupica ukomljava i kuha ukotlu za kominu. Ako udjel kukuruza (krupice) u usipku prelazi 30 %, enzimski kapacitet slada nije dovoljan za uspješnu hidrolizu, pa treba upotrijebiti i komercijalne enzimske pripravke. Ako se koriste kukuruzne pahuljice, one se mogu ukomljavati zajedno sa sladom, jer sadrže škrob u topljivom obliku. No, njihova je cijena slična ili viša od cijene slada. Riža se koristiti kao rižin lom ili kao rižino brašno. Sadrži uglavnom škrob, dok je udjel masti minimalan, a proteina optimalan. Temperatura klajsterizacije rižinog škroba je visoka (80 - 85 °C). Zbog jakog bubrenja škrobnih zrnaca, rižina komina je vrlo gusta i sklona zagorijevanju. Pri zamjeni slada s rižom dobiva se pivo svijetle boje i vrlo dobre pjenjivosti. Šećerne sirovine sadrže različite vodotopljive šećere. Najčešće se koriste sirupi (žitni, visoko fruktozni sirup i sladni ekstrakt) koji sadrže najveći dio monosaharida glukoze i fruktoze, disaharid maltozu, maltotriozu i do 20 % oligosaharida i dekstrina. Žitni ekstrakti (sirupi) su proizvodi dobiveni hidrolizom žitarica i kukuruza. Udjel šećera (glukoza, maltoza, maltotrioza) ovisi o stupnju konverzije škroba u šećere. Fermentabilnost sirupa raste, a viskoznost se smanjuje s porastom stupnja konverzije. Izomerizacijom glukoze u fruktozu dobiva se visokofruktozni sirup, koji je uz sladni ekstrakt najbolja zamjena za slad. Sladni ekstrakt je vodeni ekstrakt slada ugušćen do konzistencije sirupa ili osušen u obliku praha i može biti potpuna zamjena za slad. Omogućava preskakanje kompleksnih procesa ukomvljanja i enzimske hidrolize. Za industrijsku proizvodnju piva je preskupa sirovina, ali nalazi primjenu, kada je potražnja piva velika a kapaciteti proizvodnje sladovine ograničeni. Saharoza je fermentabilni šećer pa se dodaje samo za pojačanje alkohola u pivu. Primjena saharoze u proizvodnji sladovine je rijetka i svodi se na udjel od 10 – 20 % u usipku. Pomoćna tehnološka sredstva. Za rješavanje nastalih problema u tehnološkom procesu, koji su posljedica lošije kvalitete slada ili njegove zamjene s neslađenim sirovinama (30 do 40 %) koriste se tzv. pomoćna tehnološka sredstva, koja ubrzavaju proces cijeđenja, pomažu taloženje proteina iz sladovine i povećavaju udjel hranjivih tvari potrebnih kvascu. Dakle, pri zamjenji 30 % slada i više, moraju se koristiti različiti enzimski pripravci (tablica 3.4). Za podešavanje pH sladovine koriste se mliječna, sulfatna i fosfatna kiselina, koje se dodaju u komovnjak. Za korekciju boje sladovine odnosno piva može se koristiti tzv. šećerni kuler (karamel). U Njemačkoj je dozvoljen samo za proizvodnju piva gornjeg vrenja. U nas se smatra aditivom, pa ga treba deklarirati, baš kao i druge dozvoljene boje, što se dodaju nakon kuhanja sladovine a prije alkoholnog vrenja.
49
Tablica 3.4. Enzimski pripravci za proces ukomljavanja (Marić, 1995) Enzimi Učinak Primjenska koncentracija Termostabilna Likvefakcija škroba 80-400 ml / t neslađene žitarice - amilaza Termostabilna Razgradnja ß - glukana 200-400 ml /t slada ß - glukanaza tijekom postupka ukomljavanja do 95 °C Enzimski kompleks Likvefakcija škroba i 150-300 ml /t neslađene saharifikacija žitarice i ß - amilaze Proteinaze Razgradnja proteina, 150-250 ml / t slada povećanje slobodnog amino 350-750 ml/t neslađene dušika žitarice Voda. Voda je po količini najvažnija pivarska sirovina. Njezin utjecaj na tijek biokemijskih reakcija, boju i punoću okusa piva je vrlo značajan. Posebno je značajna tvrdoća vode za proizvodnju pojedinijh tipova piva, a definira se u njemačkim stupnjevima (1 nj° = 10 mg CaO/ L, odnosno 7,19 mg MgO / L). Ovisno o njo tvrdoće, voda za proizvodnju piva je: jako mekana 0 – 5; mekana 5-9; srednje mekana 9-13; prilično tvrda 13-19: tvrda 19-30 i jako tvrda veća od 30. Ukupna se tvrdoća vode sastoji od karbonatne i nekarbonatne tvrdoće. Za proizvodnju piva najvažnija je karbonatna tvrdoća vode. Povijesne tipove piva, moguće je proizvesti samo iz vode odgovarajuće tvrdoće (tablica 3.5.). Tablica 3.5. Tvrdoća vode za proizvodnju povijesnih vrsta piva (Marić,1995)
Tvrdoća (njo) Tip piva Plsenski* Minhenski Bečki Dortmundski
Ukupna 1,6 14,8 38,6 41,3
Karbonatna 1,4 14,2 30,9 16,8
Nekarbonatna 0,3 0,6 7,7 24,5
Stoga, ako nije na raspolaganju voda odgovarajuće tvrdoće, tvrdu vodu treba prethodno obraditi na jedan od ovih načina: dekarbonizacija sa Ca(OH)2, ionska izmjena, odsoljavanje elektroosmozom, zakiseljavanje komine (mliječna, forsforna, solna, sumporna, kiseli slad –biološko zakiseljavanje), dodavanje CaSO4 ili CaCl2 u komovnjak ili burtonizacija (dodavanje CaSO4 ili NaCl u tank vruće vode). Ukratko, voda za proizvodnju piva mora imati odgovarajuću tvrdoću, te mora biti bistra, bezbojna, bez mirisa i treba odgovarati bakteriološkim normama vode za piće (Houghat i sur., 1982). Hmelj. Hmelj (Humulus lupulus) je višegodišnja dvodomna biljka penjačica. Neoplođeni cvat ženske biljke se naziva hmeljne šišarice i koristi za hmeljenje pivske sladovine. Uloga hmelja u proizvodnji sladovine je višestruka: taloži bjelančevine iz sladovine i tako doprinosi bistrenju piva, pospješuje stvaranje pjene, produžava biološku stabilnost (trajnost) piva i daje mu ugodan gorki okus. Kemijski sastav šišarica ovisi o kultivaru (sorti) hmelja . S obzirom na udjel gorkih tvari i eteričnih ulja, sorte hmelja se dijele na aromatične i gorke (Srečec, 2004). Tradicionalne aromatične sorte, kao što su Saazer, Spalter, Tetnanger i Savinjski Golding te Fuggles i Hallertauer Gold sadrže 6,0 do 8,5 % - kiselina. Nove aromatične sorte, kao što su Aurora, Hüller i Perle imaju još veći udjel - kiselina ( 7,6 do 11,4 %). Tipične gorke sorte su Atlas, Blisk, Bullion, 50
Orion, Northern Brewer i Brewers Gold, koje sadrže od 6,0 do 8,5 % - kiselina. Najveću gorčinu ima sorta Hallertauer Magnum (do 14 %). Dakle, podjela hmelja na aromatične i gorke sorte ne zasniva se samo na ukupnom udjelu -kiselina, već i na omjeru između i - kiselina u ukupnim smolama, udjelu kohumulona u -kiselinama, udjelu i sastavu eteričnih ulja te udjelu taninskih tvari u hmelju. Hmeljni pripravci. Suhe hmeljne šišarice su voluminozne pa je njihov transport otežan, a čuvanje zahtijeva dosta hlađenog prostora. Vrijednost suhih šišarica se smanjuje s vremenom čuvanja, jer u njima opada udjel mekanih, a povećava se udjel tvrdih smola. Zato se proizvode hmeljni pripravci (hmeljni prah i peleti tipa 90 i 45, hmeljni ekstrakti i izomerizirani hmeljni ekstrakti), koji povećanju iskorištenja njihovih gorkih i mirisnih tvari. Upotreba hmeljnog praha i peleta povećava iskorištenje gorkih sastojaka za oko 10 % u odnosu na izvorne suhe hmeljne šišarice. Hmeljne ekstrakte treba toplinski izomerizirati, pa se oni dodaju u sladovinu prije njena kuhanja. Zato se danas nude i izomerizirani hmeljni ekstrakti koji su toplinski obrađeni prije stavljanja na tržište. Ovi se koriste za podešavanje gorčine piva prije punjenja u ambalažu. Svi hmeljni pripravci imaju povećani udjel gorkih i mirisnih sastojaka, a manji volumen i masu nego izvorne hmeljne šišarice. 3.4.1.2. Varionica i proizvodnja sladovine Proizvodnja sladovine se odvija u posebnom odjeljenju pivovare koje se naziva kuhaona ili varionica (Sl. 3.3.) i obuhvaća ove tehnološke operacije ■ Drobljenje ili meljava slada (neslađenih žitarica) ■ Ukomljavanje sladne prekrupe i usitnjenih neslađenih sirovina ■ Hidroliza i ekstrakcija proizvoda hidrolize ■ Filtracija (cijeđenje) komine ■ Kuhanje i hmeljenje sladovine ■ Bistrenje, aeriranje i hlađenje sladovine
Slika 3.3. Oprema varionice (Kunze, 1996). 1 - koš za slad; 2 - drobilica; 3 - komovnjak; 3a - kotao za kominu; 4 - cijednjak (bistrenik); 5 - kotao za kuhanje sladovine; 6 -vrtložni taložnjak (whirpool); 7 pločasti hladnjak; 8 - filtar (ili centrifugalni separator).
51
U drobilici (mlinu) se slad i druge sirovine usitnjavaju (suhim ili mokrim postupkom). Sladna prekrupa se ukomljava s toplom vodom u komovnjaku a neslađene žitarice u kotlu komine, koji služi za kuhanje komine neslađenih žitarica ili dijelova sladne komine radi prevođenja škroba u škrobni lijepak. Zatim se sladna komina i komina neslađenih žitarica pomiješaju u komovnjaku i zajedno podvrgavaju procesu enzimske hidrolize, kako bi se škrob razgradio do fermentabilnih šećera, a proteini do peptida i aminokiselina. U cjednjaku se odvaja tekući dio komine (sladovina) od čvrstog netopljivog dijela (vlažnog tropa). U kotlu za sladovinu se sladovina kuha s hmeljem. Zbog povećanja kapaciteta, iza cijednjaka se često nalazi i tzv. «peta posuda» koja služi za prihvat sladovine tijekom cijeđenja, pa se tako omogućava da se veći broj uvaraka skuha u kotlu tijekom jednog dana. Taložnjak služi za izdvajanje «toplog» ili grubog taloga iz djelomično ohlađene ohmeljene sladovine. U pločastom hladnjaku se ohmeljena sladovina hladi na temperaturu vrenja, a zatim se ponovno bistri prolaskom kroz filtar ili separator radi izdvajanja tzv. "hladnog" ili finog taloga. Prije ili nakon toga sladovina se aerira i zasićuje s kisikom iz zraka. U pivarskoj praksi se koriste različiti tipovi šaržnih varionica, kao što su jednostruka, dvostruka, horizontalna i blok varionica, a mogu se sresti i kontinuirane varionice. Usitnjavanje (drobljenje) slada i neslađenih žitarica. Slad se čuva u silosima, a njegova kvaliteta se provjerava prilikom punjenja pojedinih silosnih ćelija. Prije usitnjavanja slad prolazi kroz liniju za čišćenje radi izdvajanja eventualno prisutnih čvrstih metalnih predmeta, kamenčića i prašine. Odvagani slad se mora tako samljeti da se endosperm što bolje usitni, a pljevica sladnog zrna sačuva. Tako se dobiva sladna prekrupa koja osigurava dobru dodirnu površinu, dobro iskorištenje ekstrakta i veliku filtracijsku površinu za brzo cijeđenje u fazi razdvajanja slatke komine na sladovinu i trop. Zato je najbolje da endosperm sladnog zrna bude suh a pljevica vlažna i elastična. U praksi se najčešće koriste suho i mokro drobljenje te usitnjavanje neslađenih sirovina u mlinu čekićaru (Lewis i Yang, 1995). SLADNO ZRNO 1
1
P + GK K
2
2 FK
B + K + FK P
3
K
5 3
FK
P
FK
FK
FK
FK + B
Slika 3.4a. Shema šestvaljčanog mlina
4 6
Slika 3.4b. Shema mlina za mokro usitnjavanje
slada za suho usitnjavanje slada 1 - koš za vlaženje slada; 2 - valjci za prihranjivanje; 3- valjci za gnječenje; miješanje komine mlaznicama za dovod vode; P-pljevica; GK - gruba krupica; K-krupica ; FK - fina krupica; B - brašno
1, 2 i 3 parovi valjaka 4 - komora za ; 5 – regulator dovoda vode 6 - pumpa za kominu
52
Ako je na raspolaganju prhki dobro razgrađen slad s rastresitim endospermom postižu se dobri rezultati suhim postupkom drobljenja (Sl.3.4a) Pri tome se dobiva sladna prekrupa sastava: pljevica, 20 %; krupica, 50 % i brašno, 30 %. Međutim, mokri postupak usitnjavanja i ukomljavanja ima određene prednosti, jer je vlažna pljevica elastičnija (unutrašnjost zrna se lako istiskuje gnječenjem) i pogodnija za cijeđenje sladovine, pa se time ubrzava ošećerenje i povećava iskorištenje ekstrakta. Prema tome, prije početka mehaničke obrade sladno zrno treba navlažiti, močenjem u košu za slad (slika 3.4b). Na valjčanim mlinovima regulira se finoća meljave, tj. granulometrijski sastav sladne prekrupe. Za mljevenje neslađenih žitarica ne mogu se koristiti valjčani mlinovi za slad jer je njihovo zrno pretvrdo, ali su upotrebljivi mlinovi čekićari. Teorijske osnove ukomljavanja i enzimske hidrolize. Ukomljavanje je postupak miješanja sladne prekrupe i usitnjenih neslađenih žitarica s toplom vodom u cilju prevođenja njihovih netopljivih sastojaka u topljiv oblik enzimskom hidrolizom s pomoću enzima sintetiziranih tijekom klijanja ječma (slađenja). Aktivnost tih, kao i svih drugih enzima, ovisi o pH vrijednosti komine i temperaturi. Stoga tijekom hidrolize za svaki enzim treba osigurati optimalne vrijednosti pH i temperature. S obzirom na kemijski sastav sladne prekrupe i usitnjenih neslađenih žitarica najvažnije su enzimske razgradnje škroba, proteina i β-glukana. Enzimska hidroliza škroba se odvija u tri faze koje se međusobno preklapaju: klajsterizacija (prevođenje škroba u škrobni lijepak), likvefakcija i ošećerenje. Kada je škrobna sirovina (sladna prekrupa ili usitnjena neslađena žitarica) suspendirana u vodi, škrobne molekule vežu vodu, pa škrobna zrnca bubre, a njihova ovojnica puca i škrob postaje dostupan djelovanju enzima. Proces klajsterizacije je vrlo brz u sladnoj komini. Međutim, u neslađenim žitaricama škrob se nalazi u intaktnim škrobnim zrncima pa je taj proces spor. Radi ubrzanja klajsterizacije te je komine potrebno zagrijati odnosno skuhati na što višoj temperaturi (100 ºC ili više). Nakon bubrenja škroba započinje njegova likvefakcija kao posljedica hidrolize škrobnog lijepka pomoću enzima α – amilaze koji razgrađuje škrob do dekstrina, pa se viskoznost komine smanjuje. Kada se komini podesi temperatura za optimalno djelovanje enzima β – amilaza, započinje razgradnju dekstrina (7 do 12 glukoznih jedinica) s nereducirajućeg kraja uz odcjepljivanje maltoze. Zbog neparnog broja glukoznih molekula u dekstrinskim lancima osim maltoze nastaju i drugi šećeri (glukoza i maltotrioza). Iz molekula amilopektina nastaju i razgranate dekstrinske molekule, tzv. granični dekstrini, jer se hidroliza zaustavlja na udaljenosti od 2 do 3 glukozne jedinice ispred 1,6 – veze, koju β – amilaza ne može niti preskočiti niti razgraditi. Hidroliza škroba pomoću amilolitičkih enzima slada može se ovako sumirati: Amilopektin + α - amilaza (T. optimum: 72 do 75 °C; pH optimum: 5,6 do 5,8) dekstrini (manje M. m.) Dekstrini + β - amilaza (T. optimum: 60 d0 65 °C; pH: 5,4 do 5,5)
glukoza maltoza maltotrioza
Enzimi djeluju i pri nižim temperaturama, ali znatno sporije. Temperature inaktivacije su im različite, pa se β - amilaza inaktivira pri 70 a α - amilaza pri 80 °C. Tijek hidrolize škroba se nadzire pomoću tzv. jodne probe. Brzina ošećerenja ovisi o temperaturi na kojoj se komina zadržava, vremena zadržavanja komine pri odabranoj temperaturi, pH vrijednosti komine i koncentraciji komine (udjelu suhe tvari u vodenoj suspenziji
53
odnosno otopini). Stoga se komina zadržava pri 62 do 64 °C, kada se želi dobiti sladovinu s puno maltoze odnosno pivo s visokim stupnjem prevrenja. Naravno, ako se želi u sladovini dobiti više dekstrina, preferira se zadržavanje komine pri 72 do 75 °C. Završna temperatura hidrolize škroba je 76 - 78 °C, jer je to nešto niža temperatura od inaktivacije α - amilaze, pa ona nastavalja hidrolizu škroba i tijekom cijeđenja sladovine. Isto tako, pH vrijednost komine je bitan parametar za odvijanje enzimskih reakcija, pa se komina može zakiseliti na pH optimum od 5,5 do 5,6, pri čemu se postiže bolji stupanj prevrenja sladovine, bolja razgradnja proteina, ubrzava cijeđenje zbog manje viskoznosti i sprječava pojačavanje boje sladovine pri kuhanju. Razgradnja β – glukana. Stanične stjenke endosperma žitarica su građene od β glukana i malo pentozana. Nažalost, ostatak β – glukana u ječmenom zrnu, koji nije razgrađen tijekom slađenja izaziva poteškoće pri cijeđenju sladovine i filtraciji piva. Još veće probleme izaziva β - glukan iz neslađenih žitarica. U oba slučaja nastaje β glukanski gel koji usporava cijeđenje sladovine i filtraciju piva. Stoga se preostali β – glukan treba razgraditi prije hidrolize škroba, pomoću specifičnih enzima iz slada, kako slijedi: β - glukan + β - glukanaza ( T. optimum: 45 do 50 °C) β - glukan + β - glukan-solubilaza (T. optimum: 60 do 65°C) glukan
β - glukanski dekstrin otopljeni β -
Razgradnja proteina. Enzimska razgradnja proteina se odvija pri 45 do 55 °C, ali s nastavlja i pri višim temperaturama. Taj proces je važan jer pri 45 °C nastaje više spojeva male molekulske mase, koji služe kao izvor dušika u metabolizmu kvasca, dok pri 55 °C nastaje više makromolekulskih sastojaka, koji pozitivno utječu na stabilnost pjene i punoću okusa piva, ali u suvišku mogu izazvati koloidno zamućenje piva. Razgradnja drugih sastojaka. Fosfataze iz slada razgrađuju netopljive organski vezane fosfate. Dio fosfata se taloži sa solima iz vode, dok ostatak povećava puferski kapacitet sladovine i sudjeluje u procesu alkoholnog vrenja. U otopinu prelazi oko 20 % od ukupno prisutnog cinka u sladu, a on je važan za razmnožavanje kvasca i aktivno vrenje. 3.4.1.3. Praktično izvođenje ukomljavanja i hidrolize Ukomljavanje: Za ukomljavanje i hidrolizu se koriste već ranije spomenute dvije posude: komovnjak i kotao za kominu (slika 3.3). Suvremene pivovare imaju komovnjak i kotao za kuhanje komine jednake konstrukcije, ali je volumen komovnjaka za 1/3 veći od volumena kotla. Obje se posude zagrijavaju vodenom parom od 2 do 3 bara. Uvarak, usipak i glavni naljev: Za određeni volumen sladovine (uvarak) uzima se određena masa slada ili slada i neslađenih sirovina (usipak) i odgovarajući volumen vode (glavni naljev) te određeni volumen vode za ispiranje ekstrakta zaostalog u tropu, tzv. naknadni naljevi. Zbroj volumena glavnog i naknadnih naljeva predstavlja ukupni naljev ili ukupno potreban volumen vode za proizvodnju 100L (hl) sladovine sa zadanom koncentracijom suhe tvari. Za kvalitetu piva je bitan omjer glavnog i naknadnog naljeva. U pivarstvu vrijedi opće pravilo: veći volumen naknadnih naljeva povećava iskorištenje ekstrakta, dok manji volumen naknadih naljeva smanjuje količinu, ali povećava kvalitetu piva. Tip piva također utječe na udjel glavnog i naknadnih naljeva. Tako svijetla piva zahtijevaju veći glavni naljev, dok za tamna piva treba dati prednost gušćoj komini, pa je naknadni naljev veći od glavnog. Omjer usipka i glavnog naljeva određuje koncentraciju suhe tvari u osnovnoj sladovini koja se naziva prvijenac, a dobije se nakon ukomljavanja
54
i hidrolize. Ovisno o tipu piva, postupku usitnjavanja slada (suhi ili mokri) i uređaju za cijeđenje komine (cijednjak ili kominski filtar) taj omjer može varirati od 1 : 2,5 do 1 : 5. Zbog praktičnih razloga dobro je znati da volumen 100 kg usipka (sladne prekrupe i usitnjenih žitarica) iznosi samo 0,7 do 0,8 hl. Masa usipka (MU; kg) za uvarak (UV; hl) koji odgovara kapacitetu varionice (KV; hl) za proizvodnju sladovine sa zadanom koncentracijom ekstrakta (%), može se izračunati: MU = KV NS, gdje je Ns normativ sirovina za 1hl, koji se izračuna iz izraza: Ns = 100 e γ / IE =(kg usipka / hl), gdje je IE iskorištenje ekstrakta u varionici ( %), e zadana koncentracija ekstrakta i γ specifična gustoća ohlađene sladovine. Kako normativ varira od pivovare do pivovare normativ sirovina za 1 hl gotovog (prodajnog) piva je prema tome : Ns' = NS/(100 – g) /100 =(kg usipka / hl gotovog piva), gdje je g-gubitak ekstrakta (%) S druge strane, potrebni volumen vode za glavni naljev (GN; hl) za ukomljavanje, uvažavajući zadanu koncentraciju ekstrkta u prvijencu (e'; %), izračuna se iz jednadžbe: Gn = IE (100 – e') MU/ e' 100 Postupci ukomljavanja: Zbog optimalnog korištenja aktivnosti raspoloživih enzima, sladna se komina neko vrijeme zadržava na optimalnim temperaturama za njihovo djelovanje, i to : ■ 45 do 55 °C; tzv. stanka od 40 - 60 minuta za razgradnju proteina (proteoliza), ■ 62 do 65 °C; stanka od 30 – 45 minuta za nastajanje maltoze (β - amilaza), ■ 70 do 75 °C; stanka od 30 – 45 minuta za potpuno ošećerenje (α – amilaza,), ■ 78 °C; završetak ukomljavanja. Prema načinu postizavanja temperatura, postoje tri osnovna postup1ka ukomljavanja. 1. Infuzijski. Ukomljavanje počinje na temperaturi od 35 °C. Potom se komina zagrijava do temperature za djelovanje proteolitičkih enzima, na kojoj se komina neko vrijeme zadržava. Nakon toga slijedi zagrijavanje na temperaturu djelovanja β – amilaze i zadržava na njoj određeno vrijeme. Slijedi zagrijavanje na temperaturu djelovanja α – amilaze uz zadržavanje te se na kraju komina zagrijava na 78 ˚C (Sl. 3.5). Postupak ima ove značajke: ▪ Pogodan samo za ukomljavanje i hidrolizu sladne prekrupe; ▪ Postepeno zagrijavanje cjelokupne komine u komovnjaku do završne temperature (78 °C); ▪ Daje sladovinu s povećanim udjelom fermentabilnih šećera, a konačni rezultat je visok stupanj prevrenja ( Sp ); ▪ Koristio se za proizvodnju piva gornjeg vrenja i za proizvodnju "laganih" i drugih piva donjeg vrenja, ako se proizvode samo od slada; ▪ Iskorištenje ekstrakta je nešto slabije nego u dekokcijskom postupku ali se zato troši manje toplinske energije.
55
Proteoliza Vrijeme (min) Ošećerenje Slika 3.5. Dijagrami ukomljavanja po infuzijskom postupku Dakle, komina koja ostaje u komovnjaku zadržava se određeno vrijeme na određenim temperaturama (35, 50, 62, 72, 78 °C) za djelovanje enzima slada. Brzina zagrijavanja komine iznosi oko 1°C/min. Takav režim ukomljavanja omogućava intenzivnu razgradnju β – glukana, ali i proteina. Ukupno trajanje postupka je oko 3 sata, što znači da se u tijeku jednog dana može dobiti 8 uvaraka. Lako se nadzire zbog automatskog vođenja procesa, a utrošak energije je za 20 do 50 % manji nego po dekokcijskom postupku. 2. Dvojno ukomljavanje ili postupak s dvije komine. Za razliku od slada, neslađene sirovine (kukuruz, riža, ječam, pšenica) moraju se posebno prerađivati, jer njihove stanične opne treba otvoriti. Kod slada ovaj posao obavlja enzim citaza tijekom klijanja. Kod neslađenih sirovina (žitarica) za otvaranje staničnih opni koristi se snažno kuhanje komine, koje se obavlja u kotlu komine, kojoj se prije kuhanja doda 20 % slada na upotrijebljenu masu žitarice ili 0,2 – 0,5 % komercijalnih enzimskih pripravaka. Proteolitički enzimi odmah započinju razgradnju bjelančevina, dok se komina polako zagrijava na 78° C, te zadržava 15 minuta na toj temperaturi. Tada amilolitički enzimi započinju djelomičnu razgradnju škroba, pa se smanji viskoznost komine prije kuhanja na 100° C. Na kraju se kuhana komina neslađenih sirovina doda sladnoj komini, čija temperatura naglo naraste na optimalnu temperaturu djelovanja β- amilaze (slika 3.6). Zatim se ukomljavanje nastavlja kao kod infuzijskog postupka.
56
3.6. Dijagram ukomljavanja s dvije komine
3. Dekokcijski (odvarni) postupak. Tim načinom se u proizvodnji sladovine iz komovnjaka uzima dio komine, kuha u kotlu komine i zatim vraća u komovnjak. Miješanjem komina postiže se skokovit porast temperature u komovnjaku, slično postupku s dvije komine (Sl 3.6). Postoji nekoliko dekokcijskih postupaka koji se razlikuju po broju kuhanih komina, a najpoznatiji su: s tri, dva ili jednim odvarkom ili jednom kominom..
Slika 3.7. Dekokcijsko ukomljavanje slada i neslađene žitarice s dvije komine i jednim odvarkom (izvor enzima: komercijalna termostabilna α - amilaza) Značajke postupka su: - Pogodan za ukomljavanje slabije razgrađenog slada, izuzimanjem jednog ili više odvaraka; - Pogodan za ukomljavanje usipaka u kojima je slad zamijenjen dijelom neslađenih sirovina, - Daje sladovinu s većim udjelom nefermentabilnog ekstrakta, a konačni rezultat je niže prevrelo pivo, pa se koristi samo za proizvodnju piva donjeg vrenja, radi boljeg okusa. 57
- Veće iskorištenje ekstrakta slada i neslađenih žitarica, ali zato veća potrošnja energije Odvarak se brže zagrijava od ostatka komine, pa je razgradnja proteina u njemu slabija, a na kraju kuhanja su enzimi inaktivirani toplinom. No, zato se bolje odvijaju želatinacija i otapanje škroba u neslađenim sirovina i neproklijalim sladnim zrnima. Kuhanje komine prati i izluživanje sastojaka zrna uz pljevicu kao i nastajanje melanoidina, što povećava intenzitet boje i okusa piva. Volumen odvarka (Vodv) obično iznosi 1/3 do 1/4 uvarka. Njega treba točno izračunati, jer on određuje temperaturu cjelokupne komine nakon vraćanja u komovnjak: Vodv =Vuv . (t3 - t1)/ t 2 - t1 , gdje je: Vuv = volumen uvarka, t1 = temperatura komine prije odvarka (°C), t2 = srednja temperatura odvarka nakon kuhanja (°C), t3 = željena temperatura komine nakon vraćanja odvarka (°C). Kuhanje odvarka traje 10 do 15 minuta kod proizvodnje sladovine za svijetlo pivo, odnosno 20 do 30 min za tamno. Kuhani se odvarak vraća u komovnjak odozdo, kako bi se spriječila oksidacija njenih sastojaka. Trajanje i nadzor procesa. Bez obzira na postupak, važno je tijekom procesa ukomljavanja i hidrolize osigurati optimalan dodir između enzima i sastojaka komine, ali bez utjecaja sila smicanja na male čestice. Naime, smicajne sile izazivaju nastajanje β glukanskog gela, koji pogoršava filtrabilnost sladovine. Zato kominu treba stalno, ali polagano miješati i zadržavati je određeno vrijeme na zadanoj temperaturi za djelovanje enzima. Povišenje ili sniženje temperature, kao i produženje vremena zadržavanja utječu kako na trajanje procesa i udjel fermentabilnih šećera, tako i na stupanj prevrenja sladovine te okus i pjenivost piva (tab. 3.7). Tablica 3.7. Utjecaj temperature i vremena zadržavanja komine na aktivnost enzima te povećanje (+) i sniženje (-) svojstava sladovine i piva Enzim Proteaza β-amilaza α - amilaza Djelovanje Cijepa proteine na Cijepa škrob do Cijepa škrob; više enzima manje jedinice ferm. šećera neferm. šećera Temperatura zadržavanja (°C) 53 63 75 Zadržavanje na + bistrenje piva + stupanj prevrenja + stupanj prevrenja nižoj temperaturi - pjena - nešećeri - nešećeri - punoća okusa Zadržavanje na + pjena + nešećeri + nešećeri višoj temperaturi + punoća okusa - stupanj prevrenja - stupanj prevrenja - bistrenje Vrijeme(min.) zadržavanja 60 30 – 45 30 – 45 Skraćivanje vremena zadržavanja Produljenje vremena zadržavanja
+ bistrenje - pjena - punoća okusa + pjena + punoća okusa - bistrenje
+ nešećeri - stupanj prevrenja
+ nešećeri - stupanj prevrenja
+ stupanj prevrenja - nešećeri
+ stupanj prevrenja - nešećeri
58
Osim toga, važno je spriječiti pretjeran dodir komine sa zrakom, jer otopljeni kisik povećava intenzitet boje sladovine, a utječe i na stabilnost okusa piva. Na kraju hidrolize u sladovini ne smije biti visokomolekulskih dekstrina niti škroba, što se određuje «jodnom probom». Ovisno o postupku, ukomljavanje i hidroliza traju 3 do 4 sata. 3.4.1.4. Izdvajanje sladovine iz slatke komine Nakon završene hidrolize, iz slatke komine se izdvaja prvijenac (sladovina) a ostaje trop. Za razdvajanje sladovine od tropa koriste se dva postupka: cijeđenje i filtracija sladovine. Cijeđenje sladovine. Komina iz komovnjaka prepumpava se u kadu za cijeđenje gdje se ostavi mirovati oko pola sata, dok se trop ne slegne na perforirano dno. Istaloženi trop služi kao filtarski sloj kroz koji teče bistri prvijenac. Kada se većina prvijenca procijedi, preko tropa se izlijevaju naknadni naljevi tople vode kako bi se isprali ostaci ekstrakta iz tropa. Temperatura vode za naknadne naljeve ne smije biti viša od 80 °C, zbog sprječavanja ispiranja nerazgrađenog škroba i inaktivacije α-amilaze. Postupak cijeđenja traje 2 do 3 sata. Teorijski, bolje je za ispiranje koristiti više naljeva vruće vode jer se tako postiže bolje iskorištenje ekstrakta, ali se tada treba otpariti više vode tijekom kuhanja sladovine. Zato u praksi treba naći pravi kompromis. Ispiranje traje tako dugo dok udjel ekstrakta u zadnjem naljevu vode za ispiranje tropa ne padne na 0,5 - 0,6 %, za standardno pivo. Ipak, vrijeme cijeđenja može potrajati do 6 sati pa cijeđenje može biti usko grlo u proizvodnji sladovine Filtracija sladovine. Kako bi se skratilo trajanje cijeđenja sladovine, mnoge pivovare umjesto cijednjaka koriste kominske filtre, starije ili novije konstrukcije Filtracija se obavlja kroz filtarske marame od pamuka, najlona ili polipropilena, obješene preko ploča. Trop se skuplja u rami filtra (debljina sloja 4 - 6 cm). Nakon filtracije prvijenca slijedi ispiranje tropa s vrućom vodom. Ukupno trajanje filtracije iznosi maksimalno 3 sata. Kominski filtar nove generacije umjesto jednostavnih okvira koristi membranske komorne module, koji imaju s obje strane ugrađenu tanku nažljebljenu ploču obavijenu elastičnom membranom od plastične mase, koja je preko savitljivog cjevovoda spojena sa zrakom pod tlakom. Nakon filtracije prvijenca (oko 20 min) pri 0,5 - 0,6 bara iz tropa se istiskuje zaostali prvijenac (oko 5 min.) i započinje ispiranje tropa s vodom koja ulazi odozdo (50 do 55 min). Zaostala voda u tropu se istiskuje pomoću zraka (0,7 bara; oko 10 min). Pomoću kominskog filtra nove generacije skraćuje se vrijeme filtracije na 2 sata, pa je moguće pripraviti 12 uvaraka/dan. Sladovina je nakon filtracije bistra (mutnoća ispod 1 EBC j.), a iskorištenje ekstrakta visoko i nema otapanja kisika u sladovini. Količina i kemijski sastav ekstrakta ovise o uspješnosti procesa ukomljavanja i hidrolize te ispiranja topljivih sastojaka iz tropa. Preostali trop se prebacuje u silos, gdje se čuva ograničeno vrijeme do isporuke potrošačima. 3.4.1.5. Kuhanje sladovine Sladovina se nakon cijeđenja i ispiranja skuplja u kotlu za kuhanje sladovine i kuha s hmeljom. Suvremeni kotlovi za kuhanje nemaju miješalicu, ali im je oblik dna različito izveden (konkavno, uzdignuto, koso, nesimetrično konusno) da se pojača konvekcijsko strujanje tijekom kuhanja (Sl. 3.8). Para za zagrijavanje se dovodi kroz zavarene polucijevi. Radi bolje iskoristivosti kotlova, ugrađuje se među-posuda za skupljanje sladovine, dok se u kotlu kuha prethodno pripremljena sladovina s hmeljom.
59
a)
b)
Slika 3.8. Shematski prikaz kotlova za kuhanje sladovine s vanjskim i unutarnjim kuhalom Kotlovi s unutaranjim kuhalima imaju vertikalni izmjenjivač topline u obliku snopa cijevi. Sladovina cirkulira kroz cijevi odozdo prema gore i zagrijava se vodenom parom. Odbojni pokrov usmjerava struju sladovine vodoravno prema stijenkama kotla i sprječava pjenjenje. Zagrijavanje sladovine na 100 °C traje oko 15 min, a kuhanje na toj temperaturi 10 min. Zatim se sladovina zagrijava na 102 - 104 °C tijekom 15 min i kuha pri toj temperaturi pod blago povišenim tlakom 15 min. Slijedi dekompresija na 100 °C tijekom15 min i kuhanje se nastavlja pri 100 °C još 10 min. Kuhanje traje 60 do 70 min., a otpari se 4 do 6 % od ukupnog volumena sladovine. U literaturi se spominju brojne prednosti ovog postupka kao što su: manji investicijski troškovi, jer nema habanja, nema dodatne potrošnje energije ni gubitka topline zbog isijavanja, mogućnost podešavanja temperature kuhanja pomoću zasićene pare niskog tlaka, mala brzina strujanja sladovine bez smicanja zbog mehaničkog miješanja. Kao nedostaci navode se: teže pranje, lokalno pregrijavanje kod prevruće pare zbog smanjene brzine strujanja sladovine što može pojačati boju i negativno utjecati na okus piva (Hough i sur., 1982; Kunze, 1995). Vanjsko kuhalo (Sl.3.8 b) je cijevni izmjenjivač topline smješten izvan kotla. Tijekom kuhanja kroz njega recirkulira sladovina (7 - 12 puta / sat pomoću pumpe). U kotlu je atmosferski tlak i temperatura 100 °C. U kuhalu je zbog prigušnog ventila na izlazu blago povišeni tlak, pa je temperatura kuhanja sladovine od 102 do 106 °C. Prilikom vraćanja sladovine u kotao dolazi do dekompresije i usisavanja kroz središnju cijev, što izaziva snažno miješanje recirkulirane sladovine s onom u kotlu, a odbojni pokrov usmjerava sladovinu vodoravno prema obodu kotla. Na taj se način skraćuje kuhanje za 20 – 30 %, bolje iskorištavaju gorki sastojci hmelja, bolje talože koagulirani proteini, bolje otparava DMS (dimetil sulfid), postiže niža pH vrijednost i svjetlija boja sladovine te stabilniji okus piva. Nedostatak je dodatna potrošnja energije za pumpu i gubitak topline isijavanjem pa cjevovode i kuhalo treba toplinski izolirati ( Kunze, 1995) Tijekom kuhanja sladovine zbiva se otapanje i pretvorba sastojaka hmelja, inaktivacije enzima, nastajanje proteinsko - taninskih spojeva i taloženje, otparavanje vode, uništenje mikroorganizama (sterilizacija), povećanje obojenosti (3 do 5 EBCj. zbog nastajanja melanoidina), zakiseljavanje, nastajanje reduktivnih sastojaka (melanoidini = reduktoni),
60
smanjuje se udjel DMS-a. Na početku kuhanja sladovini se dodaju hmeljne šišarice ili hmeljni pripravci iz kojih se ekstrahiraju gorki sastojci tj. hmeljne smole (α - i β – kiseline) koje joj daju gorčinu i djeluju antiseptički. Hmeljno ulje je odgovorno za hmeljnu aromu piva a taninski sastojci potiču koagulaciju proteina. Kako su prirodne αkiseline (humulon) netopljive u hladnoj sladovini, moraju se kuhanjem prevesti u vodotopljiv oblik (izohumulon). Unatoč tome, iskorištenje izohumulona jedva prelazi 30 %. Najbolje se iskorištava kohumulon, pa stoga hmeljne sorte bogate kohumulonom imaju prednost u pivarskoj praksi. Iskorištenje izohumulona se povećava s trajanjem i temperaturom kuhanja, ali je ono zbog energetskih razloga ograničeno na 1 - 1,5 sata pri 100 do 105 ºC. Ustanovljeno je da se izomerizacija poboljšava pri višim pH vrijednostima sladovine, ali je gorčina finija i homogenija pri nižim. Brzina ekstrakcije i iskorištenje gorkih sastojaka se povećavaju s usitnjenosti hmelja, pa se stoga u praksi za hmeljenje daje prednost mljevenim šišaricama, hmeljnim peletima i hmeljnim ekstraktima. Hmeljna ulja su hlapiva, pa se tijekom kuhanja gube zajedno s otparenom vodom. Zato se aromatične sorte hmelja dodaju u kotao 15 - 20 min prije završetka kuhanja. Istina, tako se smanjuje iskorištenje izohumulona ali sprječava veći gubitak aromatičnih sastojaka. Iz hmelja se tijekom kuhanja ekstrahiraju i taninski sastojci, koji su topljivi u vodi. To su antocijanogeni, tanini i katehini, koji potpomažu nastajanje proteinskih pahulja u sladovini pri kraju kuhanja (tzv. "loma" sladovine). Doprinose punoći okusa piva, ali isto tako imaju sposobnost polimerizacije, što se negativno odražava na koloidnu stabilnost piva. Osim toga, kuhanjem se inaktiviraju enzimi koji više nisu potrebni, sladovina se sterilizira a njena boja pojačava zbog kemijskih reakcija između šećera i aminokiselina tj. nastajanja melanoidina. Uz to, kuhanjem se razrijeđena sladovina koncentrira na zadanu koncentraciju ekstrakta. Vrijeme kuhanja ovisi o koncentraciji ekstrakta u sladovini prije i poslije kuhanja, te intenzitetu otparavanja vode u kotlu. Za otparavanje vode se potroši oko 1 kg pare / kg vode. Stoga, kuhanje treba završiti što je prije moguće, otprilike za 1 sat ovisno o količini i razrijeđenosti prvijenca. Tijekom kuhanja sladovina postaje kiselija, jer nastali melanoidini daju kiselu reakciju. Na početku kuhanja pH sladovine treba biti 5,8 - 5,9, a nakon završenog kuhanja 5,5 - 5,6. Naime, niže pH vrijednosti ubrzavaju taloženje proteinsko - taninskog kompleksa, sprječavaju povećanje obojenosti sladovine, daju finiju i ravnomjerniju hmeljnu gorčinu, spriječavaju rast nepoželjnih mikroorganizama, ali smanjuju iskorištenje gorkih sastojaka hmelja. Ako sladovina prije početka kuhanja nema željenu pH vrijednost, preporučljivo ju je dodatno zakiseliti s kiselinama, na isti način kako se zakiseljava komina. Međutim, potrebno je napomenuti da zakiseljavanje sladovine pri kuhanju ne utječe na povećanje njenog puferskog kapaciteta. 3.4.1.6. Hlađenje, bistrenje i aeracija sladovine Iz kuhane sladovine se prvo uklanja tzv. grubi ili «topli» talog u vrtložnom whirpool taložnjaku. Zatim sladovina prolazi kroz pločasti izmjenjivač topline, gdje se ohladi na temperaturu fermentacije. Iz ohlađene sladovine se uklanja fini ili «hladni» talog filtracijom ili flokulacijom. Bistra sladovina se prije fermentacije aerira sa zrakom pomoću venturijeve cijevi.
61
3.5. FERMENTACIJA SLADOVINE – GLAVNO VRENJE Ohlađena i aerirana sterilna sladovina se nacjepljuje cjepivom pivskog kvasca tijekom prebacivanja u posude za vrenje: otvorene kade, vertikalne ili horizontalne tankove, odnosno cilindrično konusne fermentore. U pivarskoj praksi se koriste dva postupka vrenja (Sl. 3.9.). 1. Klasični postupak, koji započinje kao glavno vrenje u posebnom odjeljenju pivovare zvanom vrioni podrum, a nastavlja se kao naknadno vrenje, dozrijevanje ili odležavanje mladog piva u ležnom podrumu; 2. Suvremeni postupak, koji započinje kao glavno vrenje u cilindrično konusnom fermentoru u kojem se nastavlja naknadno vrenje nakon ispuštanja glavnine kvasca.
Slika 3.9. Glavno vrenje i dozrijevanje piva: 1 – vriona kada (tank); 2 – ležni tank; 3 – cilindrično – konusni fermentor
3.5.1. Čista kultura kvasaca Pivski kvasac mora imati specifična tehnološka (sposobnost flokulacije i brzina izdvajanja iz mladog ili zrelog piva) i fiziološka svojstva (proizvodnje metabolita koji su važni za ugodan okus piva). Tim zahtjevima udovoljavaju neki sojevi samo dviju vrsta kvasaca iz roda Saccharomyces, a to su S. cerevisiae i S. uvarum (Reed i Nagowithama, 1991). Kvasac je odgovoran za ukupni buke piva, a pivovare do njega dolaze na dva načina: a) Izdvajanjem jedne stanice kvasca iz vlastitog ili tuđeg mladog piva pomoću Kochove i Lindnerove metode te primjene mikromanipulatora (Marić i Bohumicki, 1972). b) Kupovinom liofilizirane kulture iz neke od poznatih Zbirki kvasaca, kao što su npr. NCYC (National Colection of Yeast Culture, Reding) i HB (Hefe Bank, Freising). Većina pivovara dolazi do čiste kulture proizvodnog soja kupovinom, jer dobavljač prodaje kulture kvasaca s precizno opisanim ili šifriranim (šest brojeva) tehnološkim svojstvima Tako npr. šifra 2232/14, označava umjereno pahuljast soj kvasca koji se brzo razmnožava, potpuno previre sladovinu te daje nearomatično pivo čistog okusa. Čuvanje čiste kulture. Čista se kultura najčešće čuva u epruvetama na sladnom agaru pri +4 oC u hladnjaku. Radi očuvanja aktivnosti kvasac se precjepljuje svakih 3-6 tjedana na svježi sladni agar. Liofilizacija u pivarstvu nije prihvaćena metoda, jer neki kvasci
62
gube osnovna svojstva tijekom postupka sušenja. Kvaščeve stanice suspendirane u glicerolu uspješno se zamrzavaju u struji tekućeg dušika (-196 oC) i čuvaju pri -20 do 30 oC u zamrzivaču. 3.5.1.1. Umnožavanje čiste kulture Umnožavanje čiste kulture kvasca se provodi u dvije faze (Sl. 3.10). 1. Priprema laboratorijskog cjepiva se obavlja prenošenjem čiste kulture izrasle na kosom agaru u epruvetu s tekućom podlogom. Sistemom precjepljivanja u veće posude proizvede se 5 L laboratorijske čiste kulture (LČK). 2. Umnožavanje u pogonu započinje prenošenjem laboratorijske čiste kulture (LČK) u Carlsberšku posudu, što je nakon umnožavanja cjepivo za propagaciju u pogonu. 1. Umnožavanje u laboratoriju Kultura na kosom agaru
10 ml ml
2. Umnožavanje u pogonu a) Klasični („otvoreni“) postupak 50 L
50 ml
0,5 L
5L
b) Suvremeni(„zatvoreni“) postupak 50 L
1 : 10
Carlsberg posude
Propagator
5 hL1: 10 1:5 25 hL
CK 1:7
fermentor
100 - 180 hL Kada za vrenje
Matični kvasac 1. generacija Slika 3.10. Shematski prikaz umnožavanja čiste kulture kvasca
Matični kvasac 1. generacija
(1. Generacija
63
Dobije se 15 – 18 x106 anaerobno umnoženih stanica/ml, odnosno 6-10 x 106 aerobno. Carlsberška posuda je hermetički zatvorena posuda od 10 – 20 L s navojnim poklopcem (Sl. 3.11.) do pola napunjena sa sladovinom koja se sterilizira zajedno s njom. U toj se posudi cjepivo sterilno prebacuje u pogon, gdje se vrši pogonska propagacija.
Slika 3.11.Carlsberška posuda 1- filter za sterilizaciju zraka; 2- slavina za uzorkovanje; 3- otvor s gumenom membranom za nacjepljivanje; 4+5- navojnice za zatvaranje; 6-ručica za nošenje U pivovarama koje nemaju suvremenu stanicu za umnožavanje, kvasac se umnožava anaerobno u otvorenim ili zatvorenim posudama kako je prikazano na Sl. 3.10.a. Za manje pivovare, posebno gostioničke, preporučljiv je postupak po Stockhausen – Coblitzu ili Carriereu (Kunze, 1996), koji traju 2 – 4 dana. Sladovina se nacjepljuje s pripremljenim cjepivom u tanku za vrenje u omjeru 1 : 3 do 1 : 4. Bez obzira na postupak, anaerobno umnožavanje čiste kulture kvasca je dugotrajno, složeno i obzirom na mikrobnu čistoću problematično. Zbog toga se proces anaerobnog umnožavanje kvasca provodi samo nekoliko puta godišnje, a kvasac reciklira u procesu vrenja (Sl. 3.12.) dok je fiziološki aktivan (maks. 5 % mrtvih stanica) i mikrobiološki čist. Matični kvasac 1. generacija; dobivena propagacijom
Vrioni tank (CK-fermentor) Otakanje piva
Izravna reciklacija
Reciklacija nakon dezinfekcije
Matični kvasac (2. generacija)
Dezinfekcija
(talog iz vrionog tanka) Višak kvasca Ležni tank Filtracija
Otpadni kvasac (Istaloženi kvasac)
Dozrelo pivo Slika 3.12. Shematski prikaz reciklacije anaerobno uzgojenog kvasca
64
Za reciklaciju se uzima srednji sloj istaloženog kvasca s dna vrionika ili iz konusa CKFa, jer sadrži najaktivnije stanice. Prije prebacivanja u posude za čuvanje, suspenzija kvasca se obrađuje na vibracijskom situ da bi se iz nje uklonile druge čvrste čestice (ostaci tropa, listići hmelja, stvrdnute hmeljne smole, koagulirani proteini). Ovakav postupak umnožavanja i reciklacije kvasca ima i neke prednosti. Propagacija se provodi nekoliko puta na godinu. Izdvojeni kvasac iz taloga nakon fermentacije ima veliku koncentraciju stanica (1 – 4 x 109/ml, ), pa je potreban manji prostor za čuvanje cjepiva. Osim prednosti nedostaci ovog postupka su prije svega dugotrajna (10 – 14 dana) priprema prve generacije matičnog kvasca. Pad fiziološke aktivnosti kvaščevih stanica raste s rednim brojem recikliranja, pa se time pojavljuju i promjene tehnoloških svojstava kvasca te pojave mikrobnog zagađenja pa može doći do promjene kakvoće piva. Osim toga, u višku guste suspenzije kvasca ima mnogo zaostalog piva, koje predstavlja gubitak ako se pivo ne izdvaja na neki od raspoloživih načina. Za taj posao potrebno je mnogo ljudskog rada. Dakle, matični kvasac se može reciklirati u naredni proces vrenja samo ako je fiziološki aktivan (> 95 % živih), genetski nepromijenjen i mikrobiološki čist. Mikrobiološka čistoća se postiže aseptičnom tehnikom rada, pri čemu se koristi kiselinsko pranje pri pH 2,0 - 2,2 tijekom 1 do 2 sata (100 – 130/ml 80 % fosfatne kiseline/L kvasca). Fiziološka aktivnost stanica se može sačuvati 7 ili više dana, ako se suspenzija kvasca čuva pri 2 – 5 oC pod pivom, sladovinom ili vodom. Prije nacjepljivanja u sladovinu za glavno vrenje, čuvani i zakiseljeni kvasac se aktivira aeracijom. Suvremeni pogoni su opremljeni odgovarajućim uređajima za brzo aerobno umnožavanje u jednoj ili dvije posude. Za manje pivovare dovoljna je samo jedna posuda u kojoj se prvo sladovina sterilizira i hladi, te nacijepi s cjepivom iz Carlsberške posude. Volumen posude za umnožavanje (propagatora; VP) obično iznosi oko 10 % od volumena uvarka (VUV). Velike pivovare imaju dvije posude u propagatorskoj stanici , koje rade plukontinuirano. Sterilna sladovina se čuva u jednoj a propagacija provodi u drugoj (Sl. 3.13.).
Slika 3.13. Stanica za umnožavanja kvasca s dvije posude
65
Iz tanka za čuvanje, prebaci se početni volumen sladovine uz dovođenje zraka u bioreaktor za propagaciju, zatim nacijepi s čistom kulturom iz Carlsberške posude te s pomoću pumpe recirkulira i istovremeno aerira. Nakon 24 – 36 sati u propagator se dovodi novi obrok sterilne aerirane sladovine. Ovaj se postupak ponavlja sve dok se ne ispuni korisni volumen propagatora (1/2 bruto volumena). Za nacjepljivanje fermentora se koristi 4/5 volumena, a u propagatoru se ostavlja jedna petina cjepiva za naredni uzgoj. Polukontinuirani način rada omogućava dobivanje potrebne mase cjepiva stalne kvalitete, što je dvostruko brže od šaržnog uzgoja. Postoje i propagatori sa miješalicama, pa se zrak može uvoditi neposredno ispod propelerske miješalice. Koncentracija otopljenog kisika se automatski mjeri kisikovom elektrodom, a temperatura umnožavanje se održava u rasponu od 8 – 14 ºC, tj. 2 – 4 ºC iznad temperature nacjepljivanja sladovine u glavnom vrenju. Prednosti aerobnog umnožavanja kvasca su: propagacija traje samo 2 – 3 dana, manji utrošak energije i radne snage, stanice kvasca su u logaritamskoj fazi rasta, udjel mrtvih stanica je manji od 1 %, pa je za početak glavnog vrenja dovoljno dodati 6 – 10 x 106 stanica/ml. Glavno vrenje je brže, diacetil se brže reducira a mlado pivo ima viši stupanj prevrenja. Međutim, investicijska ulaganja u stanicu za aerobnu propagaciju kvaščeve biomase su visoka (Lewis i Yang, 1985; Kunze, 1996).
3.5.2. Biokemijske promjene tijekom fermentacije sladovine Tijekom fermentacije u sladovini se odvijaju važne biokemijske reakcije koje izazivaju kvalitativne i kvantitativne promjene sastojaka mladog i dozrelog piva, a uvjetno se mogu podijeliti na glavno i naknadno vrenje, jer se međusobno prepliću. Naime, kvaščeve stanice, fermentiraju šećere u etanol, ugljični dioksid i druge nusproizvode alkoholnog vrenja, koji pivu daju određena kvalitetna svojstva (Varnam i Sutherland, 1994; Hough, 1998). Pivska sladovina proizvedena od ječmenog slada sadrži sve hranjive sastojke potrebne za rast kvasca. Ako se sladovini dodaju kalcijeve soli, poboljšava se flokulacija kvasca na kraju vrenja. Sladovina pripravljena s dodatkom visokih koncentracija ugljikohidrata (šećera, škroba) može sadržavati manjak asimilacijskog dušika i vitamina (posebno biotina). Metabolizam ugljikohidrata: Glavni fermentabilni ugljikohidrati u sladovini su glukoza (oko 14 %), maltoza (oko 59 %), maltotrioza (oko 20 %), saharoza (oko 6 %) i fruktoza (oko 1 %). Glukoza i fruktoza se transportiraju u stanicu pomoću permeaze vezane na membrani dok se saharoza cijepa s kvaščevom invertazom koja se nalazi u staničnom zidu pa ulazi kao smjesa glukoze i fruktoze. Transport maltoze i maltotrioze se odvija djelovanjem specifično induciranih permeaza. Metabolizam opisuje sve enzimske reakcije koje se događaju u stanici te organizaciju i regulaciju tih reakcija. Biokemijski putovi razgradnje šećera u stanici kvasca su dobro poznati, kao i putovi biosinteze kvaščeve biomase. Razni sojevi pivskog kvasca imaju različite afinitete prema maltozi i maltotriozi, što se može objasniti razlikama u aktivnostima permeaze maltoze i permeaze maltotrioze. Metabolizam dušika:: Kvaščeve stanice prvenstveno koriste aminokiseline iz sladovine kao izvor dušika, ali samo u L-obliku. Asimiliraju ih po određenom redoslijedu. Tako kvasci najbrže asimiliraju asparaginsku kiselinu, serin, treonin i lizin, zatim slijede glutaminska, valin metionin itd. (Enari i sur., 1970). Kad aminokiseline uđu u stanicu kvasca, sustav transaminaza uklanja amino-grupu, a preostali dio molekule se metabolizira. Asimilacijski dušik u pivskoj sladovini se ne mjeri specifično, već se
66
izražava mjerenjem slobodnog amino dušika (FAN). Uobičajena sladovina od ječmenog slada sadrži 100-140 mg FAN-a /L. Mineralne tvari i tvari rasta: Sladovina općenito sadrži dovoljnu količinu minerala i tvari rasta (vitamini, aminokiseline) za rast kvasaca. Prema Lewis i Yang-u ( 1985) šest je makro-elemenata esencijalno za rast kvasca: fosfor, magnezij, kalij, natrij, mangan i sumpor, koji su prisutni u sladovini u obliku fosfata i sulfata. Od mikro-elemenata za rast kvasaca su bitni cink, bakar i željezo, jer su aktivatori mnogih enzima ili kofaktori u biokemijskim reakcijama. Metabolizam lipida: Kvaščevi su lipidi sastavljeni od triacilglicerola, fosfolipida i sterola. Sadrže uglavnom dugolančane masne kiseline od 16 do 18 C atoma, ali su nađeni lanci od 8 do 24 C atoma. Masne kiseline mogu biti zasićene i nezasićene. Fosfolipidi su supstituirani diacilglicerofosfati: kolin, etanolamin, serin i inozitol. Glavni steroli su ergosterol, zimosterol i drugi steroli. Dakle, lipidi su uglavnom esencijalni sastojci stanične membrane, a za njihovu sintezu se koriste zasićene i nezasićene masne kiseline, koje se sintetiziraju iz acetil CoA djelovanjem enzimskog kompleksa. Različiti sojevi pivskog kvasca zahtijevaju različite koncentracije otopljenog kisika, koji troše za sintezu staničnih lipida, točnije sterola (uglavnom ergosterola). Prema tome, u aeriranoj sladovini kvaščeve stanice razgrađuju glukozu glikolizom do pirogrožđane kiseline koja dekarboksilacijom i dehidrogenacijom prelazi u etanol, ali se istovremeno odvijaju i anaboličke reakcije u kojima se putem TCA (Krebsovog) ciklusa sintetiziraju sastojci mikrobnih stanica i nusproizvoda vrenja te pomoću HMP (heksoza monofosfatnog ili pentoznog) puta nastaje riboza potrebna za sintezu NAD-a, NADP-a, ATP-a i nukleinskih kiselina. 3.5.2.1. Alkoholna fermentacija Teorija alkoholne fermentacije prikazana je u poglavlju 5 (Proizvodnja alkohola) ove knjige, a može se pronaći i u biokemijskim udžbenicima (Karlson,1993: Berg i sur., 2001). U pivskoj sladovini se uz glukozu nalaze i drugi šećeri, kao što je prethodno navedeno. Afinitet kvaščevih stanica prema šećerima u sladovini se razlikuje, pa ih kvasci previru ovim redoslijedom: heksoze i saharozu na početku vrenja, maltozu tijekom glavnog vrenja, a maltotriozu tijekom naknadnog vrenja. Tijekom fermentacije sladovine kvasac se razmnožava i pri tome troši dio šećera. Balling je eksperimentalno ustanovio da za 1g alkohola/etanola treba 2,0665 g glukoze, što znači da se mali dio šećera iz ekstrakta (cca 5 %) troši na umnožavanje i rast kvaščevih stanica. Prema tome, udjel etanola u pivu ovisi o koncentraciji ekstrakta u ohlađenoj sladovini (e) i njegovoj fermentabilnosti. Fermentabilnost ekstrakta se određuje kao stupanj prevrenja (Sp) koji se izražava u postocima: Sp = (E – n)/E x 100 , gdje je n neprevreli ekstrakt, a E ukupni ekstrakt Na brzinu vrenja i kvalitetu piva utječe niz čimbenika, a posebno su značajni: a) Soj kvasca tj. njegova specifična brzina rasta, fermentacija sladovine, pahuljanje i taloženje nakon završetka fermentacije, proizvodnja nusproizvoda fermentacije odgovornih za aromu piva te otpornost na visoke koncentracije etanola i CO2. b) Fiziološko stanje kvaščevih stanica (starost stanica, redni broj generacije, udjel mrtvih stanica, udjel rezervnih sastojaka u stanici ). c) Količina inokuluma. Podaci iz prakse pokazuju da početna koncentracija anaerobno uzgojenog kvasca treba biti do 20 x 106 stanica/ml, ili 0,6 – 0,7 L kvaščeve suspenzije sa 6-7g s.tv. po hektolitru sladovine. d) Raspodjela kvasca u pivu. Ona ovisi uglavnom o geometrijskom obliku fermentora,
67
e) Koncentracija otopljenog kisika u sladovini prije početka vrenja. f) Sastav i pH sladovine. Optimalni udjeli ekstrakta i asimilacijskog dušika (amino kiseline, purini, pirimidini), mineralnih tvari i tvari rasta u sladovini te njena optimalna pH vrijednost (5,3 – 5,6), doprinose brzom umnožavanju kvaščevih stanica na početku vrenja. Udjel spomenutih sastojaka se tijekom vrenja smanjuje baš kao i pH vrijednost koja u konzumnom pivu iznosi 4,0 – 4,2. Porast pH vrijednosti u mladom pivu tijekom vrenja/doviranja je indikacija autolize kvasca što se negativno odražava na kvalitetu piva. g) Temperatura vrenja je važan čimbenik brzine vrenja i kvalitete piva. U praksi se koriste različite početne i završne temperature vrenja (tablica 3.7) pa postoje 3 osnovna tipa vrenja: Tablica 3.7. Karakteristične temperature tijekom glavnog vrenja T e m p e r a t u r a (oC) Vrsta Početna Završna vrenja Hladno 5 - 6 9 Toplo 5 - 6 10 - 11 Ubrzano 8 - 12 15 - 18 Hladnim se vrenjem u pravilu postiže bolja kvaliteta piva, jer konačni proizvod sadrži manje nepoželjnih nusproizvoda (viši alkoholi, esteri), a stabilnost pjene i okusa su bolji, h) Porast tlaka usporava vrenje i umnožavanje kvasca zbog povećavanja otopljenog CO2 u pivu (> 1,5 % tež, zaustavlja vrenje ali ne ubija kvasac). To se jasno odražava i na nastajanje nusproizvoda vrenja. Zbog toga za glavno vrenje pod tlakom treba selekcionirati čistu kulturu kvasca koja podnosi povećane udjele otopljenog ugljičnog
dioksida. Nusproizvodi alkoholne fermentacije. Tijekom alkoholne fermentacije u sladovini uz etanol nastaju nusproizvodi koji u optimalnim koncentracijama doprinose punoći okusa piva. Međutim, ako je njihov udjel previsok mogu negativno djelovati na okus, miris i stabilnost pivske pjene. Postupci ubrzane fermentacije i skraćenog dozrijevanja piva potenciraju problem nastajanja i uklanjanja visokih koncentracija nepoželjnih nusproizvoda. Naime, neprijatna aroma mladog piva potječe od visoke koncentracije diacetila, aldehida i sumpornih spojeva koji se nakupljaju tijekom fermentacije a uklanjaju tijekom dozrijevanja (Sl. 3.14., krivulja b.). Suprotno tome, ugodna aroma dozrelog piva je posljedica ograničene koncentracije viših alkohola i estera, čiji se udjel u pivu povećava tijekom glavnog vrenja i dozrijevanja (Sl. 3.14.; krivulja a).
68
Slika 3.14. Promjene koncentracija nusproizvoda tijekom glavnog i naknadnog vrenja a - sastojci arome dozrelog piva; b - sastojci arome mladog piva Diacetil (2,3 butandion) i acetoin (2,3-pentandion), koji se analitički određuju zajedno kao vicinalni diketoni, najvažniji su sastojci arome mladog/nezrelog piva. U koncentraciji iznad granice osjetljivosti ljudskih osjetila okusa i mirisa (0,20 mg/L) daju pivu nečist, slatkast i odbojan okus, koji pri višim koncentracijama prelazi u miris po užeglom maslacu. Prag osjetljivosti samog diacetila je niži (0,15 mg/L), a acetoina mnogo viši (0,90 mg/L), ali im je učinak isti. Stoga je koncentracija diacetila kriterij za ocjenu dozrelosti piva. Nastajanje i uklanjanje vicinalnih diketona se odvija u tri faze (Slika 3.15).
Slika 3.15. Biosinteza diacetila i njegova konverzija s kvascima u 2,3 –butandiol (Lewis i Yang, 1995)
69
Prva faza je nastajanje prekursora. Za diacetil je to α-acetolaktat, a za 2,3 pentadion je to α-ketobutirat, koje kvaščeve stanice proizvode tijekom razgradnje šećera i izlučuju ih u mlado pivo. Te su kiseline intermedijeri u biosintezi aminokiselina valina i izoleucina. One su bez mirisa i okusa, a njihova koncentracija ovisi o soju kvasca, masi stanica i prisustvu otopljenog kisika. Što je više stanica i otopljenog kisika to nastaje više hidroksikiselina. Druga faza je spontana oksidativna dekarboksilacija prekursora u diketone, prvenstveno u diacetil, koja se odvija izvan stanica i neovisna je o kvascu. Reakciji pogoduje smanjenje pH vrijednosti (4,2 – 4,4), porast temperature (do 18 oC) i prisustvo kisika. Treća faza je uklanjanje ili redukcija diacetila, koju provode kvaščeve stanice tako da diacetil prvo prevode u butandiol i izlučuju u okoliš (pivo). Srećom, sposobnost kvaščevih stanica da reduciraju diacetil je 10 puta veća od njihove sposobnosti da proizvedu njegov prekursor. Nadalje, brzina redukcije ovisi o koncentraciji kvasca u mladom pivu, kontaktu stanica s pivom te temperaturi. Ukratko, povećava se s porastom temperature i pojačanom distribucijom stanica u pivu. Udjel diacetila (vicinalnih diketona i prekursora) u zrelom/odležanom lager pivu obično ne prelazi 0,1 mg/L (Kunze, 1996). Drugu skupinu nepoželjnih sastojaka u dozrelom pivu čine aldehidi (karbonilni spojevi). Među njima je najvažniji acetaldehid, koji nastaje dekarboksilacijom piruvata, a nakuplja se u pivu tijekom prva tri dana vrenja (20 – 40 mg/L). Nakupljanju pridonosi nedovoljno zasićenje sladovine s kisikom iz zraka, ubrzano vrenje izazvano povišenjem temperature i visokom koncentracijom stanica, porast tlaka u fermentoru i mikrobno zagađenje. Acetaldehid je odgovoran za podrumski (pljesniv) okus mladog piva. Tijekom uspješnog dozrijevanja njegova se koncentracija smanjuje na 8 – 10 mg/L. U treću skupinu nepoželjnih sastojaka spadaju sumporni spojevi, H2S, merkaptani i dimetil sulfid (DMS) koji mladom pivu daju neugodan miris karakterističan za nezrelo pivo. Sumporovodik ima miris na pokvarena jaja, a proizvode ga kvaščeve stanice i eventualno prisutne termobakterije, metabolizmom aminokiselina koje sadrže sumpor, odnosno sulfata iz sladovine. Srećom, H2S je hlapiv, pa se uspješno “ispire” s ugljičnim dioksidom. Merkaptani su tioalkoholi, a imaju najnegativniji utjecaj na aromu piva. Osim toga, odgovorni su za tzv. svjetlosni priokus. Tijekom glavnog vrenja udjel merkaptana se povećava a tijekom doviranja smanjuje. U prisustvu kisika se oksidiraju do organoleptički manje opasnih disulfida. DMS daje pivu miris po povrću i plijesni. Kako je DMS sastojak sladovine, a koncentracija mu se ne mijenja tijekom alkoholnog vrenja, važno je da njegov udjel u sladovini bude što niži. Viši alkoholi (patočna ulja) su sastojci arome gotovog piva, a 80 % ih nastaje u glavnom vrenju, što je povezano s metabolizmom aminokiselina iz sladovine, kako slijedi: NH2 O │ - NH3 ║ - CO2 R-CH-COOH R-C -COOH R-CHO Transaminaza Dekarboksilaza
RCH2OH Hidrogenaza
Viši alkoholi su važni sa stanovišta okusa i mirisa. Lager piva ih sadrže manje (60 do 90 mg/L) od ale-a (> 100 mg/L). Razina propanola, izobutanola i amil alkohola je ispod 10 mg/L, dok koncentracija fenil etanola doseže 30 mg/L, a izo-amil alkohola do 40 mg/L. Ako ih tijekom vrenja nastaje više od spomenute razine, ne mogu se ukloniti pa je njihovo nastajanje potrebno držati pod kontrolom tijekom vrenja. To se postiže optimalnim doziranjem kvasca u hladnu sladovinu, provođenjem glavnog vrenja na nižoj temperaturi, sprječavanjem dodira sladovine s kisikom nakon nacjepljivanja i
70
održavanjem koncentracije aminokiselina na dovoljnoj razini za umnožavanje kvasca. Međutim, pri vrenju sladovine s povećanom količinom ekstrakta (> 13 %) razina viših alkohola premašuje gore spomenute vrijednosti. Esteri su najvažniji sastojci arome piva. Rezultat su reakcija između alkohola, acil CoA i acetil CoA, posrednika u sintezi masti. Stoga, kako je već spomenuto, nedostatak kisika u sladovini može izazvati ne samo povećanje razine acetil koenzima A u stanicama, nego i povećanje razine estera u pivu. Ova pojava naročito dolazi do izražaja pri vrenju sladovine s visokom koncentracijom ekstrakta (“high gravity brewing“). Pivo sadrži do 60 različitih estera. Najvažniji su etil acetat, izoamil acetat, izobutil acetat, fenilacetat, etil kaprilat i etil kaproat. Najzastupljeniji ester u pivu je etil acetat (8 do 70 mg/L; prag osjetljivosti: 33 mg/L), jer od svih alkohola pivo sadrži najviše etanola. Podaci iz prakse pokazuju da je optimalna razina estera u lager pivu 60, a u ale-u 80 mg/L. Ostale promjene tijekom alkoholnog vrenja i doviranja. Tijekom alkoholnog vrenja sladovine i doviranja mladog piva zbiva se i veliki broj drugih promjena, kao što su: smanjenje udjela dušikovih spojeva i pH vrijednosti, promjena oksido-redukcijskog potencijala i boje, izdvajanje gorkih i taninskih sastojaka i otapanje CO2. Na početku vrenja kvaščeve stanice koriste aminokiseline i niže peptide kao izvor dušika za svoj rast (oko10-14 mg amino dušika/100 ml sladovine). Tijekom vrenja viši proteini se talože, vežu na površinu kvaščevih stanica ili se s mjehurićima CO2 dižu na površinu piva gdje tvore pjenu. Na kraju glavnog vrenja kvaščeve stanice izlučuju u mlado pivo metabolite s dušikom (aminokiseline, peptide, vitamine, glikopeptide i enzime) i masne kiseline što doprinosi zaokruživanju punoće okusa i mirisa piva. Isto tako, kvaščeve stanice tijekom dozrijevanja izlučuju u pivo proizvode autolitičke razgradnje kvaščevih stanica, a posljedice su pogoršanje okusa piva Uobičajena pH vrijednost sladovine je između 5,3 i 5,6. Tijekom glavnog vrenja pH se smanji na 4,3 –4,6 zbog nastajanja organskih kiselina, potrošnje primarnih fosfata i NH4 iona te otapanja CO2. Time se ubrzava taloženje nestabilnih koloidnih proteinskotaninskih spojeva, povećava brzina dozrijevanja, poboljšava okus piva i produžava biološka trajnost piva. Nakon odležavanja pH vrijednost dozrelog piva trebala bi biti između 4,2 i 4,4. Redukcijska moć sastojaka piva se tijekom vrenja povećava, a mjeri se kao: rH vrijednost (negativni logaritam parcijalnog tlaka vodika), ITT vrijednost (indikator – time – test) po Gray-u ili Stone-u - udjel kisika u pivu. Boja piva se tijekom vrenja smanjuje zbog sniženja pH vrijednosti piva, adsorpcije obojenih sastojaka na stanice kvasca, tj. njihovog prijelaza u talog ili pjenu. U području izoelektrične točke pH vrijednost piva ima određene učinke na koloidno otopljene gorke i taninske sastojke. Tako se neizomerizirane – kiseline talože ispod pH 5, a dio izohumulona se diže s pjenom i na površini mladog piva tvore tzv.“deku”, pri čemu se gubi 25-30 % od ukupnih gorkih sastojaka prisutnih u sladovini. Tijekom fermentacije i dozrijevanja u pivu se otopi oko 15 % nastalog CO2, ali se količina CO2 povećava s povećanjem tlaka a smanjuje s porastom temperature. Udjel CO2 u pivu prije dorade (filtracije) trebao bi iznositi 4,7 – 5,2 g/L. Tijekom odležavanja (doviranja ili dozrijevanja) pivo se bistri, povećava mu se filtrabilnost i koloidna stabilnost. Jedan od indikatora bistroće dozrelog piva je broj kvaščevih stanica u pivu, koji bi trebao biti < 2 x 106/ml. U praksi se to postiže za 1 - 2 tjedna odležavanja mladog piva pri 0 – 1o C.
71
3.6. VOĐENJE GLAVNOG VRENJA I DOVIRANJA 3.6.1. Klasični postupak glavnog vrenja piva Glavno vrenje se u tradicijskim pivovarama odvijalo u otvorenim hlađenim vrionim kadama, ili zatvorenim tankovima (fermentorima), smještenim u hlađenim vrionim podrumima (5,5 – 6 oC) duboko pod zemljom. U podrumsko vrionište ulazi hladna ohmeljena sladovina kojoj se prvo određuje volumen pomoću rotometra te udjel ekstrakta pomoću areometra. Zatim se sladovina priprema za vrenje aeracijom ili prepumpavanjem iz jedne posude u drugu i nacjepljuje s čistom kulturom anaerobno uzgojenog ili istaloženog kvasca iz prethodnog vrenja. Potrebni volumen cjepiva se izračuna tako da se postigne 20 – 30 x 106 stanica/ml sladovine prije početka vrenja. Kontuinuirano doziranje kvasca i sladovine uz aeraciju prikazano je na slici 3.16.
Slika 3.16. Kontinuirano doziranje kvasca i aeracija sladovine 1- taložnjak (virpul); 2- tank za kvasac; 3- flotacijski tank; 4- pločasti hladnjak Postupak, prikazan na slici 3.16, ujedinjuje sve tradicionalne postupke koji prethode glavnom vrenju, kao što su nacijepljivanje sladovine, predvrenje u otvorenoj kadi ili tanku a koji traju 12 – 24 sata radi taloženja suspendiranih čestica, hmeljnih smola i neaktivnog kvasca, te prevođenje kvasca iz lag u log fazu rasta, prije prepumpavanja u posude za glavno vrenje. Tijekom vrenja oslobođeni ugljični dioksid se odsisava iz podruma pomoću ventilatora. Dok se vrenje odvijalo u otvorenim kadama, moglo se vizualno promatranjem površine mladog piva pratiti tijek vrenja.Tako je na početku bila slaba bijela pjena, zatim se pjenjenje pojačalo u toku burnog vrenja (krupni mjehurići CO2). Pri kraju vrenja je pjena opadala, da bi se na kraju vrenja pojavila tzv. deka. Smeđa rahla deka od pjene se obirala s površine piva prije hlađenja i prebacivanja mladog piva u ležne tankove da ne bi potonula zajedno s kvascem, koji se ponovno koristi za narednu fermentaciju sladovine. Temperatura sladovine prije nacjepljivanja iznosila je 6 – 7 oC, koja se zbog egzotermnosti procesa vrenja povećavala do 9 oC za hladno vrenje, odnosno 10 – 11 oC za toplo vrenje. Maksimalna temperatura se održavala 1 – 2 dana, a tada započinje polagano hlađenje (brzina 1 oC/dan) na 4 – 5 oC. Glavno vrenje je obično trajalo 6 dana
72
za topli, odnosno 8 dana za hladni postupak vrenja standardnog (12 %-tnog) piva (Sl. 3.17.).
Slika 3.17. Promjene temperature, udjela ekstrakta i pH vrijednosti tijekom klasičnog hladnog glavnog vrenja piva Stupanj prevrenja. Pravi stupanj prevrenja (Sp) je mjera pretvorbe ekstrakta iz sladovine u alkohol i CO2, a izračuna se kao postotak prevrelog ekstrakta po već spomenutom izrazu. Ovisno o postupku određivanja neprevrelog ekstrakta, postoje tri stupnja prevrenja, različitih vrijednosti : 1. pravi (Sp); 2. prividni (Sp'), i 3. granični (Sp'gr). U vrioništu se izračunava prividni stupanj prevrenja (Sp'), jer se mjeri u mladom pivu pomoću areometra. Naime, zbog udjela alkohola gustoća mladog piva je manja od gustoće sladovine s istim udjelom ekstrakta i areometar utone dublje, pa je Sp' > Sp, tj. Sp je približno 0,80 od Sp'. Određivanje koncentracije pravog ekstrakta je dosta složeno, a provodi se u laboratoriju pivovare, prema propisanoj proceduri za određivanje alkohola i ekstrakta u pivu (Anon.,1985). Glavno vrenje završava kada Sp' dosegne 66 – 68 % (svijetlo), odnosno 60 % (tamno pivo). Granični stupanj prevrenja se također određuje u prodajnom pivu i to samo u laboratoriju po posebnoj analitičkoj metodi. Mijenjanje udjela pravog ekstrakta tijekom glavnog i naknadnog vrenja prikazano je na slici 3.18.
73
Slika 3.18. Promjene udjela pravog ekstrakta tijekom glavnog vrenja, doviranja i određivanja graničnog stupnja prevrenja (Kunze, 1996) Odvajanje kvasca. Na kraju glavnog vrenja kvasac se taloži na dno kade (tanka) za vrenje u tri sloja: gornji (potonuli djelići deke i zadnje istaložene stanice); srednji (glavnina kvasca, fiziološki najaktivnije stanice) i donji (mrtve stanice, hmeljne smole, proteini). Volumen taloga kvasca iznosi 2,0 – 2,5 L/hl mladog piva. Pahuljasti sojevi kvasca tvore više taloga nego praškasti. Za reciklaciju tj. za nacjepljivanje slijedećih uvaraka sladovine koristi se srednji sloj. Prije reciklacije se kvasac propušta preko vibracijskog sita radi uklanjanja čestica nečistoća (ostaci listića hmelja, hmeljnih smola, tropa). Zatim se reciklacija kvasca u procesu izvodi na dva načina: 1. „Suho“ doziranje tj. izravnim nacjepljivanjem izdvojenog kvasca u naredni uvarak. 2. „Mokro“ doziranje, tj. nakon pranja kvasca i njegova čuvanja pod vodom, što je povezano s određenim gubitkom piva. Odvođenje topline. Tijekom glavnog vrenja previre oko 2/3 pravog ekstrakta. Poznato je da 1 kg ekstrakta tijekom alkoholnog vrenja oslobađa 586,6 KJ topline. Prema tome, brzina nastajanja topline (Qtopl), koju treba odvoditi tijekom procesa može se izračunati ovako: Qtopl = V. 2/3 e 586,6/ KJ/dan, gdje je V = volumen sladovine (hl),e = pravi ekstrakt (kg/hl) i τ = vrijeme (dan ili sat) Za odvođenje topline oslobođene tijekom glavnog vrenja, tankovi za vrenje se hlade preko zmijača ili dvostrukih plašteva pomoću rashladne smjese. Na početku glavnog vrenja obično se ne odvodi toplina oslobođena vrenjem kako bi se sladovina, odnosno mlado pivo zagrijalo do zadane maksimalne temperature vrenja. Provjetravanje (odvođenje CO2). Tijekom alkoholnog vrenja iz 1 kg pravog ekstrakta nastaje 0,5 kg ili 0,25 m3 CO2, koji je teži od zraka, pa se skuplja uz pod, ako slobodno izlazi u prostor vrionog podruma (otvorene vrione kade). Smrtonosna koncentracija u zraku iznosi 7 – 10 %, pa se njegovom odvođenju pomoću ventilatora treba posvetiti posebna pažnja. Tek je primjena zatvorenih tankova za glavno vrenje piva omogućila prikupljanje, pročišćavanje i ukapljivanje nastalog ugljičnog dioksida i njegovu primjenu 74
u svim tehnološkim operacijama tehnološkog procesa radi sprječavanja dodira piva s kisikom iz zraka.
3.6.2. Klasično naknadno vrenje (doviranje) mladog piva Naknadno vrenje, doviranje ili dozrijevanje mladog piva se po klasičnom postupku odvija u ležnim tankovima smještenim u hlađenom podrumu. Tankovi za odležavanje su nekada bile velike drvene bačve od hrastovog drveta (do 15,0 m3) iznutra premazane crnom pivarskom smolom. Zatim su se koristili metalni horizontalni tankovi od crnog lima obloženi iznutra emajlom, smolom, plastičnom masom ili od nehrđajućeg čelika. Za održavanje piva pod stalnim tlakom tankovi su opremljeni sa sigurnosnim ventilima. Tank za odležavanje se puni odozdo da se spriječi dodir mladog piva s kisikom i smanji gubitak CO2. Tijekom punjenja sigurnosni je ventil otvoren, korisni volumen punjenja je 95 % od brutto volumena. Nakon 24 sata, kada CO2 iz tanka istisne ostatke zraka, sigurnosni ventil se zatvara i namješta na odgovarajući pretlak. Naime, doviranje piva se provodi pri + 1 do – 1 ºC, a tlak se lagano povećava zbog oslobađanja CO2. Mlado pivo mora sadržavati dovoljno fermentabilnog ekstrakta da njegovim previranjem nastane toliko CO2 da u tanku tlak naraste na 1,5 bara, jer prodajno pivo (otočeno u ambalažu) mora sadržavati minimalno 4g/L otopljenog CO2. Cilj procesa dozrijevanja piva je: 1. Zasititi pivo sa CO2, pa se proces vodi pod povišenim tlakom pri niskoj temperaturi. 2. “Ispiranje” hlapivih sastojaka (sumporni spojevi npr.) s CO2, koji nastaje tijekom doviranja i prolaskom kroz mlado pivo odnosi nepoželjne hlapive sastojke; 3. Izdvajanje svih suspendiranih sastojaka koji se mogu istaložiti, radi prirodnog bistrenja piva, a to su: kvasac, proteinski talog i druge koloidne tvari iz sladovine. Na uspješnost bistrenja, tj. taloženja suspendiranih čestica iz mladog piva utječe temperatura (bolje što niža), volumen i dužina odležavanja (bolje duže odležavanje) i ostatak fermentabilnog ekstrakta. Ponekad se može dogoditi da se tlak u ležnom tanku ne povećava zbog premalo preostalih fermentabilnih šećera (previsoki Sp') ili nema dovoljno fiziološki aktivnih kvaščevih stanica u mladom pivu. U takvim se slučajevima „osvježava“ ili „pomlađuje“ pivo, što se postiže dodatkom 5 % sladovine u aktivnom vrenju iz tanka za glavno vrenje. Drugi razlozi nepostizanja potrebnog tlaka mogu biti: nehermentičnost (CO2 negdje “curi”), i nemar radnika (tank je prepunjen, sigurnosni ventil je začepljen pjenom ili pivom).
3.6.3. Vrenje i doviranje piva u cilindrično-konusnim fermentorima Kada se vrenje i doviranje piva odvija u jednoj posudi, cilindrično-konusnom fermentoru, ta se posuda naziva kombi-tank, jer je konstruirana za kombinirani postupak (Slika 3.19). 3.6.3.1. Konstrukcija, veličina i postavljanje CKF-a CK fermentor je izrađen od nehrđajućeg čeličnog lima. Unutarnja površina mu je vrlo fino polirana. Konusni dio služi za sakupljanje istaloženog kvasca, a u cilindričnom dijelu ostaje prazan prostor za sakupljanje CO2 (25 - 50 %, ovisno o tipu piva tijekom glavnog vrenja, odnosno 5 – 12 % ovisno o temperaturi dozrijevanja mladog piva). Kut konusa je od 60 do 90°, najčešće između 60 i 75°. Promjer fermentora je 5 – 10 m, a visina 20 do 40 m. Odnos promjera i volumena CK fermentora je od 1 – 1,5 do 1 – 4. 75
CK fermentor se puni odozdo, a korisni mu volumen (KVk + KVc) ovisi o poludnevnom kapacitetu varionice. Naime, punjenje velikih tankova traje suviše dugo pa se s prvim uvarkom sladovine dodaje ukupna masa kvasca za korisni volumen cijelog fermentora, a to znači da vrenje započinje prije završetka punjenja. Stoga vrenje zadnjeg uvarka zaostaje, jer se iznad njega nalazi visok stupac sladovine u kojoj se nalaze sve aktivne stanice kvasca. Pražnjenje tanka nakon završenog procesa također traje predugo (10 – 12 h), pa je prazni hod fermentora zbog pražnjenja, pranja i ponovnog punjenja predugačak. Osim toga, u velikom se fermentoru može proizvoditi samo jedan, masovni tip piva, pri čemu je vršna potrošnja energije za hlađenje mnogo veća nego za veći broj manjih fermentora.
Slika 3.19. CKF s armaturom (Kunze, 1996) 1-podest; 2-kupola; 3- cijevi za kablove; 4- priključak za termometar; 5- zona za hlađenje tijekom odležavanja; 6+8- zone za hlađenje (tijekom vrenja); 7-izolacija; 9- priključci za rashladna sredstva (amonijak); 10- zona hlađenja konusa;11- manipulativni otvor; 12slavina za uzorkovanje; 13- spoj s kupolom (CO2, zrak, CIP) postavljen u izolaciju; 14sigurnosni ventil; 15 - donja sonda napunjenosti CK fermentori se mogu postaviti na otvorenom ili zatvorenom prostoru. Najčešće se postavljaju na otvorenom u dva ili više redova. Svaki fermentor je toplinski izoliran, a pod krovom između fermentora je manipulativni prostor za cjevovode, ventile i razvodne ploče. Na bombiranom pokrovu i konusu fermentora nalaze se uređaji i sigurnosna armatura za nadzor i automatsko vođenje procesa. Svaki je fermentor povezan s cjevovodom za
76
dovod sladovine, odvod istaloženog kvasca i odvod piva, dovod sredstava za CIP pranje, i odvod sredstava nakon CIP pranja (Peterson, 1993). CKF nema mehaničko miješalo. Stoga prijenos mase i topline u njemu nije homogen. Održavanje optimalne temperature tijekom vrenja u CKF- može se postići posredno pomoću glikola ili izravno pomoću amonijaka na dva načina: 1. Cirkulacijom rashladne tekućine kroz plašteve za hlađenje od zavarenih polucijevi, u dvije do tri rashladne zone na cilindričnom i jedne zone na konusnom dijelu (Slika 3.19 i 3.20). 2. Cirkulacijom piva kroz vanjski hladnjak, što pogoduje održavanju kvasca u suspenziji, povećanju brzine vrenja i većem iskorištenju fermentora (Slika 3.21). U okolici kvaščevih stanica koji previru šećere u etanol i CO2 uz oslobađanje topline, temperatura je viša nego u onim dijelovima gdje kvaščevih stanica nema ili nisu prisutne u dovoljnom broju. Zbog toga, tijekom intenzivnog vrenja dolazi do značajnog gibanja i miješanja sadržaja fermentora. Mjehurići CO2 struje uzlazno prema praznom prostoru fermentora i poput balona podižu kvaščeve stanice prema vrhu, gdje plinoviti CO2 izlazi iz piva, a kvaščeve stanice zbog veće specifične mase polako tonu natrag prema konusu tanka. Toplije okolišno pivo se također uzdiže prema gore. Zato se tijekom glavnog vrenja suvišna toplina odvodi hlađenjem odozgo tako da se uključi gornja zona hlađenja na CKF-u, pivo se hladi, postaje gušće i počinje strujati prema dolje. Tako, zbog temperaturnih razlika u pojedinim slojevima piva dolazi do usmjerenog kretanja molekula plinova i tekućine, odnosno tzv. konvekcijskog prenošenja topline (Sl.3.20a). Tijekom odležavanja hlađenje se obavlja pomoću konusne rashladne zone, pa se u konusu skuplja pivo s najvećom gustoćom (pivo temperature oko + 2,5 °C), dok se hladnije pivo (- 1 °C) zbog manje gustoće diže prema vrhu fermentora (Slika 3. 20b).
Slika 3.20. Konvekcijsko miješanje i prijenos topline u CKF-u a) Hlađenje odozgo (glavno vrenje) b) Hlađenje u zoni konusa (odležavanje) Hlađenje piva preko pločastog hladnjaka (Slika 3.21.) je investicijski jeftinije, jer cijena rashladnih zona na CKF iznosi 25 do 30 % od njegove ukupne cijene, dok je cijena pločastog hladnjaka oko 10 % te cijene. No, potrošnja energije je nešto viša zbog pogona pumpe. Pivo može izlaziti iz fermentora pri dnu ili vrhu konusa, ovisno o potrebi suspendiranja kvasca istaloženog na dnu konusa.
77
Slika 3.21. Hlađenje preko pločastog izmjenjivača topline 1- cjevovod za vraćanje piva; 2- pumpa za pivo; 3- pločasti hladnjak; 4- usisni vod za pivo u konusu; 5- usisni vod za pivo iznad sloja kvasca u konusu
Ekstrakt
Na početku glavnog vrenja se ne odvodi toplina oslobođena vrenjem kako bi se sladovina, odnosno mlado pivo mogli zagrijati do zadane maksimalne temperature vrenja, pa se toplina što ju treba odvesti (Qtopl.) računa na isti način kao i kod klasičnog postupka vrenja. Vođenje kombiniranog procesa vrenja. S obzirom na početnu temperaturu sladovine i maksimalnu temperaturu vrenja u praksi se mogu susresti različiti načini procesa vođenja vrenja, kao što su (Kunze, 1996): 1. Hladno vrenje – hladno dozrijevanje (klasični postupak, slika 3.22) 2. Hladno vrenje – toplo dozrijevanje (ubrzani postupak) 3. Toplo vrenje – toplo dozrijevanje (brzi postupak, slika 3.23)
_____
-----
temperatura diacetil ekstrakt izdvajanje kvasca
Slika 3.22 Hladno vrenje – hladno dozrijevanje (klasični postuak)
78
Ekstrakt
Temperatura sladovine prije nacjepljivanja je 6 – 7 °C, a maksimalna temperatura glavnog vrenja je 8 – 9 °C, na kojoj se mlado pivo zadržava oko 2 dana. Zatim započinje hlađenje mladog piva na 3 – 4 oC radi taloženja kvasca, koji se ispušta iz konusa CKF kada se postigne ta temperatura. Udjel fermentabilnog ekstrakta je u tom trenutku 0,8 – 1,0 %. Slijedi daljnje polagano hlađenje na -1 oC, tijekom kojeg preostale stanice kvasca previru ostatak fermentabilnog ekstrakta i reduciraju diacetil. Odležavanje se nastavlja na –1 oC i traje 1 do 2 tjedna, ali ne duže od 5 tjedana, jer pivo poprima nepoželjan priokus po kvascu (autoliza), smanjuje mu se pjenivost i stabilnost pjene. Postupak hladnog vrenja i toplog dozrijevanja se odvija na 8 – 9 oC dok se ne postigne prividni stupanj prevrenja (Sp) od 50 %. Zatim se isključi hlađenje, pa se temperatura mladog piva podigne na 12 – 13 oC za nastavak vrenja i redukciju diacetila. Tako se za ukupno 10 dana dovrši glavno vrenje i reducira diacetil ispod praga osjetljivosti. Nakon toga se pivo ohladi na – 1 oC i nastavi odležavanje koje traje minimalno 7 dana. Tijekom ljetnih mjeseci kada je potražnja za pivom velika, mnoge pivovare koriste postupak toplog vrenja i toplog dozrijevanja. Na početku vrenja temperatura sladovine prije nacjepljivanja je 8 oC, dok je maksimalna temperatura vrenja 12 – 14 oC, što je pogodno za brzu redukciju diacetila. Postupak obilježava ubrzano glavno vrenje u kojem nastaje puno diacetila, pa zadržavanje na toj temperaturi traje dok se udjel diacetila ne smanji. Odležavanje mladog piva na –1 oC traje do tjedan dana. Bez obzira na temperaturu vođenja procesa, ugljični dioksid što nastaje tijekom vrenja i doviranja izlazi u atmosferu na vrhu CKF-a samo tijekom prvog dana vrenja, kada je onečišćen zrakom. Nakon toga se ugljični dioksid prikuplja, pročišćava i ukapljuje.
temperatura diacetil ------- ekstrakt ispuštanje kvasca _______
Slika 3.23. Toplo vrenje – toplo dozrijevanje (brzi postupak) Neke pivovare imaju cilindrično-konusne fermentore konstruirane za sigurno vođenje procesa vrenja pod tlakom. Proces obilježava početna temperatura sladovine od 10 oC , a maksimalna temperatura vrenja dosiže 18 oC. Kada prividni stupanj prevrenja mladog piva dostigne 50 % (za 2 dana), u fermentoru se s pomoću nastalog CO2 i sigurnosnog
79
ventila uspostavi željeni tlak (oko 1,8 bara). Zatim se nastavlja vrenje i redukcija diacetila pri stalnom tlaku i temperaturi još 6 – 7 dana. Tada započinje hlađenje na temperaturu odležavanja (-1 oC) i dekompresija. Ovaj postupak zahtijeva primjenu selekcioniranog kvasca koji podnosi visoke udjele otopljenog CO2 Ako se primjenom bilo kojeg postupka dogodi da tijekom glavnog vrenja mlado pivo prevre do kraja, tj. da ne sadrži dovoljno fermentabilnog ekstrakta za naknadno vrenje, uobičajeno je takvo pivo ohladiti na 5 oC i nakon ispuštanja kvasca primijeniti postupak “pomlađivanja“. To znači da se takvom pivu dodaje 5 – 10 % mladog piva iz CKF-a koji se nalazi u fazi aktivnog vrenja (Sp = 25 %). 3.6.3.2. Izdvajanje i čuvanje kvasca za ponovno nacjepljivanje Višak kvasca se ispušta iz CKF-a nakon završenog glavnog vrenja ili prije početka dozrijevanja piva u njemu. Vrijeme ispuštanja kvasca treba pažljivo odabrati, kako bi se iz fermentora ispustile fiziološki najaktivnije istaložene stanice, a u mladom pivu ostalo dovoljno kvasca i fermentabilnog ekstrakta za uspješan proces doviranja piva. Kvasac za cjepivo se čuva u posebnim posudama pod pivom ili sladovinom na 0 oC. Tijekom glavnog vrenja masa kvasca se poveća do 3 puta, ali se za ponovno nacjepljivanje koristi samo njegov najaktivniji dio.
3.7. DORADA PIVA Glavni postupci dorade piva su: 1. Filtracija pomoću naplavnih okvirnih ili svjećastih filtera, slojnih te mikro- i ultrafiltera 2. Centrifugiranje (centrifugalna separacija).
3.7.1. Filtracija Filtracija je vjerojatno najučinkovitija metoda izdvajanje većih čvrstih čestica i stanica iz dovrelog piva. Pivo pod tlakom prolazi kroz filtarsko sredstvo na kojem ili u kojem se formira filtarski «kolač» od zadržanih čvrstih čestica. Pogonska sila je razlika tlaka na ulazu i izlazu iz filtera. Ako ne dođe do «proboja» filtera, filtracija traje dok se izlazni tlak ne izjednači s ulaznim. Zato je kapacitet šaržnih filtera ograničen. Naime, brzina filtracije ovisi o razlici tlakova iza i ispred filtracijskog sloja, permeabilnosti, debljini i površini sloja te viskoznosti piva. Kako je površina sloja ovisna o uređaju za filtraciju, dakle konstantna, brzina filtracije je upravno proporcionalna konstanti, razlici tlaka i permeabilnosti, a obrnuto proporcionalna debljini sloja i viskoznosti filtrata. Ovisno o veličini i udjelu čvrstih čestica (stanica) koriste se dva postupka izdvajanja: 1. Prosijavanje ili površinska filtracija kroz filtarski sloj, čije su pore manje od promjera čestica. To dovodi do brzog povećanja debljine filtarskog kolača i oštrine filtracije, ali i smanjenja protoka bistre tekuće faze te konačno i do začepljenja filtarskog sloja. 2. Dubinska filtracija kroz filtarski sloj velike površine, s manjim većim porama od promjera čvrstih čestica. Filtarski sloj je građen u obliku labirinta, pa tekućina prilikom prolaza kroz njega mijenja smjer i brzinu protoka. Dakle, zaustavljanje čvrstih čestica na i unutar filtarskog sloja može se ostvariti mehanički (kao kod površinske filtracije) ili apsorpcijom finih čestica zbog različitog elektro naboja (Sl. 3.24.).
80
Slika 3.24. Principi izdvajanja suspendiranih čestica 1. površinska filtracija; 2. dubinska filtracija (mehaničko zadržavanje); 3. dubinska filtracija (apsorpcija) U praksi se koriste različita osnovna filtarska sredstva: 1. Sita svih vrsta (metalna, ploče s prorezima, sita od paralelnih profiliranih žica, sita u obliku svijeća). 2. Tkanine od metala ili tekstila (metalne tkanine imaju prednost pred tekstilnim odnosno propilenskim zbog lakšeg pranja i dezinfekcije). 3. Filtarski ulošci načinjeni od različitih materijala (celuloza, pamučna vata, staklena vuna). 4. Porozna tijela (sinterirani metali i sinterirano staklo) za filtraciju i raspršivanje zraka. 5. Membrane na visokoporoznim nosačima ili membrane od šupljih vlakana (od poliuretana, poliamida, polietilena, polikarbonata, acetatceluloza i dr.). Pomoćna filtracijska sredstava. Kao pomoćna filtracijska sredstva koriste se anorganski i organski praškasti materijali, promjera 2 do 4 μm, koji se naplavljuju na filtar tj. osnovno filtarsko sredstvo, da bi se mogla provoditi dubinska filtracija. Najčešće se koristi: 1. Dijatomejska zemlja (kieselgur) dobivena sušenjem, mljevenjem i žarenjem fosilnih ostataka algi kremenjašica. U praksi se koristi fina, srednje fina i gruba dijatomejska zemlja, a na tržištu se nalazi pod različitim komercijalnim nazivima kao što su: filtar-cel, celite itd. 2. Perlit, anorganski prah dobiven zagrijavanjem i mljevenjem alumino silikata vulkanskog podrijetla. Nepodoban je za filtraciju kiselih medija jer pri niskim pH vrijednostima otpušta ione Ca+2 i Fe+3, ako nije posebno obrađen s kiselinama, što ga jako poskupljuje. U pivovarama se uglavnom koriste: • Naplavni filtri s ravnim pločama, svijećama, diskovima i ulošcima, za primarno uklanjanje mikrobne biomase iz mikrobiološki promijenjenih podloga u kojima biomasa nije glavni proizvod, nego bistra biotehnološki promijenjena hranjiva podloga (npr. pivo, vino, ocat), • Slojni filtri ili filtri sa slojnicama, koji se koriste nakon naplavnog filtera za sekundarnu filtraciju odmikrobljenih biotehnoloških proizvoda, odnosno, ovisno o vrsti ploča za njihovu hladnu sterilizaciju. • Modularni i membranski filtri; također za sekundarnu filtraciju.
3.7.2. Centrifugiranje Kada se tijekom doviranja mladog piva, kvasac i druge suspendirane čestice ne istalože u dovoljnoj mjeri ili se postupak bistrenja piva želi ubrzati, taloženje se ubrzava primjenom centrifugalne sile. U praksi se koriste:
81
1. Centrifugalni separatori, koji mogu automatski izdvojiti suspendirane čestice i tekuću fazu s centrifugalnim ubrzanjem do 11.000 x g, a kapacitet im je do 200 m3/h. 2. Dekanteri (pužne centrifuge) s okretnim bubnjem i vodoravno ugrađenom pužnicom koja se okreće manjom brzinom od bubnja. Diferencijalna brzina pužnice omogućava pražnjenje taloga sa stjenki bubnja kroz središnji konusni otvor. Koriste se za separaciju vrlo gustih suspenzija. Ubrzanje im je oko 1000 g, a kapacitet im je ograničen. Za izdvajanje suspendiranih čestica u industriji piva češće se koriste centrifugalni separatori, jer su efikasniji. Brzina okretanja bubnja iznosi od 2.500 do 10.000 min -1, a njegov promjer do 800 mm, što omogućava postizavanje visokih g -vrijednosti koje se koriste za izdvajanje kvaščevih stanica.
3.7.3. Stabilizacija piva Gostioničke pivovare toče nefiltrirano pivo u vlastitim pivnicama izravno iz ležnih tankova, pa ga ne stabiliziraju. Neke ga prodaju kao točeno pivo iz bačvi, ali je trajnost takvog piva najviše 72 h, što znači da pivo treba istočiti iz bačve u tom vremenu. Za transportiranje piva na veće udaljenosti, prije otakanja u ambalažu pivo treba doraditi tj. stabilizirati da ne dođe do kvarenja. Postupak stabilizacije ovisi o roku upotrebljivosti, odnosno oznake «najbolje upotrijebiti do (mjesec i godina, što je navedeno na deklaraciji. Uzroci kvarenja, tj. zamućenja ili neupotrebljivosti piva mogu biti: 1. Mikroorganizmi (biološka nestabilnost) koji izazivaju zamućenje piva te promjenu okusa i mirisa. 2. Čestice koloida (proteini i polifenoli) koje se povećavaju s vremenom (starenjem piva) i izazivaju koloidnu nestabilnost; 3. Ostali prirodni sastojci piva koji se djelovanjem otopljenog kisika, ako je prisutan; ili djelovanjem svjetlosti mogu oksidirati ili promijeniti , što se naziva nestabilnost okusa. Koloidne čestice, prirodni sastojci piva, izazivaju njegovo zamućenje tijekom čuvanja u ambalaži, nakon dužeg vremena skladištenja. Razlikuju se dvije vrste zamućenja (Kunze, 1996): 1. Hladno ili prolazno 2. Trajno ili starosno. Prva vrsta zamućenja se događa tijekom čuvanja piva u hladnjaku pri - 2 do – 5o C, kada se molekule koloidnih sastojaka piva (proteina i polifenola) zbog Brownovog gibanja međusobno povezuju vodikovim mostovima (labilne veze) i povećavaju. Na njih se vežu i mali udjeli ugljikohidrata i mineralnih sastojaka (soli teških metala), pa se pivo zamuti. No, kada se pivo izvadi iz hladnjaka i zagrije na sobnu temperaturu labilne veze pucaju i pivo se izbistri. Nažalost, ova vrsta zamućenja s vremenom prelazi u trajno zamućenje koje se ne gubi nakon zagrijavanja i naziva starosna mutnoća. U pasteriziranom se pivu, koje nije bilo prethodno koloidno stabilizirano, može brzo pojaviti tzv. „pasterizacijska“ mutnoća. Isto tako, ako je tijekom otakanja pivo došlo u dodir sa zrakom, može se pojaviti „oksidacijska“ mutnoća, jer kisik povećava brzinu pojave zamućenja za 5 puta. Pivo u kojem su prisutni ioni teških metala se također lako zamuti, a takva vrsta mutnoće se naziva „metalna“ mutnoća. Do pojave koloidnog zamućenja piva neće doći ako se tijekom proizvodnje sladovine spriječi nastajanje visokog udjela složenih proteinskih sastojaka te ukloni dio tih sastojaka (potpuno odvajanje vrućeg taloga i dijela hladnog iz sladovine). Osim toga, iz piva prije otakanja u ambalažu potrebno je ukloniti sve sastojke i postupke koji doprinose nastajanju čestice mutnoće (složeni proteinski i polifenolni, teški metali, kisik, protresanje, svjetlost).
