Faculté de medecine de Constantine Laboratoire de toxicologie CHUC Cours de 1e année résidanat année 2013/2014
Khaoula KOULOUGHLI Le 16 Décembre 2013
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Plan : I. Introduction ; II. Généralité ; III. Phase I ; IV. Phase II ; V. Pase III ; V. Facteurs variabilité de la biotransformation; VI. Résultats de la biotransformation et bioactivation ; VII. Interet de la connaissance de la biotransformati biotransformation on VIII. Exploration de la biotransformation IX. Conclusion. bibliographie 2
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Le métabolisme des xénobiotiques xénobiotiques est inévitable. in évitable. L'accumulation sans fin xénobiotiques même non toxiques toxiques est incompatible avec la survie sur vie des organismes organismes vivants. Des stratégies stratégies de protection sont mis en eouvre, dont le métabolisme des xénobiotiques (6).
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Le métabolisme des xénobiotiques comme un domaine de recherche est né au cours de la première moitié du 19 e siècle: Découverte de l'acide hippurique (le conjugué de la glycine de l'acide benzoïque) dans l'urine de cheval. Dans les années 1950 l’étude du métabolisme a vraiment décollé en raison de la prise de conscience progressive des scientifiques sur la variété et l'importance des réactions métaboliques. 4
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La biotransformation est un ensemble de processus biochimiques mis en oeuvre pour former des composés : plus polaires, hydrophiles, moins toxiques facilement excrétables par le rein ou la bile (détoxification (détoxification : dans la majorité des cas). Parfois la biotransformation peut conduire à des produits plus toxiques (toxification). 6
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Le lieu principal de la biotransformation est le foie. En raison de son flux sanguin élevé 1.5L/min + sa richesse en enzymes de métabolisation. métabolisation.
Peut se produire dans d’autres organes : Poumon, estomac, placenta, intestin, peau, et rein. 7
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Les réactions de biotransformation se divisent en deux types :
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Réaction de phase I / Dégradation/ Fonctionnalisation:
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Réactions de phase II/synthèse II/synthèse / Conjugaison : La molécule-mère ou les métabolites (produit de phase I) se conjuguent avec une substance endogène.
Phase III la phase dans laquelle les métabolites quittent la cellule gràce a des protéines, pour étre éliminés (Glycoprotéine P par exemple) (2).
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Figure 1. Biotransf Biotransformation ormation
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C ’est la réaction de biotransformation biotransformation la plus importante (2). Les métabolites qui en résultent résultent sont nombreux. L’oxydation est e st catalysée par des systèmes enzymatiques : => Monooxygénase Monooxygénase à cyt P450. Microsomale à flavine. => Amine oxydase. oxydase. Non Microsomale => déhydrogénase 11
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Les monooxygénases sont des oxydoréductases catalysant le transfert d’électrons. d’électrons.
Monooxygénation : L’incorporation d’un groupement hydroxyl sur le substrat. Au cours de cette réaction : => Deux atomes d’oxygènes sont réduits en un groupement hydroxyl; hydroxyl; => Une molécule d’eau sera libérée par oxydation concomitante du NADPH. 13
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Cyt P450 : Les CYP constituent une famille d’hémoprotéines d’hémoprotéines initialement identifiées comme des pigments dans des microsomes de foie de rat. Ils sont caractérisés par une bande d'absorption intense à 450 nm en présence de monoxy mo noxyde de de carbone. Impliqués dans le métabolisme de substances substances endogènes e ndogènes (tel que les stéroides) stéroides) et exogènes. exogènes. 14
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CYP450 sont composés de :
hème (Fe3+) (groupement prosthétique) + apoprotéine + cystéinate+Site actif de CYP450. •
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Localisation: Présents en grande quantité dans les hépatocytes, dans les entérocytes de l’intestin grêle. En plus faible quantité dans d’autres tissus comme le rein, le poumon,le cerveau, la peau (5). Se trouve dans la partie externe du REL. Et au niveau des mitochondries (9). 15
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Le système P450 des microsomes eucaryotes contient deux composantes: NADPH CYP450 réductase, une flavoprotéine contenant contenant à la fois FAD et FMN, et P450. FMN et cytochrome b5, assure les transport des électrons depuis FAD au CYP450.
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Les CYP450 ont besoin de deux élèments : >> Une source d’électrons : la NADP cytochrome P450 réductase (flavoprotéine donneuse d’élèctrons)(3). >> Phospholipide (PL) CYP450 (de la mbr du RE) : assure ass ure la cohèsion monooxygénaseréductase. 17
Structure du CYP450 :
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Des familles de gènes de CYP450 ont été identifiées chez l‘Homme. Trois familles sont impliquées dans la plupart des biotransformations biotransformations de drogues sont CYP1, CYP2 et CYP3. Ils sont divisés sur la base de similarités de séquences d'acides aminés, et chaque famille peut être divisée en sous-familles, qui sont désignés par des lettres majuscules après la désignation de la famille (par exemple, CYP3A). Enzymes individuels sont ensuite indiqués par des chiffres chiffres arabes (par exemple, CYP3A4). 19
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Homologie de la séquence d’acide aminé
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Même famille
40%
Même sousfamille
59%
Même isofomre
97%
Un seul hépatocytes peut contenir une variété de CYP450. Sa spécificité peut étre : Relative :un isoforme va métaboliser des substrats différents. Chevauchante Chevauchante :un même substrat est métabolisé par plusieurs isoformes. 22
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Tableau montrant les substrats des CYP450 (11) :
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Réaction générale :
Oxydation par CYP450 est une source physiologique de stress oxydant (libération d’un o° o° au cours du cycle catalytique). 25
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Cycle catalytique du CYP450 (5) :
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Monooxygénase à flavine oxydase : Un groupe d'enzymes qui catalysent catalysent des réactions chimiques par l'intermédiaire l'intermédiaire du cofacteur lié à la flavine. Ces protéines microsomales catalysent catalysent l'oxygénation l'oxygénation de l'azote , de soufre , de phosphore et sélénium atomes nucléophiles dans une gamme de composés de structures diverses . L'utilisation d'un cofacteur NADPH et groupement prosthétique FAD.
