UNIVERSIDAD DE TALCA FACULTAD DE CS. DE LA SALUD DPTO. BIOQUÍMICA CLÍNICA E INMUNOHEMA INMUNOH EMATOLOGÍA TOLOGÍA
BIOQUIMICA CLINICA I CÁTEDRA- TALLER CONTROL DE ERRORES EN ESPECTROFOTOMETRÍA
PROF. T.M. MSc. ELBA LEIVA MADARIAGA
Relación entre el porcentaje de transmitancia (%T) y la concentración T %
Concentración
LEYES DE LA ESPECTROFOTOMERIA Io
ε
c
It
Lambert-Bourguer-Bunsen-Roscoe-Beer ( Lambert-Beer)
b
Io = Intensidad de la luz incidente It = Intensidad de la luz transmitida b = espesor del medio ε = coef. de absorción molar (cte. para cada solución a una solución de 1 molar) c= concentración de la solución It = Io*10-εbc Transmitancia = It/Io Absorbancia = -logT Entonces: Abs = -log (10-εbc) Abs = ε*b*c
Errores en Espectrofotometría Escala de absorbancia y porcentaje de transmitancia Ab
2.0 1.0 .80.70 .60 .50 .40 . 30
.20
.10
% T 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
ERROR EN LA ABSORBANCIA EN FUNCIÓN DEL PORCENTAJE DE TRANSMITANCIA.
%T
4 10 25 35 50 70 90
Absorbancia
1 1 1 1 1 1 1
1.398 1.000 0.602 0.456 0.301 0.155 0.046
Variación en absorbancia
0.22 0.041 0.035 0.025 0.017 0.012 0.0097
Porcentaje de error en la medida de absorbancia 15.8 8.60 5.79 5.44 5.78 8.03 21.2
Rayo de luz monocromática que muestra el ancho de banda espectral A d a d i s n e t n I
B
D
C
E
Longitud de onda
INTERFERENCIAS ESPECTRALES
60
i c 40 n a b r o s 20 b A a
Oxihemoglobina
0 400
500
600
700
Longitud de onda (nm) Espectro parcial de la oxihemoglobina
Curva estándar para medir proteínas totales por reacción de Biuret: A 540 v/s concentración .
Líneas continua , A540 para un estandar de proteínas de 50 g/L; línea punteada, A540 para el mismo estándar que
además contiene hemoglobina.
1.2 0 4 1.0 5 ( a i 0.8 c n a 0.6 b r o ) s 0.4 b m A n
Hemoglobina estándar 50 g/L
0.2
0
25
50
75
Proteínas totales (g/L)
100
CORRECIÓN DE LA INTERFERNCIA ESPECTRAL Blancos de muestras Mediciones cinética
PROPIEDADES FOTOMÉTRICAS EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDA EXACTITUD FOTOMÉTRICA LINEALIDAD FOTOMÉTRICA PRECISIÓN FOTOMÉTRICA PRESENCIA DE LUZ PARÁSITA ESTABILIDAD FOTOMÉTRICA: DERIVA Y RUIDO
CONTROL DE EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDA Es necesario calibrar la longitud de onda como mínimo una vez al mes: •
METODOS PRIMARIOS a.- Uso de filtro de Didimio: se puede usar en espectrofotometros que tengan un ancho de banda espectral de 20 nm, este tiene la máxima absorbancia a 585 nm. b.- Uso de filtro de Oxido de Olmio: se puede usar en espectrofotometros que tengan un ancho de banda espectral de 2-8 nm, y se obtiene la máxima absorbancia a 360 nm. METODOS SECUNDARIOS Utilización de Punto Isosbéstico
EXACTITUD FOTOMETRICA Solución de 50 mg/l Dicromato de Potasio en Ácido sulfúrico 0.01 N Absorbancia a 350 nm debe ser 0.535 Tolerancia de la medición 2 % Dicromato de Potasio: Calidad máxima normalizado del National Bureau of Standar, secado overnight a 110ªC y enfriado a temperatura ambiente en un desecador. Otras soluciones usadas son : SOLUCIÓN DE SULFATO DE COBRE: SOLUCIÓN DE SULFATO DE AMONIO Y COBALTO SOLUCIÓN DE CROMATO DE POTASIO