82
3.7.3.1. Koloidna stabilizacija piva Za postizavanje duge koloidne trajnosti, pivo je nužno stabilizirati dozvoljenim sredstvima, kao što su: bentoniti (prirodni alumosilikati), silikageli (H2SO4 + Na-vodeno staklo → hidrogel, sadrži 50 % H2O; ili kserogel, sadrži < 5 % H2O) i PVPP (polivinilpolipirolidon). Silikageli (promjer pora 3,0 – 3,5 μm) se doziraju u pivo tijekom filtracije (50 do 150 g/hl) u pufer tank u kojem se provodi stabilizacija prije doziranja pomoćnog filtracijskog sredstva (kieselgura) ili se doziraju zajedno s kieselgurom izravno u pivo prije filtracije. U oba slučaja na sebe vežu proteinske sastojke mutnoće koji ostaju na filtru. Taninski sastojci se vežu na PVPP vodikovim mostovima u kiselom mediju, a koji pucaju u lužnatom, pa je moguća regeneracija PVPP s lužinom. Primjena PVPP je ograničena na 50 g/hl piva. Učinak stabilizacije ovisi o vrsti, koncentraciji i kombinaciji sredstava za stabilizaciju. Naime, procjena koloidne stabilnosti piva nije jednostavna i uključuje brojne metode, kao što su kvantativno određivanje udjela proteina i polifenola u odležanom pivu, te određivanje proteinsko-taninskog kompleksa pomoću formalin testa, testa na hladno, alkohol-hladnog testa, testa ubrzanog starenja itd. Ipak, najčešće se ocjena koloidne stabilnosti piva izvodi na osnovi broja „toplih“ dana (Forcing test), tj. zadržavanja piva pri 40o C za nestabilizirano ili pri 60o C za stabilizirano pivo, te hlađenje na 0 oC dok se pivo ne zamuti do 2 EBC jedinice mutnoće. Najvjerojatnija trajnost piva u stvarnim uvjetima čuvanja dobije se množenjem „toplih“ dana s 40 do 60. 3.7.3.2. Biološka stabilizacija U pivu se mogu naći različiti mikroorganizmi, koji mogu biti štetni za potrošače, što je regulirano Pravilnikom o mikrobiološkim standardima za namirnice. Taj Pravilnik jamči da je pivo zdravstveno ispravno tj. - proizvedeno i otočeno u primjerenim higijenskim uvjetima, jer sadrži samo vrlo ograničen broj živih stanica kvasca, aerobnih mezofilnih bakterija i enterobakterija. Ipak, postoje i drugi mikroorganizmi koji su štetni za pivo, što je regulirano internim proizvođačkim standardom Međutim, to ne garantira da u pivu nema anaerobnih i mikroaerofilnih bakterija štetnih za biološku stabilnost piva. Procjena biološke stabilnosti piva je problematična, jer ovisi o broju i vrsti mikroorganizama primarnog i sekundarnog zagađenja te broju stanica pivskog kvasca zaostalom u filtriranom pivu, koncentraciji hranjivih sastojaka u pivu (šećeri, O2), te uvjetima čuvanja (temperatura, svjetlost) i specifičnoj brzini rasta prisutnih mikroorganizama (Marić i Bohunicki, 1972; Rainbow, 1981; Priest i Campbell, 1996). Stoga se biološki stabilnim smatra samo pivo koje ne sadrži žive mikrobne stanice, ima visoki stupanj prevrenja, sadrži malo otopljenog kisika (ispod 0,5 mg/l) i nije sekundarno zagađeno (punjač, boce, čepovi). Za biološku stabilizaciju piva se primjenjuju postupci smanjivanja ukupnog broja ili potpunog uklanjanja živih mikroorganizama. Biološka stabilizacija tijekom bistrenja/filtracije. To je ustvari stabilizacija piva pomoću naplavne/dubinske, odnosno površinske filtracije kroz slojnice ili membrane s različitim promjerom pora; biološka trajnost piva se povećavaju s “oštrinom” filtracije. To znači da se zadovoljavajuća biološka stabilnost može postići povećanim doziranjem fine dijatomejske zemlje tijekom filtracije, odnosno sekundarnom filtracijom piva kroz slojnice ili membrane finog poroziteta. U suvremenom pivarstvu taj se postupak može povezati i s koloidnom stabilizacijom (Sl. 3.25.) Nedostatak ovog postupka je što velike
83
industrijske pivovare trebaju nekoliko stotina takvih membranskih modula, a to je skupo i složeno.
3.25. Linija za biološku i koloidnu stabilizaciju piva tijekom filtracije (Kunze, 1996) 1 – naplavni sviječasti dijatomejski filtar; 2 – filtar s PVPP-om (uklanjanje polifenola); 3 – slojni filtar; 4 – membranski filtar; 5 – pufer tank; 6 – tlačni tank Broj prisutnih mikroorganizama u pivu se može smanjiti ili odgoditi njihovo umnožavanje primjenom konzervansa (k-sorbat, sorbinska kiselina, Kmetabisulfit/vinobran) tijekom filtracije. Taj postupak nije dozvoljen u nekim zemljama, a u drugima zahtijeva deklariranje vrste i koncentracije dodanog konzervansa. Pasterizacija. Nakon bistrenja pivo se biološki stabilizira pomoću topline postupkom pasterizacije. Prije pasterizacije je preporučljivo pivo koloidno stabilizirati. Primjenjuju se dva postupka: brzi/protočni i šaržni/tunelski. Prvi se postupak temelji na zagrijavanju piva koje teče kroz pločasti ili cijevni izmjenjivač topline na 68 do 72o C u trajanju oko 50 sekundi, te brzom hlađenju, prvo s nepasteriziranim pivom, a zatim rashladnom smjesom prije punjenja u ambalažu. Kako zadržavanje piva u postrojenju pasterizatora traje do 2 minute nema nepoželjnih posljedica po okus piva. Postupak omogućava regeneraciju oko 80-90 % unesene energije, pa se primjenjuje u mnogim pivovarama. Šaržni postupak je dugotrajan i energetski nepovoljan pa se u suvremenim pivovarama rijetko provodi. Biološka stabilizacija nakon otakanja u ambalažu: Potpuna biološka stabilnost piva postiže se pasterizacijom napunjenih staklenih boca ili limenki šaržnim postupkom u tunelskom pasterizatoru. Pivo se polagano zagrijava na 60 – 62 oC tijekom 20 – 25 minuta. Zadržavanje piva na toj temperaturi traje 10 – 20 minuta. Zatim slijedi hlađenje piva, koje također traje 20 – 25 minuta. Prema tome, ukupno vrijeme prolaza piva kroz pasterizator je oko 1 sat, a posljedice su povećanje boje piva, eventualno pojava taloga i okusa po kruhu, što se često naziva “pasterizacijski“okus. Stoga, gotovo pivo mora biti prije otakanja koloidno stabilizirano, otočeno u boce bez prisustva kisika ili mu se dodaju reduktoni (askorbinska kiselina npr.). Postupak zahtijeva puno toplinske energije (1,2 x 106 Kj/1000 boca), iako voda recirkulira u zatvorenom sustavu, što omogućava ponovno korištenje topline.
3.7.4. Nestabilnost okusa Tijekom čuvanja piva u ambalaži dolazi do promjene njegova okusa zbog oksidacijskih reakcija, ako je pivo pri otakanju došlo u dodir sa zrakom (kisikom). Naime, oksidirani
84
sastojci daju “nečist” okus i miris. Promjene okusa se ubrzavaju pod utjecajem povišenih temperatura skladištenja i izloženosti svjetlosti, pa se preporuča ambalažirano pivo čuvati u tamnom prostoru pri stalnoj temperaturi (< 10° C). Ipak, tijekom čuvanja pivo postaje sve «starije», jer se zbog tih reakcija povećava udjel karbonilnih spojeva u njemu (tablica 3.8.). Stoga je senzorska ocjena piva najbolja 2 do 3 dana nakon filtracije i otakanja u ambalažu. Tablica 3.8. Udjel nekih sastojaka u svježem i starom pivu (Kunze, 1996) Sastojak Svježe pivo “Staro“ (μg/L) pivo (μg/L) 2 – metil butanal ~ 60 ~ 180 3 – metil butanal ~ 20 ~ 110 3 – metil butan-2-on ~ 16 ~ 110 Fenilacetaldehid ~ 45 ~ 250 Benzaldehid ~4 ~ 259 2 – furfural ~ 40 ~ 3000 γ – nonalakton ~ 60 ~ 150 Etilester nikotinske kiseline ~ 10 ~ 750 Heptanal ~4 ~ 25 Nije poznato koji od ovih sastojaka utječe na pojavu okusa “starog“ piva, ali je ustanovljeno da kisik i u najmanjim koncentracijama ubrzava pojavu okusa “starog“ piva. Zato se sve manipulacije s pivom provode u atmosferi CO2, koji se koristi za uspostavljanje pretlaka u posudama prije punjenja i održavanje tlaka prilikom njihova pražnjena.
3.7.5. Korekcija udjela nekih sastojaka piva Pivo otočeno u ambalažu mora imati uvijek istu tj. stalnu kvalitetu. To se prije svega odnosi na punoću okusa, udjel neprevrelog ekstrakta i alkohola, boju, reskost, gorčinu, visinu i trajnost pjene. Za standardizaciju kvalitete piva mogu se primijeniti slijedeće metode. Karbonizacija piva: Otočeno pivo u ambalaži mora sadržavati preko 4 g CO2/L. Dorada piva pri nižim tlakovima i višim temperaturama može izazvati gubitak CO2, koji se tijekom točenja nadoknađuje karbonizacijom pomoću CO2, koji se kao nusproizvod alkoholnog vrenja prikuplja, pročišćava i ukapljava. Razrjeđivanje piva, dodavanje boje, gorkih sastojaka i stabilizatora pjene: Danas je uobičajeno proizvoditi pivo iz sladovine s višim udjelom ekstrakta (npr. 15 – 18 %; a zatim ga nakon stabilizacije i filtracije razrjeđivati posebno pripremljenom karboniziranom vodom (deaerirana i omekšana) na zadanu koncentraciju etanola i neprevrelog ekstrakta. Za povećanje boje razrjeđenog piva dodaju se dozvoljene boje (karamel). Gorčina se korigira dodatkom sintetske α-kiseline ili izomeriziranog hmeljnog ekstrakta. Oksidacijske promjene se mogu spriječiti dodatkom reducensa, kao što su askorbinska kiselina, izoaskorbinska kiselina ili SO2. Stabilizatori pjene i reducensi su aditivi, pa se moraju navesti na deklaraciji. Za stabilizaciju pjene dodaju se dozvoljeni stabilizatori (različiti komercijalni pripravci na bazi alginatnih estera).
85
3.7.6. Tlačni tankovi Bistro, stabilizirano, karbonizirano i eventualno korigirano pivo se čuva u tlačnim tankovima, koji su prije punjenja stavljeni pod tlak CO2. To su puferske posude između filtera i punjača. Njihove unutrašnje stjenke su vrlo glatke, pa se lako čiste CIP sustavom pranja. U njima se pivo zadržava do tri dana prije izobarometarskog punjenja u ambalažu.
3.8. MIKROBIOLOŠKI NADZOR PROIZVODNJE PIVA U svakoj tehnološkoj fazi proizvodnje piva mogu se pojaviti specifični mikroorganizmi (tablica 3.9). Spomenuti se mikroorganizmi mogu podijeliti u tri grupe: 1. Neškodljivi; tzv. prateći mikroorganizmi, koji se ne mogu razmnožavati u pivu, pa s vremenom odumiru. To mogu biti spore plijesni, različite vrste bakterija i kvasaca. 2. Potencijalno štetni mikroorganizmi: koji se razmnožavaju u samo za njih povoljnim uvjetima, kao što su npr. povećan udjel kisika u pivu, relativno visoka pH vrijednost piva (4,7 do 4,8), mali udjel gorkih sastojaka hmelja i visoki udjel neprevrelog ekstrakta. Predstavnici ove vrste mikroorganizama su bakterije: Lactobacillus casei, Streptococcus lactis, Pectinatus cerevisiphilus, Megasphera cerevisiae i Enterobacteriaceae. Posljedice njihova rasta u pivu su: promjena pH vrijednosti zbog nastajanja mliječne kiseline i loš okus (S. lactis) te potpuno kvarenje piva (P. cerevisiciphilus i M. cerevisiae) Tablica 3.9. Rodovi bakterija i divljih kvasaca pronađeni u pivovarama (Priest i Campbell, 1996) Gram-pozitivne Gram-negativne bakterije Divlji kvasci bakterije Bacillus Acetobacter Klebsiella Brettanomyces Kloeckera Lactobacillus Acinebacter Candida Pichia Leuconostoc Alcaligenes Megashaera Cryptococcus Rhpdotorula Micrococcus Citrobacter Obesumbacterium Debaryomyces Torulopsis Pediococcus Enterobacter Pectinatus Endomyces Saccharomyces Streptococcus Flavobacterium Proteus Hansenula Zygosaccharomyces Gluconobacter Pseudomonas Hafnia Zymomonas 3. Obligatno štetni mikroorganizmi, koji su imuni na odsustvo kisika i niske pH vrijednosti. Njihov rast, razmnožavanje i proizvodi metabolizma također izazivaju promjenu okusa i mirisa piva, a ako se razviju u većem broju, nakon dovoljno dugo vremena tvore talog i zamućuju pivo. Najčešće su to mliječno kisele bakterije iz roda Lactobacillus, kao što su L. brevis, L. lindneri, L. frigidus te Pediococcus damnosus. Tako P. damnosus, tzv. pivska sarcina može povećati udjel diacetila u ambalažiranom pivu. No, među njima se mogu naći i stanice različitih kvasaca koje izazivaju promjenu okusa, pojavu zamućenja i taloga. Često su to stanice pivskog kvasca zaostale u pivu nakon filtracije, zatim stanice “divljih” kvasaca iz roda Saccharomyces te stanice stranih kvasaca, koji ne pripadaju tom rodu, kao npr. sojevi iz rodova: Brettanomyces, Torulopsis, Hausenula i Candida.
86
3.8.1. Divlji kvasci Gilliland (1967) je podijelio „divlje“ kvasce u četiri skupine, i to: fermentativni kvasci; kvasci ubojice (“killer” kvasci); različiti “kulturni“(proizvodni) kvasci i aerobni kvasci Fermentativni kvasci su pripadnici rodova Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora i Zygosaccharomyces, koji imaju slične biokemijske osobine i mogu rasti zajedno s sojevima kvasca S. cerevisiae. Međutim, “divlji“ sojevi iz roda Saccharomyces rastu brže od proizvodnog soja, jer brže koriste hranjive sastojke iz sladovine, a imaju i manje zahtjeve za vitaminima, pa njihov broj može brzo nadmašiti broj stanica proizvodnog kvasca, pa se čista kultura kvasca neminovno, prije ili kasnije zagadi nakon uzastopnog recikliranja u proces. Kako je sposobnost flokulacije, odnosno sedimentacije stanica, jedno od najvažnijih svojstava pivskog kvasca, a divlji kvasci nisu flokulentni, pivo zagađeno divljim kvascem ostaje mutno i nakon dugog odležavanja. Ako se takvo pivo tretira sa sredstvima za bistrenje, prisutnost divljih kvasaca može izazvati trajno zamućenje, jer su stanice mnogih od ovih kvasaca manje od stanica “kulturnog“ kvasca koji se uklanja filtracijom ili centrifugiranjem. Osim toga, pivski kvasac rijetko sporulira, ali “divlji“ da, pa i nakon pasterizacije zaostaju u pivu, jer su njihove spore otporne na povišene temperature. Kvasci ubojice su ekstremni oblici bioloških zagađivača, jer u okoliš izlučuju različite zimocine (proteine) koji ubijaju osjetljiv “kulturni“ kvasac, pa nakon nekog vremena postaju dominantni u mladom pivu. Takvo pivo ima loš (smrdljiv) okus i miris, a konačni stupanj prevrenja mu je nizak. Ti kvasci pripadaju rodu Saccharomyces, pa se često ne može ustanoviti prisutnost sve dok ne postanu dominantna kultura. Međutim, njihova prisutnost na neselektivnim podlogama može se odrediti samo na bazi različite morfologije i boje kolonija. Iako bi se genetičkim inženjerstvom u “kulturni“ kvasac mogla ugraditi određena otpornost (ugrađivanjem “killer” faktora), to se izbjegava, zbog opasnosti od promijene njegovih specifičnih svojstva. Proizvodni (kulturni) kvasci: U proizvodnji piva se obično koristi jedan ili više specifičnih sojeva čiste kulture pivskog kvasca. Kada se proizvodi više vrsta piva postoji opasnost od pogreške da se u sladovinu za jedan tip piva nacijepi kultura kvasca za drugi tip. Takve pogreške treba izbjegavati, jer brzina vrenja, prevrelost, sposobnost flokulacije, vrsta i udjel sastojaka o kojima ovisi okus i miris piva te nastajanje pjene su važna svojstva pojedinačnih sojeva. Stoga je nužno povremeno provjeravati svaki soj pomoću brzih testova ili genetskih proba, da bi se ustanovio njegov identitet. Aerobni kvasci: Kvasci iz roda Pichia, posebice P. membranaefaciens, su najčešći aerobni nefermentativni(ili vrlo rijetko fermentativni) kvasci koji zagađuju pivo. Iako se ovi kvasci smatraju aerobnim mikroorganizmima, u sladovini mogu rasti u potpuno anaerobnim uvjetima. No, u mladom pivu, koje sadrži kiseline i etanol, ne mogu rasti anaerobno. Rodovi Brettanomyces i Dekkera, koji proizvode octenu kiselinu i izazivaju zamućenje piva, trebaju kisik za svoj rast i metabolizam, važan su sastojak kvaščeve flore pri vrenju Belgijskih lambic piva. Poput bakterija iz roda Acetobacter i Gluconobacter, mogu rasti i u pivu tijekom odležavanja, ako slučajno postoji dodir sa zrakom. Priroda pivske flore uvelike ovisi o pristupu zraka, pa takve kulture mogu rasti i u pakiranom pivu, ako nisu inaktivirane pasterizacijom ili nisu uklonjene filtracijom. Pripadnici rodova Debaromyces, Filobasidium i Pichia, te Candida rastu u aerobnim uvjetima u pivu. Izazivaju zamućenje, ponekad stvaraju pokožicu ili “film” na površini, te pahuljice ili talog.
87
3.8.2. Bakterijski kontaminanti piva Bakterijska se populacija u pivovari mijenja tijekom tehnološkog postupka od početka proizvodnje stadovine do gotovog piva otočenog u boce ili bačve, ovako: 1. Ukomljavanje i kuhanje sladovine: BMK (Pediococcus acidi lactici i L. delbrueckii); 2. Ohmeljena sladovina od hlađenja do početka vrenja: koliformne i bakterije octene kiseline; 3. Glavno vrenje: Obesumbacterium proteus, laktobacili, pediokoki; 4. Naknadno vrenje: Zymomonas anaerobia, bakterije octene kiseline; 5. Punjenje u boce ili bačve: koliformne bakterije. Obligatno štetne bakterije u pivu mogu biti Gram-pozitivne i Gram–negativne. 3.8.2.1. Gram-pozitivne bakterije Tipični predstavnici Gram-pozitivnih bakterija su bakterije mliječne kiseline(BMK), u obliku štapića i koka, najčešće iz rodova Lactobacillus i Pediococcuc (Priest i Campbell, 1996). Lactobacillus. BMK iz ovog roda nemaju enzim katalazu, pa im je metabolizam striktno fermentativan, ne sporuliraju i većinom su štapićastog oblika. Prema metaboličkim putevima razgradnje šećera dijele se na homofermentativne i heterofermentativne, te fakultativno heterofermentativne. Homofermentativne proizvode samo mliječnu kiselinu iz piruvata, dok heterofermentativne preko 6-P- glukonatnog puta proizvode smjesu mliječne kiseline, CO2, octene kiseline i etanola. Međutim, fakultativno heterofermentativne bakterije imaju enzim fosfoketolazu koja se inducira pentoznim šećerima, a u prisustvu glukoze ponašaju se kao homofermentativne BMK. Bakterije iz ovih rodova su aerotolerantni anaerobi, odnosno mikroaerofili, pa za razliku od striktnih anaeroba, BMK ne odumiru u prisutnosti kisika. Najčešći zagađivač piva je L. brevis, bakterija otporna na mikrobicidno djelovanje hmelja. Optimalno raste pri 30 oC i pH 4-5. Ostali laktobacili koji se mogu naći u pivu su: L. lindneri, L. delbrueckii, L. fructivorans, L. fermentum, L. oryneformis i L. plantarum. Eschenbecher (1969) je uočio da se u jače hmeljenim pivima mnogo češće pojavljuju fakultativno heterofermentativne nego heterofermentativne BMK. Back (1982) smatra da u pivarskoj praksi treba eliminirati i najmanju prisutnost laktobacila, a da njihov rast u pivu ovisi o vrsti piva. Rast laktobacila u pivu inhibiraju trans-humuloni i kolupuloni, sastojci hmelja. Laktobacili su najopasniji tijekom odležavanja piva i njegova čuvanja u ambalaži. Kvarenje ima za posljedicu pojavu blage mutnoće, ali se ponekad prije toga javlja okus i miris na užegnuti maslac, kao posljedica nastalog diacetila (prag: 0,15 mg/L). Glavni proizvod metabolizma laktobacila je mliječna kiselina, čiji je prag osjetljivosti 300 mg/L). Pediococcus. To su homofermentativne bakterije mliječne kiseline, pojavljuju se u obliku parova ili tetrada, a u pivarstvu su poznati pod imenom “sarcina”. Najčešći pediokok pronađen u pivu tijekom doviranja i u ambalaži je Pediococcus damnosus. On se rijetko nalazi u kvascu za nacjepljivanje, a uopće ga nema na pivskim sirovinama. Pojava vrsta Pediococcus dextrinicus i P. pentosaceus u pivu je mnogo rjeđa. Iako različite vrste pediokoka mogu preživjeti u pivu tijekom dužeg perioda, samo se P. damnosus i P. inopinatus mogu u njemu razmnožavati, jer je rast različitih vrsta pediokoka inhibiran niskom pH vrijednošću i gorkim sastojcima hmelja. Pediokoki izazivaju nastajanje kiselina i diacetila i daju pivu okus po maslacu, kao i laktobacili. Ostale Gram-pozitivne bakterije. Leuconostoc vrste su heterofermentativne bakterije, koje se rijetko susreću u pivovarama. U pivu je pronađen samo Leuuconostoc
88
mesenteroides, ali nije odgovoran za kvarenje piva. Od ostalih Gram-pozitivnih bakterija u pivovarama se pojavljuje jedino Streptococcus lactis koji se može lako zamijeniti s laktobacilima jer raste na istim podlogama. Razlikuje se od leukonostoka po homofermentativnom metabolizmu šećera, a od pivskih pediokoka po staničnoj morfologiji, jer tvori prije lance nego tetrade, rastu pri pH 9,2, dok pediokoki ne rastu na visokom pH. Rodovi Micrococcus i Staphylococcus također pripadaju Gram-pozitivnim kokima. Imaju katalaznu aktivnost ali nemaju mliječno – fermentativni metabolizam. Mikrokoki su striktni aerobi. Iako ih pivari ne smatraju važnim, najnovija su istraživanja pokazala da su široko rasprostranjeni u pivu i pivovarama, te da izazivaju kvarenje piva (Priest i Campbell, 1996 ). Slabo ili nikako ne rastu pri pH vrijednostima nižim od 4,5, ali im ne smetaju sastojci hmelja. U pivu mogu preživjeti duže vrijeme. Micrococcus kristinae je atipični Micrococcus, jer je fakultativni anaerob, otporan na kiselinu i hmelj i odgovoran za kvarenje piva s niskom gorčinom, posebno pri višim pH vrijednostima. Intenzitet rasta ovisi o koncentraciji kisika u pivu, ali čak i rast u tragovima izaziva voćnu aromu i netipičan okus piva. 3.8.2.2. Gram - negativne bakterije Tijekom proizvodnje piva mogu se naći u pivu mnoge gram-negativne bakterije. Bakterije octene kiseline. One su tipičan predstavnik gram–negativnih bakterija sposobnih da oksidiraju alkohol u octenu kiselinu, pa mogu pokvariti pivo. Podijeljene su u dva roda: Acetobacter i Gluconobacter. Stanice roda Acetobacter su obligatni aerobi, katalaza pozitivni s respiratornim metabolizmom. Etanol oksidiraju do octene kiseline, a octenu kiselinu do CO2 i H2O heksoza monofosfatnim putem i TCA-ciklusom (Rainbow,1981). U tekućim podlogama stvaraju tanki biofilm i zamućenje a ponekad se mogu uočiti nakupine stanica. Razlikuju se ove vrste: Acetobacter aceti, A. liquefaciens, A. pasteurianus i A. hansenii. Acetobacteri izravno oksidiraju šećere, alkohole i steroide. Dobro rastu u podlozi koja sadrži etanol, glicerol i natrijev laktat kao jedini izvor ugljika. Morfologija stanica roda Gluconobacter je vrlo slična stanicama roda Acetobacter. Pokretne stanice imaju između tri i osam polarnih flagela. Obligatni su aerobi, katalaza pozitivni, oksidaza negativni, ne reduciraju nitrat do nitrita, ali oksidiraju etanol do octene kiseline. U pivu, sladovini ili podlogama s glukozom, stvaraju film na površini. Neki sojevi viskozno rastu u pivu, kao posljedica izlučivanja dekstrana. Gluconobacter vrste imaju respiratorni metabolizam s kisikom kao krajnjim akceptorom elektrona. Mogu oksidirati šećere, steroide i alifatske i cikličke alkohole. Vrste iz rodova Acetobacter i Gluconobacter su otporne na bakteriostatska svojstva hmelja, kiseline i alkohol i zbog toga su sposobne kvariti pivo. Iako su striktni aerobi, pa ne mogu rasti u sladovini i pivu dok vladaju anaerobni uvjeti, istraživanja su pokazala da su sojevi pronađeni u pivu vjerojatno mikroaerofili, jer su izolirani iz piva s malom koncentracijom kisika Ove bakterije izazivaju kiseli, neugodan okus, zamućenje piva, kao posljedicu oksidacije polialkohola, kao što je glicerol sve do dihidroksiacetona. Zamućenje piva se ogleda u pojavi pokrova (pokožice) na površini piva. Jačina zagađenosti piva ovisi o vrsti i soju bakterije i koncentraciji alkohola u pivu. Još 1936. godine je uočeno da su bakterije potpuno inhibirane kod koncentracije alkohola iznad 6 %. No, neki sojevi rastu na podlogama koje sadrže i 10 % alkohola, a Acetobacter sp. BS05 i Gluconobacter oxydans var. oxydans NCIB 9013 mogu preživjeti i pri 12-13 % alkohola u pivima proizvedenim iz sladovine s visokom koncentracijom ekstrakta (Priest i Campbell,1996).Bakterije iz ovih rodova nalaze se na ječmu, sladu i hmelju,u sladovini,
89
kvascu, tankovima za odležavanje, postrojenju za filtraciju te zraku. Otporne su na antiseptična svojstva hmelja, kisele uvjete i tolerantne su na etanol. Enterobacteriaceae. Ta porodica ima velik broj bakterijskih rodova koji zaostaju u pivu, a to su: Escherichia, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Salmonella, Erwinia, Klyvera, Serratia, Cedecea, Morganella, Hafnia, Proteus, Yersinia, Rahnella i Tatumella. Sve vrste iz tih rodova važne za pivarstvo su katalaza pozitivne i oksidaza negativne. Obesumbacterium proteus je najpoznatija enterobakterija koja zagađuje pivo. Najčešće se nalazi u kvascu za nacjepljivanje, a ima oblik kratkog debelog štapića. Raste u hmeljenoj i nehmeljenoj sladovini pri od pH 4,4, do 9,0 i podnosi koncentracije etanola do 6 % vol. Može usporiti glavno vrenje, a posljedica je pivo s previsokom koncentracijom neprevrelog ekstrakta i povišenom pH vrijednošću. Ova je bakterija odgovorna za povećanu koncentraciju dimetil sulfida, dimetil-disulfida, n-propanola, izobutanola, izopentanola, 2,3-butandiola i diacetila u pivu. Udjel ovih spojeva ovisi o soju. Pivo zagađeno s O. proteus ima jako izražen voćni okus i miris. Poznato je da enterobakterije usporavaju ili ubrzavaju vrenje i značajno utječu na miris i okus konačnog proizvoda. Plinskom kromatografijom je ustanovljeno da enterobakterije izlučuju u pivo 60 proizvoda svog metabolizma. Smatra se da ostale enterobakterije, za razliku od bakterija O. proteus i Rachnella aquatilis, ne preživljavaju uvjete vrenja piva. No, moguće je da postoje u tzv. “nevidljivom” stanju, što znači da se njihov rast ne zapaža na standardnim laboratorijskim podlogama, pa mogu imati ozbiljan učinak na pivo. Anaerobne Gram-negativne bakterije: Striktno anaerobne bakterije izazivaju kvarenje piva, jer proizvode značajne količine octene i propionske kiseline te acetoina, prvo u mladom a zatim i u pakiranom pivu, koje se postepeno zamućuje i dobiva okus po pokvarenim jajima. Rod Zymomonas je tipičan predstavnik ovih bakterija čije su stanice kratki debeljuškasti štapići veličine 1,0-1,4 μm x 2,0-6,0 μm, a pojavljuju se najčešće u parovima i samostalno. Ne tvore endospore, uglavnom nisu pokretni, a pokretni sojevi imaju četiri polarne flagele. Previru glukozu i fruktozu do etanola i CO2 modificiranom glikolizom, pri čemu nastaju male koncentracije acetaldehida, octene kiseline, mliječne kiseline i glicerola. Oksidaza su negativni i anaerobni, ali podnose male koncentracije kisika. Najvažnije im je svojstvo sposobnost rasta i metabolizma u prisutnosti visokih koncentracija etanola (čak do 15 % vol). Rijetko se nalaze u lager pivima, jer im niske temperature vrenja (8-12 oC) ne odgovaraju. Kokoidne stanice roda Megasphaera mogu se naći u zamućenom i smrdljivom pivu u ambalaži. Striktno su anaerobni, rastu na temperaturama između 15 i 37 oC, a optimalna je 28 oC. Katalaza su negativni, proizvode H2S. Vrste iz roda Megasphaera proizvode značajne količine maslačne kiseline u pivu, a u manjim koncentracijama acetoin. Smatraju se pravim i opasnim zagađivačem piva.
3.8.3. Sporogene bakterije Od aerobnih sporogenih bakterija najčešće su one koje pripadaju rodu Bacillus. Njihove se spore nalaze na sladu i zrnju žitarica koje se koriste za proizvodnju sladovine. Spore mogu preživjeti kuhanje sladovine, otporne su na hmelj, ali ne mogu proklijati zbog niske pH vrijednosti sladovine i mladog piva. B. coagulans i B. stearothermophylus mogu proizvesti mliječnu kiselinu u sladovini pri temperaturi 55-70 oC, ako je vrijeme zadržavanja duže od 2 sata. Osim toga, sojevi vrste B. coagulans potpomažu nastajanje nitrozamina preko redukcije nitrata do nitrita.
90
3.8.4. Cilj i provedba mikrobiološkog nadzora Cilj mikrobiološkog nadzora je ustanoviti gdje i kako nepoželjni mikroorganizmi dospijevaju u sladovinu ili pivo. Najčešći izvori zagađenja mogu biti: nedovoljno čisti cjevovodi kroz koji se transportiraju sladovina ili pivo, nečiste posude za njihovo čuvanje ili tehnološku preradu, nesterilan zrak i voda s kojima oba medija dolaze u dodir te “čista“ kultura kvasca koja se može mikrobiološki zagaditi tijekom reciklacije kvasca za nacjepljivanje u sladovinu. Prema mnogim autorima (Marić i Bohumicki, 1972; Rainbow, 1981; Anon., 1985; Priest i Campbell, 1996 ), uspješna biološka kontrola se svodi na: 1. Često uzimanje uzoraka, 2. Učestali nadzor mjesta koja se nepouzdano peru i dezinficiraju, kao što su: mjerni uređaji i cjevovodi za njihovo povezivanje, pumpe, ventili s čepovima i poklopcima za blindiranje te ventili za uzorkovanje, gumena crijeva i ostali cjevovodi i dr. 3. Stalni mikrobiološki nadzor “čiste“ kulture kvasca (prije nacjepljivanja i nakon vrenja), vode za pranje i ispiranje te zraka za aeraciju sladovine. U pivarskoj praksi se razlikuje šest tipova uzoraka za mikrobiološku analizu, koji se tretiraju na različite načine kako bi se dobili zadovoljavajući rezultati. Određeni se broj brzih metoda temelji na istraživanjima rasta bakterije E. coli, čija je specifična brzina rasta vrlo velika u odnosu na većinu zagađivača u proizvodnji piva. Stoga, brzi test određivanja prisutnosti E. coli (generacijskovrijeme 20-30 minuta) traje oko 2-3 sata, dok test za određivanje prisutnosti vrsta Pediococcus damnosus ili Lactobacillus lindneri (generacijsko vrijeme 5 sati) zahtijeva nekoliko dana. Nova znanja temeljena na molekularnoj biologiji i genetičkom inženjerstvu omogućila su razvoj novih tehnika za karakterizaciju kontaminanata na molekularnoj razini. (tablica 3.10). Tablica 3.10. Tehnike brzog otkrivanja mikroorganizama (Priest i Campbell, 1996) Metoda Tehnike Fizičke Mjerenje vodljivosti; Mikrokalorimetrija; Turbidometrija Protočna citometrija; Metoda s mikrokolonijama Biokemijske Izravna epifluorescencija filterske tehnike; ATP bioluminiscencija;Uzimanje proteinskih otisaka;Imunoanaliza (ELISA) Molekularne Molekularne probe (DNK / RNK); Kariotipija (CHEF);Polimerazna lančana reakcija; Slučajnim odabirom pojačana polimorfna DNK PCR
3.8.5. Uklanjanje nepoželjnih mikroorganizama, čišćenje i dezinfekcija Higijena je oduvijek bila važna u procesu proizvodnje piva. Danas su higijenski zahtjevi povećani, zbog sve dužih distribucijskih putova i zahtjeva za povećanom trajnošću proizvoda. Ukratko, potrebno je čistiti, dezinficirati ili sterilizirati sve potencijalne izvore mikrobnog zagađenja konačnog proizvoda u svim fazama proizvodnje. Mogući izvori mikrobnog zagađenja su: sirovine, voda, zrak, djelatnici, radne površine i tehnološka oprema. Tipične nečistoće su ostaci ishodnih sirovina ili gotovih proizvoda na tehnološkoj opremi, ambalaži i ostalim površinama. Po kemijskom sastavu to su: proteini, masnoće (masti i ulja), pektini, tanini, hmeljne smole, prirodne i sintetičke boje, soli, mineralni sastojci (pivski kamenac, Ca-oksalat) te spojevi nastali korozijom opreme. Čišćenje i dezinfekcija su fizički i kemijski postupci za sprječavanje mikrobnog zagađenja putem djelatnika, radnih površina i tehnološke opreme.
91
Koriste se dva sustava čišćenja: CIP postupci (cleaning in place) i COP postupci (cleaning out place), dok su standardi čišćenja podijeljeni na (Kunze,1996): • Fizičku čistoću: “okom” vidljiva čistoća, • Kemijsku čistoću: čišćenje pri kojem sve što je u dodiru s proizvodom (bilo koja površina) ne sadrži zagađivala, • Mikrobiološku (biološku) čistoću: čišćenje do razine kada nema nikakvog zagađenja. Čišćenjem se uklanjaju razne nečistoće koje mogu poslužiti kao hranjiva podloga za mikroorganizme, kao i sami mikroorganizmi. Postupak čišćenja i dezinfekcije provodi se po fazama: mehaničko čišćenje – uklanjanje vidljive nečistoće; kemijsko čišćenje – uklanjanje okom nevidljivih zaostataka vidljive nečistoće; ispiranje vodom; dezinfekcija i zadnje ispiranje vodom. U praksi je CIP sustav pokazao nekoliko prednosti pred COP sustavom: • Veća sigurnost (manje ručnog rada, reduciran ljudski faktor, siguran rad) • Viša kvaliteta sanitacije (kontrola parametara, ponovljivost rezultata) • Kontrola troškova (potrošnja vode, energije, kemikalija, manji broj zaposlenih) Ipak, COP postupak se koristi za vanjsko čišćenje proizvodnih linija i površina u pogonima (prije i nakon demontaže).
92
LITERATURA Anon. (1985). Analitika EBC III i mikrobiološka analitika EBC, Poslovna zajednica industrije piva Jugoslavije, Beograd Beazly, M. (1994). Michael Jackson's beer companion, A DBP book, Duncan Baird publishers, London. Berg,, J.M., Tymoczko,J.L. and Steyer,L. (2001). Biochemistry, W.H Freeman and Company, 438-439. Enari, T.M., Linko,M., Loisa, M. and Makinen,V. (1970). The effect of wort aminoacids on fermentation. Master brewers assoc. Am. Tech.Quart. 7,237-240 Enari,T.M. (2000). One hundred yeasrs of brewing research, EBC publi. company. Fertman, G.I., Šoihet,M.I. i Čepeleva.A..S. (1966). Tehnologija brodiljnih proizvodstv, Izdatelstvo «Višaja škola», Moskva Gaćeša,S. (1979). Tehnologija slada sa sirovinama za tehnologiju piva, Poslovna zajednica industrije piva i slada Jugoslavije, Beograd,. Hough,J.S., Brigs,D.E. and Stevens,R. (1982). Malting and brewing science, second edition, Chapman & Hall, London. Hough, J.S. (1998). Biotechnology of malting and brewing, Cambridge University Press,. Jackson, M. (1988). The new world guide to beer, A Quarto book, Running press book publishers, Philadelphia,. Jacksom, M. ( 2000). Great beer guide, Dorling Kindersley Limimted, London. Karlson, P. (1993).Biokemija, Školska knjiga .Zagreb. Kunze, W. (1996).Technology, Brewing and Malting, international edition, VLB, Berlin,. Leskošek–Čukalović, I. (2002). Tehnologija piva, Prvi dio, Slad i nesladovane sirovine, Poljoprivredni fakultet, Beograd. Lewis, J.M. And Young,T.W. (1995). Brewing, Chapman & Hall, London. Maljcev, P.M.(1964). Tehnologija soloda i piva. Izdateljstvo «Piščevaja promišlenost», Moskva. Marić,V. i Bohunicki,J. (1987). Priručnik za mikrobiologe u pivarstvu, Poslovna zajednica industrije piva i slada Jugoslavije, Zagreb. Marić, V. ( 1987). Tehnologija slada i piva, PBF, interna skripta, Zagreb. Marić, V. i Nadvornik,Z. (1995). Pivo-tekuća hrana, ZSB, Zagreb,. Marić, V. ( 2000). Biotehnologija i sirovine, SIP, Zagreb,. Mohaček, M. (1948). Pivovarstvo, Priručnik za izobrazbu stručnih kadrova. Nakladni zavod Hrvatske, Zagreb. Petersen, H. (1993). Brauereianlagen, Vrlag Hans Carl, Nürnberg. Priest, F.G. and Campbell, I. (1996). Brewing microbiology, second edition, Chapman & Hall, London. Rainbow, C. (1970). Brewer's yeast. In The Yeasts, vol 3., Rose A.H. and Harrison J.S. (eds.), Academic Press, London, 147 – 550. Rainbow, C. (1981). Beer spoilage microorganisms. In Brewing Science, vol 2, Pollock,J.R.A. (ed.), Academic Press, New York and London,.491 - 550. Reed, G. and Nagodawithana,T.W. (1991). Brewer's yeast In Yeast technology, second edition, .89 – 149. Rhodes, A.. and Fletcher,D.L. (1966). Alcoholic bevarages. In Principles of industrial microbiology, Pergamon Press, Oxford, 164 – 174. Schuster, K., Weinfurtner, F. and Narzis,L. (1988).Tehnologija proizvodnje sladovine, Poslovna zajednica industrije piva i slada Jugoslavije, Beograd. Schuster, K., Weinfurtner,F. i Narzis,L.(1990). Tehnologija proizvodnje slada, Ibid., Beograd, Semiz, M. (1979). Tehnologija piva, Ibid., Beograd,. Štefanić, K., Lalić,B. i Marić,V.(1983). Otpadne vode proizvodnje piva, slada i bezalkoholnih pića s mogućnostima njihove obrade, Ibid., Beograd,. Štefanić, K. i Marić,V., Pivarski priručnik, Ibid, Zagreb, 1989. Varnam, A.H. and Sutherlana,J.P. (1994). Baverages, technology chemistry microbiologa, Chapman & Hall, London, 296 – 352.
93
Poglavlje 4: PROIZVODNJA VINA Sandi Orlić i Ana Jeromel
4.1. UVOD Vino svojom duhovitošću može zavarati mudre, činiti pametne vragoljastima te ozbiljne smiješnima. Homer 900 p.K. Vino je proizvod koji nastaje alkoholnom fermentacijom grožđa ili grožđanog soka. Prvi arheološki podaci o njegovoj proizvodnji sežu u vrijeme prije 7500 godina. Većina istraživača je mišljenja da vinarstvo ili bolje rećeno njegov razvoj, započinje na južnom Kavkazu. To područje obuhvaća današnju sjeverozapadnu Tursku, sjeverni Irak, Azerbejdžan i Gruziju. Također se pretpostavlja da se u tim istim područjima dogodila i domestifikacija vinove loze (Vitis vinifiera L.). Iz Kavkaza loza se proširila preko Palestine i Sirije do Egipta i Mezopotamije i kasnije po cijelom Mediteranu. U 16. stoljeću europski kolonizatori su prenijeli vinovu lozu u Meksiko, Argentinu, Čile, u 17. stoljeću u Južnu Afriku i Kaliforniju te u 19. stoljeću u Australiju. Sedamdesetih godina 19. stoljeća vinarski je svijet zahvatila najveća kriza i to u obliku insekta Phyloxera vastatrix (Dactylasphaera vitifoliae). Rješenje je pronađeno u cijepljenju loze na američke, filoksera otporne podloge loze. Prema današnjim podacima OIV-a (Međunarodne organzacije za vinovu lozu i vino) na svijetu ima oko 8 milijuna hektara vinograda koji su većinom smješteni u umjerenim klimatskim zonama (70% se nalazi u Europi). Od ukupnog iznosa, 71 % grožđa se preradi u vino, 27 % se pojede kao svježe voće, a 2 % se suši. U zadnjih 10-ak godina veliki kvalitativni pomak u proizvodnji vina postigle su zemlje tzv. Novog svijeta (Australija, Novi Zeland, Čile, Argentina, Južnoafrička Republika) te se je i udio njihovih vina na europskom tržištu značajo povećao. Danas se o vinu zna više nego ikada. Vinogradarima je dobro poznato kako uzgojiti visokokvalitetno grožđe, a vinarima kako proizvesti vrhunsko i kvalitetno vino, te kako ga sljubiti s odgovarajućom hranom. Time se u potpunosti ističu njegove vrline i svojstva. Naime, ljudi su spoznali i ponovno otkrili vino kao jedan od izvora nutrijenata te istaknuli njegove prednosti u cilju pravilne prehrane. Do tih spoznaja došli su brojni istraživači, naročito nutricionisti stjecanjem novih znanja o kemijskom tj. nutritivnom sastavu vina te povoljnom utjecaju vina na zdravlje (Francuski paradoks). Novija saznanja omogućuju da se proces proizvodnje vina može u potpunosti kontrolirati i usmjeriti u željenom smjeru, tj. dobivanju što kvalitetnijeg proizvoda. Naravno, osim navedenih karakteristika koje vino posjeduje, ljudima je najvažniji užitak koji im vino pruža tijekom konzumacije.
4.2. VRSTE I KULTIVARI VINOVE LOZE Vinova loza svrstana je u rod Vitis porodicu Vitaceae. U porodicu Vitaceae pretežno spadaju tropske i suptropske vrste, njih oko 1000, razvrstane u 15-16 rodova. U rod Vitis pretežno spadaju suptropske biljke sjeverne hemisfere. Rod Vitis je podijeljen u dva podroda: Vitis i Muscardinia. U podrod Muscardina spadaju samo vrste V. rotundifolia i V. popenoei, a sve ostale vrste spadaju u podrod Vitis. Podrod Vitis sadrži 38 kromosoma, a Muscardinia 40 kromosoma. Evolucija roda Vitis je potpuno nepoznata. Današnja rasprostranjenost podroda Vitis obuhvaća sjeverni dio Južne Amerike (kolumbijske i 94
venecuelanske Ande), Središnju i Sjevernu Ameriku, Aziju i Europu. Vrste podroda Muscardina se nalaze samo u jugoistočnom dijelu SAD-a i sjeverozapadnom dijelu Meksika. Mnošto je kultivara vinove loze danas poznato u svijetu, a najpoznatiji kultivari najvećim dijelom potječu iz Francuske. Svjetski najznačajniji bijeli kultivari su: Chardonnay, Sauvignon bijeli, Rajnski rizling, Chenin Blanc, Rizvanac, Pinot bijeli, Pinot sivi, Semillion, Traminac i dr. U Hrvatskoj, pored prethodno navedenih kultivara, značajno mjesto zauzimaju i kultivari Graševina, Malvazija Istarska, Škrlet, Kraljevina, Viška Vugava, Pošip i Debit, od kojih su neki udomaćeni a neki autohtoni što im daje dodatnu vrijednost. Među svjetski najznačajnijim crnim kultivarima su Cabernet Sauvignon, Cabernet Franc, Merlot, Gamay noir, Grenache, Pinot crni, Syrah, Tempranillo, Zinfandell i Frankovka. U Hrvatskoj je veliki broj autohtonih crnih kultivara raspostranjen uglavnom na području Dalmacije. Među njima u svakom slučaju prvo mjesto zauzima Plavac mali dok se ne smiju izostaviti Teran, Plavina i Babić.
4.3. KEMIJSKI SASTAV MOŠTA I VINA Kemijski sastav mošta, koji uglavnom ovisi o kultivaru te kvaliteti samog proizvedenog grožđa, prikazan je u tablici 1. Tablica 4.1. Prosječan kemijski sasta mošta Sastojak količina (%) Voda 75-85 Šećeri 17-25 Organske kiseline 0,40 - 1,2 Anorganske tvari 0,15 - 0,3 Ostale tvari 0,30 - 1,0 Za razliku od mošta, vino se sastoji od velikog broja kemijskih spojeva porijeklom iz grožđa i velikim dijelom nastalih tijekom alkoholne fermentacije. Osim alkohola, vino sadrži od 0,8 do 1,2 g/L aromatičnih spojeva. Među njima najzastupljeniji su viši alkoholi, hlapljive kiseline i esteri. Iako prisutni u manjim koncentracijama terpeni, pirazini, laktoni, fenoli te sumporni i dušikovi spojevi uvelike pridonose formiranju sortne arome i arome starenja jedinstvene za svaki tip vina. Okus vina, njegov doživljaj tijekom kušanja i duljina trajanja prvenstveno su vezani za nekoliko kemijskih spojeva i to vodu, etanol, organske kiseline, šećere i glicerol. Uz njih važnu ulogu igraju i tanini u crnim vinima, ali i bijelim koja su neko vrijeme bila u kontaktu s drvenim posuđem (bačvama). Obzirom na brojnost komponenti i njihov značajan utjecaj na kvalitetu vina, o njima će u ovom napisu biti naglašeno kako slijedi:
4.3.1.Voda Voda je najzastupljeniji sastojak vina pa je vino tekućina. Voda je ustvari otapala te sudjeluje u svimbiokemijskim reakcijama tijekom cjelokupnog procesa proizvodnje vina.
4.3.2. Etanol Etanol je nesumnjivo najvažniji alkohol u vinu. Nastaje tijekom alkoholne fermentacije. Vinu daje stabilnost, djeluje kao otapalo te utječe na njegova senzorska i organoleptička svojstva. Za vina koja imaju manje od 9 vol% alkohola kaže se da su tanka, slabo 95
alkoholična, ona između 9,5 - 10,5 vol% alkohola da su lagana, blago alkoholična, s 10,5 - 12,0 vol% alkohola da su srednje jaka, alkoholična, te s 12,5 - 14 vol% alkohola da su jaka, snažna, dok za ona iznad 14 vol% alkohola se kaže da su izrazito alkoholična.
4.3.3. Metanol Metanol nije produkt alkoholne fermentacije već je posljedica hidrolize pektina gdje su karboksilne skupine galakturonske kiseline esterificirane s metanolom. Pod djelovanjem enzima pektinmetilesteraze dolazi do oslobađanja metanola u mošt i kasnijeg prelaska u vino. U bijelim vinima koncentracija metanola kreće se od 40 do 120 mg/L dok je kod crnih od 120 do 150 mg/L. Nema nikakvog utjecaja na senzorska svojstva vina te ne stupa u reakciju s drugim spojevima koji se nalaze u vinu.
4.3.4. Viši alkoholi Alkoholi sa više od dva ugljikova atoma nazivaju se višim alkoholima. Sačinjavaju približno 50 % svih aromatičnih tvari vina, a značajni su pri njegovom dozrijevanju jer iz njih nastaju esteri. Uglavnom nastaju tijekom alkoholne fermentacije, ali ih ima i u grožđu. U grožđu se mogu naći 2-etilheksanol, 3-oktanol, 2-feniletanol, i 1-okten-3-ol. Tijekom alkoholne fermentacije nastaju iz odgovarajućih aminokiselina ili šećera. Na konačnu koncentraciju viših alkohola utječe veći broj faktora i to: soj kvasca; temperatura alkoholne fermentacije; količina prisutnog kisika; pH; bistroća mošta; količina aminokiselina. Najzastupljeniji viši alkoholi u vinu su izoamilni alkohol, amilni alkohol, izobutilni alkohol, n-propanol te 2-feniletanol. Od svih navedenih najzastupljeniji viši alkohol je izoamilni alkohol (50 % od svih viših alkohola). Dosadašnja istraživanja pokazala su da ukupna koncentracija viših alkohola do 350 mg/L pozitivno utječe na senzorska svojstva vina dok u većim koncentracijama ima negativan utjecaj.
4.3.5. Alkoholi s više hidroksilnih skupina Najznačajniji predstavnici alkohola s više hidroksilnih skupina su glicerol, manitol, eritrol, arabinol, sorbitol, ksilitol i mezoinozitol. Glicerol je najzastupljeniji sekundarni produkt alkoholne fermentacije (između 4 i 10 g/L) iako može biti prisutan već i u grožđu. Na konačnu koncentraciju glicerola u vinu utječe temperatura fermentacije, soj kvasca, koncentracija šećera u moštu, koncentracija dušičnih spojeva i koncentracija sumpornog dioksida. Prisutnost plijesni Botrytis cinerea na grožđu utječe na povećanje koncentracije glicerola (do 15 g/L). Manitol nastaje iz fruktoze pod utjecajem plijesni, kvasaca i mliječno-kiselih bakterija. Koncentracije se kreću od 10 do 300 mg/L. Prisutnost plemenite plijesni na grožđu uvelike će povećati količinu ovoga alkohola u vinu, što posebno dolazi do izražaja u predikatnim vinima (do 600 mg/L). Eritrol nastaje redukcijom eritroze. Ima ga manje nego manitola, od 100 do 200 mg/L, a sintetiziraju ga pojedini sojevi različitih kvasaca te plijesan B. cinerea. Arabinola u vinu ima oko 40 mg/L, a stvaraju ga kvasci C. krusei i M. pulcherrima te plijesan B. cinerea. U grožđu napadnutom s plijesni B. cinerea može ga biti i do 250 mg/L. Sorbitol, ksilitol, mezoinozitol. Koncentracija sorbitola u vinima je ovisna o prisutnosti mikroorganizama, prvenstveno pljesni i kvasca, a prosječna koncentracija je između 50 i
96
100 mg/L. Ksilitol i mezoinozitol su prirodni sastojci grožđa te je njihova koncentracija ovisna o stupnju dehidracije bobice tijekom dozrijevanja.
4.3.6. Ugljikohidrati Monosaharidi-heksoze su najznačajniji i najzastupljeniji ugljikohidrati kako u moštu tako i u vinu. Nastaju putem fotosinteze vinove loze te su kvascima glavni izvor ugljika i energije. Najznačajnije heksoze su glukoza i fruktoza, a na njihovu koncentraciju u grožđu utječe veliki broj čimbenika kao što su sorta, stupanj zrelosti, klima i tlo. Odnos između glukoze i fruktoze mijenja se tijekom dozrijevanja grožđa. Na početku prevladava glukoza, a što se bliži trenutak pune zrelosti taj odnos je sve bliži 1:1. Nakon pune zrelosti, tj. u fazi prezrelosti grožđa odnos se pomiče na stranu fruktoze. Kvasci fermentiraju obje heksoze, ali brže glukozu. Tako u vinima s ostatkom šećera prevladava fruktoza koja je ujedno i dva puta slađa od glukoze. Monosaharidi-pentoze se također nalaze u moštu i vinu, ali u značajno manjim količinama. Vinski kvasci ih ne mogu fermentirati pa prelaze iz mošta u vino nepromijenjeni. Glavni predstavnici su arabinoza, ksiloza i ramnoza. U vinima dobivenim od grožđa zaraženog s plijesni B. cinerea koncentracija arabinoze je i dvostruko viša u odnosu na nezaraženo grožđe. Disaharid-saharoza je optički aktivan spoj sastavljen od glukoze i fruktoze i u većini biljaka ima značajnu ulogu kao izvor energije. Kvasci saharozu ne mogu direktno koristiti, već je putem enzima invertaze hidroliziraju na glukozu i fruktozu. U slučaju vinove loze saharoza se invertira prilikom aktivnog transporta tako da je u grožđu ima vrlo malo. Polisaharidi u vino prelaze tijekom postupaka muljanja i runjenja ili tijekom mikrobiološke aktivnosti. Obično su njihove koncentracije veće u crnim vinima vezano uz samu tehnologiju proizvodnje. Celuloza i hemiceluloza sastavni su dio stanične stijenke bobice te se vrlo slabo ekstrahiraju u mošt. Pektin je sastavljen iz molekule galakturonske kiseline povezane s L-1,4 vezama. Karboksilna skupina galakturonske kiseline je slobodna ili je na nju vezan metanol. Uz galakturonsku kiselinu pektin je sastavljen i od galaktoze, arabinoze, ramnoze i ksiloze. U moštu se ili prirodno taloži ili razgrađuje djelovanjem pektolitičkih enzima. U grožđu zaraženom s plijesni B. cinerea nalaze se i ß-glukani, koji u moštu i vinu stvaraju probleme pri taloženju i filtriranju.
4.3.7. Kiseline U moštu i vinu nalaze se uglavnom organske kiseline. Vinska i jabučna kiselina nastaju u bobici nepotpunom oksidacijom šećera te iz bobice prelaze direktno u mošt i vino. Njihova koncentracija ovisi o sorti loze, klimi, zrelosti grožđa i vremenu berbe. Kod grožđa zaraženog s plijesni B. cinerea može doći do povećanja koncentracije limunske i glukonske kiseline. Tijekom alkoholne fermentacije dolazi do sinteze i drugih organskih kiselina kao što su mliječna, octena i jantarna kiselina te u vrlo malim koncentracijama ostale kiseline iz ciklusa trikarbonskih kiselina. U vinu su količinski najzastupljenije vinska, jabučna i limunska kiselina te mliječna kiselina u vinima u kojima se dogodila mliječno-kisela fermentacija. Ukupna kiselost u vinu se najčešće kreće u rasponu od 5 do 8 g/L. U bijelim vinima kiselost je nešto veća u odnosu na crna vina. Koncentracija kiselina važna je za okus, boju, stabilnost vina, pH te potencijal dozrijevanja. Kiseline vina se dijele na hlapive i nehlapive kiseline. Među hlapivim kiselinama najzastupljenija je octena kiselina, a manje zastupljene su mravlja, propionska i maslačna.
97
Najzastupljenije nehlapive kiseline su vinska, jabučna i limunska. Koncentracija vinske kiseline u grožđu se kreće od 4-10 g/L (zavisno od sorte, klimatskih prilika, položaja) te je najzastupljenija organska kiselina u moštu i vinu. Tijekom alkoholne fermentacije i dozrijevanja dolazi do taloženja jednog dijela u obliku vinskog kamena. Koncentracija jabučne kiseline kreće se od 1 do 4 g/L (zavisno od sorte, temperature u periodu dozrijevanja i vremenu berbe). Mikrobiološki je nestabilna te podložna razgradnji djelovanjem mliječno kiselih bakterija. Limunska kiselina prelazi iz grožđa u mošt i vino u koncentracijama od 0,1 do 0,5 g/L. U vinu je stabilna, osim tijekom malolaktične fermentacije kada je najčešće razgrade mliječno kisele bakterije. Octena kiselina je najznačajnija hlapiva kiselina te u normalnim koncentracijama u vinu ima značajnu ulogu pri sintezi estera. U vinu se njezina koncentracija kreće od 0,2 - 0,6 g/L, što je posljedica biosinteze tijekom alkoholne fermentacije s kvascima dok veće koncentracije upućuju na štetno djelovanje prvenstveno octenih bakterija.
4.3.8. Aldehidi Acetaldehid predstavlja više od 90 % svih aldehida u vinu. Najvećim dijelom nastaje tijekom alkoholne fermentacije. U mladim vinima je njegova koncentracija oko 75 mg/L. Međutim, u koncentracijama iznad 100 mg/L negativno utječe na kakvoću vina. Nazivaju ga još i „potrošač sumpora“ jer se vrlo brzo veže na dodani sumporni dioksid. Tijekom starenja vina njegova koncentracija se povećava uslijed kemijske oksidacije etanola. Drugi značajni aldehidi vina su fenolni aldehidi koji nastaju tijekom razgradnje lignina iz hrastovih dužica (aldehid cimetne kiseline, vanilin), kao posljedica rada kvasaca ili plijesni B. cinerea (benzaldehid) ili prelaskom direktno iz grožđa (heksanali).
4.3.9. Esteri Esteri imaju vrlo velik utjecaj na aromatična svojstva vina. U vinu ih je pronađeno više od 160, iako ih se većina nalazi u vrlo malim koncentracijama. Nastaju reakcijom između karboksilne skupine organskih kiselina i hidroksilne skupine alkohola (alifatski esteri) ili fenola (fenolni esteri). Puno značajniji su alifatski esteri pošto fenolnih estera ima vrlo malo, a i nisu toliko hlapivi. Među alifatskim esterima najznačajniji su esteri koji nastaju reakcijom između etanola i masnih kiselina (etil heksanoat, etil oktanoat, etil dekanoat) te oni koji nastaju reakcijom između octene kiseline i etanola te viših alkohola (etil acetat, izoamil acetat, izobutil acetat, 2-feniletil acetat, heksil acetat). Kao posljedica malolaktične fermentacije nastaje etil laktat. Najzastupljeniji među navedenima je etil acetat, a njegove koncentracije se kreću od 50 do 100 mg/L, ali količine iznad 150 mg/L daju vinu neugodan miris na aceton. Na koncentraciju stvorenih estera može se utjecati s kontrolom temperature fermentacije, primjenom pojedinih sojeva kvasca te bistrenjem mošta. Niže temperature fermentacije te niže koncentracije sumpornog dioksida pozitivno utječu na sintezu voćnih estera kao što su izoamil acetat, izobutil acetat i heksil acetat. Tijekom dozrijevanja vina esteri se ponovno hidroliziraju u alkohole i octenu kiselinu što ima za posljedicu gubitak tih voćnih mirisa.
4.3.10. Fenoli Fenolni spojevi imaju značajnu ulogu u kakvoći vina, daju vinu boju, utječu na miris i okus, osnova su za starenje vina, djeluju antioksidativno te pokazuju antimikrobna svojstva u vinu. Po kemijskoj strukturi fenoli su ciklički benzojevi spojevi s jednom ili
98
više hidroksilnih skupina. U vino dolaze najvećim dijelom direktno iz bobice grožđa a u manjoj mjeri tijekom ekstrakcije iz drvenog suđa. Dijelimo ih na dvije osnovne skupine: flavonoide i neflavonoide. Flavonoidi u crnim vinima čine preko 80 % svih fenolnih spojeva dok su u bijelim vinima zastupljeni sa 20 %. Najzastupljeniji flavonoidi su: antocijani (monoglukozidi malvidina, cianidina, delfinidina, petunidina i peonidina te njihovi pripadajući esteri), flavonoli (kvercetin, miricetin, kamferol) i flavanoli (katehin, epikatehin, proantocianidini tj. kondenzirani tanini). Antocijani i flavonoli se nalaze u kožici bobice. Flavan-3-oli se najvećim dijelom nalaze u sjemenkama i peteljkovini. Flavonoidi se u vinu mogu naći u slobodnom i vezanom obliku i to na druge flavonoide, neflavonoide te šećere. Katehin i epikatehin se najvećim dijelom polimeriziraju u tzv. kondenzirane tanine. Tehnologija proizvodnje crnih vina velikim dijelom je povezana s ekstrakcijom dostatnih količina flavonoida iz grožđa. Na njihovu količinu u grožđu utječe sorta, klimatski uvjeti i stupanj zrelosti. Na jačinu ekstrakcije tijekom proizvodnje vina utječe dužina maceracije, temperatura, pH, koncentracija etanola i sumpornog dioksida. Neflavonoidi su derivati hidroksicimetne i hidroksibenzojeve kiseline te stilbeni (resveratol). Najvećim dijelom se nalaze u kožici bobice. Najzastupljeniji su derivati hidroksicimetne kiseline koji su vezani na šećere, alkohole i kiseline. Među njima najviše je estera vinske kiseline, kava kiseline, kumarne i ferulične kiseline. Drugi izvor neflavonoida je njihova ekstrakcija iz dužica drveta. Glavni predstavnik je elagična kiselina. Razgradnjom lignina oslobađaju se i neki drugi neflavonoidi kao benzaldehid te aldehidi cimetne kiseline.
4.3.11. Aromatski spojevi U vinu je pronađeno više od 800 spojeva koji utječu na njegov miris, okus i aromu. Spojevi najvećim dijelom odgovorni za miris su prvenstveno alkoholi, kiseline, aldehidi, ketoni, terpeni, norisoprenoidi, pirazini i merkaptani. S izuzetkom etanola ostali navedeni spojevi u vinu se nalaze u koncentracijama od 0,2 do 1,2 g/L od čega skoro 50% čine viši alkoholi. Aromatske spojeve može se razdijeliti u tri glavne skupine i to: -aromatski spojevi porijeklom iz grožđa, -aromatski spojevi nastali tijekom alkoholne fermentacije, -aromatski spojevi nastali tijekom dozrijevanja i starenja vina. 4.3.11.1. Aromatski spojevi iz grožđa Terpeni su vrlo značajna grupa aromatskih spojeva i važni su nosioci sortne arome muškata, traminca, rizlinga i dr. U moštu i vinu nalaze se najvećim dijelom u obliku slobodnih monoterpenskih alkohola (geraniol, linalol, nerol, citronelol). Nalaze se također i u vezanom obliku, kao glikozidi. Istraživanja su pokazala da ukupna koncentracija terpena u grožđu raste s dozrijevanjem. Pri višim temperaturama dolazi do većeg nakupljanja, prvenstveno vezanih oblika, tj. glikozida dok se slobodni monoterpenski alkoholi gube zbog lake hlapivosti. U bobici grožđa najvećim dijelom terpeni su smješteni u kožici i neposredno ispod kožice. Na njihovu efikasniju ekstrakciju iz grožđa može se utjecati trajanjem i temperaturom maceracije te dodatkom enzima. Norisoprenoidi su aromatični spojevi nastali hidrolizom međuprodukata oslobođenih tijekom razgradnje karotenoida. Tijekom dozrijevanja vina dolazi do njihovog dodatnog oslobađanja uslijed hidrolize glikozidnih oblika. Najpoznatiji je 1,1,6-trimetil-1,2dihidronaftalen (TDN) koji daje vinu jak miris na kerozin te se smatra jednim od nositelja arome starenja kod vina rajnskog Rizlinga. Javljaju se još ß-damascenon (izraženi cvjetni 99
miris), α i ß-ionon (miris na ljubicu) i vitispirini (miris na eukaliptus). Njihov utjecaj na aromu vina posebno je naglašen kod Chardonnaya, Sauvignona, Rizlinga rajnskog i Syraha. Pirazini su ciklički spojevi s dušikom. U vinu su najzastupljeniji 2-metoksi-3-izobutil pirazin (miris po travi, zelenom papru) te 2-metoksi-3-izopropil pirazin, koji ima vegetalni miris. Pirazini imaju vrlo niski prag organoleptičke detekcije. Prvi puta izolirani su iz grožđa i vina Cabernet Sauvignona. Također i kod Sauvignona bijelog te Cabernet Franca imaju izraziti utjecaj na aromu. Njihova koncentracija se tijekom dozrijevanja vina smanjuje. 4.3.11.2. Aromatski spojevi nastali tijekom alkoholne fermentacije Većini ovih spojeva je prethodno opisana, a to su: - alkoholi kao što su etanol te viši alkoholi izoamilni, amilni, izobutanol, heksanol, - esteri kao što su etil acetat, izoamil acetat, izobutil acetat, heksil acetat, - kiseline i to prvenstveno masne kiseline kao što su heksanonska, oktanonska, dekanonska, - aldehidi i to prvenstveno acetaldehid, - ketoni-među njima najzastupljeniji diacetil i acetoni, - merkaptani – 4MMP (4-merkapto-4-metil-pentan-2-ol) i A3MH (3-merkapto heksan-1ol). koji pozitivno utječu posebno na aromu Sauvignona bijelog. 4.3.11.3. Aromatski spojevi nastali tijekom dozrijevanja i starenja vina Tijekom dozrijevanja vina dolazi do smanjenja koncentracije estera koji se uglavnom hidroliziraju, ali dolazi do sinteze nekih novih estera kao što je dietil sukcinat. Također dolazi i do smanjenja koncentracije terpena koji uglavnom prelaze u odgovarajuće okside kao npr. linalol oksid i nerol oksid. Dolazi do oslobađanja nekih norisoprenoida iz vezanih oblika što pozitivno utječe na aromu vina. Ako vino dozrijeva u barik bačvama dolazi do oslobađanja aromatskih spojeva drveta kao što su vanilin, siringaldehid, benzaldehid i dr. Intenzitiet i brzina svih tih promjena vezanih uz hidrolizu vezanih oblika, oksidaciju slobodnih te ekstrakciju novih spojeva ovisnih o vremenu starenja, temperature, dostupnosti kisika te svjetlosti.
4.3.12. Vitamini Nalaze se u grožđu, moštu i vinu u relativno malim koncentracijama. Tijekom alkoholne fermentacije i dozrijevanja njihova koncentracija se smanjuje kao posljedica potrošnje za rast kvasaca i reakcije sa sumpornim dioksidom te vezanja na enološka sredstva te zbog razgradnje s nekim drugim mikroorganizama. Prisutni su askorbinska kiselina (vitamin C), tiamin (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2) i biotin (vitamin H).
4.3.13. Minerali Koncentracija minerala u moštu prvenstveno je vezana na njihovu akumulaciju u bobici grožđa. Među njima najzastupljeniji su kalij, kalcij, magnezij, fosfati i sulfati. U nekim slučajevima vino može sadržavati veće koncentracije bakra i željeza što dovodi do pojave tzv. lomova vina. Ioni nekih metala su sastavni dio vitamina i enzima i bitni su za mnoge metaboličke procese u razmnožavanju kvaščevih stanica.
100
4.4. POSTUPCI PROIZVODNJE VINA Proizvodnja vina iz tehnološki zrelog grožđa podrazumijeva pravilan izbor osnovnih postupaka obrade grožđa i mošta koji prethode samom procesu alkoholne fermentacije. Naime, grožđe se usitnjava muljanjem i runjenjem. Za bijela vina usitnjeno grožđe se preša da se odvoji sok, koji se bistri i zatim fermentira. S druge strane, za proizvodnju crnog vina nakon usitnjavanja vrši se maceracija i alkoholna fermentacija koja traje 1-2 tjedna, a potom se obavlja prešanje odnosno odvajanje mošta od tropa. Zatim se vrši naknadna fermentacija, koja traje nekoliko tjedana. Za proizvodnju nekih bijelih i crnih vina koristi se i malolaktična fermentacija. Nakon završene fermentacije slijedi pretakanje (izdvajanje kvasca), sumporenje, dozrijevanje i stabilizacija vina te punjenje i dozrijevanje u bocama. Proizvodnja vina prikazana je shematski na slici 4.1 i 4.2
Slika 4.1. Principijelna shema za proizvodnju bijelih i crnih vina
101
A. B. C. D. E.
Mehanička obrada grožđa Fermentacija crnog vina i prešanje Glavna fermentacija crnih (1) i bijelih (2) vina Pretakanje, sumporenje i dozrijevanje (1), te filtracija i stabilizacija vina (2) Punjenje u boce i skladištenje vina
Slika 4.2. Prikaz osnovnih procesa u proizvodnji vina (Trost, 1972)
4.4.1. Muljanje i runjenje grožđa Pod ovim postupkom podrazumijeva se mehaničko drobljenje grožđa pri čemu se vrši odvajanje peteljkovine od bobice grožda (runjenje) te izdvajanje soka i mesa od kožice bobice (muljanje). Runjenje se provodi prvenstveno kako bi se smanjila ekstrakcija nepoželjnih fenola iz peteljke koji imaju gorak i trpak okus. Muljanje je najvjerojatnije jedan od najstarijih predfermentacijskih postupaka pri čemu bobice prolaze kroz valjke 102
koji mogu biti različite izvedbe. Po završetku muljanja i runjenja dobije se masulj koji može ići na maceraciju ili direktno na prešanje ( slika 4.2).
Slika 4.2. uredjaj za muljanje i runjenje grožđa
4.4.2. Maceracija grožđa Pod maceracijom se podrazumjeva proces ekstrakcije u kojem dolazi do oslobađanja enzima iz stanice grožđa, što omogućuje olakšano otapanje i oslobađanje tvari koje su vezane unutar stanice pokožice, mesa i sjemenki. Obično se maceracija odvija u početnim fazama fermentacije, obavezno u proizvodnjih crnih, ali sada već i sve češće nekih bijelih vina. Najznačajniji fizikalni čimbenici koji utječu na ekstrakciju su temperatura i vrijeme ekstrakcije. Ektrakcija se može predstaviti kao linearna funkcija temperature i dužine ekstrakcije. Npr. maceracija pri nižim temperaturama i u kraćem vremenskom periodu dovodi do minimalog oslobađanja flavonoida i samim tim do minimalnog povećanja gorčine vina. Tijekom maceracije primarno se odvija ekstrakcija aromatičnih spojeva i flavonoidnih fenola te tvari boje koje su locirane u pokožici bobice te tanina iz sjemenke.
4.4.3. Prešanje grožđa Postupak prešanja podrazumijeva postepeno stiskanje masulja pri čemu dolazi do odvajanja soka (mošta) od krutih dijelova bobice (kožice, sjemenke i mesa). Razvoj novih tehnika prešanja te samih preša ima pozitivan utjecaj na kakvoću dobivenog mošta. Međutim, još uvijek se razlikuje samotok, odnosno mošt koji se dobije direktnim ocjeđivanjem u preši, te prešavinska frakcija koja se dobije primjenom sile tj. stiskanjem masulja. Za pravilan postupak prešanja važno je da se upotrebom određenog tlaka stiskanja u relativno kratkom periodu dobije mošt odgovarajuće kakvoće. Primjena višeg tlaka stiskanja vodi ka sabijanju mase unutar preše što rezultira u slabijem otakanju mošta, što negativno utječe na njegovu kakvoću mošta i vina. U današnje vrijeme kao najbolja a ujedno i najlakša za rukovanje pokazala se primjena pneumatskih preša uz tlak do 2 bara. Zavisno od programa prešanja, zdravstvenog stanja i zrelosti grožđa te sorti dobije se 65 do 80 L mošta iz 100 kg grožđa dok se kod grožđa s plemenitom plijesni
103
(izborna berba, izborna berba bobica, ledeno vino) dobije od 30 do 50 L mošta iz 100 kg grožđa. Preše koje se koriste u proizvodnji vina moraju zadovoljiti slijedeće uvjete: - brzo izdvajanje mošta s upotrebom relativno malog tlaka, - mogućnost reguliranja tlaka, - minimalno oštećenje sjemenki bobica. Po tipu rada dijele se na: - kontinuirane (neprekidni rad), - diskontinuirane (mogućnost prekida rada). Najveći broj proizvođača koristi diskontinuirane preše koje se dijele na: - mehaničke - hidraulične - pneumatske Mehaničke preše su se prve koristile pri prešanju te su ujedno i najjednostavnije izvedbe. Kod nas je s povijesnog gledišta značajno spomenuti starohrvatsku prešu koja je bila obavezni dio svake kleti (slika 4.3). Hidrauličke preše bile su značajni tehnički pomak u odnosu na mehaničke. Rade na principu hidraulike što je omogućilo brže istjecanje mošta, ravnomjerniji rad te lakše rastresanje tropa. Pneumatske preše rade na principu stiskanja zraka. Bubanj u koji se unosi masulj može se rotirati čime je olakšano njegovo rastresanje. Posebna gumena membrana koja se nalazi na nutarnjoj strani bubnja puni se zrakom i na taj način lagano stišće masulj (grožđe). Mošt polagano istječe kroz posebne kanale koji su smješteni po sredini bubnja. Najmoderniji modeli pneumatskih preša imaju i mogućnost uvođenja inertnog plina što omogućava u potpunosti reduktivne uvjete prešanja (slika 4.4).
Slika 4.3. Starohrvatska preša
104
Slika 4.4. Pneumatska preša
4.4.4. Bistrenje mošta Postupak bistrenja mošta obavlja se prije početka alkoholne fermentacije a osnovna namjena mu je uklanjanje nepoželjnih tvari što vodi pravilnijem i kvalitetnijem tijeku alkoholne fermentacije. Provodi se kod proizvodnje bijelih vina. Trajanje bistrenja se prati mjerenjem bistroće što se izražava u NTU (Nephelometric turbidity units) jedinicama. Do željenih podataka dolazi se korištenjem turbidimetra. Intenzitet bistrenja ne smije biti niti preveliki niti premali te su dosadašnja istraživanja pokazala da se idealne vrijednosti kreću između 100 i 200 NTU jedinica. Pozitivan utjecaj pravilno provedenog bistrenja sastoji se u eliminaciji nepoželjnih krutih čestica kao što su dijelovi kožice, peteljkovine, sjemenke, ostaci zaštitnih sredstava, čestica zemlje. Primjenom sumpornog dioksida dodatno se pospješuje njihovo taloženje ali se i inaktivira rad nepoželjnih mikroorganizama, prvenstveno divljih kvasaca i octenih bakterija. Sve to pozitivno utječe na tijek alkoholne fermentacije te smanjenje aktivnosti oksidativnih enzima koji se nalaze u kožici i mesu bobice. Međutim, s intenzitetom bistrenja nije dobro pretjerati (vrijednost NTU manja od 80), jer može izazvati suprotan učinak. Takvi moštovi sadrže premale količine hranjivih tvari za kvasce što može dovesti do problema u tijeku alkoholne fermentacije, te povećanju sinteze octene kiseline. Bistrenje se može provoditi i spontanim taloženjem čestica te primjenom centrifuga ili vakuum filtera.
4.4.5. Postuci pojačavanja/doslađivanja, otkiseljavanja i dokiseljavanja Pojačavanje mošta dozvoljeno je dodatkom saharoze ili koncentriranog mošta u zakonski propisanim granicama. Dozvolu za pojačavanjem u svakoj godini izdaje Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinarstvo, državna institucija koja temeljem podataka za svaku godinu te temeljem zahtjeva proizvođača izdaje rješenje. Pravilnikom i Zakonom o vinu definirane su maksimalne količine šećera i to prema zonama proizvodnje. Tako je za mošt, masulj ili mošt u vrenju u zonama C1, C2, C3 maksimalno dozvoljena količina saharoze 3,4 kg/100 L mošta ili 3 kg /100 L masulja, dok je u zoni B ta količina 4,2 kg/100 L. Preračunato u vol % alkohola to povećanje iznosi 2 % vol u zonama C1, C2 i C3, te 2,5 % vol u zoni B. Međutim, Zakonom i Pravilnikom RH (96/03) o vinu jasno su definirane maksimalne količine alkohola za pojačavanje vina , te ona iznose: 12,0 vol % u zoni B, a iznimno kod crnih vina u zoni B može biti do 12,5 % vol etanola; 12,5 % vol u zoni C1; 13,0 % vol u zoni C2; 13,5 % vol u zoni C3.
105
Doslađivanje. Pod pojmom doslađivanja podrazumijeva se korekcija količine šećera u vinu nekim od dozvoljenih postupaka a zavisno od kategorije i kakvoće samog vina. Pojam doslađivanja prvenstveno je vezan na korekciju okusa koja se mijenja dodatkom određene količine šećera, pogotovo u proizvodnji specijalnih vina (likerska vina, aromatizirana vina). Doslađivati se smiju i stolna vina, odnosno kvalitetna vina ako u njihovoj proizvodnji nije prethodno primijenjen niti jedan postupak pojačavanja. Ne smiju se doslađivati vrhunska vina. Dokiseljavanje/otkiseljavanje.U masulju, moštu, moštu tijekom vrenja i mladom vinu koje još fermentira može se provesti postupak: – djelomičnog otkiseljavanja u zoni B, – djelomičnog otkiseljavanja i dokiseljavanja u zoni C1 i C2, – djelomičnog dokiseljavanja u zoni C3. Dokiseljavanjem se ukupna kiselost u g/l izražena kao vinska kiselina smije maksimalno povećati za 2,5 g/l. Ukupna kiselost vina u prometu mora biti najmanje 4 g/L, izraženo kao vinska kiselina, a najviše do 14 g/L. Istovremeno dokiseljavanje i pojačavanje, kao i dokiseljavanje i otkiseljavanje istog proizvoda nije dopušteno. Prije same fermentacije najčešće se dodaje vinske kiseline. Dodaje se L- vinska kiselina s obzirom na to da D,Lvinska kiselina može uzrokovati kasniju nestabilnost u vinu vezano uz probleme sa taloženjem D,L-kalcij tartarata. Dodatak vinske kiseline treba biti u svakom slučaju prije provođenja postupka hladne stabilizacije, pošto naknadni dodatak može uzrokovati nepoželjno taloženje tartarata u boci. Jabučna kiselina dodaje se više zbog utjecaja na senzorna svojstva vina te provođenje malolaktične fermentacije. Komercijalno dostupna je D,L-jabučna kiselina te pošto bakterije razgrađuju isključivo L-jabučnu kiselinu D izomer će i po završetku MLF-a ostati prisutan u vinu i utjecati na ukupnu kiselost te okusna svojstva. Limunska kiselina rijetko se dodaje prije alkoholne fermentacije ili prije malolaktične fermentacije pošto uslijed njezine razgradnje od strane kvasaca ili bakterija vino može sadržavati veće koncentracije hlapive kiselosti. Najčešće se dodaje prije samog punjenja vina u bocu sa ciljem manjih korekcija kiselosti pošto je njezin sadržaj u vinu limitiran Pravilnikom o vinu, prema kojem vino u prometu smije imati najviše 1 g/L. Otkiseljavanje vina može se provoditi do granice od 1,0 g/L izraženo kao vinska kiselina i to metodom kemijskog ili biološkog otkiseljavanja (malolaktička fermentacija, maloalkoholna fermentacija). Pod kemijskim otkiseljavanjem podrazumijeva se smanjenje kiselosti vina, uz povećanje pH, primjenom neutralnog kalijevog tartarata, kalijevog hidrogen karbonata ili kalcijevog karbonata koji može sadržavati malu količinu kalcijevih dvosoli L(+) vinske i L(-) jabučne kiseline (O.I.V., 2001). Nakon procesa kemijskog otkiseljavanja, vina i dalje moraju sadržavati minimalno 1 g/l vinske kiseline. Kemijsko otkiseljavanje ustvari podrazumijeva neutralizacija vinske kiseline, dok jabučna kiselina nije toliko utjecajna jer su njezine soli puno topljivije u vinu.
4.4.6. Sumporni dioksid u vinarstvu Do današnjeg dana nije pronađeno prikladno enološko sredstvo koje bi moglo u potpunosti zamijenilo primjenu sumpornog dioksida u vinarstvu. Glavna svojstva sumpornog dioksida te razlozi njegovog korištenja u moštu i vinu su sprječavanje aktivnosti oksidacijskih enzima, prvenstveno polifenoloksidaza, vezanje na tzv. „potrošače sumpora“ kemijske spojeve kao što su acetaldehid, piruvat, ketoglutarat, šećeri i antocijani, sprječavanje promjene boje vina tj. posmeđivanja i spriječavanje rasta nepoželjnih mikroorganizama. Sumporni dioksid u moštu ili vinu disocira te se može naći u tri oblika: u molekularnom obliku (SO2) ,u bisulfitnom obliku (HSO-3), u sulfitnom obliku (SO32-). 106
U vinu se nalazi kao slobodni sumporni dioksid u koji ulazi prvenstveno molekularni oblik, nevezani bisulfitni oblik te nedisocirani sulfitni oblik (H2SO3). Koncentracija slobodnog sumpornog dioksida se smanjuje vezanjem bisulfitnog oblika s acetaldehidom, šećerima, piruvatom, ketoglutaratom, što u konačnici predstavlja vezani sumporni dioksid. Vrijednosti vezanog i slobodnog daju ukupnu koncentraciju sumpornog dioksida u vinu, što se izražava u mg/L. Među najznačajnijim faktorima koji utječu na odnose među pojedinim oblicima sumpornog dioksida su pH (pri nižem pH veći je udio molekularnog oblika) te koncentracija pojedinih tvari koje se direktno vežu na dodani sumporni dioksid. Kao što je već naglašeno, sumporni dioksid ima nekoliko važnih uloga u proizvodnji mošta i vina, a najvažniji su antimikrobno i antioksidacijsko djelovanje. Antimikrobno djelovanje. Sprječavanje rasta i razmnožavanja mikroorganizama direktno je povezano sa slobodnim oblikom SO2, dok je utjecaj vezanog oblika zanemariv. Na djelovanje slobodnog sumpornog dioksida najosjetljivije su bakterije octene kiseline (Acetobacter, Glucobacter), kvasci (Kloeckera, Hanseniaspiora) i mliječno-kisele bakterije (Lactobacillus). Odgođeni početak alkoholne fermentacije ili duži period prilagodbe kvasca kod jače sumporenih moštova povezan je prvenstveno uz vezivanje SO2 na acetaldehid. Naime, tek kada u moštu dođe do smanjenja koncentracije slobodnog sumpornog dioksida, kvasci mogu početi s normalnim rastom i metabolizmom. Antioksidativno djelovanje. Svojim djelovanjem sumporni dioksid smanjuje aktivnost oksidacijskih enzima te sprječava tvorbu kinona nastalih oksidacijom fenolnih spojeva. Tako se dodatkom 50 mg/L sumpornog dioksida smanjuje enzimatska aktivnosti oksidaza za 90 %. Isto tako, sumporni dioksid je važan i pri antioksidativnom djelovanju askorbinske kiseline gdje sudjeluje pri redukciji vodik peroksida, međuprodukta nastalog oksidacijom askorbinske kiseline. 4.4.6.1. Dodavanje sumpornog dioksida Sva umjetnost sumporenja skriva se u odgovoru na pitanje kada i koliko sumporiti. Osnovni cilj je zaštititi mošt, provesti alkoholnu fermentaciju i omogućiti starenje vina. U tome je sumporni dioksid odličan suradnik ako pravilno znamo iskoristiti njegova svojstva. Samim time cilj je proizvesti vino odgovarajuće kakvoću uz minimalnu koncentraciju sumpornog dioksida. Osnovna pravila sumporenja su: - minimalno sumporenje mošta od zdravog grožđa, dok se u mošt od jako trulog grožđa dodaje maksimalno od 75 do 100 mg/L sumpornog dioksida, - zdravo grožđe, minimalan kontakt sa zrakom, brzi početak i ravnomjean tijek alkoholne fermentacije do kraja procesa omogućuju dodatak sumpornog dioksida tek pri prvom pretoku, - spriječavanje kontakta vina sa zrakom nadolijevanjem posuda ili upotrebom inertnog plina, - praktično je nemoguće predvidjeti koliko će se dodanog sumpornog dioksida vezati, zato je potrebna redovita kemijska analiza slobodnog sumpornog dioksida, - koncentracija kiselina i pH utječu na odnos između pojedinih oblika sumpornog dioksida. Pri nižem pH, veći je dio slobodnog molekularnog oblika SO2, - veće koncentracije slobodnog sumpornog dioksida negativno utječu na starenje vina i senzorska svojstva. Glavni oblici sumpornog dioksida koji se koriste u vinarstvu su: plinoviti SO2, 5% otopina sumporaste kiseline i kalijev bisulfit. Sumporne trake više nisu u upotrebi radi nemogućnosti točnog doziranja u tank, mogućnosti pojave negativnog okusa te jednostavnija upotreba drugih sredstava. Sumporenje je najtočnije primjenom plinovitog SO2 ako postoji na raspolaganju prikladan dozator. Točno je također i sumporenje
107
dodatkom 5% sumporaste kiseline pod uvjetom da se dodaje iz prethodno neotvorene boce s obzirom da se njezina koncentracija u kontaktu sa zrakom mijenja. Pri sumporenju vina važno je znati da: - 1 g kalijevog bisulfita oslobađa 500 mg SO2 u litri vina, - 1 ml 5 % sumporaste kiseline oslobađa 50 mg SO2 u litri vina, - 1 g plinovitog SO2 oslobađa 1000 mg SO2 u litri vina.
4.4.7. Bistrenje i bistrila Sredstva za bistrenje dodaju se u mošt ili vino s ciljem smanjenja koncentracije tvari koje bi inače uzrokovale probleme nepoželjne za organoleptička svojstva vina i za stabilnost. Tako npr. sredstva za bistrenje mogu biti dodana: - radi postizanja veće bistroće, - za uklanjanje fenolnih tvari koje uzrokuju gorčinu, - za uklanjanje sumporovodika. - za popravak kakvoće okusa i mirisa. Važno je naglasiti da djelovanje sredstava za bistrenje nije usko specifično, te će uz smanjenje količine željene grupe spojeva reagirati i sa drugim tvarima vina pri tome utječući na senzorska svojstva u većoj ili manjoj mjeri. Određivanje količine bistrila koje će se dodati može biti objektivno (temeljem kvantitativnih mjerenja) ili subjektivno (temeljem senzorske procjene). Izbor pojedinog bistrila temelji se jednim dijelom i na prethodnim iskustvima i zabilješkama kako ono djeluje na pojedina vina. Tvari koje se koriste za bistrenje tijekom djelovanja se talože, a mošt ili vino se zatim pretače , filtrira ili centrifugira sa ciljem odvajanja nastalog taloga. 4.4.7.1. Način djelovanja bistrila U vinu se nalaze tvari s pozitivnim i negativnim električnim nabojem. Samim time za njihovo taloženje i izdvajanje iz vina moraju se dodati tvari suprotnog električnog naboja. Temeljem njihovog podrijetla te osnovne strukture dijele se na : -zemlju: bentonit, kaolin, -bjelančevine: želatina, riblji mjehur, kazein, bjelanjak, -polisaharide: gumiarabika, -aktivni ugljen, -sintetičke polimere: PVPP, -kieselsol (silicijev dioksid), -tanine, -ostale: kalijev ferocijanid (plavo bistrenje), enzimi. Bentonit je vrlo rašireno sredstvo za bistrenje dobiveno iz gline vulkanskog podrijetla koje sadrži minerale tvari, kao što su Mg, Ca, Na, Al2O3 × 5 SiO2. Razlika je najčešće u omjeru između Mg Ca i Na, što se očituje u adsorptivnoj moći te kompaktnosti nastalog taloga. U moštu ili vinu upotrebljava se prvenstveno za uklanjanje termolabilnih bjelančevina te uz to smanjuje mogućnost pojave bakrenog loma. Mehanizam bistrenja temelji se na reakciji između negativno nabijene površine bentonita i pozitivno nabijenih bjelančevina pri čemu dolazi do flokulacije i sedimentacije nastalog kompleksa. Dodatak drugih bistrila kao što su kazein ili tanin pospješit će brzinu sedimentacije. Nedostatak njegove upotrebe je tvorba relativno voluminoznog taloga (5 do 10 % cjelokupne površine), uklanjanje aminokiselina i ostalih hranjiva te djelomičan gubitak boje. Uz to nije učinkovit za uklanjanje neutralnih te negativno nabijenih bjelančevina.
108
Kazein je mješavina glavnih proteina mlijeka koji s natrijevim i kalijevim ionima tvore soli topive u vinu. S obzirom da ima pozitivan naboj veže na sebe negativno nabijene čestice kao što su tanini te fenolni spojevi. Najčešće se upotrebljava za korekciju boje i mirisa bijelih vina. Riblji mjehur sadrži proteine ribljeg mjehura te kao većina proteinskih bistrila posjeduje pozitivan naboj te uklanja najvećim dijelom tanine. Prvenstveno se koristi za bistrenje bijelih vina te daje vinu visoki stupanj bistroće a da pri tome ne djeluje na tijelo i aromu vina tako drastično kao želatina. Najefikasnije reagira sa monomernim te manjim polimernim oblicima polifenolnih spojeva. Bjelanjak jajeta je jedno od najstarijih sredstava za bistrenje. Aktivna mu je komponenta bjelančevina albumin koja primarno uklanja tanine. Dolazi do formiranja vodikovih veza te brzog taloženja na dnu posude. Uglavnom se koristi za bistrenje crnih vina, tj. uklanjanje trpkosti te korekcije boje okusa i mirisa. U slučajevima dugotrajne maceracije može se koristiti i za bistrenje bijelih vina. Ima pozitivan naboj te se može koristiti svježi bjelanjak ili onaj u obliku praha. Aktvni ugljen je vrlo agresivno bistrilo pa se upotrebljava samo u krajnjoj nuždi. Postoji ugljen dezodorans koji odstranjuje negativne mirise te ugljen dekolorans koji veže tvari boje te utječe na obojenost vina. Njegov najveći problem je neselektivnost te uz negativne spojeve veže na sebe i veći postotak pozitivnih tvari. Niža pH-vrijednost, kao i povišena temperatura pospješuju djelovanje ugljena. Tanini se najčešće koriste u kombinaciji sa želatinom za poboljšanje bistroće vina. U otopini je tanin negativno nabijen te u kombinaciji sa želatinom uspješno odstranjuje koloidne bjelančevine. Prvo se dodaje tanin te zatim želatina. Tanini se mogu koristiti i s ciljem povećanja trpkosti vina koja su siromašna na njima. Gumiarabika je polisaharid u kojem prevladava arabinoza. Može djelomično spriječiti taloženje vinskog kamena no ne tako uspješno kao hladna stabilizacija. Ima i zaštitno koloidno djelovanje te može spriječiti bakreni lom te taloženje bojila crnog vina. Dodaje se u kombinaciji s metavinskom kiselinom neposredno pred punjenje vina u boce. Želatina je derivat kolagena dobiven hidrolizom iz kostiju i kože životinja. Dolazi u obliku praha, listića ili tekućine i pozitivnog je naboja. Uglavnom se koristi za uklanjanje suvišnih tanina te smanjenje trpkosti i za bistrenja oksidiranih bijelih vina koja su dugo bila na talogu. Kod bistrenja bijelih vina može doći do pojave maglastog zamućenja uslijed dodavanja prevelike količine želatine, koji se uklanja dodatkom tanina ili silicijevog dioksida. Silicijev dioksid (kieselsol) je vodena otopina silicijevog dioksida s negativnim nabojem. Koristi se kao zamjena za tanine te u odnosu na njih ima i neke prednosti. Tvori manje taloga i brže se taloži te daje bolju bistroću vina. U kombinaciji sa želatinom poboljšava okus vina. Posebno dobre rezultate daje vinima dobivenim od grožđa napadnutog sivom plijesni. Prvo se dodaje kieselsol a nakon 2-3 sata želatina. Može se koristiti i u kombinaciji s bentonitom. PVPP. Polivinilpolipirolidon je sintetički polimer koji se koristi za uklanjanje fenola i to posebice za nepolimerizirane oblike. Time se spriječava posmeđivanje i pojava neželjene gorčine. Može se koristiti i u kombinaciji s aktivnim ugljenom da se smanji boja.
4.4.8. Filtracija vina Filtracija vina podrazumijeva odstranjivanje čestica mutnoće i taloga iz vina kako bi ono postalo i ostalo bistro. To se postiže propuštanjem vina kroz porozne materijale ili pregrade na kojima se zadržavaju čestice mutnoće a prolazi bistro vino. Postoji nekoliko načina i to: 109
- naplavna filtracija (otvorena, zatvorena), - filteri sa okvirima (pločasti filtri), - filteri sa membranama. 4.4.8.1. Naplavna filtracija Ovaj proces se koristi za filtraciju jače mutnih vina te je to tzv. gruba filtracija. Uređaji za filtraciju prikazani su na slici 4.5. Materijal za filtraciju je infuzorijska (dijatomejska) zemlja ili perlit u kombinaciji s celulozom ili pojedinačno. Mutno vino zajedno sa naplavnom masom ulazi u filtracijski prostor odozdo te polagano ispunjava prostor pri čemu se stvara naplavni sloj na metalnim sitima. Vino prolazi kroz taj sloj, ulazi u međuprostor između sita te preko odvodne cijevi izlazi bistro van. Po završetku filtriranja sita se operu uvođenjem vode u filtracijski prostor.
Slika 4.5. Uređaji za naplavnu filtraciju 4.4.8.2. Filteri s okvirima (pločasti filteri) Za razliku od naplavnih filtera koji imaju jedan veliki prostor za mutno vino kod pločastih filtera postoji prostor za mutni i bistri dio, što omogućuju postavljeni okviri s filter pločama između njih. U toku filtracije mutno vino ulazi u filter s jedne strane okvira preko proreza na toj strani okvira te prolaze kroz vertikalne proreze na okvirima te ulaze u međuprostor između dvije hrapave strane filter ploča. Vino se bistri prolazeći kroz filter te prolazi na glatku stranu filter ploče i preko izlaznog kanala izlazi van. Ovisno o vrsti filtracije koja se želi provesti izabire se odgovarajuća filter ploča, a njihove oznake različite su zavisno od proizvođača do proizvođača. Tako se može za primjer navesti oznake filter ploča Seitz: 1.Gruba filtracija: K-900, K-800, K-700 2.Fina filtracija: K-300, K-250, K-200, K-150, K-100 3.Sterilna (EK) filtracija: KS 80, KS 50, EK, EK-1*
110
*EK-filtracija: Oznaka EK dolazi od njemačke riječi entkeimen, što znači odstraniti mikroorganizme iz neke sredine. EK filtracijom se to može postići zbog vrlo malih pora na filter pločama. EK filtracija ustvari predstavlja jedan oblik biološke stabilizaciju te njezin osnovni cilj nije bistrenje vina već njegova stabilizacija. Vina za ovu filtraciju moraju biti već bistra a ako nisu prvo ih treba filtrirati kroz ploče većeg poroziteta, a tek onda kroz EK ploče. Pri provođenju EK filtracije cjelokupan prostor u kojem se odvija filtracija treba biti sterilan. Aparatura za EK filtraciju s pločama prikazana je na slici 4.6.
Slika 4.6. Pločasti filter 4.4.8.3 Filteri s membranama Karakteristična im je vrlo fina struktura te vrlo mala poroznost koja se kreće između 0,25 m do 1,4 m. Tako se za odvajanje kvasaca koriste membrane sa poroznošću od 0,8 1,5 m, dok se za uklanjanje bakterije koriste membrane od 0,45 m. Membrane se uglavnom koriste za uklanjanje mikroorganizama iz vina prije punjenja u boce. U SAD-u i globalno se najviše koriste filtri tvrtke Millipore. Postoje različite vrste ovih filtera no najzastupljeniji su: - filtri s membranama u obliku vertikalnih ploča koje se nalaze u zatvorenoj posudi, - filtri sa svijećama. 4.4.8.4. Tangencijalna filtracija (cross flow filtracija) Kod tradicionalnih tipova filtracije tekućina prolazi preko filter materijala. Kod tangencijalne filtracije tekućina ide paralelno s filter materijalom. Razlikuju se: - tangencijalna ultrafiltracija-veličine pora od 0,1 do 0,001 μm, dijelomično eliminira i nestabilne proteine iz vina, - tangencijalna mikrofiltracija-veličina pora od 10-0,1 μm, postiže se sterilnost vina U proizvodnji vina upotreblavaju se već desetak godina no glavne zamjerke su: - modifikacija mirisa i okusa gubitkom hlapivih komponenti, - izuzetno spori tijek filtracije, - relativno visoki troškovi u odnosu na tradicionalne tipove.
111
Slika 4.7. Tangencijalni filter 4.4.8.5. Vakuum filtri Odvajanje bistrog vina iz taloga putem ovih filtera vrši se uz pomoć vakuuma koji se stvara u filtru. Prije nego što se počne s filtriranjem na platneni omotač oko bubnja nanese se filter-sloj infuzorijske zemlje ili perlita. U toku rotiranja bubanj svojim doljnim dijelom prolazi kroz supenziju (talog) te zahvaća dio koji je privučen unutrašnjim vakuumom. Tekući dio (vino) prolazi kroz filtracijsko sredstvo a talog (čvrsti dio) se priljubljuje za površinu bubnja, koji se uz pomoć noža skida s bubnja. Princip filtracije je sličan onom u proizvodnji pekarskog kvasca ( slika 7.14). Talog se poslije filtracije mutnog vina koristi za izdvajanje soli vinske kiseline. Djelovanje vakuuma utječe na: - gubitak hlapivih komponenti, - smanjenje količine slobodnog SO2, - smanjenje količine CO2, - potencijalnu opasnost od oksidacije. 4.4.8.6. Centrifuge Primjenom centrifuga odvajaju se suspendirane čestice od bistrog vina. Stupanj izdvajanja čestica iz mutnog vina odnosno mošta postiže se reguliranjem broja okretaja centrifuge. U tehnologiji vina centrifuge imaju višestruku primjenu. Tako služe za odstranjivanje velikih količina taloga iz mošta i iz vina nakon završetka alkoholne fermentacije. Također pri bistrenju s bentonitom stvoreni talog lagano se odstranjuje centrifugiranjem. Centrifuge za bistrenje vina, koja su čuvana duže vrijeme, nisu pogodne jer se ne postiže visoki stupanj bistroće. Moguće ih je koristiti pri čišćenju vina s grubog taloga s time da se nakon toga podvrgnu filtraciji. Dijele se na: otvorene, poluzatvorene i zatvorene. Za rad sa vinom u svakom slučaju pogodnije su zatvorene jer na taj način vino manje dolazi u dodir sa zrakom. Takoder, postoji i podjela po načinu rada, a dijele se na: 1.diskontinuirane; povremeno se moraju zaustaviti te odstraniti talog i 2. kontinuirane, pražnjenje je automatsko tijekom rada.
4.5. ALKOHOLNA FERMENTACIJA Prvi znanstveni podaci o alkoholnoj fermetnaciji potječu od Louisa Pasteura prije oko 140 godina. Razvoj znanosti posljednjih 30 godina jasno pokazuje da je fermentacija i proizvodnja kvalitetnih vina složeni ekološki i biokemijski proces u kojem sudjeluje veći broj mikrobnih vrsta, najviše kvasaca, mliječnih i octenih bakterija, a ponekad nekih vrsta 112
bakterija iz rodova Bacillus, Clostridium i Streptomyces. Neke vrste imaju pozitivan, a neke negativan učinak na tijek fermentacije i zato je neophodno shvaćanje tog osnovnog procesa u vinarstvu. Njihovo poznavanje je sigurniji put u proizvodnji vrhunskih, tipičnih vina, koje tržište, inozemno i domaće, danas traži. Tablica 4.2. Različiti mikroorganizmi vina i njihova uloga u vinarstvu MIKROBNA GRUPA Kvasci Mliječno kisele bakterije Octene bakterije Gljive Bacillus, Clostridium Actinomyces, Streptomyces Bakteriofagi
ULOGA Alkoholna fermentacija, autoliza, otkiseljavanje, bolesti vina Mliječno kisela fermentacija, bolesti vina Bolesti vina, zaustavljene fermentacije Plemenita plijesan, bolesti čepova Bolesti vina Bolesti čepova Ometanje mliječno-kisele fermentacije
Svi ti pomaci uzrokovali su poboljšanje kvalitete vina. Pasteur je prvi dokazao da su kvasci odgovorni za alkoholnu fermentaciju mošta u proizvodnji vina. U tablici 4.2 su prikazani različiti mikroorganizmi vina i njihov značaj za vinarstvo. Vrlo je značajno u današnjem suvremenom vinarstvu odrediti prisustvo i populaciju tih mikroorganizama na grožđu, u vinu, na površini strojeva za preradu, u starter kulturama, u čepovima itd. da bi se u potpunosti mogla kontrolirati proizvodnja vina.