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FMOs ont été impliqués dans le métabolisme d'un certain nombre de produits p roduits pharmaceutiques, de pesticides et de substances toxiques . Cinq formes de la FMO sont s ont maintenant connus et ont été désignés de FMO1 - FMO5
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Une certaine compétition peut exister entre les CYP et les FMO vis-à-vis de certains substrats. dans le foie on observe 85 % de CYP pour seulement 15 % de FMO. F MO. dans la peau seulement 33 % de CYP pour 66 % de FMO. 29
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Les amine oxydases sont des enzymes largement distribuées dans l’organisme. Catalysent la désamination oxydative.
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Classées en deux groupes :
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FAD amine oxydase : Monoamine oxydase, polyamine oxydase. Amine oxydases carbonylées dépendentes : diamine oxydase... (8). 31
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Les MAO sont à localisation mitochondriale, DAO DAO : enzyme soluble (8).
Isoformes : Les monoamine oxydases oxydases (MAO-A et MAO-B) sont différenciées différenciées selon leur spécificité sp écificité vis à vis des substrats substrats et selon leur sensiblité aux inhibiteurs inhibiteurs .
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Elles diffèrent diffèrent aussi par leur poids moléculaire (MAO A=60kDa, MAO B= 58kDa)(8). 32
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Fonction des MAO : Elles évitent la pénétration de ces amines vasoconstrictives ou toxiques dans l’ l’organisme comme la tyramine (3). •
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Les monoamine oxydases sont présentes dans le système système nerveux central, qui participent au catabolisme des amines endogènes. L’eau oxygénée produite produ ite au cours de cette réaction est détruite par la catalase ou une peroxydase (3).
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Enzyme qui oxyde un substrat par le transfert d'un ou plusieurs ions (H+) à un accepteur, généralement un coenzyme type NAD+/NADP+ ou flavine comme le FAD ou le FMN.
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L’aldéhyde déhydrogénase ;
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L’alcool déhydrogénase.
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1. Aldéhyde déhydrogénase (ALDH) : Enzyme polymorphe responsable de l'oxydation des aldéhydes en acides carboxyliques. Localisées dans de nombreux tissus, principalement au niveau du foie.
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Il existe trois types différentes différentes de ces enzymes chez les mammifères : Il existe des formes ALDH 1 : cytosolyque, constitutives et ALDH 2 : mithochondrial, inductibles ALDH 3 : tumeurs, l'estomac et la cornée.
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ALDH1 et ALDH2 (tétramériques) sont les plus importantes.
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2. Alcool déhydrogénase ADH : L’alcool déshydrogénase (ADH) est une enzyme dimérique, hépatique et cytoplasmique. cytoplasmique. L’enzyme est aussi présente dans le rein et le tube digestif.
L’ADH catalyse l’oxydation d’un alcool en aldéhyde en transportant les hydrogènes sur le coenzyme NAD+. 37
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2. Alcool déhydrogénase ADH :
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Spécificité :
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Spécifique des alcools primaires, particulièrement l’alcool l’alcool ethylique. ethylique.
NB : Le foie peut aussi oxyder oxyder partiellement l’alcool l’alcool par des hydroxylases hydroxylases à cyt p450 (CYP 2E1) inductibles (MEOS = Microsomal Ethanol Oxidizing System). Il existe aussi une très faible oxydation oxydation par des catalases. 38
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Classification Classification de l’ l’ADH (13): (13 ):
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1. Oxy Oxydati dation on alip aliph hatique ique ; 2. Oxy Oxydati dation on arom aroma atique ique ; 3. Epoxydation ; 4. O. Dé Désalkylation ; 5. N. Désalkylation ; 6. S. Dé Désalkylation ; 7. Désa Désami mina nati tion on oxyd xydativ tive ; 8. N. Oxygénation ; 9. Sulfoxydation; 10. N. Hydro Hydroxylat xylation; ion; 11. Désulfur Désulfuratio ation n oxydati oxydative ve ; 12. Déshalo Déshalogé génat nation ion.. 41
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1. Oxydation aliphatique : La plus fréquente ; Donne des alcools primaires et secondaires qui vont eux mème subir d’autre oxydation.
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2. Oxydation aromatique : Deux mécanismes mécanismes : hydro hydroxylation/par xylation/par intermédiare epoxyde :
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3. Epoxydation : Ex : Epoxydation des alcènes: formation formation d’espèces réactives potentiellement toxiques.
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4. O-désalkylation :
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5. N. Désalkylation :
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6. S-Désalkylation :
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7. Désamination oxydative :
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8. N. Oxygénation : Peut étre une étape préliminaire préliminaire de la N. Désalkylation. Les flavine oxydase interviendraient interviendraient aussi dans ce mécanisme.