EXACTITUD FOTOMÉTRICA 1.- DISOLUCIÓN DE SULFATO DE COBRE: 20,0 g CuSO4 x 5 H2O + 10 ml de H 2SO4 concentrado aforado a 1000 ml, dan una disolución con las siguientes longitudes de onda. 400 nm 600 nm 650 nm
700 nm
0,002 0,068 0,224
0,527
2. DISOLUCIÓN DE SULFATO DE AMONIO Y COBALTO: 14,481 g de CoSO4 NH4 SO4 x 6 H2O + 10 ml de H2SO4 concentrado aforados a 1000 ml con agua de pureza analítica, dan una disolución con las siguientes absorbancias en las longitudes de ondas específicas. 400 nm 450 nm
0,012 0,077
550 nm
0,077
500 nm
0,163
EXACTITUD FOTOMÉTRICA (UV)
3.- DISOLUCIÓN DE CROMATO DE POTASIO: 40 mg de KCrO4 en 1000 ml de KOH 0,05 N (3,3 g/L), dan una disolución con las siguientes absorbancias en las longitudes de onda específicas. 340 nm 375 nm 400 nm 450 nm
0,316 0,991 0,396 0,033
LINEALIDAD FOTOMÉTRICA SOLUCIONES DE DISTINTA CONCENTRACIÓN CUYAS ABSORBANCIAS ABARQUEN EL RANGO DE TRABAJO A CADA LONGITUD DE ONDA
UV . DICROMATO DE POTASIO EN MEDIO ÁCIDO 405 nm: p-NITROFENOL EN MEDIO ALCALINO 510 nm: NITRATO DE COBALTO EN MEDIO ÁCIDO
PRESENCIA DE LUZ PARÁSITA
340nm: SOLUCIÓN DE NITRITO DE SODIO LECTURA DE ABSORBANCIA O % DE T
LÍMITE DE ACEPTABILIDAD :% DE T < 1 %
PRECISIÓN FOTOMÉTRICA ESTUDIO A 650 nm CON SULFATO DE COBRE EN MEDIO ÁCIDO. 1O MEDIDAS DE LA ABS. DE ALÍCUOTAS DE LA MISMA SOLUCIÓN. CÁLCULO DE LA PRECISIÓN DE LAS LECTURAS DE ABSORBANCIA LÍMITE DE ACEPTABILIDAD: CV< 1 %
SERIE DISTRIBUCIÓN NORMAL
88,2 95,5 99,7 3DE
2DE 1DE
X
1DE 2DE 3DE
Curva de Gauss
ANÁLISIS DE LOS DATOS x= x n
i
n DE =
(xi -x)2 estándar
Desviación n -1
S2 =
( xi - x)2
Varianza n-1
CV = DE - 100 Coeficiente de Variación
Distribuciones de Frecuencia
a i c n e u c e r F
Valores
Distribución de frecuencia de los resultados de una muestra por dos métodos diferentes, 1 y 2. Ambos métodos son de igual precisión ( ) pero con promedios diferente una de otra (x1 = x2). 1 2 a i c n e u c e r F
x1 = x2
x1 x2
ESTABILIDAD FOTOMÉTRICA
340nm: SOLUCIÓN DE DICROMATO DE POTASIO EN MEDIO ÁCIDO
- ESTUDIO DE LA DERIVA Y RUIDO FOTOMÉTRICOS - CÁLCULO DE LA PENDIENTE Y DE LA DISPERSIÓN DE LA RECTA ABS/TIEMPO
LIMITE DE ACEPTABILIDAD: ( DERIVA +RUIDO < 1 % )
Deriva y Ruido a i c n a b r o s b A
a i c n a b r o s b A
Tiempo bajo deriva y alto ruido
Tiempo bajo ruido y baja deriva a i c n a b r o s b A
Tiempo alta deriva y bajo ruido
a i c n a b r o s b A
Tiempo alta deriva y alto ruido
Error constante y proporcional (Westgard J, de Vos D, Hunt M, et al: Am J Med Technol 1978;44:290)
30
Error constante Sin error Error proporcional
20 10
10
20
30
Medido por métodos comparativos
A continuación se presenta una serie de datos al medir diferentes concentraciones de una sustancia determinada por un método de referencia ( IDEAL, teóricamente sin errores) en el eje X y por otra metodología en el eje Y. De acuerdo a los siguientes datos y observando el gráfico Ud. debe encontrar para cada uno de ellos la ecuación de la recta que los identifica, e interpretar su resultado.
Tecnica de referencia
X / Y 0 / 0 10 / 8
Error …………………
X / Y 0 / 3 10 / 11
Error……………………..
X /Y 0 /0 20 / 12