4.5.1. Kvasci Kvasci su jednostanični organizmi koji su glavni nosioci alkoholne fermentacije. Mošt predstavlja odličan medij za kvasce općenito jer sadrži sve tvari koje su potrebne za razvoj mikroorganizama. U praksi samo ove porodice imaju značenje u vinarstvu: - Schizosaccharomycetalesoideae, s vrstama roda Schizosaccharomyces, - Saccharomycodaceae, s vrstama roda Hanseniaspora i Saccharomycodes, - Saccharomycetaceae, s vrstama roda Dekkera, Pichia, Saccharomyces, Torulaspora i Zygosaccharomyces, - Candidaceae, s vrstama roda Brettanomyces, Candida, Kloeckera, - Metschnikowiaceae, s vrstama roda Metschnikowia. Sve ove porodice spadaju u askomicete i red Saccharomycetales, razred Hemiascomycetes, osim porodice Schizosaccharomycetaceae koja spada u red Schizosaccharomycetales, razred “Archiascomycetes”. (Poglavlje 1: sistematika) 4.5.1.1. Porijeklo vinskih kvasaca Kvasci koji su odgovorni za alkoholnu fermentaciju obično potječu iz tri izvora: - s površine grožđa - s površine opreme u vinariji, - iz različitih starter kultura. Brojna istraživanja bavila su se ekologijom površine bobica grožđa. Zaključci su: 1. zrelo grožđe, aseptično gnječeno ima brojnost populacije između 103-105 CFU; 2. vrškaste vrste kvasaca (Kloeckera apiculata i Hanseniaspora) su najbrojnije vrste na površini grožđa i njihov broj u odnosu na druge vrste je 50-75 %; 3. u manjem broju se pojavljuju vrste rodova Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Piciha, Kluyveromyces i Hansenula;
113
4. fermentativne vrste roda Saccharomyces se nalaze u vrlo malom broju na površini ne oštećenog grožđa i vrlo se rijetko izoliraju pomoću metode razrijeđenja ili iscrpljenja. Brojni čimbenici utječu na ukupnu populaciju kvasaca i odnos među vrstama na grožđu. Ti čimbenici uključuju: temperaturu, oborine i druge klimatske čimbenike, stupanj zrelosti grožđa i vrijeme berbe, upotrebu fungicida, fizikalna oštećenja uzrokovana pticama, gljivama i insektima te kultivar vinove loze. Površina vinarske opreme koja dolazi u kontakt s moštom i vinom postaje tijekom vremena mjesto razvoja tzv. autohotne mikroflore vinarije. Brojnost mikroba na opremi ovisiti će ponajviše o stupnju čistoće opreme. Kvasac S. cerevisiae, kao i druge vrste iz rodova Candida, Pichia, Hansenula i Brettanomyces također se mogu pronaći u tim uvjetima.
4.5.2. Mliječno-kisele bakterije (MKB) MKB su značajne u vinarstvu jer uzrokuju neke bolesti vina i odgovorne su za malolaktičnu fermentaciju. Te bakterije fermentiraju šećere u najvećoj količini do mliječne kiseline. Na kraju malolaktične fermentacije u vinu zaostaje oko 107 stanica/ml. Međutim, još ima mnogo neistraženi čimbenika u pogledu djelovanja malolaktičnih bakterija na kvalitetu vina. S fiziološkog gledišta one predstavljaju vrlo homolognu grupu (u pogledu zahtjeva za hranom, fermentativnom aktivnošću, u odnosu na kisik, i dr.). Mliječno kisele bakterije su štapićastog ili kokoidnog oblika, pokretljive su, asporogene, gram pozitivne, anaerobne ili fakultativno aerobne, katalaza su negativne (osim nekih vrsta iz roda Pediococcus), imaju dosta složene zahtjeve za tvari rasta iz supstrata. Najznačajniji rodovi mliječno kiselih bakterija su: Lactobacillus, Oenococcus, Leuconostoc i Pediococcus .
4.5.3. Bakteriofagi Od davno je poznato djelovanje faga na MKB u fermentaciji mlijeka. Vinske mliječno kisele bakterije također mogu napasti fagi što može ometati malolaktičku fermentaciju. U nekim slučajevima ekologija malolaktičke fermentacije može se u potpunosti promijeniti. Naime, poželjni soj Oenococcus oeni počinje uništavati fag i posljedica toga je da malolaktičku fermentaciju završavaju one vrste bakterija koje uzrokuju bolesti vina.
4.5.4. Octene bakterije Octene bakterije oksidiraju etanol do octene kiseline u kiselom mediju u aerobnim uvjetima. To je relativno homogena grupa, a najvažnija dva roda za vinarsku industriju su Acetobacter i Glucobacter, koji pripadaju porodici Acetobacteraceae. Rod Acetobacter obuhvaća štapićaste gram negativne bakterije. To su obligatni aerobi s optimalnim pH od 5,4 – 6,3 i optimalnim temperaturama od 25-30 oC. Najznačajnije vrste su A. aceti i A. pasteurianus. S druge strane, rod Glucobacter obuhvaća eliptične ili štapićaste bakterije, koje su gram negativne ili varijabilne, obligatni su aerobi, s optimalnim temperaturama od 25-30 oC i pH od 5,5 – 6,0. Rod obuhvaća samo vrstu G.oxydans. Općenito octene bakterije za svoj razvoj u vinu zahtijevaju visoku temperaturu (oko 30oC), pH oko 5.46.3. Osjetljivost na etanol je ovisna o soju i hranidbenim uvjetima medija. Oni nemaju zahtjevne hranidbene potrebe i mogu se vrlo dobro razmnožavati i u vrlo jednostavnom mediju. Vrlo su osjetljive na djelovanje SO2. Pošto se octene bakterije mogu razmnožavati i pri niskim pH vrijednostima, pojavljuju se u moštu i u vinu u bilo kojoj 114
fazi vinifikacije. Njihov razvoj je ograničen sa odsustnošću zraka odnosno kisika, ali postoji stalna opasnost od kontaminacije i razmnožavanja tih bakterija zbog raznih postupaka u kojima je vino dolazi u dodir s zrakom. Kemizam octene fermentacije je prilično jednostavan: CH3CH2OH + O2
CH3 COOH +H2O
4.5.5. Bacili i druge bakterije Postoje neki podaci da Bacillus spp. i druge vrste bakterija mogu preživjeti sve uvjete pri proizvodnji vina pa sudjelovati u kvarenju vina. Bakterije koje su najčešće izolirane iz vina pripadaju vrstama B. coagulans, B. circulans, B. subtilis, B. megaterium, Clostridium spp.
4.5.6. Plijesni Postoji nekoliko načina pomoću kojih plijesni mogu utjecati na kvalitetu vina. Sigurno je najznačajniji predstavnik Botritys cinerea, plemenita plijesan. Također su utvrđene i druge vrste koje djeluju na kvalitetu i kemijski sastav mošta. Tu spadaju rodovi: Penicillium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Cladosporium, Alternaria, Unicula, Plasmopora. Veće koncentracije etanola i SO2 negativno djeluju na razvoj gljiva. Kontaminacija vinskog suđa s nekim plijesnima (Penicillium, Aspergilus) daje vrlo negativan okus vinu. Plijesni također upotrebljavaju i pluto kao supstrat za rast i oslobađaju svoje metabolite u vino, što ima vrlo negativne posljedice za vino.
4.5.7. Spontana i inducirana (kontrolirana) alkoholna fermentacija U nesulfitiranom i neinokuliranom moštu kvasci se počinju razmnožavati već nakon nekoliko sati iza punjenja tanka s moštom. Najviše se susreću vrškasti kvasci (Kloechera, Hanseniaspora). Aerobni kvasci (Candida, Pichia, Hansenula) se također susreću pri čemu svojim radom stvaraju octenu kiselinu i etil acetat. Kada koncentracija alkohola dosegne 4 – 6 % vol navedene vrste više se ne mogu razmnožavati pa glavnu ulogu preuzimaju vrste kvasaca iz roda Saccharomyces, a najčešći su S.cerevisiae i S.bayanus. Navedene vrste dovršavaju alkoholnu fermentaciju. Na kraju alkoholne fermentacije neke vrste kvasaca mogu uzrokovati kvarenje vina. Spontana fermentacija, zbog nekontroliranosti uvjeta, odvija se sporije pa je krajnji produkt fermentacije vrlo promjenljiv, što često mijenja organoleptička i kemijska svojstva (manjak ili višak kiselina, pojava neželjenih spojeva, početak neželjene malolaktične ili octene fermentacije itd.) i postoji veća mogućnost kvarenja vina. Sredinom šezdesetih godina 20.stoljeća na tržištu su se pojavili prvi preparati suhih aktivnih vinskih kvasaca. U to doba, na tržištu su se pojavile samo dvije vrste kvasaca: S. cerevisiae i S. oviformis. Suhi aktivni kvasci omogućili su vinarskoj industriji korištenje svih pozitivnih karakteristika kvasaca (relativna lakoća uporabe i sigurnost u ishod fermentacije). To je bila prva generacija suhih vinskih kvasaca. Oni su se koristili samo za ponovno započinjanje prekinute alkoholne fermentacije. Sredinom sedamdesetih godina tvrtka Lallemand u suradnji sa brojnim institutima i vinogradarima, razvila je drugu generaciju kvasaca koji su utjecali na kvalitetu vina. Ta generacija je obuhvaćala sojeve: WSK, 71B, K1 i EC. Svaki od tih sojeva bio je specifičan za neko svojstvo, npr. WSK je fermentirao na niskim temperaturama, 71B stvarao je aromatske spojeve, K1 imao je killer faktor. Danas se je na tržištu pojavila treća generacija kvasaca koji ističu 115
aromatična svojstva kultivara. To su smjerovi na tržištu kojima se koriste veliki proizvođači vina. Na svjetskom tržištu 2005.godine postojala su oko 200 različita soja kvasca S. cerevisiae od kojih su neki bili izvrsni dok drugi nisu mogli nikako zadovoljiti tržište, jer su negativno utjecali na tijek fermentacije. Današnja svjetska proizvodnja suhih kvasaca iznosi oko 350-400 tona godišnje, a pretpostavlja se da će potrebe tržišta doseći oko 3000 tona. Međutim, stalnom uporabom selekcioniranih kvasaca sa tržišta, koji sadrže mali broj vrsta u odnosu na ukupnu populaciju kvasaca prisutnih u proizvodnji vina, dolazi do gubitka autohtone populacije, koja još uvijek nije ispitana. Zato je neophodno obaviti selekciju aotohtonih kvasaca i na teritoriju Republike Hrvatske, kako bi hrvatska vina bila fermentirana s autohtonim sojevima, koji najbolje ističu aromu domaćih kultivara budući su prilagođeni na odgovarajuće uvjete.
4.5.8. Metabolizam kvasaca Fermentacijm glukoze i fruktoze iz mošta nastaje etanol, što je glavni proces u proizvodnji vina. Koncentracija etanola u vinu ovisi, naravno, o početnoj koncentraciji šećera u moštu i o temperaturi fermentacije. Naime, pri višim temperaturama fermentacija je brža, ali je i gubitak etanola isparavanjem veći. Količina šećera u grožđu je važan čimbenik pri izboru vremena berbe, dok je ostatak šećera u vinu nakon fermentacije važan stilistički čimbenik vina. Poželjan je u desertnim vinima a nepoželjan u ostalim tipovima vina. Sa senzorskog gledišta, koncentracije neprovrelog šećera, kiselosti i alkohola moraju biti uravnotežene u gotovom proizvodu. Sastav mošta utječe značajno na tijek fermentacije, a time i na kvalitetu gotovog proizvoda. Poznavanjem tijeka alkoholne fermentacije mogu se spriječiti mogući problemi. 4.5.8.1 Alkoholna fermentacija Alkoholna fermentacija vina je anaeroban proces, jer se kisik brzo potroši iz mošta. Tada sojevi kvasca Saccharomyces spp. preuzmu vodeću ulogu tijekom fermentacije i dovrše ju. Kvaščeve stanice se razmnožavaju tijekom fermentacije i pri anaerobnim uvjetima i pri tome proizvod alkohol (slika 4.8). 25
16
12 10
15
8 10
6 4
5
2 0 0
100
200
0 300
X /g/L), Etanol (% vol/vol)
Koncentracija šećera (%)
14 20
Šećer X Etanol
Vrijeme (sati)
Slika 4.8. Dinamika alkoholne fermentacije 116
Najvažniji put razgradnje glukoze i fruktoze tijekom fermentacije sa Saccharomyces vrstama je glikoliza do piruvata, nakon čega slijedi dekarboksilacija i redukcija u etanol (vidi poglavlje 6: Proizvodnja alkohola). Dva najvažnija enzima u biosintezi etanola su piruvat dekarboksilaza i alkohol dehidrogenaza. 4.5.8.2. Sekundarni produkti metabolizma šećera Na početku alkoholne fermentacije pri inokulaciji s kvascima Saccharomyces spp. nastaju jednake koncentracije etanola i glicerola (glavnog sekundarnog produkta fermentacije). Napretkom fermentacije stvara se sve više etanola jer se pri njegovoj sintezi oslobađa energija koju kvasci koriste za rast. Glicerol, piruvat i sukcinat stvaraju se u to vrijeme zajedno s drugim organskim kiselinama. Dihidroksiaceton fosfat se može reducirati do glicerol fosfata uz pomoću molekule NADH koja se reducira u NAD+, a glicerol fosfat se defosforilizira u glicerol. Tijekom ovog puta ne stvara se ATP, odnosno energija potrebna za rast. 4.5.8.3. Metabolizam dušika Spojevi dušika su esencijalni u rastu i metabolizmu kvasaca. Dušik je iza ugljika glavni element kojeg koriste kvasci za svoj rast. Frakcija dušika u moštu je složena i promjenjiva i sastoji se većinom od aminokiselina, NH4+ iona, peptida i proteina. Dušik ima vrlo važnu ulogu u stvaranju arome i za tok fermentacije. Primanje i metabolizam spojeva dušika ovise ne samo o soju kvasca S.cerevisiae već i o njegovoj fiziologiji te kemijskim i fizikalnim svojstvima okoline. S. cereviase može rasti u različitim koncentracijama dušičnih spojeva, uključujući amonijak, ureu, aminokiseline, peptide, purine i pirimidine. Mošt sadrži različite koncentracije ovih spojeva koje kvasci mogu koristiti za svoj rast. Prije uporabe, dušični spojevi moraju se transportirati unutar stanice. Ovisno o tipu dušičnog spoja koji će se akumulirati, uporaba će biti različita: bez modifikacija, npr. aminokiseline se direktno ugrađuju u proteine; sa modifikacijom, npr. aminokiseline se razgrađuju oslobađajući dušik koji se koristi za biosintezu drugih staničnih sastojaka s dušikom; kao izvor ugljika, npr. ugljikovi dijelovi aminokiselina se upotrebljavaju za biosinteze drugih staničnih ugljikovih spojeva. Asimilirajući izvori dušika: Veći dio dušika koji se nalazi u moštu mogu upotrebljavati kvasci kao izvor dušika. Od aminokiselina iznimka su lizin, cistein, prolin. Velike proteine i peptide S. cerevisiae ne može hidrolizirati ili akumulirati. Njihovo iskorištenje može biti olakšano od ostalih vrsta prisutnih tijekom fermentacije koje imaju značajnu proteolitičku aktivnost. Redoslijed prijenosa aminokiselina i amonijaka: Kod S.cerevisiae zabilježen je selektivni prijenos (transport) različitih aminokiselina i amonijaka. Važne aminokiseline, gledano s obzirom na brzinu primanja, su arginin, glutamat, valin, izoleucin, histidin, aspartat, triptofan, fenilalanin i metionin. Kod ovih aminokiselina je zabilježeno primanje od 7095% iz medija. Agrinin i histidin stvaraju najveće rezidualne koncentracije, ali početna koncentracija arginina u moštu je 5-10 puta veća od ostalih aminokiselina. Valin, tirozin, izoleucin, leucin i triptofan se u malim koncentracijama otpuštaju u medij u zadnjoj fazi fermentacije. Glicin, lizin i cistein ne upotrebljava S.cerevisiae značajno. Akumulacija aminokiselina i amonijaka se obično događa u fazi rasta, nakon čega se obično ne utvrđuju značajne razlike osim pri kraju fermentacije gdje se zabilježi malo otpuštanje aminokiselina. Ipak, ove opće karakteristike treba uzeti s rezervom jer je do sada istražen premali broj mošteva koji su sami po sebi vrlo složeni medij. 117
4.5.8.4. Metabolizam sumpora Sumpor je prisutan u esencijalnim vitaminima, koenzimima i aminokiselinama kao što su metionin i cistein. Tiolne grupe imaju važnu ulogu u aktivnim mjestima nekih enzima. Oksidacijsko stanje sumpora je od –2 do +6. Kvasci mogu reducirati sulfate, spojeve s najvišim oksidacijskim stanjem sumpora u sulfite koji se upotrebljavaju kasnije u metabolizmu. U kvascu S. cerevisaiae, maseni udio sumpora varira od 0,2 do 0,9 % suhe tvari. Najznačajniji spojevi sumpora su aminokiseline metionin i cistein, koje su prisutne u peptidima i proteinima i tripeptidu glutation. Glutation je koenzim, donor je tiolnih grupa i ima esencijalnu ulogu u biološkom redoks sistemu. Ostali sumporni spojevi kao npr. tiamin, acetil-CoA, biotin i liponska kiselina predstavljaju mali dio ukupnog sumpora. Gotovo sve vrste kvasaca za svoj rast upotrebljavaju anorganski oblik sumpora, najčešće u obliku sulfata.
4.6. MALOLAKTIČKA FERMENTACIJA Malolaktička fermentacija je proces u kojem malolaktične bakterije vina metaboliziraju L-malat u L-laktat. Malolaktičke bakterije vina posjeduju svojstvo otpornosti na visoke koncentracije etanola i kiselina te mogu metabolizirati velik broj spojeva u vinu. Još je 1866. godine Pasteur u “Etudes sur le vin” poistovjetio malolaktične bakterije s negativnim promjenama u vinu. Trebalo je 50 godina da se njegov stav promjeni i da se u praksi shvati da malolaktične bakterije mogu vršiti i pozitivne promjene na vinu; to se naročito odnosilo na smanjenje kiselosti. Glavne promjene koje se zbivaju tijekom malolaktične fermentacije prikazane su u tablici 4.2.Tek 50-tih godina ovog stoljeća objavljeni su prvi znanstveni radovi o malolaktičnoj fermentaciji i to iz enološke škole iz Bordeauxa. Kasnije su se istraživanja oko malolaktične fermentacije proširila. U moštu prvo se zbiva alkoholna fermentacija, koju vrše kvasci, a potom malolaktična fermentacija, koju vrše malolaktične bakterije. Tablica 4.2. Glavne transformacije sastojaka vina s mliječno-kiselim bakterijama SUPSTRATI PROIZVODI ŠEĆERI Laktat, etanol, CO2 Glukoza Laktat, etanol, CO2, manitol Fruktoza Arabinoza Laktat, acetat Ksiloza Laktat, acetat Riboza Laktat, acetat AMINOKISELINE Arginin Ornitin, CO2, NH3 Histidin Histamin, CO2 Fenilalanin 2-fenilalanin, CO2 Tirozin Tiramin, CO2 Ornitin Putrescin, CO2 Lizin Kadaverin, CO2 Serin Etanolamin, CO2 Glutamt -aminobutirat, CO2 KISELINE L-laktat, CO2, sukcinat, acetat L-malat Citrat, piruvat Laktat, acetat, CO2, acetoin
118
Glukonska 2-ketoglutarna Vinska Sorbinska Klorogenska
Laktat, acetat, CO2 4-hidroksibutirat, sukcinat, CO2 Laktat, acetat, CO2, Sukcinat 2,4-heksadien-1-ol Etil-katekol
Glicerol 2,3-butandiol
1,3-propandiol, akrolein 2-butaol
POLIOLI
Malolaktička fermentacija je sekundarni proces koji je moguć samo u nekim vinima. Ona je neophodna, za većinu crnih vina, a fakultativna je za bijela, ovisno o kultivaru (Chardonnay). Postoji slaba kontrola proizvođača nad malolaktičkom fermentacijom te ona ponekad može imati negativan tijek. Vrste malolaktičkih bakterija koje su do danas izolirane iz vina i taloga prikazane su u tablici 4.3. Tablica 4.3. Vrste bakterija izolirane iz vina i taloga Lactobacillus plantarum HOMOFERMENTATIVNE Lactobacillus casei
ŠTAPIĆI Lactobacillus brevis HETEROFERMENTATIVNE Lactobacillus hilgardi Pediocoxccus damnosus HOMOFERMENTATIVNE Pediococcus pentosaceus KOKI Leuconostoc mesentroides HETEROFERMENTATIVNE Oenococcus oeni
4.6.1. Biokemizam malolaktičke fermentacije Malolaktička fermentacija je u biokemijskom pogledu vrlo jednostavna: iz jedne molekule malata stvara se jedna molekula laktata i jedna molekula ugljičnog dioksida: COOH-CH2-CHOH-COOH
CH3-CHOH-COOH + CO2
Proces malolaktičke fermentacije nije samo jednostavna dekarboksilacija. U procesu sudjeluju dva enzima: malični enzim i malat dehidrogenaza. Malolaktički enzim katalizira reakciju malata do piruvata i CO2: Malat + 2NADP+
piruvat + 2NADPH2
U toj reakciji djeluje i trans hidrogenaze, koja katalizira premještaj vodika sa koenzima NADP na NAPDH2. Malat dehidrogenaza, koja je rjeđa, katalizira transformaciju malata u oksalacetat, koji djelovanjem dekarboksilaze prelazi u piruvat:
119
L-malat + NAD
oksalacetat
piruvat+CO2
U oba slučaja piruvat djelovanjem laktat dehidrogenaze prelazi u laktat. U tehnologiji vina malolaktička fermentacija je važna zbog tri učinka: a) smanjuje kiselost vina putem konverzije L-malata u L-laktat i CO2; b) povećava biološku stabilnost vina; c) mijenja aromu i okus vina, povećavajući koncentraciju spojeva koji utječu na te karakteristike.
4.6.2. Čimbenici malolaktičke fermentacije Najčešća vrsta koja sudjeluje u malolaktičnoj fermentaciji je zasigurno O. oeni. Na početku vinifikacije, nakon berbe, mogu se utvrditi vrste MKB, što ovisi o klimatskim prilikama i stanju grožđa. Tijekom alkoholne fermentacije broj MBK opada i na završetku alkoholne fermentacije iznosi102-103 CFU/ml i tada malat još nije razgrađen. Nakon alkoholne fermentacije malolaktične bakterije se nalaze u latentnoj fazi, nakon koje slijedi eksponencijalna faza. Kada se populacija približi vrijednosti oko 106 CFU/ml malat se počinje razgrađivati. Optimalni čimbenici koji uvjetuju rast malolaktičnih bakterija su: temperatura, pH, koncentracija etanola i SO2. Optimalna temperatura za malolaktičku fermentaciju je oko 20o C, dok je rast bakterija onemogućen kad pH padne ispod 3. Koncentracija etanola je vrlo značajna i selekcija ide u pravcu selekcije što otpornijih sojeva na što veće koncentracije etanola u vinu. Vrlo je značajna i količina slobodnog i vezanog SO2, jer veće koncentracije inhibiraju malolaktične bakterije. Zato se ne smije sumporiti vino odmah nakon alkoholne fermentacije, ako se želi aktivirati malolaktičnu fermentaciju.
4.6.3. Utjecaji malolaktičke fermentacije na vino Smanjenje kiselosti. Kao što je prije navedeno kod malolaktične fermentacije osnovni način smanjenja kiselosti je konverzija L-malata u L-laktat uz oslobađanje CO2. L-malat + malolaktični enzim
L-laktat +CO2
Također, limunska kiselina prisutna u vinu je često metabolizirana od strane malolaktičkih bakterija. Isto tako, malolaktičke bakterije mogu metabolizirati neke fenolne spojeve različite spojeve arome. Međutim, o metabolizmu ovih spojeva se vrlo malo zna. Glavni produkti metabolizma citrata su acetat i diacetil. Povećana količina acetata škodi kvaliteti vina, kao i suvišak diacetila (najznačajnijeg produkta malolaktične fermentacije koji daje aromu maslaca tipičnu za malolaktičnu fermentaciju). Količina acetata i diacetila, koji se stvaraju iz citrata, ovisi, naravno o količini razgrađenog citrata, ali i o uvjetima u kojima se vrši malolaktična fermentacija. Biološka stabilnost vina. Malolaktična fermentacija povećava biološku stabilnost vina jer malolaktične bakterije iskoriste sve izvore šećera te je vrlo otežan ili čak onemogućen razvoj drugih mikroorganizama. Također je utvrđeno izlučivanje određenih tvari koje inhibiraju rast drugih mikroorganizama. Promjene arome koje uzrokuje malolaktična fermentacija. Što se tiče utjecaja malolaktične fermentacije na aromu vina postoje suprotna mišljenja. Svojim metabolizmom malolaktične bakterije mijenjaju kemijski sastav vina i pitanje je da li su
120
te razlike organoleptički primjetljive i da li su primjetljive u pozitivnom ili negativnom smislu. Neki od kemijskih spojeva na koje utječe malolaktična fermentacija: 1) acetaldehid je važan spoj alkoholne fermentacije koji u visokim koncentracijama daje negativnu aromu vinu, dok je u nižim koncentracijama poželjan. Tijekom malolaktične fermentacije smanjuje se koncentracija tog spoja, ali također može negativno utjecati na malolaktičnu fermentaciju jer se njegovom razgradnjom oslobađa SO2 koji je na njega vezan od početku alkoholne fermentacije. 2) octena kiselina - koncentracija octene kiseline je vrlo bitna jer taj spoj ima pozitivan ili negativan utjecaj. Ona je uz D-laktat obavezan metabolit heterofermentativnih mliječno kiselih bakterija (O. oeni i Lactobacillus) te se njena koncentracija povećava tijekom malolaktične fermentacije. 3) Acetoin i 2,3 butandiol – nastaju redukcijom diacetila. Ti spojevi u koncentracijama u kojima se nalaze u vinu nakon malolaktične fermentacije obično ne utječu na vino. 4) Akrolein se stvara mliječno kiselom fermentacijom iz glicerola. Oko 10 mg/L uzrokuje negativne posljedice na vino. Može se spajati s fenolnim grupama antocijana i dati vinu gorčinu. Tu negativnu karakteristiku imaju samo neke vrste malolaktičnih bakterija i to P. parvulus, Lb .cellobosus, Lc. mesentroides. 5) Diacetil se smatra najvažnijim aromatičnimm spojem malolaktičke fermentacije. Njegov doprinos vinu ovisi o koncentraciji, tipu i stilu vina. Koncentracija slobodnog SO2 ima vrlo snažan učinak na hlapivost diacetila. Diacetil nije stabilan produkt i lako se reducira u 2,3 butandiol. Koncentracija diacetila u vinu ovisi o odnosu stvorenog i reduciranog diacetila. Na akumulaciju diacetila u vinu utječe soj MKB, prisustvo kvasaca, pH vina, temperatura, tlak O2, koncentracija citrata kao ishodišnog spoja za njegovu sintezu i suvišak dostupnog piruvata. Neke vrste bakterija rodova Pediococcusa i Lactobacillusa sintetiziraju visoke koncentracije diacetila, dok O. oeni stvara niže koncentracije. On se stvara tijekom metabolizma malata i obično se reducira nakon što se je metabolizam malata završio. Zato kada želimo zadržati visoke koncentracije diacetila u vinu, vino odmah nakon malolaktične fermentacije sumporimo da bi izbjegli redukciju diacetila. Prisustvo kvasaca tijekom malolaktične fermentacije smanjuje količinu diacetila. Citrat povećava koncentraciju diacetila tijekom malolaktične fermentacije. 6) Jabučna kiselina - kao što je prije navedeno dekarboksilacija malata je kvantitativno najvažnija reakcija malolaktične fermentacije. Malat se može razgraditi na tri različita načina : 1) dekarboksilacijom do laktata; 2) konverzija malata do piruvata kod Lb. casei i Lact. faecalis pomoću maličnog enzima; 3) redukcija malata do L(+)D laktata, acetata, sukcinata i CO2 (Lb.fermentum).
4.7. POSTUPCI STABILIZACIJE I DOZRIJEVANJA VINA Prije punjenja vina u boce te njegovog stavljanja u promet mora se vino obavezno stabilizirati kako tijekom daljnjeg čuvanja ne bi došlo do pojave zamućenja, taloga, oksidacije ili naknadne mikrobiološke aktivnosti.
4.7.1. Stabilizacija vina na tartarate Kristali vinske kiseline, tj. vinski kamen sastavljen je najvećim dijelom od kalijevog bitartarata te manjim dijelom kalcijevog tartarata. Javlja se u obliku taloga na dnu boce. Na stabilizaciju tartarata u vinu utječe više čimbenika te tako s povećanjem koncentracije 121
alkohola smanjuje se njihova topivost te time povećava izdvajanje iz medija. Niže temperature potenciraju stvaranje kristala dok prisutnost koloida ima suprotni učinak, posebice manoproteina koji su pokazali pozitivna svojstva u stabilizaciji tartarata. Kod crnih vina kalijevi i bitartaratni ioni vežu se s taninima te je samim time i proces kristalizacije usporen. Najčešći postupak stabilizacije je hlađenje vina uz kasniju filtraciju ili centrifugiranje. Postupak stabilizacije može se provesti i dodatkom metavinske kiseline koja spriječava kristalizaciju. Dodaje se neposredno pred punjenje vina u boce, najviše do 100 mg/L. Međutim, njezina učinkovitost nije dugotrajna jer se u vinu s vremenom hidrolizira .
4.7.2. Stabilizacija vina na bjelančevine U vinu u boci lagano može doći do pojave zamućenja tj. maglušavosti. To je posljedica prisutnosti bjelančevina koje se zbog pozitivnog naboja ne mogu istaložiti. Njihovo izdvajanje pospješuje se apsorpcijom, denaturacijom ili neutralizacijom dodatkom enoloških sredstava. Pošto je pojava zamućenja puno izraženija na višim temperaturama nazivaju se još i termolabilne bjelančevine. Najčešća metoda za stabilizaciju vina na bjelančevine je dodatak bentonita. Pošto je negativnog naboja dolazi do intenzivne reakcije između čestica bentonita i prisutnih bjelančevina te njihovog taloženja. Najčešće se koristi Na-bentonit koji ima najveći potencijal za izmjenu kationa i absorpciju bjelančevina. Po završetku postupka stabilizacije treba provesti test na stabilnost koji se sastoji od zagrijavanja vina na 80 °C 30 minuta te naglog hlađenja. Ako nije došlo do promjene bistroće znači da je stabilnost postignuta.
4.7.3. Stabilizacija vina na polisaharide Koncentracija polisaharida u vinu kreće se između 300 i 1000 mg/L. Porijeklom su iz grožđa (ß-glukani, pektini) ili nastaju kao posljedica aktivnosti mikroorganizama. Njihova glavna uloga je da djeluju kao zaštitni koloidi te vezanjem s drugim koloidima usporavaju ili sprječavaju njihovo taloženje. Samim time povećavaju mutnoću vina te otežavaju filtraciju. Najčešći problem je prisutnost ß-glukana u vinima, dobivenim od grožđa zaraženog s plijesni Botrytis cinerea. Problem se rješava dodatkom bistrila (želatina, silicijev dioksid) ili dodatkom enzima ß-glukanaze.
4.7.4. Stabilizacija vina na metale Problemi s većom količinom teških metala su zahvaljujući modernizaciji tehnoloških postupaka u vinarstvu u današnje vrijeme vrlo rijetki. Ako i dođe do nestabilnosti najčešći razlog je povišeni sadržaj iona željeza i/ili bakra. U vino dođu preko grožđa, čestica zemlje, ostataka pesticida i neodgovarajuće vinske opreme. Višak željeza može uzrokovati tzv. bijeli ili plavi lom. Do njihove pojave dolazi kada se vino nađe u kontaktu sa zrakom pri čemu dolazi do oksidacije topivog Fe2+ u netopivi Fe3+ koji se lagano veže i na proteine. Puno češće se javlja kod bijelih vina i to u obliku zamućenja sivkasto-bijele boje. Kod plavog loma ioni Fe3+ vežu se na antocijane i tanine prisutne u crnim vinima. Njihova pojava je prvenstveno vezana uz koncentraciju željeza (iznad 20 mg/L), oksidoredukcijski potencijal (niži potencira pojavu loma), prisutnost limunske kiseline (sprječava pojavu loma). Ioni bakra u vino uglavnom prelaze preko zaštitnih sredstava te kontakta s bakrenim vinskim suđem. Bakreni lom javlja se u boci, u reduktivnim uvjetima i to ako je koncentracija bakra veća od 0,5 mg/l. Potencira ga niski oksido-
122
redukcijski potencijal te izloženost vina svjetlosti. Dolazi do prelaska topivog Cu2+ u netopivi Cu+ ion što se manifestira pojavom crvenkastog taloga u boci.
4.8. PRETOK I DOZRIJEVANJE VINA 4.8.1. Dolijevanje posuda Općenito vrijedi da nadolijevanje počinje po završetku burnog vrenja, kada dolazi do smanjenog oslobađanja ugljičnog dioksida te njegove količine više nisu dostatne da spriječe kontakt vina sa zrakom. Umjesto nadolijevanja može se koristiti i inertni plin (dušik, argon).
4.8.2. Pretok vina Ovaj postupak obavlja se radi odjeljivanja mladog vina od nastalog taloga. Najjednostavnije je obaviti ga jednostavnim dekantiranjem, primjenom gravitacije ili primjenom električne pumpe. Pored bistrenja vina pretok i na druge načine pozitivno utječe na kakvoću vina. S odstranjivanjem mikroorganizama, kristala vinskog kamena, bjelančevina povećava se mikrobiološka stabilnost vina. Pretokom se odstranjuju reduktivni mirisi, koji se mogu javiti u vinu (sumporovodik, merkaptani). Posljedica pretoka je i aeracija tj. kontakt vina s kisikom te djelomični gubitak ugljičnog dioksida. Za prvi pretok vina obavezno se čeka kraj alkoholne fermentacije te je potrebno općenito pridržavati se nekih pravila: - vino od trulog grožđa treba pretočiti odmah po završetku alkoholne fermentacije kako ne bi došlo do pojave neugodnih reduktivnih mirisa, - ukoliko se pojavi reduktivni miris vina potrebno je provesti intenzivan zračni pretok (jača aeracija tijekom pretoka), - vina u kojima ne želimo provesti malolaktičnu fermentaciju pretačemo odmah po završetku alkoholne fermentacije, - bijela vina s većim ostatkom neprevrelog šećera pretaču se odmah po prekidu alkoholne fermentacije kako bi se smanjila mogućnost naknadne fermentacije. Broj pretoka vina prvenstveno ovisi o stupnju bistroće, dodatku enoloških sredstava te eventualnoj pojavi bolesti i mana vina. Obično je drugi pretok vezan uz odstranjivanje taloga nastalog zbog dodavanja nekog od enoloških sredstava (bentonit, PVPP, želatina).
4.8.3. Dozrijevanje vina Dozrijevanje vina može se podijeliti u dvije faze. Prvu fazu obuhvaća period od završetka alkoholne fermentacije do punjenja vina u boce. Taj period obilježava veliki broj fizikalno-kemijskih promjena koje uzrokuju enološki postupci kao npr. malolaktična fermentacija, pretoci, dodatak enoloških sredstava, stabilizacija i filtracija vina, primjena drvenog suđa. Može trajati od 4 mjeseca pa do preko godinu dana i duže. Druga faza započinje sa punjenjem vina u boce te je njezina dužina određena sposobnošću pojedinog vina za povećanjem kvalitete tijekom starenja u boci. Većina bijelih vina povećava svoju kakvoću u periodu od nekoliko mjeseci pa do 2-3 godine starenja. Kod crnih vina priča je nešto drugačija te pojedina godišta mogu dozrijevati i duži period (5 do 10 godina). Promjene po završetku alkoholne fermentacije započinju sa smanjenjem tipične fermentacijske arome te postepenim formiranjem arome starenja uz gubitak svježine
123
vezano za smanjenje ugljičnog dioksida u vinu. Vino postaje skladnije, pitkije, harmoničnije te mu se povećava kompleksnost.
4.8.4. Promjena boje Dozrijevanjem vino mijenja boju te poprima zagasitije tonove što je posebice naglašeno kod crnih vina. Tako intenzivni ljubičasto crveni tonovi mladih vina prelaze u tamnije crvene, ciglaste tonove. Osnovni razlog je polimerizacija antocijana te gubitak jednog dijela slobodnih antocijana taloženjem ili njihovim vezanjem na proteine. Polimerizaciju i stabilizaciju boje kod crnih vina potencira aeracija te viša temperatura. Kod bijelih vina promjena boje nije toliko istražena no najvećim dijelom veže se uz sintezu nekih novih spojeva te oksidaciju fenola porijeklom iz grožđa ili dužica drvenog suđa. Pri tome intenzivne zeleno žute tonove mladih vina zamjenjuju zlatno žuti do jantarni tonovi.
4.8.5. Promjena okusa Pored polaganog smanjivanja koncentracije ugljičnog dioksida jedna od najznačajnijih promjena vezana je uz smanjenje intenziteta gorčine i trpkoće posebice kod crnih vina. To je posljedica polimerizacije tanina između sebe ili sa antocijanima te proteinima. Na promjenu okusa u manjoj mjeri utječe i smanjenje ukupne kiselosti.
4.8.6. Promjena mirisa Najznačajnije promjene vezane su uz promjene estera, terpena, norisoprenoida: - hidroliza estera octene kiseline te viših alkohola dovodi do gubitka svježe, voćne arome karakteristične za mlada bijela vina, - dolazi do sinteze nekih novih estera kao npr. dietil sukcinata, - etil esteri masnih kiselina su kemijski stabilni ili se njihova koncentracija starenjem čak i povećava, - ukupna koncentracija terpena se starenjem smanjuje ali može doći i do oslobađanja dijela vezanih terpena, - dolazi do postupno oslobađanja glikozidno vezanih norisoprenoida, - oksidacija sumpornih spojeva (4-merkapto-4-metil-2-pentanon, 3-merkaptoheksanol, 3-merkapto-heksilacetat), što utječe na gubitak sortne arome kod vina Sauvignon.
4.8.7. Čimbenici koji utječu na dozrijevanje vina u boci Temperatura: Veće temperature potenciraju hidrolizu aromatičnih estera. Izoamil acetat i heksil acetat brzo degradiraju pri temperaturi od 30 °C. Slično se ponašaju i terpeni. Zato je idealna temperatura skladištenja oko 10 °C. U crnim vinima temperatura utječe na brzinu posmeđivanja uslijed gubitka slobodnih antocijana i formiranja polifenolnih pigmenata. Velika kolebanja temperature tijekom skladištenja mogu uzrokovati veći ulazak kisika u bocu uslijed slabijeg prijanjanja plutenog čepa što je posljedica smanjenja i povećanja volumena vina u boci. Kisik: Nekontroliranim ulaskom kisika u bocu može doći do oksidativnih procesa koji vode ka gubitku voćne sortne arome i oksidaciji mirisa i okusa vina. Bez dostatne količine slobodnog sumpornog dioksida moguće je i brzo posmeđivanje pogotovo bijelih
124
vina. Posmeđivanje crvenih vina naglašenije je pri višem pH. Isto tako u prisutnosti kisika brži je postupak polimerizacije tanina i antocijana.
4.8.8. Dozrijevanje u drvenom posuđu U prošlosti je drveno posuđe imalo ulogu fermentacijskih posuda, posuda za dozrijevanje i ujedno transportnih posuda. U današnje vrijeme uslijed uvođenja drugih materijala u podrum (inox) njihova glavna uloga vezana je uz dozrijevanje vina i to crnih te pojedinih bijelih. U nekim tehnologijama (sur lie) koriste se i kao posude za fermentiranje. Volumen drvenih bačava se s vremenom smanjio, što znači veći kontakt vina sa kisikom a kao glavni tipovi nametnule su se barrique bačvice (225-250 L), koje se razlikuju po intenzitetu paljenja (lagano, srednje i jako). No to ne znači da pri proizvodnji pojedinih tipova vina ne treba koristiti i veće bačve (iznad 1000 L) što uvjetuje i manji kontakt vina sa kisikom te duži period dozrijevanja vina u njima. Ovisno od dužine držanja vina u bačvi različit je i njihov utjecaj na mirisna i okusna svojstva. Tanini drveta su u vinu dobro topivi te mogu značajno utjecati na okus, boju ali i miris vina. Pošto oni imaju gorak okus, za bijela vina bolje je koristiti dobro ovinjenje bačve tj. nešto kraći kontakt vina sa drvetom u odnosu na crna vina. Pod utjecajem etanola i kisika dolazi do razgradnje lignina iz drveta i sinteze značajnih aromatskih spojeva kao što su vanilin, siringaldehid, sinapaldehid. Na njihovu koncentraciju značajno utječe i jačina paljenja dužica bačve. Među fenolnim spojevima ekstrahira se najviše neflavonoida, među njima posebice hidrolizirajućih tanina tj. elagotanina. Hrastovi laktoni imaju pozitivan utjecaj na aromu tih vina ali je njihova ekstrakcija iz drveta relativno spora (6-12 mjeseci). Sa višekratnim korištenjem drvenih bačava dolazi do smanjenja ekstrakcije gore spomenutih spojeva. Pri dozrijevanju vina u drvenom posuđu mora se imati na umu da dolazi do smanjenja količine vina uslijed evaporacije. Računa se da gubitak vina, ovisino o relativnoj vlažnosti i temperature okoline, iznosi 2-5%.
Slika 4.9. Barik bačve
4.9. PUNJENJE VINA U BOCE Punjenje vina se obavlja u odgovarajućoj prostoriji koja se isključivo koristi u tu svrhu kako bi se izbjegla moguća mikrobiološka kontaminacija vina. Osnovni postupci pri punjenju vina u boce su: -provjera i priprema aparata za punjenje, -nabava boca, čepova, -ispiranje, sterilizacija i čišćenje boca, -sterilizacija cijelog sustava za punjenje (filter-linija za punjenje-čepilica), -sterilna filtracija vina, 125
-punjenje i čepljenje vina, Boce s plutenim čepom obavezno se ostave uspravne jedan dan kako bi se postiglo potpuno sljubljivanje čepa s grlićem boce. Punjenje vina u boce prikazano je na slici 4.10.
Slika 4.10: Poluautomatska punilica-čepilica vina
4.10. TEHNOLOGIJA PROIZVODNJE BIJELIH VINA Za proizvodnju bijelih vina u svijetu koriste se različite tehnologije koje omogućavaju proizvodnju vina različitih stilova od mladih, lepršavih izrazito aromatičnih do kompleksnih bogatih, spremnih za duže dozrijevanje. Isto tako pravilno korištenje pojedine tehnologije omogućava smanjenje razlika u kakvoći vina uvjetovane godinom berbe i kakvoćom grožđa. Kod klasične proizvodnje bijelih vina maceracija se najčešće ne provodi prvenstveno kako ne bi došlo do pretjerane ekstrakcija fenolnih spojeva. Međutim, kod grožđa aromatičnih sorti (traminac, sauvignon, muškati) provodi se kratka maceracija pri temperaturama od 10-15 °C sa ciljem ekstrakcije aromatičnih spojeva smještenih u kožici bobice. Postupak bistrenja neizbježan je u proizvodnji bijelih vina ali se zna da intenzivo predbistrenje moštova ( ispod 80 NTU) može imati negativne posljedice na tijek alkoholne fermentacije i kasnije kakvoću dobivenih vina. Alkoholnu fermentaciju u većini slučajeva provode selekcionirani sojevi kvasca poznatih svojstava, koja se najčešće zbiva u inox tankovima uz mogućnost kontrole temperature fermentacije. Kontrola temperature je nužna kako fermentacija ne bi bila preburna što može utjecati na znatan gubitak aromatičnih spojeva. Najčešća temperatura fermentacije kreće se od 15 do 18 °C, nešto viša kod vina s većim potencijalom starenja. Malolaktična fermentacija se ne provodi kod svih bijelih vina već zavisno od sorte i tipa vina koja se žele proizvesti. Uobičajena je kod vina koja duže vrijeme dozrijevaju te sorti čija aroma je kompatibilna sa aromom MLF-a kao npr. Chardonnay. Najčešće se ne provodi kod vina od aromatičnih sorti gdje se sprječava pravovremenim sumporenjem, snižavanjem temperature i filtracijom. Postupci vezani uz dozrijevanje bijelih vina prvenstveno su ovisni o tipu vina koje se želi dobiti. Vina s većim ostatkom reducirajućeg šećera moraju se dodatno zaštititi te spriječiti mikrobiološku aktivnost. Vina s naglašenom voćnom aromom čuvaju 126
se pri nižim temperaturama (oko 10 °C), a ona s većim potencijalom dozrijevanja (dobivena od zdravog grožđa, većeg postotka alkohola i izrazite punoće okusa) ostavljaju se jedan period u drvenom posuđu ili se proizvode posebnom tehnologijom njege na kvascu (sur lie). Među novijim postupcima u proizvodnji bijelih vina mogu se svrstati i hiperoksidacija te hiperredukcija, ali i tehnologija dozrijevanje vina na kvascu (tzv. sur lie).
4.10.1. Hiperoksidacija Ta tehnika se primjenjuje kod proizvodnje bijelih vina prije početka alkoholne fermentacije, neposredno po prešanju, a prije bistrenja i dodatka sumpornog dioksida. Osnovni princip je dodavanje kisika u mošt s pomoću posebnog uređaja za hiperoksidaciju, s ciljem enzimske oksidacije većine fenolnih spojeva te se na taj način eliminira mogućnost kemijske oksidacije i posmeđivanja vina. Mošt tijekom dodavanja kisika intenzivno posmeđi a oksidirani fenoli se tijekom alkoholne fermentacije vežu, najvećim dijelom na proteine i na taj način talože. Samim time dodatak sumpornog dioksida u mošt je nepoželjan jer sprječava enzimatsku oksidaciju. Glavni problem ove tehnike je pravilno odrediti potrebnu količinu kisika koja je potrebna za oksidaciju prisutnih fenolnih tvari. Izmjerene količine su vrlo različite i kreću se od 9 do 30 mg/L. U praksi se kisik dodaje postepeno, uz intenzivno miješanje, do trenutka kada mošt jako posmeđi. Rezultati istraživanja opravdanosti upotrebe ove tehnike su različiti no sigurno je da dolazi do smanjenja fenolnih spojeva, a samim time i okusa gorčine koja je s njima povezana. Tako dobivena vina također su puno stabilnija u kontaktu s kisikom te imaju stabilniju boju koja je nešto intenzivnija (svjetlo zlatna, slamnato žuta) u odnosu na tonove koji se dobiju tijekom klasične proizvodnje bijelog vina.
4.10.2. Hiperredukcija Postupak hiperredukcije podrazumijeva postizanje reduktivnih uvjeta od trenutka prešanja grožđa pa sve do formiranja krajnjeg proizvoda, vina. Glavni cilj ovoga postupka je očuvanje aromatičkih spojeva porijeklom iz grožđa koji su na taj način sačuvani od djelomične ili potpune oksidacije. Pošto je upravo postupak prešanja period kada je masulj/mošt u najvećoj mjeri u kontaktu s kisikom proizvođači vinarske opreme nude posebne membranske preše koje imaju mogućnost dodavanja dušika ili ugljičnog dioksida i na taj način postižu odsutnost kisika tijekom prešanja. Slični uvjeti moraju biti postignuti i kod pretoka mošta u fermentacijske posude ili bilo kojeg daljnjeg pretoka ili postupka obrade/dorade vina za što se također koriste posebni sistemi. Tako se posude najprije napune s dušikom koji zatim mošt (vino) postepeno istiskuje iz posude.
4.10.3. Njega vina na kvascu (sur lie) Sur lie francuski je izraz za držanje vina na talogu kvasca nakon fermentacije, a bâtonnage izraz za miješanje taloga s vinom. Glavni razlog primjene sur lie tehnologije temelji se na povećanju kompleksnosti strukture i okusa vina, izražajnosti „tijela“ te poboljšanju složenosti i duljine trajanja arome vina. Talog odnosno stanice kvasaca apsorbiraju kisik osiguravajući polaganu i kontroliranu oksidaciju tijekom dozrijevanja vina. Miješanjem taloga s vinom potencira se autoliza kvasaca što direktno utječe na senzorska svojstva vina dajući mu kremasti, viskozitetni okus u ustima. Sur lie proizvodnja bijelih vina tradicionalna je tehnologija pokrajne Burgundije uglavnom za
127
kultivar Chardonnay. Tom se tehnologijom proizvode svjetski poznata Chablis vina. Tijekom godina tehnologija se proširila i po drugim vinorodnim krajevima svijeta, te vina tog tipa proizvode u Švicarskoj, Australiji, Mađarskoj, Italiji. Razlike u kakvoći i senzorskim svojstvima vina vežu se uz kultivar, tip bačvice i dužinu držanja vina na talogu. U proizvodnji vina sur lie tehnologijom treba uvažavati slijedeće tehnološke kriterije: -grožđe mora biti dobro dozrelo i potpuno zdravo, a vina trebaju sadržavati više od 12.5 vol.% alkohola, biti dobre strukture i bogata ekstraktom, -sulfitiranje mošta teorijski je nepotrebno, u praksi se koriste minimalne količine, -predbistrenje mošta provodi se isključivo taloženjem i ne smije biti preintenzivno. Optimalne vrijednosti bistroće kreću se oko 250 NTU jedinica, -alkoholna fermentacija mošta provodi se upotrebom selekcioniranih kvasaca poznatih enoloških svojstava sa ciljem potpune razgradnje šećera (S. cerevisiae), -kontrolirana malolaktična fermentacija upotrebom starter kultura (O. oeni), -nakon fermentacije višemjesečna njega vina na kvascu u barik bačvicama uz stalno miješanje vina s kvascem, Vina dobivena «sur lie» tehnologijom otpornija su na : -oksidacijske promjene, jer kvaščeve stanice djeluju reduktivno vežući slobodni kisik,. -imaju stabilniju boju, jer kvasci adsorbiraju spojeve odgovorne za pojavu sivo ružičaste nijanse nekih bijelih vina izloženih laganoj oksidaciji, -manja je potreba vina za sulfitiranjem zbog reduktivnog djelovanja kvasčevih stanica. Tijekom tog procesa dolazi do prirodne fizikalno-kemijske stabilizacije vina i to zbog, -poboljšanja stabilnosti na proteine uslijed otpuštanja manoproteina (molekule polisaharida koje čine više od 35 % kvaščeve stanice) u vino. Time se također smanjuje i potreba za upotrebom bentonita, -poboljšane stabilnosti vina na tartarate, jer manoproteini djeluju kao inhibitori stvaranja kristala kalijevog hidrogentartarata. Istraživanja su potvrdila da držanjem na talogu vina već nakon nekoliko mjeseci postižu tartaratnu stabilnost, čime postupak hladne stabilizacije u doradi vina postaje nepotreban, Kemijski sastav sur lie vina vrlo je kompleksan jer ga čine: spojevi podrijetlom iz grožđa i spojevi sintetizirani u alkoholnoj fermentaciji, spojevi porijeklom iz hrastovine, produkti autolize kvaščeve stanice, produkti metabolizma mliječnih bakterija (MLF). Također se javlja i mikrooksidacija odnosno postupno prodiranje kisika kroz pore dužica što omogućuje odvijanje vrlo složenih kemijskih reakcija pri formiranju vina.
4.11. TEHNOLOGIJA PROIZVODNJE CRNIH VINA Pri proizvodnji različitih stilova crnih vina najviše mogućnosti ima u mijenjaju uvjeta maceracije i dozrijevanja vina. U tome veliku ulogu igra i iskustvo samog enologa, te podrumara. Tehnologija proizvodnje crnih vina više je usmjerena na ekstrakciju željenih fenolnih spojeva nego na sintezu i očuvanje aromatskih spojeva. Kod klasične proizvodnje crnih vina poznata su dva stila: proizvodnja dobro obojenih vina naglašenije voćnosti i manje izražene trpkosti (kraća maceracija) koja obično ne dozrijevaju u drvenom suđu te vina bogata fenolnim spojevima kao posljedica duže maceracije zrelog i/ili prezrelog grožđa u kojima obavezno protječe malolaktična fermentacija te dozrijevanje duži period u drvenom suđu. Na sami tijek maceracije utječe se prvenstveno
128
dužinom njezinog trajanja, temperaturom i tehnikom potapljanja klobuka (površinskog sloja). Većina proizvođača primjenjuje tzv. klasičnu maceraciju koja protječe paralelno s alkoholnom fermentacijom. Temperatura se kreće od 26 do 30 °C dok se niže temperature od 20 do 25 °C koriste za dobivanje svježih, voćnih, aromatičnih crnih vina koja će brzo doći na tržište. Klobuk treba redovito potapati i to ručno više puta na dan ili primjenom posebnih vinifikatora gdje je taj postupak automatiziran. Među fenolnim spojevima koji se tijekom maceracije izdvajaju za vinare su najvažniji flavonoidi, među njima antocijani te proantocianidini tj. kondenzirani tanini. Ekstrakcija antocijana najizraženija je u prva 3-4 dana maceracije (može se potencirati primjenom pektolitičkih enzima) dok se tanini izdvajaju nešto sporije. Dio tanina odmah reagira sa antocijanima tvoreći komplekse koji utječu na kasniju stabilnost boje. Više temperature u maceraciji i alkoholnoj fermentaciji potenciraju rast i metabolizam kvasaca te samim time i tvorbu alkohola te ekstrakciju fenolnih spojeva pri čemu etanol djeluje kao ekstrakcijsko sredstvo. Previsoka temperatura ima negativan utjecaj prvenstveno radi veće sinteze octene kiseline i sumporovodika te većeg gubitka aromatičnih spojeva. Dužina maceracije ovisna je prvenstveno od tipa vina koji želimo proizvesti. Ako se proizvodi vino koje će prije doći na tržište dužina maceracije se obično kreće između 3-5 dana. Kratka maceracija daje dovoljno boje ali i manje tanina. Najdulje maceracije traju i preko 3 tjedna u kojem periodu dolazi i do jače ekstrakcije tanina iz sjemenki. Po završetku maceracije najprije dolazi do smanjenja koncentracije fenolnih spojeva zbog njihovog vezanja na proteine te djelomične oksidacije. Međutim kraj maceracije ne znači i kraj alkoholne fermentacije. Zato se tijekom prešanja pazi da ne dođe do prekida alkoholne fermentacije uslijed snižavanja temperature. Obično se ova zadnja faza fermentacije odvija pri temperaturi od 18 do 20 °C. U nekim slučajevima proces maceracije može se produžiti i po završetku alkoholne fermentacije, tada klobuk pada na dno, a prostor se zapuni inertnim plinom kako ne bi došlo do oksidacije. Dozrijevanje crnih vina najvećim je dijelom povezano sa drvenim suđem. U tom periodu dolazi do protjecanja malolaktične fermentacije, stabilizacija boje vezanjem antocijana i tanina te smanjenja gorčine vina.
4.11.1. Mikrooksidacija Dodatak minimalne količine kisika, mikrooksidacija, je postupak čiji osnovni cilj je postizanje optimalnih uvjeta dozrijevanja vezanih uz bržu stabilizaciju boje, te smanjenje gorčine tanina. Kisik se pomoću posebnih sondi i aparata za doziranje kisika uvodi u inoks posude u točno određenim intervalima. Postupak obično traje od 3 do 6 mjeseci. Mikrooksidacija kao postupak prvenstveno je namijenjena za vina s velikom količinom antocijana. Prosječno dodana količina kisika kreće se od 3 do 30 mg/L na mjesec. Pri tome dolazi do bržeg dozrijevanja vina pri čemu se intenzitet boje povećava. Pri tom postupku važno je vina neprekidno organoleptički kontrolirati kako umjesto procesa dozrijevanja ne bi došlo do oksidacije i povećanja kratkolančanih (hlapivih) organskih kiselina.
4.11.2. Karbonska maceracija To je maceracija u atmosferi ugljičnog dioksida te je vezana najvećim dijelom na područje južne Francuske (Beaujolais). Ta tehnologija omogućava proizvodnju crnih vina specifične arome u vrlo kratkom vremenskom periodu. Glavna razlika u odnosu na klasičnu tehnologiju je da se grožđe ne mulja i runji te ne preša. Tako se cijelo grožđe
129
poslaže u veliku ne previsoku posudu. Uvođenjem ugljičnog dioksida pri temperaturi do 30 °C počinje u bobicama alkoholna fermentacija ali ne uslijed rada kvasaca već djelovanjem enzima koji se nalaze u grožđu. Sama fermentacija nije tako intenzivna no sintetiziraju se isti spojevi: etanol, CO2, glicerol, acetaldehid, octena kiselina. Glavne promjene do kojih dolazi su: - mekšanje kožice bobice i pucanje stanične stijenke uslijed razgradnje pektina te oslobađanje soka iz bobice, - sinteza etanola (prosječno od 1,5-2 vol%), - razgradnja do 60 % jabučne kiseline u piruvičnu, oksaloctenu kiselinu i etanol, - sinteza aromatskih spojeva, - veća koncentracija aminokiselina uslijed enzimatske razgradnje proteina, - ekstrakcija fenolnih spojeva iz kožice, - sinteza nešto veće koncentracije etil acetata pod utjecajem mikoorganizama prisutnih na grožđu. Karbonska maceracija obično traje 10-ak dana nakon čega se grožđe preša. Slijedi nastavak alkoholne fermentacije pri temperaturi od 18-20 °C koja obično traje 2-3 dana. Tako dobivena vina spremna su odmah za tržište te nemaju veliki potencijal starenja.
4.12. MANE I BOLESTI VINA Vino je proizvod alkoholne fermentacije kojom se lako kvarljivi proizvod, mošt transformira u puno stabilniji proizvod, vino. Ipak i mošt i vino i sam proces proizvodnje mogu biti kontaminirani različitim mikroorganizmima i tvarima koje naposlijetku mogu uzrokovati kvarenje. Kvarenja mošta i vina obilježena su kemijskim promjenama i očituju se negativnim organoleptičnim promjenama. U većini slučajeva navedene promjene ne uzrokuju opasnost za zdravlje ljudi.
4.12.1. Mikroorganizmi uzročnici kvarenja 4.12.1.1. Octene bakterije Octene bakterije su prvi put bile prepoznate kao uzročnici kvarenja vina još u 19. stoljeću. U osnovi one oksidiraju šećere te etanol u octenu kiselinu. Kao što je navedeno prije ova grupa obuhvaća dva roda Gluconobacter i Acetobacter (G.oxydans, A.pasteurianus, A.aceti). Octene bakterije predstavljaju uobičajenu mikrofloru grožđa i tijekom fermentacije njihov se broj ne spušta ispod 102-103 CFU/mL. Tijekom čuvanja vina vijabilna populacija opada, ali tijekom pretoka opet raste zbog prisustva kisika. Kvarenje koje uzrokuju octene bakterije može se pojaviti u bilo kojoj fazi proizvodnje vina. Najčešće djelovanje je ipak zabilježeno na početku alkolhone fermentacije, naročito kod grožđa koje nije u najboljem zdrastvenom stanju. Rijeđa je pojava tijekom alkohole fermentacije, jer današnje vinarije podrazumijevaju uporabu sumpora i čeličnih nehrđajućih tankova s minimalnim doticajem zraka. Opet postoji mogućnost djelovanja octenih bakterija tijekom čuvanja vina u drvenom ili nekom drugom suđu u kojem postoji doticaj sa zrakom. Kvarenje octenim bakterijama se manifestira povećanim koncentracijama octene kiseline (hlapiva kiselost). Prag osjetljivosti ovog spoja je 0.7g/L. Osim octene kiseline često se pri kvarenju uzrokovanim octenim bakterijama povećava i koncnetracija acetaldehida. Osim toga sintetiziraju se i određene koncentracija dihidrokisacetona iz glicerola i sorboze iz sorbitola, acetaldehid i acetoin iz mliječne kiseline te glukonske i mono i diketoglukonske kiseline iz glukoze.
130
Kontrola rasta ove grupe mikroorganizama se danas provodi sumporenjem, nešto nižim temeperaturama fermentacije, bez prisustva kisika te niskim pH. 4.12.1.2. Mliječno kisele bakterije (MKB) Najznačajnije djelovanje MKB je malolaktična fermentacija koja je prije opisana kao vrlo pozitivan proces za određene tipove vina. Osim pozitivnog djelovanja na vino, MKB djeluju i vrlo negativno. Vina koja su podložna kvarenju su u toplijim klimama, višeg pH od 3.5 te u kojima ima malo ili ništa sumpornog dioksida. Prevrnulost (tourone) – razgradnja vinske kiseline - Glavni uzročnik navedene mane je Lactobacillus brevis. Karakterisitka ove mane je fermentacija vinske kiseline do oksalacetatne kiseline. Ovisno o soju bakterije oksalacetat je kasnije metaboliziran do mliječne, jantarne ili octene kiseline i CO2. Osim toga karakterisično je za ovu manu i povišenje pH te «prazan» okus vina. Crna vina mijenaju boju u crveno smeđu, postaju mutna i imaju viskozni talog. Gorčina vina - Glavni uzročnici su pojedini sojevi bakterija L. brevis i L .buchneri koji okisidiraju glicerol u akrolein ili reduciraju do1,3-propandiola. Akrolein ima jako gorak okus po kojem je mana i dobila ime. Djelovanjem ovih bakterija koncentracija glicerola se može smanjiti za 80-90 %, što je nepoželjno. Manitno vrenje - Neke heterofermentativne mliječno kisele bakterije metaboliziraju glicerol u manitol i octenu kiselinu, koji su nepoželjni Sluzavost - Ova je mana karakterizirana sintezom velikih koncentracija sluzavih polisaharida (-1,3glukana). Najčešći uzročnicu su O. oeni i Pediococcus spp. Vina imaju uljasti izgled i viskoznu teksturu. Miševina - Uzročnici su sojevi vrsta L. brevis, L. cellobiosis i L. hilgardii koji sintetiziraju 2 acetiltetrahidropiridin i 2 propiltetrahidropiridin iz etanola i 1-propanola. Miris po geraniju - Uzročnici su sojevi Lactobacillus spp. i O.oeni koji sorbinsku kiselinu metaboliziraju u p-sorbinski alkohol (2,4-hexadienol) koji u kiseloj sredini vina prelazi u s-sorbinski alkohol (1,3-hexandienol). Ovaj posljednji reagira s etanolom i stvara se ester 2-etoksiheksa-3,4-dien (geranuim miris) 4.12.1.3. Kvasci Kvasci su glavni nositelji alkoholne fermentacije, ali u pojedinim slučajevima mogu uzrokovati i kvarenja vina. Najznačajnije vrste kvasaca uzročnici kvarenja su: S. cerevisiae, Brettanomyces bruxellensis, Zygosaccharomyces bailii, Kloeckera apiculata i Metschnikowia pulcherrima. Ove dvije posljednje vrste sintetiziraju značajnije količine octene kiseline, etil acetata, diacetila i 2–aminoacetofenona, svih spojeva koji su djelomično odgovorni za sintezu netipčne arome starenja vina (UTA– untypical aging flavor). Z.baili stvara flokulacijske i granularne taloge i može se razvijati tijekom cjelokupne proizvodnje vina. Osim toga, sintetizira i visoke koncentracije octene kiseline i viših alkohola te može izvršiti redukciju malata te uzrokovati povišenje pH vrijednoti vina. To je vrlo rezistentna vrsta koja podonsi ekstremnmo visoke koncentracije etanola, sumpornog dioksida i šećera. Zbog karakteristične osmofilnosti, najčešći je uzročnik kvarenja slatkih vina. Iako je kvasac S.cerevisiae glavni uzročnik alkoholne fermentacije u pojedinim fazama proizvodnje može uzrokovati određena kvarenja vina. Na kraju fermentacije pojedini sojevi kvasca S. cerevisiae mogu isplivati na površinu (tzv. FLOR sojevi) i mogu stvarati film u kojem se vrši oksidacija alkohola. Navedeni je proces poželjan u proizvodnjih sherry vina, a nije poželjan u proizvodnji normalnih tipova bijelih vina. Osim toga, različiti sojevi S. cerevisiae mogu
131
uzrokovati i naknadnu fermentaciju vina s ostakom šećera u boci ili u tanku te tako stvoriti talog i visoke koncentracije CO2, što čini ta vina neužitnim za potrošača. S. cerevisiae tijekom fermentacije sintetizira i određene koncentracije viših alkohola te pojedini sojevi mogu sintetizirati visoke koncentracije koje čine vino neužitnim. Sumporni spojevi su obično u vinima negativnog karaktera, naročito H2S (miris na trula jaja). Ipak postoje sojevi S.cerevisiae koji mogu sintetizirati više koncentracije sumporovodika. U današnjem vinarstvu najznačajni uzročnik kvarenja vina je vrsta B. bruxellensis. Ekonomska šteta koju prouzrokuje navedeni rod mjeri se u milijunima američkih dolara. Brettanomyces spp. se razvija vrlo sporo i nema nikakvih vidljivih znakova da je vino inficirano. Nažalost, kada se napokon utvrdi prisustvo kvasaca u vinu, odnosno kada se osjeti miris, obično je prekasno. Brettanomyces vrste mogu sintetizirati hlapljive fenolne spojeve, uključujući i fenol siringol i nekoliko etilfenola. Navedene mirise možemo opisati kao «životinjska», «paljevina», «plastika», «konjski znoj» i sl. Brett mirisi su češći kod crnih vina čuvanih u drvenom suđu. Kada se utvrdi prisustvo tog mirisa obično je već prekasno te je najbitinije održavanje higijene podruma
4.12.2. Prisutnost teških metala Vrlo rijetka mana u današnjem vinarstvu su teški metali. Za to su odgovorni željezo, bakar i aluminij. Porijeklo ovih metala je iz vinograda, preša, posuđa (prekasno tretiranje vinograda, loši uvjeti u podrumu). Problemi s viškom teških metala te njihovo riješavanje detaljnije su opisani u poglavlju posvećenom stabilizaciji vina.
4.12.3. Negativan utjecaj čepa - “Cork taint” Pluto je kora hrasta Quercus suber, vrste hrasta koja raste u zemljama Mediteranskog bazena. Portugal je najveći svjetski proizvođač pluta. Pluto održava vino u dobroj “kondiciji” u većini slučajeva; ipak dva su njegova velika nedostatka: propustljivost (oksidacija vina) i “cork taint”. Po definiciji Land-a (1989) taint je miris ili okus koji je stran proizvodu. “Cork taint” se smatra vrlo ozbiljan nedostatak buteljiranih vina i to naročito u posljednjih 15 godina. On obuhvaća oko 0,5 do 6% ukupnih buteljiranih boca. Uloga mikroflore čepa pretpostavlja da postoje tri mehanizma pomoću kojih mikroflora sudjeluje u stvaranju “cork tainta”: a) prvi mehanizam, koji je i najviše prihvaćen odnosi se na mikrobni rast u i na čepu, pri čemu se stvaraju metaboliti koji se otpuštaju u vino djelujući negativno na njegovu kvalitetu. Ustvari, tvari s kojima se pluto čisti i ispire mikroorganizami metaboliziraju u te spojeve. Plijesni se smatraju najodgovornijim mikrobima za stvaranje takvog tipa “cork tainta” (Penicillium chrysogenum, P. glabrum, Aspergillus niger, A. oryzae, Chrysonilia sitophila, Mucor racemosus, Paecilomyces sp., Trichoderma viride). Osim toga i neki kvasci iz rodova Rhodotorula i Candida i bakterije iz roda Streptomyces imaju negativan učinak. b) Drugi mehanizam je da iz čepa ulaze živi mikroorganizmi u vino, koji se dalje razvijaju u vinu. Ovaj mehanizam je upitan jer je vrlo teško dokazati razvoj gljiva u vinu. c) Postoji mogućnost koja još nije dokazana da se mikrobnim rastom u čepu stvaraju enzimi koji u vinu mogu uzrokovati reakcije kojima se stvara “cork taint”.
132
Najznačajniji spojevi, koji su do danas izolirani i identificirani i imaju važnu ulogu u “cork taintu” su : 2,4,6-trikloroanisol, 1-okten-3-ol, 1-okten-3-on, 2-metilizoborneol, geozmin i guajakol. Vino je proizvod vrlo podložan različitim manama i bolestima, ali kao i kod ljudi uz pravilnu prevenciju koja se postiže higijenom podruma i modernim načinom tehnologije manje je vjerojatnost da će “oboliti”.
4.13. SPECIJALNA VINA Prema OIV-u specijalna se vina definiraju kao vina dobivena od svježeg grožđa, mošta ili vina koja su prošla uobičajene tehnološke procese za vrijeme ili nakon njihove proizvodnje. To su vina čija svojstva ne potječu samo od grožđa, nego i od primjenjenih tehnoloških postupaka proizvodnje. Stilovi i vrste vina ponekad odražavaju područja, klimatsko-edafske uvjete i političko-ekonomske prilike u kojima su nastali. Npr. vina s plemenitom plijesni se proizvode u krajevima gdje se ta gljiva pojavljuje, pjenušava vina su se pojavila u regiji gdje nije bilo moguće proizvoditi crvena vina vrhunske kakvoće, a porto tipovi vina nastali su kada je počela pojačana trgovina između Velike Britanije i Portugala s ciljem smanjenja ovisnost Britanaca o francuskim vinima.
4.13.1. Slatka vina Slatka vina obuhvaćaju široki spektar vina kojima je jedino zajedničko visoka količina neprovelog šećera. Najpoznatija slatka vina su ona koja se proizvode od posebnog grožda napadnutog s plemenitom plijesni (Botritis cinerea). 4.13.1.1. Vina od grožda napadnutog s plemenitom plijesni Nije poznato kada je počela proizvodnja ovakavog tipa vina, ali prvi službeni podaci potječu iz sredine 16. stoljeća iz regije Tokaj u Mađarskoj (1560). Kasnije se takva vina spominju u Njemačkoj (1750) te u Sauternu u Francuskoj (1830-1850). Danas se takav način prozivodnje vina proširio po cijelom svijetu gdje su povoljni uvjeti za razvoj plemenite plijesni. Kemijske promjene prouzrokovane s plemenitom plijesni: B. cinerea je gljiva, koja se razmnožava konidijama na površini bobice grožđa, kao ektoparazit. Gljiva crpi hranu iz mrtve bobe, što uzrokuje značajne promjene u kemijskom sastavu bobe, iako gljiva ne prodire u meso bobe. Obično se količina glukoze i fruktoze smanji do dva puta, a organske kiseline se smanje još više; 70-90 % vinska i 50-70 % jabučna, ali gubitkom vode u bobi, ti nedostaci nisu tako osjetni. Mošt proizveden iz takovog grožđa ima visoku koncentraciju šećera od oko 360g/L i relativno nisku pH vrijednost (3,5-4,09). Dokazano je da u moštu prevladavaju visoke koncentracije K+ iona. B.cinerea u konidijama i u mladom miceliju ima enzime EMP puta, heksoza monofosfatnog puta i ciklusa trikarbonskih kiselina. Međutim, gljiva ne može asimilirati glukozu u anaerobnim uvjetima, dok u atmosferi siromašnoj s kisikom dolazi do akumulacije glukuronske kiseline, pa mošt sadrži 5-7g/L glukuronske kiseline. I drugi polioli se također stvaraju tijekom razvoja plemenite plijesni na grožđu, što se naročito odnosi na manitol, eritol i mezo inozitol. Alkoholna fermentacija mošta od grožđa napadnutog sa plemenitom plijesni: Alkoholna fermentacija takvog mošta obično se vrši u drvenim bačvama i temperatura
133
mošta može doseći i do 28 oC. Zbog visoke koncentracije šećera u moštu fermentacija je vrlo polagana, pogotovo na početku procesa. Osim alkohola tijekom fermentacije stvaraju se i veće količine glicerola i octene kiseline. Primjena visoko tolerantnih sojeva kvasca S. cerevisae i dodatak dušičnih spojeva lagano pospješuju brzinu alkoholne fermentacije. Otežavajuće okolnosti za fermentaciju takvog grožđa vjerojatno su spojevi s inhibicijskim djelovanjem (tzv. botryticidi). To je grupa heteropolisaharida bogatih ramnozom i manozom koje otpušta plemenita plijesan u mošt. Ti heteropolisahridi igraju dvostruku ulogu: 1) na početku fermentacije uzrokuju stvaranje octene kiseline, glicerola i stimuliraju glicerol-piruvatni put u kvascima; 2) tijekom faze izumiranja i pred kraj fermentacije uzrokuju jače izlučivanje acetata od glicerola, što utječe na kvalitetu vina. Najpoznatiji tipovi vina proizvedenog od grožđa napadnutog s plemenitom plijesni su: Tokaj Aszu te njemački i francuski tipovi. Tokaj Aszu: Proizvodi se od kultivara Furmint. Većina Tokaj vina se proizvodi tako da se mošt gust poput meda i s više od 60 % šećera (aszu) dodaje osnovnom vinu. Različite katogorije vina se proizvode ovisno o količini slatkog mošta koji se dodaje (26 puttony; 1 puttony je 28-30 L). Miješanje se odvija u otvorenim bačvama i traje 24 – 36 sati, a nakon toga fermentira u specijalnim drvenim bačvama od 136 L (Gonci). Bačve se ostavljaju djelomično prazne (1/3), a čep otvoren 1-3 mjeseca, čime se omogučuje oksidacija ovog tipa vina. Glavni nosioci alkoholne fermentacije su kvasci S. bayanus, Candida stellata i C. zemplinina. Najkvalitetnija vrsta Tokaja je Azsu Eszencia koja se dobiva spontanim cjeđenjem bobica s visokim postotkom botiritisa (aszu grožđe). Obično se iz 30 L grožđa dobije oko 1-1,5 L esenzia-e. Nakon što se skupi, sok se stavlja na fermentaciju u drveno posuđe. Zbog vrlo visokih početnih koncentracija šećera (oko 50%) fermentacija se odvija vrlo sporo i završava pri 5-7 % etanola. Nakon toga vino sazrijeva, što može trajati i preko 20 godina. Njemački tip vina napadnutnih s plemenitom plijesni: Postoje različite kategorije ovog tipa vina u Njemačkoj: auslessen (kasna berba), što su vina koja se proizvode od sepcijalno izdvojenog i posebno odabranog grožđa; beerenauslessen (izborna berba bobica) i trockenbeerenauslessen (izborna berba prosušenih bobica) proizvode se ili od odabranih ili prosušenih bobica grožda koje može, ali i ne mora biti napadnuto s plemenitom plijesni. Vina koja nastaju iz takva mošta sadrže obično od 6 -8 % alkohola i dosta zaostalog šećera. Koriste se slijedeće sorte: Traminac, Rizling rajnski, Pinot bijeli. Francuski tip vina napadnutnih s plemenitom plijesni: Najpoznatija vina od grožđa napadnutnog s plemnitom plijesni prozivode se u Francuskoj pokrajni Sauternes. Proizvodnja je slična kao i u Njemačkoj, jedino u ovom kraju vina imaju više alkohola po završetku fermentacije (11-13 %). Koriste se sorte grožda (Sauvignon blanc i Semillon) koje vinu daju »tiolne« arome. 4.13.1.2. Slatka vina od grožda koje nije napadnuto s plemenitom plijesni Ovakav tip vina se proizvodi gotovo u svim vinorodnim regijama svijeta. U osnovi postoje dva podtipa, a to su vina koja nastaju prosušivanjem grožda te ledeno vino. Vina iz prosušenog grožđa: Sušenje je najstarija metoda proizvodnje slatkih vina. Nakon što se grozdovi osuše i proizvede mošt, koncentrirani mošt se stavlja na fermentaciju. Postoje različiti načini sušenja grožda. Napoznatiji tipovi ovakvog vina su »Moscato« vina sa Sicilije (grožđe se u jednom trenutku čuva u slanoj vodi s vulkanskim pepelom); vin santo (fermentacija se odvija u malim drvenim bačvama te se nakon fermentacije čuva 2-6 godina u vrlo varijabilnim temepraturnim uvjetima); na otoku Malagi se radi vino od sorte Pedro Ximenez. U ovu kategoriju vina spada i prošek.
134
Prošek je desertno kvalitetno ili desertno vrhunsko vino s kontroliranim zemljopisnim podrijetlom iz regije »Primorska Hrvatska«. Prošek se proizvodi od prezrelog ili prosušenog bijelog ili crvenog grožđa bez ikakvih dodataka, najčešće s ostatkom šećera. Boja može varirati od jantarnožute do tamnocrvene boje. Prošek se proizvodi od slijedećih autohtonih sorti vinove loze: plavac mali, okatac crni, muškat ruža crni, crljenak, vugava, pošip bijeli, grk, maraština, babić, plavina, lasina, malvazija, žlahtina, malvasia dubrovačka bijela. Karakteristika navedenih sorti je visoka kvaliteta, a šećer u grožđu prije prosušivanja mora biti najmanje 100° Oe. Tehnologija proizvodnje Prošeka: Bere se grožđe zdravih grozdova, po mogućnosti već lagano prosušenih na trsu, te se dalje suši na suncu ili u hladovini na tavanima i sušarama dok se ne postigne šećer od 120°Oe (24 % šećera). Prerada započinje gnječenjem osušenog grožđa i maceracijom koja traje 2 – 5 dana. Nakon maceracije masulj se cijedi i preša. Alkoholna fermentacija traje do godinu dana. Dozrijevanje i njega Prošeka traje najmanje godinu dana u drvenim bačvama. Iskorištenje u proizvodnji Prošeka je 10 – 30 %. Ledeno vino: Koncentriranje mošta se u ovom tipu proizvodnje vina postiže smrzavanjem grožđa. Prvi podaci o ovakom tipu vina potječu iz Njemačke iz 18 stoljeća. Za proizvodnju ovakvog tipa vina, grožđe se ostavlja do zime na trsu dok se temepratura ne spusti na -7 oC. U ovakim uvjetim voda u bobicama se smrzne, a ostatak se koncentrira. Berba i prešanje se obavljaju dok je grožđe još smrznuto. Tijekom prešanja led zaostaje zajedno s košticama i kožicom. Zbog vrlo visoke koncentracije šećera (više od 250 g/L) fermentacija se odvija vrlo polagano i kvasci nikad ne iskoriste sav šećer. Naravno, fermentaciju koncentriranog mošta provode osmotolerantni kvasci. Dakle, gusti, aromatični i slatki grožđani sok, koji sadrži visok udio šećera, voćnih kiselina te različitih voćnih aroma, fermentira polagano na prirodan način, pa nastaje iznimno aromatično ledeno vino. Nakon fermentacije i dorade, ledeno vino potom sazrijeva u bocama u kojima svoju optimalnu zrelost postiže tek nakon tri do pet godina.
4.13.2. Likerska vina Zajednička karakteristika likerskih vina je visoka koncentracija alkohola. Ovaj se tip vina pojavio u posljednih 300 godina na Sredozemlju (Malaga, Španjolska), Marsala (Sicilija), Samos (Grčka), Madeira (Portugal). Madeira vina: Navedeni tip vina nastao je na portugalskom otoku Madeira. Ovo vino je karatkerizirano aromama nastalim tijekom procesa grijanja (estufagem proces). Madeira vina se proizvode u vrlo različitim varijantama: od vrlo slatkih do suhih, te od jedne sorte grožđa do mješavine sorti. Iako postoje tako velike varijacije unutar same proizvodnje, grijanje (estufagem) čini ova vina posebnim. Madeira vina se proizvode isključivo od bijelih sorti grožđa (Malvasia, Secial, Verdelho, Bual de Madeira). Listao i crne sorte (Tinta Negra Mole i Negra) se dodaju samo za jeftinija madeira vina. Fermetacija se obično odvija u velikim betonskim fermentorima od 200-300 hl. Duljina fermentacije ovisi o tipu vina koji se želi dobiti. Vrlo slatkim madeirama (malmsey) se alkohol dodaje ranije da bi se održala visoka koncentracija šećera. Buals-u (bols) se dodaje alkohol oko polovice fermentacije, a kod verdelho vina se dodaje na kraju fermentacije. Alkohol koji se dodaje sastoji se od vinskog destilata (95 %) s ciljem spuštanja koncentracije alkohola na 14-18 %. Nakon bistrenja vino (vinho claro) je spremno za grijanje. Grijanje se odvija u prostoriji gdje se temperatura kroz 2 tjedna podiže do 45-50 oC (oko 5oC po danu) i vino se tada čuva na toj temperaturi 3 mjeseca. Naime, vino se grije na nekoliko načina. Najpoznatija su tri načina grijanja, ovisno o kvaliteti i cijeni konačnog proizvoda. Najobičniji način je grijanje vina u čeličnim posudama s vrućim ugljenom ili grijanje s
135
vrućom vodom koja cirkulira kroz cijevi oko posude s vinom. U tom procesu se vino zagrijava na 55oC i drži na toj temperaturi 90 dana. Drugi način grijanja je odležavanje drvenih bačvi u prostorijama koje se griju vodenom parom, kao u sauni. Ovim procesom se vino grije mnogo blaže (nježnije) i ostaje u tom prostoru šest mjeseci do godinu dana. Za najkvalitetnije Madeira vina ne koristi se umjetno grijanje, već se bačve spreme u prostoriju, gdje se vino zagrijava sunčanom toplinom. Taj proces može potrajati do 20 godina. Nakon »pečenja« vino se sporo hladi na temepraturu okoline. Taloženjem se eliminira veći dio teškog smeđeg sedimenta koji nastaje tijekom grijanja. Nakon toga vino dozrijeva u drvenom suđu te se ponovno dodaje alkohol da bi se nadoknadila količina koja je isparila tijekom grijanja. Sazrijevanje može trajati od 13 mjeseci do 20 godina (garrafeira). Tijekom grijanja odvijaju se različite reakcije oksidacije u kojima nastaju aldehidi, koji vinima daju poseban okus i miris, te stabilnost. Porto (oporto, vinho do Porto): Počeci proizvodnje porta nisu poznati, ali standardizacija proizvodnje je započela negdje polovicom osamnaestog stoljeća. Porto se primarno proizvodi od crvenih (Touriga Nacional, Mourisco, Mourisco de Semente, Tinta Roiza, Tinta Cao, Tinta Francisco) i bijelih (Sodega, Malvasia, Rabigato) lokalnih sorata grožđa iz gornjeg dijela doline rijeke Duero u sjevenom Portugalu. Iako se grožđe uzgaja u sjevernom dijelu porto vino se transportira rijekom do grada Porta na sazrijevanje. Proizvodnja baznog vina se provodi kao i svaka vinifikacija. Jedino pri proizvodnji porta treba paziti na ekstrakciju antocijana. Međutim, u proizvodnji Porto vina fermentacija se zaustavlja nakon 36-48h dodatkom destilata (77 %) koji se specijalno priprema za te namjene. U ovoj fazi je nešto veća koncentracija acetaldehida, što je pozitivna karakteristika u prozivodnji porta. Mlado vino sadrži oko 19 % alkohola i 9-10 % šećera. Nakon toga vino ide na odležavanje. Ono odležava u drvenim bačvama od 525 L (pipes) za visokokvalitetna vina ili u drvenom posuđu sve do 100 m3 i više. Odležavanje se vrši obično u podrumima pri nižim temperaturama, a traje nekoliko godina. Sherry, jerez, xeres: Sherry je zaštićeno ime vina koji se proizovdi u gradu Xerez de la Frontera, u Andaluziji u Španjolskoj. Proizvodi se od lokalnih neutralnih bijelih sorata Palomino i Pedro Ximenez. Postoje tri tipa sherry vina: fino (najkvalitetniji), amontillado i oloroso. Fermentacija baznog vina se provodi na nešto višim temepraturama nego što je obično za bijela vina (20-27 oC) te uz minimalnu ekstrakciju tanina, jer oni negativno utječu na aromu sherry vina. Inokulacija kvascima je vrlo rijetka te se fermentacija provodi spontanom mikroflorom. Vino se prebacuje u drvene bačve (oko 490 L), ali se uvijek 1/3 bačve ostavi praznom (solera sustav). Nakon prvog pretoka vino se pojačava da dosegne vrijednosti do 15 % alkohola. Pojačavanje se vrši s mješavinom (50:50) vinskog destilata i starog sherrya (miteado). Cherry vina se mogu pojačati do 18 % alkohola (aloroso). Nakon toga počinje se razvijati velum (s flor kvascima na površini vina). Bačve se drže u obliku piramide gdje su na vrhu najmlađa vina, a dolje starija. Vino se svakih nekoliko mjeseci prebacuje iz gornjih bačava u doljnje. Specifične arome ovom tipu vina daju «sherry» kvasci koji u oksidativnim uvjetima iz etanola stvaraju aldehide.
4.13.3. Aromatizirana vina Aromatizirana vina su specijalna vina dobivena iz vina posebnim postupkom uz dodatak alkohola, sladora, kiselina i/ili ekstrakta dobivenog maceracijom aromatičnih biljaka. Sadrže najmanje 8 %vol fermentiranog alkohola iz grožđa, a najviše 25 %vol ukupnog alkohola. Aromatiziranje vina obavlja se dodavanjem prirodnih aroma, prirodnih aromatskih pripravaka, te aromatičnih biljaka i njihovih plodova. U aromatiziranom vinu 136
odnos osnovnog vina i dodataka (aromatskih pripravaka) treba biti najmanje 75 % : 25 % u korist osnovnog vina. Proizvodi dopušteni u proizvodnji aromatiziranih vina su: a) za doslađivanje – dodatak jednog ili više zaslađivača (saharoza, šećerni sirup, fruktoza, glukozni sirup, dekstroza, invertni šećer, karamelizirani šećer, koncentirani mošt, rektificirani koncentrirani mošt, med i drugi prirodni ugljikohidrati); b) za aromatiziranje – dodatak jednog ili više aromatičnih ili biljnih, voćnih, začinskih pripravaka koji će dati svojstvenu aromu i okus aromatiziranom vinu; c) za obojenje – dodatak jednog ili više bojila: karamel, prirodne i prirodno identične boje; d) dodatak alkohola – dodatak jednog ili više proizvoda: etilni alkohol vinskog podrijetla, vinski alkohol ili alkohol od prosušenog grožđa, etilni alkohol poljoprivrednog podrijetla, vinski destilat ili destilat od prosušenog grožđa, vinjak. Obzirom na sadržaj šećera aromatizirana vina mogu biti: – suha: ako sadrže manje od 50 g/L invertnog šećera – polusuha: sadrže od 50–90 g/L invertnog šećera – poluslatka: sadrže od 90–130 g/L invertnog šećera; – slatka: ako sadrže više od 130 g/L invertnog šećera. Najčešći tipovi aromatiziranih vina su: Vermouth (vermut) je aromatizirano vino čiji karakterističan okus potječe od biljke Artemisia sp., i može se dosladiti šećerom, moštom, koncentriranim moštom ili rektificiranim koncentriranim moštom. Gorko vino (bitter) je aromatizirano vino s karakterističnim gorkim okusom. Bermet je aromatizirano crno vino koje se proizvodi dodatkom aromatičnih biljaka i plodova voća (pelin, gorušica, korijandor, klinčić, muškatni oraščić, naranče, limun, rogač, smokva i dr.).
4.13.4. Pjenušava vina Pjenušava vina spadaju u posebnu vrstu (grupu) specijalnih vina s određenom količinom ugljičnog-dioksida, koji pri otvaranju boce stvara pjenu. Dakle, vino se u zatvorenoj boci nalazi pod pritiskom, a jačina tog pritiska zavisi od količine ugljičnog dioksida i može dostići vrijednost do 5 bara. Zbog prisustva ugljičnog dioksida pjenušava vina imaju rezak i osvježavajući okus, što je i njihova osnovna karakteristika. Proizvode se uglavnom od kvalitetnih i visokokvalitetnih sorti grožđa, te pored ugljičnog dioksida na njihovu kvalitetu utječu i ostali sastojci baznog vina. Povijest proizvodnje pjenušavih vina je povezna s tehnološkim unapređenjima, koja su omogućila proizvodnju ovako specifičnog tipa vina (proizvodnja otpornog stakla te plutenih čepova u 16 stoljeću) te izuzetno hladne zime u Europi u 16. i 17. stoljeću. Kada su mirna vina iz pokrajine Champagna bila dostavljena u Englesku u bačvama, profermentirala su tek na proljeće te su čak u Engleskoj dodavali šećer da bi prouzrokovali sekundarnu fermentaciju. Trebalo je gotovo jedno stoljeće da se odredi potrebna količina šećera za dodatno (naknadno) vrenje kako ne bi došlo do visokog tlaka, odnosno puknuća boce. Rezultat ovog procesa bila je transformacija lošeg crvenog vina u pjenušavo vino koje je bilo vrlo popularno. Zasluga Don Perignona bila je u mješavini baznih vina za proizvodnju vrhunskih pjenušaca. Za proizvodnju pjenušavog vina najčešće se upotrebljavaju bijele (Chardonnay, Parellada, Viura, Xare-lo, Macabeo), ali i crvene sorte vina (Pinot noir i Meunier). Najpoznatija pjenušava vina se proizvode u regiji Champagn u Francuskoj koja je i zaštitila ime šampanjac te se pjenušava vina iz te 137
regije jedino mogu zvati šampanj. U drugim zemljama se zovu pjenušava vina, cava (Španjolska), spumante (Italija). Berba grožđa za proizvodnju pjenušavih vina se obično odvija ranije nego za obična vina, jer je potrebno zadržati visoki sadržaj kiselina koja daju svježinu pjenušavim vinima. Alkoholna fermentacija baznog vina se odvija na 15-18 oC te se u većini slučajeva dodaju selekcionirani kvasci. U baznim vinima pri završetku vrenja koncentracija alkohola je oko 9-10,5 %. Nakon završetka alkoholne fermentacije slijede standardni postupci za proizvodnju bijelih vina. Potom bazna vina odleže određeni period (ovisan o proizvođaču i tipu vina) te se miješaju. Nakon toga slijedi dodavanje šećera i kvasca (tirage) te sekundarna fermentacija vina, koja obično traje oko 2 mjeseca i odvija se na temperaturama ispod 15 oC, a potom slijedi sazrijevanje vina u bocama te odvajanje taloga kvasca nakon toga. Osim ove klasične metode proizvodnje pjenušavog vina u boci, postoji i proizvodnja pjenušavog vina u tankovima tzv. Charmat metoda. Ova metoda je izuzetno pogodna za proizvodnju pjenušavih vina s ostatkom neprevrelog šećera. Najpoznatiji tipovi ovog vina su ona koja se proizvode od muškatnih sorti, kao npr. Asti (Italija). Fermentacija baznog vina se zaustavlja na oko 6 % alkohola. Zaustavljanje se vrši ili centrifugiranjem ili filtracijom. Kad se odstrani ostatak taloga od kvasca, vino odležava određeni period te se prebacuje u velike inox tankove gdje se vrši sekundarna fermentacija, uz dodatak šećera (ako je potrebno), kvasaca te dodataka za rast kvasaca. Ovaj način prozivodnje vina je značajno jeftiniji od postupka fermentacije u bocama. 4.13.4.1. Autoliza kvasaca Tijekom sazrijevanja pjenušavih vina odvija se proces autolize u kojem kvasci otpuštaju unutarstanicne tvari u vino, koje mogu znacajno promjeniti krajnju aroma proizovda. Autolizu kvasca može se definirati kao hidrolizu polimera pod utjecajem hidrolitickih enzima koji oslobadaju tvari iz citoplazme (petide, aminokiseline, masne kiseline i nukleotide) i iz stanicne stijenke (glukane i manane). Obicno se autoliza odvija na kraju stacionarne faze rasta i povezana je sa smrcu stanice. Autoliza u industrijskim procesima se moze inducirati s povišenom temepraturom, tlakom, detergentima, pH i sl. Tada se proces odvija vrlo brzo u prosjeku 48-72h. Tijekom tradicionalong sazrijevanja pjenusavih vina autoliza se odvija u vrlo specificinm uvijetima: prt pH 3 do 3.5, niskoj temepraturi (10-15 C), koncnetraciji etanola oko 10 % vol, dok je pritisak CO2 visok pa je trajanje autolize puno duže (oko godinu dana). Tijekom autolize najvise se oslobadjaju dušični spojevi.
LITERATURA Berry,D.R. (1995). Alcoholic beverage fermentations, Fermented beverage production, Blackie Academic & professional, Glasgow, 32-44. Borneman, A.R., Chambers,P.J., Pretorius,I.S.(2007). Yeast systems biology: modelling the winemaker's art. Trends Biotechnol. 25(8),349-55. Boulton, R.B., Singleton,L.V., Bisson,F.L., Kunkee,E.R. (1995). Principles and practices of winemaking, Chapman & Hall. Fleet, G.H. (2003). Yeast interactions and wine flavour. Int. J. Food Microbiol. 86(1-2),11-22. Fleet, G.H.(2007). Yeasts in foods and beverages: impact on product quality and safety. Curr Opin Biotechnol. 18(2),170-5. Jackson, R.S. (1994). Wine science: Principles and Applications, Accademic press, Taylor, S.L.,University of Nebraska. Loureiro, V, Malfeito-Ferreira,M. (2003). Spoilage yeasts in the wine industry. Int. J. Food Microbiol.
138
86(1-2), 23-50. Martini, A. (2003). Biotechnology of natural and winery-associated strains of Saccharomyces cerevisiae. Int. Microbiol. 6(3), 207-9. Mattick, R.L., Plane,R.A., Weirs,I.V.D. (1980). Lowering wine acidity with carbonates, Am. J. Enol. Vitic. 31, 350-355 Mazza, G., Fukumoto,L., Delaquis,P., Girard,B. and Ewert,B. (1999), Anthocyaninphenolics, and colour of Cabernet Franc, Merlot and Pinot Noir wines from British Columbia. Journal of Agricultural and Food Chemistry 47, 4009-4017. Moreno-Arribas,M.V.and Polo,MC. (2005). Winemaking biochemistry and microbiology: current knowledge and future trends. Crit. Rev. Food. Sci. Nutr. 45(4), 265-86. O.I.V. „International Code of Oenological Practices“, edition 2001, Paris Pretorius,I.S. (2000). Tailoring wine yeast for new millennium: novel approaches to the ancient art of winemaking, Yeast 16, 675-729 Ribéreau-Gayon,P., Dubordièu,D., Donèche,B., Lonvaud,A. (1998). Handbook of enology, The microbiology of wine and vinification ,Volume I, J. Wiley & Sons ltd. Ribéreau-Gayon,P., Glories,Y., Maujean,A.and Dubordieu,D. (1999). Handbook of enology, The chemistry of wine, stabilization and treatments, Volume II, J. Wiley & Sons ltd. Ruffner, H.P. (1982). Metabolism of tartaric and malic acids , Vitis 21, 247-259 Snowdon, E.M., Bowyer,M.C., Grbin,P.R. and Bowyer PK. (2006). Mousy off-flavor: a Review. J. Agric. Food Chem. 54(18), 6465-74. Troost,G. (1980). Technologie des Weines, Verlag Eugen Ulmer, Stuttgart, 338. Usseglio-Tomasset,L. (1995). Chimica enologica, Edizione Aeb Brescia Trost, G. (1972). Technologie des Weines, Verlag Eugen Ulmer Stuttgart, 158-175. Wilson,B., Strauss C.R. and Williams,P.J. (1986). The distribution of free and glycosidically-bound monoterpens among skin, juice and pulp fraction of some white grape varieties, Am. J. Enol. Vitic. 37, 107-111 Würdig, G., Woller,R. (1989). Chemie des Weines, Ulmer GmbH&Co., Stuttgart Zambonelli, C. (1998). Microbiologia e biotecnologia dei vini, Edagricole, Bologna
139
Poglavlje 5: PROIZVODNJA ETILNOG ALKOHOLA Slobodan Grba
5.1. UVOD Alkoholna fermentacija je značajan biotehnološki proces koji se vrlo često koristi u industriji. Osim u proizvodnji vina, piva i drugih alkoholnih pića, primjenjuje se u proizvodinji čistog alkohola, koji se koristi u proizvodnji žestokih alkoholnih pića, kemijskoj i farmaceutskoj industriji, te kao gorivo. Danas se naravno zna, da alkoholnu fermentaciju provode uglavnom kvasci iz fermentabilnih šećera. Također se zna i biokemijski put razgradnje šećera do etanola. Kako pri razgradnji šećera uz etanol nastaje i plin CO2, koji pri izlasku iz komine izaziva njeno pjenjenje što podsjeća na vrenje, ovaj proces je nazvan alkoholna fermentacija ili vrenje. Nakon fermentacije, alkohol se izdvaja iz prevrele komine destilacijom i rektifikacijom. Tako proizvedeni rafinirani alkohol sadrži oko 96 % etanola, koji se koristi za proizvodnju žestokih pića. Upotreba alkohola u proizvodnji pića dobro je poznata, o čemu će biti više govora u poglavlju o njihovoj proizvodnji. Također se proizvodi i bezvodni alkohol, pod nazivom dehidrat, koji se pretežno koristi u kemijskoj industriji ili kao gorivo, najčešće u smjesi s benzinom za pogon automobila. Manje količine vrlo čistog alkohola koriste se i u kozmetici. Povijest proizvodnje alkohola za gorivo počinje početkom 20. stoljeća kada je Henry Ford (1908) dizajnirao automobil s pogonom na etanol. Ovo rješenje nije našlo veliku primjenu u praksi, jer se pojavio jeftini benzin (nafta), pa se ta praksa zadržala sve do danas. U kriznim godinama prošlog stoljeća (oko1970.godine) uveden je u Brazilu Gasohol, koji sadrži 22 - 24 % vol bezvodnog etanola u benzinu (Pereira i sur., 2004). Međutim u SAD-u i drugim razvijenim zemljama koristi se najčešće E-85, što je smjesa od 85 % bezvodnog etanola i 15 % benzina. Svjetska proizvodnja alkohola prikazana je u tablici 5.1. Od toga iznosa 80-85 % se potroši za gorivo.
Tablica 5.1. Fermentativna proizvodnja alkohola u svijetu (Licht, 2008) Zemlja Proizvodnja (mil. litara) Sirovina Sjeverna Amerika 27.399 kukuruz, melasa, šećerna repa Južna Amerika 21.399 šećerna trska, melasa Europa 5.112 žitarice, šećerna repa, melasa Azija 7.225 šećerna trska i repa, žitarice Afrika 695 šećerna trska, melasa Oceanija 202 šećerna trska, žitarice Ukupno 62.031 U industrijskoj proizvodnji alkohola zastupljeni su šaržni, semikontinuirani i kontinuirani procesi, pa je alkoholno vrenje sa stanovišta biokemijskog inženjerstva jedan od najbolje istraženih tradicionalnih mikrobnih procesa.
140
5.2. ALKOHOLNA FERMENTACIJA Lavoisier je još u 18. stoljeću počeo proučavati kemizam alkoholne fermentacije, a Guy Lusac je prvi postavio kemijsku jednadžbu alkoholne fermentacije. Danas se zna točan biokemijski put razgradnje šećera do etanola, a to je glikoliza do piruvata, zatim dekarboksilacija nastalog piruvata u acetaldehid i njegova redukcija u etanol. Takav način razgradnje šećera je svojstven kvascima i nekim bakterijama što je prikazano relacijom. Glukoza = 2 Piruvata = 2 Etanola + 2CO2 + energija (cca. 200 kJ) Prema tome, nastajanje etanola iz heksoza može se prikazati brutto-jednadžbom: C6H12O6 (180)
→
2 C2H5OH + (2 x 46 = 92)
2 CO2 (2 x 44 = 88)
+ E
Međutim, za nastajanje etanola iz diheksoza (saharoza, maltoza) vrijedi brutto-jednadžba: C12H22O11 (342)
→
4 C2H5OH + (4 x 46 = 184)
4 CO2 (4 x 44 = 176)
+ E
Analogno tome, nastajanje etanola iz heksoznih polisaharida (škrob, inulin, celuloza) može se prikazati jednadžbom: (C6H10O5)n (162n)
→
2n C2H5OH + (2n x 46 = 92n)
2n CO2 (2n x 44 = 88n)
+ E
Iz ovih jednadžbi proizlazi da su teoretska iskorištenja alkohola iz navedenih supstrata različita, pa slijedi: a) monoheksoze
I = 92/180 x 100 =
51,0 %
b) diheksoze
I = 184/342 x 100
c) poliheksoze
I = 92/162 x 100 =
=
53,8 % 56,8 %
Međutim, primjenom kvasaca u proizvodnji alkohola, praktična iskorištenja sirovina na šećernim supstratima iznose 90 – 95 % od teoretskih, jer uz etanol nastaju i mnogi nusproizvodi alkoholne fermentacije, kao što su glicerol, acetaldehid, esteri, viši alkoholi, octena kiselina itd. Isto tako, dio šećera se troši na prirast kvašćeve biomase koja vrši vrenje. Razgradnja šećera (ugljikohidrata) pomoću kvasaca prikazana je na slici 5.1. Osim kvasaca i neki drugi mikroorganizmi izlučuju etanol tijekom rasta na ugljikohidratima, ali u malim količinama, pa je iskorištenje sirovine vrlo nisko. Primjenom kvasaca praktična iskorištenja sirovina su zadovoljavajuća, a mogu se postići prinosi s visokom koncentracijom etanola u komini (čak do 18 % vol.).
141
Slika 5.1. Razgradnja šećera u kvaščevim stanicama (Pretorius, 2000) Važno je napomenuti da je alkoholna fermentacija prirodno zaštićeni proces, jer alkohol koji nastaje djeluje kao inhibitor za većinu bakterijskih vrsta, pa one postepeno nestaju kako napreduje alkoholno vrenje. Postepeno se uspostavljaju i anaerobni uvjeti, jer se na površini komine nakuplja plin CO2, pa se konačno prestaju razmnožavati i oni mikroorganizmi koji su obligatni aerobi (plijesni i aerobne bakterije). Tako na kraju vrenja zaostanu samo kvasci. Zato su ugljikohidratne sirovine prirodna staništa kvasaca. Međutim, za postizanje visokog prinosa u alkoholnom vrenju, komina se ne može pustiti spontanom vrenju, jer se ipak dio šećera utroši na rast različitih mikroorganizama (na početku procesa) umjesto za nastajanje alkohola. Zato se podloge za proizvodnju alkohola steriliziraju ili dezinficiraju. Uvjete okoline za alkoholno vrenje treba podesiti tako da najviše odgovaraju kvascima: temperatura se treba održavati između 25-35 °C, a pH vrijednost od 4-5. Koncentracija šećera u podlogama može biti od 15-20 %, ali je poželjna nešto niža koncentracija od oko 5 % zbog moguće inhibicije sa supstratom (vidi objašnjenje u idućim poglavljima). U takvim uvjetima dolazi do burnog alkoholnog vrenja pri čemu se oslobađaju velike količine CO2 plina i topline, pa je neophodno hlađenje. Vrijeme trajanja alkoholnog vrenja i iskorištenje supstrata ovise o mnogim čimbenicima, a to su: vrsta i količina kvasca, njegov aktivitet te koncentracija šećera i sastav podloge. Zbog toga je potrebno dobro poznavati tijek i uvjete alkoholnog vrenja te svojstva kvasca koji se koristi. Izlučivanje etanola traje sve dok ima šećera u komini. Kada se potroši sav šećer kvasci u anaerobnim uvjetima ne traše nastali alcohol. Međutim, u aerobnim i poluaerobnim uvjetima kvasci za svoj rast troše nakupljeni etanol. Iapk, sve dok u komini ima šećera, kvasci ne troše etanol, bez obzira na prisustvo kisika.