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9. Sulfoxydation : Processus métabolique général des phénothiazines. Aboutit à la formation du sulfoxide correspondant puis de la sulfone. Les flavines oxydases prendraient prendraient par aussi aus si à ce mécanisme(2). 50
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10. N. Hydroxylation :
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11. Désulfuration oxydative :
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12. Déshalogénation oxydative :
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12. Déshalogénation oxydative : Le chloroforme peut former l’oxychlorure d’oxygène (phosgène) toxique (2).
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Oxydation Oxydation des amines : Les amines oxydases oxydases les transforment transforment en aldéhydes.
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Déhydrogéna Déhydrogénation tion des alcools :
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Par ALDH et ADH.
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Les réactions de réduction sont peu courantes. peuvent impliquer des enzymes microsomales à CYP450. Ces réactions sont beaucoup plus intenses chez les bactéries intestinales que dans les tissus des mammifères. La réduction du pront p rontosil osil en sulfanilamide en est un exemple remarquable. 58
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1. Réduction des dérivés nitrés en une amine :
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Assurée par la nitroréductase. nitroréductase.
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2. Réduction des dérivés azoiques en amines:
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Assurée par l’azoréductase.
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Azobenzène Azobenzène => aniline.
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R-N=N-R => R-NH2 + R-NH2.
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C ’est la réaction réaction reverse des déshydrogénase.
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De nombreux xénobiotiques peuvent subir des hydrolyses sous l’effet d’estérases et d’amidases. Ces enzymes se trouvent dans les tissus, et le plasma des mammifères. 63
A. Estérases (2): Regroupées Regroupées en 4 catégories:
1. Aryl estérases estérases: hydrolysant les esters aromatiques.
2. Carboxyl estérases: les esters aliphatiques. 4. Acétyl estérase : hydrolyse les esters dont la moitié acide est l’acide acétique.
5. Choline estérases: les esters dont le résidu est un alcool. 64
B. Amidases (2): Contrairement Contrairement aux estérases, estérases, les amidases ne peuvent être classées en fonction de leur spécificité pour leur l eur substrat. De plus, l'hydrolyse enzymatique enzymatique des amides se produit beaucoup plus lentement que celle des esters, esters, probablement par manque m anque de spécificité.
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Exemples d’hydrolyse (2) :
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L’inhibition ou l’activation de ces enzymes peut entrainer une toxicité :
Ex : Les OP agissent agissent par inhibition de l’Ach l’Ach Esterase. 67
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Définies par la liaison covalente d’une d’une molécule endogène (polaire) à un groupement fonctionnel fonctionnel d’une molécule substrat (hydrophobe). Certains substrat contenant un groupement g roupement fonctionnel approprié puisse directement subir la phase II du métabolisme. Mais la conjugaison se produit souvent consécutivement à une réaction de phase I. 69
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C'est la forme de conjugaison conjugais on la plus courante courante et la plus Molécule endogène Acide glucuronique. importante. Forme activée : l'UDPGA (acide uridine-5'diphospho-a-D-glucuronique). Enzyme et localisation
UDP-glucuronyltransfér UDP-glucuronyltransférase ase (UGT): localisée dans le réticulum endoplasmique. endoplasmique. Foie, rein , intestin. Deux familles: UGT1,2. Les UGT sont impliquées dans la détoxification des endobiotiques (ex. bilirubine, thyroxine, stéroïdes) et des xénobiotiques .
Substrat
Alcools aliphatiques ou aromatiques, Acides carboxyliques, Composés soufrés , Amines. 70
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La réaction aboutira à la formation de S, O, N glucuronides polaires, éliminés dans la bile et les urines.
L’hydrolyse du conjugué à cause du PH urinaire ou à cause des Béta-glucoronidases des bactéries intestinales intestinales génèrent des molécules toxiques. Ex : 2-naphtyl amine ; libération d’ion nitrénium électrophile éle ctrophile cancérogène (2(2naphtyl hydroxyl amine). 71
Devenir des glucuronides : PM < 250 : élimination urinaire. PM > 250 : excrétion biliaire, élimination fécale ou hydrolyse hydrolyse par les β-Glucoronidases intestinales.
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Molécule endogène
Sulfate. Forme activée: PAPS (3phosphoadénosine-5'phosphosulfate).
Enzyme et localisation
Sulfotransférase Sulfotransférase : localisées dans le cytosol du foie, rein, intestin. 03 familles (SULT 1,2,3) : 16 isoformes/
Substrats
les phénols, les alcools aliphatiques et les amines aromatiques.
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Molécule endogène CH3 Forme active s adénosyl méthionine. Enzyme et localisation
N. Méthyltransférases. Méthyltransférases. S. Met transférase transférase O. Met transférase. 06 isoformes.
Substrat
Phénol, amine, thiol, As.
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Les produits méthylés ne sont pas nécessairement plus hydrosolubles.
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Molécule endogène Acétyl : CO-CH3 Forme active Acétyl CoA. Enzyme et localisation
-acétyltransférases : N -acétyltransférases
cytosolique foie ,intestin ,rein ,poumon.
2 isoformes :NAT1 :NAT1 et NAT2 NAT2
Substrat
Des amines aromatiques primaires, Des hydrazides, Des sulfonamides, Certaines amines aliphatiques primaires.