5.2.1. Kvasci u proizvodnji etanola Kao što je već djelomično opisano u poglavlju 1, kvasci pogodni za alkoholno vrenje su fermentativni, askosporogeni i svrstani su uglavnom u red Endomycetales, koji ima četiri (4) porodice. Najbrojnija porodica je Saccharomycetaceae i sadrži 4 podporodice, od
142
kojih je najbrojnija Saccharomycoidae, koja obuhvaća 13 rodova. Kvasci iz rodova Saccharomyces, Hansenula, Pichia i Debaromyces su veoma rašireni u prirodi. Najbolje proučeni rod askosporogenih kvasaca je Saccharomyces, jer se u njemu nalazi oko 30 vrsta koje su od velikog industrijskog, odnosno ekonomskog značaja. Najpoznatija vrsta iz ovoga roda je svakako Saccharomyces cesevisiae, od prije poznat kao kvasac gornjeg vrenja piva. Ovaj kvasac se također upotrebljava u proizvodnji vina, piva, voćnih rakija i pekarskog kvasca. Ekonomska važnost kvasca S. cerevisiae i podvrsta (sojeva, izolata) posljedica je svojstava ovog mikroorganizma da vrlo brzo fermentira šećere do etanola i CO2, te da ima visoku toleranciju na alkohol kao proizvod. Svi sojevi kvasca S.cerevisiae fermentiraju monosaharide i disaharide veoma brzo, dok trisaharid maltotriozu previru sporije, a samo djelomično rafinozu. Ne previre pentoze i disaharid laktozu. S druge strane, neki sojevi kvasca S. cerevisiae imaju visoku toleranciju na visoke koncentracije šećera u kominama i alkohola kao produkta. Obzirom da kvasac S . cerevisiae ne fermentira laktozu, u tu svrhu se najčešće koristi kvasac Kluyveromyces marxianus. U slučaju da se za proizvodnju alkohola koriste pentoze iz hemiceluloze lignoceluloznih materijala (LCM), tada se mogu primijeniti kvasci iz roda Candida (C. shehate), te kvasci Pichia stipitis i Pachysolen tannophilus (Limtong i sur., 2000).
5.2.2. Sirovine u proizvodnji etanola Sirovine iz kojih se alkoholnom fermentacijom može dobiti etanol su različite. Kao što je već navedeno, iz davnina je poznato alkoholno vrenje mošta u proizvodnji vina i drugih voćnih sirovina u proizvodnji voćnih rakija, što se u prirodi zbivaju kao spontane fermentacije. Međutim, osnovne sirovine u industrijskoj proizvodnji alkohola su uglavnom šećerne i polisaharidne sirovine te u novije doba lignocelulozni marterijali. Od šećernih sirovina se najćešće koriste melase šećerne repe i šećerne trske, sokovi šećerne repe i trske, sirutka, sulfitna lužina i hidrol, a veoma rijetko voćne sirovine. S druge strane, od polisaharidnih sirovina najčešće se koriste žitarice (kukuruz, pšenica, raž i slatki sirak) i gomoljike kao što su krumpir, kasava i jeruzalemska artičoka (Marić,200; Berg, 2004; Grba i sur, 2007). U najnovije vrijeme se primjenjuju fermentativni procesi proizvodnje alkohola na otpadnim lignoceluloznim materijalima kao što su slama, kukuruzovina, bagasa, drvni otpaci i drugo (Zaldivar i sur., 2001; Demirbas, 2005 i 2007). Za razliku od šećernih sirovina, škrobne i druge polisaharidne sirovine, koje se primijenjuju u proizvodnji alkohola, moraju se prethodno hidrolizirati specifičnim tehnološkim procesima do fermentabilnih šećera (mono- i disaharida).
5.2.3. Proračun alkoholne fermentacije Za razumijevanje procesa alkoholne fermentacije potrebno je poznavati nekoliko osnovnih zakonitosti. Ako se tijekom bioprocesa uspostave optimalni uvjeti (koncentracija šećera u komini, temperatura i pH), brzina alkoholne fermentacije ovisi o masi kvasca i aktivnosti kvaščevih stanica, što se može prikazati jednadžbom: dS/dt = X x A gdje je: S – količina supstrata (g) t – vrijeme (sati) X – prosječna masa kvasca (g) A – specifična brzina potrošnje supstrata (g supstrata/ g kvasca x sat)= aktivnost kvasca Dinamika procesa alkoholne fermentacije u šaržnom procesu prikazana je na slici 5.2. 143
Slika 5.2 Dinamika alkoholne fermentacije u šaržnom procesu Iz slike 5.2. se vidi da se tijekom alkoholne fermentacije kvasac razmnožava, pa je prosječna masa kvasca u komini: X = Xo + ΔX/2 gdje je: Xo – početna masa kvasca (g) ΔX – prirast kvasca tijekom fermentacije Prirast kvasca (ΔX) u anaerobnom vrenju u korelaciji je s količinom šećera, pa se može pisati da je: ΔX = ΔX' x S gdje je ΔX' specifični prirast kvasca i iznosi oko 0,03-0,04 g kvasca, s.tv./g šećera Kada se to sve uvrsti u gornju osnovnu jednadžbu, dobije se da je: S/t = Xo + (S x ΔX'/2) x A ili Xo = (2S – ΔX' x S x A x t) / (2 x A x t) Drugim riječima, unosom proračunate količine kvasca na početku procesa može se odrediti vrijeme trajanja procesa, odnosno ako se definira vrijeme procesa onda se mora unijeti proračunata masa kvasca (Xo) da fermentacija završi u zadano vrijeme. Potrebno je naglasiti da je aktivnost kvasca promijenjiva tijekom alkoholne fermentacije. Naime, etanol kao produkt je inhibitor pa se porastom koncenracije alkohola u komini smanjuje aktivnost kvaščevih stanica. Medjutim za proračun potrebne količine kvasca na početku procesa (Xo) uzima se prosječna aktivnost kvasca, koja u anaerobnim uvjetima iznosi 0,6 – 0,8 g/g/sat. S druge strane, aktivnost kvasca se može povećati do 1,2 kada se u kominu upuhuje zrak, što znači da male količine kisika pospješuju rast i fermentacijsku aktivnost kvaščevih stanica.
144
5.3. PROIZVODNJA ALKOHOLA U POGONU 5.3.1. Proizvodnja alkohola na melasi U proizvodnji alkohola se koriste sve vrste melasa. Sastav i svojstva melasa detaljno su opisani u knjizi «Sirovine u biotehnologiji» (Marić, 2000), što je prikazano u tablici 5.2. Tablica 5.2. Kemijski sastav melasa šećerne repe i šećerne trske (Grba 2000) Sastojci (%) Suha tvar Ukupni šećer Invertni šećer Rafinoza Dušik Pepeo P2O5 CaO K2O Na2O MgO Talog izdvojen centrifugiranjem (%) Oligoelementi (mg/kg) Cink Bakar Željezo Mangan Vitamini (mg/kg) Tiamin Riboflavin Piridoksin Nikotinamid Ca-pantotenat Folna kiselina Biotin Inozitol
Repina melasa
Trščana melasa
75 - 85 46 - 55 0,5 - 1,0 0,6 - 1,0 0,8 - 2,5 5 - 10 0,02 - 0,07 0,3 - 0,7 2,2 - 4,5 0,8 - 1,5 0,01 - 0,4
77 - 86 50 - 60 10 - 30 0,4 - 1,5 7 - 11 0,6 - 2,0 0,1 - 1,1 2,6 - 5,0 0,5 - 2,0 0,3 - 1,0
0,5 - 1,0
1,0 - 1,5
30 - 50 3-7 50 -100 3 - 12
5 - 20 5 - 25 150 - 500 -
1-3 0,1 - 0,7 3-6 37 - 51 40 - 120 0,2 - 0,3 0,01 - 0,12 5000 - 8000
3 -4 2-3 6-7 20 - 30 20 - 120 0,03 - 0,1 0,8 - 1,8 5000 - 6000
5.3.1.1. Tehnološki postupci Tehnološki postupci proizvodnje etanola na melasi uglavnom se razlikuju prema načinu vođenja fermentacije u «glavnom vrenju» jer su postupci pripreme melase i pripreme inokuluma veoma slični u svim tehnologijama. U proizvodnji alkohola na melasi najčešće se koriste šaržni proces s pritokom supstrata, te polukontinuirani i kontinuirani procesi. Šaržni postupci s pritokom supstrata koriste se kako bi se izbjegla početna inhibicija sa supstratom, zbog visoke koncentracije šećera na početku fermentacije, koja u šaržnom procesu iznosi oko 15-17 %. Smanjenjem početne koncentracije šećera na oko 5 % izbjegava se dugačka lag faza te skraćuje ukupno vrijeme fermentacije. Preostali dio šećera do 15 % dodaje se u pritoku tijekom fermentacije. U prvim uvedenim šaržnim 145
procesima s pritokom na supstrata nakon završene fermentacije kvasac je zajedno s prevrelom kominom odlazio destilaciju. Da se to izbjegne Melle i Boinot (1954) su uveli postupak reciklacije kvaščeve biomase, gdje se kvasac nakon završene fermentacije u glavnom vrenju izdvaja iz prevrele komine separacijom i ponovno vraća u fermentor kao inokulum za postavljanje naredne fermentacije. Na taj se način izbjegava umnožavanje kvaščeve biomase u predfermentorima za svaku fermentaciju. Naime, nakon izdvajanja kvasca iz prevrele komine na kraju procesa, masa kvasca je dovoljna za postavljanje nekoliko fermentora u glavnom vrenju. Time se povećava iskorištenje supstrata, jer se uštedi šećer koji se potroši na umnožavanje kvaščeve biomase. Tako izdvojena biomasa kvasca se čuva u hlađenim posudama na 4° C, da ne dođe do većeg pada aktiviteta i koristi se tjedan dana za postavljanje narednih fermentacija. Prije prebacivanja u fermentor, dio kvaščeve suspenzije se zakiseli na pH = 2,0 – 2,5 i drži 2 sata, da se usmrte eventualno prisutne bakterije koje ne podnose tako niski pH. Taj postupak, s neznatnim izmjenama, zadržao se sve do danas. Najveća prednost vraćanja biomase je da omogućuje unošenje veće količine biomase kao inokuluma, čime se znatno skraćuje vrijeme procesa, odnosno povećava produktivnost procesa. Austrijska firma Vogelbusch uvela je tzv. «B-postupak» u kojem se uz alkohol proizvodi i prehrambeni kvasac. Proces je sličan Melle i Boinot (MB-postupku) s tom razlikom što se u glavnom vrenju uvodi zrak (vidi opis B-postupka).Važno je naglasiti da se u istom pogonu mogu voditi i B-postupak i razne varijante MB-postupka. To znači da je vođenje procesa u glavnom vrenju osnova za razlikovanje varijanti tehnoloških procesa proizvodnje alkohola. U novije se vrijeme sve više uvode kontinuirani procesi proizvodnje alkohola, radi povećanja produktivnosti procesa. Proces je najčešće sinhroniziran u 3-5 fermentora koji su spojeni u seriju (vidi poglavlje kontinuirane fermentacije). 5.3.1.2. Proizvodnja alkohola po fazama Proizvodnja alkohola u pogonu prikazana je na slikama 5.3. i 5.4.
Slika 5.3. Blok shema proizvodnje alkohola u pogonu
146
Na slici 5.3. prikazana je shematski proizvodnja alkohola, kao i pomoćni pogoni koji sudjeluju u opskrbi tvornice s energijom (kotlovnica), zrakom (kompresorska stanica s kompresorima za zrak) i toplom tehnološkom vodom. Također su shematski prikazana skladišta za sirovine i gotove proizvode. Osim toga postoji mogućnost ukapljivanja CO2 plina, za što je potreban poseban pogon.
Slika 5.4. Shematski prikaz proizvodnje alkohola i suhog kvasca iz melase u pogonu 147
5.3.1.3. Priprema supstrata Priprema melasnog supstrata objašnjena je u knjizi «Sirovine u biotehnologiji» (Marić, 2000). Priprema melase u proizvodnji alkohola prikazana je na slici 5.5. Dakle, nakon prepumpavanja iz skladišnih rezervoara u pogon, melasa se mora razrijediti s toplom vodom u omjeru 1:1 da joj se smanji viskozitet, radi lakšeg transporta i bistrenja. Nakon toga se razrijeđena melasa filtrira i zagrije na 80 o C, izbistri centrifugalnim separatorom, a potom sterilizirati. Sterilizacija je kontinuirana i obavlja se pomoću dvostrukog pločastog izmjenjivača, gdje se u prvom dijelu melasa predgrije sa sterilnom melasom, a u drugom dijelu se pomoću pare postiže željena temperatura od oko 110 oC. Tada se zadržava na toj temperaturi 2-3 minute u posudi za zadržavanje. Sterilna melasa se prihvaća u prihvatni spremnik iz kojeg se centrifungalnim pumpama prubacuje u fermentore.
Slika 5.5. Priprema melase S druge strane, otopina soli se priprema u dvije posude s mješalima, slično kao i u proizvodnji pekarskog kvasca, što je prikazano na slici 5.6. U proizvodnji alkohola melasi se dodaje diamonijev fosfat, kao izvor fosfata i dušika, što je uglavnom dovoljno za optimalan rast kvaščevih stanica i brzinu alkoholne fermentacije. Katkada se za otopinu soli dodaje i diamonijef sulfat, ako melasa ne sadrži dovoljne količine asimilirajućeg dušika. Dakle, u posudi s miješačom soli se otapaju u toploj vodi pri oko 60o C. Nakon otapanja, ostavi se otopinu stajati 2-3 sata da se istalože eventualno prisutne nečistoće, a zatim se bistra otopina oddekantira i prebaci u prihvatni spremnik (slika 5.5), odakle se po potrebi prebacuje (prepumpava) u fermentore za proizvodnju alkohola.
148
Slika 5.6. Priprema otopine soli 5.3.1.4 Priprema laboratorijske čiste kulture Laboratorijska čista kultura (LČK) priprema se s odabranim sojem kvasca S. cerevisiae, koji se čuva na kosom agaru. Kvasac se precijepi na tekuću podlogu u Erlenmeyerovu tikvicu od 500 ml s 200 ml podloge. Tekuća podloga je kvaščeva podloga ili melasna podloga s oko 5 % šećera kojoj se doda određena količina diamonijevog fosfata, diamonijevog sulfata i kvaščevog ekstrakta. Nakon umnožavanja d 24 - 48 sati sva količina inokuluma se precijepi u Hansenovu tikvicu od 10 L koja sadrži oko 6 L iste ili vrlo slične hranjive podloge. Inkubacija LČK obavlja se u termostatu. Nakon inkubacije od 24 - 48 sati pri 30o C, cjepivo je pripravljeno za inokulaciju bioreaktora u pogonu. Priprema LČK prikazano je na slici 5.7.
Slika 5.7. Priprema laboratorijske čiste kulture (LČK)
149
5.3.1.5. Uzgoj pogonskog inokuluma U suvremenim pogonima za proizvodnju alkohola na melasi, cjepivo (inokulum) se umnožava u propagatoru i predfermentoru, što se često zove propagatorska stanica, a nalazi se u posebnoj prostoriji. Najčešći volumen propagatora je 0,6 – 1,2 m3, a predfermentora 8 – 12 m3. Procesi uzgoja kvaščeve biomase u tim fermentorima su šaržni. Međutim, u pogonima velikog kapaciteta (> 100.000 L etanola/dan) propagacija se odvija u većim fermentacijskim posudama, ili sa dva predfermentora koji često rade semikontinuirano. Sastav hranjive podloge je gotovo isti u oba procesa, a najčešće se koristi podloga sastava (u g/L): melasa 80-100; diamonij-fosfat 1; diamonij-sulfat 2. Uvjeti okoline za umnožavanje su: temperatura 30-31 °C i pH = 4,2 – 4,5. Komina se propuhuje zrakom radi bržeg rasta kvaščevih stanica. Za postavljanje procesa uzgoja u propagatoru, podloga se priprema ručno, što znači da radnici donose sirovine, otope ih u vodi te podese pH na 4,2 – 4,5 s razrijeđenom sulfatnom kiselinom. Zatim se podloga sterilizira u propagatoru pri 110 °C, 10 – 20 min, ohladi na 30 °C i inokulira s laboratorijskom čistom kulturom (LČK). Uzgoj u ovoj fazi traje 20 –24 sata, što ovisi o količini LČK. Nakon završetka procesa sva količina komine iz propagatora služi kao inokulum za proces uzgoja u predfermentoru. Međutim, u predfermentoru se podloga priprema tako da se prepumpa proračunata količina sterilne melase i otopine soli iz prihvatnih rezervoara. Zatim se podesi pH na 4,2 s H2SO4 (koja se također prepumpa) i temperatura na 30° C. Tako pripremljena podloga se zatim inokulira s cjepivom proizvedenim u propagatoru te otvori dovod zraka. Proces traje 12-14 sati, pri optimalnim uvjetima okoline. To je cjepivo za inokulaciju jednog fermentora u glavnom vrenju Ovi procesi umnožavanja pogonskog inokuluma u suvremenim tvornicama alkohola, gdje se vrši reciklacija kvaščeve biomase, obavljaju se obično jednom tjedno. 5.3.1.6. Alkoholna fermentacija-Glavno vrenje Već je prethodno objašnjeno da se postupci proizvodnje alkohola iz melase uglavnom razlikuju prema načinu vođenja procesa u glavnom vrenju. Zato će u ovom poglavlju biti detaljnije opisani procesi koji se najčešće primjenjuju u proizvodnji alkohola u industriji. 5.3.1.6.1. Šaržni procesi Od šaržnih procesa se najčešće koriste tzv. šaržni procesi s pritokom supstrata i reciklacijom kvaščeve biomase. Najčešće zastupljeni su Melle-Boinot postupci (Matta i Medrohno, 2000) i Vogelbusch B-postupak, dok se klasični šaržni postupak primjenjuje samo u proizvodnji alkohola iz kukuruza i drugih polisaharidnih sirovina. Postrojenje za glavno vrenje u tim postupcima, kao i konstrukcija fermentora su isti ili veoma slični. Fermentori, kao i sva armatura, izrađuju se od nehrđajućeg čelika, što je prikazano na slici 5.8. U glavnom vrenju ima najčešće 4 -6 fermentora, veličine od 60 – 200 m3, što ovisi uglavnom o kapacitetu tvornice. Fermentori su opremljeni s uređajima za mjerenje i regulaciju procesa (temperatura, pritok supstrata, aeracija, uzimanje uzoraka). Treba naglasiti da je poželjno da svi fermentori imaju dovod zraka, jer to omogućuje prijelaz s jednog postupka na drugi. Tako se npr. bez problema može prijeći iz MB-postupka u Bpostupak i obrnuto.
150
Slika 5.8. Fermentor za glavno vrenje sa svim potrebnim priključcima Zato će u ovom poglavlju biti opisan Vogelbusch B-postupak, kao vrlo anivljiv postupak, u kojem se osim alkohola proizvodi i prehrambeni kvasac, koji se primjenjuje u nas u tvornici BADEL u Sesvetama. Postavljanje i vođenje procesa fermentacije po Bpostupku prikazano je u tzv. listi vrenja (tablica 5.3) i na slikama 5.9. i 5.10. U suvremenim pogonima postavljanje i vođenje procesa fermentacije se izvodi pomoću automatske kontrole i regulacije procesa, s minimalnim utroškom fizičkog rada.
Slika 5.9. Postavljanje i vođenje fermentacije u glavnom fermentoru 151
Tablica 5.3. Postavljanje i vođenje fermentacije u glavnom vrenju po B-postupku Sastav hranjive podloge Litara voda 27.000 melasa (40°Blg) 6.000 otopina solix 1.125 cjepivo (inokulum) 7.000 iz PF (50 kg kv.stv.) konc. H2SO4 30-40 Vrijeme °Blg pH Temperatura Punjenje Pritok melase Aeracija o * (sati) (s.tv.) ( C) (%) (L/h) (m3/h) 0 7,2 4,2 31 58 250 1 6,8 4,2 30 250 2 6,0 4,3 30 250 3 5,1 4,3 31 250 4 3,4 4,3 31 58 250 5 3,6 4,4 31 2.500 200 6 3,8 4,4 31 2.500 200 7 4,0 4,4 31 2.500 200 8 4,4 4,4 31 2.500 9 5,0 4,5 31 2.500 10 5,4 4,5 31 2.500 11 6,0 4,5 31 2.500 12 5,4 4,5 31 80 13 5,4 4,5 31 80 Laboratorijska analiza prevrele komine____________________________________ etanol: 7,5 % vol ; neprevreli šećer: 0,15 % tež; količina kvasca: 540 kg (10kg.s.tv./m3) x 3 %-tna otopina diamonijevog fosfata i po potrebi diamonijevog sulfat * Volumen fermentora, 70m3
Slika 5.10. Dinamika alkoholne fermentacije u glavnom vrenju po B-postupku Proces se postavlja tako da se u oprani i sterilizirani (ili dezinficirani) bioreaktor prepumpa proračunata količina vode, sterilne melase i otopine soli, tako da suha tvar podloge u oBlg (oko 25 % šećera) bude 8 - 10. Zatim se podlozi podesi temperatura na
152
30-31°C i pH na 4,2 - 4,5 s H2SO4 koja se zapravo dodaje zajedno s vodom u tzv. «cijev u cijevi» sustavu. Nešto niži pH na početku procesa je poželjan zbog održavanja aseptičnih uvjeta tijekom vrenja, odnosno spriječavanja kontaminacije komine. Tako pripremljena podloga se tada inokulira s cijepivom umnoženim u propagatorskoj stanici (predfermentoru). Istovremeno se otvori dovod zraka. Nakon toga se prati potrošnja supstrata (šećera) kontrolom suhe tvari. Kada stupanj Balinga padne na polovicu početne vrijednosti (oko 4 - 5) počinje pritok sterilne melase od 40° Blg. Pritok sterilne melase se programira prema brzini potrošnje šećera, tako da se u komini održava 1 - 2 % šećera, pri čemu se održava optimalna brzina alkoholne fermentacije. Tijekom fermentacije u anaerobnim i semiaerobnim uvjetima razvija se toplina, pa se temeperatura održava automatskom regulacijom pomoću rashladne vode. Kiselost, odnosno pH se ne korigira, jer melasa ima relativno dobar odnosno dostatan puferki kapacitet. Pritok melase zaustavlja se 1- 2 sata prije prekida procesa, kako bi se potrošio sav šećer, dok se dovod zraka prekida nakon 2/3 vremena fermentacije. Količina alkohola na kraju procesa je 7.5 - 8.5 % vol, a neprevreli šećeri trebaju biti ispod 0,2 %, što se vidi u tablici 5.3. Kvaščeva biomasa se tijekom procesa umnoži 8 - 10 puta. Iz slike 6.10 se vidi dinamika alkoholne fermentacije u glavnom vrenju po B-postupku. Na sličan način postavlja se i vodi vrenje po Melle- Boinot (MB) postupku, gdje je proces anaeroban. Međutim, u ubrzanom MB postupku, proces se vodi s kratkom aeracijom od 1 - 2 sata na početku procesa. U procesima po B postupku umnožavanje kvasca se vrši u uvjetima aerobne fermentacije, pa je nešto brže nego u potpuno anaerobnim uvjetima. Dakle, količina inokuluma se može izračunati iz jednadžbe: Xo = Xt/f gdje je: Xo – početna količina kvasca Xt – konačna količina kvasca f – faktor razmnožavanja kvaščeve biomase U standardnom B postupku koncentracija kvasca na kraju procesa (Xt) je oko 10-12 g/L suhe tvari. Prema tome podatku se računa početna količina kvasca (Xo). Nakon završene fermentacije kvaščeva biomasa se izdvaja iz prevrele komine separacijom, što je prikazano na slici 2.9. 5.3.1.7. Separacija komine Separacija se obavlja u 3 stupnja, a ispiranje kvaščeve biomase se vrši nakon 1. stupnja s vodom iz 3. separatora i nakon 2. stupnja s čistom vodom (slika 5.11). Time se, naravno, uštedi određena količina vode potrebna za pranje kvaščevog mlijeka. Tekući dio ide na destilaciju, kao u svim fermentativnim procesima. Nakon 1. fermentacije, sva količina odsepariranog kvaščevog mlijeka se sprema u prihvatnu posudu i čuva na 4° C uz hlađenje. To se naziva 1. generacija kvasca. Slijedeća (naredna) fermenatcija se postavi na identičan način kao i prva fermentacija, s tom razlikom što se kao inokulum koristi kvaščeva biomasa iz 1. generacije, a ne inokulum iz predfermentora. To je druga fermentacija a kvaščeva suspenzija se nakom separacije sprema u posebni spremnik s hlađenjem, kao i prva generacija (slika 6.12).
153
Slika 5.11. Separacija kvaščeve biomase iz prevrele komine 1, 2, 3 – centrifugalni separatori Nakon završenog procesa, fermentirana komina ide također na separaciju, a izdvojena kvaščeva suspenzija se čuva u drugoj posudi iste veličine, pri 4° C. To je inokulum 2. generacije i služi kao cjepivo za postavljanje svih fermentacija u jednom danu (6 - 7). Kada se potroši inokulum iz 2. generacije, ponovno se postavlja fementacija 2. generacije, gdje je inokulum kvaščevo mlijeko iz 1. generacije. To traje oko tjedan dana, sve dok se ne potroši cijepivo iz 1. generacije. Nakon toga se ponovno kreće iz početka s pripremom svježeg cjepiva u laboratoriju i propagatorskoj stanici. Čuvanje cjepiva 1. i 2. generacije prikazano je na slici 6.11. Ponekad se kvaščeva suspenzija 1. generacije zakiseljuje na pH 3-4 sa sulfatnom kiselinom da se spriječi kontaminacija s bakterijama, koje se uglavnom ne razmnožavaju pri toj pH vrijednosti. Prije inokulacije fermentora sa cjepivom iz 1. ili 2. generacije kvaščeva suspenzija (inokulum) se izdvaja u posudu za zakiseljavanje na pH 2,0 , gdje se zadržava 1-2 sata.
154
Slika 5.12. Čuvanje inokuluma 1. i 2. generacije. 1 – spremnik 1. generacije; 2 – spremnik 2. generacije ; 3 – hladnjak; 4 – posuda za zakiseljavanje inokuluma Višak kvasca, koji se izdvaja u svim fermentativnim procesima (osim 1. i 2. generacije) ide na preradu, tj.za proizvodnju suhog neaktivnog kvasca koji se koristi u prehrambene ili krmne svrhe. 5.3.1.8. Proizvodnja suhog neaktivnog kvasca Višak kvaščeve biomase prihvaća se u prihvatni rezervoar i ide na daljnju preradu. Proces proizvodnje neaktivnog kvasca prikazan je na slici 5.13. To je česti način prerade kvaščeve suspenzije u suhi neaktivni kvasac i primjenjuje se u većini tehnoloških procesa. Iz prihvatnog rezervoara (1) kvaščeva suspenzija ide na vakuum filtraciju (2), gdje se odsiše dio vode, tako da se dobije kvaščev kolač s oko 27 % s.tv. Naime, proces filtracije se često ubacuje jer je jeftinije odsisati dio vode iz kvaščeve suspenzije od isparavanja tijekom sušenja. Biomasa sa filtera pada u posudu za termolizu (3), gdje se liziraju kvaščeve stanice pomoću visoke temperature (80 oC, 20 min). Temperatura u posudi za termolizu se održava tako da se dio zagrijanog hidrolizata u izmjenjivaču topline (4) vraća u posudu za termolizu. Nakon toga termolizat ide na sušenje (5). U tu svrhu često se koriste valjkaste sušnice koje se griju unutar valjka vodenom parom. Mogu se koristiti i sušnice fluidizacijskim slojem. Valjci imaju prednost za nize kapacitete dok se fluidne sušnice koriste za veće kapacitete. Osim toga, mnogi potrošači žele proizvod u listićima, koji se dobije kada se osušena biomasa skida nožem s valjka. Nakon toga se biomasa po potrebi usitnjava i prihvaća u posudu (7) na kojoj se nalazi uređaj za punjenje i vaga.
155
Slika 5.13. Proizvodnja suhog neaktivnog kvasca 1 – posuda za miješanje; 2 – vakuum-filter; 3 – posuda za termolizu; 4 – predgrijač; 5 – sušnica s valjcima; 6 – transporter; 7 – posuda za skladištenje; 8 - vaga Osušeni kvasac se pakira u specijalne papirnate vreće u količini od 20 - 30 kg. Proces proizvodnje suhog neaktivnog kvasca prikazan na slici 11. može se koristiti u svim tehnologijama za proizvodnju alkohola i suhog kvasca s neznatnim izmjenama. Ovisno o kvaliteti suhog kvasca neaktivna biomasa upotrebljava se u prehrambene ili krmne svrhe, što je opisano u poglavlju 9.«Proizvodnja prehrambenog i krmnog kvasca». 5.3.1.9. Kontinuirana fermentacija Već duže vrijeme sve više se u proizvodnji alkohola na melasi primjenjuju kontinuirani procesi (Cysevski i Wilke, 1978; Lichts, 2006). Osnovni razlozi su veća produktivnost procesa odnosno smanjenje fiksnih investicijskih troškova, koji mogu biti smanjeni za 50 % u odnosu na šaržne procese. Kao što je bilo prethodno naglašeno, osnovna razlika između kontinuiranih i svih šaržnih procesa je vođenje fermentativnih procesa u glavnom vrenju. Kontinuirana fermentacija se vodi u 3 – 5 serijski povezanih fermentora što je prikazano na slici 5.15. Proces se vodi tako da se izbjegne inhibicija kvaščevih stanica produktom (alkoholom). Naime, kada bi se proces vodio samo u jednom fermentoru koncentracija alkohola bila bi konstantno visoka, što s vremenom smanjuje aktivnost kvaščevih stanica, tako da bi već nakon
156
nekoliko dana brzina fermentacije pala na minimalne vrijednosti. Ovisnost aktivnosti kvasca, odnosno brzine fermentacije o količini alkohola u komini prikazano je na slici 5.14., gdje je vidljivo da relativna brzina alkoholne fermentacije (ν) opada s porastom koncentracije alkohola u komini, pogotovo nakon što se koncentracija alkohola poveća na 5 - 6 % vol.
ν
Slika 5.14. Relativna ovisnost brzine fermentacije o koncentraciji etanola u komini To je temeljni razlog što se kontinuirana fermentacija mora voditi u nekoliko serijski povezanih fermentora. Proces kontinuirane fermentacije prikazan je na slici 5.15.
Slika 5.15. Kontinuirana fermentacija: 1 – propagator; 2 -predfermentor ; 3 – fermentori; 4 – prihvatna (degažna) posuda; 5 – centrifugalni separatori Procesi pripreme melasnog supstrata i otopine soli, kao i pripreme cjepiva su isti ili vrlo slični onima u šaržnim procesima koji su prethodno opisani.
157
5.3.1.9.1. Vođenje biotehnološkog procesa kontinuirane fermentacije Nakon što se pripreme supstrat i inokulum, proces počinje tako da se postavi fermentacija u 1. fermentoru na isti način kao po opisanom B postupku. Vođenje fermentacije u 1. fermentoru na početku procesa je također isto ili vrlo slično onom po B-popstupku, a obavlja se u aerobnim uvjetima tako da pri kraju fermentacije u komini bude što više kvaščeve biomase i 4.5-5.5 % vol etanola. Kada se prvi bioreaktor napuni do preljevne cijevi, komina se preljeva u 2. fermentor. Istovremeno započinje pritok sterilne melase u 2. fermentor, dok i dalje ide pritok melase u 1. prema definiranom programu. Kada se napuni 2. fermentor započinje preljev u 3. fermentor, gdje se odmah započinje s pritokom melase . Tada se izbalansira pritok melase u prva 3 fermentora i on obično ima omjer 40 : 35 : 25. Kada se napuni 3. fermentor započinje preljev u 4. fermentor i tako dalje. U zadnja dva fermentora se ne dodaje melasa jer oni služe za naknadno vrenje. Kada je kvaščeva biomasa aktivna, fermentacija završava u 4.fermentoru, a 5. služi kao rezerva. Nakon završenog procesa, komina iz 5. fermentora ili eventualno 4. ide na separaciju. Na početku, prilikom uhodavanja procesa, separacija se obavlja u jednom stupnju, a izdvojena kvaščeva biomasa u obliku kvaščeve suspenzije se preko kisele kupelji.vraća u biorektor 1. Kao kisela kupelj može poslužiti bioreaktor 2.(predfermentor). Tu se kvaščeva suspenzija zakiseli na pH = 2 sa sulfatnom kiselinom i zadržava jedan do dva sata da se usmrte eventualno prisutne bakterije. U 1 fermentor se dodaje otopina soli za prirast kvasca, voda za razrjeđivanje, te sulfatna kiselina za podešavanje pH vrijednosti. Kvaščeva suspenzija se vraća tako dugo dok se ne postigne željena količina kvaščeve biomase u sustavu. Tada se podese pritoci melase, otopine soli i količina recikliranog kvasca (prema potrebi). Kada se uspostave željeni parametri u kontinuiranom procesu izlazna komina se separira u dva stupnja jer se višak kvasca izdvaja i prerađuje u neaktivni suhi kvasac (slično B postupku). U dobro vođenom kontinuiranom postupku stanje fermentacijskog procesa u svim bioreaktorima prikazano je u tablici 5.4. Tablica 5.4. Karakteristike kontinuiranog procesa Parametar Fermentor F3 F1 F2 Suha tvar, % 5,0 - 6,0 - 6,5 5,5 6,5 7,5 Biomasa, g/ 18 - 20 16 -17 15 -16 L,s.tv. Alkohol, % vol 4,0 - 5,0 - 6,5 4,5 6,0 7,3 pH 4,0 - 4,2 - 4,5 4,2 4,5 4,8
F4 7,5 8,0 15 16 7,5 8,0 4,8 5,0
F5 - 7,5 8,0 - 15 -16 - 8,0 8,5 – 4,8 5,0
-
Važno je napomenuti da se gotovo svi kontinuirani procesi vode uz minimalnu aeracije, tako da se u kominu upuhuje zrak. Dovod zraka najveći je u prvom fermentoru, da se reaktivira kvaščeva biomasa, a zatim sve manji, da bi se u zadnja dva fermentora upuhivala samo mala količina zraka za miješanje komine. Naime, kao što je već spomenuto u B-postupku, aeracija pospješuje brzinu rasta kvaščevih stanica a time se poboljšava fiziološko stanje kvaščeve biomase odnosno njezina fermentacijska aktivnost.
158
5.3.2. Izdvajanje alkohola iz prevrele komine: destilacija i rektifikacija Nakon separacije prevrele komine, tekući dio sadrži 7 - 9 % vol etanola. Osim etanola, u komini se nalazi i mnoštvo primjesa organskog i anorganskog porijekla iz melase, te spojevi koji nastaju kao nusprodukti alkoholne fermentacije, kao što su glicerol, acetaldehid, viši alkoholi, octena kiselina, etilacetat, diacetil i drugi. Zbog toga je teško iz smjese izdvojiti čisti etanol, pa se to radi pomoću različitih sustava za destilaciju i rektifikaciju. Temeljne osnove alkoholne distilacije iz prevrele komine opisali su Kvaalen i sur.(2007/04). Dakle, ako se želi proizvesti alkohol sa što manje primjesa, potrebno je odabrati efikasan sustav za destilaciju i rektifikaciju. Sustavi za destilaciju i rektifikaciju sastoje se od najmanje tri (3) kolone, kao što je prikazano na slici 5.16. Međutim, suvremeni sustavi za destilaciju i rektifikaciju sadrže 5 - 7 kolona, u kojemu se može proizvesti alkohol vrhunske kvalitete, pogotovo za proizvodnju jakih alkoholnih pića (vtdka) ili za kozmetičke svrha.
Slika 5.16. Destilacija i rektifikacija 1- predgrijač; 2 – destilacijska kolona; 3 – kolona 1. toka; 4 - posuda sa parnim injektorom; 5 – rektifikacijska kolona; 6 – Barbetov predložak; 7 – posuda za odvajanje patočnih ulja; K – kondenzator; H – hladnjak Kao što je prikazano na slici 6.16. sustav mora sadržavati najmanje tri kolone, i to: I - destilacijsku kolonu I I - kolonu 1. toka /epiracijska kolona III - rektifikacijsku kolonu U prvoj (destilacijskoj koloni) odvoji se alkohol od preostalog dijela komine koji se izdvaja na dnu kolone i naziva se džibra. Prije ulaska u destilacijsku kolonu, tekući dio komine predgrije se s izlaznom džibrom u pločastom izmjenjivaču topline (1) i pri vrhu 159
ulazi u destilacijsku kolonu (2). U toj koloni se izdvaja sva količina etanola iz tekućeg dijela prevrele komine, zajedno sa svim hlapivim primjesama, a na dnu kolone zaostaje džibra koja sadrži sve anorganske tvari i teško hlapive organske tvari (melanini, koloidi ,itd.). Izdvojeni alkohol s primjesama odlazi u kolonu II (kolona 1. toka), gdje se izdvajaju lako hlapive tvari (acetaldehid, esteri, octena i dr.) Kako bi se te lako hlapive tvari bolje razdvojile od etanola kao teže hlapive komponente, destilat iz prve kolone koji sadrži oko 60 % vol etanola se razrijedi s vodom na oko 30 %. Time se povećava koeficijent isparavanja lako hlapivih komponenti prema Sorelovom zakonu, što je prikazano na slici 5.17.
Slika 5.17. Sorelov dijagram Koeficijent isparavanja je omjer lakše hlapive komponente u parnoj fazi prema istoj komponenti u tekućini. Taj omjer je uvijek veći u razrijeđenim smjesama. Koeficijent isparavanja se može izračunati prema slijedećoj jednadžbi. Kisp= A/a , gdje je: A- koncentracija komponente u parama a - koncentracija komponente u tekućini Primjeri koeficijenata isparavanja alkohola u vodenoj otopini: za 10 %-tnu otopinu; K= 52/10= 5,2 za 50 %-tnu otopinu; K= 75/50= 1,5 Zato se sve kolone za destilaciju i rektifikaciju sastoje od velikog broja podova kako bi došlo do boljeg razdvajanja komponenata. Nakon izdvajanja lakše hlapivih komponenata s vrha I. kolone, alkohol se izdvaja s dna kolone 1. toka (II kolona) i odlazi u kolonu III. U trećoj koloni, koja se naziva rektifikacijska kolona, dolazi do potpunog pročišćavanja alkohola od preostalih primjesa. U ovoj koloni je alkohol opet lakše hlapiva komponenta pa se koncentrira pri vrhu kolone. Isto tako i preostali dio najlakše hlapivih komponenti se koncentrira na samom vrhu kolone i izdvaja se kao tehnički alkohol. Pri dnu kolone se nakupljaju viši alkoholi pa se izdvajaju sa 2-3 poda pri dnu kolone. Izdvojeni viši alkoholi se nazivaju još i patočnim uljima, jer su lakši od vode. Prilikom izdvajanja plivaju na vodi pa se odvoje
160
dekantiranjem. Ovako pročišćeni alkohol zovemo rafinada, koja sadrži 96 % vol/vol etanola. Daljnje koncentriranje nije moguće jer se kod tih vrijednosti stvara azeotropna smjesa. 5.3.2.1. Proizvodnja bezvodnog alkohola U procesu proizvodnje bezvodnog alkohola za gorivo postoje dvije kolone za destilaciju i rektifikaciju i dvije kolone s molekularnim sitima za dehidrataciju, što je prikazano na slici 5.18.( Madson i Monceaux, 2003). U destilacijskoj koloni izdvoji se sav proizvedeni alkohol, koji odlazi na vrh kolone, a s dna kolone se izdvaja džibra. U rektifikacijskoj koloni se izdvoje patočna ulja, koja se naknadno miješaju s bezvodnim alkoholom nakon dehidratacije. Zato je potrebno naglasiti da u proizvodnji alkohola za gorivo tijekom destilacije i rektifikacije nema izdvajanja lakohlapivih komponenti u obliku tehničkog alkohola, kao što je to u proizvodnji rafiniranog alkohola. Nakon rektifikacije u kojoj se proizvede 96 %-tni etanol, vrši se dehidratacija u kolonama s molekulskim sitima koje rade naizmjenično. Dok jedna kolona izdvaja vodu iz rafiniranog alkohola, druga se regenerira s pregrijanim dehidriranim alkoholom. Ovaj sustav je znatno efikasniji od azeotropne destilacije, što se očituje u većoj ekonomičnosti procesa, jeftinijoj investiciji, boljoj kvaliteti alkohola te u jednostavnosti procesa. Naravno, ovisno o kapacitetu tvornice za proizvodnju alkohola, broj kolona za dehidrataciju može biti veći (slika 5.19.). Bezvodni alkohol koristi se za gorivo, kao E85, E-10 i E-5.
161
Slika 5.18. Proizvodnja bezvodnog alkohola iz prevrele hranjive podloge (Madson Monceaux, 2003)
Slika 5.19. Kolone s molekularnim sitima u proizvodnji bezvodnog alkohola
5.4. PROIZVODNJA ALKOHOLA NA ŠKROBNIM SIROVINAMA U proizvodnji alkohola sve više se koriste škrobne sirovina (kukuruz, druge žitarice, riža, krumpir). Razlog tome je sve veće korištenje alkohola za gorivo. U svijetu je najveća proizvodnja alkohola iz kukuruzua (Case, 2007), posebno u SAD-u, a u novije vrijeme i u Kini i Europi. Proizvodnja alkohola na škrobnim sirovinama je principijelno ista ili slična onoj na melasi. Bitna razlika je u pripremi supstrata. Naime, u tim sirovinama je nužno razgraditi škrob do fermentabilnih šećera (monosaharidi, disaharidi), koje kvasci mogu prevreti u etanol. Kako je proizvodnja alkohola na žitaricama sve zastupljenija, u ovom poglavlju biti će opisana proizvodnja alkohola iz kukuruza, odnosno kukuruzne krupice. Proizvodnja alkohola iz škrobnih sirovina, koje se primjenjuju u proizvodnji alkohola, prikazana je shematski na slici 5.20. (Vogelbusch prospekti, 2007). Dakle, škrobne sirovine se moraju najprije usitniti i zatim obraditi kao što je prikazano na slici 5.21. Tako pripremljeni supstrat koristi se kao kompleksna sirovina za fermentaciju u proizvodnji alkohola. Supstratu se može dodati određena količina amonijevih soli (diamonijev fosfat) ako se želi ubrzati rast kvasca i time povećati produktivnost procesa. Naime, u proizvodnji alkohola iz nebistrenih škrobnih sirovina ne izdvaja se kvaščeva biomasa i ne reciklira, pa se sva količina kvaščeve biomase mora dodati na početku procesa. Fermentacija je najčešće kontinuirana, pogotovo u tvornicama velikog kapaciteta, a isto tako i destilacija i rektifikacija. Kao što se vidi na slici 5.20. nakon destilacije zaostaje kukuruzna džibra koja se dekantira. Čvrsti dio (talog) se koristi kao stočna hrana, a tekući reciklira u pripremu supstrata. Nakon nekoliko reciklacija rijetka džibra se ugušćuje uparavanjem i najčešće miješa s dekantatom (čvrstom džibrom), te koristi u svježem stanju za stočnu hranu ili se suši i također koristi u smjesama stočne hrane. Ova džibra je visokovrijedni dodatak (po nutritivnoj vrijednost bolji za 30 - 40 % od kukuruza) za prehranu stoke (Ham et al.,1994; Klopferstein, 1996).
162
Slika 5.20. Blok shema proizvodnje alkohola iz škrobnih sirovina (Vogelbusch,2007)
5.4.1. Priprema supstrata u proizvodnji alkohola iz žitarica (kukuruza) U suvremenim biotehnološkim procesima proizvodnje alkohola iz kukuruza ili neke druge žitarice, supstrat se samelje u krupicu. Ako se proizvodi samo alkohol, najčešća je suha meljava, dok se u proizvodnji škroba i pivarske krupice koristi mokra meljava.
163
U proizvodnji alkohola koristi se uglavnom kukuruzna krupica, jer je tehnološki pogodnija od fino usitnjenog brašna. Zato je na slikama 5.20. i 5.21. prikazana proizvodnja alkohola iz kukuruzne krupice. U pripremi supstrata primjenjuju se šaržni i kontinuirani postupci ukomljavanja i ošećerenja. Šaržni proces ukomljavanja i ošećerenja kukuruzne krupice prikazan je na slici 5.21. Dakle, krupica se suspendira s vodom (može se dodati i dio bistre džibre) u posudi s miješalicom tako da koncentracija škroba u hranjivoj podlozi bude oko 16 - 18 %. Tada se smjesi doda mala količina termostabilne α-amilaze i sve zagrije najprije na 70-75 oC, pri čemu se smjesa zadrži oko 30 min, a zatim se zagrije do 100 oC. Grijanje se obično radi indirektno s parom da ne dođe do pregrijavanja smjese. Pauza na 70-75 oC je bitna za razgradnju škroba s alfa-amilazom. Naime, tijekom zagrijavanje škrob bubri, pri čemu se znatno povećava viskozitet, a α -amilaza djelomično razgrađuje molekule škroba te smanjuje viskozitet čime se olakšava pumpanje smjese, što je posebno važno u kontinuiranom procesu pripreme supstrata. Nakon zagrijavanja, smjesa se prebaci u drugu posudu i ohladi na oko 65 – 70 oC, što je optimalna temperatura za djelovanje preostalih amilolitičkih enzima. Tada se doda sva količina glukoamilaze (ili smjesa βamilaze i glukoamilaze) i preostala količina α -amilaze. Ošećerenje traje 2 - 3 sata, ovisno o količini dodanih enzima. Nakon toga se smjesa ohladi na 35 oC i prebaci u bioreaktor. Za pripremu supstrata poželjno je imati dvije posude, koje rade naizmjenično (slika 5.21).
Slika 5.21. Ukomljavanje, likvefakcija i ošećerenje škrobnih supstrata Ako se želi proizvesti alkohol iz izbistrene kukuruzne sladovine tada se primjenjuju postupci, kao što je prikazano u slici 5.22. U tom procesu se uz alkohol može proizvesti nekoliko vrijednih nuzproizvoda kao što su: svježi i suhi trop te visokovrijedni prehrambeni kvasac. Ovakova priprema bistrog supstrata primjenjuje se i u proizviodnji pekarskog kvasca visoke kvalitete, što je opisano u poglavlju o proizvodnji pekarskog kvasca.
164
Slika 5.22. Proizvodnja alkohola iz bistre kukuruzne sladovina (Grba i Marić, 2004 ).
5.4.2. Fermentacija Fermentacija ošećerenog kukuruznog supstrata izvodi se šaržno (najviše u malim farmerskim pogonima) ili kontinuirano. Ipak, u suvremenim pogonima sve je više zastupljena kontinuirana fermentacija. U ovim procesima vrijede sve prethodno opisane zakonitosti kao i za proizvodnju alkohola na melasi. Ipak treba naglasiti da se primjenom nebistrene podloge ne može izdvojiti kvaščeva biomasa nakon fermentacije, pa nema reciklacije kvaščeve biomase. Samo u slučaju korištenja bistre sladovine moguća je reciklacija kvasca i veća produktivnost fermentativnog procesa. Zbog toga se na početku procesa dodaju nešto manje količine kvasca kao inokuluma, što rezultira u produljenom vremenu fermentacije. Šaržni procesi traju 40 - 48 sati, dok je vrijeme zadržavanja u 165
kontinuiranom procesu 20 - 25 sati. Obzirom da nema reciklacije kvasca, za svaki šaržni proces potrebno je pripremiti inokulum. S druge strane, u kontinuiranim procesima priprema inokuluma je nešto jednostavnija, jer se kvaščeva biomasa zadržava u fermentorima u povoljnim količinama. Naime, tijekom procesa fermentacije priraste dovoljno kvaščeve biomase, tako da je njena količina tijekom procesa konstantna. Međutim, ako se želi ubrzati proces, tada je nužno dodavati određenu količinu kvaščeve biomase tijekom procesa koja se umnožava u propagatorskoj stanici. Brzina fermentacije kontrolira se pomoću saharometra (areometra) ili određivanjem količine nastalog alkohola. Fermentori za proizvodnju alkohola na kukuruznom supstratu slični su onima za proizvodnju alkohola na melasi. Po potrebi pH se regulira s amonijačnom vodom, dok se temperatura održava automatskim hlađenjem procesa kao i u svim procesima.
5.4.3. Izdvajanje proizvoda Nakon završene fermentacije, sva fermentirana komina ide na destilaciju a sirovi alkohol na rektifikaciju, slično onim procesima koji su prethodno opisani (slika 5.16). Iz destilacione kolone s dna izlazi džibra koja se može koristiti za krmivo. Rijetka kukuruzna džibra se prije upotrebe može doraditi filtracijom ili centrifugalnom dekantacijom, a bistri dio (20 - 30 %) se reciklira u posudu za pripremu suspenzije krupice s vodom. Preostali tekući dio džibre može se ugustiti uparavanjem u vakuum uparivačima i pomiješati s kolačem nakon dekantacije. Ovakva smjesa se može koristiti direktno u prehrani stoke i peradi. Međutim, trajnost ove smjese je mala (5 - 7 dana), pa se takova smjesa često suši i upotrebljava kroz duži period.
5.5. PROIZVODNJA ALKOHOLA IZ LIGNOCELULOZNIH MATERIJALA Proizvodnja alkohola iz lignoceluloznih materijala (LCM) je u novije vrijeme sve zanimljivija zbog sve veće potrošnje energije i zbog nadolazeće naftne krize. Kao što je već spomenuto, u te svrhe predviđa se sve veće korištenje alkohola za gorivo. Osim toga, lignocelulozni materijali su prisutni u prirodi u velikim količinama pa pretpostavljaju potencijalne sirovine za proizvodnju alkohola. Isto tako, kukuruz i druge žitarice kao i šećerni materijali (šećerna repa) su hrana, pa su LCM sve konkurentniji u proizvodnji alkohola za gorivo jer su otpadak. Konačno, proizvodnja bioetanola iz LCM-a je poželjna, obzirom na proizvodnju stakleničkih plinova. Ipak, treba naglasiti da je konverzija LCM-a u etanol znatno kompleksnija nego iz škroba i šećera. Zato istraživači ulažu velike napore kako bi se pronašla što racionalnija i ekonomičnija rješenja (Zaldivar i sur., 2001). Osnovni problem korištenja LCM-a je njihova voluminoznost, doprema do tvornice i hidroliza do fermentabilnih šećera. Tek u novije vrijeme postavljeni su proizvodni pogoni u industrijskom mjerilu manjeg kapaciteta (3-5.000 m3/god) u Kanadi, Brazilu, SAD-u i Europi (Tribe, 2006). LCM koji se koriste u proizvodnji alkohola za gorivo prikazani su u tablici 6.4. Tablica 6.4. Lignocelulozni materijal za proizvodnju alkohola Poljoprivredni ostaci Drvo
slama (pšenica, ječam, riža, raž), kukuruzovina, biomasa šećerne trske (bagasa) nativno, šumski otpadci, otpadci od prerade drveta, piljevina
166
Papir
otpadni papir
U lignoceluloznim materijalima im 50 – 70 % hemiceluloze i celuloze. Ovi polisaharidi se moraju razgraditi do fermentabilnih šećera, pri čemu se iz hemiceluloze dobiju uglavnom pentoze (ksiloza), a iz celuloze glukoza.
5.5.1. Hidroliza LCM Hidroliza LCM-a se obavlja enzimski ili pomoću kiselina. U tu svrhu razrađene su mnoge metode kiselinske hidrolize, a mogu se podijeliti u dvije grupe: hidroliza s koncentriranim kiselinama i hidroliza s razrijeđenim kiselinama. Hidroliza s koncentriranim kiselinama (70 %-tna sulfatna kiselina i 40 %-tna klorovodična kiselina) daje bolje rezultate i iskorišenje ali je prisutan problem toksičnosti i korozije materijala. Osim toga koncentrirane kiseline se moraju regenerirati da bi proces bio ekonomičan. U novijim rješenjima, daje se prednost kombiniranom procesu hidrolize, pri ćemu se najprije u prvom stupnju koriste razrijeđene kiseline (1 %) za razgradnju hemiceluloze, a u drugom stupnju s koncentriranim kiselinama se razgrađuje samo celuloza. Za razgradnju celuloze primjenjuje se u novije doba sve više enzimska hidroliza pomoću celulaza, pri čemu se dobije glukoza koju kvasci lagano previru u etanol (Sun i Chang, 2002; Gibson 2007). Taj proces zahtjeva prethodnu obradu LCM-a s kiselinama i lužinama, što je prikazano na slikama 5.23 i 5.24. LCM kuhanje s parom pod tlakom
obrada s kiselinom
neutalizacija s NaOH ili amonijakom
izdvajanje vlakana
mlin ili ekstruzija Slika 5.23. Obrada LCM-a prije enzimske hidrolize Nakon prethodno obrađenog LCM-a, dobije se otopina s razgrađenom hemicelulozom u kojoj su prisutne pentoze (ksiloza). Ova otopina se također može koristiti za proizvodnju alkohola, jer neki kvasci mogu efikasno fermentirati ksilozu u etanol (Jeffreis, 1985; Jeffreis i Jin, 2004). Preostala celuloza se razgradi enzimski s celulazama nakon čega se dobije otopina sa glukozom koju fermentiraju svi kvasci (Gusakov i sur., 2007). Predlažu se također i procesi simultane saharifikacije i fermentacije (Krishna i Chowdary,2000) pri ćemu se istovremeno vrši hidroliza i proizvodnja alkohola, najčešće sa dva mikrooganizma. Shema procesa proizvodnje etanola iz LCM-a prikazana je na slici 5.24.
167
Prikupljanje biomase
Proizvodnja enzima
Obrada biomase
Hidroliza celuloze
Alkohol
Fermentacija glukoze
Fermentacija pentoza
Destilacija
Korištenje lignina
Slika 5.24. Proizvodnja etanola iz lignoceluloznih materijala
5.5.2. Fermentacija Za fermentaciju ošećerenih lignoceluloznih ošećerenih materijala, koriste se mnogi kvasci: za fermentaciju pentoza kvasci iz rodova Candida, Pachisolen i Pichia, a za fermentaciju heksoza sojevi kvasca Saccharomyces cerevisiae (Nigam, 1985). Međutim, za simultanu saharifikaciju i fermentaciju, konstruirani su specijalni sojevi kvasca S. cerevisiae, koji mogu fermentirati heksoze i pentoze. Fermentacija se dakle može raditi odvojeno, kao što je prikazano na slici 2.24. ili zajedno, za što postoje mnoga rješenja ispitana u malim pogonima (Jeffreis, 2006). Nakon fermentacije prevrela komina ide na destilaciju i rektifikaciju te dehidrataciju kao što je prethodno opisano.
5.6. NOVOSTI U PROIZVODNJI ALKOHOLA ZA GORIVO Upotreba alkohola za gorivo najveća je u Brazilu gdje se koristi Gasohol (oko 25% etanola u benzinu ) i SAD-u, gdje se najčešće koristi E-85 (smjesa od 85 % etanola i 15 % benzina). E-85 i Gasohol mogu koristiti samo novokonstruirani fleksibilni motori (FFV-flex fuel vehicles). S druge strane, bio-etanol se koristi i kao dodatak modificiranom benzinu (5-10 %). Takvu smjesu mogu koristiti standardni automobili bez preinake. U 2007 proizvedeno je oko 50 x10 9 litara bio-etanola za gorivo (Licht, 2008).
5.6.1. Stanje i predviđanja u proizvodnji alkohola za gorivo (bio-etanola) Bio-etanol je biološko gorivo koje se danas koristi i to uglavnom zbog velike potrošnje energije. Najveće količine se proizvode u SAD i Brazilu, a u novije vrijeme i u Kini, Indiji i Europi. Proizvodnja etanola iz kukuruza provodi se u SAD-u od početka osamdesetih godina prošlog stoljeća, a u 2005.godini je dostigla iznos od 15 milijardi litara, odnosno udio od 3 % goriva na tržištu motornih goriva.U Brazilu je proizvodnja bio-etanola iz šećerne trske započela 1975. te uz određene oscilacije u 2005. dosegla količinu kao i SAD.
168
Ukupna svjetska proizvodnja od 2000. godine stalno raste, a u 2005. godini je iznosila oko 40 mil m3 što je odgovaralo oko 2 % ukupne potrošnje motornog benzina (slika 5.25). Sve do 2007. porast proizvodnje bio-etanola je bio u stalnom porastu, dok se je taj trend nešto usporio u 2008. godini, uglavnom radi znatnog porasta cijene poljoprivrednih proizvoda (naročito žitarica) u cijelom svijetu. I pored toga izgrađene su ogromne tvornice u Kini, Indiji i SAD-u. Uvođenjem proizvodnje bioetanola iz lignoceluloznih sirovina, očekuje se ponovni rast proizvodnje bio-etanola (Licht, 2008).
Slika 5.25. Kretanje svjetske proizvodnje bio-goriva (Licht, 2006.) Sličan je trend zabilježen i na području Europske unije u 2007. Proizvedeno je 1,77 milijuna tona bio-goriva što je porast od 15 % u odnosu na 2006. godinu. Proizvodnja bio-etanola u EU prikazana je u tablici 5.5. U 2007. godini došlo je do znatnih promjena u proizvodnji bioetanola kod najvećih proizvođača u EU. I pored porasta od 15%, neki veliki proizvođači iz EU, osim Francuske, su stagnirali ili smanjili proizvodnju. Tako je Francuska, koja bioetanol proizvodi iz žitarica ali i iz šećerne repe, udvostručila proizvodnju bioetanola, dok su Njemačka, Španjolska, Švedska i Italija smanjile proizvodnju. To je očito odraz značajnog poskupljenja žitarica u 2007. godini u Europi (Annon 3. 2008).
169
Tablica 5.5. Proizvodnja bio-etanola u EU (Annon.2, 2008)
Država
FR DE ES PL SE IT CZ HU CZ UK EU
Francuska Njemačka Španjolska Poljska Svedska Italija Cz Republika Mađarska Slovačka Britanija Drugi EU-27
2002
godišnja proizvodnja [Ml/god] 2003 2004 2005 2006 2007
114 0 222 83 63 103 6 0
103 0 201 76 65 88
128 25 244 45 65 109
126 151 302 86 164 1 15 0 63
250 431 402 120 140 128 15 34 0 45
578 394 348 155 70 60 30 30 20 52
103
534
618
907
1.565
1.770
5.6.2. Prikaz proizvodnje bio-etanola na različitim sirovinama Sirovine koje se najčešće koriste u proizvodnji bio-etanola su šećerna trska i kukuruz te šećerna repa, pšenica, manioka i slatki sirak. Prinosi etanola po hektaru poljoprivrednog zemljišta zasijanog različitim kulturama prikazan je u tablici 5.6. Tablica 5.6. Prinosi etanola po hektaru zemljišta zasijanog različitim poljoprivrednim kulturama (Brown, 2000.) Kultura Zemlja Litara po ha Šećerna repa Francuska 6.679 Šećerna trska Brazil 6.192 Manioka Nigerija 3.835 Slatki sirak Kukuruz Pšenica
Indija SAD Francuska
3.498 3.311 2.591
Iz tablice se može uočiti da se najveći prinosi alkohola dobiju iz šećerne repe i trske. Druga vrlo zanimljiva sirovina je kukuruz naročitio u SAD-u, Kini i Evropi te manioka u Africi i slatki sirak u Indiji. Međutim, proizvodnja bio-etanola iz krumpira nije ekonomična. Dakle, prinos etanola po hektaru poljoprivrednog zemljišta ovisi o kemijskom sastavu pojedine poljoprivredne kulture odnosno njenom iskorištenju u procesu prerade.
170
LITERATURA Anon 1, (2007). Production of bioethanol from corn . Vogelbusch prospekti. Anon 2, (2008). Production of bioethanol in the EU. http//www. biofuels-platform.ch/ en/ infos/eubioethanol.php. Anon 3,(2008). Biofuels platform-bioethanol. http//www. biofuels-platform.ch/ en/infos/eu-bioethanol.php. Anon 4, (2008). Lignol. Suncor plan JV for commercial cellulosic ethanol projects, Biofuel Digest. http://www.biofuelsdigest.com/blog2/2008/10/24/lignol-suncor-plan-jv-for-commercialcellulosic-ethanol-projects/ Berg,C. (2004). World Fuel Ethanol Analysis and Outlook 2004, 1-24. http://www.distill.com/World-FuelEthanol-A&O-2004.html . Brown,L.R. (2000).Rescuing a Planet under Stress and a Civilization in Trouble. W.W. Norton, New York. Case,S. (2007). Commercial production of ethanol from corn. http://www.ownmax.com/ articles/2137/1. Cysewski, G.R. and Wilke, C.R. (1978). Process design and economic studies of alternetive fermentation methods for the production of ethanol. Biotechnol. Bioeng. 20(9), 1421-1444 Demirbas, A. (2005). Bioethanol from cellulosic materials: A renewable motor fuel from biomass. Energy sources, 27, 327-337. Demirbas ,A. (2007). Progress in recent trends in biofuels. Progress in Energy and Consumption Science 33(1), 1-18. Gibson,G.W. (2007). Process of treating lignocellulosic materials to produce bioethanol. US-patent 718999306 Grba,S. i Marić,V. (2004). Idejno strojno-tehnološki projekt proizvodnje alkohola iz škrobni sirovina. Tehnološki projekt MZOŠ, Zagreb, 1-34. Gusakov,AG., Salanovich,T.N., Antonov,A.I., Ustinov,B.B., Okunov,O.N., Berlingame,R, Emalfarb,M. Baez,M., Sinitsyn,A.P. (2007). Design of highly efficient mixture for enzymatic hidrolysis of cellulose. Biotechnol. Bioeng. 96(5),1028-1038. Ham,G.A., Stock,R.A., Klopferstein,T.J. Larson,E.M., ShainD.H. and Huffman,R.P. (1994). Wet corn distillers byproduct compared with dried corn distillers grain with solubles as a source of protein and energy for ruminants. J. Anim. Sci. 72, 3246-3257. Jeffreis,T.W. (1985). Comparison of alternatives for the fermentation of pentoses to ethanol by yeasts. In: Lowenstein.M.Z.,ed. Energy applications of biomass. Proceed. Nat. Meeting on Biomass R and D for energy Appl.,1984. Oct 1-3; Arlincton, VA. New York: Appl.Sci. Publishers , 231-252. Jeffreis,T.W., Jin,Y.S. (2004). Metabolic enginereeng for improved fermentation of pentoses by yeasts. Appl.Microbiol. Biotechnol. 63, 495-509. Jeffreis,T.W. (2006). Enginereeng yeasts for xylose metabolism. Current opinion in biotechnol. 3, 320-326. Klopferstein,T. (1996). Distillers grain as an energy source and effect of drying on protein avilability. Anim. Feed Sci. Technol. 60, 220 -1207 Kvaalen,E., Wancat, P.C. and McKenzie, B.A. (2007). Alcohol distillation: Basic principles, equipment, performence relationships and safity..http://www.ces.purdue.edu/extmedia/AE/AE-117.html Krishna, S.H. and Chowdary,G.V. (2000) Optimisation of simultaneous saccharification and fermentation for the production of ethanol from lignocellulosic Biomass.J. Agri.Food Chem. 48(5), 1971 1976. Licht, F.O. (2006), World Ethanol and Biofuels Report, Vol 4(16) , 391. Tunderbridge Wells UK. Lichts ,F.O. (2007). Worl ethanol production may slow in 2008. World ethanol and biofuels report 6(4), 61-99. Lichts,F.O.(2008).The outlock to 2015 World Etanol. A special study from F.O.Licht's. World Ethanol Market, 3-6 November, Paris: F. O. Licht's World Ethanol Conference 2008 Limtong,S., Sumpradit,T., Kitpreechavanich,V., Tuntirungij,M., Seki,T. i Yoshida,T. (2000). Effect of acetic acid on growth and ethanol fermentation of xylose fermenting yeast and S. cerevisiae. Kasetart J. (Nat.Sci.) 34, 64-73. Marić, V. (2000). Biotehnologija i sirovine , str. 80-83,148-150 . Stručna knjiga , Zagreb. Madson,P.W. and Monceaux ,D.A. (2003). Fuel ethanol production. Katzen International. Inc., Cincinnati Ohio, USA, 1-12. Nigam,J.N., Irelad,R.S., Margaritis,A., Lachance,M.A. (1985). Isolation and screening of yeasts that ferment D-xylose directly to ethanol. Appl. Environ. Microbiol. 50(6), 1486-1489. Pereira, P.A., Santos, L.M., Souza E.T. and Andrade, J.B. (2004). Alcohol and feuls: a comparative chamber study of photochemical ozone formation. J.Braz. Chem. Soc. 15(5), 646-651. Pretorius,I.S. (2000). Tailoring wine yeast for the new millenium:novel approaches to ancient art of winemaking. Yeast 16, 675-729. Tribe,D.(2006). World first commercial straw to ethanol plant. http://gmopundit.blogspot.com 2006702
171
Zaldivar,J., Nielson,J. and Olsson,L. (2001). Fuel ethanol production from lignosellulose: a challenge for metabolic engineering
172
Poglavlje 6: PROIZVODNJA JAKIH ALKOHOLNIH PIĆA Vesna Stehlik-Tomas i Slobodan Grba
6.1. UVOD Alkoholna pića, kao što su vino i pivo, bila su poznata već u dalekoj prošlosti, što je opisano u prethodnim poglavljima ovog udžbenika. Međutim, stari narodi (Sumerani, Asirci, Babilonci i Egipćani) nisu znali da je alkohol glavni sastojak alkoholnih pića. To je vjerojatnio osnovni razlog što je proizvodnja jakih alkoholnih (destiliranih) pića počela mnogo kasnije. Prema današnjim spoznajama, destilaciju su pronašli Arapi u 8. i 9. stoljeću, kada su počeli destilirati aromatsko i ljekovito bilje za proizvodnju aromatskih vodica koje su se koristile u farmaciji za ljekovite svrhe. Međutim, ti destilati se nisu koristili za proizvodnju pića. Kako se jaka alkoholna pića u primarnoj proizvodnji, dobivaju iz alkoholnih destilata, jasno je da njihova proizvodnja ne seže daleko u prošlost za razliku od proizvodnje vina i piva. Proizvodnja alkohola destilacijom počela je tek u 11. stoljeću, kada je pronađena mogućnost kondenzacije lakše hlapljivih supstanci hlađenjem. Dobiveni destilat nazvan je “Aqua ardens” - plamena voda. U svom djelu magistar Salermus opisuje dobivanje alkohola destilacijom vina (Kugler, 2005). Naziv alkohol smislio je Paracelsus, lječnik i kemičar, oko 1500 god. upotrijebivši arapsku riječ al-kohl i nazvao ga je alcohol vini, kao najfiniji sastojak vina. U 13. i 14. stoljeću, počela je veća proizvodnja alkoholnih destilata u Europi, Kini i Mongoliji (Shackelford, 2007). . U početku su destilate proizvodili alkemičari i apotekari pa su se ti proizvodi koristili kao lijek. U 16. stoljeću u Nizozemskoj počinje proizvodnja rakija iz vina, jer pomorci na svojim dugotrajnim putovanjima nisu mogli sačuvati vino od kvarenja pa su ga pretvarali u rakiju. To piće su Nizozemci nazvali Brandwijn, što je preteča današnjeg Brandy-a. Nakon tog perioda započinje masovna proizvodnja voćnih rakija. Srednji vijek u Europi (naročito u Francuskoj) obilježava procvat proizvodnje rakije od grožđa i drugog voća. Tijekom ratnih zbivanja u to doba u Europi i širenjem raznih epidemija zaraznih bolesti, potrošnja rakija bila je stalno u porastu. Gotovo istovremeno, u 16. stoljeću u Njemačkoj, počinje proizvodnja žitnih rakija. Ta se proizvodnja proširila po cijeloj Europi, a kao rezultat tih tehnologija nastala je proizvodnja Wiskey-a, Vodke i Genevera. S vremenom su se usavršili uređaji za preradu voća i žitarica, pogotovo uređaji za destilaciju koji u novije vrijeme predstavljaju složena industrijska postrojenja koja prerađuju velike količine prevrele komine proizvodeći destilate, odnosno rakije. Početkom 17. stoljeća dvostrukom destilacijom proizvedeno je i danas nadaleko poznato piće Cognac, a zatim Calvados u Francuskoj (pokrajina Normandija). U Hrvatskoj proizvodnja maraskino destilata iz višnje maraske počinje u 18. stoljeću u Zadru (Anon 1, 2007). Povijest jakih alkoholnih pića opisali su Bluhm (1983) i Hanson (1995 i 2008). Razvojem industrijske proizvodnje jakih alkoholnih pića po cijelom svijetu, došlo je također i do razvoja «nacionalnih» pića kao što su Šljivovica u slavenskim zemljama, Tekila u Meksiku, Rum u Jamajci, Vodka u Rusiji i Poljskoj, Gin u Engleskoj itd.
173
6.2. DEFINICIJA I PODJELA JAKIH ALKOHOLNIH PIĆA Jaka alkoholna pića su pića u kojima je glavni sastojak etilni alkohol (etanol), čiji postotak iznosi najmanje 15 % vol. (Pravilnik RH, 2004; Pravilnik EU, 1989). U većini JAP-a, alkohol je visokokvalitetan odnosno rafiniran. Alkohol se dobiva destilacijom i rektifikacijom prevrelih hranjivih šećernih podloga te od prevrelih komina škrobnih sirovina, u kojima je škrob hidroliziran do fermentabilnih šećera koje kvasci mogu prevreti. Međutim, u voćnim rakijama alkohol potjeće od direktne destilacije prevrelih komina voća ili vina. Ovisno o vrsti sirovine i tehnološkog postupka te količini alkohola i šećera u pićima, jaka alkoholna pića su svrstana u 3 skupine i to: prirodna jaka alkoholna pića, umjetna jaka alkoholna pića i aromatizirana vina. Prirodna jaka alkoholna pića: To su pića koja se proizvode destilacijom prevrelih «prirodnih supstrata», a karakterizirana su specifičnom aromom koja potječe od sirovina iz kojih su pića proizvedena. U proizvodnji tih pića (šljivovica, konjak, kalvados, viski, tekila, vodka) nije dozvoljena uporaba šećera, škrobnog sirupa ili sirovina na bazi škroba kao niti dodavanje sirovog ili rafiniranog etilnog alkohola te biljnih proizvoda koji su ekstrahirani rafiniranim etilnim alkoholom, umjetnih boja i aroma. Umjetna jaka alkoholna pića: To su pića koja se proizvode maceracijom sirovina u alkoholu, destilacijom voćnih sokova i/ili dodatkom rafiniranog alkohola i aromatskih supstanci. Ta pića sadrže sve karakteristike sirovina iz kojih su proizvedena i to u oplemenjenom obliku te ne smiju sadržavati razne nekorisne i štetne supstance, niti gorke supstance koje također ne destiliraju. S obzirom da se maceracija vrši u rafiniranom alkoholu, takva pića ne sadrže aldehide i patočna ulja. U ovu skupinu pića spadaju poznati maraskino destilat koji se dobiva destilacijom macerata ploda višnje maraske. U Švicarskoj je poznato piće proizvedeno maceracijom malina himbergeist, dok je u Francuskoj omiljeno piće Cassis (proizvedeno maceracijom crnog ribizla). Aromatizirana vina: Ova pića se proizvode dodatkom mirodija i aroma prevrelim voćnim sokovima (vinima) s ili bez dodatka šećera i rafiniranog alkohola. U ovu skupinu pića spadaju vermut i bermet. U posebnu skupinu ovih pića spadaju gorki likeri (Amaro, Pelinkovac).
6.3. PRIRODNA JAKA ALKOHOLNA PIĆA Prirodna jaka alkoholna pića spadaju među najkvalitetnije proizvode JAP-a, jer sadrže sve okusne i mirisne karakteristike sirovina iz kojih su proizvedena (Lyons i Rose, 1977; Lyons, 1999; Christopher i Bauer-Christoph, 2007). Prirodna pića se dijele prema sirovinama iz kojih se dobivaju na: voćne rakije, žitne rakije, šećerne rakije i aromatizirane rakije, što je definirano hrvatskim pravilnikom (NN/172/2004). Pri proizvodnji žitnih i nekih aromatiziranih rakija, gdje je osnovna sirovina škrob mora se prethodno izvesti ošećerenje (hidroliza) škroba do monosaharida i disaharida (glukoze, odnosno maltoze) jer kvasci nemaju amilolitičke enzime. U tu svrhu se koriste čisti amilolitički enzimi ili različiti pripravci amilolitičkih enzima, kao što je slad. Pojedine tehnologije proizvodnje spomenutih vrsta rakija znatno se razlikuju pa su zato i posebno opisane.
174
6.3.1. Voćne rakije Za proizvodnju voćnih rakija mogu se koristiti bilo koji zreli voćni plodovi koji sadrže dovoljno šećera. Aromatični plodovi mogu se koristiti za dobivanje određene karakteristične arome i stavljaju se najčešće u prevrele komove ili u sirovi proizvod. U različitim zemljama razvila se proizvodnja voćnih rakija za čiju proizvodnju ima dovljno odgovarajućeg voća. Tako je u mediteranskim zemljama, u kojima dobro uspijeva vinova loza, razvijena proizvodnja destilata iz vina, kao što su komovica i vinjak u Hrvatskoj (konjak i armagnac u Francuskoj, metaxa u Grčkoj te grappa u Italiji). U Srednjoj Europi proizvode se rakije iz različitog voća koje tamo dobro uspjeva (jabuke, kruške, šljive, marelice, trešnje, jagode, kupine, maline, borovnice i dr.). Tako se u Normandiji (Francuska) proizvodi poznato piće od jabuke calvados, a u Njemačkoj, Francuskoj i Švicarskoj se od trešanja dobiva kirš (Kirschwasser). U Hrvatskoj, Bugarskoj, Rumunjskoj, Češkoj, Mađarskoj i Poljskoj proizvodi se šljivovica kao i u Francuskoj, Njemačkoj i Švicarskoj. Posebno cijenjena je rakija od krušaka (viljamovka), koja se proizvodi u područjima uzgoja te vrste. (Slovenija, Hrvatska i dr.) (Pravilnik, NN/172/2004). Podjela rakija ovisno o vrsti voća prikazana je u tablici 6.1. Tablica 6.1. Podjela rakija ovisno o vrsti voća VOĆE
NAZIV PIĆA Osnovni tipovi bez dodataka
šljiva šljivovica grožđe vinjak, lozovača marelica barack (Mađarska) kruška kruškovača; viljamovka jabuka jabukovača; calvados (Franc.) dunja dunjevača trešnja trešnjevača (Njem, Franc.) višnja marskino Rakije s prirodnim dodatkom (osnovna rakija je komovica s travama travarica s orasima orahovača s medom medovača/medenica s višnjama višnjevača
Tehnologija proizvodnje različitih voćnih rakija prilično je slična. Glavne faze proizvodnje su slijedeće: usitnjavanje sirovine, priprema hranjive podloge, odabir i priprema kvasca, fermentacija, destilacija te dorada i zrenje proizvoda. Osnovna shema proizvodnje voćnih rakija prikazana je na slici 6.1.
175
Berba voća USITNJAVANJE
Drobljenje
Kvasac
ili
Prešanje
masulj sok (priprama podloge)
Fermentacija
Prevrela podloga Destilacija
Odležavanje
Slika 6.1. Osnovna shema proizvodnje voćnih rakija 6.3.1.1. Opis procesa proizvodnje voćnih rakija Priprema hranjive podloge (usitnjavanje sirovine): Zreli i zdravi plodovi (šljiva, kruška, jabuka, marelica, trešnja i dr.) se stavljaju u prihvatne betonske bazene. Slijedi izdvajajanje koštica (ako ih voće sadrži) i dijela pokožice uz istovremeno pasiranje plodova. Usitnjeno (pasirano) meso ploda s ostatkom pokožice prihvaća se u odvojenu posudu i s monopumpama prebacuje u fermentacijske posude. Zajedno s plodovima u fermentacijske posude dospijeva i mikroflora (kvasci) koji vrše alkoholno vrenje. Međutim, kada se voće bere poslije kiše ili se dobro ispere prije usitnjavanja, tada je nužno komu dodati prethodno uzgojen odabrani kvasac. Alkoholna fermentacija: Proces alkoholne fermentacije odvija se u bioreaktorima ispunjenim do 75 % volumena kako zbog burne fermentacije ne bi došlo do prelijevanja komine izvan posude. Vrijeme fermentacije ovisi o količini šećera u sirovini, količini prisutnog kvasca i temperaturi komine tijekom vrenja. Tako fermentacija koma od šljiva traje pri temperaturi od 15-20 0C oko 4 tjedna, a pri temperaturi od 25 0C 6-10 dana. S druge strane, fermentacija koma od jabuka ili krušaka traje 2-3 tjedna, a od trešanja oko 3 tjedna pri temperaturi od 15-20 0C ili znatno kraće na temparaturama od 20-25 0C. Tijekom fermentacije dolazi do ekstrakcije različitih tvari iz voćnih dijelova ploda. Osim ekstrakcije, u tijeku vrenja dolazi i do biosinteze različitih organskih spojeva (organske
176
kiseline, viši i niži alkoholi, aldehidi, esteri i dr.) kao nusproizvoda alkoholne fermentacije. Nastajanje ovih spojeva ovisi o sirovini, vrsti kvasca, temperaturi fermentacije i o prisustvu drugih mikroorganizama. Esteri su poželjna komponenta u rakiji, jer daju ugodnu aromu i okus. Nastaju u tijeku naknadnog alkoholnog vrenja i u tijeku zrenja sirovog proizvoda. Za razliku od estera, viši alkoholi su nepoželjni jer daju pićima neugodan miris i okus, a nastaju tijekom burne fermentacije pri višim temperaturama. Zato se za proizvodnju visokokvalitetnih voćnih rakija preporuča duža fermentacija (6 do 8 tjedana) pri nižim temperaturama (10-15 0C). Fermentacija se smatra završenom, kada koncentracija šećera padne ispod 0,3 %. Za proizvodnju voćnih rakija može se upotrjebiti i suho voće. U tom slučaju je potrebno suhom voću dodati toliko vode da se dobije oko 15-20 % šećera ili onoliko vode koliko je ima u podlozi od svježeg voća. Komu pripravljenom od suhog voća obavezno se mora dodati prethodno uzgojen kvasac (Križanić, 2002). Destilacija: Nakon završenog vrenja, prevrela komina prebacuje se u kotlove za destilaciju. Način izvođenja destilacije vrlo je specifičan proces, što je naslijeđena ili stečena vještina i smatra se tajnom svakog proizvođača. Osim starinskih šaržnih (lambik) uređaja za destilaciju, danas se sve češće koriste kontinuirani sustavi u dva ili tri kotla te kolonski sustavi. Uređaj za kontinuiranu destilaciju prikazan je na slici 6.2. Sastoji se od 3 kotla koji su serijski povezani: kondenzatora, regulatora povratnog toka i hladnjaka. Tri spojena kotla omogućuju dobro korištenje vremena. Dok se jedan prazni, priprema i puni, drugi se zagrijava, a prevrela komina trećeg odlazi na destilaciju. Destilacijski kotao se puni prevrelom kominom preko gornjeg otvora. Na donjem djelu se nalazi otvor za pražnjenje džibre (ostatak nakon završene destilacije). Kotao se grije preko omotača u koji se uvodi vodena para ili vrelo ulje. Parna smjesa akohol-voda prolazi kroz destilacionu kolonu u kojoj se postiže efikasno razdvajanje komponenata. Iz kolone dolaze u kondenzator, u kojem se prevode u tekuće stanje. Dio alkoholne smjese vraća se na vrh kolone kao povratni tok, koji se podešava u odgovarajućem regulatoru, a dio ide kroz hladnjak i odvodi se kao destilat. Efikasnost koncentriranja regulira se povratnim tokom. Metanolska frakcija ili prvi tok izdvaja se na početku destilacije. Pri kraju destilacije, kad koncentracija destilata počinje opadati, podesi se veći povratni tok. Na taj način se postiže dobro iscrpljivanje alkohola iz komine, uz postizanje relativno visoke koncentracije destilata. Pare slabije zadnje frakcije tzv. zadnjeg toka se uvode u slijedeći kotao radi predgrijavanja.
177
Slika 6.2. Uređaj za kontinuiranu destilaciju voćnih rakija (Anon 3, 1995) 1-prevrela komina; 2-destilacioni kotlovi; 3 i 6-regulatori; 4-kondenzator; 5-hladnjak; 7destilat; 8-povratni tok; 9-džibra. I pored napredka u destilacijskim sustavima, još uvijek se za proizvodnju voćnih rakija «na malo» koriste šaržni starinski «lambik» destilacijski uređaji (slika 6.3). Ti kotlovi imaju često dvostruko dno za indirektno grijanje, da ne dođe do zagaranja komine u kotlu ili imaju sustav za miješanje iz istog razloga. U takovom sustavu se nakon destilacije odbacuje prvijenac (oko 5 %) u kojem ima najviše od alkohola lakše hlapljivih komponenti (metanol, acetaldehid, esteri) i destilira do pojave mutnoće, što je znak pojave viših alkohola, koji proizvodu daju nepoželjan okus i miris. Radi poboljšanja proizvoda (voćne rakije), često se obavlja ponovna destilacija (tzv. prepeka) čistog destilata.
178
Slika 6.3. Šaržni uređaji za proizvodnju rakije 6.3.1.1.1. Vinjak Vinjak je jako alkoholno piće, koje se proizvodi destilacijom vina i dodatkom aditiva (bonifikatori), te dozrijevanjem vinskog destilata više godina u manjim hrastovim bačvama utvrđenim postupkom. Slično piće vinjaku je brandy, koji se priprema od etanola i vinskog destilata gdje udio alkohola iz vinskog destilata ne prelazi više od 50 % od ukupne količine alkohola u gotovom proizvodu (NN/172/2004). Prvi zahtjev kod proizvodnje vinjaka je pravilno odabiranje sirovine, tj. sorte grožđa. Naime, za proizvodnju vinjaka nije pogodno svako grožđe i vino. Karbonatna tla daju grožđe pogodno za vinjak. Sorte grožđa koje kasnije dozrijevaju daju vina s manje alkohola i ekstrakata pogodnih za proizvodnju vinjaka. Za proizvodnju kvalitetnog vinjaka, vrlo je važna boja, okus i miris sorte grožđa, te da je vino proizvedeno s malo ekstrakta, 7-12 % vol. alkohola, najmanje 6 g/L ukupnih kiselina te šećera manje od 0,2 % (Koscica, 2004). Primarne aromatske tvari također utječu na kvalitetu vinjaka, jer prelaze u destilat. Sumpor ne smije doći u mošt, jer nastaje H2S koji daje neugodan miris, a s alkoholom se veže u etil-merkaptan (C2H5SH). Također je važno ne sumporiti vina, jer SO2 pogoduje nastajanju aldehida tijekom fermentacije, a za vrijeme destilacije dolazi do stvaranja tio-estera (C2H5-S-C2H5), koji imaju neugodan oštar miris. S jedne strane, SO2 nepovoljno utječe na sazrijevanje i razvijanje bukea vinjaka, dok s druge strane spriječava oksidacijske procese u destilatu. Fermentaciji mošta mora se pažljivo provoditi. Koriste se posebno selektirani vinski kvasci iz roda Saccharomyces koji moraju zadovoljiti slijedeće karakteristike: brzina fermentacije, potpuni utrošak fermentabilnih šećera, visoka tolerancija na alkohol, dobra temperaturna tolerancija, slaba sposobnost redukcije SO4-2 i H2S, te proizvodnja željenih aroma (glicerol, esteri, viši alkoholi). Kolone (kotlovi) za destilaciju vina u vinski destilat, napravljene su od bakrenog lima sa specijalnim dodacima za otklanjanje sumpornih spojeva. Tijekom šaržne destilacije najveći dio primjesa, a posebno onih s najjačim mirisom (metanol, aldehidi, esteri) prelazi u prvu frakciju destilata. Hlapljivih kiselina je najviše u poslijednoj frakciji. Vraćanjem ove frakcije na ponovnu destilaciju, smanjuje se količina kiselina i teže hlapljivih estera, što je povoljno za kvalitetu vinjaka, jer se koristi srednja frakcija.
179
Noviji postupci su dorađeni i kompleksniji. Jedan od načina destilacije u proizvodnji francuskog konjaka prikazan je na slici 6.4.
Slika 6.4. Destilacija vina u proivodnji konjaka (Koscica, 2004) U suvremenim destilacijskim aparaturama koje najčešće rade kontinuirano, tehnolog može utjecati na količinu i kvalitetu primjesa u nekom destilatu. Naime, destilati moraju sadržavati određne primjese koje im daju poželjan okus i miris (buke). Alkohol i primjese mogu se dobro razdvajati zahvaljujući raznim točkama vrelišta. Dorada vinjaka je završna faza za poboljšanje kvalitete samog proizvoda. U toj fazi ″sirovom″ vinjaku dodaju se prirodne tvari (bonifikatori) koje mu daju prepoznatljiv okus i miris. Najčešće se po tome i razlikuju pojedine vrste vinjaka. Odležavanje vinskog destilata za proizvodnju vinjaka posebno je važan proces. Obavlja se u hrastovim bačvama (volumen 100-250 L) tijekom nekoliko godina. Tijekom odležavanja, odvijaju se složeni oksidoredukcijski procesi koje kataliziraju kisik iz zraka (nalazi se u mikroprostorima hrastovine) i taninske komponente hrastovine. Kvalitetan vinjak dobiva se dugim odležavanjem vinskog destilata u manjim hrastovim bačvama (10-50 L). Opravdano je čuvanje samo kvalitetnog destilata. Na kemijski sastav vinjaka utječe sastav vina i način destilacije. Određene su količine pojedinih sastojaka (esteri, ugljična kiselina, octena, propionska) koje treba sadržavati dobar destilat. Odležavanje je u trajanju od najmanje 5 godina. 6.3.1.1.2. Šljivovica Šljivovica se proizvodi najviše u europskim zemljama panonskog područja kao što su Bugarska, Rumunjska, Češka, Slovačka, Mađarska, Poljska, Srbija i BIH, a proizvodi se i u Hrvatskoj (posebno u Slavoniji i Lici). Kvaliteta šljivovice najviše ovisi o vrsti i zrelosti šljive, načinu i vremenu berbe plodova, ukomljavanju, posudama u kojima se provodi alkoholna fermentacija, čuvanju prevrele komine do destilacije i o načinu destilacije. Plodovi šljive beru se u fazi potpune tehnološke zrelosti kada plodovi nakupe maksimalnu količinu šećera i aromatičnih tvari. Nakon berbe, plodovi se smještaju u prijemne bazene izrađene od betona. Zatim se izdvajaju koštice i dio pokožice uz istovremeno pasiranje plodova. Time se sprječava ekstrakcija nepoželjnih tvari iz pokožice i koštica kao što su amigdalin, benzaldehid, HCN i drugi spojevi koji nepovoljno utječu na kvalitetu šljivovice. Ukomljavanje je poželjno obaviti po suhom i
180
toplom vremenu radi brže i lakše fermentacije. Pasirano meso ploda s pokožicom se monopumpama prenosi u fermentacijske posude koje se napune do 3/4 volumena, kako zbog burnih reakcija ne bi došlo do preljevanja komine. Zajedno s plodovima šljive, u posude dospjeva mnoštvo prirodne mikroflore (kvasci), koja uz određenu količinu kisika i uz optimalnu temperaturu uzrokuje burnu fermentaciju. Ukoliko se berba šljiva odvija poslije kišnog perioda, potrebno je komu dodati umnoženi selekcionirani vinski kvasac. Također je važno naglasiti da se fermentacija odvija u zatvorenim posudama s malim otvorom za izlazne plinove pri čemu se stvore anaerobni uvjeti, što onemogućava razmnožavanje aerobnih mikroorganizama i gubitak stvorenog etanola. Fermentacijom u otvorenim posudama, uz gubitak alkohola, stvoreni ugljični dioksid podiže gustu masu komine na površinu, stvarajući klobuk koji se kroz kratko vrijeme ukiseli jer se u njemu brzo razmnože octene bakterije koje stvoreni alkohol oksidiraju u octenu kiselinu. Vrijeme trajanja fermentacije ovisi o slijedećim faktorima: vrsti sirovine, količini i vrsti prisutnog kvasca, temperaturi i količini kisika. Zbog mogućeg gubitka alkohola, optimalna tremperatura vrenja je od 15-20 0C. Završetak fementacije može se odrediti po prestanku izlaska ugljičnog dioksida i stvaranja pjene, odnosno kada je utvrđeno da je ostalo 0,3 % neprevrelog šećera (Križanić, 2002 g). Destilaciju rakije potrebno je provesti odmah nakon završene fermentacije ili najkasnije 2-3 tjedna poslije završenog vrenja kako bi se sprječilo djelovanje plijesni i bakterija koje uzrokuju kvarenje komine jer se stvara octena kiselina iz alkohola i povećava koncentracija cijanovodične kiseline. Prevrela komina od šljiva (kao i ostalog voća) destilira se u aparatima za dvokratnu destilaciju u rakijskim kotlovima. Svrha destilacije prevrele komine je da se zagrijavanjem iz nje odvoje hlapljivi sastojci i prevedu u tekući destilat, tj. rakiju. Hlapljive sastojke komine čine brojni kemijski spojevi, koji uz vodu i alkohol prelaze u destilat. To su neke aromatične tvari (hlapljive kiseline, esteri, viši alkoholi itd.). Svi hlapljivi destilati nisu jednako važni za dobivanje kvalitetne rakije. Neke pri pečenju treba svakako ukloniti, naročito više alkohole (patoke) koji rakiji daju loš okus. Desilacija se izvodi frakcijski, što znači da je nužno izdvojiti tri frakcije (dijela): prvijenac, srednju frakciju (srce) i poslijednju frakciju (patoku). Prvi tanki mlaz rakije (prvijenac) ima najveći sadržaj alkohola (oko 70 % vol.). Obzirom da taj dio sadrži veliki postotak lako hlapljivih štetnih spojeva (aldehidi neugodnog mirisa i metanol), potrebno ga je odvojiti (300-600 mL na 100 L komine). Poslije prvijenca, hvata se najveći dio srednjeg destilata kojim se dobije tzv. «meka rakija» (25-38 % vol. etanola). Kada jačina destilata na izlazu iz hladnjaka padne na 10-15 % vol. alkohola, hvata se poslijednja frakcija, viši alkoholi, odnosno patoke (n-propanol, i-butanol, s-butanol) i organske kiseline (mravlja, octena, propionska, maslačna, valerijanska). Viši alkoholi i organske kiseline su nepoželjni spojevi u srednjem dijelu destilata i bitno umanjuju kvalitetu gotovog proizvoda. Patoke se počinju destilirati odmah nakon druge frakcije sve dok u destilatu alkohol ne padne na 2-3 % vol.. Frakcije prvijenca i patoke miješaju se i na kraju zajedno ili posebno destiliraju uz ponovno odvajanje prvijenca i patoke. Tako dobivena rakija je obično lošije kvalitete (Kunovac, 2007). Jake šljivovice s 45-50 % vol. etanola, odlične kvalitete mogu se dobiti samo ponovnom destilacijom «mekane» rakije. Svrha druge destilacije «mekane» (slabe) rakije je da joj se povisi sadržaj alkohola, ali da se ujedno i pročisti (rektifikacija) od eventualnih nepoželjnih sastojaka (metanola, kiselina, patočnih ulja itd.) Ponovnom destilacijom se također koncentriraju aromatične tvari koje im daju izvanredan miris i okus plodova plave šljive. Detaljan opis utjecaja vođenja destilacije na kvalitetu proizvoda u proizvodnji šljivovice opisala je Spaho (2007). Nakon destilacije, šljivovica odležava u staklenim ili drvenim posudama (dudove i hrastove bačve), a zatim se puni u boce različitog oblika i veličine (slika 6.6). Opća shema proizvodnje šljivovice prikazana je na slici 6.5. (Anon 2).
181
Slika 6.5. Proizvodnja rakije iz šljiva
A
B
C
Slika 6.6. Rakije od šljiva i krušaka A-Šljivovica; B-Viljemovka; C-Rakija od krušaka tepki
182
6.3.1.1.3. Rakija od krušaka Rakije se mogu proizvesti iz različitih vrsta krušaka, kojih u našem podneblju ima u izobilju. Jedna od najkvalitetnijih rakija proizvodi se od krušaka sorte ″Viljamovke″. Zbog svoje kvalitete nazvana je ″kraljica rakija″. U Hrvatskoj postoje dvije sorte i to viljamova žuta i viljamova crvena koje su bogate u udjelu šećera. Sadrže od 7-10 % šećera, ovisno o vrsti i stupnju zrelosti plodova. Odlikuju se također vrlo izraženom aromom. Za proizvodnju rakije viljamovke važno je koristiti samo plodove čiste sorte. Preradu treba započeti kada su plodovi mekani pod pritiskom prstiju, a meso ploda ispod pokožice ne smije biti smeđe obojeno. Peteljke prije početka vrenja treba obavezno ukloniti. Kruške se ubiru u punoj zrelosti, radi kvalitete okusa i mirise te količine šećera (Anon 3, 2008; Carlsson, 2008). Tehnološki postupak uključuje slijedeće operacije: berba plodova, pranje i sušenje plodova, skladištenje od 2-4 tjedna, muljanje krušaka, alkoholno vrenje soka ili masulja, destilacija prevrele komine, odležavanje, dozrijevanje i završna obrada rakije. Pranje i sušenje plodova: Prije skladištenja, potrebno je kruške oprati vodom. Pranjem s vodom uklanjaju se s površine plodova zemlja i druge mehaničke nečistoće, koje mogu u daljnjem postupku dati rakije nepoželjnih mirisa. Isto tako se pranjem s površine plodova uklanjaju razni štetni mikroorganizmi kao što su primjerice divlji kvasci i bakterije koji bi mogli loše djelovati na vrenje, tj. dovesti do kvarenja masulja krušaka. Nakon pranja, potrebno je kruške osušiti. Skladištenje : Nakon pranja i sušenja, kruške se skladište u trajanju od 2-4 tjedna, kako bi za to vrijeme u njima došlo do stvaranja najveće količine šećera i do punog izražaja aroma. U tom vremenu odležavanja, kruške u potpunosti omekšaju i zbog djelovanja vlastite mase, lako otpuštaju sok. Priprema masulja: U vrionik se ne smiju stavljati cijeli plodovi, jer bi oni sporo otpuštali sok, zbog čega bi se alkoholno vrenje sporo odvijalo, a kvasac ne bi mogao šećer iz krušaka u potpunosti fermentirati u alkohol. Zato se priprema masulj, tako da se kruškama doda malo vode i po potrebi gnječe da se dobije žitka smjesa. Dodatkom tople vode može se također namjestiti željena temperatura kruškovog masulja. Alkoholna fermentacija soka ili masulja: Alkoholna fermentacija se provodi na isti način kako je opisano kod alkoholnog vrenja soka ili masulja šljive s tim da se mora obratiti pozornost na temperaturu fermentacije koja ne smije biti iznad 18 0C. Za alkoholno vrenje komine od krušaka viljamovki preporuča se koristiti isključivo selekcioniranu kulturu kvasca, koja se priprema u laboratoriju i propagatorskoj stanici (vidi odabir i pripremu inokuluma u proizvodnji žitnih rakija). Prije početka alkoholnog vrenja masulja (hranjiva podloga) važno je podesiti kiselost podloge. Naime, zbog niskog udjela kiselina u kruškama i visokog pH može ponekad doći do razvoja mliječno-kiselih bakterija tijekom fermentacije masulja. Tada fermentacija može otići u nepoželjnom smjeru pri čemu se stvara loša aroma proizvoda. Zato se kiselost komine treba podesiti na pH 3,2-3,6. Pri korištenju kiselinskog pripravka, potrebno je pridržavati se uputa proizvođača. Podešavanje kiselosti moguće je obaviti dodatkom koncentrirane sumporne kiseline, pri čemu se na 100 kg masulja od krušaka preporučuje dodati oko 50-60 mL koncentrirane sumporne kiseline. Za podešavanje kiselosti masulja od krušaka moguće je upotrebljavati i fosfornu kiselinu ili mliječnu kiselinu u količini od cca 100-250 g svake kiseline na 100 kg masulja. Pri alkoholnom vrenju komine od krušaka viljamovki preporučuje se upotreba enzimskih preparata za što bržu razgradnju pektina. Kruške viljamovke, relativno su siromašne spojevima dušika, a neki spojevi dušika topivi u vodi predstavljaju važnu hranu za kvasce. Ako kvasci nemaju dovoljno takve hrane neće se moći razmnožavati i time će
183
doći do zastoja u procesu vrenja. Zbog toga se preporučuje dodati na 100 L kruškovog masulja oko 10-20 g amonijevog sulfata ili diamonijevog fosfata. Važno je da se vrenje komine ne odvija odviše burno kako ne bi došlo do gubitka poželjne arome i time do lošije rakije nakon destilacije. Završetak vrenja ustanovljava se na isti način kako je opisano kod alkoholnog vrenja soka ili masulja šljive. Alkoholna fermentacija je potpuno završena kada filtrat prevrelog masulja krušaka viljamovki pokazuje vrijednost od 0,3-0,5 % šećera (izmjereno refraktometrom). Šaržna destilacija prevrele komine. Nakon završetka vrenja, potrebno je što prije destilirati prevrelu kominu, jer duljim stajanjem ona gubi na kvaliteti. Karakteristične arome sorti krušaka «Wiliams» brzo se gube ako se destilacija ne provede odmah nakon vrenja. Destilacija je najčešće šaržna, koju je potrebno pažljivo obaviti . Kada koncentracija alkohola u destilatu (srednji, odnosno drugi tok) padne ispod 55 %, potrebno je organoleptički ocijeniti uzorke destilata i ustanoviti imaju li još uvijek besprijekoran okus. Čim se u uzorcima primjeti, po okusu, pojavljivanje patočnih ulja, prekida se izdvajanje srednjeg toka. Iako destilat ispod 40 % vol. alkohola sadrži još dosta aroma, one su pomiješane s patočnim uljima pa ih se ne može koristiti. Da se poboljša kvaliteta proizvoda obavlja se ponovna destilacija. Tada se u prvoj destilaciji može uzimati više tzv. srednjeg toka. Veliki problem pri pripremi viljamovke je svakako nastajanje jednog aldehida, akroleina. Taj aldehid ima specifičan miris, a po okusu podsjeća na hren. Nastaje tijekom fermentacije, a razvijaju ga neke octene bakterije. Taj aldehid ne može se odvojiti destilacijom na normalnim kotlovima za pečenje rakije, već na specifičnim kolonama za frakcijsku destilaciju (dvokratna destilacija). Odležavanje, dozrijevanje i dorada: Destilat krušaka viljamovki sadrži puno eteričnih ulja, tako da je često lagano mutan. Zbog toga će često nakon razrijeđenja destilata na željenu jačinu rakije, biti potrebno provesti postupak filtriranja. Uobičajeno se prije filtriranja rakija ohladi na temperaturu od 5-8 0C. Ne preporučuje se hlađenje rakije na temperaturu ispod 5 0C jer bi moglo doći do izdvajanja eteričnih ulja, a s njima i pojedinih aroma. Zbog toga se također ne preporučuje skladištenje rakije viljamovke u hladnjaku. Arome (kombinacija percepcije okusa i mirisa) u rakiji viljamovki su osjetljive na svjetlo, toplinu i kisik. Zbog toga se preporučuje skladištenje u tamnim i zatvorenim spremnicima na temperaturi od oko 15 0C. Osim viljamovke u nas se proizvode i rakije od krušaka vrste tepka, što je postao također Hrvatski izvorni proizvod (slika 6.6 c). Princip proizvodnje te rakije je sličan osnovnoj tehnologiji za proizvodnju viljamovke, ali se ipak razlikuje u nekim postupcima (odležavanje, muljanje). 6.3.1.1.4. Rakija od jabuka Najpoznatija jabučna rakija je calvados proizvedena u Francuskoj. Fermentacijom jabučnog soka uobičajenim postupkom dobiva se jabučno vino od kojeg se nakon dozrijevanja i destilacije priprema calvados (Mattsson, 2005). Pravi calvados priprema se u 11 općina u Normandiji. Ime calvados je španjolskog podrijetla jer se jedan jedrenjak Filipa II, tj. brod ″El Calvados″ razbio o stijenje Normandije pri pohodu na Englesku 1588. godine i po tom brodu, prozvana je regija u Normandiji Calvados (Križanić, 2002). Za proizvodnju rakije od jabuka koriste se kisele, gorkaste jabuke, dok se u Normandiji za proizvodnju calvadosa koriste 2 dijela trpkih, 2 dijela slatkih i 4 dijela kiselih jabuka. Tehnologija proizvodnje slična je proizvodnji rakije od krušaka. Da bi se dobila homogena smjesa (pulpa), jabuke moraju biti jednako zrele. Prije prerade, plodove treba
184
oprati ali ne guliti. Prešanje jabuka obavljalo se u kamenim posudama, što je prikazano na slici 6.7. Danas se jabuke melju u suvremenijim mlinovima, a samljevene jabuke odlažu se direktno u prihvatne posude. Samljevene jabuke (pulpa) se ostave stajati nekoliko sati u prihvatnim posudama kako bi se ekstrahirali tanini i drugi aromatični sastojci koji se nalaze u pokožici. U proizvodnji rakija od jabuka mogu se fermentirati pulpa ili jabučni sok nakon prešanja i cijeđenja.
Slika 6.7. Prešanje jabuka (na starinski način) Samljevene jabuke s malim dodatkom vode ili jabučni sok, koji se proizvodi prešanjem, prebacuje se u fermentacijske posude. Za fermentaciju jabučnog soka ili masulja, dodaju se selekcionirani kvasci. Najčešće se koristi kvasac Saccharomyces cerevisiae, var. elipsoideus. Također je važno dodati kalij metabisulfit ili sulfitnu kiselinu da bi se spriječila oksidacija na površini komine, a također i uništili štetni mikroorganizmi koji bi mogli uzrokovati neželjene učinke. Nakon završene fermentacije masulja, često se vrši prešanje masulja u svrhu dobivanja bistrog jabučnog vina, koje se lakše destilira. Bolji proizvod dobije se fermentacijom soka, ali se bolje iskorištenje postiže kada se fermentira masulj.Da bi se dobila kvalitetna rakija, prije destilacije, jabučno vino mora odležati oko 6 mjeseci u hrastovim bačvama.
Slika 6.8. Uređaj za destilaciju jabučnih rakija
185
Destilacija se odvija u bakrenim kotlovima polagano ″kap po kap″ na nižoj temperaturi (slika 6.8). Pri destilaciji se odbacuje približno 15 % destilata (5 % prvijenca i 10 % patoke). Ostatalo je jabučni kvalitetan destilat. Ako se destilacija obavlja na kolonama (rektifikacijske kolone), uzima se samo destilat sa 70 % vol. alkohola. Tako dobivena rakija u proizvodnji calvadosa leži u hrastovim bačvama i do 25 godina. Pri tome se odvijaju oksidoredukcijske reakcije. Naime, sastojci jabučnog destilata (etanol, aldehidi, esteri, voćne kiseline) uz pomoć tanina i kisika iz zraka stvaraju mirisne komponente specifične za calvados. Mladom calvadosu dodaju se aditivi (esencije, boja) i prilagođava se jakost s demineraliziranom vodom na 36 % vol. alkohola. Međutim, u proizvodnji ostalih vrsta rakija od jabuka koriste se različite specifične tehnologije. Opću shemu proizvodnje rakije od jabuka prikazuje slika 6.9.
Slika 6.9. Faze proizvodnje rakije od jabuka
6.3.2. Žitne rakije Tehnologija proizvodnje žitnih rakija je slična proizvodnji voćnih rakija. Proizvode se pažljivom destilacijom prevrelih ošećerenih supstrata, dobivenih iz žitarica. Razlika je u tome što se prije fermentacije, škrob mora razgraditi do fermentabilnih šećera s pomoću slada ili amilolitičkim enzima, jer kvasci iz roda Saccharomyces, koji se koriste za fermentaciju, ne mogu previrati škrob. Glavne faze proizvodnje žitnih rakija su slijedeće: ukomljavanje i ošećerenje supstrata, fermentacija, destilacija, dorada i zrenje. Najpoznatije žitne rakije su: viski, vodka, genever i đin. 6.3.2.1. Viski Viski je žitna rakija s karakterističnim okusom i mirisom, što je poslijedica korištene sirovine i tehnologije. Proizvodi se pretežno od ječmenog slada, raži, te kukuruza i pšenice. Mora sadržavati najmanje 43 % vol. etanola. Najpoznatije vrste viskija su: škotski, irski, američki i kanadski viski.
186
Škotski viski. Obzirom na tehnologiju može biti sladni viski (eng. ″malt-whisky″) i žitni viski (eng.«grain-whisky»). Sladni viski dobiva se iz ječmenog slada, a žitni viski dobiva se iz žitarica (kukuruz, raž, pšenica) hidroliziranih amilolitičkim enzimima uz dodatak manjih količina ječmenog slada. Za razliku od tih vrsta viskija, blendid viski je dobiven miješanjem različitih destilata. Karakterističan miris i okus, sladni viski dobiva zahvaljujući procesu sušenja zelenog slada. Zeleni slad (proklijali ječam) se suši na perforiranim tavanima kroz koje prolazi vrući dim nastao izgaranjem vlažnog treseta. Tijekom sušenja dolazi do oksidacijskih procesa, te nastanka mnogih spojeva koji se nalaze u viskiju. Modernim analitičkim metodama utvrđeno je postojanje više od 1200 različitih spojeva u viskiju. U ovisnosti o načinu izvođenja procesa sušenja, proizvod ima jači ili slabiji okus po dimu (Lyions, 1999). Irski viski dobiva se od prerađenog (slada) i neprerađenog ječma, bez korištenja treseta prilikom sušenja. Američki viski (burbon) proizvodi se od kukuruza (najmanje 51 %) i miješavine drugih žitarica. Kanadski viski se proizvodi iz raži. Njegova proizvodnja slična je proizvodnji žitnog viskija (Škotska). Viski koji dolazi na tržište u pravilu je smjesa sladnog i žitnog viskija (više žitnog nego sladnog). Ostale vrste viskija su: indijski, velški, kineski (Morrison, 1999) U tablici 6.2. prikazane su sirovine, procesi fermentacije i destilacije različitih viskija (Lyons i Rose 1977; Lyons, 1999). Tablica 6.2. Sirovine i procesi proizvodnje različitih vrsta viskija Vrste viskija
Škotski sladni viski
Škotski žitni viski
ječmeni slad sušen s tresetom Proces kuhanje ošećerenja komine i ošećerenje alkoholni Fermentacija ili pivski kvasac Destilacija u dva kotla
žito i dio slada
62 %-tni alkohol (hrastove Dozrijevanje bačve ili od trešnje)najmanje 3 godine
Sirovina
Irski viski
kuhanje komine i ošećerenje alkoholni kvasac
ječam i ječmeni slad kuhanje komine i ošećerenje alkoholni kvasac
višekolonska
u tri kotla
Preko 67 %tni alkohol (hrastove bačve ili od trešnje) )najmanje 3 godine
70 %-tni alkohol (hrastove bačve ili od trešnje)najmanje 3 godine
Bourbon (američki viski) kukuruz i sitno žito
Kanadski žitni raž, ječam
kuhanje komine i ošećerenje alkoholni kvasac
kuhanje komine i ošećerenje alkoholni kvasac
višekolonsk a 60 %-tni alkohol (hrastove bačve ili od trešnje)najmanje 3 godine
višekolonska 60 %-tni alkohol (hrastove bačve ili od trešnje)najmanje 3 godine
Kao što je prethodno spomenuto viski se proizvodi kao i svaka druga žitna rakija. Tehnološki proces proizvodnje viskija prikazan je shematski na slici 6.10. Samljeveni suhi slad ili smjesa slada i samljevenih žitarica se ukomljuje s točno određenom količinom tople vode. Za vrijeme ukomljavanja, odvijaju se poznate
187
biokemijske reakcije enzimske hidrolize (ošećerenje) kao kod prooizvodnje piva. Ukoliko se viski proizvodi iz žitarica, samljevenoj smjesi ukomljenoj s toplom vodom dodaju se amilolitički enzimi radi ošećerenja kao u proizvodnji alkohola ili vodke. Obzirom da enzimi imaju različite temperaturne optimume, ukomljavanje se odvija u rasponu od 3576 0C polaganim zagrijavanjem komine i njezinim zadržavanjem pri određenim temperaturama (52 0, 65 0 i 76 0C) kao u proizvodnji pive. Tijekom ukomljavanja, komina se stalno miješa. Vruća ošećerena komina, ohladi se na 30 0C, te inokulira sa selekcioniranim kvascem.
Slika 6.10. Skladištenje sirovina, ukomljavanje, fermentacija, destilacija prevrele komine skladištenje i zrenje žitnih rakija (Anon 5, 2006) Za fermentaciju ošećerene komine koriste se najčešće posebni suhi aktivni kvasci iz roda Saccharomyces koji imaju veću toleranciju na proizvedeni alkohol (12-15 %). Rehidratacija kvasca obavlja se na isti način kao što je praksa u pekarskoj ili industriji vina. Osim toga, koristi se svježe pripremljeni kvasac S. cerevisiae kao i u proizvodnji alkohola iz škrobnih supstrata (vidi poglavlje: proizvodnja alkohola). Fermentacija se izvodi u velikim čeličnim fermentorima, pri temperaturi od 20 0C, tijekom 72 sata pri čemu se dozvoljava temperaturni maksimum pri kraju fermentacije od najviše 32 0C. Uz alkohol i ugljični dioksid, tijekom fermentacije se sintetiziraju i manje količine drugih organskih komponenti koje daju organoleptičke karakteristike destiliranom proizvodu. Više temperature pospješuju brzinu fermentacije, ali pogoduju rastu mliječnokiselih bakterija. Neke vrste bakterija iz roda Lactobacillus pretvaraju glicerol u hidroksipropionaldehid koji se cijepa do akroleina tijekom destilacije i daje oštar miris. Kontaminanti mogu ući u fermentor na nekoliko načina: preživljavanjem bakterijskih spora, s ječmenim sladom (ukoliko nije grijan do 65 0C) ili s kvaščevim inokulumom
188
(Morrison, 1999). Prije fermentacije, sladovina se aerira, kako bi se ubrzao razvoj kvasaca, olakšalo izlaženje CO2, olakšala flokulacija koloidnih tvari, te sprječilo taloženje kvasca. Nakon završene fermentacije, prevrela komina se destilira u relativno jednostavnim aparatima za destilaciju (kao kod proizvodnje šljivovice). Destilacija se ponavlja da bi se dobio proizvod s visokim sadržajem alkohola. Sirovi proizvod (“mladi viski”) je neugodna mirisa i nakon destilacije se stavlja u hrastove bačve za zrenje. Svježi destilat treba odležati u hrastovim bačvama od jedne do deset godina. Tijekom starenja alkoholnih destilata u proizvodnji viskija, odvijaju se složeni biokemijski i oksidacijsko-redukcijski procesi. Dakle, pod utjecajem kisika iz zraka, koji prodire kroz pore hrastovih bačvi, nastaju složeni organski spojevi (mirisne komponente). U prvoj godini zrenja događaju se znatne promjene u mirisu i okusu, tako da se nakon isteka već jedne godine zrenja dobije viski zadovoljavajuće kvalitete. Sazrijevanje viskija traje 2-12 godina. Nakon odležavanja, viskiju se dodaje prirodna boja (šećerni kuler), te prilagodi jakost s demineraliziranom vodom na 43 % vol alkohola. Kod proizvodnje žitnog viskija, nakon završenog ošećerenja i vrenja, koje se izvodi jednako kao i kod sladnog viskija, slijedi kontinuirana destilacija prevrele komine, nakon čega se dobije sirovi viski s oko 90 % vol. etanola. Aroma ovog viskija je daleko blaža nego aroma sladnog viskija, a i proces zrenja traje kraće vrijeme. Proizvodnja ostalih vrsta viskija ne razlikuje se znatno od opisanog postupka proizvodnje škotskog viskija; česte su jedino promjene s obzirom na vrste upotrebljenih sirovina, načine sušenja slada, ošećerenja ili destilacije. Rezultati tih promjena su proizvodi koji se međusobno razlikuju u većoj ili manjoj mjeri. Točni propisi proizvodnje svih vrsta viskija su poslovna tajna. Proizvodnju viskija podrobno su opisali Reed i Nagodawithama (1991). 6.3.2.2. Vodka Vodka je jedna od najpopularnijih žitnih destiliranih rakija u Europi i svijetu. Vodka je ustvari s vodom razrijeđeni vrlo čisti alkohol, a sadrži 35-50 % vol etanola. Međutim, većina današnjih vodki sadrži 40 % vol etanola. Ime vodka potječe od slavenske riječi voda pa je porijeklo vodke vjerojatno Rusija ili Poljska. Postoje zapisi iz 14. stoljeća o proizvodnji vodke u Rusiji, gdje je 1540. godine car Ivan Grozni utvrdio prvi državni monopol. Kasnije, početkom 20. stoljeća je ″Vodka moskovskaja″ proizvedena iz raži postala standard vrlo kvalitetne vodke. Preteča vodke u Poljskoj je bio destilat «okawita», što potječe vjerojatno od latinske riječi ″aquavitae″, početkom XV stoljeća, a koristio se za medicinske svrhe i pića. Vodka se proizvodi iz žitarica (raž, kukuruz, pšenica, ječmeni slad), krumpira i ponekad iz melase. Proizvodnja vodke u Poljskoj temelji se na krumpiru, dok je u Rusiji glavna sirovina kukuruz (Murtagh, 1999). Budući da su sirovine za proizvodnju vodke žitarice ili krumpir, prije fermentacije se mora provesti ošećerenje škroba sadržanog u supstratu. To se najčešće izvodi s pomoću slada ili s amilolitičkim enzimima. Nakon završenog alkoholnog vrenja, prevrela komina se destilira na poseban način, kako bi se postigla potrebna čistoća i mekoća alkohola. Destilacija i rektifikacija se provode kontinuirano u destilacijskim kolonama, na više podova. Naročito pažljivim izvođenjem destilacije i rektifikacije (3-5 kolona), te filtriranjem destilata kroz aktivni ugljen, dobije se alkohol takve čistoće, da se nakon razrjeđenja s demineraliziranom vodom može odmah koristiti kao gotov proizvod. Danas se sve češće proizvodi vodka iz kukuruza jer je najjeftinija. Vodki se mogu dodati različiti dodaci pa postoje nekoliko tipova vodki:
189
Starka (eng. old) je stara vodka duge tradicije. Uglavnom se proizvodi u Poljskoj. Proizvodi se iz raži i sadrži 43 % vol. alkohola. Može se aromatizirati s različitim dodacima (suho voće i lišće različitih biljaka). Neki proizvodi koriste hrastove bačve za odležavanje proizvoda. Limonnaya je vodka s dodatkom limuna i malo šećera. Proizvodi se u Rusiji iz pšenice i sadrži 40 % vol alkohola. Zubrovka je vodka aromatizirana s bizonskom travom koja raste u šumi Bialowieza, poljskom nacionalnom parku. Osnovna sirovina za njenu proizvodnju je raž.. Sadrži 40 % vol. alkohola. Petrovska je vodka aromatizirana s zrnjem crnog papra i ljuskom crvenog papra. Kubanskaya je vodka s dodatkom limuna i narančine kore. Proizvodi se u Rusiji iz pšenice i sadrži 40 % vol. alkohola. Za vodku ne postoji univerzalna klasifikacija. Međutim, pojedine države imaju svoju kategorizaciju prema kvaliteti. Tako npr. u Poljskoj postoje tri tipa vodki: luksuzowy je najkvalitetnija vrsta (deluxe); wyborowy je vrlo kvalitetna vodka (premium) i zwykly, je obična vodka. Slična klasifikacija, prema kvaliteti postoji i u Rusiji i Skandinaviji. 6.3.2.3. Genever i gin Genever je nacionalna nizozemska rakija, koju su Nizozemci počeli proizvoditi u 17. stoljeću, dok se gin počeo proizvoditi nešto kasnije, najprije u Engleskoj također kao nacionalno piće. Ustvari, mnogi povjesničari smatraju da je gin mlađi brat genevera. Genever se proizvodi i pod nazivom Jenever, uglavnom u Belgiji i Nizozemskoj. Genever je razvio fizičar i kemičar Sylvius de Bouve, najprije kao medicinski preparat, koji je ubrzo zbog svog djelovanja postao vrlo popularan. Dr. Sylvius je razradio destilaciju. Kasnije je proizvod unaprijeđen dodatkom borovice i drugog aromatičnog bilja. Poznata su dva osnovna tipa genevera; mladi genever (eng. young), što je blago aromatizirana rakija i stari genever (eng. old), jače aromatiziran i odležan. U Nizozemskoj se najviše proizvodi stari genever, koji se proizvodi iz slada ili miješanjem mljevenog kukuruza, raženog brašna i ječmenog slada u jednakim omjerima. Proces saharifikacije, odnosno razgradnje škroba u fermentabilne šećere, provodi se kao pri proizvodnji piva, ali u novije vrijeme i s dodatakom amilolitičkih enzima. Ošećerena komina se filtrira kako bi se dobila bistra sladovina koja odlazi na fermentaciju. Fermentacija se odvija dodatkom selekcioniranog kvasca. Nakon 3-4 dana fermenitiranoj sladovini s oko 6 % alkohola dodaje se svježe ošećerena profiltrirana sladovina kako bi se na kraju fermentacije dobilo oko 11 % alkohola. Takva fermentirana sladovina, odlazi na destilaciju. Dakle, stari genever se proizvodi iz slada ili žitarica. S druge strane, mladi genever se počeo proizvoditi u 20. stoljeću, sadrži najviše 15 % sladnog alkohola, a ostalo je fini rafinirani alkohol. Sadrži 10 g/L šećera, svjetliji je i suhlji od starog genevera. Postoji i tradicionalni ″Korenvijn″ koji se proizvodi po starim recepturama i sadrži uglavnom sladni alkohol (najmanje 50-70 % vol.). Nakon priprave odležava nekoliko godina u hrastovim bačvama. Originalni genever se je destilirao šaržno iz sladnog vina (piva). Destilatu je dodavana borovica i drugi začini. U današnje vrijeme destilacija se obavlja u destilacionim kolonama, kao i kod većine žitnih rakija. Destilatu se dodaje borovica i različite aromatične biljke ili gotovi ekstrakti pripremljeni iz borovice i drugog začinskog bilja. Gin je engleska modifikacija nizozemskog genevera. To je poznato nacionalno piće u Engleskoj, premda se proizvodi u cijelom svijetu (SAD, Njemačka, Kanada i dr.). Alkohol se za pripravu kvalitetnog gina proizvodi iz pšenice, ječma i raži, a ponekad iz melase. Nakon meljave žitarica, dobijena krupica se pomiješa sa vodom, zagrije i
190
klajsterificira te ostavi stajati tako da se škrob djelomično ošećeri s pomoću prisutnih enzima. Daljnje ošećerenje se nastavlja s dodatkom od 15% suhog slada, koji sadrži amilolitičke i proteolitičke enzime uz zagrijavanje do temperature od 56 0C. Kada je ošećerenje završeno, smjesa se naglo ohladi do temperature alkoholne fermentacije, a zatim inokulira prethodno uzgojenim kvascem. Nakon nekoliko dana, vrenje je završeno i prevrela komina se zatim destilira. Dobiveni sirovi destilat se još jednom destilira i pri tome se uzima samo srednja frakcija koja ima karakterističan miris i okus po upotrebljenoj sirovini. Prilikom druge destilacije, u kotao se stavljaju određene aromatske tvari (najviše borovica) koja proizvodu daje karakterističnu aromu. Količine i vrste dodanih aromatskih tvari variraju pa se ovisno o tome dobivaju proizvodi različitih svojstava. Gin poznatih svjetskih proizvođača proizvodi se iz žitnih destilata i odgovarajućih mirodija. Poznate vrste gina su: gin (40 % vol. alkohola); suhi gin (42 % vol. alkohola) i ekstra suhi gin (minimalno 43 % vol. alkohola). Međutim postoji i druga, vjerojatno engleska klasifikacija: London dry gin, Plymouth gin i Old Tom gin. London dry gin je kvalitetan gin, koji je dominantan u Engleskoj, SAD-u, Španjolskoj i bivišim engleskim kolonijama, karakterističnog je okusa i mirisa. Plymouth gin je jače aromatiziran od londonskog i punijeg je okusa. Proizvodi se danas samo u jednoj destileriji u Plymouthu. Old Tom gin je vjerojatno zadnji gin koji se proizvodi po originalnim recepturama iz 18. stoljeća. Vrlo je popularan, tako da mnogo pubova u UK nose naziv «Old Tom». Za razliku od genevera (ili jenevera), većina sirovih destilata koji se koriste za proizvodnju gina nemaju jaku aromu po žitaricama. Zato se osim borovice, u kotao za drugu destilaciju obavezno stavljaju različite druge aromatske tvari (muškatni oraščić, korijen angelike, kora gorke i slatke naranče). Zbog dodatka aromatskih tvari, genever i gin se istovremeno smatraju i aromatiziranim rakijama (Murtagh, 1999).
6.3.3. Šećerne rakije Šećerne rakije su rakije koje se proizvode iz sirovina koje sadrže isključivo saharozu ili invertni šećer (fruktozu i glukozu). Takve sirovine su sokovi šećerne trske ili melasa (zaostala nakon proizvodnje šećera). Najpoznatije šećerne rakije su rum i arrak. Najpozantiji proizvođaći ruma su Kuba, Jamajka, Portoriko, Barbados, Dominikanska Republika i južni djelovi SAD-a. Arrack se proizvodi u azijskim zemljama Srednjeg i Dalekog Istoka (Sirija, Jordan, Indija Bangladeš). 6.3.3.1. Rum Prema literaturnim podacima, prva destilacija ruma počinje u “Mount Gay Distillery” na Barabadosu 1663. Međutim, rum se prvi put spominje u uredbi guvernera Jamajke 1661. godine. Stoga se može reći da je domovina ruma Jamajka ili Barbados, iako se originalni (domaći) rum priprema i na ostalim otocima u Karipskom moru (Kuba, Haiti, Puerto Rico, Barbados, Martinique). Kasnije se rum počeo proizvoditi u mnogim zemljama svijeta (Brazil, Australia, Djevičanski otoci, New england-SAD, Kanada). Oko 1800 godine na Jamajki je bilo više od 1000 malih samostalnih proizvođača ruma, a danas ih ima samo 20-tak. Naime, razvojem proizvodnje ruma zatvarale su se male domaće, a otvarale velike tvornice. Postoje četiri glavna tipa ruma: -Laki rum tipa brandy (Kuba), poznat također kao “srebrni” ili “bijeli” rum. Svijetle je boje, slatkastog okusa i slabog mirisa. Proizvodi se iz soka šećerne trske ili iz melase. Obično ima kratak period starenja.
191
-Zlatni rum. Nekoliko godina se skladišti u hrastovim bačvama zbog čega ima tamniju boju. -Aromatizirani rum. Sadrži dodatak ekstrakta nekog voća (mango, naranča, kokosov orah). Sadrži najmanje 40 % vol. alkohola. -Premium rum. Vrlo dugo se čuva u hrastovim bačvama. Karakteristike su mu slične konjaku ili škotskom viskiju. Sirovine za proizvodnju kvalitetnog ruma su čisti šećerni sirup dobiven iz šećerne trske ili sirovi sok dobiven prešanjem šećerne trske u posebnim mlinovima, katkad pomješan s melasom. Šećernim sirupima se često dodaju još i različite frakcije iz proizvodnje šećera i melase te zaostaci od prethodnih destilacija, što daje određenu aromu konačnom proizvodu. Rum se u manjim količinama proizvodi i iz melase, ali je lošije kvalitete od ruma koji se proizvodi iz šećernih sirupa. Fermentacija. Supstrat (tršćani sok ili razrijeđena melasa) koji sadrži 10-15 % šećera, inokulira se sa određenom količinom kvasca S. cerevisiae i fermentira pri temperaturi 3033 0C. Ta fermentacija traje, ovisno o količini dodanog kvasca, 2-4 dana. Ako se podloga ne sterilizira, namnoži se relativno velik broj različitih bakterija (mliječnih i octenih) koje proizvode kiseline koje u tijeku zrenja reagiraju s alkoholom i daju estere ugodne arome. Jedna od starijih fermentacijskih posuda prikazana je na slici 6.11. Danas se naravno koriste suvremeni bioreaktori, gdje se fermentacija obavlja u aseptičnim uvjetima. Ti bioreaktori su slični onima iz proizvodnje alkohola, vina ili piva.
Slika 6.11. Fermentacijska posuda u domaćim pecarama Nakon vrenja slijedi destilacija prevrele komine. Destilacija se obavlja na različite načine, šaržno, ili češće kontinuirano (slika 6.12).
192
Slika 6.12. Destilacione kolone za proizvodnju ruma Zrenje sirovog ruma traje relativno dugo, ovisno o kvaliteti. Često se obavlja u hrastovim bačvama i traje najmanje 3 godine (slika 6.13). Veličina bačvi ovisi najčešće o kapacitetu tvornice.
Slika 6.13. Hrastove bačve za zrenje i čuvanje ruma (Murtagh, 1999, Reed, 1991) 6.3.3.2. Arrack Arrack se proizvodi na otoku Javi (Indonezija). Zapisi o proizvodnji arraka stari su približno 380 godina, iz razdoblja dolaska prvih Nizozemaca na taj otok. Arrack se proizvodi iz sirovine koja se sastoji od smjese trščane melase i riže koja se podvrgava slađenju. Proces proizvodnje slada od riže istovjetan je dobivanju ječmenog
193
slada. Tijekom klijanja riže, razvija se specifična mikroflora. Naime, na proklijalim zrnima riže rastu brojne plijesni (Mucor rouxii, Aspergillus oryzae Rhizopus oryzae) a također i kvasci. Međutim, slad od riže se ne suši, već se zeleni rižin slad melje i zagrijava na 60 oC radi ošećerenja. U ošećerenu kominu od rižina slada dodaje se melasa šećerne trske do koncentracije šećera od 25 %. Vrenje tako načinjene smjese je rezultat simbioze pljesni i kvasaca. K tome se još kod nekih tipova dodaju različite aromatske tvari ili sokovi različitog voća (banana, datula i dr.). Glavna fermentacija traje nekoliko dana. Prevrela komina se preša da se odstrani kom. Bistra i djelomično prevrela komina se sprema u drvene bačve na tzv. naknadno vrenje koje traje oko 10 dana. Prevrela arrakova komina koja sadrži minimalno 12 % vol. alkohola se potom destilira (Anon 6, 2008). Destilacija se izvodi kontinuirano u kolonama koje se zagrijavaju vodenom parom. Zrenje u bačvama od stare tikovine traje oko pola godine ili dulje.
6.4. PROIZVODNJA AROMATIZIRANIH RAKIJA I LIKERA Aromatizirane rakije su proizvodi dobiveni aromatiziranjem vinskog destilata i rakija raznim plodovima (voće, aromatsko bilje, njihovi macerati i eterična ulja). One se mogu proizvesti i tako da se voćnom ili grožđanom masulju ili soku dodaju izgnječeni svježi plodovi ili mljeveno aromatsko bilje prije fermentacije. U Hrvatskoj su poznate aromatizirane rakije travarica, komovica, orahovica. Ove rakije se često podvrgavaju procesu zrenja (NN/172/2004). Orahovica se zbog velikog sadržaja šećera može svrstati također u voćni liker.
6.4.1.Travarica Travarica je tradicionalno alkoholno piće mediteranskih država (Italija, Grčka, Hrvatska). Travarica se proizvodi od vinskog destilata i macerata aromatskog ljekovitog bilja. Ugodan okus i karakteristična aroma aromatskog bilja ovom proizvodu daju posebna svojstva prirodnih aperitiva. To je proizvod koji spada i u kategoriju specijalnih rakija. Za aromatiziranje i/ili spravljanje macerata travarice upotrebljava se odabrano aromatsko bilje (komorač, ružmarin, metvica, majčina dušica, kadulja) u količini i sastavu prema vlastitim recepturama proizvođača s osnovnom karakteristikom da prevladavaju aromatske komponente karakteristične za goransko-mediteransko podneblje. Lagano obojenje ovog proizvoda potječe od dodanih macerata aromatskog bilja, a proizvod može sadržavati dijelove biljaka s kojima je aromatiziran. Osnovna sirovina (vinski destilat ili rakija od grožđa ili voća) mora udovoljavati zahtjevima kvalitete sukladno posebnim propisima (NN/172/2004).
6.4.2. Komovica Komovica se koristi kao temeljna rakija za proizvodnju travarice, orahovice i domaćih likera. U zemljama s razvijenom vinogradarskom proizvodnjom, komovica je cijenjeno alkoholno piće (talijanska «grappa»; francuski «mare»). Grožđani kom, sirovina od koje se poizvodi ta rakija sastoji se od kožice i sjemenki bobica. Ovisno o načinu tiještenja, kom je više ili manje vlažan. Sadržaj suhe tvari kreće se od 34-50 %, ovisno o sorti grožđa i načinu prerade. Ukomljavanje koma potrebno je
194
obaviti dodatkom vode, samo sa 20 % obujma koma. Zajedno sa vodom, komu se postupno dodaje matična kultura kvasca čime se ubrzava vrenje. Najbrže vrenje odvija se na temperaturi 25-30 0C i traje 10-14 dana. Destilaciju je potrebno obaviti najkasnije mjesec dana nakon završenog vrenja. Prilikom punjenja kotla za destilaciju, potrebno je dodati do 30 % vode da prevrela komina ne zagori. Komovicu proizvedenu od grožđa s izrazito sortnom aromom čuva se u staklenim posudama. Time će aroma ostati sačuvana, a rakija će biti bezbojna. Rakiju od manje vrijednih sorti grožđa treba držati u hrastovim bačvama gdje će se aromatizirati i poprimiti zlatno-žutu boju.
6.4.3. Komovica s kupinom ili ribizlom Plodovi divlje kupine bogati su taninom i prirodno vezanim željezom pa su poznati lijek protiv anemije i probavnih smetnji. Zato se u novije vrijeme sve više koriste za proizvodnju kupinovog vina i aromatičnih rakija. U pripremi rakije se najčešće dodaje ekstrakt kupina a ponekad i šećer. Isto tako, komovici se dodaje i ribizl. Ribizl je poznato bobičasto voće s bogatim sadržajem vitamina C. Za pripremu pića, oko 100-200 g zrelih bobica se stavi u litrenu bocu i nadolije komovicom. Za pripravu većih količina dodaje se proporcionlna količina bobica ribizla. Nakon izvjesnog vremena rakija je spremna za konzumiranje.
6.4.4. Ostale aromatizirane rakije Neke rakije imaju karakterističnu aromu koja dolazi samo od jedne ili dviju komponenata, u stvari začina, koji se dodaju čistom razrijeđenom alkoholu. U tom slučaju govori se o aromatiziranim alkoholnim rakijama. Vrste začina s kojim se aromatizira razrijeđeni alkohol, razlikuje se od slučaja do slučaja i ustvari su lokalnog karaktera. U nordijskim zemljama poznata je takva rakija pod nazivom “Aquavit”. Aquavit kao i vodka, se destilira iz prefermentiranog ošećerenog krumpira ili žitarica. Rektificiranom destilatu (alkoholu) se doda različito aromatsko bilje (sjeme kumina, anisa ili kopra. Aquavit, ovisno o vremenu stajanja u hrastovim bačvama može biti svijetlo žut do svijetlo smeđ (Anon 7, 2008). Poznate su i aromatizirane rakije tipa vodka (Wiborovka i dr). Vrlo cjenjena aromatizirana rakija je također i arak, piće koje se proizvodi uglavnom u istočnim mediteranskim zemljama (Irak, Jordan, Libanon i Sirija). To je bistro, bezbojno neslađeno aromatično destilirano piće. Riječ “arak” potiće od arapske riječi “araq”. Proizvodi se destilacijom (jednom ili dvostrukom) profermentiranog grožđa. Nakon druge destilacije, u alkohol se dodaje sjeme anisa i ponovo predestilira. Količina dodanog anisa nakon druge destilacije ima direktan utjecaj na kvalitetu araka (Anon 7, 2008). U Turskoj i drugim zemljama koje su dugo vremena bile u sastavu turskog carstva (Grčka, Bugarska, Makedonija) proizvodi se mastika. Ime mastika, koja je po našem pravilniku zapravo slatki liker, potječe od biljne smole (Mastix) koju ispušta jedna vrsta pistacija s grčkog otoka, a koristi se u proizvodnji grčke mastike (Križanić, 2002). U današnjoj Turskoj, mastika se proizvodi pod nazivom ″RAKI″ od komovice ili rakije od smokava i sadrži 50 % vol. ili više alkohola. Postupak za dobivanje prave mastike je slijedeći: svježe smokve se melju, a kaša razrijedi vodom (oko 20 % suhe tvari). Razrijeđenoj kaši dodaje se odgovarajuća količina kvasca za vrenje. Fermentacija se odvija na 30 0C, a prekida se kad gustoća (suha tvar) komine padne na 8-10 %, te se potom destilira. Dobiva se sirova mastika ili tzv. ″soma″. Somi se dodaje vlažno sjemenje anisa (5-10 kg anisa na 100 L some). Koncentracija alkohola u somi koja se ponovo 195
destilira je približno je 45 % vol. Tijekom destilacije, uzima se samo tzv. srednji tok, koji ima koncentraciju alkohola 75-81 % vol. Destilat leži u hrastovim bačvama najmanje tri mjeseca. Dodaje mu se šećer (4-6 g/L) i razrijedi s vodom na predviđenu jakost alkohola (45-50 % vol.). Slićna proizvodnja vrši se i u Bugarskoj. Jedina razlika od turske rakije je po količini šećera (više od 200 g/L šećera) te dodatku drugih mirodija (komorač).
6.4.5. Likeri Likeri su alkoholna pića s manjim postotkom alkohola (od 15-35 % vol.), a sadrže najmanje 100 g/L šećera. Općenito, to su pića proizvedena mješanjem prirodnih rakija ili rafiniranog etanola sa šećerom, vodom, eteričnm uljima, mlijekom, jajima, kavom, čokoladom, a najčešće s voćnim sokovima. Razlikuju se po volumnom udjelu alkohola, ekstraktu, dodacima, boji, okusu i mirisu. Dijele se prema sastavu, osnovnim svojstvima i načinu proizvodnje: na slatke, gorke i specijalne likere (Pravilnik EU, 1989; NN/172/2004). 6.4.5.1. Slatki likeri Slatki likeri se dijele na podskupine i to voćni, likeri s aromom voća, likeri od aromatičnih destilata, aromatizirani likeri i likeri od čokolade, čaja, kakaa i kave. Svi slatki likeri sadrže preko 150 g/L šećera. Voćni likeri: imaju svojstven okus i miris po voću od kojeg su napravljeni. Proizvode se od voćnog soka ili macerata voća, alkohola i šećera. Tu spadaju likeri od višanja, marelica, krušaka, oraha, itd. Najpoznatiji predstavnici ove skupine su orahovac i cherry brandy. Orahovac je liker koji poput svih voćnih likera nema veliki postotak alkohola (oko 20 %). Tamne je boje, gust, a okus je kombinacija slatkog i gorkog prožet mirisom mirodija. Proizvodi se na slijedeći naćin: Zeleni plodovi oraha beru se početkom srpnja, režu i suše. Tako pripremljeni plodovi maceriraju se u komovici kojoj se doda đumbir, klinčić i cimet. Zatim se stavi gusti šećerni sirup. Zatvorene posude drže se na suncu mjesec dana, potom se takav proizvod profiltrira. Bistri proizvod se puni u boce različitih veličina. Cherry brandy se proizvodi maceracijom plodova višnje maraske sa šećerom (200 g/L) u čistom etanolu pri sobnoj temperaturi tijekom 4-5 tjedana. Nakon filtriranja, macerat dozrijeva u zatvorenim bocama 2-3 mjeseca. Piće sadrži 31 % etanola. Likeri s aromom voća dobivaju se na bazi prirodnih voćnih aroma pomješanih s alkoholom, šećerom i destiliranom vodom. Imaju svojstven miris i okus voća od kojeg su proizvedeni. U tu skupinu spadaju likeri s aromom višnje, naranče, oraha i limuna. Volumni udio alkohola je od 25-40 % vol. Likeri od aromatičnih destilata proizvode se od destilata voća ili macerata prirodnih tvorevina sa šećerom i destiliranom vodom. U tim likerima, udio alkohola kreće se od 3550 % vol. Često su nazivi poznatih aromatičnih likera zakonom zaštićeni. Najpoznatiji liker u Hrvatskoj je maraskino. Načinjen je od destilata višnje maraske. To je originalan hrvatski proizvod, a ujedno je i simbol stoljetnog iskustva. Na početku XVI. st. u dominikanskom samostanu stvoren je liker kojeg su prvi pravili ljekarnici tog samostana. Liker su nazvali “rosalj” od riječi ros-solis, što znači sunčana rosa. Upravo zbog tog starog naziva, mnogi miješaju dubrovačku Ruzolinu (liker od ruža) s Rosaljom, starim nazivom maraskina. Ljekarnici su zapisali recepturu autentičnog likera koji se dobiva iz esencije zrelih plodova višnje maraske i lišća mladih grančica. U početku se taj ljekoviti liker pio samo kao lijek. Tek pojavom manufakture u XVII. st. mnogi su upoznali čari tog likera. Već u slijedećem stoljeću pio se u mnogim europskim dvorovima: bečkom, 196
berlinskom, talijanskom, engleskom, danskom i belgijskom. Kasnije je morskim putem stigao u Ameriku, Afriku i Australiju. O kvaliteti tog likera govori i činjenica da ga je Napoleon Bonaparte redovito pio poslije ručka i večere. Maraskino, piće bogatih, služilo se i na prvoj plovidbi, a ujedno i poslijednoj čuvenog broda Titanica. I dan danas, taj je liker zadržao svoju izvornu kvalitetu, a pravi se po tradicionalnoj recepturi od dalmatinske višnje maraske. Liker ima poseban buke jer je destilat oplemenjen maceracijom nekih mirisnih planinskih (brdskih trava) trava. Recept je tajna proizvođača pa je stoga i zakonom zaštićen. Aromatizirani likeri su dobiveni na osnovi eteričnih ulja, umjetnih esencija i aroma pomješanih sa šećerom, destiliranom vodom i etilnim alkoholom. Udio alkohola je od 2540 % vol. U tu skupinu spadaju likeri od anisa, kima i mentola. Likeri od čokolade, čaja, kakaa i kave dobivaju se maceracijom (postupak namakanja sirovine u vodi radi bubrenja i smekšavanja sirovine). Dobijeni sastojci pomješani s etanolom, šećerom i destiliranom vodom imaju svojstven okus i miris po korištenoj sirovini, a sadrže 20-40 % vol. alkohola. Često se upotrebljavaju umjetne boje, ali to mora biti navedeno na deklaraciji. 6.4.5.2. Gorki likeri Gorki likeri proizvode se ekstraktacijom aromatičnih i gorkih djelova biljaka u rafiniranom alkoholu ili dodatkom prirodnih esencija koji su svojstveni za pojedinu vrstu likera. Ti likeri povoljno djeluju na otvaranje apetita pa ih stoga zovu aperitivni likeri. U Hrvatskoj su najpoznatiji likeri bermet, pelinkovac, vlahovac i biter. Za pripremu bermeta koristi se crno vino. Naime, tijekom fermentacije u slatki mošt se urone platnene vreće koje sadrže različite mirodije (pelin, narančina kora, limunova kora, cimet i divlji peršin). Maceracija mirodija u slatkom moštu traje oko tjedan dana. Nakon provedene maceracije, inokulira se dobiven aromatiziran mošt s vinskim kvascem. Nakon fermentacije, daljnji postupak provodi se kao kod proizvodnje i obrade mladog vina. Sličan postupak je i kod proizvodnje pelinkovca. Pelinkovac može biti gorak s manje šećera i slatki s više šećera. Naziv biter je nastao od engleske riječi “bitter” što znači gorak-trpak i ujedno je zajedničko ime za jaka alkoholna pića kojima su osnovne sirovine kora, korjen, lišće i plodovi raznih biljaka (cimet, gorčika, kinin). (Križanić, 2002). 6.4.5.3. Specijalni likeri Specijalni likeri se proizvode specijalnim tehnološkim postupkom i zato se razlikuju od ostalih likera. Dijele se na Koridijal likere koji se proizvode od vina, vinskog destilata, etanola, šećera i destilirane vode i na Emulzijske likere koji se proizvode od žumanjca kokošjih jaja, mlijeka, kakaoa, etanola, šećera i destilirane vode. Jako su gusti, a volumni udio alkohola je manji od 18 %. Takvo poznato piće je punč. To je miješavina ruma, šećera, limunske kiseline, destilata limuna ili naranče, destilirane vode i etanola.
197
6.5. OSTALE SIROVINE U PROIZVODNJI JAKIH ALKOHOLNIH PIĆA 6.5.1. Alkohol Osnovni sastojak većine jakih alkoholnih pića je rafinirani etilni alkohol koji se proizvodi destilacijom i rektifikacijom prevrelih komina. Zahtjevi koje mora ispunjavati alkohol za proizvodnju JAP prikazani su u tablici 6.3. (NN/172/2004). Tablica 6.3. Zahtjevi za kakvoću alkohola u proizvodnji JAP-a Zahtjevi Pokazatelji kakvoće organoleptička svojstva miris i okus sirovine iz koje potjeće ukupna kiselost 1,5 g/hL (preračunato na octenu kiselinu i 100 % vol. EtOH) esteri 1,3 g/hL (preračunato na etil acetat i 100 % vol.. EtOH) aldehidi 0,5 g/hL (preračunato na acetaldehid i 100 % vol. EtOH) viši alkoholi 0,5 g/hL (preračunato na metil-2-propanol-1 i 100 % vol. EtOH) metanol 50 mg/hL (preračunato na 100 % vol. EtOH) hlapljive baze sa 0,1 g/hL (preračunato na 100 % vol. EtOH) dušikom suhi ekstrakt 1,5 g/hL (preračunato na 100 % vol. EtOH) furfural ne smije sadržavati Za proizvodnju JAP-a preporučuje se alkohol proizveden iz žitarica (kukuruz, ječam, raž) i krumpira. Alkohol dobiven iz melase je manje vrijedan za proizvodnju alkoholnih pića pa se ne može koristiti za proizvodnju vodke ili gina. Za proizvodnju jakih alkoholnih pića mora se koristiti rafinirani alkohol. U suvremenim pogonima, destilacija i rektifikacija se obavlja u 5-7 kolona koje rade kontinuirano. Takav alkohol je potpuno bistar, blagog mirisa i neutralan.
6.5.2. Destilati prevrelih voćnih komina Destilati prevrelih voćnih komina (rakije) također su izvor etanola u sastavu jakih alkoholnih pića. Proizvode se destilacijom i rektifikacijom prevrelih voćnih komina, kao što je prethodno opisano. Destilat sadrži 66 – 72 % vol. etanola.
6.5.3. Destilati neprevrelog (maceriranog) voća U proizvodnji jakih alkoholnih pića su to vrlo cijenjeni destilati. Proizvode se maceracijom voća u kvalitetnom rafiniranom alkoholu, te potom destilacijom i rektifikacijom macerata. Ti destilati sadrže 66 – 80 % vol. etanola. Tipični predstavnici ovih vrsta voćnih destilata su maraskino destilat, destilat malina, breskvi i drugog voća.
198
6.5.4. Macerati aromatskog bilja Maceracija je tehnološki postupak ekstrahiranja sastojaka aromatskog bilja, voća ili plodova u destilatu ili etilnom alkoholu pri sobnoj temperaturi. Macerati imaju alkoholnu jakost oko 60 % vol., a proizvode se maceracijom, najčešće raznih djelova osušenog bilja (korjen, kora, list, cijela stabljika, cvjet) u 62 % vol. alkohola.
6.5.5. Destilati aromatskog bilja Proizvode se destilacijom i rektifikacijom macerata aromatskog bilja. Ovi destilati kao i voćni destilati, posjeduju vrlo finu, oplemenjenu aromu bilja iz čijih su macerata proizvedeni, a naročito nakon starenja (odležavanja). Alkoholna jakost tih destilata je 6080 % vol.
6.5.6. Eterična ulja i esencije Eterična ulja su produkti koji se dobivaju uglavnom destilacijom s vodenom parom iz aromatskih bilja koji ta ulja sadrže, a esencije su otopine eteričnih ulja ili otopine smjesa raznih eteričnih ulja i drugih aromatskih supstancija u rafiniranom alkoholu. Upotrebljavaju se također za korekciju aroma kao i za brzu proizvodnju raznih JAP-a. Alkoholna jakost esencija kreće se od 60-80 % vol.
6.5.7. Alkoholizirani voćni sokovi Proizvode se maceracijom voća u alkoholu uz naknadno prešanje. Ovako proizvedeni voćni sokovi sadrže sve arome dotičnog voća. Alkoholna jakost je oko 35 % vol. (Šimić, 1977).
6.5.8. Voda Voda koja se upotrebljava u proizvodnji JAP-a mora ispunjavati slijedeće uvjete: 1. Bakteriološki ispravna, čista, bistra i bezbojna, 2. Bez mirisa i stranih okusa, 3. Bez organskih supstancija, 4. Bez željeza i ostalih metala. Tvrde vode se ne upotrebljavaju jer sadrže karbonate i sulfate, te kalcij i magnezij koji se u alkoholnim otopinama zbog smanjene topivosti, talože. Taloženje tih soli vrši se postepeno i može trajati nekoliko mjeseci, tako da mogu nastati zamućenja u bocama. Meke i čiste bunarske vode mogu se upotrebljavaju jedino ukoliko proizvedeno JAP odstoji u spremnicima par mjeseci kako bi se sve soli istaložile. Kišnica koja se je nekada koristila u toj proizvodnji, jer je skoro istih kvaliteta kao i destilirana voda, danas se usljed zagađenosti atmosfere ne može preporučiti kao potrebna sirovina u proizvodnji JAP-a. Najčešće se koristi destilirana ili omešana ili demineralizirana voda za piće koja udovoljava posebnim propisima o zdravstvenoj ispravnosti vode za piće (bez stranih mirisa i okusa) (NN/172/2004). Naime, takve vode ne sadrže katione (Ca+2, Mg+2, Na+) i teške metale, kao ni anione (HCLO3-, Cl -, SO4-2, NO3-), organske tvari i mikroorganizme.
199
6.5.9. Sredstva za slađenje Za slađenje JAP-a koriste se različiti šećeri, kao što su: saharoza, glukoza i šećerni sirupi. Šećer mora zadovoljavati slijedeće uvjete: 1. Potpuna topivost u vodi, 2. Bez stranih mirisa, 3. Slatkog okusa, 4. Neutralne reakcije. Od šećera se najčešće upotrebljava konzumni šećer saharoza, a zatim glukoza u kristalnim oblicima. Šećer je slabije topiv u alkoholnim otopinama nego u vodi, što je prikazano u tablici 6.4. Tablica 6.4 . Topivost šećera (saharoze) u alkoholnim otopinama pri 20 0C Alkohol (%, vol.) Količina šećera (g) u 100 mL alkohola 90 0,9 80 6,6 70 18,8 60 33,9 50 47,1 40 58,0 30 67,9 20 74,5 10 81,5 Osim saharoze i glukoze također se koristi često i škrobni sirup, kako bi se postigla osim slatkoće, i gušća konzistencija, koja je poželjna kod mnogih JAP-a. Škrobni sirup koji se koristi u proizvodnji JAP-a mora imati slijedeće karakteristike: bezbojan, neutralnog mirisa i okusa i ne smije, u koncentracijama alkohola koje dolaze u obzir u proizvodnji likera, prouzrokovati bilo kakva zamućenja. Kako je škrob hidroliziran do manjih jedinica, ima određenu slatkoću. Međutim, vrijednost zaslađivanja sa škrobnim sirupom je 2 do 3 puta manja od saharoze. Škrobni sirup u proizvodnji JAP-a dodaje se u količini od 5 do maksimalno 10 L/100 L pića. Ne smije ga se dodavati direktno u pića jer se teže otapa. Dodaje se tijekom kuhanja šećernog sirupa
6.5.10. Sredstva za bojenje Mnoga jaka alkoholna pića, posebno ona koja se proizvode destilacijom su bezbojna. Međutim mnogo veći broj JAP-a su pića koja se moraju obojiti raznim prirodnim ili umjetnim tvarima za bojenje u raznim nijansama, a prema zahtijevu tržišta. Boja nekog pića mora biti uvjek ista i jednolikog intenziteta, tako da se i ona pića koja su obojena, u većini slučajeva moraju korigirati do standardne boje. Boje koje se mogu primijeniti za bojanje prehrambenih proizvoda ili JAP-a moraju biti potpuno neškodljive po ljudsko zdravlje, te moraju biti na listi odobrenih bojila za prehrambene proizvode. Boje moraju biti postojane tj. ne smiju mijenjati boju i nijansu tjekom izvjesnog vremena (Križanić, 2002). U proizvodnji JAP-a koriste se prirodne i umjetne boje.
200
Prirodne boje koje se često koriste za bojenje JAP-a ekstrahiraju se iz raznih dijelova bilja (list, korjen, cvijet, drvo). Među najviše upotrebljavane boje iz sirovina prirodnog porijekla spada šećerni kuler (karamel), koji služi za bojanje i korekciju obojenja mnogih pića (konjak, viski, kalvados). Kuler dobiven od glukoze tzv. rum kuler koristi se za bojanje svih vrsta pića kod kojih je dozvoljeno bojanje. Šećerni kuler je tamnosmeđe boje osebujnog i gorkastog okusa, poboljšava aromu u pićima i čini ih blažim. Na tržištu postoje razne vrste kulera ovisno o načinu proizvodnje. Proizvode se kuleri za alkoholna pića male alkoholne jakosti, za ocat, za sirupe i za jaka alkoholna pića. Kuler za JAP mora posjedovati dovoljnu snagu bojenja i biti topiv u alkoholnim tekućinama bez pojave bilo kakvog zamućenja. Mnoge prirodne boje su nepostojane (zelena boja klorofila), naročito ako su izložene svjetlu, pa se rijeđe koriste za korekciju boje pića. Umjetne boje su uglavnom prehrambene boje (crvena, zelena, plava) i uz šećerni kuler najviše se upotrebljavaju u industriji jakih alkoholnih pića (NN 173/2004)
6.5.11. Aromatsko i ljekovito bilje Mnoge biljke sadrže u svojim stanicama aromatske i gorke tvari čije se osobine koriste u proizvodnji jakih alkoholnih pića. Mirodije (osušeno aromatsko i ljekovito bilje) koje se upotrebljavaju u industriji JAP-a osim aromatskih osobina posjeduju i izvjesno fiziološko djelovanje na ljudski organizam. Naime, mnoge mirodije korištene u industriji JAP-a posjeduju slijedeće karakteristike: pojačavanje apetita i pospješenje probave, umirujuće djelovanje i ublažavanje jakih grčeva, diuretsko djelovanje, pobuđivanje znojenja, osvježavajuće djelovanje, jačanje organizma i dezinfekcijsko djelovanje. Neke od mirodija koje se koriste u proizvodnji raznih pića, a posjeduju gore navedena svojstva jesu: anis, kim, kamilica, metvica, ružmarin, pelin, borovica, timijan i mnoge druge. Potrebno je naglasiti da u proizvodnji JAP-a nije svrha proizvesti prvenstveno ljekovita pića, već skladna i prvorazredna pića, ali je pri tom potrebno voditi računa i o fiziološkom djelovanju pojedinih mirodija na ljudski organizam. Od aromatskog bilja koriste se svi dijelovi (korjen, cijela biljka, cvijet, list, sjeme, plod, kora i drvo) već prema tome u kojem se dijelu biljke nalazi najviše aktivnih aromatičnih supstancija. Karakteristike najčešće korištenih aromatskih biljaka u proizvodnji jakih alkoholnih pića prikazuje tablica 6.5. (Križanić, 2002).
201
Tablica 6.5. Aromatsko i ljekovito bilje u proizvodnji jakih alkoholnih pića Bilje Sadržaj Miris/okus Djelovanje Upotreba Anđelika valerijanska i sličan mošusu ublažava dodatak jabučna kiselina, ili vaniliji reumatske likerima kao eterično ulje bolove, macerat ili poboljšava destilat apetit i probavu asparagin, tirozin, izrazito po poboljšava dodatak biljnim Celer eterična ulja celeru apetit, otklanja likerima kao probavne macerat smeđosmetnje žute boje
Kadulja
mentol, terpen, pobuđuje eterična ulja živčani sustav, centar za disanje i srčani mišić gorke supstancije, po kamforu tujon, eterična ulja
Timijan (vrtni)
smole, saponozid
Majčina dušica
Stolisnik
timol, kiseli saponin, glikozid, tanin eterična ulja, derivati kumarina, flavonski glikozidi eterično ulje, gorke tvari, alkaloidi,
Bazga
eterična ulja, holin, antocijan
Paprena metvica
Kamilica
Anis
Borovica
eterično (anetol)
tanin,
ulje
eterično ulje, invertni šećer, gorki tanoglikozid
aromatski, mentolu
po kao macerat i destilat za biljne likere
antisepitčna i kao macerat i antibakterijska destilat za biljne svojstva i gorke likere opor okus, antiseptična kao macerat i miris na timol, svojstva destilat za biljne eterična ulja likere ugodan, napitak kod kao macerat i osvježavajući oboljenja želuca destilat u i crijeva biljnim likerima aromatičan, lječenje probave kao macerat i tipičan za i živčanih destilat za biljne kamilicu poremećaja likere aromatičan, liječenje kao macerat i gorkast ispucalih ruke, destilat za biljne psorijaze i gorke likere specifičan liječenje¸¸ kao macerat i miris, po nazebe, gripe, destilat za biljne bademu glavobolje i gorke likere karakterističan odvodi štetne kao macerat i miris, slatkast sokove iz destilat za okus organizma, čisti aromatizirane krv, jača živce rakije fini, sredstvo za kao macerat i aromaričan preznojavanje destilat za okus specijalne rakije
Za poboljšanje arome pića koristi se također glicerol (glicerin). Topiv je u vodi u svim omjerima. Otapa vrlo dobro obojene supstancije i biljne ekstrakte. Glicerol koji se koristi u industriji JAP-a mora biti čist, rafiniran, bezbojan, viskozan, bez mirisa i slatkastog okusa.
202
6.5.12. Voće, voćni sokovi i plodovi Od voća za proizvodnju voćnih pića, najznačajniji su plodovi višnje, šljive, kruške, jabuke, vinove loze kao i ostalo koštičavo voće. Najkvalitetnija višnja je dalmatinska maraska, od koje se proizvodi iz soka poznato liker Cherry brandy, te od destilata maraske marascino. Također se često koristi i bobičasto voće (malina, kupina, jagoda, crni ribizl, bazga, borovnica). Za sve voćne rakije kao što su šljivovica, breskovača, konjak, kalvados, baza je odgovarajuće voće. Voće za proizvodnju alkoholnih pića mora biti zdravo i potpuno zrelo jer tada sadrži najviše arome i šećera, odnosno senzorske osobine potrebne za korištenje u proizvodnji JAP-a. Voćni sok korišten u proizvodnji JAP-a proizvodi se direktnom mehaničkom preradom zdravog, tehnološki zrelog voća. Boja, aroma, okus i miris voćnog soka moraju biti svojstveni voću od kojeg su proizvedeni.
6.5.13. Eterična ulja Eterična ulja su proizvodi dobiveni najčešće destilacijom s vodenom parom iz aromatskih supstancija sadržanih u bilju. Nalaze se u svim djelovima bilja, u cvijetu, listu, korjenu, stabljici, sjemenu i kori. Eterična ulja su smjesa raznih kemijskih spojeva kao što su ugljikohidrati, alkoholi, aldehidi, ketoni, organske kiseline, esteri, oksidi, dušični spojevi. Eterična ulja se upotrebljavaju za proizvodnju likerskih esencija, kozmetičkih preparata, raznih mirisa i u ljekovite svrhe. Mnogo se koriste i za korekciju arome u svim vrstama likera. Tako se napr. u poznati liker “maraskino” dodaje vrlo mala količina najboljeg bugarskog ružinog ulja čime je aroma maraskina još delikatnija. Kombinacijom raznih eteričnih ulja može se postići izvanredna aroma i miris alkoholnog pića.
6.5.14. Sintetski aromatici Potreba za sintetski dobivenim aromama nastala je prvenstveno zbog mogućnosti njihove uporabe kod namirnica koje zbog duljeg skladištenja izgube svoja aromatska svojstva. Osim toga, sintetski spojevi imaju veliku prednost pred prirodnima s obzirom na njihovu dostupnost u željenim i potrebnim količinama i na njihovu kakvoću. Ujednačena kakvoća umjetnih aroma omogućava njihovu standardizaciju, a njihovom primjenom moguće je mjenjati udjele pojedinih tvari i time kreirati novi aromatski profil nekog proizovda. Ova mogućnost, temelj je uporabe umjetnih aroma u suvremenoj prehrambenoj industriji. Za stvaranje aromatskih kompozicija danas se koristi oko 2000 sintetski dobivenih aromatskih tvari. Većina od njih je dokazana u prirodnom materijalu. Manji dio među njima još nije nađen u prirodi ali je toksikološki ispitan i uvršten na pozitivne liste mnogih zemalja. Najveći porast primjene sintetski dobivenih aromatskih tvari uočen je između 1965 i 1985 g. zahvaljujući napredku na polju instrumentalne analitičke tehnike kao što su GC, GC-MS, HPLC i dr. Zbog izvanrednog napredka na području kemijske sinteze i dobivanju novih spojeva s jedne strane i mogućnosti kompjutorski kontrolirane izolacije i dobivanja čistih prirodnih tvari s druge strane, proizvođačima aroma danas je moguće dobiti aromu vrhunske kakvoće i selektivnosti. Primjena novootkrivenih aromatskih tvari, uglavnom ovisi o poznavanju njihovih organoleptičkih svojstava, njihove komercijalne upotrebljivosti i toksikološke ocjene. To je razlog da će vjerojatno, samo manji broj među njima i zauzeti svoje mjesto u industriji aroma. Dakle, sve arome i mirisi raznog voća i aromatskog bilja mogu se proizvesti kemijskom sintezom, te se većom ili manjom sličnosti približuju originalnim aromama bilja. Ovako
203
proizvedeni umjetni aromatici upotrebljavaju se i u proizvodnji likera. Tako naprimjer, nekada, vrlo traženi aromatizirani liker kruškovac se proizvodi aromatiziranjem etilnog alkohola različitim aromama. Posebno valja istaknuti sintetski proizveden izoamilacetat koji daje kruškovcu miris po kruški. Umjetni rum u Hrvatskoj (domaći rum) proizvodi se od sintetski dobivenog estera etilformijata koji miriše na rum.
6.6. Sastavljanje jakih alkoholnih pića Nakon pripreme svih potrebnih sirovina koje ulaze u sastav JAP-a, sirovine se mješaju u posudama s ugrađenom mješalicom. Takve posude, danas se izgrađuju od nehrđajučeg čelika. Dodavanje pojedinih komponenti koje ulaze u sastav pića, vrši se određenim redoslijedom kojeg se treba držati. Redosljed dodatka komponenti je slijedeći: 1-alkohol; 2-razni macerati i destilati; 3-razne esencije i eterična ulja; 4-ostale komponente koje ne sadrže alkohol; 5-šećerni sirup, 6-glicerin; 7-boje; 8-voda (demineralizirana ). Ukoliko se u piće dodaju esencije ili eterična ulja, potrebno ih je prije otopiti u alkoholu obzirom da u vodi nisu topiva. Količina alkohola za otapanje, određuje se prema topivosti eteričnog ulja. Alkohol za otapanje, izuzme se iz ukupne količine potrebnog alkohola. Također, pri dodatku šećernog sirupa, izuzme se količina vode od ukupno potrebne vode. Isto vrijedi za boje koje se moraju također otopiti u toploj vodi. Opća blok shema tehnološkog procesa proizvodnje jakih alkoholnih pića prikazana je na slici 6.14. demineralizirana voda
boje
destilati, macerati
bonifikatori
alkohol
arome (esencije, eterična ulja) miješanje
šećerni sirup
filtracija
šećerni kuler (KARAMEL
odležavanje
punjenje u boce
Slika 6.14. Blok shema proizvodnje jakih alkoholnih pića
204
LITERATURA Anon 1, (2007). Legenda o maraški. Anon 3, ( 2008).Rakija Viljamovka. Anon 4, (2008). Bavarian Breweries & Distilleries. All rights reserved. Made by Heffernan Engineering,LTD. Anon 5, (2006). A Glossary of Whisky terms Anon 6, (2008).Arrack Anon 7, (2008). Akvavit. Bluhm, L. (1983). Destilled beverages. In: Biotechnology vol 5, Rehm,H.J. and Reed,G.(eds.).VCH Publishing Com., Weinheim, West Germany. Carlsson, C. (2008). Spirits review: Pear William Eau de Vie ( Pear Brandy) . http://www.spiritsreview.com/reviews-eaudevie-westford-pear-will... Christoph, N. and Bauer-Christoph, C. (2007). Flavour and spirit drinks: Raw materials, fermentation, Destilation and Ageing, In: Flavours and Fragrances, 219-239. Springer, Berlin and Heidelberg. Hanson, D.J. (1995). Alcohol around the world.In: Preventing alcohol abuse, 19-69.Amazona.com. publisher, Barnes and Noble.com. Hanson, D.J. (2008). History of alcohol and drinking around the world. International information.1-14, . Koscica, M. (2004). Cognac, the elixir of the Gods, TED Case Studies, No 728. 231 Nostrand Reinhold, NewYork. Križanić,J. (1995): Svijet pića, Ur. Z. Mršić. Križanić,J. (2002). Priručnik 5 za vinogradare i podrumare, rakije i likere, pića s markom i domaći ocat, Ur. Kugler, H.G. (2005) Elementares ủbers fủnfte elements, World-Spirits Geschichte,1-8. Kunovac, D. (2007). Toksikološki rizici konzumiranja rakije od šljiva proizvedene na tradicionalan način, Magistarski rad, Prehrambeno-tehnološki fakultet Sveučilišta J.J. Strossmayera u Osijeku. Lyons, T.P. (1999). Production of Scotch and Irish whiskies: the history and evolution (138-165), In: The Acohol Textbook, ed. Ka Jarques, TP Lyons and DR Kelsall. Lyons, T.P, and Rose, A.H. (1977). Whisky: In Economic Microbiology, vol 1, Rose (ed.) Academic Press, New York Mattsson, H. (2005), Calvados: The World‛s Premier Apple Brandy, ed. Hardcover Morrison, J.A. (1999), Production of canadian rye whisky of the prairies (170-193) in: The Acohol Textbook, ed. Ka Jarques, TP Lyons and DR Kelsall. Murtagh, J.E. (1999), Feedstock, fermentation and distillation for production of heavy and light rums (244-254), In: The Acohol Textbook, ed. Ka Jarques, TP Lyons and DR Kelsall Murtagh, J.E. (1999), Production of neutral spirits and preparation of gin and vodka (196-210), In: The Acohol Textbook, ed. Ka Jarques, TP Lyons and DR Kelsall. Pravilnik o aditivima RH (NN 173/2004) Pravilnik o jakim alkoholnim i alkoholnim pićima RH (NN 172/2004) Pravilnik EU, (1989). Definition of categories of Alcohol Beverages. Article 1.and 3., Section 4 of the Council regulation No.1576/89. Reed, G. and Nagodawithana,T.W. (1991), Yeast Technology ed..Van Nostrand Reinhold, New York Shackelford, J. (2007), Paracelsus, Healer of the German reformation, Chemical Heritage Newsmagazine,vol. 25, No. 2, (str. 446). Spaho, N. (2007). Efekti presijecanja toka destilacije sirovih destilata šljiva na distribuciju viših alkohola i estera. Doktorska disertacija. Agronomski fakultet Sveučilišta u Sarajevu.
205
Poglavlje 7: PROIZVODNJA PEKARSKOG KVASCA Slobodan Grba
7.1. UVOD Pod pojmom pekarski kvasac podrazumijeva se aktivna kvaščeva biomasa koja se koristi za dizanje tijesta u pekarstvu. Kvasac u tijestu alkoholnom fermentacijom šećera iz brašna proizvodi alkohol i ugljični dioksid koji diže tijesto. Prvi zapisi o proizvodnji kruha datiraju još iz Egipta prije 5.000 godina, a u Bibliji se spominje dizanje tijesta pomoću «sredstva za dizanje», što je vjerojatno bila smjesa kvasaca i bakterija iz roda Lactobacillus. U tom procesu je nakon svakog dizanja ostavljen dio kiselog tijesta za slijedeće dizanje. Proizvodnja pekarskog kvasca je novijeg doba. Ranije se za pekarske svrhe koristio suvišni kvasac iz proizvodnje piva i vina. Početkom proizvodnje pekarskog kvasca smatra se tzv. Dutch-proces 1780. godine kada su nizozemski proizvođači alkohola izdvojeni kvasac počeli koristiti za pekarstvo. Taj se proces nedugo zatim prenio u Njemačku, a 1825. proizvođač Tebbenhof je prvi put proizveo kvaščev kolač (prešani kvasac) pomoću filter preše. U Danskoj 1883. Hansen uvodi čistu kulturu kvasca za industrijske potrebe. Međutim, industrijska proizvodnja pekarskog kvasca počinje krajem 19. stoljeća. Naime, 1880. u Austriji u tzv. «Bečkom procesu « i 1886. u Velikoj Britaniji započinje aerobni uzgoj kvaščeve biomase, na način da se kroz kominu propuhivao zrak. Početkom 20. stoljeća uvodi se gotovo istovremeno u Danskoj i Njemačkoj šaržni postupak s pritokom supstrata (Zulauf), koji se u svom osnovnom obliku primjenjuje i danas. Tim se postupkom poboljšava aerobnost procesa i iskorištenje supstrata. Tijekom I. svjetskog rata, zbog nedostatka žitarica, uvodi se melasa kao osnovni supstrat u proizvodnju pekarskog kvasca. Od tada počinje intenzivan znanstveni napredak u proizvodnji pekarskog kvasca. Napredak se očitovao vrlo brzo u većem iskorištenju supstrata i produktivnosti procesa, te u poboljšanju aktivnosti i stabilnosti (trajnosti) kvaščeve biomase. Potreba za stabilnijim kvascem rezultirala je proizvodnjom suhog aktivnog kvasca, a komercijalna proizvodnja počinje početkom II. svjetskog rata u Australiji i Europi. Sedamdesetih godina 20. stoljeća nizozemski istraživači uvode proizvodnju instant suhog aktivnog kvasca, koji se ne mora rehidratirati prije upotrebe u zamjesu. Danas sav razvijeni svijet koristi kvalitetan pekarski kvasac, ali se još uvijek čine napori za daljnjim poboljšanjem kvalitete kvaščeve biomase, što se prije svega odnosi na automatizaciju i vođenje procesa s pomoću računala, te uvođenje novih vrsta i sojeva kvasaca za posebne pekarske namjene. Fermentacija tijesta u proizvodnji kruha i drugih pekarskih proizvoda je relativno kratak proces, a traje od 30 minuta do 4 sata, ovisno o količini kvasca u tijestu i njegovom aktivitetu. Najčešće se u pekarske zamjese dodaje 1-3 % svježeg pekarskog kvasca . Upotreba kvasca je uglavnom jednokratna, mada postoji i reciklacija, o čemu će biti govora u slijedećem poglavlju. Zbog toga se u svijetu u novije doba proizvode velike količine pekarskog kvasca (cca 2,5x106 tona svježeg kvasca/godinu). Naravno razvijene zemlje troše više pekarskog kvasca, pa je njegova proizvodnja u tim zemljama količinski znatno veća. Povijest proizvodnje pekarskog kvasca detaljno su opisali Burrows (1975) te Reed i Nagodawithama (1991), a proizvodnju suhog aktivnog kvasca Frey (1957) i Langejan (1972; 1982).
206
7.2. PROIZVODNI PROCES – OPĆE POSTAVKE Proces proizvodnje pekarskog kvasca opisali su detaljno White (1954), Burrovs (1970) i Reed i Nagodawithana (1991). Pekarski kvasac se proizvodi na melasi šećerne repe i šećerne trske ili na smjesi te dvije melase (70-80 % melase šećerne repe i 20-30 % melase šećerne trske). Melase su kompleksne sirovine i sadrže, osim izvora ugljika i energije, izvjesnu količinu organskog dušika, sumpora te ostalih minerala i elemenata u tragovima i vitamina. Međutim, za optimalan rast kvaščevih stanica hranjivom supstratu (melasi) se dodaje otopina soli koja sadrži dušik u obliku amonijevih soli i fosfor u obliku fosfatnih soli. Također se dodaju mikro – i makroelementi (minerali) od kojih su dominantni Mg, Zn, Cu i Fe, a od vitamina se obavezno dodaje biotin. Osim melase u novije vrijeme sve više se koristi kukuruzni hidrolizat kao osnovna sirovina za proizvodnju pekarskog kvasca. Hidrolizatu se kao i melasi dodaju otopine soli i vitamini kako bi se pospješio rast kvaščevih stanica. Kvasac se uzgaja u bioreaktorima s regulacijom svih parametara uzgoja. Najčešći broj faza uzgoja (generacija) u pogonu je 4-5. Poslije uzgoja kvasac se izdvaja separacijom, nakon čega se dobije kvaščeva suspenzija sa 18-20 % suhe tvari, što je prvi proizvod (tekući kvasac). Nakon toga, na vakuum filterima se iz kvaščeve suspenzije izdvoji dio vode, a proizvod koji se skida s filtra je kvaščev kolač s oko 30 % suhe tvari. Ta biomasa se preša, oblikuje i pakira, i to je drugi oblik kvasca tzv. svježi prešani kvasac koji se hladi u hladnjačama, nakon čega se odvozi na tržište. Usitnjavanjem kvaščevog kolača i sušenjem u struji kondicioniranog zraka proizvodi se suhi aktivni kvasac koji sadrži 9296 % suhe tvari. Pakira se najčešće pod vakuumom i ne zahtijeva hlađenje tijekom skladištenja i transporta, što je treći oblik pekarskog kvasca. Faze proizvodnje prikazane su u blok shemi (slika 7.1)
Slika 7.1. Osnovna shema proizvodnje različitih oblika (vrsta) pekarskog kvasca na melasi ( Mauri Integrated Ingredients, 1995.).
207
7.3. VRSTE I SOJEVI KVASACA U PROIZVODNJI Za proizvodnju standardnih oblika pekarskog kvasca koriste se uglavnom različiti sojevi kvasca Saccharomyces cerevisiae. Dobro poznatim genetičkim metodama (selekcija, hibridizacija i dr.) dobiveni su sojevi kvasca S. cerevisiae posebnih karakteristika, koji zadovoljavaju zahtjeve suvremenog pekarstva (Kowalski i sur.,1981; Higgins i sur., 2001). Ipak, u proizvodnji prevladavaju dva osnovna tipa kvasca S. cerevisiae. Jedni sojevi imaju nešto nižu inicijalnu aktivnost, ali veću stabilnost tijekom skladištenja, dok drugi imaju višu inicijalnu aktivnost, ali nižu stabilnost (trajnost). Uglavnom su višeg ploiditeta (triploidi do tetraploidi) što im omogućava da posjeduju željena fiziološka svojstva. Ipak, sojevi visokog ploiditeta su prilično nestabilni, pa se najčešće koriste triploidi (Hadfield i sur.,1995). Posebno se ističu sojevi za proizvodnju instant suhog aktivnog kvasca koji posjeduju visoku aktivnost, ali i stabilnost tijekom sušenja (Langejan,1980). S druge strane, postoje tzv. kvasci za specijalne pekarske namjene, kao što su osmotolerantni sojevi za fermentaciju slatkih tijesta, kvasci stabilni tijekom zamrzavanja i skladištenja tijesta pri niskim temperaturama, što se danas sve više primjenjuje u pekarstvu. Osim osnovnog kvasca S. cerevisiae, u nekim razvijenim zemljama za proizvodnju pekarskog kvasca koriste se i druge vrste kvasaca. Tako se u Japanu koristi Torulospora delbrueckii (sinonim Saccharomyces rosei) za fermentaciju slatkih tijesta i za zamrzavanje (Sasaki i Ohshima, 1987; Hernandez-Lopez i sur. ,2007). Osim toga, hibrid kvasaca T. delbrueckii i S. cerevisiae također se koristi kao osmotolerantni kvasac (Lucca i sur.,2004). Pivski kvasac Saccharomyces uvarum koristi se u Italiji za proizvodnju pekarskog kvasca, koji talijanski pekari često koriste u proizvodnji peciva. Sojevi pekarskog kvasca mogu se nabaviti u privatnim i javnim kolekcijama koje navode Kirsop i Kurtzman (1988.). Međutim, proizvodni sojevi mogu se izolirati i iz komercijalnih pekarskih kvasaca, jer su u njima, naravno – žive stanice. Postoje isto tako i patenti koji zaštićuju specijalne sojeve. Zadržavanje patentnog prava ovisi o sposobnosti utvrđivanja specifičnosti pojedinih sojeva, što je u praksi veoma teško.
7.4. PRINCIPI AEROBNOG UZGOJA KVAŠČEVE BIOMASE 7.4.1. Brzina rasta U melasnoj podlozi koja sadrži sve nužne sastojke za rast kvaščevih stanica, i kada je gustoća stanica niska, može se postići maksimalna specifična brzina rasta od 0,6 h -1. Međutim, u proizvodnji pekarskog kvasca specifična brzina rasta se kreće u području 0,1 – 0,3 h-1, jer je zbog ekonomičnosti procesa poželjna visoka koncentracija kvaščevih stanica u komini (kulturi) na kraju procesa, te optimalno iskorištenje supstrata. Tako je u području specifične brzine rasta μ od 0,09 do 0,2 h-1, stupanj konverzije šećera u biomasu optimalan i konstantan. Pri većim brzinama rasta koncentracija supstrata u komini je relativno visoka i omogućuje da dio šećera konvertira u etanol (dugotrajni Crabtree efekt). Tada kvasac proizvodi etanol i u potpuno aerobnim uvjetima. Zato se proces uzgoja pekarskog kvasca vodi s programiranim i kontroliranim pritokom supstrata (vidi: Uzgoj u generaciji Prodajni kvasac, slika 7.11). Uglavnom se smatra, prema većini literaturnih navoda, da koncentracija fermentabilnih šećera ne treba biti veća od 300 mg/L u komini. Tada ne dolazi do katabolitičke represije i Crabtree efekta. Dakle, specifična brzina rasta je ključni kontrolni parametar u industrijskoj proizvodnji pekarskog kvasca.
208
Brzina rasta, pri kojoj se postiže optimalan prinos i dobra svojstva kvaščeve biomase za pekarske svrhe, određuje se eksperimentalno programiranjem pritoka supstrata (melase i otopine soli) u zadanim aerobnim uvjetima. Tako je na početku uzgoja, u generacijama «Velika matica» i «Prodajni kvasac», u eksponencijalnoj fazi rasta najveća brzina rasta. Zatim slijedi, u tim generacijama, linearna faza rasta gdje se specifična brzina rasta postupno smanjuje zbog limitacije s kisikom. Prema literaturnim podacima specifična brzina rasta ne bi trebala biti veća od 0.2-0.28 h-1 ako se želi optimizirati iskorištenje supstrata, što je prikazano na slici 7.2 (Van Hoek i sur, 1998). A) 25
0,6
0,5
0,4 15 0,3 10
Y x/s (g*g-1)
q (etanol) (mmol*g-1*h-1)
20
0,2 Etanol
5
0,1
Y X/S 0
0 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
D (h-1)
B) 60
50
protein (%)
40
30
20
10
0 0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
D (h-1)
Slika 7.2. Prirast kvasca S. cerevisiae DS 28911 (A) i količina proteina (B) u aerobnim uvjetima uzgoja s limitacijom glukoze u kemostatu pri različitim specifičnim brzinama rasta (VanHoek i sur.,1998.).
209
Iz slike 7.2 A se vidi da je pri nižim brzinama rasta koeficijent konverzije supstrata u kvaščevu biomasu konstantan, dok se pri većim brzinama naglo smanjuje zbog prelaska na respiro-fermentativni metabolizam. Također je važno uočiti da se s porastom brzine rasta povećava i udjel proteina u kvaščevim stanicama (slika 7.2 B), što je bitno za fermentacijsku aktivnost kvaščevih stanica. Do istih spoznaja došli su Čović i sur. (1992.) u istraživanjima šaržnog procesa uzgoja pekarskog kvasca s pritokom supstrata, u laboratorijskim i pogonskim uvjetima. U šaržnom procesu s pritokom supstrata za rast kvaščevih stanica vrijedi slijedeća jednadžba: X = Xo eμt gdje je: X - masa kvasca u vremenu t Xo - masa kvasca na početku uzgoja μ - specifična brzina rasta e - baza prirodnog logaritma U eksponencijalnoj fazi rasta konstanta eμ = H, pa jednadžba poprima oblik: X = X0 Ht ako je t=1, H je specifični faktor prirasta kvaščeve biomase u jednom satu Specifični satni prirast H je pogodan za računanje prirasta kvasca, iz čega se izračunava i potrebna količina supstrata za pritok. Tako se prirast kvasca u bilo kojem satu uzgoja, za eksponencijalnu fazu rasta, može izračunati na slijedeći način: ΔXt = Xt – Xt-1 = Xt-1 H – Xt-1 Međutim, u proizvodnim procesima uzgoja pekarskog kvasca μ se mijenja. Naime, kada je uzgoj limitiran s kisikom onda je satni prirast konstantan, a specifična brzina rasta se smanjuje. Na bazi satnih prirasta kvasca može se izračunati potrebna količina hranjivih supstrata (razrijeđena melasa i otopine soli) za cijeli tijek uzgoja. Stoga se mora imati na umu da faktor satnog prirasta nije konstantan tijekom uzgoja, nego se mijenja sa specifičnom brzinom rasta kao što je već opisano.
7.4.2. Potreba kisika i aeracija U proizvodnji kvaščeve biomase, pogotovo u industrijskom mjerilu, koeficijent iskorištenja supstrata se povećava sa aerobnošću procesa. Tako je npr. u anaerobnim uvjetima koeficijet Yx/s malen i iznosi svega 0,075 ili 7,5 kg s.tv. prirasta kvasca na 100 kg šećera. S druge strane, u striktno aerobnim uvjetima koeficijent iskorištenja supstrata iznosi 0,50-0,54 ili 50-54 kg kvasca s.tv. po 100 kg šećera. Osim toga, brzina rasta kvaščevih stanica je veća u aerobnim uvjetima, što je i cilj industrijske proizvodnje, naravno uz minimalnu proizvodnju alkohola. To se postiže na nekoliko načina. Uzgoj kvasca se mora obavljati u uvjetima limitacije izvorom ugljika ili energije (kao što je prethodno opisano), odnosno niske koncentracije šećera u komini (do 0,3 g/L) da se izbjegne katabolitička represija, odnosno Crabtree efekt. Osim toga, specifična brzina rasta mora biti manja od 0,2 h-1 sa efikasnom dobavom kisika. U takvim uvjetima ne nastaje etanol.
210
Dakle, kisik je važan biogeni element u aerobnim biotehnološkim procesima. Mateles (1971.) je proračunao da je za 1 g prirasta suhe tvari kvasca potrebno oko 1g kisika, ako se kvasac uzgaja na šećeru u prisutnosti amonijevih iona kao izvora dušika. U tom smislu veoma su mala odstupanja, ovisna o sastavu kvaščevih stanica. Dobava kisika vrši se aeracijom, jer je topivost kisika veoma mala ( 7-9 mg/L). Dakle, dobava kisika se mora vršiti kontinuirano. Kako je i brzina rasta kvaščevih stanica ovisna o koncentraciji otopljenog kisika, važno je imati efikasne bioreaktore za prijenos kisika, odnosno s visokim volumetrijskim koeficijentom prijenosa kisika. Naime, osim neophodne dobave kisika, potrebno je zadržati u komini što duže vrijeme željenu koncentraciju kisika, kako bi se kvasac razmnožavao dovoljno brzo. Naime, kisik je također supstrat, pa o koncentraciji kisika, prema Michaelis-Mentenskoj zakonitosti ovisi i brzina rasta. Osim toga, važno je napomenuti da mikroorganizmi troše samo otopljeni kisik. U proizvodnji pekarskog kvasca brzina dobave kisika u komini na neki način uvjetuje i produktivnost procesa, odnosno brzinu prirasta kvasca. Obzirom da je za 1 g kvasca potrebno 1g kisika, bioreaktori trebaju imati brzinu prijenosa kisika oko 4-5 gO2/Lh jer je produktivnost procesa u proizvodnji pekarskog kvasca oko 5 g/L h. Sistemi za efikasnu aeraciju su opisani u knjigama iz biokemijskog inženjerstva (Marić, 2008). Najčešće se koriste fermentori s miješalima i ugrađenim odbijačima, iako se koriste i tzv. «Air Lift» bioreaktori (bioreaktori miješani samo sa zrakom). Međutim, u svim bioreaktorima limitacija s kisikom tijekom uzgoja pekarskog kvasca u potpuno aerobnim uvjetima započinje relativno brzo, kao što je prikazano na slici 7.3. Koncentracija otopljenog kisika u bioreaktorima se najčešće određuju kisikovom elektrodom. Na slici 7.4. vidi se koncentracija otopljenog kisika tijekom šaržnog uzgoja pekarskog kvasca s pritokom supstrata. 80
otopljeni kisik (%), X (g/L)
70 60 50 40
otopljeni kisik
30
X
20 10 0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
vrijeme (sati)
Slika 7.3. Koncentracija otopljenog kisika tijekom uzgoja kvasca u bioreaktoru od 125m3 Koncentracija otopljenog kisika smanjuje se s povećanjem prirasta kvaščeve biomase, odnosno s povećanjem pritoka melase. Razlozi za to su, naravno, veća potrošnja kisika te smanjenje topivosti kisika u komini usljed povećanja koncentracije supstrata. Na slici se vidi da u tipičnim industrijskim šaržnim procesima limitacija rasta s kisikom počinje relativno rano, nakon 6-8 sati uzgoja. Od tada je prirast kvaščeve biomase linearan uz 211
konstantno smanjenje specifične brzine rasta. U stvari rast je limitiran dobavom kisika, odnosno aeracijskim sistemom.
7.4.3. Fermentativni metabolizam u aerobnim uvjetima Prisustvo izvora ugljika (šećera) iznad kritičnih vrijednosti i u aerobnim uvjetima dovodi do proizvodnje etanola, odnosno fermentabilnog metabolizma šećera, što nazivamo Crabtree efekt. Kvasac S. cerevisiae je osjetljiv na koncentracije šećera veće od 300 mg/L. Dakle, u uvjetima povišene koncentracije šećera pri čemu je ubrzana glikoliza, nastaje etanol. Ovaj važni fenomen istražili su i opisali mnogi autori (Fiechter i sur. 1987; Van Urk i sur.1989; Postma i sur. 1989) i pronašli kritične vrijednosti glukoze od 3,6 – 210 mg/L. Razlike se mogu odnositi na različite sojeve kvasca S. cerevisiae ili na njihova fiziološka stanja. Danas se smatra da je glikolitski put ubrzan supstratnom aktivacijom enzima fosfofruktokinaze i inhibicijom respiracijskih enzima što dovodi do manje proizvodnje ATP-a koji ne inhibira dovoljno enzim fosfofruktokinazu pa dolazi do ubrzanja glikolize i proizvodnje alkohola. To je temeljni razlog zašto se proizvodnja kvaščeve biomase S. cerevisiae mora voditi s kontroliranim pritokom supstrata da se izbjegne katabolička represija. Za nastajanje etanola, odnosno fermentativni metabolizam, najbolji indikator je respiracijski kvocijent (RQ), koji naglo poraste (slika 7.4). Osim toga, nastali etanol se može registrirati direktnim mjerenjem etanola u komini ili u izlaznim plinovima, na bazi čega se zapravo i vrši regulacija pritoka supstrata (vidi u poglavlju "Proizvodnja kvasca u zadnjim generacijama"). 25
6 qO2 qCO2
5
RQ 4
15 3
RQ
q O 2 , q CO 2 (mmol*g -1*h -1)
20
10 2
5
1
0
0 0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
-1
D (h )
Slika 7.4. Respiratorni kvocijent (RQ), potrošnja kisika (qO2) i proizvodnja CO2 (qCO2) u oksidativnom i fermentativnom metabolizmu kvasca S.cerevisiae (Van Urk,1989)
212
7.5. HRANJIVI SUPSTRAT Osnovna sirovina za proizvodnju pekarskog kvasca je melasa. Dominantna je melasa šećerne repe, ali se koristi i melasa šećerne trske. Također se koristi i njihova smjesa. Ako se koristi smjesa onda se dodaje do 25 % tršćane melase melasi šećerne repe, radi biotina kojeg ima znatno više u tršćanoj melasi. Potrebe različitih sojeva kvasca S. cerevisiae za komercijalnu proizvodnju pekarskog kvasca intenzivno su istražene. Problemi su se odnosili uglavnom na povećanje prinosa i produktivnosti procesa. Međutim, dostupno je mnogo manje informacija koje govore o utjecaju hranjivih sastojaka na kvalitetu gotovog proizvoda. Osim melase za proizviodnju pekarskog kvasca koristi se i kukuruzni hidrolizat a iznimno sirutka. Međutim, melasa je još uvijek dominantan osnovni supstrat u proizvodnji pekarskog kvasca u cijelom svijetu, pa će se u ovom poglavlju raspravljati uglavnom o utjecaju melase, kao osnovnog supstrata, na proces proizvodnje kvaščeve biomase, kao i o dodacima za optimizaciju hranjivog supstrata. Kemijski sastav melasa šećerne repe i šećerne trske prikazan je u tablici 5.2.u poglavlju “Proizvodnja etilnog alkohola”. Melasi šećerne repe često se dodaje 20-25 % melase šećerne trske zbog biotina, jer ima znatno veću količinu tog vitamina od melase šećerne repe, pa se tada ne treba dodavati čisti vitamin. I pored toga, melasa u svim oblicima nije potpun hranjivi supstrat za proizvodnju kvaščeve biomase, pa joj je potrebno prije svega dodati izvore P i N, neke faktore rasta (vitamini B grupe) i neke makro- i mikroelemente.
7.5.1. Izvori ugljika Osnovni šećer u melasi je saharoza, koju kvasac S ceravisiae vrlo brzo metabolizira.Ovaj kvasac koristi i druge šećere: glukozu, fruktozu, manozu i maltotriozu. Osim šećera, kvasac S. cerevisiae u aerobnim uvjetima metabolizira mliječnu, octenu, jantarnu i vinsku kiselinu te etanol. Kvasac S. cerevisiae ima visoku aktivnost enzima invertaze koja vrlo brzo hidrolizira saharozu na glukozu i fruktozu. S druge strane, maltazna aktivnost može biti promijenjiva u kvascu S .cerevisiae. Današnji sojevi kvasca S. cerevisiae visoke fermentativne aktivnosti imaju i visoku konstitutivnu maltaznu aktivnost, te je i razgradnja maltoze znatno brža. Iz kemijskog sastava pojedinih komponenata kvaščevih stanica Harrison (1967.) je izradio empirijsku jednadžbu u molarnim ekvivalentima, koja glasi: 0,585 C12H22O11 + 0,61 NH3 + 3,205 O2 → C3,72H6,11O1,95N0,61 + 4,29 H2O + 3,3 CO2 Iz gornje jednadžbe proizlazi da se iz 200 g saharoze proizvede 100 g suhe tvari kvasca. S druge strane, iz jednadžbe proizlazi da za 100 g s.tv. kvasca treba 102,5 g kisika, te da se za taj prirast oslobodi 1600 kJ. Te vrijednosti se vrlo dobro podudaraju s praktičnim podacima iz proizvodnje pekarskog kvasca na melasi, uz dodatak dušičnih soli.
7.5.2. Izvori dušika i fosfora Kvasci brže troše dušik iz amonijevih soli nego iz pojedinačnih aminokiselina ili iz jednostavne smjese aminokiselina. Aminokiseline kvasac S. cerevisiae troši samo u odsutnosti amonijevih soli. Međutim, dobro izbalansirana smjesa aminokiselina ima prednost pred amonijevim ionima. To vrijedi i za proizvodnju pekarskog kvasca ako se
213
kao osnovni supstrat koristi melasa koja sadrži malu količinu od nekoliko aminokiselina. Dakle, u osnovni supstrat je neophodno dodati amonijeve soli. Od amonijevih soli najčešće se u praksi koriste amonij-hidrogenfosfat koji ujedno služi i kao izvor fosfora, te amonij-sulfat. Kao izvor dušika može se koristiti i urea, ali se rijetko upotrebljava jer je kvasci sporije troše. Potrebna količina soli izračuna se iz količine kvasca i kemijskog sastava kvaščevih stanica, te količine dušika koji kvasci mogu asimilirati iz melase. Melase sadrže minimalne količine fosfora pa se sav fosfor dodaje sa solima ili sa fosfatnom kiselinom. Kao izvor dušika često se koristi amonijačna voda koja ujedno služi za korekciju pH vrijednosti.
7.5.3. Ostali elementi (minerali) Kvasci za brzi rast trebaju različite makro-i mikroelemente. U tablici 7.2 su prikazane minimalno potrebne količine esencijalnih makro- i mikro oelemenata u litri podloge. Tablica 7.2. Minerali i vitamini potrebni za aerobni rast kvacsa S. cerevisiae Elementi (g) I II III N S P K Mg Ca Na Elementi u tragovima (mg) Zn Fe Cu Mn Co Mo B I Ni Vitamini (mg) Biotin Pantotenat M-inozitol Tiamin Piridoksin Nikotinska kiselina Kvaščev ekstrakt (g) Autori:
19.0 28.5 4.9 4.7 0.9 0.24
25.4 36.0 5.0 0.6 0.62 0. 24 0.23
-
20.5 25.8 1.4
23.0 44.9 1.3 10.4 4.8 12.9 12.8 4 5.6
92.5 46.2 3.2 9.25 1.85
1.4 20 900 181
1.25 62.5 1250 50 36
0.3 40 600 11 62
9.2 0.92 9.2 (?) 0.46
1.8 (I) Woehrer i (II) Oura 1974 (III) Roehr 1981 1985
Bronn
Iz tablice se vidi koliko se pojedini autori razlikuju u koncepciji (proračunu) za te elemente. Ovdje je potrebno naglasiti da su potrebe računate za rast kvasca S. cerevisiae na glukoznom sintetskom mediju. Naravno, u kompleksnom mediju je situacija sasma drukčija, jer se trebaju dodati samo elementi u obliku soli kojih u osnovnom supstratu
214
nema dovoljno. Međutim, u kompleksnim supstratima teško se može utvrditi u kojim koncentracijama su prisutni esencijalni elementi za rast kvaščevih stanica. Tako, u melasi ima dovoljno nekih makro elemenata (K, Ca, S), a magnezija nema dosta, pa se dodaje u obliku soli i sa vodovodnom vodom. Sumpora obično ima dosta u melasi ili se dodaje sa sulfatnom kiselinom koja ujedno služi i za korekciju pH, pa ga ne treba dodavati. Osim toga sumpor u suvišku može stvarati probleme u otpadnim vodama pri proizvodnji pekarskog kvasca. Od elemenata u tragovima, melasi se u proizvodnji pekarskog kvasca najčešće dodaju Zn, Cu i Fe, kojih u melasi često nema dovoljno.Ti elementi se dodaju osnovnom supstratu kao otopina soli (najčešće sulfati, kloridi ili fosfati).
7.5.4. Tvari rasta Spojevi poznati kao tvari rasta za kvasac S. cerevisiae su uglavnom vitamini B skupine. Tu prije svega spadaju biotin, pantotenska kiselina, inozitol, tiamin, nikotinska kiselina i piridoksin (vidi tablicu 7.2). Obzirom da melasa šećerne repe ne sadrži dovoljno biotina, u hranjivu podlogu se najčešće dodaje sintetski biotin. Međutim, kao što je već spomenuto, dodatak 20-25 % melase šećerne trske u osnovni supstrat može zadovoljiti potrebe na biotinu. To je osnovni razlog miješanja melasa u proizvodnji pekarskog kvasca. Ostalih vitamina u melasi ima dovoljno (pogotovo inozitola). Ipak, u mnogim tehnološkim postupcima dodaju se određene količine pantotenske kiseline te B1, B2 i B6 vitamina. Optimiranje količine vitamina u melasnim supstratima veoma je važno zbog postizanja željene brzine rasta kvaščevih stanica, te optimalnog iskorištenja supstrata i produktivnosti procesa.
7.5.5. Alternativni izvori ugljika i energije Danas je još uvijek melasa osnovni supstrat u proizvodnji pekarskog kvasca, jer je najjeftinija. Međutim, u zadnje vrijeme cijena melase nije stabilna i mijenja se značajno (često poraste). Zato su interesantni i drugi izvori ugljika. U tom smislu najzanimljiviji je kukuruzni hidrolizat, jer se na njemu može postići dobro iskorištenje supstrata i produktivnost procesa, gotovo ista kao i na melasi. Osim toga, kukuruzni hidrolizat je čišći supstrat od melase, pa u otpadnim vodama zaostaje manje organskih tvari (znatno niži KPK, do 80 %). Također je interesantan za proizvodnju takozvanog biokvasca koji garantirano ne posjeduje nikakvih štetnih tvari, ili drugim riječima, to je GRAS (Generaly Recognised As Save) sirovina. Sirutka je isto tako potencijalni supstrat, jer je ima u prilično velikoj količini i još uvijek se baca kao otpadna voda u prirodne vodotokove. Međutim, za proizvodnju pekarskog kvasca potrebna je vrsta kvasca koja asimilira laktozu, a to je Kluyveromyces marxianus. Ako se želi uzgojiti kvasac S. cerevisie na sirutki, laktoza se mora enzimski hidrolizirati na glukozu i galaktozu. Korištenje sirutke za proizvodnju pekarskog kvasca je upitno, jer sirutka sadrži samo 4-5 % laktoze, pa bi sirutku trebalo ugustiti, budući je transport prilično skup. Zato do današnjih dana nema ozbiljne proizvodnje pekarskog kvasca na sirutki.
215
7.6. UVJETI OKOLINE 7.6.1. Temperatura Pekarski kvasac se dobro razmnožava u temperaturnom području od 20-35° C. U industrijskoj praksi područje je uže i iznosi 28-33 °C. Pri temperaturama uzgoja nižim od optimalnih, prinos kvasca je nešto viši, vjerojatno zbog niže energije održavanja, dok je pri višim temperaturama manji. Porastom temperature procesa pri kraju uzgoja, povećava se stabilnost kvaščevih stanica, uz neznatno smanjenje aktivnosti. Zbog ekonomskih razloga, prikladnija je viša temperatura, radi efikasnijeg hlađenja odnosno odvođenja topline, koja se oslobađa pri oksidativnim procesima u kvaščevim stanicama. Zbog toga danas postoje kvasci s kojima se postiže visok prinos biomase i pri višim temperaturama uzgoja (32-33 °C). Međutim, još uvijek nije pronađen termostabilni kvasac koji nakon uzgoja pri 40 °C ima zadovoljavajuća svojstva za pekarske potrebe.
7.6.2. Koncentracija H+ (pH) Većina proizvodnih sojeva kvasca S. cerevisiae dobro raste u pH području od 4,0 – 7,0. U graničnim pH područjima usporava se rast većine proizvodnih kvasaca. U proizvodnji pekarskog kvasca, pH se regulira prema potrebi, odnosno prema generaciji uzgoja kvaščeve biomase, pomoću razrijeđene sulfatne kiseline i amonijačne vode. Tako se npr. u proizvodnji kvasca u generaciji "Prodajni kvasac" pH na početku uzgoja podesi na 4,0 – 4,5. Tijekom uzgoja pH postupno raste i održava se uglavnom pri vrijednostima 4,5 – 5,0, da bi na kraju pH bio 6.0-7.0 (oko izoelektrične točke), što je važno za ispiranje obojenih tvari melase sa kvaščevih stanica tijekom separacije. Naime, pri višim pHvrijednostima smanjuje se pozitivni naboj obojenih tvari iz melase, koje se tada slabije vežu na negativno nabijene kvaščeve stanice i lakše ispiru s vodom tijekom separacije.
7.6.3. Koncentracija kvaščevih stanica Ako se zadovolje optimalni uvjeti rasta kao što su aeracija, miješanje, brzina rasta, temperatura, pH i koncentracija supstrata, kvaščeve stanice se dobro razmnožavaju u širokom području njihove koncentracije. Međutim, treba naglasiti da se kvasac brže razmnožava kada je koncentracija stanica u mikrobnoj kulturi (komini) manja. Danas se u proizvodnim pogonima postiže prinos na kraju procesa od 50-70 g s.tv./L kvaščeve biomase dobre kvalitete. U specijalnim uvjetima se može postiči prinos do 150 g s.tv./L, ali je kvaliteta pekarskog kvasca upitna. Naime, visoke koncentracije supstrata i produkata metabolizma smanjuju brzinu rasta zbog osmotskog pritiska ili direktne inhibicije. S druge strane, pri visokim koncentracijama kvaščevih stanica u komini teško se postiže efikasna aeracija i dobro miješanje, a problem može biti i regulacija temperature, odnosno efikasno hlađenje. Zbog toga postoji praktični limit koncentracije kvaščevih stanica u komini na kraju procesa, koji iznosi oko 70 g s.tv./L.
7.6.4. Prinos kvasca po utrošenom supstratu Prinos kvasca najbolje se može definirati s koeficijentom iskorištenja YX/S koji prema većini literaturnih podataka iznosi 0,50–0,54, što ovisi o vrsti izvora ugljika i sastavu supstrata te o energiji održavanja. Cooney (1981.) je izračunao potrošnju supstrata za održavanje kvaščevih stanica tijekom uzgoja pekarskog kvasca, što iznosi do 5 % od 216
ukupne količine izvora ugljika. U praksi se prinos (iskorištenje) obično izračunava kao prinos svježeg kvasca po jedinici melase. Tako se npr. za 1 kg svježeg kvasca sa 30 % suhe tvari potroši oko 1,2 kg melase sa 50 % šećera ili za 1kg suhe tvari oko 4 kg melase.
7.6.5. Toplina – odvođenje topline U aerobnom procesu tijekom uzgoja pekarskog kvasca oslobađaju se velike količine topline koje treba odvesti pa odvođenje topline može biti priličan problem. Zato se pri odabiru bioreaktora za efikasnu proizvodnju kvaščeve biomase odabiru bioreaktori sa efikasnim sustavom za hlađenje. Prema literaturnim podacima, za 1 g s.tv. proizvedene kvaščeve biomase oslobodi se 3,9 – 4,4 kcal (16,3 - 18,5 kJ). Kako se prirast kvasca povećava tijekom uzgoja u eksponencijalnoj fazi rasta, tako je i odvođenje topline sve intenzivnije. Tek početkom linearne faze dolazi do oslobađanja konstantne količine topline. Zato je regulacija hlađenja neophodna u proizvodnji pekarskog kvasca.
7.6.6. Periodičnost i pupanje Tijekom uzgoja pekarskog kvasca kvaščeve stanice se umnožavaju različitim brzinama rasta. Pogotovo se to odnosi na zadnje tri generacije uzgoja, gdje se procesi vode s programiranim i kontroliranim pritokom supstrata. Zato je i postotak stanica koje pupaju prilično nejednolik. Za uzgoj u generaciji prodajni kvasac, postotak stanica koje pupaju u odnosu na vrijeme uzgoja prikazan je na slici 7.5. Iz slike se vidi da na početku uzgoja, kada počinje intenzivno razmnožavanje, raste broj pupova (eksponencijalna faza rasta). Nakon toga, na početku linearne faze (limitacija s kisikom), započinje smanjenje broja pupova, jer se smanjuje i specifična brzina rasta. U zadnjoj fazi, tj. u fazi zrenja, broj pupajućih stanica padne na ispod 2 %, što je poželjno jer se u toj fazi završavaju svi ciklusi razmnožavanja kvaščevih stanica, nakupljaju se rezervni ugljikohidrati (naročito trehaloza), a stanice se pripremaju za gladovanje. Na taj način se zapravo povećava trajnost pekarskog kvasca tijekom skladištenja, odnosno čuvanja pod različitim uvjetima. Faza zrenja je posebno važna za proizvodnju suhog aktivnog kvasca, jer se na taj način pojačava i čvrstoća staničnih membrana kvaščevih stanica. Naime, stanice koje pupaju nisu pogodne za sušenje, jer zbog veće propusnosti gube više staničnih sastojaka tijekom sušenja, što znatno smanjuje aktivnost osušenog kvasca. 70
% pupova
60 50 40 30 20 10 0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
vrijeme (sati)
Slika 7.5. Udjel stanica koje pupaju tijekom komercijalnog uzgoja pekarskog kvasca u generaciji «Prodajni kvasac» 217
7.7. PROIZVODNJA KVASCA U POGONU 7.7.1. Priprema hranjive podloge Kao što je prethodno opisano, u proizvodnji pekarskog kvasca koristi se melasa. Melasa se dovozi vagon-cisternama ili auto-cisternama i skladišti uspremnicima, kako je prethodno opisano (poglavlje 5: Proizvodnja alkohola). Melasa se u pripremi supstrata razrijeđuje s vodom, u omjeru 1:1, bistri i sterilizira (Rosen, 1997., Marić, 2000). Ipak treba naglasiti da postoji nekoliko različitih postupaka pripreme melase, a u proizvodnji pekarskog kvasca najčešće se koristi kontinuirani sustav, kao što je prikazano na slici 7.6.
Slika 7.6. Priprema melase u proizvodnji pekarskog kvasca (KVASAC, Lesaffre) 1. pužne pumpe; 2. vaga; 3. pužne pumpe; 4. međuspremnik; 5. melanžer (posuda za razrijeđivenje melese); 6. separator za bistrenje; 7.među-posuda; 8. pločasti izmjenjivač topline; 9 cijevni sterilizator; 10. ekspanziona posuda; 11. grijač vode; 12. spremnik za sterilnu melasu. Dakle, iz skladišnih spremnika se melasa pumpa pužnim pumpama (1) u pogon, gdje se ulaz kontrolira automatskom vagom (2) te pumpa također pužnim pumpama (3) u prihvatni spremnik (4) odakle melasa ide na razrijeđivanje u posudu (5). Tu se melasa razrijedi s vodom u omjeru 1:1. U posudu za razrjeđivanje može se dodavati razrijeđena sulfatna kiselina da se melasi podesi pH na 5.7 – 6.0. Tada se melasa bistri separacijom (6) i sterilizira kontinuirano. Sterilizacija se sastoji od prihvatne posude (7), pločastog izmjenjivača topline (8) gdje se melasa predgrijava sa sterilnom melasom, cijevnog sterilizatora (9) u kojem se postiže temparatura sterilizacije od 130-135 oC u vrlo kratkom vremenu (20-30 sek) i ekspanzione posude (10). U ekspanzionoj posudi se sterilna melasa zadržava kratko. Pare se koriste za grijanje vode u cijevnom izmjenjivaču topline (11). S druge strane, soli se pripremaju kao 10 %-tna otopina, dok se amonijak gotovo uvijek dodaje posebno kao 25 %-tna otopina i služi kao izvor dušika i za korekciju pH vrijednosti. Mikro- i makroelementi se mogu dodati u melasu ili u otopinu soli. Vitamini također. Otopina soli priprema se otapanjem dušičnih i fosfornih soli sa toplom vodom u posudama s miješalicama, kao što je opisano u poglavlju 6 (slika 6.5 ).