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A cause du polymorphisme générique, certains individus sont des acétyleurs rapides, d’autres d’autres des acétyleurs lents. Les acétyleurs lents seraient plus sensibles à l’apparition l’apparition de de cancer dus aux a ux amines aromatiques. Les métabolites acétylés sont éliminés de l’organisme par excression rénale. 77
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Mais pour l’isoniaside l’acétylation l’acétylation produit des composés moins hydrosolubles, qui se cristalisent cristalisent au niveau rénal : néphrotoxicité néphrotoxicité (!). Les effets effets secondaires neurologiques seraient plus importants chez les acétyleurs lents (12).
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Molécule endogène Glutathion tripeptide : ac glutamique –cystéine-glycine Enzyme et localisation
glutathion S-transférases -transférases . Au moins 5 sous-familles, 20 isoformes :A1 ,A2 …M1 ,M2. •cytosol (A,M P T )+ RE (Z) + noyau
surtout foie ,reins ,poumon ,intestin
Substrat
→ grande variété de composés
environnementaux (carcinogènes (ex :benzo[a]pyrène) → médicaments :Paracétamol
,anticancéreux (alkylants). = les électrophiles
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De nombreux métabolites électrophiles se forment forment au cours de la biotransformation biotransformation des toxiques: Certains de ces métabolites peuvent réagir avec des constituants cellulaires et causer la mort de la cellule ou induire ind uire la formation de tumeurs. La fonction du glutathion (nucléophile) est de réagir avec ces métabolites électrophiles et de prévenir ainsi leurs effets effets nocifs sur les cellules. 80
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L'exposition à de grandes quantités de ces métabolites réactifs réactifs peut diminuer la quantité de glutathion disponible et provoquer des effets effets toxiques toxiques marqués. Ex : Le 3-méthylindole est bioactivé principalement dans les poumons, et après avoir abaissé la teneur en glutathion, produit des lésions pulmonaires (1). 81
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Certains conjugués du glutathion peuvent être toxiques (1).
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Conjugaison à des acides aminés. Cette Cette conjugaison est catalysée par des acides aminés déjà conjugués et le coenzyme A. Les acides carboxyliques aromatiques, aromatiques, Les acides arylacétiques, Les arylacides aryl-substitués, Peuvent former des conjugués avec des a-aminoacides, principalement la glycine, mais aussi avec la glutamine(1).
83
Molécule endogène
Thiosulfate Na2S2O3.
Enzyme et localisation
Rhodanèse = transulfurase. Mitochondrie.
Substrat
Cyanure : assure leur détoxification détoxification en thiosulfate.
Réaction
Na2S2O3 + CN- ¾® SCN- + Na2SO3
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Les transporteurs transporteurs membranaires facilitent la capture ou l’efflux l’efflux des composés endogènes, d’ions et de xénobiotiques à travers travers la membrane m embrane cellulaire. Ils influencent par conséquent la biodisponibilité des xénobiotiques dans l’organisme en participant à leur absorption, leur distribution et leur élimination (10). 85
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Les transporteurs sont divisés en deux catégories:
La superfamille des transporteurs ABC (ATP-binding cassette) : Des pompes d’efflux qui dépendent de l’hydrolyse de l’ATP afin d’activer le passage des substrats au travers des membranes biologiques. Limitent l’accumulation de composés cytotoxiques. Les transporteurs ABC incluent l’archétype PPglycoprotéine (P-gp ou Multidrug resistance protein 1 [MDR1] (10). 86
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La superfamille des transporteurs transporteurs de solutés (solute carriers [SLC]): Assurent généralement la capture cellulaire des nutriments comme le glucose ou les acides aminés, a minés, soit par mécanisme de transport passif ou actif. Jouent un rôle prononcé dans la pharmacocinétique (absorption, distribution et élimination) d’un large panel de médicaments, toxines, composés endogènes et de leurs métabolites (10). 87
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Les transporteurs d’efflux réduisent la charge locale cellulaire de composés toxiques, renforçant ainsi la protection de la cellule contre les effets toxiques. Ces transporteurs sont essentiellement exprimés dans la membrane apicale des cellules épithéliales (comme les entérocytes) entérocytes) qui sont exposées aux xénobiotiques. => phase III : transport de l’efflux, l’efflux, ou extrusion (10). 88
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Causes de variation du métabolisme (5):
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1. Polymorphisme:
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Le niveau d’activ d’activité ité enzyamtique est soumis à une régulation génétique. Les mutations des gènes codant pour une enzyme peuvent donner lieu à des variations : l’activité de l’enzyme peut être plus élevée, plus basse ou nulle. 90
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Le polymorphisme divise la population en deux catégories de métaboliseurs :
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Les métaboliseurs lents;
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Les métaboliseurs rapides ou extensifs.
91
Métaboliseurs lents : Métaboliseurs En cas de détoxification : •
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Il se produit une accumulation de la molécule. Pour les médicaments ça entrainera l’apparition d’effets indésirables, voir de surdosage.
En cas de toxification : Absence d’effets. 92
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Métaboliseurs rapides :
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En cas de détoxification : pas de réponse.
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En cas de toxification :
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Accumulation du métabolite toxique toxique dans l’organisme. 93
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2.Âge : A. Nouveau né : A la naissance, la concentration totale des cytochromes P450 hépatiques représente 30% du niveau adulte. Le CYP 3A7 chez le feotus, joue le role du CYP 3A4 chez l’adulte.
B. Personne agée : L’influence de l’âge l’âge sur les cytochromes cytochromes reste controversée. De plus, elle est difficile à étudier en raison des variations interindividuelles non dépendantes de 94 l’âge.
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3. Sexe : La différence d’activité enzymatique entre les hommes et les femmes peut s’expliquer par la présence d’hormones stéroïdes, comme les oestrogènes et la progestérone en plus grande quantité chez la femme. Les hormones stéroïdes semblent activer les CYP 3A4 (substrat endogène). De plus, il a été prouvé que les contraceptifs oraux peuvent influencer le métabolisme de certains médicaments en inhibant par un mécanisme suicide les cytochromes P450, et en particulier le CYP 3A4. 95
4. Obésité : •
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Les études ont montré que l’effet de l’obésité sur les cytochromes P450 était fonction des isoenzymes. Les résultats les plus concluants ont été rapportés rapportés pour le le CYP 3A4 et pour le CYP 2E1 :
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Pour le CYP 3A4, l’activité est diminuée.
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A l’inverse, l’activité du CYP 2E1 est augmentée. 96
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5. Pa Pathologies thologies hépatiques : Les effets sont plus marqués avec la cirrhose qu’avec une hépatite chronique et une cholestase. Les maladies hépatiques réduisent l’activité des cytochromes de façon spécifique. Ex : en cas de cirrhose quelque soit sa gravité 1A diminue. Le cyp 2C semble étre moins affecté par les pathologies hépatiques. hépatiques.
97
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6. CYP450 et interactions : 1. Inhibition du CYP450 : Certaines substances ont la capacité d’inhiber le CYP450. L’inhibition est généralement spécifiques d’une isoenzyme . Phénomène plus dangereux que l’induction. 98
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6. CYP450 et interactions : Essentiellement 3 étapes au niveau du cycle du cytochrome sont particulièrement vulnérables à l’inhibition : L’étape 1 quand quand le le substrat se fixe fixe sur l’ l ’enzyme. L’étape 3 quand quand l’oxygène l’oxygène moléculaire moléculaire se fixe fixe sur le fer ferreux. L’étape 6 quand quand la molécul m olécule e d’oxygène d’oxygène est transférée sur le substrat. 99
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6. CYP450 et interactions interactions :
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Mécanismes de l’inhibition :
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Réduction de synthèse ou augmentation du catabolisme; L’introduction dans la membrane du REL de substances désorganisant les structures structures de la mbr. mbr. De la fixation sur le groupement hème du CYP450 de molécules bloquant le cycle catalytique. 100
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6. CYP450 et interactions :
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Types d’inhibitions d’i nhibitions :
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Réversible
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Irreversible.
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6. CYP450 et interactions : 1. A. Inhibition réversible réversible : Les plus puissants inhibiteurs réversibles réversibles ont dans leur structure chimique des groupements : imidazoles, pyridines ou quinoliques. La fonction du cytochrome est restaurée après élimination par l’organisme de l’inhibiteur (il été lié par une liaison faible). 102
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6. CYP450 et interactions interactions : 1. A. Inhibition réversible réversible : Compétitive : La liaison de l’inhibiteur l’inhibiteur empêche la fixation du substrat sur le site actif de l’enzyme car l’inhibiteur a une plus forte concentration au niveau du site actif. Une substance inhibitrice d’une enzyme n’est pas nécessairement le substrat de cette enzyme. Se produit et s’estompe rapidement car aucune synthèse enzymatique enzymati que n‘est n‘est requise.
103
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6. CYP450 et interactions : 1. A. Inhibition réversible réversible : Non compétitive : La liaison se fait sur un site différent différent du site actif et ne bloque pas la fixation du substrat. Entraîne Entraîne une modification de la conformation conformation tridimensionnelle de l’enzyme l’enzyme la rendant ainsi non fonctionnelle. 104
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6. CYP450 et interactions : 1. A. Inhibition réversible réversible :
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Exemples Exemples d’inhibition réversible :
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Cimétidine.
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Antifongiques Antifongiques azolés (CYP3A).
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Jus de pamplemousse pamplemousse (CYP3A intestinale).
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105
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6. CYP450 et interactions : 1. B. Inhibition irreversible irreversible : Certains agents peuvent être oxydés par le cytochrome en intermédiaire réactif qui va provoquer une inactivation irréversible (destruction).
Substrat suicide: intermédiaires réactifs se lient de façon covalente covalente à l’hème, à la protéine ou aux deux.
•
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Un phénomène rapide, dose et temps dépedant. La synthès synthès de nouvelle enzymes est est nécessaire pour restaurer l’activité. l’activité. 106
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6. CYP450 et interactions : 1. B. Inhibition irreversible :
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Exemples Exemples d’inhibition irreversible :
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Ethymyloestradiol : (3A4).
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Chloramphénicol : (2B, 2C).
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107
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6. CYP450 et interactions : 2. Induction enzymatique/Mécanisme :
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6. CYP450 et interactions : 2. Induction enzymatique :
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En cas de détoxification :
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La concentration plasmatique du substrat est notablement réduites (↘ de la tox).
En cas de toxification : Le métabolite métabolite actif s’accumu s’accumule le dans dans l’organisme l’organisme (↗ de la tox).