218
7.7.2. Faze uzgoja Pekarski kvasac se proizvodi industrijski prema različitim tehnologijama, najčešće u 4-5 generacija. Količina inokuluma koja ulazi u pogon je obično 10-30 L laboratorijske čiste kulture (LČK) s oko 0,3 – 1,0 kg svježeg kvasca. Ta količina se tijekom proizvodnje umnoži nekoliko tisuća puta (vidi sliku 7.7). Umnožavanje kvaščeve biomase u pojedinim generacijama je specifično i biti će opisano detaljnije. Tehnologije proizvodnje pekarskog kvasca razlikuju se po: - broju generacija - vremenu trajanja pojedinih generacija - aerobnosti procesa u pojedinim generacijama - sistemu bioreaktora za efikasnu aeraciju - vođenju procesa uzgoja u zadnjoj generaciji Na slici 7.7. shematski je prikazan proces pogonskog umnožavanja kvaščeve biomase po generacijama, od F1 do F5. Količina kvasca izražena je kao kvasac sa 30 % s.tv.(Kv30). Generacije uzgoja
Masa kvasca (kg)
F-1, propagator 1 F-2, propagator 2
F-3, mala matica
F-4, velika matica
F-5, završni uzgoj
166611000 0000
8335000
166611000
Ukupno kg
25 - 120
120
120-420
420
4202500
2,500
8335000
166611000
166611000
166611000
15.000 15.000 155,000
8335000
166611000
166611000
166611000
166611000
100,000
Slika 7.7. Faze uzgoja kvaščeve biomase (Reed i Nagodawithana, 1991.) F1, F2 – faze šaržnog uzgoja kvaščeve biomase F3, F4, F5 – faze šaržnog uzgoja kvaščeve biomase s pritokom supstrata. Ova shema je principijelna za proizvodnju pekarskog kvasca. Međutim, u suvremenim tehnologijama postoji mnoštvo tehnoloških procesa koji se razlikuju u vođenju procesa u pojedinim generacijama. Suvremeni proizvodni procesi se vode u manjem broju generacija (4-5). Najčešći broj generacija uzgoja u pogonu je pet (5). Međutim, već postoje tehnološki procesi proizvodnje u 4 generacije, gdje se prve dvije generacije spajaju u jednu. Prema najnovijim podacima (Anon , 2008) primjenjuje se potpuno novo tehnološko rješenje proizvodnje kvaščeve biomase u tri generacije.
7.7.3. Bioreaktori u pogonu Pogon za proizvodnju pekarskog kvasca najčešće sadrži ove osnovne bioreaktore: -1 propagator I, 0,5 – 1 m3 219
-1 propagator II, 8 – 12 m3 -1-2 bioreaktora za uzgoj male matice, 30 – 60 m3 -2-4 bioreaktora za uzgoj «velike matice» i «prodajnog kvasca», 120 – 250 m3 Ovisno o kapacitetu tvornice, broj i veličina propagatora (predfermentora) i bioreaktora su različiti, što se može jednostavno proračunati i dimenzionirati. Svi bioreaktori su izrađeni od nehrđajućeg čelika. Konstrukcija malih bioreaktora (propagator I i II) za proizvodnju pogonskog inokuluma je vrlo jednostavna. Obično su to bioreaktori bez mješalice i odbijača. Zrak se raspršuje kroz sistem perforiranih cijevi, a kontrolira se i regulira praktički samo temperatura. S druge strane, pH nije nužno regulirati, jer melasa ima zadovoljavajući pufer-sustav za ove procese. Konstrukcija bioreaktora za uzgoj biomase u višim generacijama je kompleksnija. U tu svrhu se koriste bioreaktori različitih konstrukcija. Najčešće se koriste bioreaktori s raspršivanjem zraka, sa i bez miješanja. Kao što je prethodno opisano, odvođenje topline je važan dio u regulaciji procesa. Iz tog razloga se također koriste bioreaktori sa različitim sustavima za odvođenje topline (unutarnje hlađenje, površinsko, vanjsko), što je opisano drugdje (Ebner i sur., 1967; Rosen, 1977; Chen i Chiger, 1985; Blenke, 1987, Marić, 2009). Ipak, može se reći da osim svih navedenih tehničkih detalja, najvažnije u konstrukciji bioreaktora za intenzivnu proizvodnju pekarskog kvasca je učinkovitost sustava za prijenos kisika iz zraka u kominu, što je prikazano u tablici 7.3. Tablica 7.3. Učinkovitost aeracijskih sustava (Chen i Chiger, 1985) Aeracijski sustavi Brzina prijenosa O2 Ekonomičnost (mmolO2/Lxsat) aeracije(kgO2/kWh) Mehaničko miješanje: Submerzna turbina 300-350 1.48 Waldhof sistem 1.48-1.97 Frings sistem 1.48 Phrix 1.05-1.54 Aeracijsko krilo 140 1.42-1.67 Bez mehaničkog miješanja: Raspršivanje kroz 100-150 1.67 perforirane cijevi Air lift-bioreaktor(ICI) 120 2.65-4.32 Aeracija s reciklacijom 315-385 2.04 mikrobne kulture
Iskorištenje kisika iz zraka (%) 14-45 14 14-22 14-19
10-15 7-8 28
7.7.4. Proizvodnja kvaščeve biomase po fazama 7.7.4.1. Proizvodnja pogonskog inokuluma U proizvodnim pogonima potrebno je obaviti uzgoj kvasca u potpuno aseptičnim uvjetima, da ne dođe do kontaminacije procesa. Zato se kvasac uzgaja šaržno u propagatorima I i II, slično ili identično kao u proizvodnji alkohola po B-postupku (vidi poglavlje 6: Proizvodnja alkohola). U tim generacijama kvasac se uzgaja semiaerobno, dakle s ograničenom količinom kisika. Sastav podloge i uvjeti uzgoja u propagatorima su gotovo isti ili identični onima u pogonu za proizvodnju etanola. Dakle, u melasnoj podlozi s oko 8 oBg ili 8 % suhe tvari (5-6% šećera) s dodatkom diamonijevog fosfata i diamonijevog sulfata kvaščeva biomase se razmnožava šaržno u semiaerobnim uvjetima
220
(lagano propuhivanje zraka kroz kominu). Kada je proces umnožavanja završen, sva količina uzgojenog kvasca iz propagatora II služi kao cjepivo za postavljanje uzgoja u maloj matici. Kao što je već prethodno spomenuto ove dvije faze se mogu spojiti u jednu. Tada je u procesu aeracija snažnija i uzgoj traje nešto duže (16-22 sata). U tom slučaju je predfermentor konstruiran tako da ima znatno bolju brzinu prijenosa kisika, da se poboljša brzina razmnožavanja kvaščevih stanica. Za taj proces potrebno je umnožiti više LČK ( cca 20L u Carlsberg posudi). 7.7.4.2. Proizvodnja matičnog kvasca Uzgoj u generaciji «Mala matica»: Nakon uzgoja u predfermentoru počinje potpuno aerobno razmnožavanje kvaščeve biomase, u tzv «Maloj matici», gdje se procesi vode s programiranim pritokom supstrata. U generaciji «Mala matica» kao inokulum se upotrebljava cijeli sadržaj predfermentora koji se razrijedi s kloriranom ili na neki drugi način steriliziranom vodom, a sterilna melasa (40 oBg, 25 % šećera) i otopina soli pritječu sukladno programu koji se temelji na proračunu krivulje rasta (regulirani pritok supstrata). U ovoj generaciji postoji relativno dugačka lag faza (3-6 sati) pri čemu kvaščeve stanice prelaze s fermentativnog u oksidativni metabolizam. Naime, u toj fazi kvaščeve stanice obnavljaju svoje organele (mitohondrije) za aeroban rast kvaščevih stanica. Nakon lag faze slijedi eksponencijalna faza rasta, kada se kvaščeve stanice razmnožavaju u striktno aerobnim uvjetima. Pri kraju uzgoja, rast kvasca prelazi u linearnu fazu kada je proces limitiran s kisikom i na kraju u stacionarnu fazu rasta (Slici 7.8.). Poželjno je da stacionarna faza traje što kraće. 60 Biomasa Pritok Me25
50
Biomasa (g/L s.tv.) Pritok Me 25 (L/sat)
40
30
20
10
0 0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Vrijeme (sati)
Slika 7.8. Krivulja rasta i pritok supstrata (melase) tijekom uzgoja "Male matice" u bioreaktoru od 30m3 Uzgoj u generaciji «Velika matica»: Za uzgoj kvasca u generaciji «Velika matica» sva količina kvasca iz male matice služi kao inokulum U tu svrhu, nakon uzgoja kvaščeve biomase u «Maloj matici», kvasac se može izdvojiti separacijom, jer nakon uzgoja u «Maloj matici» u komini ne bi smjelo biti etanola. Kako su kvaščeve stanice adaptirane na aerobni metabolizam, u «Velikoj matici» nema lag faze, pa se uzgoj vodi uglavnom u 221
eksponencijalnoj fazi rasta sve do limitacije s kisikom, da se biomasa umnoži što brže, što povećava aktivnost kvaščevih stanica. Uzgoj kvasca u «Velikoj matici» vodi se šaržno s neprekidnim (kontinuiranim) i programiranim pritokom supstrata, u potpuno aerobnim uvjetima (oksidativni metabolizam), na sličan način kao što se vrši umnožavanje kvaščeve biomase u generaciji prodajni kvasac (slika 7.9). U ovoj generaciji nema stacionarne faze (faze zrenja). Nakon završenog uzgoja, kvasac se izdvaja separacijom, sprema u prihvatne rezervoare kao kvaščeva suspenzija, te hladi na 4-8°C. Sva kvaščeva biomasa proizvedena u «Velikoj matici» koristi se kao inokulum za generaciju «Prodajni kvasac».
Slika 7.9. Bioreaktor sa regulacijom za proizvodnju kvaščeve biomase u generacijama «velika matica» i «prodajni kvasac» 7.7.4.3. Proizvodnja prodajnog kvasca U ovoj generaciji, proces se vodi šaržno s proračunatim i reguliranim pritokom supstrata, u potpuno aerobnim uvjetima. Osim visokoga prinosa i produktivnosti procesa, posebno je važno postići optimalan odnos svih svojstava kvaščeve biomase za pekarske potrebe. Tu se prije svega misli na aktivnost i postojanost tijekom skladištenja ili eventualnog sušenja. Ta svojstva se postižu pažljivom kontrolom svih parametara uzgoja. Zato su 222
bioreaktori opremljeni instrumentima za mjerenje i regulaciju svih bitnih parametara uzgoja. Danas se vođenje procesa obavlja pomoću računala (KVASAC- Lesaffre, Savski Marof). Na početku šaržnog procesa, u oprani i sterilizirani (dezinficirani) bioreaktor postavi se proračunata količina vode kojoj se podesi temperatura (30oC) i pH (4,2-4,5) te doda određena količina inokuluma (kvaščeva suspenzija nakon separacije «velike matice»). Zatim se uključi dovod zraka, pritok sterilne melase i otopine soli. U većini procesa faktor razmnožavanja kvasca je 5:1 do 10:1. Pritok melase vodi se programirano, a program je proračunat i podešen prema krivulji rasta. Regulacija pritoka se obavlja specijalnim uređajem koji mjeri udjel alkohola ili CO2 (respiracijski kvocijent) u izlaznim plinovima i šalje signal na ventil (pneumatski) koji je ugrađen na ulazu melase u bioreaktor. U slučaju da tijekom uzgoja poraste koncentracija etanola ili CO2, uređaj reagira tako da pritvara ventil na ulazu melase u bioreaktor. Kada je pritvoren dotok melase, kvasac troši i etanol za svoj rast, a nakon što koncentracija etanola padne ispod zadane vrijednosti, opet se otvara ventil za pritok melase (slika 10). Tako se održava optimalna koncentracija šećera u komini, pri kojoj se kvasci razmnožavaju željenom brzinom, a da ne nastaje veća količina etanola (0,05- 0,1 %). Kao što je već objašnjeno, koncentracija šećera od 200-300 mg/L zadovoljava te uvjete, pri čemu ne nastaje etanol, a kvasac se umnožava željenom brzinom (izbjegnut Crabtree efekt). Pritok melase se pritvara (smanjuje za 10-50 %) jedan sat prije kraja procesa da bi stanice kvasca prošle fazu zrenja ili stabilizacije. Tijekom te faze, kvaščeve stanice potroše hranjive tvari iz podloge, sintetiziraju rezervne ugljikohidrate, sinhroniziraju svoj reprodukcijski mehanizam i ulaze u fazu mirovanja. Tako se one dulje održe na životu tijekom skladištenja odnosno gladovanja. S druge strane, pritok otopine soli se programira tako da se u početnim satima dodaje nešto više dušičnih i fosfornih soli nego je potrebno po krivulji rasta, a pritok se završava 3-5 sati prije kraja procesa uzgoja. To omogućuje kvaščevim stanicama da se što prije stabiliziraju i sintetiziraju rezervne tvari. Naime, amonijevi ioni ubrzavaju glikolitski put što smanjuje biosintezu rezervnih ugljikohidrata. Temperatura u bioreaktoru se održava na oko 32-33 oC prvih 6-7 sati te na 33-34 oC daljnjih 6 sati a pri kraju (zadnjih 4-5 h) na 35o C, zbog aktiviranja trehaloza sintetaze, pa kvaščeve stanice pri višim temperaturama nakupe više trehaloze (iznad 10 %). pH tijekom procesa se korigira najčešće s amonijačnom vodom, ali se može vršiti i pritokom diamonij-sulfata, pogotovo u prvim satima uzgoja. U tom slučaju, mora se odabrati prikladan omjer amonijaka i diamonijsulfata, jer ukupna količina dodanog dušika treba biti izračunata iz koncentracije dušika u biomasi kvasca. U stvari, diamonij-sulfat snizuje pH zbog viška sulfat iona, a NH3 ga podiže. Ako se ne dodaje diamonij-sulfat, pH se regulira s amonijačnom vodom i sulfatnom kiselinom. Tijekom procesa pH se održava u području 4,5 – 5,0, a pri kraju se pusti da poraste na 6,0-7,5. To je važno da se kvaščeve stanice lakše operu tijekom separacije i filtracije, što je prethodno objašnjeno. Tijekom uzgoja se oslobađaju velike količine topline (3500 kJ/ kg melase), pa su zato bioreaktori opremljeni efikasnim sustavom za hlađenje, što je prethodno opisano. Količina zraka mjeri se rotametrom, a koncentracija otopljenog kisika s pomoću kisikove elektrode. Dovođenje zraka mora zadovoljiti aerobnost procesa, pa se u prvim satima uzgoja koncentracija otopljenog kisika održava iznad 2 mg/L (25 % zasićenja s kisikom). Kada koncentracija otopljenog kisika padne ispod tih vrijednosti, razmnožavanje kvasca ulazi u linearnu fazu, jer je rast limitiran brzinom dovoda kisika. Tada u stvari počinje limitacija s kisikom. Proces uzgoja traje 16-18 sati, a trajanje procesa ovisi o brzini rasta, te efikasnosti sistema za aeraciju i sistema hlađenja. Proces uzgoja u generaciji «prodajni kvasac» prikazan je grafički na slikama 7.10. i 7.11.
223
Kvasac sa 32% s. t. (ukupno kg)
16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 0
1
2 3
4
5
6
7 8
9 10 11 12 13 14
Vrijeme (sati)
Slika 7.10. Krivulja rasta pekarskog kvasca S. cerevisiae u šaržnom uzgoju s pritokom supstrata (generacija «prodajni kvasac»), u bioreaktoru od 130 m3
1.400
50 45 40
1.000
35
800
30 25
600
20
400
15
N,P2O5 (kg)
M25 (kg/h)
1.200
M25 (kg/h) N (kg) (kg/h) P2O5 (kg/h)
10
200
5
0
0 0
2
4
6
8
10
12
14
Vrijeme (sati)
Slika 7.1. Pritok supstrata tijekom šaržnog uzgoju pekarskog kvasca s pritokom supstrata (za sliku 7.10), u bioreaktoru od 130 m3
224
Kontinuirani uzgoj: Proizvodnja pekarskog kvasca može se obavljati i u kontinuiranom procesu s visokim prinosom i dobrom produktivnošću procesa (Olson,1961). Međutim, u praksi su problemi mnogostruki (Burrows,1970). Poseban problem je aseptičnist procesa i kvaliteta gotovog proizvoda. Kako ti problemi još nisu riješeni sve do današnjih dana, pekarski kvasac se ne proizvodi kontinuirano u velikim pogonima.
7.7.5. Izdvajanje i filtracija kvaščeve biomase Kvaščeva biomasa nakon uzgoja, u zadnje dvije generacije, se izdvaja iz komine separacijom s centrifugalnim separatorima (Slika 7.12). Kvaščeve stanice sadrže 58-60 % vode, a gustoća im je 1.13 g/cm3 (Sambuchi i sur.,1974). Dakle, gustoća im je dovoljno veća od tekućine (komine) što omogućuje efikasnu separaciju s pomoću separatora sa diskovima i sapnicama (engleski: nozzle-type). Za izdvajanje matičnog kvasca koristi se jednostruka ili dvostruka separacija, a nakon izdvajanja kvaščeva suspenzija se čuva u rezervoaru s mješalom i hladi na 4-8o C. Međutim, iz generacije prodajnog kvasca biomasa se izdvaja separacijom u dva ili tri stupnja s jednostrukim ili dvostrukim pranjem s vodovodnom vodom, nakon prve i eventualno druge separacije. Izdvojena kvaščeva suspenzija sadrži 16-20 % suhe tvari, prilično je viskozna, ali se još uvijek lagano pumpa (tekući kvasac). Kvaščeva suspenzija se nakon izdvajanja prihvaća u međuspremnik (2) i zatim ide na ugušćivanje pomoću vakuum-filtera (vidi sliku 7.13). Na vakuum-filteru se obavlja dodatno pranje kvaščeve biomase vodom. Prije filtracije u kvaščevu suspenziju se može dodati 0,5-1 % kuhinjske soli. Time se može izvući više slobodne vode, pa se dobije kvaščev kolač sa 30-33 % suhe tvari, što je posebno važno u proizvodnji suhog aktivnog kvasca. Biomasa kvasca sa 27-33 % s.tv. poprima čvrstu plastičnu konzistenciju.
Slika 7.12. Principijelna shema izdvajanja kvasca iz komine trostrukom separacijom sa dvostrukim pranjem vodom, filtracije, oblikovanja i pakiranja.
225
Slika 7.13. Vakuum filtracija u proizvodnji kvaščevog kolača
7.7.6. Miješanje, oblikovanje i pakiranje svježeg kvasca Svježi kvaščev kolač s filtera pada u aparaturu za oblikovanje koja ima kontinuiranu pužnicu. Kvaščevom kolaču se može dodati mala količina vode, da se vlažnost podesi na oko 70%. Također se može dodati i mala količina jestivog ulja (ili emulgatora), da se olakša ekstruzija te da se spriječi vlaženje kvaščevog kolača. Dobro izmiješana kvaščeva biomasa protiskuje se kroz uređaje za oblikovanje (4), tako da se dobije traka biomase, koja se automatski reže. Ovako oblikovana biomasa se pakira u specijalni papir, nepropustan za vodu, ali propustan za CO2 i druge plinove (5). Tijekom miješanja, oblikovanja i pakiranja temperatura biomase ne prelazi 8o C, pa nije nužno dodatno hlađenje. Međutim, ako kvaščev kolač ima nešto više suhe tvari (33 %), može doći do zagrijavanja biomase, što je nepoželjno. U tom slučaju je neophodno dodatno hlađenje. Za oblikovanje kvaščeve biomase postoji mnoštvo suvremenih strojeva koji oblikuju kvaščevu biomasu u kockice od 20-50 g za domaćinstvo, te u kvadre od 0,5 – 1 kg za pekare. Kvaščev kolač se nakon homogenizacije može usitniti u sitne čestice za proizvodnju svježeg granuliranog kvasca, koji se pakira u papirnate vreće od 15-30 kg. Problem ove vrste kvasca je slobodna protočnost, jer često dolazi do sljepljivanja čestica. Zato za ovu vrstu pekarskog kvasca biomasa mora sadržavati iznad 30 % suhe tvari (poželjno je oko 33%). Danas već postoji tzv. «slobodno-protočni» kvasac kojemu se dodaju različiti emulgatori i sredstva za bubrenje, tako da ne dolazi do sljepljivanja. Ova vrsta kvasca može se i djelomično osušiti, što se danas preporučuje u proizvodnji tzv. namjenskog kvasca za smrzavanje. Svi oblici svježeg kvasca se zatim skladište u hladnim prostorijama na temperaturi do 8o C.
7.7.7. Transport kvasca Svježa kvaščeva biomasa uglavnom se prevozi u auto-hladnjačama, tako da ne dođe do zagrijavanja kvaščeve biomase, odnosno gubitka aktiviteta. Ako se kvasac transportira u hladnom, može se voziti na relativno velike udaljenosti. Poseban problem je transport
226
tekućeg kvasca, koji se mora obavljati u auto-cisternama ili u specijalnim kontejnerima (slika 7.14). Često se javlja problem pothlađivanja pa se ova vrsta kvasca ne preporuča voziti na veće udaljenosti. Osim toga kvasac se taloži u vodenoj suspenziji pa se mora učiniti stabilnim s dodatkom sredstava za bubrenje. Tada ne dolazi do taloženja kvasca. Inače kontejner treba imati miješalicu, da ne dođe do taloženja kvasca. PRIKLJUČAK PRIKLJUČAK ZA PRANJE ZA PUNJENJE I PRAŽNJENJE
OZRAČNIK
RECIRKULACIJSKA CIJEV
GLAVA ZA PRANJE
RASHLADNI MEDIJ
RECIRKULACIJSKA PUMPA
Slika 7.14. Kontejner za transport tekućeg kvasca
7.7.8. Trajnost svježeg kvasca Svježa kvaščeva biomasa je relativno nestabilna. Tako npr. trajnost tekućeg kvasca iznosi najviše 7 dana na temperaturi do 20o C, dok je trajnost kvaščevog kolača nešto veća i iznosi oko 10 dana u istim uvjetima. Međutim, ako se ovi oblici kvaščeve biomase skladište pri nižim temperaturama (4-8o C), trajnost se povećava na 20-30 dana, bez većeg pada aktiviteta. I pored toga, svježa kvaščeva biomasa se još uvijek najviše koristi u pekarstvu.
7.8. SUHI AKTIVNI KVASAC Kako bi se produžila trajnost kvaščeve biomase tijekom skladištenja, osmišljen je novi proizvod – suhi aktivni kvasac (SAK). SAK sadrži najviše 8 % vode ili preporučljivo oko 5 % vode. Time je enzimska aktivnost unutar kvaščevih stanica svedena na minimum, pa se takav kvasac može skladištiti pri sobnim temperaturama (do 20o C) duži period. Povijest proizvodnje SAK-a opisao je Frey (1957). Komercijalna proizvodnja SAK-a započela je za vrijeme II. svjetskog rata (Europa, Australija, SAD).
227
Sve do 70-tih godina prošlog stoljeća proizvodio se SAK koji se prije upotrebe morao rehidratirati s mlakom vodom, kada su nizozemski znanstvenici proizveli Instant SAK. Taj suhi kvasac se ne mora rehidratirati prije upotrebe, što mu daje velike praktične prednosti (Langejan, 1972; 1980). Taj oblik kvasca našao je veliku primjenu u kontinuiranim pekarama, jer se ne mora rehidratirati prije zamjesa.
7.8.1. Opće postavke proizvodnje suhog aktivnog kvasca U početku proizvodnje SAK-a potrebno je poznavati nekoliko bitnih čimbenika, koji mogu znatno utjecati na kvalitetu gotovog proizvoda, a to su: -
izbor soja kvasca S. cerevisiae uzgoj kvasca u pojedinim generacijama kemijski sastav kvaščevih stanica zaštita i oblikovanje sušenje pakiranje
7.8.2. Sojevi kvasca S. cerevisiae Kako se danas proizvode dvije osnovne vrste SAK-a (instant, obični granulirani) postoje i dva osnovna soja kvasca S. cerevisiae za njihovu proizvodnju. Naravno, suvremenim genetičkim metodama dobiveni su sojevi željenih svojstava koji se danas koriste u proizvodnji SAK-a (Langejan, 1980., 1982.). Osim ove dvije osnovne vrste suhog kvasca, u novije vrijeme se proizvodi i osmotolerantni instant kvasac. Međutim, pokazalo se da i odabrani sojevi moraju biti uzgojeni na poseban način, kako bi se postigao željeni sastav kvaščeve biomase.
7.8.3. Uzgoj kvasca i kemijski sastav U proizvodnji suhog aktivnog kvasca poželjno je proizvesti kvaščevu biomasu određenog kemijskog sastava i fizioloških karakteristika. To se postiže s pomoću posebnih tehnoloških postupaka, u kojima se uzgoj kvaščeve biomase (sastav supstrata, pritok supstrata) vodi tako da se postigne željeni sastav (vidi poglavlje «Uzgoj kvasca u generaciji Prodajni kvasac»). Tako za proizvodnju granuliranog suhog kvasca, kvaščeva biomasa ima nešto manji udio proteina (40-45 %) i fosfora (oko 2,5 % kao P2O5), dok biomasa kvasca za proizvodnju instant-kvasca ima veći udio proteina (45-55 %) i nešto veći udio fosfornog pentoksida. Udjel trehaloze treba biti iznad 10 %, a neki autori preporučuju 12-15 % (Clement, 1983).
7.8.4. Zaštita i oblikovanje Nakon separacije, u kvaščevo mlijeko se dodaju sredstva za zaštitu (emulgatori). Danas se u tu svrhu najčešče koristi sorbitan-monostearat, a mogu se koristiti i drugi monoesteri sorbitola i glicerola. Sredstva za zaštitu omogućuju efikasnije sušenje, pogotovo instant kvasca. U stvari, pomoću zaštite se regulira izvlačenje vode iz kvaščevih stanica, te ponovni ulazak vode u stanicu tijekom procesa rehidratacije. Emulgatori se dodaju u količini od 0,5 – 1 %, na suhu tvar kvasca. Po potrebi se osim emulgatora dodaje često
228
0,2 – 0,6 % kuhinjske soli, da se dobije kvaščeva biomasa sa 30-33 % suhe tvari. Emulgatori se mogu dodavati i tijekom filtracije ili u kvaščev kolač prije oblikovanja Nakon filtracije i ugušćivanja na vakuum-filterima, kvaščeva biomasa se oblikuje u sitne kuglice promjera 2-3 mm za proizvodnju suhog granuliranog kvasca i u sitne štapiće promjera 0,2 – 1 mm i duljine 2-3 mm, za proizvodnju instant SAK-a. Oblikovanje se obavlja u posebnim uređajima (ekstruderima). Sredstva za zaštitu mogu se dodati i tijekom filtracije ili u toku oblikovanja
7.8.5. Sušenje Tijekom sušenja može doći do značajnih strukturnih promjena nekih makromolekula (proteina, nukleinskih kiselina, lipida, ugljikohidrata) unutar kvaščevih stanica. Te promjene su opisali Becker i Rapoport (1987). Navedene strukturne promjene smanjuju fermentacijsku aktivnos kvaščevih stanica Tako npr. bilo kakva strukturna promjena u citoplazmatskoj membrani tijekom sušenja dovodi do pada fermentativne aktivnosti kvaščeve biomase. Slično tome strukturna promjena fermentativnih enzima dovodi do inaktivacija enzima, a time se također smanjuje fermentacijska aktivnost. U procesu sušenja najvažnija karakteristika je brzina sušenja kvaščeve biomase, koja se može značajno razlikovati ovisno o temperaturi i vlažnosti zraka za sušenje, te o veličini oblikovanih čestica i brzini strujanja zraka. Međutim, u svakom ovom procesu postoji opća shema sušenja, što je prikazano na slici 7.15.
80 70
udio vlage (%)
60 50 40 30 20 10 0 0
5
10
15
t (h)
Slika 7.15. Krivulja sušenja kvaščeve biomase (Becker i Rapoport, 1987.) Iz slike 7.16. se vidi da se s vremenom smanjuje udjel vlage u kvaščevim stanicama. Na početku je smanjenje brže, a pri kraju se znatno usporava. U procesu sušenja se zapravo izvlače 3 različito pozicionirane vode. Prvo se izvlači slobodna međustanična voda (20 – 30 %). Izvlačenje te vode je najjednostavnije. Tada je i ulazna temperatura zraka na početku sušenja veća. Prilikom izvlačenja te vode kvaščeva biomasa se hladi i na taj način se održava temperatura ne veća od 40° C u sloju kvasca. Nakon toga izvlači se slobodna stanična voda. Izvlačenje te vode mora biti regulirano, da ne dođe do oštećenja
229
citoplazmatske membrane tijekom izlaska vode iz stanice. Zatim se izvlači vezana stanična voda. Voda je vezana u stanične makromolekule (enzime npr.). Izvlačenje tako vezane vode je najopasnije, jer može doći do oštećenja strukture u makromolekulama (konfiguracija proteina), odnosno pada aktivnosti fermentativnih enzima. Zato je proces sušenja u toj fazi znatno usporen. 7.8.5.1 Postupci sušenja U proizvodnji SAK-a se primijenjuje nekoliko vrsta sušnica, koje rade šaržno ili kontinuirano. Kratak opis nekih sušnica dat je kako slijedi: Tunelska sušnica: Prema ovoj metodi, kvaščev kolač se protiskuje kroz perforiranu ploču, s promjerom rupica od 0,2 – 2 mm. Rezanci se odrežu na ekstruderu, u dužini od 1-2 mm. Takvi štapići se ubacuju u sušnicu koja radi kontinuirano, pri čemu neprekidna traka nosi kvaščevu biomasu kroz komore, kojih obično ima 3 – 6. Zrak za sušenje se upuhuje alternativno odozdo i odozgo, kroz sloj kvasca, kao što je prikazano na slic 7.16. Vrijeme sušenja traje 2 – 4 sata, a temperatura unutar sloja kvasca je 28 – 42 ºC. Ovaj način je prikladan za manje kapacitete, dok se u industrijskim pogonima većih kapaciteta ne primijenjuje.
Slika 7.16. Kontinuirana tunelska sušnica: A- oscilirajući punjač; B- traka punilice; Cbeskonačna traka za kvasac; 1,2,3,4 – komore sušnice. Strelice pokazuju strujanje zraka Sušenje u lebdećem sloju: Ova metoda sušenja naveliko se primijenjuje u industrijskoj praksi. Postoje šaržne i kontinuirane sušnice, što je prikazano na slikama 7.17. i 7.18. Pogotovo se preporuča ovo sušenje u proizvodnji instant SAK-a (obje metode). Naime, ekstrudirani štapići promjera 0,2 – 0,5 mm i dužine 1-2 mm unose se u sušnicu na perforiranu ploču, gdje se kvasac suši toplim kondicioniranim zrakom. Brzina strujanja zraka je takva da čestice kvasca lebde, što izgleda kao lebdeći jastuk.
230
Slika 7.17. Shema šaržnog sušenja kvasca (KVASAC, Koprivnica)
Slika 7.18. Kontinuirana fluidna sušilica (Pressindustria, Milano) Ipak, potrebno je naglasiti da se u fluidnim sušnicama mora precizno kondicionirati temperatura i vlažnost zraka tijekom sušenja. Tako je Langejan (1970) opisao šaržno sušenje sa zrakom od 100-150° C na početku sušenja, a zatim se temperatura postupno smanjuje, da bi na kraju sušenja bila 40-45° C. Isto tako, vlažnost ulaznog zraka mora biti najmanja pri kraju sušenja. Nizozemski autori preporučuju vrijeme sušenja od 30-60 minuta. Također je važno naglasiti da temperatura u sloju kvasca tijekom sušenja u svim fazama ne smije prelaziti 45-50°C. S druge strane, sušenje u lebdećem sloju može se obaviti u kontinuiranim sušnicama, što se također primijenjuje u industrijskoj praksi. Kao što je prikazano na slici 7.19, postoji 3-5 komora, gdje ulazi različito kondicionirani zrak. Naravno, u prvoj komori je najtopliji (cca 100° C), a u zadnjoj najhladniji (cca 38-42° C). Rotirajuće sušnice: U industriji se ove vrste sušnica često koriste u proizvodnji tzv. granuliranog običnog suhog kvasca. Postoje šaržne i kontinuirane sušnice. Na slici 7.19 je prikazana šaržna sušnica. Ove sušnice se više koriste nego kontinuirane.
231
Slika 7. 19. Šaržna rotirajuća sušnica: 1-Vakuum filter,;2- Ekstruder; 3- Filter za zrak; 4- Rotirajuća sušnica; 5- Kompresor za zrak; 6- Ciklon; 7- Transporter kvasca; 8- Dosušivanje u vakuumu; 9- Pakiranje. (Sosojeva i sur., 1965) Kao što se vidi na slici 7.19., filtrirani kvasac (1) ide na oblikovanje, a zatim se ubacuje u veliki metalni cilindar (4), u kojemu su ugrađeni odbijači na unutarnjim stijenkama cilindra. Rotirajuća sušnica rotira tako da se biomasa stalno prevrće (miješa) tijekom sušenja. Topli zrak do 60° C se upuhuje kompresorom (5) preko filtera (3) u valjak i prolazi kroz sloj kvasca. Vrijeme sušenja je 10-20 sati, a temperatura u sloju kvasca ne smije preći 42–45° C. Proizvod je suhi kvasac oblikovan u kuglice koje je nužno rehidratirati prije upotrebe. Ove sušnice su dimenzionirane kao što je prikazano na slici: dužina cilindra – 4,85 m, dijametar – 2,2 m, brzina rotacije – 4 o/min, vrijeme sušenja -12-15 h, temp. ulaznog zraka: 50°C (Sosojeva i sur., 1965). Ostale sušnice: Osim opisanih sušnica, predloženi su i drugi načini sušenja, koji nisu zauzeli značajnije mjesto u proizvodnji. Tako je dugo razrađivano sušenje tekućeg kvasca u sušnicama s raspršivanjem (eng. spray dry). To je ekonomičan način sušenja, ali se pokazalo da je gubitak aktiviteta bio prevelik. Zatim je predloženo sušenje u vakuumu, pri čemu se usitnjeni kvaščev kolač ili čak suspenzija kvasca sušila na beskonačnoj traci u vakuumu. Ipak, sve ove metode nisu našle komercijalnu primjenu, osim sušenja u vakuumu koje se može primijeniti za dosušivanje kvasca koji je prethodno osušen prema poznatim metodama (npr u fluidnim sušnicama). 7.8.5.2 Pakiranje SAK-a Granulirani SAK se obično pakira u standardne vrećice od papira. Dakle, ne mora se pakirati pod vakuumom, a niti u struji inertnog plina. S druge strane, instant SAK se mora pakirati pod vakuumom ili u struji inertnog plina (N, CO2) u troslojne aluminijske folije. Granulirani SAK se pakira u papirnate vrećice od 10 g za domaćinstvo ili u limenke od 0,5 – 5 kg, za različite namjene (pekarske, vojne svrhe). Instant SAK se pakira pod vakuumom, najčešće u količini od 0,5 – 10 kg u Al-folije (3-4 sloja), kao što je predložio Hill (1987), a to je: poliester (20 mikrona); aluminij (12 mikrona); poliester (12 mikrona); polietilen (8 mikrona). Aluminijski sloj je potreban da folija ne bi bila propusna za
232
svjetlo. Kada se ošteti ambalaža od instant suhog kvasca, kvasac se mora što prije potrošiti, jer mu aktivnost naglo opada. 7.8.5.3 Aktivnost suhog aktivnog kvasca Tijekom sušenja fermentacijska aktivnost kvaščeve biomase se smanjuje za oko 10-15 %, zbog inaktivacije enzimskog sustava i oštećenja staničnih membrana. Isto tako, tijekom skladištenja, pri sobnim temperaturama do 20º C, aktivitet se smanjuje 10 – 20 % za godinu dana. Ipak, SAK s većom količinom suhe tvari (95-96 %) znatno je stabilniji tijekom skladištenja i može trajati nekoliko godina, naravno, ovisno o proizvođaču i njegovoj kvaliteti (Langejan, 1982.).
7.8.6. Mjerenje fermentacijske aktivnosti Fermentacijska aktivnost se mjeri različitim metodama, a najprikladnije su one gdje se fermentacijski proces odvija u tijestu. Takva je standardna SJA metoda, što je prikazano na slici 7.20. i 7.21. Mjerenje se obavlja pri 30 ili 35 oC. Prema ovoj metodi visokoaktivni kvasci imaju aktivnost oko 1800 – 2000 mLCO2/2x1 sat pri 35o C ili 24002600 mL CO2/2x1 sat pri 30o C. 1200 1000
Prvo dizanje Drugo dizanje
mL CO2
800 600 400 200 0 0
10
20
30
40
50
60
Vrijeme (min)
Slika 7.20: Prosječna fermentacijska aktivnost pekarskog kvasca u tijestu, mjerena SJAmetodom pri 35o C
233
Slika 7.21. SJA fermentograf (Nassjo,Švedska) Dakle, u zamjes za tijesto doda se određena količina kvaščeve biomase. Tada se učini zamjes kao za proizvodnju bijelog kruha. Prebaci se u poseban modul i stavi u fermentograf na dizanje. Uređaj mjeri količinu nastalog CO2-plina. Prvo dizanje traje 1 sat. Nakon toga se tijesto izvadi iz aparata, premijesi i ponovno stavi u aparat. Drugo dizanje traje također 1 sat. Mjerenje se obavlja pri 30 ili 35o C. Aktivnost se izražava u ml CO2/2x1sat. Pri 30º C fermentacijska aktivnost je manja za 20 - 25 % nego kod 35º C. U novije vrijeme sve više se koristi fermentometrijska metoda s kvaščevom biomasom, razrađena u Lesaffru (Francuska), što je prikazano na slici 7.22. Bit metode je da se, u određenim vremenskim razmacima, mjeri količina nastalog plina što se razvije u mediju sa šećernim supstratom. Mjerenje se obavlja najčešće pri 20o C tijekom 2 sata i izražava u ml CO2 po količini odvaganog kvasca.
234
Slika 7.22. Aparatura za mjerenje fermentacijske aktivnosti pekarskog kvasca (Lesaffre, Francuska)
LITERATURA Anon, (2008). Proizvodnja pekarskog kvasca u tvornici KVASAC-Lesaffre (Hrvatska). Becker,M.J. and Rapoport,A.I. (1987). Conservation of yeast by dehydration. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 35, 127-171. Blenke,H. (1987). Process engineering contributions to bioreaktor design and operations. In: Biochemical Engineering, Chmiel,H.et al.(ed.). Gustav Fischer Stuttgart, West Geramny. Bronn,W.K. (1985). Investigations of the technological and economical possibility of using raw materials other than molasses for yeast production. Research Report T 85-117, Ministry for Science and Technology, German Federal Republic. Burrows,S. (1970). Baker's yeast. In : The Yeasts, Vol 3 Yeast Technology (Rose,A.H. & Harrison,J.S. eds.), 349-420. Academic press, London and New York. Chen,S.L. & Chiger,M. (1985). Production of bakers yeast. In: Comprehensive Biotechnology, Vol 3, Moo-Young, M.(ed.). Pergamon Press, Oxford UK. Clement, Ph.(1983). Preparation of dried baker's yeast. US-patent 4,370,420. Cooney, C.L. (1981). Growth of microorganisms. In Biotechnology, Vol 1, Rehm, H.J. & Reed,G. eds.), VCH Publishing Campany, West Germany. Čović,Ž., Grba,S i Stehlik-Tomas,V.(1991). Odabir soja kvasca Saccharomyces cerevisiae za industrijsku primjenu. Prehr. Tehnol. Biotehnol. Rev. 29(1), 39-41. Dellweg,H., Bronn,W.K. and Hartmeier, W. (1977). Respiration rate of growing and fermenting yeast . Kem. Kemi 4(12), 611-615. Ebner,H., Pohl,K. and Herbst,A.M.(1967). Self priming aerator and mechanical defoamer for microbial processes. Biotechnol. Bioeng. 9, 357-364. Frey,C.N. (1957). History and development of active dry yeast. Yaests, its characteristics, growth and function in baked products. Proc. Symp. U.S. Guartermaster Food Container Inst., Chicago, 7-32.
235
Fiechter,A., Meriners,M. and Sukatsch,D.A.(1987). Biological regulation and process control. In : Fundamentals of Biotechnology. Prave,P. et al. eds. VCH Publishing company, Weinheim, West Germany. Grba,S. (2000). Kemijski sastav melasa šećerne repe i šećerne trske. U: Marić,V. Biotehnologija i sirovine, str. 81. Stručna i poslovna knjiga, Zagreb Hansen,E.C. (1883). Udersogelser over alkoholgiaersvampenes fysiologi og morfologi II. Om askospore dannelsen hos slaegten Sacccharomyces. Moddelelser fra Carlsberg Labaratoriet 2, 29-86 Harfield,C.,Harikrishna,J.A. and Wilson,J.A. (1995). Determination of chromosome copynumbers in Saccharomyces cerevisiae strains integrative probe and blot hybridisation techniques. Current Genetics 27(3), 217-228. Harrison, J.S. (1967). Aspects of commercial yeast production. Proc. Biochem. 3, 41-45. Hernandez-Lopez,M.J., Palloti,C., Andreu,P.,Aquillera,J., Prieto,J.A. and Randez-Gil,F. (2007). Characterisation of a Torulaspora delbrueckii diploid strain with optimized performance in sweet and frozen sweet dough. Int. J. Food Microbiol. 116(1), 103-110. Hill, F.F. (1987). Dry living microorganisms-Product for the food industry. In: Biochem. Engineering, Chmiel,H., Hammes,W.P. and Bailey, J.E.(eds.). Gustav Fischer Verlag, Stuttgart Kirshop,B.E. and Kurtzmann,C.P.(1988).Yeasts.Cambridge Univ. Press. Cambridge UK. Kowalski,S., Zandar,I. and Windisch,S. (1981). Hybrid yeast strains capable of raising an exstraordinary broad range of dough types. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 11,146-150. Langejan,A.(1972). A novel type of active dry baker's yeast. In: Fermentation technology today ( Terui,G. ed.), 669-671, Society of Fermentation technology, Osaka, Japan. Langejan,A. (1980). Active dry baker's yeast. US-patent 4,217,420. Langejan,A .(1982). Active dry baker's yeast. US-patent 4,341,871. Lucca,M.E., Loray,M.A., deFiguera,L.C.I. and Callieri,D.A. (2004). Characterisation of osmotolerant hybrids obtained by fusion between protoplasts of Saccharomyces cerevisiae and heat treated protoplasts of Torulaspora delbrueckii. Biotechnology Letters, 21(4),343-348. Mateles,R.I. (1971). Calculation of oxigen required for the cell production. Biotechnol. Bioeng. 13, 581582. Olson,A.J. (1961). Manufacture of bakers yeast by continuous fermentation. Plant and process. Soc.Chem.Ind. (London) Monograph 12, 18-93 Oura,E. (1974). Effect of aeration intensity on the biochemical composition of bakers yeast. Factors affecting the type of metabolisms. Biotechnol. Bioeng. 16, 1197-1212. Postma,E., Vreduyen,C. Scheffers,W.A. and Van Dijken,J.P. (1989). Enzymic analysis of the crabtree effect in glucose-limited chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 55(2), 468-477. Reed, G. and Nagodawithana,T.W.(1991). In: Yeast Technology, sec.ed., Bakers yeast production, 261314, Published by Van Nostrand Reinhold , New York. Rosen, K. (1977) .Production of bakers yeast. Proc. Biochemistry 12(3),10-12. Sasaki,T. and Ohshima,Y. (1987). Induction of artificial diploids from the haploid yeast Torulaspora delbrueckii. Appl. Environ. Microbiology, 53(7), 1504-1511. Sambuchi,M. et al.(1974). Filtration and extrusion characteristics of baker's yeast.I. Results of commpression permeability test and constant pressure filtration. Hakko Kogaku Zasshi 49, 880885. Van Hoek,P., Van Dijken, J.P.and Pronk, J.T. (1998). Effect of specific growth rate on fermentative capacity of baker's yeast. Appl.Environ. Microbiol. 11, 4226-4233. Van Urk,H., Postma,E. Scheffers.W.A. and Van Dijken, J.P. (1989). Glucose transport in Crabtree-positive and Crabtree-negative yeasts. J. Gen. Microbiology 135, 2399-2406. White,J. (1954). Yeast Technology. Chapman and Hall, London. Woehrer,W. and Roehr,M. (1981) Regulatory aspects of bakers yeast in aerobic fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 23, 567-581.
236
Poglavlje 8: PRIMJENA KVASACA U PEKARSTVU Slobodan Grba i Vesna Stehlik
8.1. UVOD U poglavlju o proizvodnji pekarskog kvasca već je opisano da se aktivna kvaščeva biomasa primjenjuje u pekarstvu za dizanje tijesta. U tu svrhu postoji mnoštvo vrsta i oblika pekarskih kvasaca, koji se nalaze na svjetskom tržištu. Osim pekarskog kvasca, u pekarstvu se za dizanje tijesta može koristiti i pekarski prašak koji sadrži 30 % natrijevog-hidrokarbonata, koji u tijestu (pogotovo u kiselom mediju) oslobađa CO2 koji diže tijesto. Tako 100 g praška oslobodi 15 g ili 8,2 L CO2. Osim natrijevog može se koristiti i kalijev ili amonijev hidrokarbonat. U tablici 8.1. prikazano je usporedno djelovanje pekarskog kvasca i pekarskog praška u tijestu. Tablica 8.1. Djelovanje pekarskog kvasca i praška u tijestu Kvasac količina, % Količina, % CO2/g sredstva (računato na brašno) (računato na za dizanje/sat tijesto) Kvasac (30 % s.tv.) 2,5 1,5 0,5g † prašak 6,0 3,5 0,15g † pekarski prašak koji sadrži 30 % NaHCO3
CO2/100 g tijesta/sat
350 mL 214 mL
Količina proizvedenog CO2 s kvascem ( tablica 8.1.) izmjerena je nakon 1 sata. Međutim, proizvodnja se može nastaviti ako je u tijestu prisutan fermentabilni šećer. S druge strane, oslobađanje CO2 iz pekarskog praška u tijesto je nešto brže, ali nakon izmjerene količine nakon jednog sata nema daljnjeg oslobađanja plina. Ipak, u nekim slučajevima pekarski kvasac nije najprikladniji za proizvodnju specifičnih pekarskih proizvoda, kao što su slatki kolačići i keksi pa se koristi pekarski prašak ili kombinacija kvasca i praška. Pekarski kvasac ima mnoge prednosti, a to su: - oslobađa se znatno veća količina CO2 ili onoliko plina koliko je potrebno da se tijesto pravilno oblikuje, - okus i miris kruha su znatno bolji, jer alkohol i nusproizvodi alkoholne fermentacije povoljno utječu na organoleptička svojstva pekarskih proizvoda, - elastičnost tijesta se povećava fermentacijom pa se kruh manje mrvi, - ekonomičnost proizvodnje pekarskog proizvoda je veća. Iz navedenih prednosti može se još jednom naglasiti da kvasac ima 3 osnovna svojstva u pekarstvu: 1. proizvodnja CO2 plina koji diže tijesto. 2. povoljan utjecaj na reološka svojstva tijesta. 3. razvoj ugodnog okusa i mirisa u tijestu, što daje bolji pekarski proizvod. Osnovna uloga tj. oslobađanje plina u tijestu je svakako dominantna, pogotovo u suvremenom pekarstvu, gdje se primijenjuju brzi zamjesi i kratke fermentacije tijesta. Većina pekarskih proizvoda može se pripremiti fermentacijom pomoću standardnih vrsta pekarskog kvasca. Međutim, u suvremenom pekarstvu, osim uobičajenih uvjeta okoline (pH, temperatura, sastav tijesta, osmotski tlak) koriste se metode i priprava tijesta na neuobičajan način (smrzavanje tijesta, slatko tijesto i dr.). Tada se ne mogu koristiti
237
standardne vrste kvasaca, pa će se u narednim poglavljima prikazati oblici i vrste pekarskih kvasaca koji se danas proizvode i nalaze na svjetskom tržištu.
8.2. OBLICI PEKARSKOG KVASCA U pekarstvu se koriste 3 osnovna oblika pekarskog kvasca: tekući (kvaščeva suspenzija), svježi (kvaščev kolač i granulirani kvasac) i suhi aktivni (instant i obični granulirani) kvasci. Od svih vrsta i oblika pekarskog kvasca se zahtijeva da imaju visoku fermentacijsku aktivnost i vrlo dobru postojanost pod određenim uvjetima (Trividi i sur., 1984 i 1986; Langajan, 1982).
8.2.1. Svježi pekarski kvasac Kvaščev kolač – svježi prešani kvasac: Pod tim pojmom podrazumijeva se kvaščeva biomasa sa 28-33 % suhe tvari, a proizvodi se uklanjanjem vode iz kvaščeve suspenzije pomoću rotacijskog vakuum filtera ili filter preše, nakon čega se oblikuje i pakira (vidi poglavlje 7.ove knjige). Na slici 8.1. prikazan je prijelom svježeg kvasca, nakon oblikovanja, a prije pakiranja, te pakiranja od 40 g i 1 kg.
Slika 8.1. Prijelom oblikovanog svježeg prešanog kvasca i pakirani svježi kvasac Prednosti ovog oblika pekarskog kvasca su: - standardna kvaliteta, - praktičan oblik pakiranja, - smanjena mogućnost oksidacije kisikom iz zraka, - ekonomična proizvodnja, - dobra trajnost u hladnom prostoru. Nedostaci su: - problem doziranja (nije automatsko), teško se suspendira u vodi, - pad aktiviteta u nepovoljnim uvjetima (visoka temperatura, vlaga), - relativno kratka trajnost pri višim temperaturama. Svježi prešani kvasac dolazi na tržište pakiran u obliku kockica od oko 40 g, za upotrebu u domaćinstvu te u obliku kvadra od 0,5 ili 1,0 kg, za velike i male pekare. Fermentacijska aktivnost ovog kvasca mjerena SJA-fermentografom (Save Job Analysis) 238
iznosi 1700-2000 mL CO2 (pri 35 oC), ili 1400-1700 mL (pri 30 oC). Trajnost mu je oko 7-10 dana na 20 oC, a 20-30 dana pri 4 oC. Pri višim temperaturama (na 35 oC) trajnost se smanji na 3-4 dana. I pored svih nedostataka, ovaj oblik kvasca se najčešće koristi u pekarstvu, tj. u proizvodnji svih vrsta kruha i peciva. Također se može koristiti i za fermentaciju slatkih tijesta, ali mu aktivnost opada znatno ako se tijestu doda više od 10 % šećera. Može se koristiti i za zamrzavanje tijesta, ali se preporučuju posebni namjenski kvasci. Međutim, potrebno je istaknuti da se i namjenski kvasci u ovom obliku najčešće koriste u pekarstvu. Granulirani svježi kvasac: Pod tim pojmom podrazumijeva se usitnjena svježa kvaščeva biomasa s 31-33 % suhe tvari. Proizvodnja ovog oblika kvasca je potpuno ista kao i za sve vrste pekarskog kvasca do kvaščevog kolača. Nakon toga se kvaščeva biomasa usitni u granule veličine 2-3 mm. Zatim se pakira u nepropusne papirnate vreće, često u struji inertnog plina (N2, CO2). Da se smanji problem sljepljivanja čestica, ovaj kvasac se može djelomično osušiti do 65-75 % suhe tvari.
Slika 8.2. Pakirani svježi granulirani kvasac Osim toga, prije oblikovanja svježem kvascu se mogu dodati specifični emulgatori i sredstva za bubrenje, tako da ne dolazi do sljepljivanja. Na taj se način proizvodi tzv. slobodno-protočni kvasac (Pomper i Moore, 1987). Kao i svaki oblik pekarskog kvasca i ovaj ima prednosti i nedostatke. Prednosti su: - lagano doziranje u kontinuiranim pekarskim procesima, - jednostavno vaganje u malim pekarama, - dobra trajnost, - prikladan za velika pakiranja (10-30 kg). Nedostaci su: - osjetljivost na kisik, - mogućnost sljepljivanja čestica. Ovaj oblik kvasca se nažalost još uvijek ne koristi često, osim u SAD-u i nekim Europskim zemljama (Francuska, Nizozemska). U Hrvatskoj se za sada ne proizvodi a niti ne koristi ovaj oblik kvasca.
239
8.2.2. Tekući kvasac-kvaščevo mlijeko Pod pojmom «tekući kvasac» podrazumijeva se kvaščeva suspenzija s 18-20 % suhe tvari koja se dobije izdvajanjem kvasca separacijom iz komine nakon uzgoja. Takav oblik kvasca se doprema u pekare autocisternama ili u posebnim hlađenim posudama, koje su obično pod tlakom zraka, što omogućuje lakše prebacivanja u posebne posude u pekarama (Slika 8.3). Ovaj oblik pekarskog kvasca se sve više koristi u velikim kontinuiranim pekarama, uglavnom za proizvodnju standardnih vrsta kruhova. Da se izbjegne taloženje kvasca, što u pekarama stvara dosta problema, danas se već proizvodi tzv „stabilno kvaščevo mlijeko“ s dodatkom sredstava za bubrenje, kao što su ksantan, guar guma i dr. ( Docter, 1991).
Slika 8.3. Doprema i spremanje tekućeg kvasca u pekari Prednosti tekućeg kvasca su: - lagano razmuljivanje u brašno tijekom zamjesa, - mogućnost automatskog doziranja u kontinuiranim postupcima, - visoka ekonomičnost procesa proizvodnje pekarskog kvasca (nema filtracije i pakiranja kvasca), - dobra aseptičnost u zatvorenim posudama. Nedostaci su: - problem aseptičnog transporta, - mala trajnost pri višim temperaturama, - problem skladištenja u malim pekarama, - taloženjenje kvasca na dno posude. Međutim, u velikim pekarama postoje uređaji za automatsko pranje i dezinfekciju uređaja za transport, čime se problem kontaminacije svede na minimum.
240
8.2.3. Suhi aktivni kvasac (SAK) Standardni: To je oblik SAK-a koji se prije upotrebe treba rehidratirati, pod posebnim uvjetima u mlakoj vodi od 35 oC tijekom 15-30 minuta. Proizvodi se sušenjem, zaštićenog i oblikovanog svježeg kvasca u sitne kuglice od 2-3 mm, do 94 % suhe tvari.
Slika 8.4. Pakirani granulirani suhi aktivni kvasac Prednosti su: - dobra postojanost, - ne mora se pakirati u vakuumu, - dobra trajnost u nepovoljnim uvjetima (zrak, vlažnost), - prikladan za sve vrste pakiranja. Nedostaci su: - nešto manja aktivnost od instant SAK-a, - mora se rehidratirati prije upotrebe, u optimalnim uvjetima (30-35 oC, 15 minuta), - nije prikladan za fermentaciju slatkih tijesta. Ovaj oblik kvasca se još uvijek često koristi, pogotovo u domaćinstvima. Pakira se za domaćinstva u vrećice i limenke po 10, 50, 100, 250 i 500 g, te u većim količinama u limenke najčešće od 3-5 kg i specijalne vreće od 30-50 kg. Najpoznatiji svjetski proizvođači ovog kvasca su Gist-brocades (Nizozemska) i Lesaffre (Francuska), pod nazivom Engedura i Saf-levure (slika 8.4). Instant: Ovaj oblik SAK-a pojavio se 1970-tih godina u Nizozemskoj pod nazivom Fermipan (Langejan, 1972). Kvasci ove vrste imaju visoku fermentacijsku aktivnost, kao i svježi kvasci. Pod pojmom «instant» se podrazumijeva SAK koji se ne mora rehidratirati prije upotrebe. To su obično sitni štapići, dužine 2-3 mm i promjera oko 0.5 mm. Pakira se pod vakuumom u troslojne alu-folije, najčešće u količini od 125 i 500 g i u male vrećice za domaćinstvo, od 8-10 grama u inertnom plinu (dušik ili CO2), kao što se vidi na slici 8.5. Može se pakirati i u količini od 10-15 kg. Ovaj oblik kvasca proizvode mnogi svjetski poznati proizvođači u Europi, sjevernoj Americi (SAD, Canada) i Australiji, kao što su Gist-brocades, Lallemand, Red star, Lesaffre i dr. Zbog svojih pozitivnih karakteristika, prije svega aktivnosti i direktne upotrebe u zamjesu, ovaj oblik suhog aktivnog kvasca se najviše primjenjuje u pekarstvu.
241
Slika 8.5. Pakirani instant suhi aktivni kvasac Prednosti instant suhog kvasca su: - visoka aktivnost, - dobra postojanost, - jednostavno doziranje u kontinuiranim pekarama, - direktna upotreba u pripravi zamjesa, bez rehidratacije. Nedostaci su: - pakiranje pod vakuumom, - ne smije se oštetiti ambalaža, - osjetljivost na kisik iz zraka i svjetlo, - ne može se koristiti za fermentaciju slatkih tijesta iznad 5 % šećera. Kao što se vidi iz karakteristika pojedinih oblika pekarskih kvasaca postoje značajne razlike u svojstvima i primjenama tih kvasaca za pekarske namjene. U tablici 8.2 dat je prikaz usporedbe pojedinih karakteristika svježeg i suhog aktivnog kvasca za pekarstvo. Tablica 8.2. Sastav i aktivnost različitih oblika pekarskog kvasca (Sanderson i sur., 1983) Vrsta kvasca Svježi kvasac Suhi aktivni kvasac kemijski sastav (%) sveži (prešani ) običan standardni instant voda 67,0-72,0 6,3-7,3 4,5-6,5 4,5-6,0 dušik (a) 8,0-9,0 5-8,3 6,5-7,36 7,0-8,0 P2O5 (a) 2,5-3,5 1,7-2,5 2,2-2,5 1,8-2,8 pepeo (a) 4,0-6,5 4,0-6,5 4,0-6,5 4,0-6, Fermentacijska aktivnost (b) zaslađeno tijesto (c) 24,5-26,1 15,8-17,4 15,8-17,4 17,9-20,5 vrlo slatko tijesto (d) 10,9-12,5 9,2-10,0 9,2-10,0 9,2-10,0 siromašno tijesto (e) 25,9-28,8 13,6-14,3 13,6-14,3 20,5-21,9 a-računato na suhu tvar; b-mM CO2 /g s.tv. kvasca/satu; c-dodatak 4-12 % šećara; d-dodatak 15-25 % šećera; e-bez dodatka šećera
242
Kao što se vidi iz tablice 8.2. aktivnost kvaščeve biomase u vrlo slatkom tijestu je prilično smanjena, što se posebno odnosi na suhi aktivni kvasac. Slično je i u proizvodnji kruha, peciva i smrznutog tijesta, gdje prilikom zamrzavanja i skladištenja smrznutog tijesta dolazi do znatnog gubitka fermentacijske aktivnosti kvasca, što je opisano kasnije (točka 2.4). Zato se danas proizvode posebne namjenske vrste kvasaca za te pekarske procese. Shodno tome promjenile su se i karakteristike pojedinih kvasaca, pa podatke u gornjoj tablici treba razmatrati kao pokazatelje karakteristika pojedinih vrsta kvasaca.
8.2.4. Namjenski kvasci 8.2.4.1. Kvasci za slatka tijesta-osmotolerantni kvasci Slatka tijesta sadrže 10-30 % šećera, što izaziva visoki osmotski pritisak u standardnim vrstama pekarskog kvasca. Zato se za fermentaciju slatkih tijesta koriste posebni sojevi kvasca S. cerevisiae s nižom invertaznom aktivnošću, što im povećava osmotsku toleranciju. Danas se već za pekarstvo proizvode svježi i suhi osmotolerantni kvasci (Paul, 1987; Lewis et al.,1997). Osim toga, u Japanu se koristi kvasac Torulospora delbrueckii za proizvodnju osmotolerantnog pekarskog kvasca (Ando i sur., 2003; Suzuki i sur., 2002). Prednosti osmotolerantnog kvasca su: - manji pad akltivnosti u slatkom tijestu, - upotreba SAK-a posebnih karakteristika (osmotolerantni instant SAK), - upotreba drugih vrsta kvasaca. Nedostaci su: - manja fermentacijska aktivnost od standardnih kvasaca u običnom tijestu. 8.2.4.2. Kvasci za smrznuta tijesta Tijekom zamrzavanja i čuvanja tijesta na niskim temperaturama, kvaščeve stanice mogu izgubiti i do 50 % svoje fermentacijske aktivnosti (Lebail i sur., 2001), pa se u uobičajenim postupcima dizanja tijesta uzima veća količina kvasca (30 – 40 %), kako bi se nadomjestio pad aktivnosti. Stoga se danas u proizvodnji kvasca za smrzavanje tijesta upotrebljavaju posebni sojevi kvasca S.cerevisiae koji imaju veću toleranciju na smrzavanje (Carr i Tadini, 2003; Hernandez-Lopez i sur., 2007). U te namjene također se može koristiti i kvasac Torulospora delbrueckii, koja se koristi za proizvodnju pekarskog kvasca u Japanu. Kvasci za smrznuta tijesta proizvode se najčešće u svježem obliku (kvaščev kolač ili granulirani kvasac). Prednosti ovog tipa kvasca su: - manji pad aktivnosti tijekom smrzavanja i skladištenja pri niskim temperaturama Nedostaci su: - uvjeti zamrzavanja i skladištenja moraju biti precizno kontrolirani. - potrebno je dodatno znanje za upotrebu ovih kvasaca. I pored ovih prednosti u proizvodnji kruha i peciva od smrznutog tijesta, preporuča se vrlo kratka fermentacija prije zamrzavanja, te optimalna temperatura i brzina zamrzavanja. Naime, kvasci tijekom smrzavanja tijesta gube aktivnost radi razaranja osnovnih staničnih struktura, koje su stabilnije u fazi mirovanja, a prije razmnožavanja odnosno pupanja.
243
8.2.4.3.Ostali namjenski kvasci Od ostalih namjenskih kvasaca treba spomenuti pivski kvasac za proizvodnju peciva (Italija), te kvasac za proizvodnju tijesta za pizze. Važno je napomenuti da kvasac za proizvodnju pizza ima znatno nižu fermentacijsku aktivnost od standardnih oblika pekarskog kvasca. Slično je i s pivskim kvascem, namijenjenim za pekarstvo. Međutim, pivski kvasac daje specifična (uglavnom bolja) organoleptička svojstva pekarskim proizvodima. Tako se npr. u Italiji za proizvodnju brioša i drugih peciva preporuča korištenje pivskog kvasca proizvedenog za pekarstvo. U proizvodnji tijesta za pizze u novije doba se sve više traže pekarski kvasci s niskom fermentacijskom aktivnošću. Naime, visokofermentativni kvasci nisu prikladni jer tijesto traje vrlo kratko, pa ga se mora često premijesiti. Prednosti kvasaca za proizvodnju pizza su: -tijesto nakon dizanja traje duže, -bolja organoleptička svojstva. Nedostaci su: -mala potražnja i slaba produktivnost u proizvodnji.
Slika 8.6. Suhi aktivni kvasac za pizze
8.3. FERMENTACIJA ŠEĆERA U TIJESTU Brašno sadrži 1-2 % šećera koje kvasci mogu brzo fermentirati. U literaturi postoji mnoštvo različitih podataka o količini fermentabilnih šećera u brašnu, što naravno ovisi o mnogim faktorima (kultivar, podneblje, agrotehničke mjere kultivacije). Osnovni šećeri su glukoza, fruktoza, saharoza i maltoza. Ostale šećere kvasci fermentiraju znatno sporije, dok polisaharide ne mogu fermentirati. Koncentracije pojedinih šećera u brašnu su različite, ovisno o vrstama žitarica koje se primijenjuju u pekarstvu. Međutim, odmah nakon što se zamjesi tijesto, počinju djelovati amilolitički enzimi prisutni u brašnu pa se povećava količina fermentabilnih šećera (glukoza, maltoza) nastalih iz škroba. Brašna uglavnom sadrže dovoljne količine beta-amilaze, pa se tijekom zamjesa u brašno može dodati mala količina alfa-amilaze ili glukoamilaze, kako bi se povećala količina glukoze koju kvasci fermentiraju najbrže.
244
Brzinu nastajanja maltoze u tijestu je teško odrediti, jer ju pekarski kvasac istovremeno fermetira u alkohol i CO2. Na slikama 8.7 i 8.8 su prikazane prosjene količine pojedinih šećera tijekom fermentacije tijesta (Tang i sur.,1972; Oura i sur.,1982)). A 1,8
Koncentracija šećera (% na tijesto)
1,6 1,4 1,2 Maltoza
1
Glukoza 0,8
Fruktoza
0,6 0,4 0,2 0 0
30
60
90
120 150 180 210 240 270 300 330 360 Vrijeme (min)
B 2
Koncentracija šećera (% na tijesto)
1,8 1,6 1,4 1,2
Maltoza
1
Glukoza Fruktoza
0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
30
60
90
120
150
180
210
240
Vrijeme (min)
Slika 8.7. Koncentracija šećera tijekom fermentacije tijesta: A – s dodatkom saharoze tijekom premjesa; B – s dodatkom saharoze na početku (Tang i sur.,1972.)
245
Iz slike 8.7A se vidi da kvasci već u toku zamjesa počinju trošiti šećere, a najbrže potroše glukozu pa onda fruktozu. Nakon 4 sata fermentacije potroši se i sva količina maltoze, čija koncentracija raste sve do 100 minuta ferementacije u tijestu u kojemu nije dodan šećer na početku. Nakon premjesa, pri čemu se doda 5 % saharoze (računato na brašno), naglo porastu količine glukoze i fruktoze, te nešto manja količina maltoze. Nakon toga kvaščeve stanice fermentiraju sve šećere, glukozu nešto brže od fruktoze i maltoze. Treba napomenuti da se saharoza hidrolizira pomoću kvaščeve invertaze veoma brzo, jer je invertazna aktivnost kvasca vrlo visoka pa se saharoza ustvari ponaša kao smjesa glukoze i fruktoze. Iz slike 8.7B se vidi da se maltoza akumulira tijekom 4 sata fermentacije, a troše se glukoza i fruktoza, ako se doda saharoza na početku zamjesa. Nakon 4 sata fermentacije zaostaje više fruktoze, jer se glukoza brže troši. S druge strane, količina maltoze koja nastaje djelovanjem amilolitičkih enzima prisutnih u brašnu, se povećava u tijestu tijekom fermentacije, jer je potrošnja maltoze inhibirana s fermentacijom monosaharida. Međutim, ako se prikaže potrošnja svih šećera u tijestu bez dodatka šećera, tada slika izgleda nešto drugačije (Oura i sur.,1982; slika 8.8). Iz slike se vidi da se najprije potroši glukoza i saharoza zatim fruktoza. Maltoza se počinje trošiti kad se potroše glukoza i saharoza. Naime, saharoza se razgradi invertazom, pa se prividno troši brže od glukoze. Ako se doda 20 - 30 % brašna prvom zamjesu, brzina fermentacije opet poraste jer se troše šećeri iz dodanog brašna. S druge strane, u tijestu bez dodatka pekarskog kvasca koncentracija maltoze raste sve dok ne počne spontana fermentacija pomoću divljih kvasaca i mliječno kiselih bakterija prisutnih u brašnu, 2-3 sata poslije zamjesa tijesta. Tada se počinju trošiti svi šećeri prisutni u tijestu pa se i koncentracija maltoze postepeno snizuje. Kao što je prethodno opisano, fermentacija tijesta s pomoću pekarskog kvasca se može izvoditi na različite načine tj. sa i bez dodatka šećera u brašno tijekom zamjesa. Brža je ako se tijestu doda mala količina šećera (do 5 %). Treba naglasiti da se u suvremenom pekarstvu ne koristi spontana fermentacija, osim za pripremu kiselih startera, što je opisano u točki 4.1.1. ovog poglavlja. 3,5
Udio šećera (g/100 g brašna)
3 Fruktoza
2,5
Glukoza 2 Saharoza 1,5 Maltoza 1
Maltoza-bez pek. kv.
0,5
0 0
1
2
3
Vrijeme (h)
Slika 8.8. Koncentracija šećera tijekom fermentacije tijesta (Oura i sur.,1982) 246
Međutim, treba naglasiti da brzina fermentacije šećera iz tijesta ovisi o količini kvasca i njegovom aktivitetu u datim uvjetima, pa se može reći da je brzina potrošnje šećera: dS/dt = XxA, gdje je X masa kvasca, A aktivitet kvasca (vidi poglavlje 5: Proizvodnja alkohola)
8.3.1. Utjecaj uvjeta okoline na dizanje tijesta 8.3.1.1. Temperatura Dobro je poznato da brzina alkoholne fermentacije, odnosno brzina dizanja tijesta, ovisi o temperaturi tijesta. Pekarski kvasci, koji su prethodno opisani, fermentiraju šećere u tijestu u širokom temperaturnom području, od 10 do 40 oC, najbrže u području 30-35 oC (Harbrech & Kautzman, 1967; Therdthai i sur, 2002), što se vidi na slici 8.9. Na slici se također vidi da krivulje pokazuju diauksije, zbog potrebnog vremena adaptacije kvasca za potrošnju maltoze. Iz slike se također vidi da je fermentacija šećera u tijestu najbrža pri 35 oC. 220 200 180
ml CO 2 / 10 min
160 140 27,5 °C
120
30,0 °C 100
32,5 °C 35 °C
80 60 40 20 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Vrijeme (min)
Slika 8.9. Utjecaj temperature tijesta na proizvodnju CO2 tijekom fermentacije (Therdthai i sur, 2002) Utjecaj većeg raspona temperatura na brzinu dizanja tijesta, odnosno aktivnost kvasca u tijestu prikazan je u tablici 8.3. Iz tablice se može zapaziti da kvasci u smrznutom tijestu pri -20o C nemaju nikakve aktivnosti. U području ispod 20o C i iznad 40o C rast kvasca je znatno usporen, a time i fermentacijska aktivnost. Kvasci dobro rastu u području 20-27o C, a najbolje pri 30-33o C, ali je najbolja fermentacijska aktivnost za dizanje tijesta oko 35o C. To vrijedi za standardne vrste pekarskog kvasca, u kojem se nalazi kvasac S. cerevisiae. Međutim, ako se koristi pivski kvasac za dizanje tijesta, onda su optimalne temperature u tijestu nešto niže i kreću se u području 25-30 oC.
247
Tablica 8.3. Aktivnost pekarskog kvasca ovisno o temparaturi tijesta Temperatura (oC) Aktivnost -20 nema aktivnosti <20>40 rast kvasca smanjen 20-27 kvasci dobro rastu i dižu tijesto 27-38 optimalno područje za dizanje tijesta 35 optimalna brzina dizanja tijesta >50 kvaščeve stanice ugibaju
8.3.1.2. pH vrijednost Pekarski kvasac ima dobru fermentacijsku aktivnost u širokom području pH vrijednosti (Cooper i sur.,1968). Naime, pH unutar kvaščeve stanice je konstantan i iznosi oko 5,86.2, a tu vrijednost kvasci održavaju jako dobro u pH području od 3-7. Međutim, brzina fermentacije je konstantna u pH području 4-6. Ispod pH 4 aktivnost naglo opada, dok prema alkalnom području pada sporije. U tradicionalnim pekarskim procesima, sa i bez dodatka šećera, pH se tijekom fermentacije kreće u području od 4,2-5,5 (slika 8.10), što je optimalno pH područje. 5,4
5,2
5
4,8
pH
I dizanje II dizanje 4,6
4,4
4,2
4 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Vrijeme fermentacije (min)
Slika 8.10. Promjene pH vrijednosti tijekom fermentacije tijesta (Reed i Nagodawithana,1991) Iz slike 8.10. se vidi da se pH tijekom fermentacije tijesta smanjuje, što je rezultat nastanka CO2 plina i organskih kiselina. Isto tako iz slike se vidi da pH poraste u toku premjesa, jer se istisne CO2. U pekarskoj proizvodnji naravno ima odstupanja od tih standardnih vrijednosti. Tako u proizvodnji kruha i peciva s kiselim tijestom pH često padne ispod 4, pa se znatno uspori brzina fermentacije. Uloga kvasca u kiselom tijestu bit će opisana nešto kasnije, u istom poglavlju, je se u tim fermentacijama koriste drugi kvasci (divlji, pivski, vinski itd.).
248
8.3.2. Osmotski tlak Fermentacijska aktivnost kvaščeve biomase se smanjuje s povećanjem osmotskog tlaka koji stvaraju visoke koncentracije šećera i soli u tijestu. Taj fenomen je poznat pekarima još prije no što su ti fenomeni bili objašnjeni. Općenito, svi fermentabilni šećeri u koncentraciji iznad 5 % imaju inhibicijski učinak na fermentacijsku aktivnost kvašćevih stanica. Inhibicijski učinak, naravno, raste sa povećanjem koncentracije šećera (Attfield i Kletsas, 2000). Glukoza, fruktoza i saharoza imaju veći inhibicijski učinak nego maltoza. Saharoza ima gotovo isti osmotski učinak kao i smjesa glukoze i fruktoze, jer standardne vrste pekarskog kvasca imaju visoku aktivnost invertaze, pa saharoza ulazi u kvaščeve stanice kao smjesa glukoze i fruktoze, što je već spomenuto. S druge strane, maltoza je disaharid kao i saharoza, ali se transport maltoze u kvašćeve stanice odvija drugačije od saharoze. Maltoza ulazi u kvašćeve stanice kao disaharid i cijepa se unutar stanice s maltazom na dvije molekule glukoze. Taj je transport znatno sporiji od glukoze i fruktoze pa je to razlog da maltoza izaziva manji osmotski tlak (slika 8.11). Iz slike 8.11 se vidi da sve koncentracije šećera veće od 5 % negativno utječu na brzinu fermentacije, dok dodatak šećera do 4 % povećava fermentacijsku aktivnost kvasca, što je posebno izraženo kada se koristi brašno siromašno na šećerima. Slične rezultate dobio je Shultz već 1956. godine.
ml CO 2 / 2x1 sat
2000
Saharoza
1500
Glukoza Maltoza
1000 0
2
4
6
8
10
% šećera
Slika 8.11. Utjecaj koncentracije različitih šećera na fermentacijsku aktivnost svježeg pekarskog kvasca (Reed i Nagodawithana,1991) Važno je naglasiti da se za zaslađivanje tijesta najčešće koristi saharoza. Zato osmotolerantni kvasci trebaju imati nisku aktivnost invertaze, da ne dođe do brzog unosa šećera u kvaščeve stanice. Međutim, u proizvodnji fermentiranih slastica sve češće se koristi fruktozni sirup koji je slađi od saharoze, pa je za isti učinak potrebno dodati znatno manje šećera. To je povoljno iz zdravstvenih razloga, a ima i povoljan učinak na fermentacijsku aktivnost kvasca. Za fermentaciju slatkih tijesta koriste se različiti osmotolerantni kvasci (Ando i sur., 2003; Alves-Arauji i sur., 2004; Hernandez-Lopez i sur., 2003 i 2007), kao što je prethodno opisano. S druge strane, kuhinjska sol NaCl također stvara osmotski tlak, koji isto tako može znatno umanjiti fermentacijsku aktivnost. Naime, kvaščeve stanice djelomično dehidriraju obzirom na povišeni osmotski tlak i na taj način gube dio aktivnosti. Stres izazvan s NaCl u S. cerevisiae naročito 249
inhibira fermentaciju maltoze (Trainotti i Stambuk, 2001). Utjecaj dodatka soli u tijesto na fermentacijsku aktivnost prikazuje slika 8.12. 2500
A, ml CO 2 / 2x1
2000
1500
Soj "A" Soj "B" Soj "C"
1000
500
0 0
1
2
3
4
5
Koncentracija NaCl (%)
Slika 8.12 . Utjecaj soli na fermentacijsku aktivnost svježeg pekarskog kvasca (Trainotti i Stambuk, 2001). Sol se dodaje u kruh radi poboljšanja okusa kruha, najčešće u količini od 1,5 do 2.5 % računato na brašno. Količina dodane soli često ovisi o državnim propisima pojedinih zemalja. Naime, veća količina soli se ne preporuča iz zdravstvenih razloga, pa se u nekim Skandinavskim zemljama plaća posebna taksa ako je koncentracija soli veća od 1,2 %. Ipak treba napomenuti da je kruh s količinom soli manjom od 1,6 % neslan, a s količinom soli većom od 2,2 % preslan. Kako se fermentacijska aktivnost najčešće mjeri u tijestu s dodatkom od 1,5 % soli, pad aktivnosti kvasca je gotovo zanemariv u proizvodnji standardnih vrsta kruha i peciva.
8.3.3. Fermentacijska aktivnost kvasca u smrznutom tijestu Upotreba smrznutog tijesta u suvremenom pekarstvu je u porastu, pogotovo u razvijenim zemljama, jer se tim procesom štedi vrijeme, prostor i radna snaga. Usprkos dodatnim troškovima za zamrzavanje i skladištenje smrznutog tijesta taj proces je atraktivan u pripremi kontinuirano svježe pečenih pekarskih proizvoda, posebno za fleksibilne pekare koje proizvode više vrsta različitih proizvoda u jednom danu. Međutim, kvaliteta pekarskih proizvoda učinjenih iz smrznutog tijesta često je lošija od onih koji su izrađeni bez zamrzavanja tijesta. U suvremenoj literaturi postoje brojni radovi koji se odnose na problematiku zamrzavanja tijesta, a većina od njih spominje, kao razloge za lošiju kvalitetu pekarskih proizvoda, pad fermentacijske aktivnosti kvaščeve biomase i razaranje glutenske mreže s kristalićima leda u tijestu tijekom zamrzavanja (Berland, 1993 ; Le Bail i sur.,1999; Havet i sur., 2000; Baking update, 1996). U ovom poglavlju posebna pažnja bit će posvećena padu aktivnosti pekarskog kvasca u smrznutim tijestima. Odmah na početku, važno je naglasiti da je pad aktivnosti veći u smrznutom tijestu nego kada se direktno zamrzne prešani kvasac (La Bail i sur, 1999). Gubitak fermentacijske aktivnosti kvaščevih stanica u smrznutom tijestu može iznositi i preko 50 % od početne aktivnosti, što je neprihvatljivo za pekarstvo. Razlozi gubitka aktivnosti pekarskog kvasca u smrznutom tijestu su mnogobrojni, pa će biti objašnjeni u slijedećim točkama. 250
8.3.3.1. Vrste kvasaca za smrzavanje Fermentacijska aktivnost kvasca u smrznutom tijestu prije svega ovisi o vrstama pekarskih kvasaca, te o sojevima unutar istih vrsta. U tu svrhu najčešće se koriste kriorezistentni sojevi kvasca Saccharomyces cerevisiae i diploidni kvasac Torulaspora delbrueckii (Takano i sur., 2002; Suzuki i sur., 2002; Alves-Arauji i sur., 2004). Fermentacijska aktivnost prešanih kvasaca u smrznutom tijestu prikazana je u tablici 8.4. Tablica 8.4. Fermentacijska aktivnost kvasaca u smrznutim tijestima (Baking update,1996) Vrijeme dizanja tijesta do zadanog Proizvodnja plina u tijestuu volumena (min) jedinice-Eagle brzi test Kvasac početno za 90 dana omjer(%) kvasac početno zamrznuto omjer (%) A 67 93 72 A 30,0 22,4 75 B 66 89 67 B 30,0 20,1 67 C 55 98 56 C 26,2 16,5 63 D 51 93 55 D 33,3 19,7 59 E 46 88 52 E 30,7 14,4 47 F 47 98 48 F 40.0 18,3 46 Iz tablice 8.4 je vidljivo da se različite vrste kvasaca značajno razlikuju u stabilnosti tijekom smrzavanja. Također se može uočiti da je pad aktivnosti nakon smrzavanja veći kod kvasaca koji imaju inicijalno veću fermentacijsku aktivnost. Neki autori također navode da postoje znatne razlike što se tiče postojanosti kvaščeve biomase tijekom zamrzavanja ovisno o pojedinim proizvodnim šaržama istog proizvođača (Gelinas i sur., 1989). Razlog za to su uglavnom uvjeti uzgoja (sastav podloge, aerobnost procesa) i kemijski sastav kvaščeve biomase (količina proteina, trehaloza) što je ustvari rezultat uvjeta uzgoja (Tanghe i sur, 2002; Le Bail i sur, 1999). Prema istraživanjima ovih autora, aerobnost procesa povećava stabilnost S druge strane, veća količina trehaloze, a nešto manja količina proteina, djeluju povoljno na stabilnost kvasca u smrznutom tijestu. U tablici 8.5 prikazani su čimbenici o kojima ovisi kriorezistencija kvaščeve biomase. Tablica 8.5. Čimbenici koji povoljno djeluju na stabilnost kvasca tijekom zamrzavanja Čimbenici Povoljno djelovanje Uvjeti uzgoja u proizvodnji Aerobnost procesa, bogati sastav podloge Kemijski sastav kvaščeve biomase Trehaloza iznad 10 %, Proteini oko 45 % Za proizvodnju pekarskog kvasca koji ima visoku stabilnost u smrznutom tijestu najviše se koriste: -Odabrani sojevi kvasca Saccharomyces cerevisiae (Takano i sur.,1998; 2002; Suzuki i sur., 2002). -Posebne vrste kvasaca, sojevi kvasca Torulospora delbrueckii (Hernendez-Lopez i sur., 2007). Ako nema namjenskih kvasaca za zamrzavanje, preporuča se upotreba svježeg kvaščevog kolača ili djelomično osušenog kvasca (oko 75 % suhe tvari) koji se može čuvati duže vrijeme u zamrznutom stanju, dok primjena suhog aktivnog kvasca nije preporučena zbog velikog pada fermentacijske aktivnosti tijekom smrzavanja i skladištenja.
251
8.3.3.2. Priprema i fermentacija tijesta prije zamrzavanja Prema literaturnim podacima (Baker's journal, 2003) preporuča se što kraća priprema tijesta pri nižim temperaturama, tako da fermentacija tijesta bude što kraća. Naime, poznato je da je kvaščeva biomasa prije početka fermentacije u stanju gladovanja ili mirovanja najstabilnija tijekom skladištenja a isto tako i zamrzavanja. Uvjeti zamjesa tijesta, koji se preporučuju u mnogim literaturnim napisima, dati su tablici 8.6. Tablica 8.6. Priprema i fermentacija tijesta prije zamrzavanje Priprema tijesta Preporučivi uvjeti Vrijeme zamjesa do 30 min. Temperatura tijesta za zamrzavanje 19-22 0C Dodatak razmuljenog kvasca Pri kraju zamjesa 8.3.3.3. Postupak zamrzavanja tijesta Postupak zamrzavanja tijesta ima znatan utjecaj na stabilnost odnosno aktivnost pekarskog kvasca u smrznutom tijestu, što je prikazano na slikama 8.13, 8.14 i 8.15. Iz slike 8.13. se vidi da je jako brzo smrzavanje tijesta nepoželjno za vitalnost kvaščevih stanica. Također se može uočiti da niti polagano smrzavanje nije najpovoljnije pa se iz prikaza može zaključiti da je optimalna brzina smrzavanja oko 0,5-0,7 oC/min. 70
60
Aktivnost (%)
50
40
30
20
10
0 0,5
0,75
1
10
50
500
Brzina zamrzavanja (°C /min)
Slika 8.13. Preživljavanje kvaščevih stanica u ovisnosti o brzini zamrzavanja. (Uzunova-Doneva i Donev,2002) Shodno prethodnim navodima o preživljavanju kvaščevih stanica, uvjeti zamrzavanja utječu znatno i na fermentacijsku aktivnost kvaščeve biomase. Havet i sur. (1999, 2000) su dokazali da s porastom brzine zamrzavanja opada fermentacijska aktivnost (moć dizanja tijesta) što je prikazano na slici 8.14.
252
Slika 8.14. Moć dizanja tijesta u ovisnosti o uvjetima zamrzavanja (Havet i sur.,2000) Ref-Standardni zamjes bez smrzavanja, 1-smrzavanje na –20 0C, brzina strujanja zraka 1 m/sek, 2-smrzavanje na –20 0C, brzina strujanja zraka 2 m/sek, 3smrzavanje na –20 0C, brzina strujanja zraka 3 m/sek. Iz slika 8.14. se vidi da je volumen tijesta u proizvodnji kruha manji ako se koristi smrznuto tijesto. Međutim, volumen kruha, učinjenog iz smrznutog tijesta, je veći ako je zamrzavanje sporije. Isti autori su također pokazali da je aktivnost kvasca veća na površini smrznutog kruha od onog u sredini kruha što je u suglasju s autorima koji govore da je pad aktivnosti prešanog kvasca manji od onog u tijestu. To drugim riječima znači da pri velikim brzinama smrzavanja dolazi do većeg oštećenja kvaščevih stanica s kristalićima leda u unutrašnjosti kruha. Isto tako, pri većim brzinama smrzavanja dolazi do većih oštećenja glutenske mreže, što također negativno utječe na postizanje željenog volumena kruha nakon odmrzavanja. Međutim, ako je tijesto pravilno smrznuto kvasac ima minimalni pad aktivnosti, te su rezultati u proizvodnji kruha i peciva znatno bolji u svakom pogledu. 450 Vol CO2
Volumen (cm3/100 g tijesta)
400
Vol CO2 - bez smrzavanja Vol tijesta
350
Vol tijesta - bez smrzavanja 300 250 200 150 100 50 0 0
40
80
120 160 Vrijeme (min)
200
240
280
Slika 8.15. Proizvodnja CO2 i porast volumena kruha u ovisnosti o pripremi kruha (Havet i sur.,1999); bez zamrzavanja; smrznuto na -20 0C pri brzini strujanja zraka od 3 m/sek.
253
Iz slike 8.15. se vidi da je kvasac u nesmrznutom tijestu u početku nešto aktivniji od onog u smrznutom. Tek nakon početnih 40-50 minuta fermentacije, brzina dizanja tijesta nakon odmrzavanja je skoro ista u oba slučaja. Iz toga se može zaključiti da je proračun za pad aktivnosti specifičan i ovisi o vremenu fermentacije. 8.3.3.4. Uvjeti skladištenja smrznutog tijesta Uvjeti skladištenja smrznutog tijesta imaju također važan utjecaj na očuvanje fermentacijske aktivnosti kvaščeve biomase, što je prikazano na slici 8.16. Iz slike se vidi da fermentacijska aktivnost kvasca u zamrznutom tijestu, odnosno volumen kruha ovisi i o načinu skladištenja smrznutog tijesta. Rezultati istraživanja pokazuju da već kod minimalnih oscilacija temperature (+/- 0,4 0C pri –22 0C) tijekom skladištenja dolazi do nepoželjnih promjena u fermentacijskoj aktivnosti kvasca. Pri većim oscilacijama fermentacijska aktivnost kvasca se smanji za 30 - 50 %, što je više od očekivanog u navedenim uvjetima (Phimolsiripol i sur., 2008). Iz ovih prikaza se lako može zaključiti da je proces zamrzavanja i skladištenja tijesta prilično kompleksan, te ako se ne izvede u optimalnim uvjetima, može doći do znatnog pada aktivnosti kvaščevih stanica, što je nepoželjno za fermentativne procese u pekarstvu. 360
Volumen tijesta (cm
3
/100g)
320
280 Uvjeti 1 240
Uvjeti 2 Uvjeti 3
200
160
120 0
9
17
38
Dani
Slika 8.16. Volumen fermentiranog tijesta ovisno o uvjetima skladištenja smrznutog tijesta ( LeBail i sur.,.1999) 1 – skladištenje pri –22°C, s precizno reguliranom temperaturom 2 – skladištenje pri –22°C, s malim odstupanjem (+/- 0,4°C) 3 – skladištenje pri –22°C, s porastom na –8°C jedan dan prije završetka skladištenja. 8.3.3.5.Odmrzavanje smrznutog tijesta Kako uvjeti odmrzavanja tijesta utječu na fermentacijsku aktivnost kvasca i kvalitetu pekarskih proizvoda, nema preciznih podataka, a neki su i proturječni. Ipak, iz dostupnih napisa može se uočiti da se preporučuje stupnjevito odmrzavanje, čime se umanjuje
254
kondenzacija na površini kruha. Isto tako, neki autori navode da su optimalne temperature odmrzavanja između 30-37 0C (Giannou i sur., 2005).
8.4. OKUS I MIRIS KRUHA Okus i miris kruha koji se priprema fermentacijom s pekarskim kvascem su vrlo dobri. Naime, tijekom alkoholne fermntacije u tijestu osim CO2 i alkohola nastaje i mnoštvo drugih spojeva, koji uglavnom pozitivno utječu na okus i aromu kruha (Frasse i sur., 1993). To se posebno odnosi na nešto duže fermentacije tijesta, jer se tijekom brzih fermentacija u kontinuiranim procesima proizvodnje kruha s visokoaktivnim kvascima proizvode uglavnom CO2 i etanol, a vrlo malo aromatičnih tvari. Stvaranje okusa i mirisa tijekom fermentacije tijesta slično je procesima fermentacije mošta i sladovine u proizvodnji vina i piva, što je opisano ranije, jer se radi o sličnim procesima alkoholne fermentacije. Međutim, većina tvari okusa i mirisa se stvara tijekom pečenja kruha, uglavnom reakcijama nusproizvoda alkoholne fermentacije i spojeva prisutnih u brašnu, kao što su šećeri i aminokiseline. Stvaranje tvari okusa i mirisa kruha detaljno je opisao Pyler (1988). Spojevi koji nastaju tijekom fermentacije i pečenja kruha navedeni su u tablici 8.7. Tablica 8.7. Spojevi koji nastaju tijekom fermentacije tijesta i pečenja kruha (Pyler,1998) Organske kiselina Alkoholi Aldehidi i ketoni Karbonilni spojevi Mravlja Mliječna Etanol Formaldehid Furfural Octena Kaproična Izobutanol Acetaldehid Hidroksi metil Maslačna n-Propanol Propionaldehid Furfural Izokaproična Amilni alkohol Izovaleraldehid Metional Izomaslačna Kaprilična Izoamilni alk Izobetiraldehid Glioksal Propionska Kaprinska 2,3-butandiol n-Valeraldehid 2-Metil butanal Valerijanska Laurinska 2-Metil n-Heksaldehid 3-Metil butanal Izovalerijanska Miristična butanol 3-Butanon Heptanoična Itakonska 2-Fenil etil-alk. Diacetil Piruvatna Levulinska Acetoin Palmitinska Benzilična Krotonična Ako se usporede spojevi koji utječu na aromu piva i vina sa spojevima prikazanim u tablici 8.7. pronaći će se mnogo sličnosti. Zato vrijedi i za fermentaciju tijesta da se bolji okus i miris tijekom tijesta postiže pri nižim temperaturama fermentacije i u dužem vremenskom periodu. Ipak treba naglasiti da je okus i miris kruha još bolji ako se fermentacija tijesta obavlja s mješovitim kulturama, odnosno starterima u kojima osim kvasaca ima i bakterija mliječno kiselog vrenja. Kvaščeva biomasa u većini slučajeva ne utječe značajno na okus i miris kruha.Tako, dodatak od 1-2 % neaktivnog prehrambenog kvasca utječe vrlo malo na promjenu okusa i mirisa. Međutim, pri višim koncentracijama kvasca, tiamin i tiamin difosfat mogu dati kruhu nepoželjan okus. To može biti problem u fermentacijama slatkih tijesta gdje se moraju uzeti veće količine kvasca (5-8 %), ako se ne koriste osmotolerantni kvasci.
255
8.4.1. Primjena kiselih startera u proizvodnji kruha Upotreba kiselih startera u proizvodnji kruha datira još iz doba starog Egipta prije 5000 godina, što je opisano i u Bibliji. Slično tome, kisele startere primjenjivali su u 19. i 20. stoljeću kopači zlata u sjevernoj Americi u proizvodnji kruha, jer kvasca nisu niti imali niti su ga mogli nabaviti. Jednostavno rečeno, kiselo tijesto (starter) je prirodno sredstvo za dizanje tijesta, koje se dobije tako da se smjesa brašna i vode ostavi stajati 24-48 sati na toplom mjestu da se u njemu razmnože kvasci i bakterije nastanjene u brašnu. Ako je miris dobar, osnovnom kiselom tijestu doda se još brašna i vode da se proizvede željena količina prirodnog startera. Međutim, spontano umnožavanje kvasaca i bakterija u tijestu može isto tako omogućiti i rast nepoželjnim mikroorganizmima kojih također može biti u brašnu. Stoga se u novije vrijeme u suvremenom pekarstvu kisela tijesta pripremaju s posebno selektiranim kvascima i bakterijama, čiji broj pri nacjepljivanju mora biti znatno veći od onog u brašnu, tako da odabrane mikrobne kulture u kiselom tijestu postanu dominantne. Selektirane starter-kulture za kiseljenje tijesta moraju imati slijedeće karakteristike: ● Moraju zadržati inicijalna svojstva nakon dehidratacije (liofilizacije), ● Liofilizirani mikroorganizmi moraju dobro i brzo rasti u hranjivoj podlozi, što mora biti prilagođeno njihovom kasnijem rastu u smjesi brašna i vode. Dakle, moraju brzo reaktivirati svoj metabolizam u tijestu, ● Zadovoljavajući omjer kiselina (mliječna i octena 3:1 do 4:1), ako su u starteru prisutne heterofermentativne bakterije. Upotreba kiselih startera naročito se razvila u proizvodnji kruha od raženog brašna, jer tijesto koje sadrži bilo koju količinu raženog brašna zahtijeva kiseljenje. Kako se raž primjenjuje u proizvodnji kruha i peciva u mnogim razvijenim Europskim zemljama, naročito u sjevernim, istočnim i srednjoevropskim, a sve više i u Hrvatskoj, primjena kiselih startera je sve interesantnija. Spicher (1999) je detaljno opisao svojstva kiselih tijesta koja se primjenjuju za poboljšanje kvalitete tijesta odnosno kruha, a to su: čvrstoća kruha (elastičnost, struktura, konzistencija i trajnost) te miris i okus. Problem pri upotrebi raženog brašna u proizvodnji kruha je stještena struktura glutena, koji se bitno razlikuje od glutena iz pšeničnog brašna pa je dobro došlo kiseljenje, da se gluten lakše strukturira. Zakiseljavanje tijesta se može obaviti i organskim kiselinama kao što su mliječna, propionska te smjesa octene i mliječne kiseline. U suvremenom pekarstvu dokazano je da je primjena kisele fermentacije tijesta, koja se zbiva istovremeno s fermentacijom tijesta s kvascima, znatno bolja od zakiseljavanja s organskim kiselinama, jer se osim kiseljenja postižu i dobar okus, miris i trajnost pekarskih proizvoda. (Decock i Cappelle, 2005; Carnevalli i sur., 2007). Ipak, dodatak kiselina u raženo tijesto ima određene svrhe, a to su: snižavanje pH i poboljšanje strukture glutena, te jednostavnost i pouzdanost u tehnološkom procesu. Dakle, pod pojmom kisela fermentacija podrazumijeva se fermentacija tijesta u kojoj MKB uzrokuju mlječno kiselu fermentaciju. U tu svrhu primjenjuju se najčešće bakterije iz roda Lactobacillus, Pediococcus, Streptoccocus i Leuconostoc (Scheirlinck i sur., 2007), a prema metabolizmu izvora ugljika (šećera) dijele se na homofermentativne i heterofermentativne, što je prikazano u tablici 8.8.
256
Tablica 8.8 . MKB koje se najčešće primjenjuju u fermentaciji tijesta Homofermentativne Heterofermentativne Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Lactobacullus farcimins Lactobacilus amylovorus Lactobacillus jonsonii Lactobacillus delbrueckii Pediococcus spp Streptoccocus spp
Lactobacillus fermentum Lactobacillus sanfranciscensis Lactobacillus reuteri Lactobacilus pontis Lactobacillus panis Leuconostoc mesenteroides
Iz tablice 8.8. se vidi da su u kiselim tijestima najdominantnije bakterije iz roda Lactobacillus. Homofermentativne bakterije proizvode samo mliječnu kiselinu, dok heterofermentativne uz mliječnu proizvode octenu kiselinu, alkohol i CO2. Obje organske kiseline (mliječna i octena) su važne za kiseljenje raženog brašna (tijesta) te za miris i okus tijesta i pečenih proizvoda (Hansen i Schiberle, 2005). Za kiseljenje tijesta važan je omjer mlječne i octene kiseline te njihova količina u tijestu, što je najčešće odraz uvjeta okoline pri fermentaciji tijesta. Smatra se da u punom kiselom tijestu treba biti oko 1 % mlječne i 0,2-0,3 % octene kiseline ( Spiecher, 1999). Osim MKB u prirodnim kiselim starterima vrlo često su prisutni i divlji kvasci, kao što su: C. crusei, C. mulleri, S. exiguus, S. uvarum, Torulopsis holmii, C. humilis, Pichia saitoi i drugi (Gobetti i sur.,1994; Damiani i sur.,1996; Meroth i sur. 2003; DeVuyst i Neysens, 2005). Broj MKB u starterima naraste do 107/g i više te oko 106/g kvasaca. Rast bakterija i kvasaca inhibiran je niskim pH vrijednostima, pa to treba uzeti u obzir u proizvodnji startera zbog vitalnosti stanica. Zato je poželjno da pH–vrijednost startera ne padne ispod 4. U suvremenom pekarstvu sve više se koriste komercijalni pripravci u suhom ili mokrom (meko tijesto) stanju. To su najčešće mješavine različitih starter kultura MKB i kvasaca. Međutim, mogu biti i starteri od pojedinačnih kultura bakterija kao što su L. brevis L -22 i L62. Ovdje je neophodno razlučiti pojmove starter kulture od startera. Naime, često se ova dva pojma poistovjećuju. Pod pojmom starter kulture podrazumijevaju se pojedinačne vrste kvasaca i bakterija, a starter je pripremljeno cjepivo od starter kultura. Pod pojmom starter ima puno naziva, kao što su: kiselo tijesto, predferment, cjepivo itd. To su nazivi koji se odnose na bilo koje sredstvo za dizanje tijesta u pekarstvu. Mliječno kisele bakterije se mogu uključiti u fermentaciju tijesta na više načina: spontana fermentacija, reciklacija punog kiselog tijesta i upotreba startera definiranog mikrobnog sastava. 8.4.1.1. Spontana fermentacija. Spontana fermentacija se izvodi tako da se brašnu (oko 100 grama) doda dvostruka količina vode i ostavi stajati pri 25-30 oC 24-48 sati. Nakon toga, ako starter ima ugodan miris, doda se početnom starteru dvostruka količina smjese brašna i vode u omjeru 1:1 i pusti stajati 24 sata kako bi se razmnožile bakterije i divlji kvasci. Kada se pripremi dovoljna količina startera (kiselog tijesta) radi se završni zamjes s 20-30 % kiselog tijesta i sa dodatkom od oko 1 % pekarskog kvasca i fermentira 2-3 sata, odnosno dok se ne digne tijesto do željenog volumena. To je tradicionalni način pripreme početnog startera, koji se koristi i danas u pripremi različitih startera, što je prikazano na slici 8.17.
257
A
B
Slika 8.17. Priprema kiselih tijesta- startera: A-početak pripreme; B-aktivirani starter 8.4.1.2. Reciklacija kiselog tijesta Najčešći način u primjeni kiselog tijesta je reciklacija dijela (20-30 %) fermentiranog tijesta (puno kiselo tijesto) za narednu fermentaciju. Daljnji proces pripreme kruha može se obaviti u nekoliko stupnjeva. Tako u procesu od tri (3) stupnja postoje: starter, početno (svježe) i puno kiselo tijesto, te završni zamjes (slika 8.18.). Starter Svježe kiselo tijesto
Puno kiselo tijesto Završni zamjes Slika 8.18. Shematski prikaz procesa proizvodnje kruha s kiselim tijestom Dakle, ponovno se priprema puno kiselo tijesto. Postoje naravno i puno jednostavniji procesi, u dva stupnja, gdje se uzeti dio od prethodnog zamjesa direktno, bez umnožavanja koristi u završnom zamjesu. Ipak treba naglasit da je tada potrebna duža fermentacija završnog tijesta. Ovaj proces se radi jednostavnosti koristi sve više. Međutin, ovaj proces se ne može izvoditi u nedogled, jer često dolazi do promjene svojstava kiselog tijesta odnosno broja i količine mikroorganizama u kiselom starteru. 8.4.1.3. Upotreba startera definiranog mikrobnog sastava U suvremenom pekarstvu koriste se sve više starteri poznatog mikrobnog sastava, što se može kontrolirati dobro poznatim metodama. Čim dođe do značajnih promjena uvodi se novi starter, da se održi jednoličnost proizvodnje. Obzirom na način priprave sredstva za dizanje tijesta (kiselog startera) na svjetskom tržištu se nalaze brojni komercijalni starteri (tablica 8.9.)
258
Tablica 8.9. Starteri koji se najčešće koriste u pekarstvu Naziv Porijeklo Karakteristika startera startera Prirodni starter za dizanje tijesta, koji se učini tako da se Chef Francuska smjesa brašna i vode ostavi stajati na sobnoj temperaturi 2448 sati. To je prvi stupanj u proizvodnji kruha. Levain Francuska Prirodni mješani starter čvrstoće kao tijesto. Radi se iz chefa kojem se radi umnožavanja doda brašno i voda. Biga Italija Starter proizveden s dodatkom svježeg pekarskog kvasca na početku pripreme kiselog tijesta. Prirodni starter koji se priprema iz svježe mljevenog punog Desem Nizozemska pšeničnog brašna i čiste neklorirane vode, te se inkubira pri niskim temperaturama (10-15oC). Proces traje 7 dana uz nadohranu s brašnom i vodom svaki dan. Barm Engleska Prirodni mješani starter, s dodatkom «ale» pivskog kvasca na početku priprave, pa ima gorkast okus. Sourdough Amerika Kiselo tijesto. Naziv za bilo koji kiseli starter, pogotovo ako se odnosi na prirodne mješane startere. Anstellgut Njemačka Prirodni starter za dizanje tijesta, sličan chef-u Sauerteig Njemačka Njemački naziv za kiselo tijesto. Prirodni starteri. Drugi nazivi za startere koji se mogu pronaći u literaturi su: sourdough starter, sponge, old dough, inokulum, mother dough, culture, mother starter, hoch, natural leaven, incubate, volsauer, anfrishsauer, lactobacili i dr. (Baking com., 2008). Većina ovih startera se priprema na tradicionalan način, što ih čini specifičnim za proizvodnju različitih pekarskih proizvoda Takvi starteri se mogu nabaviti u različitim oblicima (kao svježe kiselo tijesto), a najčešće proizvedeni starteri su osušeni i zapakirani (Slika 8.19).
Slika 8.19. Osušeni starteri za pripremu kiselih tijesta Osim toga, proizvodnja raženog kruha i drugih pekarskih proizvoda može se obaviti pomoću umnoženih pojedinačnih starter-kultura, što prikazuje slika 8.20.