109
•
6. CYP450 et interactions : 1. Induction enzymatique :
•
L’induction enzymatique est un phénomène:
•
•
•
•
•
Non spécifique (activent de très nombreux systèmes systèmes enzymatiques);
Progressif (dans (dans son apparition et sa disparition), Non immédiat ; Réversible 110
•
6. CYP450 et interactions : 1. Induction enzymatique :
•
Ex :
•
•
Millepertuis: l’hyperf l’ hyperforine: orine: accèlère la synthèse CYP3A4.
•
Phénobarbital : (2C ,2D6 ,3A).
•
Ethanol : (2 E1).
•
Fumée de cigarette : (1A).
111
Figure. Exemples Exemples d’inducteur et d’inhibiteur d’ inhibiteur des isoforme CYP450 (11)
112
•
2. variabilité alcool déhydrogénase ADH :
ADH2 :3 variants variants : => 1 forme sauvage ADH2*1. => 2 formes atypiques ADH2*2 ,ADH2*3 :↑ activité.
113
114
•
•
•
Si les deux allèles sont mutés, une accumulation d’acétaldéhyde va se produire; Apparition du syndrome de Flushing : réaction d’intolérance = effet antabuse (vasodilatation, tachycardie, sueur, nausée, vomissement, intolérance alcool, protection contre alcoolisme ) 115
V.2. Facteurs modifiant les réactions de phase II • • • • • • • •
•
1. glucuroconjugaison : Espèces : les chats n’ont pas d’UGT. Age : elle est faible à la naissance (ictère du n.né) Environnement: Induction par HAP ,phénobarbital ,phénobarbital ,éthanol… Polymorphisme génétique NB : bilirubine UGT1 →homme :mutation sur UGT1A1 : hyperbilirubinémie syndrome de Gilbert et syndrome de crigler Najar (mortel à la naissance) 116
V.2. Facteurs modifiant les réactions de phase II •
2. Glutathion :
•
Induction :HAP ,phénobarbital...
•
Polymorphisme génétique :M1 ,P1 ,T1 ,M3
117
V.2. Facteurs modifiant les réactions de phase II •
3. Acétylation :
•
Espèces : chien :pas pour amines I.
•
souris :3 isoformes.
•
Polymorphisme génétique :
•
NAT2 :9 mutation détectées dont 4 ont une activité très faible :phénotype acétyleur lent 118
V.2. Facteurs modifiant les réactions de phase II •
4. Sulfoconjugaison :
•
porc : pas de sulfconjugaison. sulfconjugaison.
•
Polymorphisme génétique.
119
V.2. Facteurs modifiant les réactions de phase II •
5. Méthylation :
•
polymorphisme sur TMPT.
•
→caucasiens : 11% méthyleurs méthyleurs lents.
•
1 personne/300 :activité nulle.
120
121
•
•
Dans la majorité des cas le métabolisame aboutit à une détoxification, détoxification, et une élimination. Les produits formés sont pharmacologiquement moins efficaces et de toxicité toxicité diminuée.
122
•
•
Pour les médicaments, il est possible que le métabolite formé formé soit plus actif que la molécule m olécule mère. Ex : Désipramine (formée par N-déméthyla N-dém éthylation tion de l’imipramine) à de plus forte forte propriété antidépressive (2). 123
•
•
Mais, certains composés chimiquement stables peuvent être convertis en métabolites métabolites réactifs. Ces réactions sont généralement catalysées catalysées par des monooxygénases à cytochrome P-450, mais d'autres enzymes, y compris ceux de la flore intestinale, intestinale, interviennent dans dan s certains cas (1). 124
•
Les réactions de bioactivations :
Epoxydation
125
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•
•
•
•
•
•
•
•
Les CYP 450 peuvent produire la conversion de nombreux composés aromatiques en epoxydes. epoxydes. Ex : Aflatoxine B1 ; Benzène ; Benzo [a] pyrène ; Furosémide ; Polychlorobiphényl ; Trichloréthylène richloréthylène ; Chlorures de vinyl. 126
•
•
L’epoxydation se produit principalement au niveau hépatique. Les métabolites formés contractent des liaisons covalentes avec les macromolécules cellulaires : provoquent des nécroses et des cancers (2). 127
•
•
Certains métabolites hydroxylés forment aussi des liasons covalentes peuvent étre à l’origine de cancers et de nécrose tissulaires. Les métabolites N.Hydroxylés N.Hydroxylés des amines aromatiques peuvent induire une hémolyse ou une méthémoglobinémie (2).
128
•
•
•
Au cours du métaboisme réductif de certains xénobiotiques (nitrobenzène, aniline, anticancéreux de de la classe des anthraquinone), se forment des structures intermédiaires radicalaires. Anions superoxydes, peroxyde d’hydrogène, radical hydroxyl. Les radicaux se lient de façon covalente avec les protéines et les lipides insaturés=> peroxydation des lipides et une série de phénomènes toxiques (2). 129
•
•
Désulfuration : Parathion => paraoxon : OP inhibiteurs plus puissant de d e la choline estérase. La déhydrogénation de l’éthanol entraine la formation de l’acétaldéhyde impliqué dans certaines manifestations toxiques de l’éthanol.
130
Certains composés peuvent subir une activation dans le tube digestif: •
•
Ex: les nitrites et certaines amines peuvent peu vent former des nitrosamines. les nitrates, qui peuvent peu vent être convertis convertis en nitrites et induire de la méthémoglobinémie.