259
Slika 8.20. Proizvodnja raženog kruha s poznatim starter-kulturama Naime, ovakav način rada je prikladan za proizvodnju različitih pekarskih proizvoda sa definiranim starter-kulturama, na relativno jednostavan način. Da bi se dobio kvalitetan pekarski proizvod, svakako je neophodno tijekom fermentacije kontrolirati faktore koji mogu bitno utjecati na kakvoću pekarskih proizvoda, a to su temperatura, iskorištenje tijesta, količina startera, količina NaCl-a i dr. Kao što je već opisano, svi kiseli starteri se primjenjuju u proizvodnji kiselih kruhova iz raženog brašna miješanog s pšeničnim brašnom. Primjenjuju se različiti postupci u Europi, što je detaljno opisao Spiecher (1982), a također i u SAD-u, što je opisao Pyler (1988). Procesi proizvodnje bijelog kiselog kruha od pšeničnog brašna također su poznati ( Paraminthiotis i sur, 2005). Svakako je najpoznatiji San Francisco proces u kojem se proizvodi bijeli pšenični kruh pomoću kiselog tijesta. Kruh ima specifičan okus i miris. Izuzetno je popularan u SAD-u. Kruh je dosta kisel, pa s takovim kruhom nisu zadovoljni Europljani. Proces je sličan onima gdje se koristi kiselo tijesto u proizvodnji raženih kruha (Kitahara, i sur., 2005). Međutim, trajnost kruha je znatno bolja od standardnog bijelog pšeničnog kruha. Zato je ovaj proces vrlo interesantan. Najveći problem ovog procesa je očuvanje vitalnost bakterije L. sanfranciscensis, koja dobro raste samo u bogatom mediju. Osim toga, u ovim starterima je gotovo uvijek prisutan i kvasac S. exiguus koji fermentira šećere i pri vrlo niskim pH vrijednostima. Zato autori ističu njegovu važnost i nužnost u kiselim tijestima (Gobbetti, 1998). Načini proizvodnje kiselih tijesta i kruha prikazani su na slici 8.21.
260
Slika 8.21. Priprema kiselih tijesta i proizvodnja kruha s kiselim starterima (Baking UPDATE). Kao što je vidljivo iz slike 8.21 A, proizvodnja kiselog tijesta odvija se spontanim načinom (tradicionalno), gdje se smjese brašna i vode ostavi stajati kroz 48-72 sata da se umnoži što više bakterija i kvasaca prisutnih u brašnu. Dobiveni starter se doda u smjesu brašna i vode, gdje se nakon fermentcije od 6-12 sati proizvede prirodno kiselo tijesto.Drugi način proizvodnje kiselog tijesta (8.21.B) je dodatak startera pripremljenog sa starter-kulturama definiranog mikrobnog sastava. Dobiveno kiselo tijesto koristi se u daljnjem postupku proizvodnje kruha. Koliko pripremljenog startera će se dodati u završni zamjes, ovisi o vrsti pekarskog proizvoda. Tako raženi kruh zahtjeva jače kiseljenje (dodatak 30 % startera) od bijelog kruha (do 20 %). Posebno je interesantna primjena kiselih tijesta u proizvodnji raženog kruha te posebnih vrsta bijelog kruha (Ciabatta, Bagetti, San francisco kiseli kruh) i slastica (brioši, panettoni). Za te fermentacije najčešće se koriste starteri koji sadrže bakteriju L. sanfranciscensis (ili L. Brevis) i kvasac S exiguus. U te svrhe koriste se najčešće starteri definiranog mikrobnog sastava ili komercijalni starteri.
261
LITERATURA Alves-Araujo,C., Almeida,M.J., Souza,M.J. and Leao,C. (2004). Freze tolerance of the yeast Torulaspora delbrueckii: cellular and biochemical basis. FEMS Microbiol. Lett. 240(1) ,7-14. Ando,M., Nakamura,N. and Shinomiya,Y. (2003). Suger super-tolerant yeast for confectionary and bakery. US-patent 6521272. Anon. (2008). Sourdough and sponge starters 101:Terms and definition. Baking 911.com. http//www.baking911.com/bread/101_terms.htm Attfield,P.V. and Kletsas.S. (2000). Hyperosmotic stress response by strain of bakers yeasts in high sugar concentration medium. Lett. Appl. Microbiol. 31, 323-327. Berland,S. (1993). Doctor's thesis, Universitate Paris 11, ENSIA-Massy, France Baker's Journal Technical talks . Carnevalli,P., Ciati,R., Leporati,A and Pease,M. (2007). Liquid sourdough fermentation: Industrial application perspectives. Food Microbiology 24(2), 150-154. Carr,L.G. and Tadini, C.C. (2003). Influence of yeast and vegetable shortening on physical and textural parameters of frozen part baked French bread. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie 36 (6), 609-614. Cooper, E.J. & Reed,G. (1968). Yeast fermentation: effects of temperature, pH, ethanol, sugar, salt and osmotic pressure, Bakers Dig. 42(6), 22–29. Damiani,P., Gobbetti,M., Corsetti,A, Simonetti,M.S. and Rossi,J. (1996). The sourdough microflora. Characterisation of hetero-and homo-fermentative lactic acid bacteria, yeast and their interactions on the basis of the volatile compounds produced. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie 29(1-2), 63-70. Decock,P. and Cappelle,S. (2005). Bread technology and sourdough technology. Trend. Food Sci.Technol. 16(1-3), 113-120. DeVuyst,L. and Neyskens,P. (2005). The sourdough microflora: biodiversity and metabolic interactions. Trends Food sci. Technol. 16(1-3), 43-56. Docter.C. (1991). Gist-brocades patent 0461725Al Frasse,P., Lambert,S., Richard-Molard,D. and Chiron,H.(1993). The influence of Fermentation on volatile compounds in French bread dough. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie 26(2), 26-132. Gelinas, P., Savoie ,L. and Rodrigue, N. (1996). Baker's yeast mitochondria, gasing power and freeze-thaw tolerance in dough. Food Microbiology 13(1), 41-46. Gelinas,P., Fiset,G., Willemot,C. and Goulet,J. (1991). Lipid Content and Cryotolerance of Bakers' Yeast in Frozen Dough. Appl. Env. Microbiol. 57, 463-468. Giannou,V., Tzia,C. and LeBail,A. (2005). Quolity and safety of frozen bakery products. In Sun,D.W.(ed.), Handboock of frozen food processing and packiging. New York City, NY:Marcel Dekker. Gobetti,M. (1998). The sourdough microflora: Interactions of lactic acid bacteria and yeasts. Trend. Food Sci. Technol. 9(7), 267-274. Gobetti,M., Corsetti,A. and Rossi,J. (1994). The sourdough microflora. Interactions between lactic acid bacteria and yeasts: metabolism of amino acids. W.J. Microbiol. Biotechnol. 10(3) ,275-279Hansen,A. & Schieberle,P. (2005). Generation of aroma compounds during sourdough fermentation:applied and fundamental aspects Trend. Food Sci. Technol.16(1-3), 85-94. Havet,H., Mankai,M. and Le Bail,A. (2000). Influence of the freezing condition on the baking performances of French frozen dough. J. Food. Ing. 45, 139-145. Harbrecht,A. and Kautzman,R. (1967). Comparative investigation of the determination of the leavening power of baker's yeast (in German). Braunntweinwirtsch 1078, 21-23. Hernandez-Lopez,M.J., Prieto,J.A. and Randez.Gil,F (2003). Osmotolerance and leavening ability in sweet and frozen sweet dough Comparative analysis between Torolaspora delbrueckii and Saccharomyces baker's yeast strains.Antonie Leeuwenhoek 84:125-134 Hernandez-Lopez,M.J., Pallotti,C., Andreu,P., Aguilera,J., Prieto,J.A. and Randez-Gil, F. (2007). Characterization of Torulaspora delbruecki diploid strain with optimized performance in sweet and frozen sweet dough. J.Food. Microbiol. 116(1), 103-110. Kitahara,M., Sakata,S. and Benno,Y. (2005). Biodiversity of Lactobacillus sanfranciscensis strains isolated from five sourdougs. Lett, Appl. Microbiol. 40(5), 353-357. Lallemand, Inc., (1996). How frozen dough affects bread quality: Cryoresistance of yeast. BAKING UPDATE Vol 1 .Nr 18.
262
Langejan,A. (1972). A novel type of active dry baker's yeast. In: Fermentation technology today ( Terui,G. ed.),669-671, Society of Fermentation technology, Osaka, Japan. Langejan,A. (1980). Active dry baker’s yeast. US-patent 4217420. LeBail,A., Havet,M., and Hayert,M. (2001). Improvement of the baking performance of frozen dough by short freezing method. Application to French baguette. IIF-IIR-Commission C2-BRISTOL-GB. Lewis, J.G., Learmonth,R.P., Attfield, R.V. and Watson, K.(1997). Stress co-tolerance and trehalose content in baking strains of Saccharomyces cerevisiae. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 18, 30−36. Matuda,T.G., Parra,D.F., Lugão,A.B. and Tadini,C.C. (2005). Influence of vegetable shortening and emulsifiers on the unfrozen water content and textural properties of frozen French bread dough. Food Science and Technology 38(3).275-280. Meroth,C.B., Hammes,W.P. and Hertel,C. (2003). Identifications and population dynamics of yeasts in sourdough fermentation processes by PCR.denaturating gradient gel electrophoresis. Appl. Envir. Microbiol. 69(12), 7453-7461. Oura ,E., Suomalainen,H. and Viskari, R.(1982). Bread making. In : Econom. Microbiol. Vol 7, Rose,a.(ed.), Academic Press, New York. Paul,V.A. (1987.) Stress tolerance: The key to effective strains of industrial baker’s yeast. Nature Biotechnol.15, 1351-1357. Paramithiotis,S., Chouliaras,Y., Tsakalidou.E. and Kalantzopoulos,G. (2005). Application of selected starter cultures for the production of wheat sourdough bread using a traditional three- stage procedure. Proc Biochem. 40(8), 2813-2819. Phimolsiripol,Y., Siripatrawan,U., Tulyathan,V and Cleland,D.J. (2008). Efects of freezing and temperature fluctuations during frozen storage on frozen dough and bread quality. J. Food Eng. 84(1), 48-56. Pyler,A.J. (1988) Baking science and Technology . Sosland Publishing Com., Merriam, Canada. Pomper,S. and Moore,E.V. (1987). Preparation of free-flowing particulate yeast. US-patent 4652453. Sanderson,G.W., Reed,G., Bruinsma,B. and Cooper,E.J. (1983). Yeast fermentation in breadmaking. Am. Inst. Baking. Res. Dept.Technol. Bull.5(12). Shulz, A. (1965). Investigation of leavening activity of baker's yeast. Brot Gebaeck 19(4), 61-65 Scheirlinck,I., Van der Muelen,R., Van schoor,A., Vancanneyt,M., De Vuyst,L., Vandamme,P. and Huys,G.(2007). Influence of geographic origin and flour type on diversity of lactic acid bacteria in traditional Belgian sourdough.Appl.Env.Microbiol. 73(19), 6262-6269. Soveral,G., Veiga,A., Loureiro-Dias,M .C. Tanghe,A., Van Dijck,P. and Moura,T. F. (2006). Water channels are important for osmotic adjustment of yeast cells at low temperature. Microbiology 152, 1515-1521. Spiecher,G. (1999). Handbuch Sauerteig 5th Ed.(Handbook of sourdough). Behrs Verlag, Hamburg . Spiecher,G. (1983). Baked goods. In Biotechnology Vol 5. Rehm,H.J. and Reed.G. (eds.).VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, West Germany. Suzuki,Y., Ando,M., Wada,Y., Hitokoto,S. and Hamada, K.(2002). Instant dry yeast for use in frozen dough-baking process. US-patent 63724481. Takano,H,, Hino,A., Iyo,C., Suzuki,Y. and Nakajima,R. (2002). Frozen dough resistant, practical baker’s yeast. US-patent 6410303. Tang, R.T., Robert,J., Robinson,J. and Hurley.W.C. (1972). Quantitative Changes in various sugar concentration during bread making. Bakers Dig. 46(4), 48-55. Tanghe,A., Van Dijck,P., Dumortier, F., Teunissen,A., Hohmann,S. and Thevelein,M. (2002). Aquaporin expression correlates with freeze tolerance in baker's yeast, and over expression improves freeze tolerance in industrial strains. Appl. Env. Microbiol. 68, 5981-5989 Therndthai,N., Zhou,W. and Adamczak,T. (2002). Optimisation of the temperature profile in bread baking. J. Food Eng. 55(1), 41-48. Trainotti,N & Stambuk,B.U. (2001). NaCl stress inhibits maltose fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Lett. 23(20), 1703-1707. Trividi,N.B., Cooper,E.J. and Bruisima ,B. (1984). Development and application of quick-rising baker’s yeast. Food Technol. 38(6), 51-57. Trividi,N.B. & Jacobson,G. (1986). Recent advantages in baker’s yeast. In: Progress in industrial Microbiology, Vol 23, Adams,M.R. (ed). Elsvier, New York.
263
Poglavlje 9: PREHRAMBENI I KRMNI KVASAC Damir Stanzer i Jasna Mrvčić
9.1. UVOD Kvasci su bez dvojbe kvantitativno i ekonomski najvažnija skupina mikroorganizama, iskorištavana od čovjeka. Prvi razlog je proizvodnja pekarskog kvasca, čija je potrošnja još uvijek u porastu. Drugi važan razlog je globalni nedostatak hrane bogate proteinima (Gilland, 2002.). Naime, brzi porast svjetske populacije, čiji je veliki dio zbog siromaštva i nepravilne preraspodjele hrane pothranjen, zahtjeva pronalaženje alternativnih riješenja. Svjetska organizacija “Food and Agriculture Organization” (FAO) utvrdila je 2000 g. da je nedostatak proteina u svijetu te godine iznosio oko 18 milijuna tona i da u je stalnom porastu. Ta količina proteina teško je nadoknadiva uzgojem životinja i biljnih kultura, pa značaj proizvodnje proteina jednostaničnih mikroorganizama rapidno raste. Taj način biosinteze proteina osobito je uspješan jer mikroorganizmi, koji često sadrže i preko 50 % proteina, udvostručuju svoju biomasu u vrlo kratkom vremenu (1 – 3 sata), a kao izvor hrane mogu koristiti sekundarne sirovine kao što su sirutka, melasa, otpadni glukozni sirup ili obnovljive škrobne i lignocelulozne sirovine. Za proizvodnju proteina najčešće se koriste različiti kvasci, jer su zdravstveno sigurni, iako se mogu koristiti i drugi mikroorganizmi. Osim proteina, mikrobna biomasa je također značajna i zbog vitamina i minerala, kojih u kvaščevoj biomasi ima u znatnim količinama. Osim povećane potrebe za hranom, u posljednje vrijeme, povećana je potreba i za energijom iz obnovljivih sirovina, što je rezultiralo korištenjem dijela poljoprivrednih površina za proizvodnju sirovina za biogoriva – kukuruza i uljane repice (Wolf i sur., 2003.). S druge strane, time se proizvode nove količine otpadnih sirovina (kukuruzovina, glicerol) pogodnih za mikrobiološku proizvodnju jednostaničnih proteina, pri čemu kvaščeva biomasa, zbog bogatog kemijskog sastava, jednostavnog uzgoja te mogućnosti korištenja brojnih otpadnih sirovina, zauzima istaknuto mjesto. S obzirom da danas potražnja za prehrambenim kvascem sve više raste, uvode se industrijski procesi koji njegovu proizvodnju potpuno odvajaju od proizvodnje etanola i piva i u kojima se inače dobiva taj vrijedan proizvod (Bekatorou i sur., 2006.). Kvasci mogu metabolizirati različite izvore ugljika, ali najbrže koriste glukozu, saharozu i maltozu. Činjenica da neki kvasci mogu metabolizirati brojne izvore ugljika, kao što su biopolimeri, pentoze, alkoholi, ugljikovodici, masne i organske kiseline, značajna je sa stajališta prehrambene industrije i ekologije. Posebno interesantni su procesi obrade otpadne vode podrijetlom iz prehrambene industrije u cilju proizvodnje biomase jednostaničnih proteina. Primjer za to su kvasci iz rodova Kluyveromyces i Candida koji mogu rasti na sirutki, sirovini koja se još uvijek ispušta u vodotokove ili u kanalizacijsku mrežu i uzrokuje znatne ekološke probleme s obzirom da ima visoke KPK i BPK5 vrijednosti. Uzgojem kvaščeve biomase pri određenim uvjetima, moguće je iz sirutke proizvesti kvalitetnu kvaščevu biomasu za primjenu u prehrambenoj industriji (Ghaly i Kamal, 2004.). Najveća količina kvaščeve biomase sigurno se konzumira s kruhom i različitim pekarskim proizvodima, pri čemu se kvasac dodaje u svrhu dizanja tijesta prije pečenja. No značajna količina kvaščeve biomase koristi se i kao dodatak drugim prehrambenim proizvodima, kako bi im se poboljšala nutritivna vrijednost. Takav kvasac, koji zadovoljava posebne zahtjeve za kvalitetom, a može se bez rizika koristiti u prehrambene
264
svrhe, naziva se prehrambeni kvasac. Dakle, pod pojmom prehrambeni kvasac podrazumijeva se toplinski inaktivirana biomasa pekarskog, pivskog i kvasca uzgojenog na sirutki, koji se koristi uglavnom kao prehrambeni aditiv. Posebno važnu ulogu ima primjena kvaščeve biomase u prehrani ljudi u nerazvijenim siromašnim zemljama i zemljama u razvoju, koje su deficitarne na proteinskim proizvodima.Osim toga, česta je primjena kvaščeve biomase nešto lošije kvalitete kao aditiva u različitim krmnim smjesama za prehranu životinja. Taj kvasac se naziva krmni kvasac. Kvaščeva biomasa koja se koristi kao aditiv za krmivo, također se proizvodi u suhom obliku slično prehrambenom kvascu. Ipak, u te svrhe koriste se biomase kvasaca uzgojene na mnogim supstratima (melasa i melasna džibra, sulfitna lužina, otpadne vode iz proizvodnje škroba te drugi otpadni materijali). Ako se kvaščeva biomasa, pri uzgoju prehrambenog kvasca, obogati s vitaminima i mineralima, tada se takova kvaščeva biomasa koristi i kao farmaceutski preparat. Već krajem devetnaestog stoljeća, nekoliko studija je pojasnilo važnost kvaščeve biomase u prehrani ljudi i životinja, naročito zbog kvalitetnih proteina, kojih u kvaščevoj biomasi ima 40-55 % (Peppler, 1970.; Rose, 1979.; Reed, 1981.). Kasniji radovi i studije su naglasili važnost vitaminskog sastava otpadnog pivskog kvasca i njegovu primjenu u prehrambene i farmaceutske svrhe. I danas se velike količine otpadnog kvasca iz pivovara koristi u prehrambene svrhe. Pionirski radovi na tom području objavljeni su u Njemačkoj i Engleskoj, što je dovelo do razvoja različitih prehrambenih proizvoda s visokom nutritivnom vrijednošću i proizvoda za poboljšanje okusa i mirisa iz pivskog kvasca. Max Delbrück bio je prvi istraživač koji je istaknuo mogućnost korištenja kvaščeve biomase u ishrani životinja. Time je Njemačka bila u mogućnosti da više od polovice potrebnih proteina tijekom I svjetskog rata zamijeni kvaščevom biomasom. Zanimanje za mikrobne proteine trajalo je do osamdesetih godina 20. stoljeća, posebice tijekom II svjetskog rata. Nakon osamdesetih svjetska politika pogodovala je razvoju poljoprivrede, što je dovelo do gašenja industrijskih pogona za proizvodnju mikrobne biomase. Kvasac koji se primjenjuje kao dodatak prehrambenim proizvodima ponekad zahtijeva poboljšanja. Naime, zbog njegove specifične arome, jednom djelu potrošaća ne odgovara okus kvaščeve biomase, posebno zbog udjela vitamina B1 i posljedične trpkosti. Zato se kvaščeva biomasa u prehrambene svrhe najčešće koristi kao aditiv, u količini od 0,5-5,0 %. Samo u nekim umacima ta količina se može povećeti do 35-50 %. Za razliku od prehrambenog kvasca, sve vrste i oblici kvaščeve biomase koriste se kao stočna hrana. Uglavnom je kvaščeva biomasa sastavni dio različitih pripravaka (smjesa) za ishranu stoke. Kemijski sastav kvaščeve biomase najviše ovisi o sastavu hranjive podloge, vrsti kvasca i vođenju biotehnološkog procesa uzgoja. Najkvalitetnija kvaščeva biomasa proizvodi se kao nusprodukt alkoholne fermentacije, u šaržnom procesu s pritokom supstrata, u semiaerobnim uvjetima (B-postupak, poglavlje 5: Proizvodnja alkohola). Kvaščeva biomasa za prehrambene i krmne svrhe proizvodi se na različite načine pri čemu se najčešće primjenjuju kvasci iz rodova Saccharomyces, Kluyveromyces i Candida. Ti procesi su dobro poznati u svijetu, pa u ovom poglavlju neće svi biti posebno opisani, već samo tipični i karakteristični za tu proizvodnju.
9.2. SASTAV KVAŠČEVE BIOMASE Kvaščeva biomasa dodaje se prehrambenim proizvodima u količini od 0,5-5,0 %. Najčešća primjena je u mesnim prerađevinama. Razlog tome su emulgirajuća svojstva kvaščevih proteina, što je važno svojstvo za povezivanje komponenti s visokim udjelom
265
masti (pašteta, hrenovka). Iako je kvaščeva biomasa odličan izvor proteina, vitamina B skupine, ugljikohidrata, vlakana i drugih korisnih tvari, intenzivno konzumiranje kvasca ima i negativnih posljedica po ljudsko zdravlje. Kvasac sadrži vrlo veliku količinu nukleinskih kiselina, 6-15 % (Ravindra, 2000.). Njihovom metaboličkom razgradnjom nastaje mokraćna kiselina, koja se taloži na zglobovima i uzrokuje giht, artritis, te pospješuje stvaranje bubrežnih kamenaca u urinarnom traktu. Zato se potrošnja kvaščeve biomase ograničava na oko 10-16 g/dan. Za proizvodnju prehrambenog kvasca boljih karakteristika potrebno je proizvesti kvaščevu biomasu s manjom količinom nukleinskih kiselina ili se one naknadno uklanjaju iz biomase. Količina nukleinskih kiselina u kvaščevoj biomasi može varirati ovisno o uvjetima uzgoja i omjeru izvora C/N. U literaturi su opisane različite metode za smanjenje količine nukleinskih kiselina u kvaščevoj biomasi, koje primjenjuju hidrolizu i enzimske metode. U ovom poglavlju bit će detaljnije opisana nutritivna vrijednost pojedinih sastojaka kvaščeve biomase. Udio osnovnih sastojaka u kvaščevoj biomasi je različit, ovisno o supstratu i brzini rasta. Komercijalno važni sojevi S. cerevisiae, C. utilis i K. marxianus imaju sličan sastav, što je prikazano u tablici 9.1. Tablica 9.1. Udio osnovnih sastojaka u prehrambenom kvascu (Reed i Nagodawithana, 1991.) Vlaga Ukupni proteini (N x 6,25) Proteini RNA i DNA Minerali Ukupni lipidi Ugljikohidrati
2-5 % 50-52 % 42-46 % 6-8 % 7-8 % 4-7 % 30-37 %
9.2.1. Proteini kvasca Količina ukupnih proteina (tzv. sirovih proteina preračunatih iz ukupnog dušika N) u kvaščevim biomasama različitog porijekla iznosi od 45-55 %. Međutim, količina pravih proteina računata na bazi aminokiselina je mnogo manja i iznosi 35-48 %. Ta količina ovisi o genetičkim svojstvima kvasca, sastavu hranjive podloge i uvjetima uzgoja tijekom kultivacije. Veća količina proteina u kvaščevoj biomasi može se postići optimiranjem sastava podloge i brzine rasta. Važno je napomenuti da su kvaščevi proteini nutritivno visokovrijedni, posebno u kombinaciji s biljnim proteinima. Kvaščevi proteini sadrže općenito puno lizina, leucina i fenilalanina, a malo aminokiselina sa sumporom (metionina), što je prikazano u tablici 9.2. Po prehrambenoj vrijednosti nešto su lošiji od kazeina, pa je PER (protein efficiency ratio) za pekarski kvasac 1,8 , dok je za kazein 2,5. Prema tome, nutritivna vrijednost proteina kvasca je oko 70 % nutritivne vrijednosti kazeina. PER vrijednost kvaščevih proteina može se povećati dodatkom metionina u suhi proizvod. Dodatkom 0,5 % metionina povećava se PER vrijednost kvaščevih proteina na 2,77. Dakle, iako su kvaščevi proteini manje vrijedni od animalnih, njihova vrijednost se može znatno povećati u smjesi s biljnim i životinjskim proteinima. Kako bi se proizvela biomasa kvasca s većim udjelom proteina i manjim udjelom nukleinskih kiselina (NK), neophodno je smanjiti udjel NK u kvaščevoj biomasi. To se može postići na dva načina: 266
odabirom uvjeta uzgoja i radnog kvasca posebnih genetičkih svojstava ekstrakcijom NK iz proizvedene kvaščeve biomase.
Tablica 9.2. Sastav esencijalnih aminokiselina proteina različitog porijekla (g na 16 g N) (Boze i sur., 1992.) Izvor proteina FAO referenca Sojino brašno Riblje brašno Jaja Kvasci C. lipolytica C. utilis K. fragilis S. cerevisiae
Supstrat
n-Alkani Etanol Sirutka Melasa
Cis
Ile
Leu
2.0
4.2
4.8
4.2
0.7
2.2
3.5
0.7
3.2
2.4 1.1 0.4 1.6
Liz Met
Fenal
Tir
Tri
Val
2.2
2.8
2.8
1.0
4.2
2.8
0.6
2.2
1.9
0.6
2.3
5.0
4.9
1.9
2.9
3.0
0.9
3.7
6.7
8.9
6.5
5.1
5.8
5.1
1.6
7.3
4.5 4.5 4.0 5.5
7.0 7.1 6.1 7.9
7.0 6.6 6.9 8.2
1.8 1.4 1.9 2.5
4.4 4.1 2.8 4.5
4.9 5.5 5.8 4.8
1.4 1.2 1.4 1.2
5.4 5.7 5.4 5.5
Uzgojne metode daju dobre rezultate, ali često ne i zadovoljavajuće, pa je potrebno dodatno smanjenje količine RNA u kvaščevoj biomasi. Dakle, nužna je ekstrakcija NK iz uzgojene kvaščeve biomase. Postoji nekoliko metoda za ekstrakciju NK iz kvaščeve biomase, a najčešće se koriste metode ekstrakcije u alkalnom mediju pri povišenim temperaturama. Tim metodama se količina RNA smanji za oko 80 %, tako da proteinski preparati sadrže svega 1-2 % RNA. Martinez i sur. (1990.) opisali su metodu smanjenja količine nukleinskih kiselina u kvaščevoj biomasi s pomoću ribonukleaze pankreasa i endonukleaze S. aureus, s pomoću kojih je količina RNA, koja je bila 5-15 % smanjena na 0,5 %, uz gubitak samo 6 % proteina. Ta metoda se pokazala uspješnom za zadovoljavajuće smanjenje purinskih baza u kvaščevoj biomasi iz koje se ekstrahiraju proteini za ljudsku uporabu. Ipak, treba imati na umu da se ekstrakcijom iz citoplazme izdvajaju i vitamini, aminokiseline, peptidi i sve topljive tvari, što uzrokuje manje iskorištenje procesa i, naravno, gubitak vrijednih komponenti.
9.2.2. Vitamini Vitamini su važni organski spojevi prisutni u svim živim organizmima, nužni za normalno funkcioniranje stanica. U stanicama su prisutni u mikro količinama, a djeluju kao aktivatori ili koenzimi pojedinih enzima. Nazivamo ih i tvari (faktori) rasta, jer su važni za rast i održavanje organizma. Kako ih organizmi ne mogu sami sintetizirati, za normalan rast i stanični metabolizam mora ih se unijeti u organizam hranom ili hranjivim supstratima. Kako kvaščeva biomasa sadrži velike količine vitamina B skupine, izuzetno je interesantna kao odličan izvor vitamina B skupine za ljudsku i animalnu prehranu. Isto tako, pospješuje rast mikroorganizama, pa se dodaje u hranjive podloge kao izvor dušika i tvari rasta (Marić, 2000.). Po svojoj strukturi, vitamini prisutni u kvaščevoj biomasi su purinski i pirimidinski kompleksi (tiamin-B1, riboflavin-B2, piridoksin, niacin, folna kiselina), porfirinski nukleotidi (cijanokobalamin-B12) i kompleksi aminokiselina (biotin i pantotenska kiselina). Po svom djelovanju najčešće sudjeluju u enzimskim reakcijama kao koenzimi
267
ili aktivatori (tiamin, riboflavin, piridoksin, niacin, biotin, folna i pantotenska kiselina), kao aktivatori mitohondrijskih funkcija (riboflavin, niacin) i u biosintezi NK (B12, biotin i folna kiselina). Kvaščeva biomasa se u ljudskoj prehrani češće koristi kao izvor vitamina nego kao izvor dušika, posebno u razvijenim zemljama. Zato se u nekim biotehnološkim procesima kvaščeva biomasa obogaćuje s vitaminima (tiamin, riboflavin, piridoksin, niacin i pantotenska kiselina) i koristi za pripravu farmaceutskih preparata. Potrebno je naglasiti da kvasci ne sadrže vitamine topive u mastima (A, D, E i K), kao ni vitamin C. Pored toga, često se koriste, pogotovo s drugim prehrambenim proizvodima (sirovinama), u ljudskim dijetalnim preparatima. Vitaminski sastav različitih kvaščevih biomasa prikazan je u tablici 9.3. Tablica 9.3. Vitaminski sastav različitih kvaščevih biomasa (Rose i Harrison,1970.) Maseni udio vitamina u suhim kvascima (μg/g)
Vitamini Tiamin HCl Riboflavin Niacin Piridoksin HCl Folna kiselina Ca-d-pantotenat Biotin p-Aminobenzojeva kiselina Holin klorid Inozitol
A 165 100 585 20 13 100 0,6 160
B 130 45 400 30 21 40 0,8 11
C 150 45 400 40 5 100 1 5
D 125 35 500 50 49 120 1 -
E 20 50 330 40 14 115 2 24
F 25 50 335 20 120 2 -
2,71 3,00
2,86 4,50
3,80 3,90
4,85 5,00
4,55 3,00
5,50 -
A - S. cerevisiae, uzgoj na melasi; B - C. utilis, uzgoj na sulfitnoj lužini; C - odgorčeni pivski kvasac, osušen na valjcima; D - odgorčeni pivski kvasac, osušen u raspršivaču; E - K. marxianus, uzgoj na sirutki; F - C. utilis, uzgoj na tršćanoj melasi. Iz tablice 9.3. može se uočiti da najveći udio vitamina imaju odgorčeni pivski kvasac osušen u sušnici s raspršivanjem (spray dry) i pekarski kvasac S. cerevisiae uzgojen na melasi, što se posebno odnosi na udio tiamina, niacina, piridoksina i folne kiseline.
9.2.3. Minerali Kvaščeva biomasa sadrži prilično velike količine pepela, oko 8 % na suhu tvar kvasca. U njemu su prisutni makroelemenati (K, P, Ca, S, Mg) i mikroelemenati (Zn, Cu, Mn, Co i dr.). Najzastupljeniji su kalij i fosfor, a zatim kalcij, magnezij i sumpor. Zbog toga je kvaščeva biomasa interesantna kao prehrambeni aditiv. Naime, prema FDA (Food and Drug Administration, američka agencija za ragulaciju i nadzor sigurnosti hrane) u 20 grama suhog prehrambenog kvasca, kolika je maksimalna dozvoljena dnevna doza, količina minerala je dovoljna za zadovoljavanje dnevnih potreba minerala za čovjeka. Udio makro- i mikroelemenata u kvaščevim biomasama (pekarski, prehrambeni i krmni) prikazan je u tablici 9.4.
268
Tablica 9.4. Prosječan sastav elemenata u suhoj tvari kvasca (Harison, 1972.) Element g/100 g suhe tvari C 45,0 - 47,0 O 31,0 - 32,0 N 7,5 - 9,5 H 6,0 - 6,5 P 1,1 - 5,2 S 0,3 - 0,5 K 0,9 - 3,5 Ca 0,4 - 0,9 Mg 0,15 - 0,5 Na 0,02 - 0,2 Cu 0,002 - 0,12 Fe 0,003 - 0,10 Zn 0,004 - 0,13 Cl 0,004 - 0,1 Pb 0,0001 - 0,0007 Mn 0,0004 - 0,0035 Co 0,0005 As 0,00001 J 0,00005 - 0,0004 Mo 0,000005 - 0,000009 Nutricionističke studije su pokazale da hrana, koja se uobičajeno konzumira, nema dovoljno mikroelemenata i elemenata u tragovima, posebice kroma, selena, cinka i molibdena. Pivski i pekarski kvasci ih sadrže, ali u nedovoljnim količinama za prehrambene potrebe. Zbog toga su razvijeni biotehnološki procesi u kojima se kvaščeva biomasa obogaćuje ovim važnim elementima. Uzgojem kvasca S. cerevisiae na melasnoj ili sintetskoj podlozi s dodatkom mikroelemenata može se dobiti mikroelementima obogaćena kvaščeva biomasa koja se sve više koristi u prehrambene ili terapeutske svrhe (Gulan-Zetić i sur., 2001.; Korniewitz i sur., 2007.; Kaur and Bansal, 2006.). Mikroelementi se u kvaščevoj biomasi obično nalaze vezani u obliku metalo-proteinskog kompleksa, što je izuzetno važno sa prehrambenog stajališta. Naime, dokazano je da se vezani u tom obliku mnogo lakše i bolje apsorbiraju iz probavnog trakta viših organizama od mikroelemenata koji se konzumiraju u anorganskom obliku (Dobrzanski i sur., 2003.). Razlog tome je što se apsorpcija mikroelemenata vezanih u anorganskom obliku odvija već u želucu, dok se razgradnja metalo-proteinskog kompleksa u organizmu odvija drugim procesima karakterističnim za proteine (u tankom crijevu) što znatno povećava efikasnost apsorpcije. To je osobito važno za one elemente koji u anorganskom obliku mogu biti toksični (bakar, selen, krom). Osim toga, organski vezani mikroelementi iz kvaščeve biomase imaju ugodniji okus u prehrambenim proizvodima ili kao aditivi. Stoga biomasa kvasca obogaćena mikroelementima predstavlja novi prirodniji (organski) izvor mikroelemenata. Dva su osnovna mehanizma kojima kvasci mogu akumulirati mikroelemente: akumulacija neovisna o metabolizmu – biosorpcija, te akumulacija ovisna o metabolizmu – bioakumulacija (Blackwell, 1995.). Akumulacija neovisna o metabolizmu je početni, samo nekoliko minuta dug proces vezanja metala na staničnu stijenku te ekstracelularne polisaharide stanica mikroorganizama. Vezanje uključuje procese ionske izmjene, 269
adsorpcije, kompleksacije, taloženja te kristalizacije. Biosorpcija je neovisna o temperaturi, prisustvu metaboličke energije te metaboličkih inhibitora, a ovisi o raspoloživim funkcionalnim skupinama na površini stanice, prirodi iona metala, koncentraciji slobodnih iona metala, sastavu podloge te naboju kationa metala i liganda. Metali se ovim mehanizmom akumulacije vežu na stanična stijenka mikroorganizama pa stoga sastav staničnog zida i faktori koji utječu na njegovu sintezu, znatno utječu na proces biosorpcije. Bioakumulacija je sporiji, o metabolizmu ovisan proces akumulacije kationa. Faktori kao što su temperatura, promjene pH, izvor energije, prisustvo metaboličkih inhibitora (i dr.) znatno utječu na odvijanje ovog procesa karakterističnog isključivo za žive stanice mikroorganizama. Osnovna prednost ovog procesa pred biosorpcijom je znatno veća količina iona metala koja se može akumulirati zahvaljujući raznolikosti metaboličkog sustava živih stanica. Ugradnja znatno veće količine kationa procesom bioakumulacije u usporedbi s procesom biosorpcije, posebno je karakteristična upravo za kvasce (Brady i Ducan, 1994.). Novije studije s više znanstvenih područja (biokemija, prehrana, medicina) bave se proučavanjem uloge biogenih elemenata u ljudskom organizmu (Heyland i sur., 2005.). Opisana su brojna patološka stanja izazvana viškom, manjkom ili nepovoljnim omjerom biogenih elemenata. U optimalnim koncentracijama pozitivno utječu na fiziološko stanje ljudi, životinja te mikroorganizama. U optimalnim koncentracijama povećavaju imunitet, djeluju antitoksično, antikancerogeno, povećavaju toleranciju organizma prema glukozi, zaštićuju krvne stanice od radijacije, poboljšavaju prijenos kisika, a neophodni su i za mnoge biokemijske reakcije. Stoga su istraživani biotehnološki procesi obogaćivanja kvaščeve biomase biogenim elementima, prije svega Se, Cr, Zn, Fe i Cu. Selen je esencijalni element čija se biološka uloga u višim organizmima intenzivno proučava, pogotovo nakon otkrića različitih bolesti izazvanih nedostatkom selena u prehrani. Naime, u nekim pokrajinama Kine zapaženo je da su mnogi ljudi vrlo lošeg fiziološkog stanja i da su nedovoljno fizički razvijeni. Otkriven je i slabi imuno sustav, što je preduvjet za različite bolesti (Gao i sur., 2007.). Pokazalo se da se radi o nedostatku selena u organizmu. Biološka uloga selena sastoji se u njegovom katalitičkom djelovanju u nizu enzimskih reakcija. Selen je važan dio antioksidativnog enzima glutation peroksidaze koji štiti stanicu od slobodnih radikala. Slobodni radikali nastaju tijekom metabolizma kisika, a njihovo je djelovanje kancerogeno na stanične strukture. Isto tako, zajedničkim djelovanjem s vitaminom E selen onemogućava nastajanje peroksida i naknadnu autokatalitičku peroksidaciju lipida, što je osobito važno u zaštiti staničnih membrana od oksidativnog oštećenja. Naime, djelovanjem oksidansa na stanične membrane dolazi do povećanja njene propusnosti, što uzrokuje brže starenje stanica. Osim antikancerogenog i antioksidativnog djelovanja selen djeluje i antitoksično. Poznato je da selen smanjuje toksičnost Cd2+ i Hg2+ koji negativno djeluju na aktivnost glutation peroksidaze. S obzirom na navedenu zaštitnu ulogu selena u organizmu, selen se smatra neophodnim za održavanje fiziološke aktivnosti čitavog organizma, te očuvanje zdravlja. Whanger (2001.) navodi preporučenu dnevnu dozu od 55 μg selena. Međutim, brojne studije pokazuju potrebu za dodatnim unosom selena u organizam. Istraživanja su pokazala da dodatne količine selena (200 μg/dan) znatno smanjuju karcinom pluća i prostate (Rayman, 2001.). Isto tako, selen djeluje pozitivno i na imuno-sustav. Prema novijim istraživanjima unos veće količine selena u organizam od preporučene, usporava replikaciju HIV – virusa, povoljno djeluje na mušku neplodnost, te pozitivno djeluje na energetski metabolizam (Hawkes, 2001.). Selenom obogaćena kvaščeva biomasa pogodna je za korištenje kao suplement ljudskoj prehrani, ukoliko se pokaže potreba za povećanim unosom selena u organizam. To je
270
posebno slučaj u područjima u kojima su tlo i voda siromašni selenom pa se on ne nalazi u dovoljnim količinama u namirnicama biljnog i životinjskog podrijetla. Selenom obogaćena kvaščeva biomasa koristi se i u prehrani sportaša (300 μg/dan) s obzirom da ga oni gube putem znoja. Selen je u kvaščevoj biomasi vezan kao Se - metionin ili Se – cistein (Whanger, 2001.). Dobrzanski i sur. (2003.) proveli su obogaćivanje mesa i jaja kokoši nesilica selenom. Selen je dodavan u hranu u organskom (selenom obogaćena kvaščeva biomasa) i anorganskom obliku (Na-Se). Nakon šest dana hranjenja analize mesa i jaja pokazale su veću masu ugrađenih iona selena u mesu i jajima kod životinja čija je hrana bila obogaćena kvaščevom biomasom. Očito je da se radi o boljoj apsorpciji iz probavnog trakta te boljoj biološkoj aktivnosti elemenata vezanih u organskom obliku. Stoga ovim organskim oblicima mikroelemenata treba dati prednost prilikom njihovog dodatnog unosa u organizam, a obogaćeni prehrambeni kvasac svakako je jedno od preporučljivih rješenja. Proučavana je kinetika ugradnje iona selena u kvaščevu biomasu pri različitim uvjetima procesa uzgoja te u različitim hranjivim podlogama (Povijač–Geršić i sur., 1993.). Uzgojem kvasca S. cerevisiae na melasnoj podlozi uz dodatak natrijevog selenita u šaržnom postupku s pritokom supstrata u aerobnim uvjetima može se ugraditi oko 2000 μgSe/g s.tv. biomase. Dobiveni rezultati pokazuju da je kvaščeva biomasa pogodan nosač za mikroelemente poput selena. Krom je aktivator inzulina, hormona koji regulira koncentraciju glukoze u krvi pa je njegovo prisustvo u organizmu u optimalnim koncentracijama neophodno za normalno funkcioniranje kataboličkih reakcija razgradnje glukoze. S obzirom da je apsorpcija anorganskog kroma posebno teška za organizam, preporuča se uzimanje kroma u obliku kvaščeve biomase gdje je krom vezan u kompleksu niske molekularne težine nazvanom glukoza tolerantni faktor (GTF). Povećan unos kroma u ovom obliku pozitivno djeluje na regulaciju glukoze u krvi viših organizama. Naime, poznato je da kvaščeva biomasa sadrži određene količine kroma vezane na GTF. Ta količina se može povećati ako se u hranjivi supstrat doda višak kromovih iona u anorganskom obliku. Gulan – Zetić i sur. (2001.) optimirali su proces ugradnje iona kroma u biomasu kvasca S. cerevisiae na melasnoj hranjivoj podlozi s dodatkom 200 mg/L CrCl3. Maksimalna ugradnja kroma od 30-45 μgCr/g s.tv. biomase postignuta je u eksponencijalnoj fazi rasta. Također je dokazano da se ugrađeni krom nalazi u Glukoza tolerantnom faktoru (GTF). Na svjetskom tržištu mogu se pronaći kvasci obogaćeni selenom i kromom u obliku GTF-a, koji se dodaju hrani prije ili u toku obroka (Slika 9.1, proizvođač TWINLAB, SAD).
Slika 9.1. Kvaščeva biomasa obogaćena selenom i kromom
271
Cink je biogeni element potreban u organizmu za DNA replikaciju, RNA transkripciju i staničnu diobu. Sadrži ga svih šest grupa enzima: liaze, oksidoreduktaze, transferaze, hidrolaze, izomeraze i ligaze. Također djeluje kao antioksidans te stabilizator staničnih membrana, a važna je i njegova uloga kao imunostimulatora (Stefanidou i sur., 2006.). Stehlik-Tomas i sur. (1997.) ispitali su mogućnost obogačivanja kvaščeve biomase S. cerevisiae ionima cinka. Fermentacije su provedene na melasnoj podlozi uz dodatak različitih koncentracija cink-sulfata pri različitim uvjetima uzgoja. Najveća masa ugrađenih iona cinka od 0,62 mg Zn/g s.tv. kvaščeve biomase, postignuta je u šaržnom procesu s pritokom supstrata. Kvaščeva biomasa obogaćena ionima cinka, kao i kvaščeva biomasa obogaćena ionima selena, koristi se kao dodatak hrani za životinje (Dobrzanski i sur., 2003.), ali se može koristiti i kao farmaceutski preparat ili prehrambeni aditiv. Željezo je sastavni dio hemoglobina, pa nedostatak željeza izaziva slabokrvnost, jedan od najčešćih poremećaja u ljudskom organizmu. Stoga bi primjena kvaščeve biomase obogaćene ionima željeza također mogla pronaći svoju primjenu. Naime,Yuan i sur. (2004.) navode maksimalnu ugradnju od 25 mg Fe/g s.tv. biomase kvasca S. cerevisiae. Od toga iznosa oko 96 % ugrađenog željeza je organski vezano na stanični zid i vakuole, dok je ostatak vezan na DNA i RNA. Takav oblik željeza pogodan je za unos u ljudski organizam. Stehlik-Tomas i sur. (2003.) također su ispitali mogućnost ugradnje iona željeza u stanice kvasca S. cerevisiae pri fermentaciji na melasnoj podlozi u statičkim i semiaerobnim uvjetima. Maksimalno je ugrađeno 10 mgFe/g s.tv. biomase u statičkim uvjetima, te 2,5 mgFe/g s.tv. biomase tijekom uzgoja na tresilici. Bakar je biogeni element koji sudjeluje u brojnim enzimskim reakcijama u stanicama jednostaničnih i viših organizama, pa je stoga esencijalan za sve organizme. Nedostatak i poremećaj metabolizma bakra u ljudskom organizmu uzrokuju Menkes-ovu te Wilsonovu bolest. Sve dosadašnje studije na području nutricionizma navode da se pravilnom prehranom u organizam unose dovoljne količine bakra te da su oboljenja uzrokovana nedostatkom bakra u organizmu rijetka i karakteristična prvenstveno za životinje. Stoga, kvaščeva biomasa obogaćena ionima bakra nije bila zanimljiva. Međutim, novije studije pokazuju da je zapadnjačka prehrana ipak siromašna na ionima bakra, pogotovo kod ljudi koji konzumiraju puno kravljeg mlijeka u kojem je udio iona bakra izuzetno nizak. Manjak iona bakra može uzrokovati i previsoka koncentracija željeza u organizmu. Nedostatak bakra u organizmu povezuje se s kardiovaskularnim bolestima, diabetesom, Parkinson-ovom bolešću, reumatoidnim artritisom (Gerson,1998.). Također, postoje naznake da bakar ima stimulativni učinak i na imunosustav (Failla i Hopkins, 1998.). Dodatkom bakar sulfata u fermentacijsku podlogu (melasu ili sirutku) moguće je proizvesti biomasu kvasaca S. cerevisiae i K. marxianus obogaćenu ionima bakra (Mrvčić i sur., 2007.). S obzirom da je Europska Unija donijela nove propise o ishrani domaćih životinja i kvaliteti životinjskih proizvoda koji zabranjuju uporabu životinjskih proteina u ishrani životinja, otvaraju se dodatne mogućnosti uporabe kvaščeve biomase kao izvora proteina budući da je aminokiselinski sastav proteina kvaščeve biomase (osim metionina i cisteina) najsličniji životinjskim proteinskim hranjivima. Zato se danas kvaščeva biomasa koristi sve više kao aditiv u krmnim smjesama. Isto tako, zbog sve brojnijih spoznaja o pozitivnom djelovanju mikroelemenata i elemenata u tragovima na ljudsko zdravlje, kvaščeva biomasa obogaćena mikroelementima povećava će njezinu primjenu.
272
9.2.4. Lipidi Količina lipida u kvaščevoj biomasi znatno ovisi o vrsti kvasca i većinom se kreće u granicama od 7–15 % na suhu tvar. Postoje i tzv. «fatt yeasts» koji sadrže znatno veću količinu lipida (30-40 %). Lipidi dolaze u različitim oblicima i imaju različite biološke uloge u stanici: granulirani i rezervni lipidi smješteni u citoplazmi, trigliceridi – funkcionalni elementi citoplazmine membrane, fosfolipidi – strukturalni elementi staničnog zida. Sastav i količina lipida ovise o vrsti kvasca i o uvjetima uzgoja. Količina lipida povećava se sa starošću kvaščeve biomase tijekom stacionarne faze rasta, dok smanjenje koncentracije glukoze u podlozi uzrokuje smanjenje količine lipida. Korištenje kvaščeve biomase u nekoliko uzastopnih fermentacija također uzrokuje smanjenje koncentracije lipida u stanici. S druge strane, smanjenje temperature te povećanje aeracije potpomažu biosintezu lipida. Pojedini supstrati, kao što su tekući ugljikovodici, zbog direktne asimilacije u odgovarajuću masnu kiselinu mogu također povećati količinu lipida u kvaščevoj biomasi. Posebnu vrijednost u lipidnim frakcijama imaju ceramidi, koji su posebno važna frakcija sfingolipida (Riezman, 2006.). Sfingolipidi su važne komponente staničnih membrana, naročito citoplazmatske membrane, gdje imaju važnu strukturnu ulogu. Biosinteza sfingolipida može se povećati različitim uvjetima uzgoja (Rupčić i Marić, 1998.). Nadalje, ovi spojevi osim strukturne uloge imaju i funkcionalnu ulogu. Naime, hidrolizom sfingomielina dobiju se ceramidi, koji imaju funkcionalnu intracelularne signalne molekule.
9.2.5. Ugljikohidrati Količina i sastav ugljikohidrata u kvaščevoj biomasi ovise prvenstveno o uvjetima uzgoja. Ugljikohidrati čine 1/4 - 1/3 suhe tvari kvaščeve biomase, pri čemu je najveći dio u obliku polisaharida, a manji dio u obliku mono-,di- i oligosaharida. Morfološki, ugljikohidrati kvasca podjeljeni su u grupu intracelularnuh ugljikohidrata i grupu ugljikohidrata stanične stijenke. Kod većine kvasaca ugljikohidrati služe kao rezerve energije, prije svega glikogen i trehaloza. Pekarski kvasac obično sadržava 16-20 % glikogena i 6-10 % trehaloze, računato na suhu tvar. Uvjeti fermentacije znatno utječu na sintezu ugljikohidrata. Ukoliko se kvaščeva biomasa uzgaja u prisustvu veće količine zraka (kisika) dolazi do boljeg skladištenja ugljikohidrata, čime se povećava stabilnost kvaščeve biomase, ali se smanjuje sadržaj proteina. Najveći dio ugljikohidrata smješten je u staničnom zidu. Udio polisaharida u staničnom zidu je gotovo 75 %. Najznačajniji polisaharidi staničnog zida su glukan i manan (čiji udio je gotovo 90 %), te manje zastupljeni hitin. Uloga polisaharida kvasaca, prije svega β-glukana, u zaštiti zdravlja i prehrambenoj industriji tema je mnogih znanstvenih studija (Kogan i Kocher, 2007.) i opisana je u Poglavlju 10 ove knjige.
9.3. PROIZVODNJA PREHRAMBENOG I KRMNOG KVASCA Osnovni parametri, pri proizvodnji kvaščeve biomase kao izvora proteina, su odabir supstrata i vrste kvasaca. Najčešće se pri proizvodnji mikrobnih proteina koriste supstrati u kojima izvor ugljika i energije potječe od ugljikohidrata. Budući da su njihovi sastojci uglavnom mono- i disaharidi, mogu se uspješno koristiti kao prirodno obnovljivi mikrobni supstrati. Supstrati koji se najviše koriste u industrijskoj proizvodnji kvaščeve biomase su poljoprivredni, šumarski ili prehrambeni nusprodukti kao što su melasa, sirutka, škrob, otpadni dijelovi voća i povrća, drvo, slama i sl. To su tzv. konvencionalni
273
supstrati. U proizvodnji mikrobne biomase također su se pokušali koriste i tzv. nekonvencionalni supstrati: naftni derivati, prirodni plin, etanol, metanol (Jay, 1996.). Međutim, tako proizvedena kvaščeva biomasa nije dobila GRAS status, pa je komercijalna proizvodnja postala upitna. Kvaščeve stanice posjeduju visoki enzimni potencijal i mogu koristiti različite sekundarne sirovine kao izvore ugljika za svoj rast i metabolizam. Ovisno o supstratu, radni mikroorganizmi koriste se kao čiste ili mješovite kulture kvasaca. Pojedini kvasci, kao što je C. utilis, mogu koristiti smjesu šećera, istovremeno ili u diauksijskom rastu. S druge strane, da bi se povećala efikasnost procesa, moguće je koristiti i mješovite kulture kvasaca. Primjer je proizvodnja kvaščeve biomase s pomoću kvasaca iz roda Kluyveromyces na sirutki, pri čemu se prinos biomase od oko 11 g/L u pojedinačoj kulturi poveća na oko 22 g/L u mješovitoj kulturi s kvascima iz roda Saccharomyces. To povećanje se pripisuje potrošnji nusprodukata alkoholne fermentacije tijekom aerobnog rasta kvasaca Kluyveromyces, kao što su etanol, esteri i sl. (Moeini i sur., 2004.). U tablici 9.5. navedene su vrste kvasaca koje se komercijalno koriste u proizvodnji biomase i njihov asimilacijski potencijal. Tablica 9.5. Komercijalne vrste kvasaca i njihov asimilacijski potencijal Supstrat S. cerevisae S. uvarum K. marxianus C. utilis C. tropicalis Glukoza + + + + + Galaktoza + + + + Maltoza + + + + + Saharoza + + + + Laktoza + Ksiloza + + Etanol (+) + + KNO3 + Poznato je da su kvasci fakultativni anaerobi i mogu rasti sa ili bez prisustva kisika. Znatno brže rastu u aerobnim uvjetima. Stoga su procesi proizvodnje kvaščeve biomase aerobni i za optimalni rast kvaščeve biomase neophodna je efikasna opskrba sa zrakom. Najveća količina prehrambenog i krmnog kvasca još uvijek se proizvodi kao nusprodukt proizvodnje alkohola i kao otpadni pivski kvasac. Osim toga, do sada su razrađeni mnogi biotehnološki procesi s kojima se proizvodi kvalitetna kvaščeva biomasa na sekundarnim sirovinama (melasa, sirutka, sulfitna lužina) i nekim otpadnim tvarima ( otpadne vode iz proizvodnje škroba, džibra). Međutim, u posljednje vrijeme sve je veći broj znanstvenih studija koji proces proizvodnje prehrambenog i krmnog kvasca povezuju s biološkom obradom otpadnih voda prehrambene industrije i obradom poljoprivrednog otpada (Zheng i sur., 2005.; Ghaly i Kamal, 2004.; Choi i Park, 2003.; Nigam, 2000.). To je od posebnog značaja, pogotovo u zemljama siromašnim na proteinima.
9.3.1. Proizvodnja prehrambenog kvasca Prehrambeni kvasac se proizvodi iz pekarskog, pivskog, alkoholnog i kvasca proizvedenog na sirutki. Iz pekarskog kvasca (suspenzije ili kolača), čija je proizvodnja detaljno opisana prethodno (poglavlje 7: Pekarski kvasac), može se sušenjem proizvesti neaktivni prehrambeni kvasac. Ovisno o vrsti sušenja (raspršivač, valjci) proizvodi se suhi kvasac u prahu ili u listićima, koji se također mogu usitniti. Takav kvasac se dodaje različitim prehrambenim proizvodima. Taj način proizvodnje prehrambenog kvasca je prilično skup pa se takva proizvodnja kvalitetne kvaščeve biomase, pogotovo obogaćene 274
vitaminima i mineralima, koristi uglavnom za pripremu farmaceutskih preparata ili prehrambenih aditiva. S druge strane, višak pivskog kvasca koji se izdvaja separacijom nakon fermentacije iz piva sadrži 12-16 % s.tv. Vrlo je jeftin i sve češće se koristi za proizvodnju prehrambenog kvasca. Prije sušenja potrebno je ukloniti neugodan gorki okus. Odgorčavanje se provodi različitim tehnikama a najčešća je pranje pivskog kvasca s razrijeđenim kiselinama i lužinama te vodom. Tako odgorčeni kvasac se termolizira i suši. Alkoholni kvasac (vidi: B-postupak u proizvodnji alkohola) se također ispire s vodom, termolizira i suši. Ostala kvaščeva biomasa koja se koristi za prehrambane svrhe može se proizvoditi samo na kvalitetnim (sigurnim-GRAS) sirovinama, s kvascima koji nemaju patološke osobine. Zato se u svijetu za proizvodnju prehrambenog kvasca kao sirovine najčešće koriste melasa, sirutka, melasna džibra i eventualno sulfitna lužina. Od kvasaca najviše se primjenjuju različiti kvasci iz rodova Saccharomyces, Kluyveromices i Candida (C. utilis). 9.3.1.1. Proizvodnja na sirutki Sirutka je nusproizvod industrije mlijeka, a dobiva se u tehnološkom procesu proizvodnje sira ili kazeina. Pri tome se samo 10-20 % komponenti mlijeka ugradi u proizvod (sir), a 80-90 % ostaje u sirutki. Zbog toga je sirutka vrlo bogat supstrat za uzgoj mikroorganizama (laktoza, mineralne tvari, vitamini), bilo za dobivanje mikrobne biomase ili za proizvodnju mikrobnih metabolita. Bez obzira na to, još uvijek se svega 50 % sirutke koristi u prehrambenoj industriji, dok se ostatak ispušta u vodotokove bez predhodne obrade. To predstavlja ozbiljan gubitak sirovine (Siso, 1996) i uzrokuje znatne ekološke probleme, s obzirom na to da sirutka ima visoku KPK i BPK5 vrijednosti (KPKkemijska potreba za kisikom, BPK5 – biološka potreba za kisikom, mjere količine kisika potrebne za razgradnju organske tvari u vodi, posredno ukazuju na stupanj onečišćenja vode). Kako je svjetska proizvodnja sirutke u stalnom porastu od velikog su značaja biotehnološka istraživanja usmjerena ka proizvodnji novih vrijednih proizvoda iz sirutke. Ovisno o tehnološkom procesu uklanjanja kazeina iz mlijeka mogu se dobiti različiti tipovi sirutke. Ukoliko se pri procesu proizvodnje sira, kazein koagulira uz pomoć industrijskih enzima (npr. kimozina) pri pH 6,5, sirutku koja se dobije nazivamo slatkom sirutkom. Drugi tip sirutke, kisela sirutka (pH<5), nastaje npr. pri proizvodnji svježeg sira fermentacijom ili koaguliranjem kazeina, uz pomoć organskih ili mineralnih kiselina. Osnovne komponente i slatke i kisele sirutke, kao što se vidi iz tablice 9.6. su laktoza, proteini i minerali. U prirodi nema puno mikroorganizama kojima metabolički sustav omogućuje direktno korištenja sirutke bez prethodne hidrolize laktoze i koji mogu koristiti laktozu kao supstrat za proizvodnju mikrobne biomase s visokim prinosima i bez proizvodnje bilo kakvih toksina. Kvasac Saccharomyces cerevisiae, koji se tradicionalno koristi u proizvodnji etanola i kvaščeve biomase na melasi, ne može fermentirati laktozu zbog nedostatka gena za proizvodnju enzima β-D-galaktozidaze, koji hidrolizira laktozu na glukozu i galaktozu. Zato je u slučaju korištenja kvasca S. cerevisiae potrebno prethodno razgraditi laktozu enzimnim preparatima ili ugraditi gen za proizvodnju enzima β-D-galaktozidaze.
275
Tablica 9.6. Sastav slatke i kisele sirutke (Jelen, 2003.) Sastav Suha tvar Laktoza Proteini Kalcij Kloridi Fosfati Laktat
Slatka sirutka (g/L) 63-70 46-52 6-10 0,4-0,6 1,1 2,0 1-3
Kisela sirutka (g/L) 63-70 44-46 6-8 1,2-1,6 1,1 6,4 2-4,5
Mikroorganizmi koji se najčešće koriste u procesima fermentacije sirutke su kvasci iz roda Kluyveromyces, prije svega tzv. mliječni kvasci K. marxianus i K. lactis (Berstein i sur., 1977.; Saunders i sur., 1980.; Grba i sur., 2002.).. Ovi kvasci efikasno rastu na laktozi kao jedinom izvoru ugljika, iako neki sojevi imaju mješoviti tip metabolizma (u anaerobnim uvjetima proizvode metabolite, prije svega alkohol, aldehide i estere). Ovisno o soju kvasca K. marxianus, u šaržnom procesu s pritokom laktoznog supstrata mogu se postići visoki prinosi kvaščeve biomase (do 105 g/L) sa prosječnom specifičnom brzinom rasta od 0,27 h-1(Lukondeh i sur., 2005.). Kvasci koji mogu fermentirati laktozu mogu se naći i u kefiru, a pripadaju rodovima Kluyveromyces, Saccharomyces, Candida, Debaryomyces i Zygosaccharomyces. Iako je biomasa kvasca K. marxianus proizvedena na sirutki manje cijenjena od biomase kvasca S. cerevisiae, sredinom prošlog stoljeća proradila su postrojenja za proizvodnju kvaščeve biomase na sirutki s tim kvascem. U Njemačkoj u vrijeme drugog svjetskog rata razvijen proces "Waldhof". Osnovni nedostatak tog procesa je velika potreba za energijom koja je nužna za koncentriranje i pročišćavanje proizvoda, budući da su zbog niske koncentracije laktoze u sirutki (4-5 %) prinosi biomase te produktivnost procesa niski. Stoga znanstvenici pokušavaju selekcijom sojeva, razvojem bioreaktora te optimiranjem procesa razviti nove tehnologije pogodne za industrijsku primjenu. Jedan od vrlo značajnih komercijalnih procesa proizvodnje prehrambenog kvasca na sirutki pojavio se prije 40 godina u Francuskoj i poznat je pod nazivom Fromagie Bel Process (Blanchet and Biju-Duval, 1969.). U to vrijeme taj je proces bio po kapacitetu jedan od najvećih proizvodnih procesa. Koristi se kvasac Kluyveromyces marxianus, a postupak se vodi kontinuirano, s vremenom zadržavanja od 4 sata. Temperatura procesa je 30-37oC, a pH 4,0-4,5. Sličan proces pojavio se SAD-u (Berstein i sur., 1977, slika 9.2). U tom procesu proizvode se alkohol i prehrambeni kvasac. Za takvu vrstu procesa potrebno je ugustiti sirutku na 10-15 % šećera. Ekonomičnost procesa je upitna pa se češće proizvodi samo kvaščeva biomasa, jer se u tim procesima sirutka ne mora ugustiti. Procesi proizvodnje kvaščeve biomase na sirutki su visoko aerobni. Budući da proteini sirutke uzrokuju jako pjenjenje tijekom aeracije, prije procesa ih je potrebno izdvojiti kiselinskom koagulacijom, toplinskom koagulacijom ili, u posljednje vrijeme najčešće, ultrafiltracijom. Izdvajanje proteina ultrafiltracijom osigurava njihovo korištenje kao visokovrijednog prehrambenog proizvoda. Osim izdvajanja proteina, podloga za uzgoj kvaščeve biomase na sirutki zahtjeva dodatak izvora dušika, fosfora i tvari rasta, za što se obično koriste (NH4)2HPO4 i (NH4)2SO4 u različitim koncentracijama, te mala količina kvaščevog ekstrakta ili CSL-a (Moeini i sur., 2004.; Ghaly i Kamal, 2004.;CristianiUrbina i sur., 2000.).
276
Slika 9.2. Proizvodnja kvasca K. marxianus na sirutki (Bernstein i sur., 1977.) . Količina kvaščeve biomase na kraju procesa iznosi 12-15 g/L, ako se koristi kvasac K. marxianus kao monokultura ili do 22 g/L ako se koriste mješovite kulture kvasaca koje mogu rasti na nusproduktima metabolizma kvasca K. marxianus. Naime, poznato je da kvasci roda Kluyveromyces u aeriranoj kulturi mjenjaju metabolizam iz oksidativnog u oksidativno-fermentativni, što dovodi do proizvodnje metaboličkih nusprodukata. Time se smanjuje efikasnost procesa, u smislu proizvedene biomase, te dolazi do smanjenja BPK5 vrijednosti. Moeini i sur. (2004.) su korištenjem kvasca S. cerevisiae kao kokulture postigli povećanje prinosa biomase s 12 g/L pri korištenju K. marxianus kao monokulture, na oko 22,4 g/L uporabom mješovite kulture kvasaca. Cristiani-Urbina i sur. (2000.) najbolje rezultate obrade sirutke postigli su upotrebom mješovite kulture kvasaca Torulopsis cremoris i Candida utilis. Prinos biomase bio je oko 0,75 g/g laktoze. Pri tome se KPK vrijednost smanjila za oko 96 %. Procesi proizvodnje kvaščeve biomase na sirutki mogu biti šaržni ili kontinuirani, pri čemu je vrijeme zadržavanja oko 4 sata. Primjer kontinuirane proizvodnje kvasca K. marxianus na sirutki prikazan je na slici 9.2. 9.3.1.2. Specifikacija kvalitete prehrambenog kvasca Kvaliteta prehrambenog kvasca proizvedenog na GRAS-supstratima definirana je vrstom kvasca, organoleptičkim svojstvima, kemijskim sastavom i mikrobiološkim uvjetima. Za to postoje različiti standardi: IUPAC (Internat. Union Pure Appl. Chem.), FDA (Food and Drug Adm.), EU-standardi i standardi pojedinih država. Jedan od IUPAC-ovih standarda prikazan je u tablici 9.7.
277
Tablica 9.7. Kvaliteta prehrambenog kvasca Organoleptička svojstva: Boja Okus Miris Kemijska svojstva: Suha tvar Proteini Pepeo Ugljikohidrati Vitamini Mikrobiološka svojstva: Ukupne bakterije Koliformne bakterije Sulfidoreducirajuće bakterije, ali za Clostridium perfrigens Salmonella
Opis što svjetliji, boja bijele kave svojstven kvascu svojstven kvascu, bez stranog mirisa Količina (%) min 92 min 46 8-10 30-35 što više broj stanica po masi kvasca do 7.500/g <1/g do 10/g ne smije sadržavati < 1/25 g
Međutim, većina nacionalnih standarda je mnogo jednostavnija i propisuju se samo neka od navedenih svojstava.
9.3.2. Proizvodnja krmnog kvasca Za proizvodnju krmnog kvasca najčešće se koriste kvasci iz roda Candida, koji se često još i danas nazivaju torula kvascima. Naziv "torula" kvasci potječe od bivšeg naziva roda Torulopsis i još uvijek se koristi u komercijalne svrhe. Najvažniji supstrati za proizvodnju ovih kvasaca su sulfitna lužina i drvni hidrolizati, a najčešće korištena vrsta kvasca je Candida utilis, koja može kao izvor ugljika koristiti heksoze i pentoze. Sulfitna lužina je nusprodukt sulfitnog postupka prerade drva u celulozu. Usitnjeno drvo se tretira natrijevim, magnezijevim ili kalcijevim sulfitima da se uklonili lignin i dio hemiceluloze, nakon čega zaostaje celuloza. Tijekom procesa hemiceluloza se hidrolizira do tzv. fermentabilnih šećera (20-30 g/L), a ovisno o tehnološkom postupku i vrsti upotrebljenog drveta, sulfitna lužina sadrži osim šećera i hlapive kiseline, SO2 i slobodni furfural. Ovi spojevi su inhibitori mikrobnog procesa i prije uporabe se moraju ukloniti. Sulfitna lužina dobivena preradom četinjača sadrži 3-5 % šećera (oko 30 % heksoza od ukupnih šećera), glukoze, manoze i galaktoze, dok u sulfitnoj lužini lisnjača prevladavaju pentoze. Drvni hidrolizati se dobivaju kiselinskom hidrolizom drvenih otpadaka do monosaharida. Relativno nizak udio šećera (oko 2-3 %), te visoki udio furfurala je ograničavajući čimbenik primjene hidrolizata drva u mikrobnim procesima. C. utilis se najčešće koristi kao radni mikroorganizam za rast na ovim supstratima, iako je moguće prvo fermentirati heksoze pomoću kvasca S. cerevisiae do etanola, a zatim preostale pentoze pretvoriti u kvaščevu biomasu s pomoću kvasca C. utilis. 9.3.2.1. Proizvodnja krmnog kvasca na sulfitnoj lužini Ovaj proces se je nekad koristio za proizvodnju prehrambenog kvasca, ali se, zbog potpune sigurnosti za ljudsko zdravlje, biomasa kvasca proizvedena na sulfitnoj lužini i drvnim hidrolizatima danas uglavnom koristi samo kao dodatak krmnim smjesama.
278
Za proizvodnju krmnog kvasca na sulfitnoj lužini najčešće se koristi kvasac C. utilis, koja za svoj rast zahtjeva dodatak izvora dušika, fosfata i kalija u hranjivu podlogu, ali ne i biotina, kao što je slučaj s uzgojem kvasca S. cerevisiae na ovim sirovinama. Prije uzgoja na sulfitnoj lužini i drvnim hidrolizatima potrebno je odpliniti SO2 i druge inhibitore s vodenom parom te podesiti pH na 4,2-4,5 s kalcijevim hidroksidom, pri čemu nastaje talog koji se odstrani dekantacijom ili filtracijom. U bistri filtrat dodaju se izvori dušika, fosfora, kalija i eventualno, izvor tvari rasta (CSL). Procesi uzgoja su uglavnom kontinuirani, a izvode se u aerobnim uvjetima. Naime, aerobnost procesa, odnosno brzina prijenosa kisika iz zraka u hranjivu podlogu je bitan čimbenik za brzinu raznožavanja kvaščevih stanica i često je limitirajući faktor za produktivnost procesa. Stoga se za proizvodnju kvaščeve biomase s kvascem C. utilis koriste bioreaktori s visokom koeficijentom prijenosa kisika. Nakon uzgoja proizvedena kvaščeva biomasa izdvaja se centrifugiranjem, uz intenzivno ispiranje s vodom kako bi se uklonila zaostala lignosulfonska kiselina (pogotovo ako se proizvodi prehrambeni kvasac). U tom slučaju biomasa se ispire i s NH4OH kako bi se smanjio udio nukleinskih kiselina (Parajo i sur., 1995.). Primjer proizvodnje biomase kvasca C. utilis na sulfitnoj lužini prikazan je na slici 9.3..
Slika 9.3. Proizvodnja biomase kvasca C. utilis na sulfitnoj lužini (Inskeep i sur., 1951.)
279
9.3.2.2. Proizvodnja krmnog kvasca na polisaharidnim sirovinama Krmni kvasac se proizvodi uglavnom na lignoceluloznim i škrobnim sirovinama. Celuloza, glavni sastojak drva i biljnih vlakana, najrašireniji je organski materijal u prirodi. U staničnim stjenkama biljaka pojavljuje se u amorfnom obliku, zajedno s hemicelulozom i ligninom. Zbog složenog sastava celuloza se s pomoću mikroorganizama teško hidrolizira do jedinica glukoze. Stoga procesu proizvodnje mikrobne biomase na celulozi predhodi njena enzimska ili kiselinska hidroliza, iako postoje mikroorganizmi (većinom iz roda Basidiomycetes) koji mogu direktno prevoditi celulozu u mikrobnu biomasu. U Kanadi je razvijen tzv. "Waterloo" proces za proizvodnju mikrobnih proteina s pomoću Chaetomium cellulolyticum koja ima sposobnost brze konverzije celuloze u staničnu biomasu bez predhodne hidrolize celuloze (Moo-Young i sur., 1988,). Trichoderma viride je mikroorganizam koji sintetizira najveću količinu ekstracelularne celulaze, a nakon enzimske ili kiselinske obrade celuloze proizvodnja mikrobne biomase provodi se s pomoću različitih kvasaca (najčešće C. utilis i S. cerevisiae). Celulozni otpatci su obećavajući izvor ugljika za različite biotehnološke procese, uključujući i proizvodnju krmnog kvasca. Međutim, prvenstveno je potrebno unaprijediti proces hidrolize celuloze, s obzirom da direktna uporaba celuloze rezultira niskom specifičnom brzinom rasta i niskom produktivnošću procesa. Škrob je također obnovljiva sirovina i zbog toga je, u posljednje vrijeme, jedna od najzanimljivijih sirovina za proizvodnju proteina jednostaničnih mikroorganizama. Jeftina je i lako dostupna sirovina, kako u tropskim, tako i u umjerenim klimama. Hidroliza mu je znatno jednostavnija od hidrolize celuloznih sirovina. Otpadne škrobne sirovine su vrlo raznolike. To mogu biti otpatci iz prerade rajčice, krumpira, žitarica, hrane, otpaci iz proizvodnje tjestenine, riže i sl. Najpoznatiji proces za proizvodnju mikrobne biomase na škrobnim sirovinama je tzv. "Symba" proces (slika 9.5.), razvijen u Švedskoj (Skogman, 1976.). Symba proces je baziran na simbiotskoj zajednici dva kvasca: brzorastuće Candida utilis i kvasca Endomycopsis fibuliger koji prilikom rasta na krumpiru proizvodi amilaze neophodne za hidrolizu škroba. Škrob se hidrolizira do smjese jednostavnih šećera koje koriste oba kvasca za rast stanica. Osušena mikrobna biomasa iz ovog procesa sadrži oko 98 % kvasca C. utilis, a zbog svog je sastava pogodna za krmiva. Naime, biomasa kvasca C. utilis bogatija je proteinima od biomase kvasca E. fibuliger. Stupanj pretvorbe supstrata u biomasu je oko 0,55 g/g.
280
Slika 9.4. Symba proces (Skogman, 1976.)
9.3.2.3. Proizvodnje kvasaca na metanolu Kvasci koji asimiliraju metanol su vrlo rijetki i slabo istraženi. Najpoznatiji kvasci su: Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta (Hansenula polymorpha), Pichia lindnerii, Candida methanolica i Torulopsis labrata (Spencer i sur., 2001.). Metilotrofni kvasci su izolirani i izučavani šezdesetih godina prošlog stoljeća u cilju proizvodnje proteina jednostaničnih mikroorganizama, s obzirom da je metanol čist i lako asimilirajući izvor ugljika za mikroorganizme. Međutim, pilot postrojenja za proizvodnju proteina na metanolu koristila su većinom bakteriju Methylophilus methylotrophus. Biomasa proizvedena pod nazivom "Pruteen" sadržavala je oko 72 % sirovih proteina. Međutim, povećanje cijene metanola smanjilo je interes istraživača za ove procese. Danas se genetika i fiziologija ovih kvasaca istražuju u cilju proizvodnje rekombinantnih proteina (Gellissen, 2000.). Pichia pastoris je najviše korišteni kvasac za ekspresiju proteina, a koristi metanol kao jedini izvor ugljika (djelovanjem enzima alkohol oksidaze). Sadrži izuzetno jaki promotor za alkohol oksidazu (AOX) koji omogućava postizanje razine ciljanog proteina do ~ 30 % ukupnih proteina stanice (indukcija metanolom). Pichia pastoris ima veliku brzinu rasta, koristi jeftini hranidbeni medij, a cijena uzgoja u fermentoru je niska. Daje visoki prinos proteina (50 – 5000 mg/L, 10-100 puta više od S. cerevisiae), a moguća je ekspresija i velikih proteina (> 50 kDa). Sve to čini ovaj kvasac konkurentnim u procesima proizvodnje rekombinantnih proteina, što je opisano u poglavlju 10 ove knjige. 9.3.2.4. Proizvodnja kvasaca na n-alkanima Mnoge vrste kvasaca i filamentoznih funga mogu koristiti ugljikovodike kao osnovni supstrat za svoj rast (tablica 9.9.). Za proizvodnju krmnog kvasca 1960-tih godina su intenzivno studirani C. tropicalis, C. oleophila i Yarrowia lipolytica. U Italiji je izgrađeno nekoliko postrojenja, dok je British Petroleum u Engleskoj razvio procese u velikom mjerilu koji su u «airlift» bioreaktorima s pomoću C. lipolytica na ugljikovodicima proizvodili 16 000 tona proteina godišnje (pod nazivom "Toprina"). Ovi procesi nisu se zadržali iz nekoliko razloga. Prije svega zbog slabe topivosti
281
ugljikovodika u vodi, te slabe topivosti kisika u podlozi, što je sve zahtjevalo visoke troškove aeracije i hlađenja (zbog visoke egzorermnosti procesa). Ipak, najvažniji razlog zatvaranja tih postrojenja je bila loša kvaliteta tih kvaščevih biomasa, koje su se uglavnom proizvodile na ugljikovodicima iz nafte. Naime, pokazalo se da kvaščeve biomase uzgojene na naftnim ugljikovodicima sadrže po zdravlje životinja štetne (kancerogene) tvari, koje se nisu mogle isprati s kvaščevih stanica normalnim (standardnim) metodama Tablica 9.8. Rodovi kvasaca koji mogu koristiti ugljikovodike kao izvor ugljika Supstrat
n-alkani
l-alkani
Kvasci
Candida Hansenula Pichia Rhodotorula Saccharomyces Torulopsis Yarrowia
Candida Hansenula Debaryomyces Rhodotorula
9.3.2.5. Proizvodnja lipidnih kvasaca Kvasci čije stanice sadrže više od 20 % lipida nazivaju se lipidni kvasci. Nekoliko rodova kvasaca ima sposobnost, pri limitaciji dušika u podlozi, koncentrirati lipide u staničnoj biomasi. Količina lipida u tako uzgojenim kvaščevim stanicama varira od 40-70 %, ovisno o procesu i vrsti kvasca (Ratledge i Wynn, 2002.). Najčešće su istraživani Rhodosporidium sp., Rhodotorula sp. i Lipomyces. Neki kvasci mogu se koristiti i za proizvodnju vrijednih lipidnih proizvoda. Tako su Rupčić i Marić (1998.) koristili kvasac Candida lipolytica za proizvodnju specifičnih dugolančanih masnih kiselina, koje se koriste u farmaceutske i terapeutske namjene. S druge strane, istraživači (Dyer i sur.,2002.; Kwun i sur., 2006.) su koristili kvasac S. cerevisiae, koji je modificiran metodom metaboličkog inženjerstva, za proizvodnju novih visokovrijednih lipidnih spojeva (ceramida). Lipidi proizvedeni s pomoću kvasaca mogu se lako ekstrahirati s pomoću heksana, pri čemu se dobije 95 % triglicerida i 2-3 % fosfolipida. Ovi procesi također su intenzivno studirani 1960-tih, paralelno s proizvodnjom proteina jednostaničnih mikroorganizama. U novije vrijeme ovi kvasci se izučavaju u cilju proizvodnje «mikrobnog ulja», analognog konvencionalno proizvedenom ulju iz uljarica za potrebe proizvodnje biodizela (Zhao, 2005.; Meesters i sur., 1996.). Naime, neki od ovih kvasaca imaju sposobnost asimilacije pentoza, tj. proizvodnje triacilglicerola iz jeftinih otpadnih lignoceluloznih sirovina. Troškovi mikrobne proizvodnje ulja su veći od proizvodnje ulja iz uljarica, stoga je cilj istraživanja optimiranje procesa proizvodnje u cilju njihovog smanjenja, što se prvenstveno odnosi na povećanje koncentracije biomase, povećanje udjela lipida u biomasi i korištenje otpadnih sirovina. Za razliku od ulja iz uljarica ova proizvodnja ne zahtjeva zauzimanje poljoprivrednih površina potrebnih za proizvodnju hrane.
282
LITERATURA Bernstein,S., Tzeng,C.H., Sisson,D. (1977). The commercial fermentation of cheese whey for the production of protein or alcohol. In Single cell protein from renewable and nonrenewable resources. A. H. Humphrey and E. L. Gaden (eds.). Biotechnol. Bioeng. Symp. 7, Wiley, New York. Bekatorou,A., Psarianos,C., Koutinas,A.A (2006). Production of Food Grade Yeast. Food Technol. Biotechnol 44(3), 407-415. Blackwell,K.J, Singleton,I. and Tobin,J.M. (1995). Metal cation uptake by yeast: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43, 579-584. Blanchet,M. and Biju-Duval,F. (1969). International Dairy federation Seminar on whey processing and utilization at Weihenstephan, Germany Boze,H., Moulin,G. and Galzy,P. (1992). Production of food and fodder yeasts. Crit. Rev. Biotechnol. 12 65−86. Brady,D. and Duncan J. R (1994). Bioaccumulation of metal cations by Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology 41, 149-154. Choi,M.H. and Park,Y.H. (2003). Production of yeast biomass using waste Chinese cabbage, Biomass Bioenergy 25, 221–226. Cristiani-Urbina,E., Netzahuatl-Munoz,A.R. and Manriquez-Rojas,F.J. (2000). Batch and fed-batch cultures for the treatment of whey with mixed yeast cultures. Process Biochem, 35, 649-657. Dyer,J.M., Chipital,D.C., Kuan,J.W., Mullen,R.T. and Pepperman,A.B. (2002). Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of novel lipid compounds. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59(2-3), 224-230. Dobrzanski,Z. and Jamroz,D (2003). Bioavailability of selenium and zinc supplied to the feed for laying hens in organic and inorganic form. EJPAU 6, 1-8. Failla,M.L. and Hopkins,R.G. (1998). Is low copper status immunosuppressive? Nutr. Rew 56, 59-64. Gao,S., Jin,Y., Hall,K.S., Liang,C., Univerzagt, F.W., Ji,R., Murrell J.R., Cao, J. Shen,J., Ma,F. Matesan,J., Ying,B., Cheng,Y., Bian,J., Li,P. and Hendrie,H.C.(2007). Selenium level and cognitive function in rural elderly Chinese Gellissen,G. (2000). Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. Appl Microbiol Biotechnol. 54, 741-50. Gerson,C. (1998). The role of copper, molybdenum, selenium, and zinc in nutrition and health. Clin Lab Med 18(4), 673-685. Ghaly,A.E. i Kamal,M.A. (2004). Submerged yeast fermentation of acid cheese whey for protein production and pollution potential reduction. Water Res, 38, 631-644. Gilland B (2002): World population and food supply can food production keep pace with population growth in the next half-century? Food Policy 27, 47-63. Grba,S., Stehlik-Tomas,V., Stanzer,D.,Vahčić,N. and Škrlin,A. (2002). Selection of yeast strain Kluyveromyces marxianus for alcohol and biomass production on whey. Chem. Biochem. Eng. Quoterly 16(1), 13-16. Gulan-Zetić,V., Stehlik-Tomas,V., Grba,S., Lutilsky,L., Kozlek,D. (2001). Chromium uptake by S. cerevisiae and isolation of glucose tolerance factor from yeast biomass. J. Biosci. 26(2) 217-223. Heyland,D.K, Dhaliwal,R., Suchner,U.and Berger,M.M. (2005). Antioxidant nutrients: a systematic review of trace elements and vitamins in the critically ill patient. Intensive Care Med 31, 327337. Koivurinta, J., Kurkela,R. and Koivistoinen,P. (1979). Uses of Pekilo, a microfungus biomass from Paecilomyces varioti in sausage and meat balls. Harison,J.S. (1972). Prosječan elementarni sastav suhe tvari pekarskog pivskog i krmnog kvasca. U Biotehnologija i sirovine. Marić,V.(Izd.). Stručna i poslovna knjiga , Zagreb 2000, str. 29. Hawkes,W.C. (2001). The biological effects of dietary selenium in humans: Can selenium supplementation decrease the risk of chronic diseases? First International Bio-Mineral Symposium: Trace elements in nutrition, health and disease, April 19-20. Hjortmo,S, Patring,J, Jastrebova,J and Andlid,T. (2005). Inherent biodiversity of folate content and composition in yeasts. Trends in Food Science & Technology 16(6-7), 311-316. Inskeep,G.C., Wiley,A.J., Holdeiby, J.M., Hughes,L.P (1951). Food Yeast From Sulfite Liquor. Ind. Eng. Chem, 43, 1702-1706. Jay,J.M. (1996). Modern Food Microbiology, Chapman i Hall, New York, USA. Jelen,P. (2003). Whey processing. In: H. Roginski, J.W. Fuquay and P.F. Fox, Editors, Encylcopedia of dairy sciences Vol. 4, Academic Press, London, pp. 2739–2751.
283
Kogan,G., Kocher,A. (2007). Role of yeast cell wall polysaccharides in pig nutrition and health protection. Livestock Science 109 (1-3), 161-165. Korniewisz,D., Dobrzanski,Z., Chojnacka,K., Korniewisz,A. and Kolacz,R.(2007). Effect of dietaryyeast enricheh with Cu,Fe and Mn on digestibility of main nutritiens and absorption of minerals by growing pigs Lukondeh,T., Ashbolt,N.J. and Rogers,P.L. (2005). Fed batch fermentation for the production of Kluyveromyces marxianus FII 510700 cultivated on lactose based medium. J. Ind. Microbiol. 32(7), 284-288. Marić,V. (2000). Biotehnologija i sirovine, Stručna i poslovna knjiga, Zagreb, str. 83 -96, i 130 – 205. Martinez,M.C, Sanchez-Montero,J.M., Sinisterra,J.V., Ballesteros,A. (1990). New insolubilized derivatives of ribonuclease and endonuclease for elimination of nucleic acid in SCP concentrates. Biotechnol Appl Biochem 12(6), 643-52. Meesters,P.A.E.P., Huijberts G.N.M, Eggink,G. (1996). High-cell-density cultivation of the lipid accumulating yeast Cryptococcus curvatus using glycerol as a carbon source. Appl Microbiol Biotechnol 45, 575–579. Moeini,H.H., Nahvi,I., Tavassoli,M. (2004). Improvement of SCP production and BOD removal of whey with mixed yeast culture. Electronic Journal of Biotechnology. ? Mrvcic,J, Stanzer,D, Stehlik-Tomas.V, Skevin,D, Grba,S. (2007). Optimization of Bioprocess for the Production of Copper-Enriched Biomass of Industrially Important Microorganism Saccharomyces cerevisiae. J Bioscience and Bioengineering 103(4), 331-337. Moo-Young,M, Chahal,D.S, Swan,J.E, Robinson,C.W. (1977). SCP production by Chaetomium cellulolyticum, a new thermotolerant cellulolytic fungus. Biotechnol. and Bioeng. 19(4), 527 – 538. Nigam,J.N., (1998). Single cell protein from pineapple cannery effluent, World J. Microbiol. Biotechnol. 14 693–696. P Parajó,J.C., Santos,V., Domínguez,H., Vázquez,M., Alvarez,C. (1995). Protein concentrates from yeast cultured in wood hydrolysates. Food Chemistry 53(2), 157-163. Peppler,H.J.(1970). Food yeasts.In The Yeasts, Vol 3, Rose,A.H. (ed.), Academic Press, London. Povijač-Geršić,Lj., Križanić,J., Grba,S. (1993). Acculumulation of Selenium and Germanium in Saccharomyces cerevisiae Yeast. Sixth European Congress on Biotechnology. Firenze, Italia, 13-17.06.93. Rayman,M.P. (2001). Selenium in human Health. First International Bio-Mineral Symposium: Trace elements in nutrition, health and disease, April 19-20. Ratledge,C., Wynn,J.P. (2002). The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginous microorganisms. Adv Appl Microbiol 51, 1–51. Ravindra,A.P.(2000).Value-added food: Single cell protein. Biotechnol. Adv 18, 459-479. Riezman,H.(2006). Organization and function of sphingolipid biosynthesis in yeast. Biochem. Soc. Transaction 34(3), 367-369 Reed,G. (1981). Use of microbial cultures. Yeast prodocts. Food Technol. 35(1), 89-94. Reed G i Nagodawithana T W (1991). Yeast Technology (2nd ed.), Van Nostrand Reinhold, New York. Rose,A.H. and Harrison,J.S., (1970). The Yeasts (Vol. 3), 421-456, Academic Press, London. Rose,A.H. (1979). History and scientific basis of large-scale production of microbial biomass. In Economic Microbiology, Vol 4. Rose.A.H. (ed.). Rupčić,J. and Marić,V.(1998). Isolation and chemical composition of the ceramide of the Candida lipolytica yeast. Chem. Phys. Lipids 91(2), 153-161. Sanders,E.J. and Lappin,T.A. (1980). Co-dried yeast whey food product and process. US-patent 4182777 Siso,M.I.G. (1996). The biotechnological utilization of cheese whey . Bioresource Technol. 57, 1-11. Skogman,H. (1976). The symba process. Starch 28(8), 278-282. Spencer,J., Ragout de Spencer,A., Laluce,C. (2002). Non-conventional yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 147-156. Stefanidou,M., Maravelias,C., Dona,A., Spilliopoulou,C. (2006). Zinc: a multipurpose trace element. Arch Toxicol 80, 1-9. Stehlik-Tomas,V., Grba,S., Stanzer,D., Vahčić,N., Gulan-Zetić,V. (2003). Uptake of iron by yeast cells and its impact on biomass production. Acta Alimentaria 32(3), 279-287. Stehlik-Tomas,V., Grba S. and Runjić-Perić,V. (1997). Zinc uptake by S. cerevisiae and its impact on alcohol fermentation. Chem Biochem Eng 11(3), 147-151. Whanger,P.D. (2001). Amounts and sorces of selenium for maximum human health. First International Bio-Mineral Symposium: Trace elements in nutrition, health and decease, April 19-20.
284
Wolf,J., Bindraban,P.S, Luijten,J.C., Vleeshouwers,L.M. (2003). Exploratory study on the land area required for global food supply and the potential global production of bioenergy. Agricultural Systems 76, 841 – 861. Zhao,Z.B. (2005). Toward cheaper microbial oil for biodiesel. China Biotechnology 25(2), 8–11. Zheng,S., Yang.M., Zhifeng,Y. (2005). Biomass production of yeast isolate from salad oil manufacturing wastewater. Bioresource Technology 96(10), 1183-1187. Yuan,Y., Xuena,G., He,X., Zang,B. and Liu,S. (2004). Construction of a high-biomass, iron-enriched yeast strain and study on distribution of iron in the cells of S. cerevisiae. Biotechnology Letters 26(4), 311-315.
285
Poglavlje 10: PROIZVODI IZ KVASCA Slobodan Grba i Marina Krpan
10.1. UVOD Kvaščeva biomasa najviše se koristi u pekarstvu te za prehrambene i krmne svrhe. Obzirom na kvalitetu kvaščeve biomase, što se posebno odnosi na proteinski i vitaminski dio, kvasac se počeo koristiti i za druge namjene. Već u prošlom stoljeću istraživači su utvrdili važnost pivskog kvasca kao izvora vitamina, naročito B-skupine. Nakon tih spoznaja veliki proizvođači piva počeli su intenzivno istraživati mogućnosti proizvodnje različitih proizvoda velike komercijalne vrijednosti. Takva istraživanja su vrlo brzo iznjedrila nekoliko značajnih prehrambenih i farmaceutskih proizvoda. Osim pivskog kvasca, koji je ustvari najjeftiniji i najpopularniji, sve više su se počeli prerađivati pekarski i prehrambeni kvasci u proizvode za specijalne namjene. Stoga će ovom poglavlju biti govora o vrijednosti pojedinih komponenata kvaščeve biomase koje se koriste u prehrambenoj industriji za poboljšanje nutritivne vrijednosti prehrambenih proizvoda, a to su proteini, vitamini, ugljikohidrati, vlakna i drugi. Kvasac sadrži 45-55 % proteina i velik udjel vitamina B skupine pa je stoga vrlo dobar izvor tih supstanci u prehrani ljudi i životinja. Osim toga kvaščeva biomasa se koristi vrlo često kao prikladan izvor dušika i tvari rasta u hranjivim podlogama za uzgoj mikroorganizama. Najtraženiji proizvod je svakako kvaščev ekstrakt koji se sve više primjenjuje kao aditiv u prehrambenim proizvodima te u fermentativnoj industriji kao izvor dušika i tvari rasta u hranjivim podlogama. Kao dodatak prehrambenim proizvodima znatno poboljšava njihov okus i miris te nutritivnu vrijednost. Kvaščevi ekstrakti su lako topivi u vodi pa se mogu primijeniti kao dodatak svim prehrambenim proizvodima. Osim kvaščevih ekstrakata, u prehrambenoj industriji koriste se i kvaščevi autolizati, ali samo u čvrstim proizvodima jer nisu potpuno topivi u vodi. U novije se vrijeme u prehrambenoj industriji sve više koriste različiti poboljšivači okusa i mirisa proizvedeni iz kvaščeve biomase. To su prije svega 5'-mononukleotidi, koji daju proizvodima okus sličan glutamatu, tzv. «umami» okus. Najznačajniji su 5'-GMP i 5'IMP. Osim toga ti spojevi imaju okus sličan kuhinjskoj soli pa mogu zamijeniti ili barem smanjiti udio soli u prehrambenim proizvodima, što je od izuzetnog značaja po ljudsko zdravlje, pogotovo kod ljudi koji imaju problema s visokim tlakom. 5'-nukleotidi se proizvode enzimskom hidrolizom RNA, koja se izolira iz kvasca, nakon čega se nukleotidi izdvoje kromatografski, a 5'-AMP se konvertira s enzimom transferazom u 5'IMP. Za razgradnju RNA koristi se enzim 5'-fosfodiesteraza izolirana iz korjenčića proklijalog ječma iz proizvodnje slada. Za proizvodnju nukleotida iz kvaščeve biomase, pogotovo iz pivskog kvasca, postoji nekoliko tehnoloških postupaka, koji su detaljno opisani. S pomoću kvasaca proizvode se i enzimi za komercijalnu upotrebu. Posebno su značajni invertaza (β-fruktofuranozidaza), laktaza (β-gaklaktozidaza) i lipaza, koji se proizvode s različitim kvascima, a primjenjuju se u prehrambenoj i fermentativnoj industriji. Isto tako se proizvodi i koristi alkoholna dehidrogenaza u čistom stanju za biokemijska istraživanja te u nepročišćenom (obliku peleta) kao prehrambeni dodatak za sprječavanje intoksikacije s alkoholom. Kvasci imaju posebno značajno mjesto u proizvodnji farmaceutskih preparata i lijekova. Neki od proizvoda se izoliraju iz kvaščeve biomase, dok se drugi sintetiziraju pomoću kvasaca, što je posebno došlo do izražaja primjenom rDNA tehnologije. U te svrhe najčešće se koristi kvasac Saccharomyces cerevisiae. Međutim, u novije doba sve više se koristi Pichia pastoris.
286
10.2. PROIZVODI ZA POBOLJŠANJE OKUSA I MIRISA 10.2.1. Kvaščev ekstrakt Kvaščev ekstrakt je koncentrat topive frakcije kvaščeve biomase, koji se izdvaja separacijom i filtracijom nakon autolize, plazmolize ili kiselinske hidrolize svježe biomase. Kvaščevi ekstrakti su dostupni komercijalno u praškastom obliku ili kao pasta i često se koriste u prehrambenoj industriji kao sredstvo za poboljšanje okusa i mirisa te nutritivne vrijednosti prehrambenog proizvoda (Maase,1991; Bebgtsson i sur.,1997; Nakajo i Sano,1999). Za prehrambene namjene kvaščevi ekstrakti imaju dvije osnovne svrhe a to su: poboljšanje organoleptičkih svojstava (mesni okus) i poboljšanje nutritivne vrijednosti (aminokiseline, nukleotidi, vitamini i minerali). Također se koriste u fermentativnoj industriji kao kompleksna sirovina visoke nutritivne vrijednosti, odnosno kao izvori tvari rasta. Najčešća je primjena u laboratorijskom mjerilu za pripremu mikrobnog cjepiva (inokuluma) za različite biotehnološke procese. Svjetska proizvodnja kvaščevog ekstrakta u svim oblicima za prehrambene i fermentativne potrebe se procjenjuje na 35-40.000 tona godišnje (Nagodawithana, 1992). Otpadni pivski kvasac iz proizvodnje piva je relativno jeftina sirovina pa se često koristi za proizvodnju kvaščevog ekstrakta, što uglavnom zadovoljava potrebe prehrambene i fermentativne industrije. Međutim, takav jeftini otpadni pivski kvasac, kojeg na tržištu ima u velikim količinama, posjeduje nepoželjne okusne karakteristike, a to je gorčina po hmelju koji se dodaje u pivo. Zato kvaščeva suspenzija otpadnog pivskog kvasca zahtijeva odgorčavanje, što je često zahtijevan postupak s dodatnim troškovima. Ipak, djelomično odgorčeni pivski kvasac, koji ima manju cijenu od potpuno odgorčenog kvasca, se može koristi za proizvodnju kvaščevog ekstrakta s poželjnim nutritivnim svojstvima, pa se često koristiti u prehrambenoj i fermentativnoj industriji. S druge strane, pekarski kvasac i kvaščeve biomase kvasaca Candide utilis i Kluyveromyces marxianus imaju nešto drugačija organoleptička svojstva. Njihov kemijski sastav te okus i miris zadovoljavaju sve zahtjeve potrošača pa se uvelike primjenjuju u prehrambenoj industriji. Treba napomenuti da su te svježe biomase znatno skuplje od pivskog kvasca, ali se unatoč tome proizvode i koriste u prehrambenoj industriji za različite namjene. Različiti oblici kvaščevih ekstrakata, koji su komercijalno dostupni razlikuju se po svojstvima okusa i mirisa, te nutritivnim vrijednostima. Osim toga, postoji i nekoliko važnih čimbenika koji mogu znatno utjecati na kvalitetu gotovog proizvoda te se stoga tim postupcima daje posebna važnost. Ti čimbenici su: pranje biomase nakon uzgoja, odgorčavanje i način autolize. Ipak, smatra se da je najčišća i najprikladnija sirovina za proizvodnju kvaščevog ekstrakta biomasa pekarskog kvasca oprana standardnim načinom. Detaljniji opisi industrijske proizvodnje pojedinih vrsta kvaščevog ekstrakta nisu dostupni u literaturi zbog poslovne tajne. Ipak, osnovni principi proizvodnje kvaščevog ekstrakta su poznati i biti će opisani u ovom poglavlju. Pivski kvasac koji se intenzivno koristi u proizvodnji kvašćeve biomase mora biti svjež, bez većeg broja kontaminanata, odgorčen i ne smije imati okus po hmelju niti druge nepoželjne čestice. Talog iz sladovine i druge netopive čestice uklanjaju se separacijom pomoću 150-200μ vibracijske mreže-sita u pivovari, dok se ostaci hmelja prisutni na kvaščevim stanicama ispiru najčešće alkalnim pranjem. Obzirom na različitosti u kvaliteti pojedinih pivskih kvasaca zbog proizvodnog procesa u pivovarama na različitim lokacijama često se korigiraju ti nedostaci kako bi se postigli proizvodi ujednačene kvalitete.
287
Puno lakša i jednostavnija proizvodnja kvaščevog ekstrakta je za biotehnološke namjene, jer okus i miris nemaju dominantnu ulogu (Marić, 2000). Tako su Champagne i sur. (2003) istražili utjecaj različitih vrsta kvaščevih ekstrakata na rast bakterija iz rodova Lactobacillus i Pediococcus. Proizveli su i ekstrakte od mješavine pivskog i pekarskog kvasca, pri čemu su dobili najbolje iskorištenje sa smjesom od 60 % pekarskog kvasca i 40 % pivskog kvasca. Ipak, najbolji rast Lb. acidophilus EQ57 bio je na autolizatu pivskog kvasca, usprkos većoj količini dušika u autolizatu proizvedenom od mješavine kvaščevih biomasa. U proizvodnji kvaščevog ekstrakta postoje tri različita procesa, a to su: autoliza, plazmoliza i kiselinska hidroliza. 10.2.1.1 Autoliza Autoliza je proces u kojem se stanične komponente razgrađuju pomoću enzima prisutnih u kvaščevim stanicama, te se na taj način prevode u topivo stanje. Takvo stanje se postiže primjenom pažljivo odabranih parametara procesa, kao što su temperatura, pH, vrijeme trajanja procesa i dodatak specifičnih sredstava za ubrzanje procesa. Ti uvjeti usmrćuju kvaščeve stanice, ali ne inaktiviraju enzime za razgradnju (hidrolizu) koji su neaktivni u živim stanicama. Naime, pod tim uvjetima enzimi važni za normalan rast i metabolizam više nisu regulirani s odgovarajućim kontrolnim mehanizmom koji postoji u živim stanicama. Dakle, smrt stanice uzrokuje nastali nered koji omogućuje slobodnim degradativnim enzimima napad na pojedine specifične supstrate, odnosno makromolekule kao što su proteini i nukleinske kiseline te ih razgrađuju u spojeve koji su topivi u vodi. Pri tim uvjetima dolazi i do razgradnje stanične membrane, što omogućuje topivim komponentama da izađu iz stanice u okolni medij. Okus i miris te prinos konačnog proizvoda ovisi uglavnom o dobro kontroliranim uvjetima (temperatura, pH, vrijeme procesa, dodatak specifičnih sredstava za ubrzanje procesa), postotku živih stanica, koncentraciji kvasca u suspenziji i tipu pomoćnog sredstva za otapanje, odnosno ekstrakciju spojeva iz stanica. Treba napomenuti da neki uvjeti koji povećavaju iskorištenje procesa ne moraju nužno poboljšati miris i okus proizvoda pa su nužna detaljna istraživanja da se proizvede kvaščev ekstrakt željenih karakteristika. Pomoćna sredstva za poboljšanje topivosti tijekom autolize najčešće su enzimski preparati kao što su proteaze, glukonaze, nukleaze i/ili fosfodiesteraze. Etil acetat se često koristi kako bi se pospješila autoliza i smanjio broj kontaminanata na minimum. Proteaze, kao što je papain pospješuju iskorištenje ekstrakta, ali samo tijekom duže autolize, što se primjenjuje u SAD, UK i Australiji. Međutim, njihov učinak je minimalan, ako je autoliza kraća od 20 sati, kao što se radi u Japanu i Europi. Kvaščevi ekstrakti proizvedeni pomoću autolitičkih procesa ne sadrže puno natrija pa su prikladni za primjenu u prehrambenoj industriji, pogotovo u proizvodnji posebne hrane za dojenčad. Blagog su mirisa i okusa pa s drugim prehrambenim dodacima mogu znatno poboljšati kvalitetu prehrambenog proizvoda. Autoliza ili samorazgradnja se obavlja u kvaščevoj suspenziji od 15-18 %, pri temperaturi od 45-50 oC i pH 5.5 u toku 24-36 sati (Kenichi, 1999), što je prikazano na slici 1. Razgradnja živih stanica je rezultat djelovanja proteolitičkih enzima prikazanih u tablici 1. i β-1,3 glukanaze. β-1,6 glukanaza i manozidaza sudjeluju u daljnjoj razgradnji staničnog matriksa. Identificirano je oko 40 proteolitičkih enzima u kvascu S. cerevisiae od kojih su samo neki opisani kao važni za autolitičke procese. Posebno su zanimljiva 4 enzima, što je prikazano u tablici 10.1.
288
Tablica 10.1. Svojstva kvaščevih proteaza (Achster i Wolf, 1985)x x-podaci uzeti iz: Reed i Nagodawithama (1991)
Naziv Tip pH optimum Opt.T (oC) Lokacija Topivost Mol. težina Izoel. točka Inhibitori Stanična uloga
Proteaza ysc A Kisela endopeptidaza 2-6
Proteaza yscB
35-40 Vakuola topiva 60.000 3.8 Protein I3A Pepstatin, idr Razgradnja proteina
45-55 Vakuola topiva 32.000-44.000 5.8 Protein I213 Kimostatin,idr Razgradnja proteina
Serin endopeptidaza 6-7
Karboksi peptidaza yscY Serin egzopeptidaza 4-7
Karboksi peptidaza ysc S Metalo (Zn2+) egzopeptidaza 7
45-55 Vakuola topiva 61.000 3.6 Protein Ie.
60 Vakuola topiva nedefinirana EDTA
Razgradnja proteina
Hg2+
Razgradnja proteina
Smatra se da su ti enzimi smješteni u staničnim vakuolama. Ta odvojenost (smještenost) omogućuje stanici kontrolu intracelularne aktivnosti za pravilno funkcioniranje svih životnih funkcija. Pod autolitičkim uvjetima kvaščeve stanice počinju umirati nakon što su potrošene sve stanične rezerve. Tada dolazi do metabolitičkog nereda u stanicama pri čemu se razgrađuju barijere unutar stanica, što se označava kao početak autolize. Tada se proteolitički enzimi oslobađaju i izlaze iz vakuola. Ti enzimi su neaktivni pri staničnom pH od oko 6.5, jer stvaraju komplekse s odgovarajućim inhibitorima u stanici. Međutim, kada se pH podesi na 5 aktivira se aktivnost ovih enzima (Saheki i Holzer 1975). Vakuolarne proteaze, kao što su proteaze ysc A i B, karboksipeptidaze ysc Y i S i aminopeptidaze su uključene u nespecifičnu razgradnju proteina i peptida. Do sada nisu poznata druga svojstva vakuolarnih proteolitičkih enzima kvaščevih stanica. Slično tome, nukleaze prisutne u stanicama počinju razgrađivati RNA i DNA, pri čemu se stvaraju polinukleotidi, mononukleotidi i nukleozidi. To su topivi spojevi koji izlaze u okolni medij. Stanične proteaze imaju veliku specifičnost prema nekim supstratima. Zbog toga u mnogim tehnološkim postupcima, koji se koriste u praksi, uvjeti za ove enzime nisu optimalni. Zato se mijenjanjem pH i temperature mogu dobiti ekstrakti različitih karakteristika. Ako se želi proizvesti kvaščev ekstrakt dobrih i ujednačenih karakteristika, neophodna je stroga kontrola svih procesnih parametara. Stanična stjenka koja daje čvrstoću i oblik, sastoji se uglavnom od alkalno netopivog čvrstog β-glukana koji čini unutarnji sloj, alkalno topivog β-glukana u srednjem sloju i glikoproteina u vanjskom sloju, u kojem su ugljikohidrati fosforilirani manani. Osim toga kvaščeva stjenka sadrži i oko 1 % hitina. Stjenka u toku hidrolize ostaje uglavnom nerazgrađena. Enzim glukanaza koja se nalazi u kvaščevim stanicama može razgraditi β1,3 i β-1,6 glukan, ali samo u toku pupanja. Međutim, β-1,3 glukanaza može uz pomoć proteaza razgraditi komponente stanične stjenke, što omogućuje lakše izlaženje topivih komponenti iz kvaščevih stanica. Ovaj proces se može ubrzati dodatkom vanstaničnih proteaza, kao što je papain. Ti enzimi se mogu nabaviti na tržištu pa se tako može ubrzati autoliza i povećati iskorištenje procesa. Nakon autolize, netopivi dio se izdvaja
289
separacijom i po potrebi filtracijom, a bistri filtrat se ugušćuje uparivanjem pod vakuumom i suši u sušnici s raspršivačem (slika 10.1). Na taj se način proizvodi kvaščev ekstrakt instant tipa, što znači da je potpuno topiv u vodi i koristi se za prehrambene namjene ili biotehnološke procese. Uz suhi kvaščev ekstrakt s 92-94 % s.tv., za prehrambene namjene proizvodi se često i pasta s 7 -80 % s.tv. Tekući kvaščev ekstrakt s 50-65 % s.tv. također se proizvodi za prehrambene i biotehnološke namjene, ali se rjeđe koristi od suhog kvaščevog ekstrakta.
Slika 10.1. Proizvodnja kvaščevog ekstrakta (Eurasyp-prospekti, 2008) 10.2.1.2 Plazmoliza Plazmoliza je postupak koji se također koristi za proizvodnju kvaščevog ekstrakta, naročito u Europi, dok nije prihvaćen u SAD-u. Razgradnja kvaščevih stanica plazmolizom je brza pa je taj proces vrlo ekonomičan. U tu svrhu koristi se najčešće obična kuhinjska sol (NaCl). Organska otapala kao što su etil acetat i izopropanol ubrzavaju ovaj proces. Naime, kvaščeve stanice u prisutnosti visokog postotka soli u mediju počinju gubiti staničnu vodu zbog osmotskog tlaka u okolnom mediju, a citoplazma se odvaja od stanične stjenke. U tim uvjetima stanični sok nastoji izaći iz stanica i koncentrira se uz staničnu membranu. Produženom plazmolizom usmrćuju se stanice, pa tada počinju razgradni procesi pri čemu puca stanična membrana i stanične tvari slobodno izlaze u okolni medij. Sol se najčešće dodaje u kvaščev kolač s oko 30 % s.tv., što daje vrlo dobro iskorištenje. Nakon toga slijedi filtracija, ugušćivanje i sušenje, slično kao i u proizvodnji drugih kvaščevih ekstrakata. Kvaščev ekstrakt proizveden plazmolizom ima manje kontaminanata jer sol djeluje baktericidno i na ostale prisutne mikroorganizme. Međutim, jako visoka koncentracija kuhinjske soli u proizvodu ograničava njegovu primjenu u prehrambenim proizvodima (Dziekak 1987). Zato se kvaščevi ekstrakti, koji se primjenjuju u prehrambenoj industriji, češće proizvode
290
autolizom nego plazmolizom. Kemijski sastav kvaščevog ekstrakta proizvedenog autolizom i plazmolizom prikazan je u tablici 10.2. Iz tablice se vidi da je sastav kvaščevog ekstrakta proizveden autolizom kvalitetniji od ekstrakta proizvedenog plazmolizom. Naime, u kvaščevom ekstraktu proizvedenom autolizom zaostaje više proteina, a time i aminokiselina. Vitaminski sastav autolizata je također znatno bolji. Očito je da tijekom plazmolize dolazi do razgradnje vrlo vrijednih komponenti kvaščeve biomase. Tablica 10.2. Sastav kvaščevih ekstrakata (Cruiger i Cruiger,1984) Osnovni sastojci (%) Autoliza Plazmoliza Suha tvar 70 80 Ukupan dušik 8.8 7.4 Proteini (Nx6,25) 55 46 NaCl <1 18 Amino kiseline (%od N) Alanin 3.4 2.3 Aminomaslačna 0.1 0.1 Arginin 2.1 1.1 Asparagin 3.8 3.1 Cistin 0.3 0.2 Glutaminska 7.2 5.1 Glicin 1.6 1.6 Histidin 0.9 0.8 Izoleucin 2.0 1.6 Leucin 2.9 2.3 Lizin 3.2 2.9 Metionon 0.5 0.5 Ornitin 0.3 0.9 Fenilalanin 1.6 1.6 Prolin 1.6 1.5 Serin 1.9 1.5 Treonin 1.9 1.4 Tirozin 0.8 0.5 Valin 2.3 1.9 Vitamini (mg/kg) Tiamin 20-30 10-15 Riboflavin 50-70 50-70 Piridoksin 25-35 20-30 Niacinamid 600 100 Pantotenska kiselina 200 350 10.2.1.3.Kiselinska hidroliza Za proizvodnju kvaščevog ekstrakta koristi se i hidroliza s jakim kiselinama pri visokim temperaturama (oko100 oC), kao što je koncentrirana HCl. Tijekom hidrolize razgrade se osnovne kvaščeve makromolekule proteini, ugljikohidrati i nukleinske kiseline u njihove odgovarajuće podjedinice, koje su topive u vodi. Da se postigne dobro iskorištenje procesa za hidrolizu se koristi djelomično osušena kvaščeva biomasa (65-85 % s.tv.). U takav osušeni kvasac se dodaje koncentrirana klorovodična kiselina, a cijeli proces se odvija najčešće u tankoslojnom uparivaču koji ima refluksni kondenzator. Stupanj
291
hidrolize se određuje vremenom potrebnim za potpunu razgradnju pojedinih makromolekula u kvaščevoj biomasi. Kiseli hidrolizat se nakon toga neutralizira s natrijevom lužinom na pH 5-6, zatim filtrira, koncentrira i suši do 5 % vlage (Ziemba,1967). Iako je kiselinska hidroliza najdjelotvornija u razgradnji makromolekula, najrjeđe se koristi u proizvodnji ekstrakata, zbog nekoliko nedostataka koji se zbivaju tijekom procesa. Ti nedostaci ga čine manje atraktivnim od drugih procesa. Veliki problem u ovoj proizvodnji je procesna oprema koja mora biti izrađena od specijalnih čelika ili od posuda presvučenih staklenim slojem tako da se izbjegnu korozivna svojstva HCl-a. Takva oprema je vrlo skupa pa je i takav proces skup. Osim toga proces se provodi pod tlakom, pa izrađene posude zbog sigurnosti moraju biti adaptirane za taj proces. Isto tako, jake kiseline pod uvjetima hidrolize mogu razgraditi vitamine i aminokiseline, pri čemu se dobiva proizvod manje nutritivne vrijednosti. Posebno opasno je nastajanje 3-kloro-propandiola koji je u višim koncentracijama štetan za ljudsko zdravlje. Navedeni nedostaci premašuju prednosti ovog procesa pa se kiselinska hidroliza rijetko koristi u proizvodnji kvaščevog ekstrakta za primjenu u prehrambenoj industriji.
10.2.2. Autolizati Za razliku od kvaščevog ekstrakta, autolizati sadrže sve komponente kvaščeve biomase nakon autolize. Proizvode se u obliku paste i osušeni (Hill, 1991). Autolizati su manje intenzivni u okusu i mirisu od ekstrakta u istoj količini, zbog inertnog učinka stanične stjenke. Za proizvodnju autolizata također se vrlo često koristi otpadni pivski kvasac, koji se prije autolize mora dobro oprati, jer za razliku od ekstrakata, u pivskom autolizatu ostaju sve komponente gorčine hmelja koje se nalaze uglavnom na staničnoj stjenci. Naime, u proizvodnji ekstrakata se izdvaja stjenka koja nosi glavni dio gorčine. U te svrhe najčešće se koristi alkalno pranje, pri čemu se pH kvaščeve suspenzije od 5-6 podesi na 9,0 s natrijevim hidroksidom. Tada gorke tvari hmelja tvore soli koje su topive u vodi i lako se ispiru sa kvaščevih stanica vodom. Nakon separacije uz pranje s vodom dobije se biomasa s vrlo malo gorkih tvari, pa se tako oprana biomasa koristi u proizvodnji autolizata. Za razliku od kvaščevih ekstrakata, autolizati nisu potpuno topivi u vodi zbog toga što sadrže komponente stanične stjenke, pa se koriste u prehrambenim proizvodima gdje nije bitna topivost. Zato se koriste uglavnom u čvrstim prehrambenim proizvodima kao poboljšivači okusa i mirisa te nutritivne vrijednosti proizvoda. Navedena svojstva čine ih poželjnim aditivom u prehrambenoj industriji, jer su jeftiniji od ekstrakata. Slično tome, mogu se koristiti i u fermentativnoj industriji, gdje hranjiva podloga nije bistra, kao izvori dušika i tvari rasta.
10.2.3. Poboljšivači okusa i mirisa Od davnina je poznato da se za poboljšanje okusa i mirisa hrane često koriste gljive i njihovi pripravci. Ipak, intenzivno korištenje tih sredstava počinje tek početkom 20-tog stoljeća kada su u Japanu otkrili da je glutamat izoliran iz morske tange (trava) nositelj okusa i mirisa, a sol histidina 5'-inozinske kiseline kao aktivnu tvar arome bonita (Kodama, 1913). Mnogo kasnije je utvrđeno da je glavna tvar okusa u shitake gljivama 5'-gvanozin monofosfat (Shimazono, 1964). U današnjim se pripravcima za poboljšanje okusa najčešće nalaze natrijev glutamat, dinatrijev 5'-IMP i dinatrijev 5'-GMP, koji se mogu nabaviti na svjetskom tržištu 292
(Nonomiya,1998). Pojačavaju mesni okus u hrani pa se često primjenjuju u proizvodnji juha, umaka, mnogih začinskih pripravaka i gotove hrane (Yamagushi i Takahashi,1984). Tako japanski proizvod » umami « sadrži glutaminsku kiselinu iz povrća, dinatrijev 5'IMP iz ribe i mesa i dinatrijev 5'-GMP iz shitake gljiva. Kasnije je utvrđeno da 5'-GMP ima nekoliko puta jače djelovanje od 5'-IMP (Kuninaka,1986). Takva svojstva nukleotida omogućuju smanjenje glutamata ili čak izostavljanje u prehrambenim proizvodima. Osim toga, relativno male količine nukleotida mogu zamijeniti i okus soli, što je od posebnog značaja, jer se iz zdravstvenih razloga nastoji smanjiti udio soli u svim prehrambenim proizvodima. Nakon tih spoznaja o djelovanju nukleotida, kvaščeva biomasa je istaknuta kao mogući izvor RNA, čijom hidrolizom se mogu proizvesti nukleotidi. Kvaščeva biomasa (naročito pekarski i pivski kvasac) je također poznata kao GRAS (generally recognized as safe) sirovina, s visokim udjelom RNA (6-11 %). Zbog ekonomične proizvodnje, kvaščeve biomase su odabrane za ekstrakciju RNA, čijom se razgradnjom s nukleazama dobiju 5'nukleotidi. Ti proizvodi mogu biti vrlo visoke čistoće (Nakao, 1979; Bigelis 1992). Količina RNA je promjenljiva u različitim kvaščevim biomasama obzirom na vrstu kvasca, supstratu za uzgoj i o uvjetima uzgoja. Zato se Candida utilis koja sadrži 10-15 % RNA, uzgojena na zdravstveno sigurnim (GRAS) supstratima (najčešće melasa), vrlo često koristi za proizvodnju nukleotida. Iako pekarski kvasac sadrži znatno manji udio RNA (6-8 %), također se često koristi u proizvodnji 5'-nukleotida. Posebno je interesantna proizvodnja nukleotida iz pivskog kvasca, jer je biomasa pivskog kvasca nuzproizvod u proizvodnji piva, pa je time ekonomičnost procesa vrlo dobra. Proces ekstrakcije RNA iz kvaščeve biomase je kritičan za ekonomičnost procesa. Najčešće se ekstrakcija RNA iz kvaščeve biomase obavlja u lužnatom mediju pri 60o C i pH oko 10 tijekom 20-30 min (Andreu i sur., 1988), nakon čega se tekući dio izdvaja centrifugiranjem i neutralizira do pH 5.0 s HCl. Pri tom pH istalože se DNA i proteini, a neznatna količina RNA zaostaje u topivom dijelu. Talog se uklanja separacijom, a supernatant se zakiseli na pH 2, pri čemu se iztaloži RNA, a talog dobro ispere vodom. Tada se pristupa procesu razgradjne RNA do nukleotida (Benaiges i sur.,1990; Bowles 1991). Ekonomičnost procesa se znatno poboljšava kada se nakon ekstrakcije NK, preostali dio koristi kao proteinski proizvod za prehrambene namjene, kao što je opisano u točki 2.5.1 ovog poglavlja. Takav proizvod u prehrani je bolji, jer je višak nukleinskih kiselina limitirajući faktor za konzumaciju većih količina kvaščeve biomase. Postoje četiri glavne vrste nukleolitičkih enzima: nukleaze, fosfataze, nukleozidaze i nukleodeaminaze. Većina tih enzima prisutna je u svim kvaščevim stanicama i ostalim biološkim materijalima u različitim koncentracijama (Nagodawithana,1993). Za razgradnju RNA koristi se danas uglavnom 5'-fosfodiesteraza (FDE). Taj se enzim danas nalazi na tržištu, najčešće pod nazivom Nukleaza PL. Izolira se iz sladnih klica vrlo uspješno ( Bowles, 1991). Razgradnja RNA i konverzija 5'-AMP-a u 5'-IMP prikazane su na slikama 10.2 i 10.3. Detaljan opis postupka ekstrakcije i razgradnje RNA iz kvaščevih stanica opisala je Beluhan (2000).
293
Slika 10.2. Razgradnja RNA enzimom 5'-fosfodiesterazom (PED)
Slika 10.3. Konverzija 5'-AMP u 5'-IMP adenilat deaminazom
294
10.2.4. Nukleotidi u funkcionalnim proizvodima Nukleotidi su unutarstanične komponente, od presudne važnosti za stanične funkcije i metabolizam. Genetička informacija za proizvodnju svih proteina je pohranjena u DNA (osim u virusima gdje je RNA), dok RNA djeluje kao biokemijski prenositelj informacija pohranjenih u DNA. Osim uloge u genetici i proizvodnji proteina, nukleotidi imaju važnu ulogu u mnogim biološkim procesima, kao što su: - prenošenje i skladištenje kemijske energije, najviše kao ATP - komponente nekih važnih koenzima kao što su NAD, NADP, FAD i koenzima A. Svi su uključeni u metabolizam ugljikohidrata, proteina i masti (Mateo, 2005). - biološki regulatori važnih staničnih procesa. Tako npr. ciklički AMP djeluje kao alosterički aktivator enzima, među ostalim kod razgradnje glikogena. ATP je regulator glikolize na nivou enzima fosfofruktokinaze, jer visoka koncentracija ATP-a smanjuje brzinu glikolize u aerobnim vrstama (Pasterov efekt). -kontrola nekoliko enzimskih reakcija -sudjeluju kao intermedijeri u biosintetskim reakcijama. Nukleotidi su prisutni kao neproteinski dušični dio većine hrane i razgrađuju se probavnim enzimima gastrointestinalnog sustava na jednostavnije oblike za apsorpciju. Još do nedavno se je mislilo da nukleotidi nemaju značajnu ulugu u prehrani ljudi, jer se smatralo da su živi organizmi, ukljućujući i ljude, sposobni sintetizirati sve nukleotide potrebne za normalan rast i razvoj organizma. Te spoznaje su temeljene na promatranju rasta i razvoja zdravih ljudi. Međutim, mnoge studije u posljednjih nekoliko dekada su pokazale, da purinski i pirimidinski nukleotidi imaju značajnu ulogu za optimalno funkcioniranje viših organizama (Kulkarni i sur.1992; Fegan 2007). Studije su rađene uglasvnom na životinjama, gdje su pokazalo da nedostatak nukleotida u hrani izaziva ozbiljne negativne promjene u imunosustavu. Zbog toga se danas smatra da su nukleotidi uvjetno esencijalni, što znači da se u određenim uvjetima odnosno stanjima organizma ne mogu sintetizirati u dovoljnoj količini pa ih treba unositi s hranom (Leach, 1995). Ta stanja su povećani rast (kod dojenčadi), oslabljeni imunosustav (bolesni ljudi) i neadekvatna prehrana. Dakle, nukleotidi su prepoznati kao važni elementi ljudske prehrane, naročito u periodu brzog rasta ili psihološkog stresa (Uauy, 1989). Postoje dva biosintetska puta metabolizma nukleotida: de novo i salvage biosintetski put. De novo biosintetski put koristi male prekursore za sintezu nukleotida, dok salvage biosintetski put koristi nukleozide i baze nastale razgradnjom nukleotida. U normalnim uvjetima nukleotidi se direktno sintetiziraju pomoću salvage biosintetskog puta u organizmu. Nadalje, imune i intestinalne stanice ne mogu sintetizirati nukleotide i ovise o nukleotidima iz drugih izvora, odnosno iz hrane. Stoga, prehrambeni nukleotidi pospješuju salvage biosintetski put, jer osiguravaju dovoljne količine nukleozida i dušičnih baza. U većini biokemijskih procesa primarni nukleotidi su 5'-AMP, 5'-CMP, 5'-GMP, 5'-IMP i 5'-UMP. Dodatak tih nukleotida prehrani osigurava njihov dostatan izvor za sintezu njihovih intermedijera kada su organizmu potrebni (Stein i Mateo, 2005). Naime, istraživanja su pokazala da dodatci nukleotida prehrani u određenim količinama imaju slijedeće pozitivne učinke: - povećavaju rezistenciju prema bakterijskim i virusnim infekcijama, - ubrzavaju proizvodnju antitijela, - povećavaju neutrofile u bijelim krvnim stanicama, - povećavaju broj makrofaga, - spriječavaju pothranjenost i gladovanje uzrokovano oslabljenim imunosustavom, - povećavaju aktivnost prirodnih stanica-ubojica i proizvodnju interleukina-2,
295
- povećavaju HDL-holesterol u plazmi (dobri holesterol), - smanjuju koncentraciju LDL kolesterola (loš kolesterol), - ubrzavaju oporavak jetre nakon oštećenja, - imaju pozitivne učinke na probavu, - ubrzavaju poboljšanje probave nakon proljeva, - imaju pozitivne učinke na oporavak organizma nakon stresa. Navedeni pozitivni učinci su znanstveno dokazani i detaljno opisani (Koppel, 2003). 10.2.4.1. Prehrambeni izvori nukleotida Nukleotidi se nalaze u mnogim biljnim, životinjskim i mikrobnim staničnim materijalima uglavnom u obliku nukleinskih kiselina. Naročito visoku količinu nukleotida imaju riblji i životinjski topivi ekstrakti (fish and animal solubles), leguminoze, kvaščevi ekstrakti, te jednostanični organizmi u obliku kvašćevih i bakterijskih biomasa koje imaju visoki udjel DNA i RNA (Fegan, 2007). Međutim, cijele stanice kvasca su manje probavljive od kvaščevog ekstrakta, koji sadrži sve komponente u topivom stanju. Zato se kvaščev ekstrakt vrlo često koristi kao dodatak prehrani (Holen i Jonsson, 2004). Osim toga, kao što je prethodno navedeno u točki 10.2.3, čisti 5'-mononukleotidi se mogu proizvesti iz RNA pivskog, prehrambenog ili pekarskog kvasca. Kako ti proizvodi već postoje na svjetskom tržištu, koriste se kao dodaci prehrani u raznim dojenačkim formulama te kao dodaci mnogim prehrambenim proizvodima za poboljšanje kvalitete.
10.2.5. Prehrambeni kvasac Korištenje kvaščeve biomase u prehrambene svrhe već je opisano u prethodnom poglavlju 9. Dakle, kvaščeva biomasa se koristi u prehrambenim proizvodima u količini od 0.5-5 %, najčešće u mesnim prerađevinama (različite vrste pašteta), jer kvaščevi proteini imaju emulgirajuća svojstva, što je važno svojstvo za povezivanje komponenti s visokim udjelom masti. Međutim, intenzivno konzumiranje kvasca ima i negativnih posljedica po ljudsko zdravlje. Kao što je prethodno spomenuto, potrošnja kvaščeve biomase u prehrani je ograničena zbog visoke koncentracije NK, kojih ima 6-15 %. Naime, metaboličkom razgradnjom NK nastaje mokraćna kiselina, koja se taloži na zglobovima i uzrokuje giht, artritis te pospješuje stvaranje bubrežnih kamenaca u urinalnom traktu. Zato se potrošnja kvaščeve biomase ograničava na 10-16 g/dan. Stoga se za proizvodnju prehrambenog kvasca boljih karakteristika vrši ekstrakcija nukleinskih kiselina, čime se proizvedu tzv. proteinski preparati kvasca 10.2.5.1. Proteinski preparati kvasca U kvaščevim biomasama različitog porijekla količina sirovih proteina je u granicama od 45-55 %, dok je količina pravih proteina računata na bazi aminokiselina nešto manja i iznosi 35-48 %. Ta količina je unaprijed određena genetičkim svojstvima kvasaca i uvjetima uzgoja tijekom kultivacije. Kvaščevi proteini sadrže općenito puno lizina, leucina i fenilalanina, a malo aminokiselina sa sumporom (tablici 10.3). Zato kvaščevi proteini imaju nešto manju prehrambenu vrijednost od kazeina, pa je PER (protein efficiency ratio) za pekarski kvasac 1.8, dok je za kazein 2.5. Prema tome je nutritivna vrijednost proteina kvasca 70 % od vrijednosti kazeina. PER vrijednost kvaščevih proteina može se povećati dodatkom metionina u suhi proizvod. Tako se dodatkom 0.5 % težinski metioniona povećava PER vrijednost kvaščevih proteina na 2.77. Dakle, iako su
296
kvaščevi proteini manje nutritivne vrijednosti od animalnih, njihova vrijednost se može znatno povećati u smjesi s biljnim i životinjskim proteinima. Tablica 10.3. Aminokiselinski sastav proteina kvasaca (Reed i Nagodawithana,1991) Aminokiselina Candida utilis Candida utilis K. marxianus S. cerevisiae (sulfitna lužina (Amoco Food) (Bernstein i (Reed i Peppler, Peppler,1965) Com. 1974) Planz,1977) 1973) Alanin 5.8 5.5 Arginin 5.4 5.4 Asparaginska 9.2 8.8 Cistin 15.6 0.4 Glutaminska 3.6 14.6 Glicin 4.5 Histidin 1.2 2.1 Izoleucin* 3.8 4.5 Leucin* 7.6 7.1 * Lizin 4.8 6.6 Metionin* 1.1 1.4 * Fenilalanin 8.6 4.1 Prolin 6.0 3.4 Serin 5.0 4,7 Treonin* 5.4 5.5 * Triptofan 2.4 1.2 Tirozin 6.2 3.3 Valin* 3.8 5.7 *Esencijalne aminokiseline za ljudski organizam
5.0 1.6
2.1 4.0 6.1 6.9 1.9 2.8
4.0 5.5 7.9 8.2 2.5 4.5
5.8 1.4 2.4 5.4
4.8 1.2 5.0 5.5
Kako bi se proizvela biomasa kvasca s većim udjelom proteina i manjom količinom NK, neophodno je smanjiti količinu NK u kvaščevoj biomasi. To se u principu postiže na dva načina: - odabirom proizvodnog (radnog) kvasca posebnih genetičkih svojstava i uvjetima uzgoja - ekstrakcijom NK iz proizvedene kvaščeve biomase. Uzgojne metode su dale dobre, ali često ne i zadovoljavajuće rezultate, pa je potrebno dodatno smanjenje količine RNA u kvaščevoj biomasi. Dakle, nužna je ekstrakcija NK iz uzgojene kvaščeve biomase. Postoji nekoliko metoda za ekstrakciju NK iz kvaščeve biomase, a najčešće se koriste metode ekstrakcije u alkalnom mediju pri povišenim temperaturama (Newell i sur., 1975; Robins, 1976). Tim metodama se smanjuje količina RNA za oko 80 %, tako da kvaščevi proteinski preparati sadrže 1-2 % RNA (purinskih nukleotida). Slično tome su Gierhart i Potter (1978) opisali metodu za uklanjanje NK iz čitavih stanica C. utilis alkalnom hidrolizom i enzimatskim metodama te pranjem sa puferom. Količina RNA od 8 % u biomasi kvasca smanjena je za 45-97 %, pri čemu je ukupno iskorištenje suhe tvari bilo 45-80 %, a proteina 67-98 %. Osim toga neki auturi su pokušali ekstrahirati RNA iz kvaščeve biomase pomoću endogenih nukleaza autolitičkim metodama (Tannenbaum i sur. 1973). Takva metoda se pokazala uspješnom za zadovoljavajuće smanjenje purinskih baza u kvaščevoj biomasi iz koje se ekstrahiraju proteini za ljudsku upotrebu. Ipak, treba imati na umu da se ekstrakcijom iz citoplazme izdvajaju vitamini, aminokiseline, peptidi i sve topive tvari, što naravno uzrokuje gubitak vrijednih komponenti, a iskorištenje procesa je znatno
297
manje. Zato se nastoje iskoristiti sve komponente kvaščeve biomase, kao što su nukleotidi i dr., za što postoje posebni postupci.
10.3. ENZIMI IZ KVASCA Kvaščeve stanice su izuzetno dobar izvor mnogih enzima, kao što je invertaza, alkoholna dehidrogenaza, β-galaktozidaza, lipaza, rafinaza, fosfofruktokinaza i fosfoglicerol kinaza. Ovi enzimi nalaze se u kvaščevoj biomasi u prilično velikim količinama pa se proizvode na komercijalnoj razini. Neki od ovih enzima su nađeni izvan stanice, ali su tijesno ili slabo vezani na staničnu stijenku i/ili citoplazmatsku membranu. Poznato je da su invertaza i neki drugi enzimi smješteni odmah ispod, odnosno u unutarnjem dijelu stanične stijenke kvasca S. cerevisiae (Pffaf, 1971). Enzimi koji su labilno vezani na staničnu stijenku mogu tijekom uzgoja biti otpušteni u okolni medij. S druge strane, laktaza je stanični enzim u kvascima iz roda Kluyveromices i Candida, pa se proizvodi komercijalno najčešće pomoću kvasca Kluyveromyces marxianus.
10.3.1. Invertaza (β-D-fruktofuranozid fruktohidrolaza) Invertaza je enzim koji cijepa saharozu na glukozu i fruktozu, tj. smjesu nazvanu invertni šećer pa joj od tuda i potječe ime. Smjesa je dosta slađa od saharoze u ekvivalentnim količinama, slabije kristalizira pa se stoga vrlo često koristi u prehrambenoj industriji. Razgradnja saharoze u invertni šećer ima dva bitna razloga: 1. U prehrambenoj industriji za proizvodnju nekih konditorskih proizvoda (čokolada, bomboni). U tim proizvodima je važno da ne dođe do kristalizacije šećera u proizvodu, što omogućuje proizvodu da ima plastičnu konzistenciju. 2. U proizvodnji visokovrijedne (high-test) melase iz šećerne trske za fermentativnu industriju. Ako saharoza u tim melesama nije invertirana dolazi do kristalizacije šećera, što otežava homogenizaciju i transport. Kada se hidrolizira saharoza, smjesa teže kristalizira, povećava se osmotski pritisak koji spriječava rast mikroorganizama pa se dobiva čist i stabilan koncentrat, s konzistencijom za lagano procesiranje. Većina kvasaca, pogotovo iz roda Saccharomyces, sadrže enzim invertazu. Tako je dokazano da kvasci iz roda Saccharomyces posjeduju šest gena označenih kao SUC, od kojih je jedan dovoljan za biosintezu invertaze i fermentaciju saharoze i rafinoze (Mortimer i Howthorn, 1969). Nešto kasnije (1975) je Hackel dokazao da se radi o SUC3 genu, odgovornom za proizvodnju oba oblika invertaze: vanjska, koja je glikozidno vezana na staničnu membranu i unutarnja koja je smještena u vakuolama i vezikulama. Vanjska je manoprotein i ima veću molnu masu, a unutarnja nije glikozidirana i ima manju molnu masu. Vanjska sadrži oko 50 % manana. Specifična aktivnost je slična, pri 30o C i pH 3,5-5,5. Proteinski dio oba enzima ima 60.000 Daltona. Karakteristike oba enzima su slične, ali je vanjska invertaza znatno stabilnija pri nižim pH vrijednostima, dok je stabilnost unutarnje invertaze znatno manja pri niskom pH ispod 6,0. Očito je da glikozidni dio daje enzimu specifičniu stabilnost. Invertaza je termički stabilna sve do 55o C, a inaktivacija počinje pri 65o C (Arnold,1971). Unutarnjoj invertazi stabilnost daje fosfomanan koji je dio u tom enzimu. Svojstva invertaza prikazana su u tablici 10.4.
298
Tablica 10.4. Svojstva kvaščevih invertaza (Gascon i sur., 1968) Vrsta invertaze Molekularna težina Količina manana, % Količina glukozamina, % Spec. aktivnist, U/mg proteina Km za saharozu, mmol /L pH-optimum za aktivnost pri 30oC pH-optimum za stabilnost pri 30oC
Vanjska 270.000 50 3 2.700 26 3,5-5,5 3,0-7,5
Unutarnja 135.000 3 0 2.900 25 3,5-5,5 6,0-9,0
Komercijalno se invertaza proizvodi iz kvaščeve biomase, naročito iz pekarskog kvasca. Najčešći način izolacije invertaze je ekstrakcija nakon autolize kvaščeve biomase i precipitacije (taloženja) s etanolom, acetonom i diamonijevim sulfatom. Nakon toga slijedi pročišćavanje, što je detaljno opisao Meister (1965). Kasnije su predloženi i drugi postupci za pročišćavanje i karakterizaciju kvaščeve invertaze (Neumann. i Lampen, 1967), koja često dolazi u obliku koncentrata s 50 % enzima. Enzimska aktivnost komercijalno proizvedene invertaze izražava se na nekoliko načina. Često se aktivnost označava sa K, što je molna konstanta brzine reakcija ili kao inverzijska jedinica IU (aktivnost po jedinici mase enzimskog preparata). Tržišna invertaza ima 1200-1800 IU/g, što odgovara K vrijednosti 2-3 računato prema AOAC metodi 31.024 (1984). Naime, jedna IU odgovara aktivnosti invertaze koja hidrolizira 5.0 mg saharoze u minuti pri 25oC.
10.3.2. Laktaza Laktaza ili β-galaktozidaza katalizira hidrolizu mliječnog šećera laktoze u glukozu i galaktozu. Ovaj enzim se intenzivno upotrebljava u prehrambenoj industriji. Naročito se koristi u obradi mliječnih koncentrata koji se smrzavaju, radi produljenja trajnosti, da ne dođe do kristalizacije laktoze. Posebno se primjenjuju u proizvodima na bazi mlijeka koje konzumiraju potrošači s niskom laktaznom aktivnošću. Naime, većina ljudi koji redovito konzumiraju mlijeko imaju visoku laktaznu aktivnost tijekom cijelog života. Međutim, početkom 60-tih godina prošlog stoljeća dokazano je da neke populacije ljudi u kasnijoj dobi ne mogu razgraditi laktozu zbog niske laktazne aktivnosti. Ta pojava je dosta česta kod crnaca iz Afrike i Amerike, Kineza, Indijanaca iz sjeverne i južne amerike, Indijaca iz Azije, Japanaca i Australskih aboriđana. Laktaznu aktivnost nemaju kvasci iz roda Saccharomyces, ali je imaju mnogi kvasci iz rodova Kluyveromyces i Candida, kao što su C. pseudotropicalis i Kluy. marxianus. Genetičke karakteristike kvasaca koji imaju beta-galaktozidaznu aktivnost opisali su Sheetz i Dickson (1981). Odredili su strukturni gen za proizvodnju β-galaktozidaze i nazvali ga LAC 4. Kasnije studije su potvrdile te nalaze. Kluyveromyces vrste, naročito K. maxianus, uglavnom se koriste za proizvodnju laktaze (Mahoney i Whitaker, 1978; Belem i Lee,1998). Enzim je dostupan na tržištu u osušenom stanju (vakuum ili fluidno sušenje) sa 5-8 % vlage. Biomasa kvasca Kluyveromyces marxianus može se još također koristiti kao: 1. izvor oligonukleotida koji se koriste kao poboljšivači okusa i mirisa u hrani; 2. izvor oligosaharida, koji se koriste kao prebiotici za stimulaciju rasta Bifidobacterium sp. u ljudskom i životinjskom probavnom traktu; 3. izvor oligopeptida, imunostimulatora, koji se dodaju mliječnim proizvodima (Belem i Lee, 1998).
299
U literaturi su opisani mnogi postupci za priozvodnju beta-galaktozidaze, a glavni kvasac za proizvodnju je Kluyveromyces marxianus koji se uzgaja na sirutki. Postupci se uglavnom razlikuju u soju kvasca specifičnih karakteristika, podlozi i načinu vođenja uzgoja te izolaciji enzima. Enzim ima pH i temperaturni optimum oko 7 i 50o C i stabilan je u području pH 6,0-7,6, ali gubi aktivnost na temperaturama iznad 60o C.
10.3.3. Proteolitički enzimi Ulogu proteolitičkih enzima u kvaščevim stanicama opisali su Halasz i Lasztity (1991). Proteolitički enzimi imaju dvostruku praktičnu vrijednost. Oni se koriste u proizvodnji autolizata (vidi poglavlje 2.1.1), a druga grupa u proizvodnji enzimskih preparata. Osim spomenute praktične vrijednosti, napredno istraživanje kvaščevih proteaza ima i znanstvenu vrijednost, pogotovo na nivou molekularne biologije kvasca jer se time dolazi do novih teoretskih spoznaja o rastu i fermentaciji kvasaca. Kao što je već prethodno opisano, proteolitički enzimi se nalaze unutar kvaščevih stanica, uglavnom u vakuolama (endopeptidaze A i B, karboksipeptidaza Y i S). Citosol sadrži proteaze D i E, a proteaza M se nalazi u mitohondriju. Većina istraživačkih radova obavljena je s kvascem S.cerevisiae (Reed i Nagodawithana,1991). Utvrđeno je da su proteolitički enzimi inhibirani specifičnim inhibitorima u živim stanicama. Tek kada se poremeti stanična struktura dolazi do aktivacije enzima, kao što je prethodno opisano u proizvodnji kvaščevih autolizata i ekstrakata. Koncentracija proteolitičkih enzima u kvaščevim stanicama ovisi uglavnom o uzgojnim uvjetima (Halasz , 1982).
10.3.4. Melibiaza (α-galaktozidaza) Melibiaza je enzim koji hidrolizira disaharid melibiozu na glukozu i fruktozu. Zbog specifičnosti ovog enzima, postoji njegova potencijalna potreba u ekstrakciji šećera iz šećerne repe. Naime, šećerna repa sadrži osim saharoze i trisaharid rafinozu, koja ometa kristalizaciju šećera, a time smanjuje i iskorištenje procesa. Rezultat toga je veća koncentracija šećera u melasi. Da se poboljša efikasnost procesa potrebno je razgraditi rafinozu. Najbolji rezultat za razgradnju rafinoze pokazao je enzim melibiaza koji cijepa rafinozu na saharozu i galaktozu, nakon čega se znatno poveća iskorištenje u proizvodnji kristalnog šećera i šećerne repe. Zato se ovaj enzim često naziva i rafinaza. Ovaj enzim nije komercijalno dostupan, ali bi mogao biti koristan u izolaciji šećera iz šećerne repe. Potencijalna primjena ovog enzima je i u proizvodnji pekarskog kvasca, jer se uzgoj pekarskog kvasca obavlja uglavnom na melesi šećerne repe koja sadrži 0.5-2,5 % rafinoze. Kvasac S. cerevisiae može potrošiti samo jednu trećinu rafinoze, jer invertaza cijepa rafinozu na fruktozu, koju kvasac metabolizira i melibiozu koju kvasac ne može razgraditi. Da se rafinoza potpuno razgradi potrebno je dodati enzim melibiazu u hranjivu podlogu ili da podloga proteče kroz kolonu koja na nosaču ima enzim melibiazu. Ovi postupci nisu ekonomični pa su istraživači pokušali ubaciti u kvaščeve stanice gen za biosintezu melibiaze. Tako su Vincent i sur. (1999) ugradili gen MEL1 u kvasac S. cerevisiae za komercijalnu proizvodnju pekarskog kvasca klasičnim križanjem i tehnologijom rekombinantne DNA. Oba soja brzo previru melibiozu i podnose visoke koncentracije šećera u tijestu pri proizvodnji kruha i fermentiranih slastica pa se mogu koristiti u industrijskoj proizvodnji pekarskog kvasca.
300
10.3.5. Alkoholna dehidrogenaza Sojevi kvasca S. cerevisiae za proizvodnju pekarskog kvasca imaju visoku konstitutivnu aktivnost alkoholne dehidrogenaze (ADH). Zato se biomasa pekarskog kvasca najčešće koristi za komercijalnu proizvodnju tog enzima. Obzirom na primjenu, proizvodi se u 2 oblika: 1. potpuno čisti, koji se koristi kao biokatalizator u biokemijskim istraživanjima, 2. nepročišćeni, u obliku kvaščevih peleta, koji se primjenjuje u nekim zemljama za spriječavanje alkoholne intoksikacije, a uzima se oralno. Naime, pretpostavka je da alkoholna dehigrogenaza smanjuje koncentraciju alkohola u krvi, prevodeći ga u acetaldehid. Uspješnost te reakcije je neizvjesna jer uvjeti u probavnom traktu nisu optimalni za rad enzima (niski pH,oko 2-3). Metodu za izolaciju i pročišćavanje alkoholne dehidrogenaze iz kvaščevog lizata (ekstrakta) opisali su Hoffstetter i Wagner (1990). Primjenili su slobodno-protočnu (freeflow) elektroforezu i dobili iskorištenje od 90-96 % enzima visoke čistoće.
10.3.6. Lipaza Lipaza je enzim iz skupine hidrolitičkih enzima, koja se puno primjenjuje u prehrambenoj i biotehnološkoj proizvodnji, te u biomedicini. Njezina intenzivna primjena u sintezi novih stereoizomera dovela je do nedostatka ovog enzima na svjetskom tržištu. Zato je porasla biotehnološka proizvodnja enzima lipaze pomoću kvasaca, posebno iz roda Candida. Najpoznatija je vrsta Candida rugosa, koja se naveliko koristi u proizvodnji lipaze (Gordillo i sur.,1998). Toksikološki je utvrđeno da tako proizvedeni enzim nema nikakvih nuspojava pa se može koristiti u prehrambenoj industriji i biotehnološkoj primjeni ( Flood i Kondo, 2001). Upotrebu lipaza mikrobnog porijekla detaljno su opisali Panday i sur. (1999). Najviše se koriste u prehrambenoj industriji, pa se može reći da su lipaze integralni dio suvremene prehrambene industrije. Korištenje ovog enzima u prehrambenoj industriji poboljšava tradicionalne kemijske procese u preradi hrane. Mikrobne lipaze se najčešće koriste u proizvodnji sira i vrhnja poboljšanog mirisa i okusa, te u proizvodnji fermentiranih kobasica i drugih prehrambenih proizvoda za interesterifikaciju masti i ulja, gdje se dobiju acil-gliceroli koji se ne mogu proizvesti uobičajenim postupcima. To se svojstvo pokazalo vrlo interesantnim u proizvodnji ulja specifičnih svojstava. Interesantna upotreba lipaza je u biomedicini zbog specifičnih selektivnih reakcija u različitim organskim otapalima za prepoznavanje supstrata, pa su važan biokatalizator u mnogim biokemijskim reakcijama. Posebno interesantna primjena lipaza je u biosintezi finih kemikalija i farmaceutskih proizvoda. Osim ovih najinteresantnijih primjena, lipaze se koriste i u proizvodnji deterđenata, te u kozmetičkoj industriji.
10.3.7. Ostali enzimi Osim prethodno opisanih enzima iz kvasca se mogu izolirati i neki drugi enzimi po ekonomičnim postupcima. U tu skupinu spadaju slijedeći enzimi: heksokinaza, L-laktat dehidrogenaza, glukoza 6-fosfat dehidrogenaza, fenilalanin amonijeva-liaza (PAL) i gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (GPDH). Metodu za izolaciju nekih od ovih enzima (GPDH, heksokinaza) opisao je Roe (2001). Primjenjena je metoda ionske kromatografije. Kao sirovina je korišten kvaščev ekstrakt, koji se prije kromatografije pročisti dijalizom.
301
Od gore navedenih enzima posebna pozornost posvećena je fenilalanin amonij-lijazi, koju proizvode neki kvasci iz roda Rhodotorula. Za komercijalnu proizvodnju ovog enzima najčešće se koriste kvasci Rhodotorula rubra i R. graminis (Orndorf i sur.,1988). PAL katalizira deaminaciju L-fenilalanina do trans–cinamične kiseline i amonijaka, što se koristi u medicini za moguće liječenje trajne (genetičke) bolesti fenilketonurije (Sarkissian i sur., 1999). Naime, taj enzim može zamijeniti fenilalanin momo-oksigenazu, koja se normalno nalazi u višim organizmima, a kod bolesnika je taj enzim deficitaran. Za sada se ta bolest liječi tako da se fenilalanin uklanja iz hrane, što je dosta uspješan ali kompliciran način liječenja.
10.4. BOJILA: tvari za bojanje prehrambenih proizvoda Posljednjih nakoliko desetljeća pojavio se značajan interes u svijetu za proizvodnju tvari za bojenje iz prirodnih izvora. U tu svrhu najčešće se koriste pigmenti biljnog i životinjskog porijekla. Osim toga, koriste se i kvasci za proizvodnju različitih boja (žuta, ljubičasta-pink) i karotenoidnih pigmenata. Naime, kvasci imaju i određene prednosti jer se mogu umnožiti u industrijskoj proizvodnji na komercijalnoj razini. Zato kvasci i njihova biomasa postaju sve interesantniji u ekonomičnoj proizvodnji prirodnih bojila. Najpoznatiji pigmentirani kvasci potječu iz rodova Rhodotorula, Rhodospondium, Phaffia, Cryptoccocus i Sporobolomyces. Određene vrste kvasaca iz ovih rodova mogu proizvesti mnoge pigmente kao što su: β-karoten, α-karoten, torulen, torularhodin, plektaniaksointin i 2-hidroksi-plektanisksantin. Karotenoide proizvode kvasci iz roda Rhodotorula, a to su uglavnom β-karoten, te oksidirani spojevi torulen i torularhodin, a omjer tih spojeva određuje nijansu crvene boje u različitim vrstama (Tinoi i sur., 2005). Bazidiomicetni kvasac Phaffia rhodozyma otkriven 70-tih godina prošlog stoljeća, je potpuno različit od svih drugih pigmentiranih kvasaca i proizvodi karotinoidni pigment astaksantin (Andrew i sur,1976). Phaffia rhodozyma je kvasac potpuno različit od svih askomicetnih kvasaca iz roda Saccharomyces, pogotovo po strukturi stanične stijenke. Ovaj kvasac osim glukoze i manoze u strukturi stijenke sadrži i ksilozu, koju askomicetni kvasci nemaju. Proizvodnja astaksantina pomoću kvasca Phaffia rhodozyma u aerobnim uvjetima je vrlo specifična, pa je zato neophodno optimizirati sastav hranjive podloge, brzinu prijenosa kisika i uvjete uzgoja. Za postizanje visokog prinosa astaksantina potreban je visokoproduktivni soj kvasca, intenzivna aeracija u procesu te pH oko 5 i temperatura 20-22,5 oC (Fang i Chiou, 1996; Lui i sur., 2008). Struktura astaksantina prikazana je na slici 10.4.
Slika 10.4. Struktura astaksantina
302
Veliki interes za astaksantin proizašao je iz činjenice što je taj pigment prisutan u velikom broju životinjskih vrsta. Taj pigment je karakterističan za boju perja ptica flamengo, za boju oklopa rakova (jastog, škamp i drugi morski rakovi), te meso riba (pastrva, losos). Industrijska proizvodnja tvari za bojenje je u porastu iako su njihove cijene vrlo visoke (Tinoi i sur. 2005). Naravno i ostali pigmenti proizvode se sve više na komercijalnoj razini, a u tu svrhu najčešće se koriste kvasci Rhodotorula glurinis (βkaroten) i Rhodotorula gramini (specifični karotenoidi, β-karoten, torulen, γ-karoten i torolarhodin).
10.5. FARMACEUTSKI I KOZMETIČKI PROIZVODI Kvaščeva biomasa je izvrsna sirovina za proizvodnju prirodnih preparata koji se koriste u zdravstvene i kozmetičke svrhe. Među njima najznačajniji su kožni respiracijski faktor, β-glukan i koenzim-A sintetizirajući kompleks, te će oni biti detaljnije opisani.
10.5.1. Kožni respiracijski faktor Proizvod izoliran iz kvaščeve biomase koji ima svojstvo zacijelivanja rana otkrio je Sperti već 1943. godine. Izolirao ga je iz svježeg pekarskog kvasca ekstrakcijom s etanolom. Ekstrakt je ugustio uparavanjem pod vakuumom. Preparat je pokazao pozitivan učinak u zacijeljivanju rana. Nakon tih spoznaja počeo se komercijalno proizvoditi kao sredstvo za zaustavljanje krvarenja i često se naziva kožni respiracijski faktor (SRF-skin respiratory factor). Često se koristio i kvaščev ekstrakt kao sredstvo za brže zacijelivanje rana. Takva sredstva su se proizvodila uglavnom u sirovom obliku. Naime, poznato je da je zaraštanje rana direktno povezano s potrošnjom kisika u oštećenim stanicama i stanicama oko oštećenog mjesta. Zbog tog razloga, svako sredstvo koje pospješuje respirativni proces s kisikom u oštećenom tkivu može ubrzati zaraštanje rane. Kožni respiratorni faktor izoliran iz kvasca, pokazuje biološka svojstva za povećanje brzine prijenosa kisika, pa tako stimulira epitelizaciju rane i brzo zaraštanje. To svojstvo je bilo dostatno kada se SRF izolira iz kvasca ili kvaščevog ekstrakta na komercijalnoj razini za kozmetičku i farmaceutsku industriju, u obliku paste ili suhog praška. Napredkom tehnologije izolacije, proizvedena je proteinska frakcija u čistom obliku koja je sadržavala proteine manje molekulske mase. Dokazano je da taj preparat ima bolji učinak za zacijelivanje rana i pojačava sintezu kolagena (Gordon i sur. 1976). Ova svojstva su pripisana peptidima male molekulske mase. Predpostavljeno je da peptidi reguliraju stanični faktor rasta, što dovodi do bržeg zaraštanja rane jer se stimulira angiogeneza (rast i obnova krvnih žila) te biosinteza kolagena. Nakon toga izolirano je preko 500 izabranih (sortiranih) proteina iz kvasca S. cerevisiae, koji su pokazali pozitivne učinke u zaraštanju rana. Od tada počinje nova era u proizvodnji kozmetičkih preparata (Lupo i Cole, 2007). U novije vrijeme ta sredstva su našla veliku primjenu u kozmetičkim preparatima koji usporavaju starenje kože.
10.5.2. Glukan Pod pojmom glukan u širem smislu podrazumijeva se netopivi dio kvaščeve biomase, koji zaostaje pri komercijalnoj proizvodnji kvaščevog ekstrakta. Dakle, to je nuzproizvod u proizvodnji topivog kvaščevog ekstrakta iz pekarskog ili pivskog kvasca. Uglavnom je to stanična stijenka koja se sastoji od glukana, manana, hitina i proteina. Strukturu
303
stanične stijenke pojasnili su Klis i sur. (2002). Taj proizvod najčešće dolazi na tržište osušen u sušnici s raspršivanjem (spray-dry), ali nije funkcionalan u ljudskom probavnom traktu, iako veći dio tog proizvoda čini glukanska frakcija. Osim toga, ovaj proizvod ima loš okus pa se koristi kao krmivo, jer sadrži 35-40 % proteina. Zbog toga se «debris» (čvrsti dio kvaščeve stanice) koji ostaje nakon separacije u proizvodnji kvaščevog ekstrakta mora pročistiti da se dobije preparat s najmanje 80 % glukana. Takav glukan se može dobiti pranjem debrisa s vodom i lužinom, a zatim kiselinom. Oprani proizvod ima poželjna organoleptička svojstva, pa se može koristiti u prehrambenoj i fermentativnoj industriji. Poželjno svojstvo glukana je da veže vodu i često se koristi u prehrambenoj industriji kao ugušćivač (sredstvo za bubrenje). Ima okus sličan masnoći pa se može koristi umjesto masnoća u prehrambenim proizvodima niske energetske vrijednosti u umacima za salate, analozima sira i desertima kao što je sladoled. Zbog velikog kapaciteta vezanja vode koristi se i kao aditiv u proizvodnji kobasica, hrenovki i nekim drugim mesnim proizvodima. Osim u prehrambenoj industriji glukan se može koristiti u proizvodnji vina, jer se pokazalo da se dodatkom malih količina glukana uravnotežuje fermentacija vina.
Slika 10.5. Struktura kvaščevog beta 1,3 glukana (Kath i Kulicke, 1999) Čisti β-glukan koji je mono-polimer glukoze, povezan β-1,3 ili 1,6 D-glikolitskim vezama ima izraženo funkcionalno djelovanje u ljudskom organizmu. U staničnoj stijenci kvasaca dominantan je β-1,3 glukan (85 %), kojeg čine dugi lanci s oko 1500 glukoznih jedinica, dok β-1,6 glukan (15 %) ima znatno kraće lance s oko 150 glukoznih jedinica. Ovi glukani su međusobno povezani kovalentno, kao i s manoproteinima i hitinom (slika 10.5). Te veze daju čvrstoću staničnoj stijenci kvasca, što pridonosi osmotskom integritetu stanice. U proizvodnji glukanskih pripravaka najznačajniji je β-1,3 glukan, koji ima molekulsku masu oko 240.000. Dolazi uglavnom u praškastom obliku. Pokazalo se da β-1,3 glukan ima pozitivan učinak na poboljšanje imuniteta ljudskog organizma. Pogotovo se to odnosi na nove pripravke sa kraćim lancima topive u vodi, koji se proizvode fosforilacijom ili cijepanjem β-1,3 glukana s kiselinama (Jamas i sur., 1997). Vodotopivi beta 1,3 glukan je ustvari farmaceutski preparat koji se koristi za pojačavanje imuniteta kod ljudi i životinja, smanjenje holesterola, te za spriječavanje raznih infektivnih bolesti (virusne, bakterijske, gljivične i parazitske infekcije), što su pokazale više od tisuću izrađenih studija i to u svjetski poznatim istraživačkim centrima i
304
institutima. Posebno je naglašen učinak topivog β-1,3 D glukana za spriječavanje ili inhibiranje rasta tumora (Lee i sur.2001; Laroshe i Michaud, 2007). U provedenim studijama također je opaženo da beta 1,3 D glukan povećava i djelotvornost terapija s raznim lijekovima kao što su antibiotici, antimikotici i antiparazitici. Važno je naglasiti da prema FDA nisu uočene nikakve nepoželjne nuspojave, čak i kod većih doza tijekom liječenja. Isto tako je opaženo da je beta-glukan, izoliran iz pekarskog i pivskog kvasca te gljiva, djelotvorniji od onog izoliranog iz žitarica (ječam, zob). Osim toga, inertna priroda kvaščevog glukana čini ga izvrsnim dijetetskim vlaknom za korištenje u različitim prehrambenim oblicima (aditivima). Tako se znatno poboljšava prehrambena i funkcionalna vrijednost dijetetskih proizvoda.
10.5.3. Koenzim A-sintetizirajući proteinski kompleks (CoA-SPC) Posljednjih godina u porastu su istraživanja za pronalaženje metoda za rano otkrivanje prisutnosti tumora u ljudskom organizmu. Takva metoda je otkrivena pa se njome određuje B-protein (po istraživaču Bucovazu) u krvi, koji nastaje odzivom organizma na pojavu tumora. B-protein se može dobro odrediti pomoću CoA-SPC jer reagira s proteinskom komponentom male molekulske mase, koji se otpušta iz CoAsintetizirajućeg proteinskog kompleksa. Taj protein, nazvan još i identificirajući (vezajući) protein, ima molekulsku masu od 10.000-15.000. S druge strane, CoA-SPC je multienzimski kompleks, koji se nalazi u kvascu Saccharomyces cerevisiae i ima molekulsku masu 200.000. CoA-SCP se izolira iz pekarskog kvasca i koristi se za određivanje specifičnog proteina u ljudskoj krvi. Izolacija čistog CoA-SPC iz kvaščeve biomase je prilično složena. Započinje s liziranjem pekarskog kvasca, a ovaj kompleks se nalazi u netopivoj frakciji odnosno debrisu (ostatku) kao i beta glukan. Zato je potrebno daljnje pročišćavanje, da se oslobodi aktivni CoA-SPC od ostalih komponenti stanične stijenke. U tom procesu najprije se obrađuje debris pomoću K, Na, Mg, Ca i Mn klorida, nitrata ili acetata da se dobije frakcija bogata s CoA-SPC kompleksom. Zatim se koristi dosta komplicirana procedura za ekstrakciju i pročišćavanje, koju su patentirali Bucovaz i sur. (1981). Metoda za određivanje pojave tumora bazira se na interakciji radioaktivno označenog proteina iz Co-SPC s B-proteinom iz seruma. Također je poznato da taj kompleks najprije reagira s L-cisteinom, D-pantotenskom kiselinom i ATP-om, pa tako nastaje kompleks sa specifičnim proteinom u krvi. Dakle, određivanje stvorenog kompleksa omogućuje brzo otkrivanje tumora.
10.5.4. Biosinteza S-adenozil L-metionina (SAMe) S-adenozil L-metionin, poznat i kao SAMe ili AdoMet, je kemijski spoj koji se nalazi u svim stanicama živih organizama. Sintetizira se u citosolu svake stanice, ali je jetra središnje mjesto u njegovoj sintezi i razgradnji kod viših organizama. Univerzalni je metil donor u staničnom metabolizmu, dajući svoju metilnu skupinu različitim proteinima, nukleinskim kiselinama i polisaharidima (Mato i sur.,1997). Sintetizira se iz metionina i ATP-a djelovanjem metioninadenoziltransferaze. Zahvaljujći prisutnosti visoko energetskog sulfonskog iona, SAMe u organizmu sudjeluje u tri važne biokemijske reakcije: trans-metilaciji, trans-sulfuraciji i aminopropilaciji, pa sudjeluje u četrdesetak bioloških reakcija. SAMe djeluje u asocijaciji sa folnom kiselinom i vitaminom B12 kao metilirajući agens, bitan je za nastajanje mnogih spojeva sa sumporom, uključujuću glutation. U uvjetima manje koncentracije metionina, folne kiseline i vitamina B12 pojavljuje se nedostatak SAMe u ljudskom organizmu, što 305
uzrokuje znatne poremećaje u funkcioniranju jetre, te imunološkom i živčanom sustavu. Zato se i primjenjuje u liječenju oštećene (cirozne) jetre, te u različitim poremećajima živčanog sustava (depresija, migrenska glavobolja) i osteoartritisa. Struktura SAMe prikazana je na slici 10.10.
Slika 10.10. Struktura S-adenozil L-metionina Poznato je da mnogi kvasci mogu akumulirati znatne količine SAMe u stanicama sa suviškom metionina u hranjivoj podlozi. Zato se ovaj spoj komercijalno proizvodi pomoću kvasaca, najčešće s kvascem S. cerevisiae (Appling i sur., 2006). Proizvod je zdravstveni dodatak (suplement) prehrani, kao što je prikazano na slici 10.11.
Slika 10.11. SAM-e obogaćen vitaminima B1, B6, B12 i folnom kiselinom
10.5.5. Proizvodi iz kvasca dobiveni tehnologijom rekombinantne DNA Tehnologija rekombinantne DNA otvorila je nove mogućnosti u proizvodnji biološki aktivnih spojeva (ljekova) pomoću mikroorganizama, a posebno za proizvodnju proteina za farmakološke namjene. Godinama je Escherichia coli bila glavni mikroorganizam za proizvodnju korisnih (ljekovitih) spojeva, kako u laboratoriju tako i u industriji. Zbog brzog rasta i efikasnosti nakupljanja te dobrog poznavanja njezinog metabolizma još uvijek se koristi u proizvodnji mnogih vrijednih i specifičnih lijekova. Ipak, potrebno je napomenuti, da je E.coli fekalna bakterija koja proizvodi pirogeni faktor koji se mora ukloniti iz svih produkata koji se koriste za ljudsku upotrebu. Osim toga, E.coli, kao i većina prokariotskih organizama ne može izlučivati ekstracelularno proteine u okolni
306
medij. Izlučivanje i nakupljanje proteina izvan stanica je bitno svojstvo, jer se time znatno pojednostavljuje proces izolacije i pročišćavanje proizvoda. Zbog toga su se sve više počeli koristiti eukariotski mikroorganizmi, a među njima je dominantnu ulogu imao kvassac S. cerevisiae, a kasnije Pichia pastoris. S komercijalnog stanovišta kvasci imaju mnoštvo prednosti pred bakterijama. Industrijski uzgoj kvasaca je dobro poznat, pa je prihvatljiviji i često jeftiniji. Od 1980 uvedena je proizvodnja inzulina, a 1990 proizvodnja interferona i interleukina s pekarskim kvascem S.cerevisiae. Posljednjih nekoliko desetljeća intenzivirala su se istraživanja genetičkog inženjerstva na kvascima. Tijekom intenziviranih istraživanja na genetici kvaščevih stanica i primjeni genetičkog inženjerstva u mnogim istraživačkim centrima do sada je pomoću kvasaca proizašlo nekoliko vrlo značajnih proizvoda (Gerngross, 2004; Walsh, 2006; Meyer i sur, 2008), što je prikazano u tablici 10.6. Iz tablice se može jasno uočiti da je većina lijekova koja se već nalaze na tržištu, proizvedena s kvascem S. cerevisiae, a samo dva s kvascima iz roda Pichia. Između 1890 i 2004 godine 400 rekombinantnih proteina ušlo je u kliničku obradu, a oko 750 novih je u istraživačkoj razradi. Međutim, u novim istraživanjima najviše se koristi P. pastoris, jer su istraživači utvrdili da taj kvasac ima neke prednosti u odnosu na standardni kvasac S . cerevisiae, a to su: -Pichia pastoris raste u sličnim uvjetima kao i kvasac S. cerevisiae pa ne treba poseban protokol za njezinu kultivaciju. Raste vrlo brzo na jednostavnoj hranjivoj podlozi u kojoj je metanol jedin izvor ugljika. Koncentracija metanola može biti dovoljno visoka da spriječi rast nepoželjnih mikroorganizama. Osim toga P .pastoris raste brzo na glicerolu, dok kvasac S .cerevisiae raste vrlo sporo, pri čemu se postiže izuzetno visoko iskorištenje supstrata (Yx/s) od 0,5 - 0,8, pri pH od 5.0. U tim uvjetima na glicerolu se mogu postići visoki prinosi kvaščeve biomase do 95 g/L s.tv. (Chiruvolu i sur. 1998). Specifična brzina rasta ovisi o koncentraciji glicerola na početku šaržnog procesa, pa su Jia i Yuan (2007) uveli šaržni uzgoj s pritokom supstrata pri čemu su postigli brzinu rasta od 0.1-0.2 h-1. P. pastoris se sve više koristi iz slijedećih razloga: - P. pastoris ima jaki, inducibilni promotor koji se može koristiti za proizvodnju proteina, dok kvasac S. cerevisiae nema tako jaki promotor, pa se može koristiti za proizvodnju velikog broja heterolognih proteina. - sposobna je generirati post-translacijske modifikacije koje su mnogo sličnije ljudskim i mamalijskim proteinskim modifikacijama nego što to čini kvasac S. cerevisiae. - moguće su tzv. integrativne ekspresije plazmida, pa se može postići visoka mitotička stabilnost s jednostavnom ili mnogostrukom- kopi- integracijom. -izolacija stranih (proizvedenih) proteina je brža i jednostavnija, jer P. pastoris ne izlučuje mnogo vlastitih proteina u okolni medij, pa je izolacija proizvedenih heterolognih proteina iz fermentirane komine puno ekonomičnija (Fischer i sur. ,1999; Annon., 2008). Međutim, prethodno navedeni autori naglašavaju dvije glavne prednosti ovog kvasca u usporedbi s kvascem S cerevisiae. Prva se odnosi na jednostavnu i vrlo učinkovitu kontrolu ekspresije heterolognog proteina pomoću metanola, tako da u odsutnosti metanola uopće ne dolazi do ekspresije, dok se dodatkom metanola u podlogu postiže snažna indukcija transgena. Drugi glavni razlog je produktivnost procesa. Naime, prinosi u proizvodnji biomse P. pastoris su visoki (do 100g/L, stv.), pa na kraju uzgoja komina izgleda kao pasta, što se teško može postići s kvascem S. cerevisiae. To je dosta bitno jer je proizvodnja heterolognih proteina u direktnoj povezanosti s količinom biomase kvasca, pa se proizvede oko 12 g/L heterolognog proteina na kraju procesa (Xie i sur.,2005).
307
Tablica 10.5. Terapeutički proteini proizvedeni s kvascima (Meyer i sur.,2008) Proizvodi na tržištu Komercijalni naziv Actrapid / Novolog Albumen Ambirix Comvax Elitex Glukagen HBVA/XPRO Hepatitis B vaccine Hexavac Leukine Pediarix Procomvax Refuldan Revasc Regranex rh
Proizvođač Kvasac Novo Nordisk S.cerevisiae Delta Biotechnol S.cerevisiae GlaxoSmthKline S.cerevisiae Merck S.cerevisiae Sanofi-Syntelabo S.cerevisiae Novo Nordisk S.cerevisiae Aventis pharma S.cerevisiae Crucell:Green P.angusta Cross (J.Koreja) Hepatitis B-antigen Aventis Pasteur S.cerevisiae Granulocitni makrofag Berlex S.cerevisiae Hepatitis B-antigen GlaxoSmthKline S.cerevisiae Hepatitis B-antigen Aventis Pasteur S.cerevisiae Hirudin/lepirudin Hoehst S.cerevisiae Hirudin/desirudin Aventis S.cerevisiae Becaplermin (PDGF) Ortho-McNeil HPD- faktor rasta Pharma, Janssen S.cerevisiae Inzulin Aventis P.pastoris Hepatitis B-antigen GlaxoSmthKline S.cerevisiae Somatropin, rh GH Biopartners S.cerevisiae
Rekombinantni protein Inzulin Rh albumen Hepatitis B-antigen Hepatitis B-antigen Urinska oksidaza Glukagon Hepatitis B-antigen Hepatitis B-proteini
Trypsin Twinrix Valtropin Proizvodi u istraživanju Proizvod Indikacija Angiostatin Antiangiogenetički faktor Collagen Rekombinantni kolagen Inhibitor elastaze Cistična fibroza Endostatin Antiangiogenetički faktor Epidermni analog Diabetes faktora rasta Epi-hNE-4 Cistična fibroza Insulin-like faktor Nedostatak faktora rasta-1 Gelatine Želatina rGuamerin Inhibitor leukocitne elastaze Humani serum Stabilizacija volumena albumin krvi u opeklinama Humani hormon rasta Pospješuje rast Kunitz Inhibitor kalikrein Neurturin OP-1 Implant
Inhibitor proteaze cistične fibroze Hereditarna angiodema Parkinsonova bolest Rekombinantni osteogenični protein
Proizvođač Entremed Fibrogen Dyax Entremed Transition Therapeutics Debiopharm Cephalon
Kvasac P.pastoris P.pastoris P.pastoris P.pastoris P.pastoris P.pastoris P.pastoris
Fibrogen/Fujifilm P.pastoris Mogam Biotech P.pastoris inst., Koreja Mitsubishi P.pastoris New Century pharmaceuticals Salk Inst. Biotechnology Dyax Chinese animal study Ortho Biotech (J & J)
P.pastoris P.pastoris P.pastoris P.pastoris Yeast
308
10.5.5.1. Hormoni inzulin, glukagon i somatropin Inzulin i glukagon su peptidni hormoni koji reguliraju koncentraciju glukoze u krvi viših organizama. Inzulin u ljudskom organizmu proizvodi gušterača i aktivira razgradnju glukoze u krvi. Nedostatak toga hormona u organizmu izaziva šećernu bolest, odnosno povećenu koncentraciju glukoze u krvi, što stvara mnoge zdravstvene probleme. Da se umanje ti negativni učinci, za liječenje se koristi čisti inzulin izoliran iz svinjske ili govedske gušterače, te humani inzulin proizveden biotehnološkim postupcima. Inzulin se počeo proizvoditi 1980-tih godina prošlog stoljeća biotehnološkim postupcima s bakterijom E. coli i kvascem S. cerevisiae (Kjeldsen, 2000), a u najnovije doba s Pichia pastoris (Trypsin, Aventis) U te svrhe korištena je rDNA tehnika. Najveći proizvođač inzulina s pomoću kvasca S . cerevisiae je Danska firma Novonordisk, a proizvod je bijeli prah koji se pakira u količini od 1g do 1kg. Taj inzulin je za razliku od svinjskog ili goveđeg potpuno identičan onom u ljudskom organizmu pa se naziva humani inzulin. Inzulin je jednostavan peptid, koji sadrži 51 aminokiselinu, a izgrađen je od dva lanca povezana S-mostovima: lanac A s 21 aminokiselinom i lanac B s 30 aminokiselina. Aminokiselinski sastav i struktura inzulina prikazani su na slikama 10.6. i 10.7. Ile Val Lanac A Glu Gln-Cys-Cys- Thr-Ser-Ile-Cys.Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys Gln Gly Asn Lanac B Glu Val Arg Phe Thr-Lys-Pro-Thr-Thr-Phe-Phe-Gly
Slika 10.6. Aminokiselinski sastav inzulina
Slika 10.7. Struktura inzulina Glukagon je jednostavni peptidni hormon koji ima 29 aminokiselina u lancu i molekulsku masu od 3.5 kD. Za razliku od inzulina povećava razinu glukoze u krvi, tako što aktivira razgradnju glikogena u glukozu, kada je koncentracija šećera manja od poželjne (hipoglikemija). Na taj se način poveća koncentracija glukoze na normalnu vrijednost.
309
Hipoglikemija je stanje niske koncentracije glukoze u krvi pa organizam nema dovoljno energije za normalno funkcioniranje, a manifestira se intenzivno i može izazvati hipoglikemijsku komu. To se događa najčešće ljudima s težim oblicima šećerne bolesti, koji ponekad koriste puno veće doze inzulina od potrebnih. U slučajevima hipoglikemije mora se reagirati vrlo brzo, uzimanjem glukoze ili inekcijama glukagona. Ustvari, strah od hipoglikemije je najčešći uzrok uzimanja manjih količina inzulina od potrebne, pa ljudi sa šećernom bolešću imaju konstantno povišenu koncentraciju glukoze u krvi. Zato je firma NovoNordisk proizvela pomoću rekombinantnog kvasca S.cerevisiae i hormon glukagon, u obliku praška nazvan GlugaGen, koji se otopljen u sterilnoj destiliranoj vodi daje ljudima putem inekcija, na sličan način kao i inzulin. Poseban oblik injektiranja razvila je ista firma i nazvala ga GlucaGen HypoKit. Somatropin (Valtropin) je humani hormon rasta, koji se također proizvodi pomoću kvasca rDNA tehnologijom. Sastoji se od jednostavnog polipeptidnog lanca s 191 AK, molekulske mase 22 kD. Dva disulfidna veza Cys53-Cys165 i Cys185-Cys189 određuju stabilnost trodimenzionalne strukture. U biotehnološkom procesu, proizvodi se ustvari metionil rh GH (growth hormon) s 192 AK, koji se enzimski obradi, pri čemu se odcijepi N-terminalni metionim, pa se dobije somatropin rh s 191 AK. Izolira se u čistom obliku kao prašak koji se koristi za pripravu injekcija za medicinsku upotrebu. Somatropin je odgovoran za stimulaciju razvoja skeleta, mišića, vezivnog tkiva i organa rasta kod djece i adolescenata. Zato se primjenjuje najčešće kod djece, koja imaju problema s rastom. Često ga koriste i muškarci (bilderi) za pojačanje muskulature. Taj hormon rasta veže receptore i proizvodi različite učinke, koji mogu biti direktni ili indirektni. Direktni učinci uključuju antagonizam periferne akcije inzulina i kasniju stimulaciju izlučivanja inzulina, što aktivira proizvodnju somatomedina ili inzulinu sličnog faktora rasta (IGF, insulin growth factor) u jetri i drugim organima, što stimulira: hidrolizu triglicerida u adipoznim organima; hepatični izlaz glukoze; ravnotežu kalcija te zadržavanje natrija i kalija. Ovi učinci IGF-a su suprotni akciji inzulina u metabolizmu ugljikohidra i masti i potencirani su glukokortikoidima. Somatomedini ili IGF indirektno posreduju u anabolitičkim reakcijama i promovirajućim učincima hormona rasta somatropina. IGF cirkulira kroz tijelo i veže se na specifične IGF receptore. Identificirana su dva IGF-a, IGF-1 i IGF-2. Pokazalo se da je IGF-1 principijelni posrednik djelovanju hormona rasta, dok je IGH-2 ima više aktivnost sličnu inzulinu. Anaboličko djelovanje IGF-a uključuje stimulaciju: transporta AK, sintezu RNA, DNA sintezu proteina, proliferaciju stanica i rast. IGF-1 je direktno odgovoran za obnovu i rast hrskavice, te rast skeleta i mekanog tkiva. Rast se također stimulira s povećanim brojem i veličinom stanica skeletnih mišića, utječući na veličinu organa, te povećanje mase crvenih stanica kroz stimulaciju eritropoetina. Djelovanje hormona rasta na crijevo može biti direktno ili posredno putem lokalne ili sistematske proizvodnje IGF-a. 10.5.5.2. Interferoni Lijekovi koji su dali vrlo dobre rezultate u liječenju specifičnih (teško izlječivih) bolesti nazvani su interferoni. Najčešće se spominju α, β i γ-interferoni. To su po kemijskoj strukturi glikoproteini, koje izlučuju leukociti i fibroplasti. Nazivaju se još i heterologni proteini (slika 9.8.). Ti spojevi se najviše koriste u liječenju tumora, multiple skleroze, hepatitisa C i reumatskog artritisa. Interferoni su posebno interesantni u liječenju virusnih bolesti.
310
Slika 10.8 . Struktura γ-interferona Za komercijalnu proizvodnju interferona koristi se uglavnom bakterija E. coli i neki kvasci (Sudhir i sur., 2001; Chu i sur., 2003)). Naime, kvasci su prikladni organizmidomaćini za proizvodnju heterolognih proteina, jer za razliku od prokariotskih stanica, njihova eukariotska struktura gena omogućuje procese tehnologije rekombinantne DNA za proizvodnju željenih (autentičnih, humanih) proteina. U tu svrhu najčešće se koriste različiti sojevi pekarskog kvasca S. cerevisiae, koji je potpuno siguran (neškodljiv po ljudsko zdravlje) mikroorganizam. Međutim, razvojem tehnologije rDNA za proizvodnju interferona postali su interesantni i drugi kvasci a posebno Pichia pastoris, Hansenula polymorfa, Kluyveromyces lactis i Yarrowia lipolytica. 10.5.5.3. Granulocitni makrofag (GM) Granulocitni makrofag je glikoprotein koji sadrži 127 aminokiselina, a karakteriziraju ga tri oblika molukulske mase 19.500,16.800 i 15.500 daltona. GM je hematopoetični faktor rasta, koji stimulira obnovu stanica u organizmu nakon terapije sa citostaticima. Na tržište dolazi pod nazivom Leukine. Proizvodi ga firma Berlex (SAD) pomoću rekombinantnog kvasca S . cerevisiae. Aminokiselinska sekvenca Leukina se razlikuje od humanog GM jer je leucin u poziciji 23 zamijenjen nekom drugom AK, a ugljikohidratni dio također može biti različit od humanog. Kvaščev granulocitni makrofag naziva se i Sargramostim. Za liječenje se priprema i upotrebljava u inekcijama. 10.5.5.4. Vakcina za hepatitis-B (HBV) Bolest jetre nazvana hepatitis-B uzrokuje virus, koji se prenosi preko krvi transfuzijom ili direktnim kontaktom s inficiranim ljudima. Utvrđeno je da oko pola milijarde ljudi širom svijeta boluje od te bolesti, koja uzrokuje cirozu jetre ili tumor, pa veliki broj ljudi smrtno strada. Zato su mnogi istraživači radili na pronalaženju lijeka za tu opaku bolest. Danas se proizvode hepatitis-B vakcine (HBV) pomoću kultura stanica i kvasaca. Od kvasaca se koristi rekombinantni pekarski kvasac S. cerevisiae (Mcaleer i sur., 1984), a proizvodni postupak razradila je firma Merck. Prema tom postupku kvasac se kultivira u kompleksnoj hranjivoj podlozi koja sadrži glukozu, kvaščev ekstrakt, pepton soje, amino kiseline i mineralne soli. Postupak izolacije je također kompleksan. Pročišćena vakcina ne sadrži onečišćenja nukleinskih kiselina, ali sadrži do 1 % kvaščevih proteina. Hepatitis-B vakcina proizvedena pomoću kvasca je učinkovita kao i ona proizvedena 311
pomoću kulture stanica (plazme). Danas HBV s pomoću kvasca S. cerevisiae proizvode četiri proizvođača (tablica 6). 10.5.5.5. Hirudin Hirudin je polipeptidni trombinski inhibitor koji se prirodno nalazi u slini pijavice Hirudo medicinalis, koja se koristila u terapiji od antičkih vremena, pa mu od tuda i potječe naziv. Izoliran je već 1957/8 iz žlijezde slinovnice Hirudo pijavice. Danas se hirudin komercijalno proizvodi pomoću kvasca S. cerevisiae rDNA tehnologijom pod nazivima Refuldan i Revacs (tablica 6). Koristi se naveliko kao antikoagulant, naročito u heparininduciranoj trombocitopeniji (Fischer, 2002). Važnost ovog lijeka je sve veća zbog specifičnosti bolesti, pa mu je određena i njegova kemijska struktura. To je polipeptid sastavljen od 65 aminokiselina, koji ima veliki broj kiselih aminokiselina, kao što su asparaginska i glutaminska (slika 10.8). Mehanizam inhibicije trombina je u stvaranju bimolekularnog kompleksa koji isključuje aktivnost oba reaktanta. Kompleks primarno nastaje tako da se kiselinski C-terminal hirudinske molekule poveže sa bazičnim (lužnatim) aminokiselinskim ostacima trombinske molekule nazvane »anionsko egzo-mjesto vezanja». Nakon tog spajanja, Nterminal slobodne amino grupe hirudina dobiva višak aktivnih mjesta enzima i reagira sa OH-grupom serina odgovornog za cijepanje veza u supstratima. Vezanje hirudina se ne zbiva na mjesta trombinske molekule koja su odgovorna za vezanje aminokiseline (obično arginina) u supstratima čiji je peptidni vez pocijepan. Kompleks hirudina s trombinom se stvara vrlo brzo i pokazuje dobru stabilnost. Kao rezultat ove reakcije, hirudin efikasno prekida enzimatske reakcije trombina s njegovim supstratima (koji reagiraju putem anionskog vezanja na vanjsko mjesto). Razgradnja malih molekula amida i esterskih supstrata, koji dominantno ili ekskluzivno reagiraju sa specifičnim mjestom vezanja enzima (s c argininom), je djelomično inhibirana, jer sva područja hirudina nisu okupirana.
Slika 10.8. Struktura rekombinantnog hirudina Refuldana (Donges i Brazel, 2002)
312
10.5.5.6. Becaplermin (derivirani faktor rasta krvnih pločica) Becaplerin je proizvod koji se dobiva pomoću rekombinantnog kvasca S . cerevisiae, u koji je ugrađen gen za derivirani faktor rasta krvnih pločica. Becaplerin je glikoprotein sastavljen od dva identična polipeptidna lanca povezana disulfidnim vezama, a ima molekulsku masu od oko 25 KD. Primjenjuje se u svim procesima za liječenje otvorenih rana pa je njegova primjena posebno zanimljiva u zacijeljivanju rana kod dijabetičara. Proces liječenja rana je kompleksan proces koji uključuje više faktora rasta, od kojih neki kao derivirani faktor rasta krvnih pločica, ima mnogostruke učinke na različite tipove stanica, pa je aktivan u svim stadijima procesa zaraštanja rana. Po biološkoj aktivnosti becaplerin je sličan indogenom PDGF-BB, jer pospješuje prestanak krvarenja i oporavak stanica uključenih u zacijeljivanje čestica u ranama. Becaplermin je siguran lijek i jednostavan za korištenje. Nalazi u Regranex-gelu u koncentraciji od 0.01 %, a koristi se jedanput dnevno za liječenje rana i prvi je licencirani lijek za te namjene (Embil i Nagai, 2002). 10.5.5.7. Oksidaza mokraćne kiseline Ovaj enzim katalizira oksidaciju mokraćne kiseline u alatoin. Prisutna je u višim organizmima osim kod ljudi i homoida (mnogi majmuni, čimpanza, orangutan i dr.). Dobro je poznato da povećana biosinteza mokraćne kiseline u organizmu može izazvati tumorski lizatni sindrom (TLS), što uzrokuje bolest a ponekad i smrt. Zato je brza inhibicija biosinteze mokraćne kiseline najučinkovitiji metoda za spriječavanje oboljenja. Najefikasnija u tom procesu je rekombinantna urinska oksidaza, koja se proizvodi s kvascem S. cerevisiae i dolazi na tržištu pod različitim imenima (Jeha i Pui, 2005; tablica 10.5).
LITERATURA Andrew,G.H., Phaff,H.J.and Starr,M.P. (1976). Carotenoids of Phaffia rhodozyma, a red pigmented fermenting yeast, Phytochemistry 15, 1003-1007. Anon 1, (2007). Cell Maker Lite2 for the culture of Pichia pastoris: growing yeast in single use bioreactor. http://www.cellexusbiosystems.com. Anon 2, (2007). NovoNordisk Lunches GlucaGen HypoKit, Science Direct-Enzyme and Microbial Technolnology. Appling,D.R.,Hanson,A.D., Roje,S and Raymond,R.K.(2006). Biosynthesis of S-adenosy methionine in rekombinant yeast strain, US-patent 7033815. Arnold,W.N. (1971). Heat inactivation kinetics of yeast beta-fructofuranosidase. A polidispersing system, Biochim. biophys. Acta 178, 347-353. Belem,M.A.F. and Lee,B.H. (1998) Production of bioingradients from Kluyveromyces marxianus grown on whey,R: Crit. Rev. Food Sci. Nutric. 38 ( 7 ) 565-598. Beluhan,S. (2000), Iskorištavanje otpadnog pivskog kvasca i sladnih klica za proizvodnju 5'-ribonukleotida, Doktorska disertacija, PB fakultet Sveučilišta u zagrebu Benaiges,M.D., Lopez-Santin,J. and Sola,C. (1990). Production of 5'-ribonucleotides by enzymatic hydrolysis of RNA, Enzyme Technology 12, 86-89 Bengtsson,B, Kochhar,S., Ractz,E. and Silver,J.J. (1997). Process for the production of flavoring agents, US-patent 5626894 Bigelis,R.(1992). Flavor metabolites and enzyme from filamentous fungi. Food Technol. Vol 46,151,154.156 i 158-161. Bowles,L.K. (1991). 5'-fosfodiesterase enzyme preparation and its production. USpatent 3.304.238
313
Champagne,C.P., Gaudeau,H. and Conway,J. ( 2003). Effect of the production or use of mixture of baker's yeast and brewers yeast extract on their ability to promote the growth of Lactobacilli and Pediococci .Elec. J. Biotechnol. 6(3), 22-34. Chiruvolu,V., Ekskrigge,K, Cregg,J. and Meagher,M. (1998). Effect of glycerol concentration and pH on growth of recombinant Pichia pastoris yeast . Appl. Biochem. Biotechnol. 75(2-3),163-173 Chu,J., Zhang,S. and Zhuang,Y.(2003). Fermentation process optimisation of recombinant S. cerevisiae for the production of human interferon-α2a. Appl. Biochem. Biotechnol. 111(3), 129-137 Cruger,W. and Crueger, A. (1984). Substrates for industrial fermentation, In: Biotechnology, A Textbook of industial Microbiology, Sinauer Associates, Inc., Sunderland ,49-53. Fang,T.J. and Chiou,T-J. (1996). Batch cultivation and astaxanthin production by a mutant of the red yeast Phaffia rhodozyma NCHU-FS501. Fegan,D.F. (2007.). Functional foods for aquaculture: benefits of NuPro® and dietary nucleotides in aquaculture feeds . Courtesy of Alltech Inc. Bankok, Tailand. Fischer, K.G. (2002). Hirudin in renal insufficiency. Semin Thromb Hemost 28, 467-482. Fischer,R. Drossard,J, Emans,N., Commandeur,U. and Hellwig,S (1999.) Towards molecular farming in the future: Pichia pastoris-based production of single-chain antibody fragments. Biotechnol. Appl. Biochem. 30, 117-120 Flood,M.T. and Kondo,M.(2001). Safity evelution of lipase production from Candida rugosa: Summary of toxicological dana. Regulatory Toxicology Pharmacology. 33(2), 157-164 Gascon,S., Neumann,P. and Lampen,J.O. (1968.) Comparative study of the properties of purified internal and external invertases from yeast. J. Biol. Chem.243, 1573-1577. Gerngross,T.U. (2004). Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nature-Biotechnology 22, 1409-1414. Gielhart,D.L. and Potter,N.N. (1978). Effect of ribonucleic acid removal methods on the composition and functional properties of Candida utilis. J. Food Sci 43 (6), 1705-1713. Gordon,W. Hohn,D. and Hunt,T.K. (1976). Augmentation of some aspects of wound healing by a «skin respiratory factor». J. Surg. Res. 21, 125-129. Gordillo,M.A., Sanz,A., Sanchez,A., Valero.F., Montesinos,J.L., Lafuente, J i Sola ,C. (1998). Inhancement of Candida rugosa lipase production by using different control fed-batch operational strategies. Biotechnology and bioengineering, 60(2), 156-168) Hackel,A. (1975). Genetic control of invertase formation in Saccharomyces cerevisiae, Mol. Gen. Genetics 140(4), 361-370. Hamilton,S.R.,Bobrowitz,P., Bobrowitz,B., Li,H., Mitchell, T., Nett,J.H, Rausch,S., Stadheim,T.A., Wildt,S., Wischnewski H. and Gerngross,T.U. (2003). Production of complex human glycoproteins in yeast. Science 301, 1244-1246 . Hjortmo,S, Patring,J., Jastrebova,J. and Andlid,T. (2005) Inherent biodiversity of falate content and composition in yeasts. Trends Food Sci. Technol. 16(6-7) , 311-316. Hoffstetter-Kuhn,S. and Wagner,H. (1990) Scale-up of free flow electrephoresis: Purification of alcohol dehydrogenase from a crude yeast ekstract by zone electrophoresis. Electrophoresis 11(6), 451456. Jamas,S.D., Davidson Eason Jr,D. and Ostroff,G.R.(1997) Gucan preparation .US-patent 5622939 Jia,L. and Yuan,J.Q. (2007). Cell cykle model for rekombinant Pichia pastoris during glycerol fed-batch cultivation. Process Biochemistry 42(5), 828-833. Kath,F. & Kulicke,W. (1999). Mild enzimatuc izolation of manan and glucan from yeast Saccharomyces cerevisiae. Angew. Makromol. Chem. 268, 59-68 Kenichi,W. (1999). Production of yeast extract, Patent JP-11332511A2. Klis,F, Mol,P., Helligwerf,K and Brul,S. (2002). Dynamic of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microniol. Rev. 26, 239-256. Kodama S. On a procedure for separating inosinic acid, J. Tokyo Chem. Soc. 1913;34:751 Koppel,P. (2003). Physiological and nutritional functions of nucleotides. Chemoforma LTD, Switzerland, for DSS Global, Inc. Glasgow Veterinary School. Kuninaka,A. (1986). Nucleid acids, nucleotides and relised compounds.In: Biotechnology Vol 4.,72-86., Rem, J. i Reed,G. ( Eds.) Verlag Cheme, Florida. Lee,J-N., Lee,D-Y., Ji, I-H., Kim,G-E., Kim,H.N., Sohn,J, Kim,S.and KimC-W (2001) Purification of soluble β-glucan with immune-enhancing astivity from the cellwall of yeast. Biocsi. Biotechnol. Biochem. 65, 837-841. Leach,J.L., Baxter,J.H., Molitor,B.E., Ramstac,M..B., Masor,M..L. (1995). Total potentially available nucleosides of human milk by stage of lactation. Am. J. Clin. Nutr. 61, 1224-1230.
314
Lui,Z.Q., Zhang,J.F., Zheng,Y. and ShenY.C. (2008). Impruvement of astaxanthin production by a newly isolated Phaffia rhodozyma mutant with low-energy ion beam implantation. J. Appl. Microbiol. 104 (3), 861-872. Lupo,M.P. and Cole, A.L.(2007). Cosmececeutical peptides, Dermatilogy Therapy 20, 343-349 Maase,F.W.J. (1991). Yeast extract, discovering the fifth taste»unami», Food Marketing and Technology 3, 16 -18. Mahoney,R.R. i Whitaker, J.R.(1978). Purification and physicochemical properties of laktase from Kluyveromycas fragilis. J. Food Sci. 43, 584 Marić, V. (2000). Kvaščeva biomasa i autolizati kvasaca kao izvori dušika i tvari rasta. U: Biotehnologija i sirovine ,113-115 i 122-124. Školska knjiga, Zagreb Mato,J.M., Alvarez,L., Ortiz,P. and Pajares,M.A.(1997). S-adenosylmethionine synthesis: Molecular mehanisms and clinical implications. Pharmacol. Therapy 73, 265-280. Mcleer,W.J., Buynak,E.B., Maigetter,R.Z., Wampler,D.E., Miller,W.J. and Hilleman, M.R. (1984). Human hepatitis B-vaccine from rekombinant yeast . Nature 307, 178-180. Meyer, H.P., Brass,J., Klein,J, Wenger,J. and Mommers (2008). An emmerging star for therapeutic and catalytic protein production. Bioprocess. Int.TWA, 10-21. Meister,H. (1965). Yeast invertase: an illusive but useful enzyme. Wallerstein Labs. communication 28, 715 Nakajo,Y. and Samo,H. (1999.) Yeast extract composition; the process for the production yeast extract. Patent WO 9916860AI Nagowithana,T.W. (1982). Yeast flavors and flavor enhancers and theire probable mode of action, Food Technology 11,140-144. Nakao,Y. (1979). Microbial production of nucleosides and nucleotides. In: Microbial Technology,Microbial Processes, Vol 1, 311-354, Peppler, H.P. i Perlman, (Eds), Academic Press, New York Newell,J.A., Robbins,E.A. i Seely,R.D. (1975). Manufacture of yeast protein isolate having reduced nucleic acid content by an alkali process. US-patent 3.867.555. Ninomiya, K. (1998) Natural occurance. Food Rev. Int. 14,177-211. Novak,S. i Marić,V. (1977). Smanjenje sadržaja nukleinskih kiselina u pivskom kvascu. Pivarstvo 10(2), 23-28. Orndorf, S.A., Costantino, N., Stewart,D. and Don Durhum,R. (1988). Strain improvement of Rhodotorula graminis for the production of a novel L-phenylalanine ammonia lyase, Appl. Environ. Microbiol. 54(4), 966-1002. Pandey,A., Benjamin,S., Soccol,C., Nigam,P., Krieger,N. and Soccol,V.T. (1999). The realm of microbial lipases in biotechnology. Biotechnoil, Appl. Biochem. 29, 119-131. Phaff, H. J. (1971). Structure and biosynthesis of the yeast cell envelope . In: The Yeasts Vol 2, 135-210, Rose,A.H. i Harrison,J.S.( Eds.) Acd, Press New York Reed,G. i Nanowithana ,T.W. (1991) Yeast derived products. In:»Yeast Technology» 369-412. sec.ed. Published by Van Nostrand Reinhold, New York, Saheki,T. i Holzer,H.(1975) Proteolitic activity in yeasts. Biochem. Bioph.Acta 384, 203-204, 2nd Ed. 369-412, Van Nostrand Reinhold. New York. Sarkissian,C.N., Shao,Z., Blain,F., Peevers,R., Su,H., Helf,R., Chang,T.M.S. and Seriver, C (1999). A different approach to treatment of phenylketonuria: Phenylalanine degradation with recombinant phenylalanine ammoni lyase. Medical Sci. 96(5), 2339-2344. Sudhir,K.V., Jogulamma,C.R., Sriram,A.V., Prasad,K.S.R. and Ramana,K.V. (2001). A process for the production of human interferon alpha from genetically engineered yeast. WO/2001/068827. Tinoi,J., Rakariyathan,N. and DemingR.L. (2005). Simplex optimisation ofcarotenoid production by Rhodothorula glutinis using hydrolysed mung bean waste flour as substrate. Proc. Biochem. 40(7), 2551-2557. Uauy,R. (1989). Dietary nucleotides and requirements in early life. U: Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy, (Lebenthal, E., ured.), Raven press Ltd., New York, str. 265. Vincent,S.F., Bell,P.J.L., Bissinger,P. and Nevalainen, K.M.H. (1999). Comparison of melibiose utilizing baker's yeast strains produced by genetic engineering and classical breeding. Lett.Appl.Microbiol. 28(2),148-152. Yanagushi,S. and Takahashi,C. (1984). Hedonic function of monosodium glutamate and four basic taste substances used in variouc concentration levels in single and complex systems,Agric. Biol. Chem. 48, 1077-1081. Ziemba,J.V. (1967) Tailored hydrolysates, how made, how used. Food Eng. 19(1), 82-85.
315
Sadržaj pojmova A Aerobni kvasci, 87, 115 Afričko pivo, 43 Alkoholna dehidrogenaza, 301 Alkoholna fermentacija, 67, 113, 116, 133, 135, 138, 140, 150, 176, 183, 184 Američki viski, 187 Amilolitički kvasci, 12 Aromatizirana vina, 136, 174 Arrack, 191, 193, 205 Ascomycetes, 2 Askomicetni kvasci, 3 Autoliza, 138, 288, 291 Autoliza kvasaca, 138 Autolizati, 292 B Bakterije octene kiseline, 89 Bakterijski kontaminanti piva, 88 Bakteriofagi, 113, 114 Basidiomycetes, 2, 280 Bazidiomicetni kvasci, 4 Becaplermin, 308, 313 Bentonit, 108 Bermet, 137 Bezvodni alkohol, 161 Bioakumulacija, 270 Biološka stabilnost vina, 120 Biosorpcija, 270 Bolesti vina, 113 B-postupak, 146, 150, 151, 265 C Calvados, 173, 184, 205 Candida, 2, 4, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 86, 87, 113, 114, 115, 132, 134, 143, 168, 264, 265, 276, 277, 278, 280, 281, 282, 284, 293, 297, 298, 299, 301, 314 Candida utilis, 2, 12, 277, 278, 280, 293, 297, 314 Carlsberška posuda, 64 Cherry, 136, 196, 203 Cork taint, 132 CSL, 276, 279 D Destilacija, 159, 168, 177, 180, 184, 186, 187, 189, 192, 194 Deuteromycetes, 2 Dezinfekcija, 64 Diacetil, 35, 69, 121, 255 Dinamika alkoholne fermentacije, 116, 144, 152 Divlji kvasci, 86, 87 Dozrijevanje vina, 123 E Elementi u tragovima, 214 Enterobacteriaceae, 86, 90 Enzimska hidroliza, 53 Eritrol, 96
316
Etanol, 89, 95, 141, 171, 255, 267, 274 Eterična ulja, 199, 203 Evolucija roda Saccharomyces, 7 F Fermentacijska aktivnost kvasca, 250, 251 Filtracija, 51, 59, 64, 80, 109 Flokulacija, 34 Francuski tip vina, 134 G Genetička nomenklatura, 22 Genetičko inženjerstvo, 27 Genever, 190 Genom kvasca Saccharomyces cerevisiae, 21 Gin, 173, 190 Glavno vrenje, 44, 62, 66, 72, 73, 88 Glavno vrenje sladovine, 44 Glicerol, 38, 96, 117, 119, 202 Glukagon, 308, 309 Glukan, 303 Gorko vino, 137 Gram-negativne bakterije, 86, 90 Gram-pozitivne bakterije, 86, 88 Granulirani svježi kvasac, 239 Granulocitni makrofag, 308, 311 GRAS, 9, 10, 215, 274, 277, 293 Gumiarabika, 109 H Hansen, 1, 16, 19, 41, 206, 236, 257, 262 Hiperoksidacija, 127 Hiperredukcija, 127 Hirudin, 308, 312, 314 Hmelj, 41, 50 I Inzulin, 308, 309 Irski viski, 187 J Jaka alkoholna pića, 174 Ječmeni slad, 43 K Kanadski viski, 187 Karbonizacija piva, 85 Karbonska maceracija, 129, 130 Kazein, 109 Kiselinska hidroliza, 291 Kluyveromyces, 4, 6, 9, 17, 20, 87, 113, 143, 215, 264, 265, 274, 276, 277, 283, 284, 287, 298, 299, 300, 311, 313 Kluyveromyces marxianus, 143, 215, 276, 283, 284, 287, 298, 299, 300 Koloidna stabilizacija piva, 83 Komovica, 194, 195 Konjugacija, 26 Kožni respiracijski faktor, 303
317
Krmni kvasac, 280 Ksilitol, 97 Kubanskaya, 190 Kvaliteta prehrambenog kvasca, 277, 278 Kvaščev ekstrakt, 214, 287, 290 Kvaščev kolač, 226, 238 Kvasci koji metaboliziraju aromatske spojeve, 12 Kvasci koji rastu na ugljikovodicima, 12 Kvasci koji sintetiziraju riboflavin, 12 Kvasci uzročnici kvarenja, 13 L Lactobacillus delbrueckii, 39, 257 Lactococcus lactis, 34, 39 Laktaza, 299 Ledeno vino, 135 Likeri, 196, 197 Likerska vina, 135 Likvefakcija, 50 Limonnaya, 190 Lipaza, 301 M Maceracija, 103, 197, 199 Madeira vina, 135 Mala matica, 221 Malolaktička fermentacija, 118, 119 Manitol, 96 Matični kvasac, 64 Melibiaza, 300 Metabolizam dušika, 66, 117 Metabolizam lipida, 67 Metabolizam ugljikohidrata, 66 Metanofilni kvasci, 11 Metanol, 96 Mikrooksidacija, 129 Mineralne tvari, 67 Mliječno-kisele bakterije, 114 Monosaharidi-pentoze, 97 Muljanje, 102 N Naknadno vrenje, 44, 75, 88 Naplavna filtracija, 110 Neslađene sirovine, 48 Njemački tip vina, 134 Norisoprenoidi, 99 Nukleotidi, 295, 296 Nusproizvodi alkoholne fermentacije, 68 O Octene bakterije, 113, 114, 130 Oksidaza mokraćne kiseline, 313 Ošećerenje, 56, 164 Osmotolerantni kvasci, 10
318
P Pasterizacija, 44, 84 Pasteur, 19, 41, 113, 118, 308 Patogeni kvasci, 14 Pediococcus, 86, 88, 91, 114, 119, 131, 256, 257, 288 Pekarski kvasac, 207, 216, 219, 237, 248, 273 Pektin, 97 PER vrijednost, 266, 296 Petrovska, 190 Phaffia rhodozyma, 10, 17, 302, 313, 314, 315 Phycomycetes, 2 Pichia pastoris, 11, 17, 20, 281, 287, 307, 309, 311, 313, 314 Pirazini, 100 Pivo, 41, 42, 71, 77, 80, 82, 84, 85, 90, 93 Pjenušava vina, 137 Plazmoliza, 290, 291 Plijesni, 115, 132 Poboljšivači okusa i mirisa, 292 Pojačavanje mošta, 105 Polisaharidi, 33, 97 Prehrambeni kvasac, 296 Prešanje, 103, 185 Pretok vina, 123 Priprema melase, 148, 218 Prirodna jaka alkoholna pića, 174 Probiotički kvasci, 11 Proizvodnja alkohola na melasi, 145 Proizvodnja krmnog kvasca, 278, 280 Proizvodnja piva, 28, 44 Proizvodnja prehrambenog kvasca, 274 Proizvodnja sladovine, 44, 46, 51 Prošek, 135 Proteini kvasca, 266 Proteinski preparati kvasca, 296 Proteolitički enzimi, 56, 300 Punjenje vina, 125, 126 R Rafinoza, 32 Rakija od jabuka, 184 Rakija od krušaka, 182, 183 Represija glukozom, 30 Riblji mjehur, 109 Rotirajuća sušnica, 232 Rum, 173, 191, 192 Runjenje, 102 S Saccharomyces, 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 19, 21, 25, 28, 30, 32, 35, 36, 40, 42, 62, 86, 87, 113, 114, 115, 116, 117, 139, 143, 168, 179, 185, 186, 188, 208, 235, 236, 251, 262, 263, 265, 274, 275, 276, 282, 283, 284, 287, 298, 299, 302, 305, 314 Saccharomyces bayanus, 17, 28, 40 Saccharomyces carlsbergensis, 28 Saccharomyces cerevisiae, 1, 2, 16, 17, 18, 19, 21, 25, 28, 30, 32, 35, 36, 40, 42, 139, 168, 185, 208, 235, 236, 251, 263, 275, 283, 284, 287, 305, 314 Saccharomyces pastorianus, 17, 28, 32, 40 Šaržni proces, 150, 164, 165 Šećerne rakije, 191 Separacija, 153, 154
319
Silicijev dioksid, 109 Sirovine u proizvodnji etanola, 143 Škotski viski, 187 Škrob, 32, 48, 280 Slad, 46, 52, 59, 60, 64, 66, 67, 93 Sladni ekstrakt, 49 Slatka vina, 133, 134 Šljivovica, 173, 180, 182 Somatropin, 308, 310 Sorbitol, 96 Spontana fermentacija, 115, 257 Sporogene bakterije, 90 Sporulacija kvasca, 24 Stabilizacija piva, 82 Stabilizacija vina, 121, 122 Stanični ciklus, 23 Starka, 190 Struktura genoma, 28 Stupanj prevrenja, 73 Suhi aktivni kvasac, 241, 244 Sulfiti, 36 Sulfitna lužina, 278 Sumporni dioksid, 106 Svježi pekarski kvasac, 238 Symba proces, 12, 280, 281 T Tangencijalna filtracija, 111 Tehnologija proizvodnje crnih vina, 99, 128 Tehnologija rekombinantne DNA, 29, 306 Tekući kvasac, 240 Tlačni tank, 86 Torulospora delbrueckii, 208, 243, 251 Trajnost svježeg kvasca, 227 Travarica, 194 Tunelska sušnica, 230 Tvari rasta, 215 Tvrdoća vode, 50 U Ukomljavanje, 51, 53, 54, 55, 88, 164, 180, 194 Umjetna jaka alkoholna pića, 174 Usipak, 47 Uvarak, 54 V Vakcina za hepatitis-B, 311 Varionica, 51 Velika matica, 209, 221 Vermouth, 137 Vinjak, 179 Vino, 94, 110, 124, 130, 133, 136 Viši alkoholi, 70, 96, 181 Viski, 186, 187 Voćne rakije, 175 Vodka, 173, 189
320
Y Yarrowia lipolytica, 10, 13, 17, 281, 311 Z Želatina, 109, 308 Žitne rakije, 186 Žitni ekstrakt, 49 Životni ciklus kvasca, 25 Zubrovka, 190
321