131
•
•
•
•
La glucuroconjugaison est une réaction de détoxification, Les substances substances glucuroconjuguées sont facilement éxcrétés, et ont moins d’activité biologique ou chimique par rapport à la molécule mère. Cependant certains glucuronides ayant une éctivité chimique électrophile peuvent étre étre impliqués dans des réactions pharmacologiques ou toxicologiques (14).
Ex : N-O N-O glucuronide de l’acide hydroxamique (N-hydroxy(N-hydroxyN-acetyl-arylamines) N-acetyl-arylamines) et les acyl glucuronides de l’acide l’acide carboxylique carboxylique (14). 132
Figure : (6) Répartition des réactions formant formant des métabolites réactifs réactifs et/ou toxiques pour pour les médicaments .
Bernard Testa & al. Foundation review: Reactions and enzymes in the metabolism of drugs and other xenobiotics. xenobiotics . Drug Discovery Today Today Volume 17, Numbers 11/12 June 2012.
133
134
135
•
•
•
1. Thérapeutique :
Permet d’éviter les interactions médicamenteuses (inhibition/induction enzymatique). => Minimiser les risques de toxicité et d’echec d’echec thérapeutique. 136
•
1. Thérapeutique : médicament
Métabolite
actif
inactif
prodrogue
actif
actif
actif
actif
toxique 137
• •
•
•
•
1. Thérapeutique : Elle permet aussi de choisir les traitements efficaces en cas d’intoxication : Ex : éthanol en cas d’intoxication par méthanol. ADH plus affine pour l’ethanol que le méthanol, en plus les métabolites issus de son action sur l’éthanol(acide acétique) sont moins toxique que ceux du méthanol (acide formique). Phénobabital : ictère du n né, maladie de Gilbert.
138
•
1. Thérapeutique : Les études biochimiques pour la conception de nouvelles molécules médicamenteuses doivent étre plus attentives attentives quant à la formation de métabolites métabolites chimiquement réactifs (désipramine ) ou toxiques (paracétamol (paracétamol en PAQI) au cours de essais cliniques et même en post-commercialisation (6).
139
•
•
•
•
2. Analytique : Quantification des métabolites : La métabolisation de la molécule mère va rendre difficile sa détection dans les liquides biologiques. La recherche des métabolites trouve alors tout son intéret. 140
•
•
•
2. Analytique : En analyse chromatographique : Ex : l’imipramine donne plusieurs métabolites. Sa chromatographie est complexe. En cas d’absorption massive l’ors d’une intoxication aigue, on trouve :
•
•
un spot → produit absorbé. une série de taches d’intensité d’intensité variable → divers métabolites. 141
•
2. Analytique : •
Les liquides d’aspiration d’aspiration ou de lavage gastrique offre un avantage car ils renfèrment les molécules non métabolisées.
142
•
•
3. toxicologique : Permet de déterminer les réactions de toxification et de détoxification des substances toxiques.
143
• • • •
• • • •
3. toxicologique : Bioactivation : Paracétamol en NAPQI (oxydation). 2-naphtylamine en 2 naphtylhydroxylamine responsable de cancer vésical (oxydation).
Détoxification (la plus fréquente) : Paraoxon en paranitrophénol (hydrolyse). Phénol en phénol glucuronide (glucuroconjugaison). (glucuroconjugaison). Cyanure en thiocyanate. 144
145
146
•
Ligne directrice de l’OCDE N°417 toxicocinétique-métabolisme (7) : •
Permet d’identifier les métabolites produits après l’ l’administr administration ation du du substrat.
147
•
•
Protocole : Espèce : les meme espèces utilisées dans les autre essai de toxicité : rat ;
•
Âge et souche: jeune adulte sain 6 a 12 semaines au moment de l’administra l’administration tion de d e la dose.
•
Nombre et sexe des animaux : au minimum 4 animaux du mème sexe. (il convient de justifier le sexe sexe des animaux employés). 148
•
Hébergement: Placés dans des cages individuelles pendant la période d’essai*.
•
Substance d’essai : radiomarquée au 14C**.
•
Choix des doses :
•
•
Etude pilote : dose orale unique, non toxique, sufisamment élevée pour permettre l’identification des métabolites dans les excréta. Etude principale : au minimum deux doses de préférence***. préférence***. Lorsque deux doses sont administrées, elles sont toutes deux suffisamment élevées pour permettre l’identification l’identification des métabolites dans les excréta. excréta.
149
•
•
On recueille les excréta excréta (et, le cas échéant, le plasma) afin d’identifier et de quantifier la substance d’essai et ses métabolites. Identifier tous les métabolites présents à hauteur de 5 % ou plus de la dose administrée et pour fournir un schéma métabolique de la substance d’essai.
150
•
•
•
•
Identification Identification des métabolites métabolites : Chromatographie gazeuse/spectrométrie de masse (CG-SM), Chromatographie Chromatographie liquide/spectrométrie liquide/spectrométrie de masse (CL-SM), Chromatographie Chromatographie liquide/spectr l iquide/spectrométrie ométrie de masse en tandem (CL-SM/SM),
•
Spectrométrie par RMN,
•
Peuvent Peuvent fournir une identification non ambiguë. a mbiguë. 151
•
La ligne directrice OCDE estime que l’étude de l’induction et de l’inhibition enzymatique est nécessaire dans certaines situations particulières. particulières.
152
Permettent de déterminer la voie métabolique métabolique impliquée dans la biotransformation d’une substance.
•
153
• •
•
•
1. Les enzymes recombinates recombinates : Obtenue partir de l’ADNc, exprimées sur différents types cellulaires. Offre un systéme enzymatique individuel permettant d’étudier d’étudier le métabolisme de la subst s ubstance ance et les interactions. Toutefois, en raison de l'absence de voies métaboliques compétitives dans ces systèmes, il est impossible d'obtenir des données sur la contribution relative de l'isoforme en question sur le métabolisme global in vivo. 154
•
•
On trouve maintenant sur le marché des préparations recombinantes recombinantes purifiées pour la plupart des enzymes du métabolisme : CYP co-exprimés avec cytochrome P450 réductase et optionnellement cytochrome b5, UGT, UGT, monooxygénases à flavine, époxyde hydrolase et glutathion Stransférases.
155
•
•
•
•
2. Fraction cellulaire : Englobe les microsomes, d’autres organelles cellulaires. Comporte : les microsomes, fraction S9 (contient des enzymes microsomiales et des enzymes cytosliques), la fraction cytosolique S100 (comporte 3 enzymes solubles de la phaseII).
3. Culture cellulaire cellul aire et organes perfusés, etc. 156
157
•
•
Identification Identification des enzymes responsables des réactions de biotransformation biotransformation (10) : Plusieurs approches existent existent pour étudier le métabolisme in vitro (phénotypage), et une combinaison de méthodes est souvent nécessaire. 158
•
•
•
1. test de compétence (enzyme recombinantes): Determiner l’isoforme responsable du métabolisme de la molécule. Par incubation de la substance avec avec des isoformes différents différents et à une seule concentration. 159
•
•
•
2. Test Test d’inhibition d’i nhibition : Une seconde approche implique des incubations menées dans des fractions subcellulaires subcellulaires ou éventuellement en culture cellulaire, et l’utilisation d’inhibiteurs d’inhibiteurs chimiques et/ou des d’immunod’immuno inhibiteurs inhibiteurs sélectifs de voies enzymatiques spécifiques.
Incubations avec différents inhibiteurs en comparant les taux relatifs de métabolisme, permet d’identifier quel inhibiteur réduit significativement le métabolisme global et ainsi découvrir la voie métabolique. 160
•
•
•
3. Test de correlation : En utilisant la même banque de microsomes, le test de corrélation se fait entre des activités spécifiques déterminées pour chaque enzyme et les activités obtenues pour la sustance à tester. Une corrélation significative démontre l’implication de l’isoforme.
161
•
Extrapolation Extrapolation in vivo in i n vitro : Extrapolations restent semi-quantitatives compte tenu des difficultés de la prise en considération des facteurs de variabilités physiologiques physiologiques (flux (f lux sanguin hépatique, fixation aux protéines plasmatiques, métabolisme extrahépatique …)(10).
162
•
•
Anticiper la biotransformation biotransformation de tout composé donné (6). Expertise humaine reste reste certainement irremplaçable, mais son efficacité efficacité peut être grandement améliorée par des méthodes in silico visant à fournir des prévisions fiables mais ne sont pas nécessairement néces sairement infaillibles infaillibles (6).
163
•
•
La biotransformation biotransformation des xénobiotiques est un un phénomène majeur de détoxification, détoxification, mais qui peut aussi entrainer la formation d’entité plus réactive. Sa connaissance est primordial pour tout xénobiotique.
164
165
•
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1. Franc Lu, toxicologie générale 1991. 2. Alain Viala, Alain Botta, toxicologie, toxicologie, 2 e édition. 3. Faculté de médecine Pierre & Marie Curie www.chups.jussieux.fr www.chups.jussieux.fr.. 5. Amélie Mathie, thèse de doctorat université université de Lorraine, Rôle des cytochromes P450 dans les interactions médicamenteuses et environnementales rencontrées à l’officine. 6. Bernard Testa & al. Foundation review: Reactions and enzymes in the metabolism of drugs and other xenobiotics. Drug Discovery Today Today Volume 17, Numbers 11/12 June 2012. 7. Ligne directrice OCDE 417, juillet 2010. 8. Rana Youssef CHAAYA, Thèse de doctorat de l’université de Toulouse. RÔLE DU STRESS OXYDANT
INDUIT PAR LES MONOAMINE OXYDASES DANS LA FIBROSE RÉNALE. •
Ann Biol 9. Les cytochromes P450 : métabolisme des xénobiotiques, régulation et rôle en clinique( Ann
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Clin 2006). 10. Koukeb ROUGUIEG-MALKI, ROUGUIEG-MALKI, thèse de doctorat de l’université de Limoge, Etudes des relations
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génotype-phénotype génotype-phénotype des enzymes du métabolisme et des transporteurs d’efflux des xénobiotiques. 11. Xavier Decleves, Université paris Descartes, Métabolisme et Excrétion : Aspects Physiologiques et Méthodes d’Exploration. 12. http://www.lab-cerba.com http://www.lab-cerba.com.. (isoniazide) 13. http://www.ipubli.inserm.fr analyse/ métabolisme de l’éthanol. 14. Joseph K. Ritter , Roles of glucuronidation and UDP-glucuronosyltransferases in xenobiotic bioactivation bioactivation reactions Chemico-Biological Chemico-Biological Interactions 129 (2000) 171 – 171 –193. 193. 15. www.pharmacorama.com www.pharmacorama.com.. 166