06 Cromatografía I-2015

Actualización II-2014

Prácticas No. 13 a 15, Módulo 5 CROMATOGRÁICAS! CC" # CC

TÉCNICAS

$a%oratorio d& 'u()ica Or*á+ica I 1----35

1. ¿Qué ¿Qué se enti entien ende de por? por? a. Crom Cromat atog ogra ra! !a" a" es uno uno de los los prin princi cipa pale less mé méto todo doss para para la se sepa para raci ción ón de especi especies es #u!mica #u!micass estre estrec$a c$amen mente te relaci relaciona onadas das en mezcla mezclass comple%a comple%as. s. &a cromatogra!a es un método !sico de separación 'asado en la distri'ución de los los co comp mpon onen ente tess de una una mezcl mezcla a entr entre e dos dos ase asess inmis inmisci ci'l 'les es(( una una )%a )%a o estacionaria * otra mó+il. '. ,istem ema a cromatogr)co" sistem ema a #ue se empl mplea para eec ecttuar una cromatogra!a( comprende la ase mó+il( estacionaria * la muestra a analizar * el material de soporte. c. aterial aterial de soporte" soporte" es un sólido sólido #ue #ue retiene retiene * u'ica la ase estacionaria estacionaria de tal orma #ue $a*a la ma*or super)cie de contacto posi'le con la ase mó+il. d. /ase estaciona estacionaria ria"" consis consiste te en part!c part!cula ulas( s( generalmen generalmente te sól sólida idas( s( pe#ueas pe#ueas * con una super)cie micro porosa( de orma #ue presenta un amplio desarrollo super)cial. uede estar empa#uetada en orma de columna o etendida en orma de capa. 3n ocasiones es necesario un tratamiento #u!mico de la ase estacionaria para conseguir unas part!culas de tamao * poro adecuados. e. /as ase e mó+i mó+il" l" la ase ase mó+il mó+il puede puede ser ser un l!#ui l!#uido do o un gas( gas( * su unc unció ión n es transportar a los componentes de la mezcla a tra+és del sist istem ema a cromatogr)co. . C Cmar mara a de desarr desarrol ollo lo"" es un reci recipi pien ente te cerra cerrado do #ue sir+e sir+e para para conten contener er el medi me dio o em empl plea eado do * la ase ase mó+i mó+il( l( al tiem tiempo po #ue #ue ma mant ntie iene ne un am am'i 'ien ente te constante del +apor de la ase. g. ,aturación ,aturación de la cmara cmara de desarr desarrollo" ollo" esta esta epresión epresión se se re)ere re)ere a la eistencia eistencia de una distri'ución uniorme del +apor de la ase mó+il dentro de la cu'eta de elución( antes de iniciarse la cromatogra!a. $. Co Colu lumn mna a relle ellena na"" es un tu'o tu'o #ue #ue conti ontien ene e un sólid ólido o ac actti+o i+o m mss la as ase estacionaria l!#uida. i. Co Colu lumn mna a de par pared rec ecu' u'ie iert rta" a" es un tu'o tu'o dond donde e ase ase es esta taci cion onar aria ia li#u li#uid ida a rec ecu' u'rre la par pared inte intern rna a del del tu'o tu'o(( la cual cual es lisa lisa * por por lo gene genera rall poco poco modi)cada. %. esarrollo cromatogr)co" es el paso de la ase mó+il a tra+és de la ase estacionaria. 5. 3ecto 3ecto de 'orde 'orde en CC" consis consiste te en sumergir sumergir el 'orde 'orde inerior inerior en el sol+ent sol+ente e este este em empie pieza za a asce ascend nder er * desp despla laza za los los co comp mpon onen ente tess de la sust sustan anci cia a a tra'a%ar. l. Cromat Cromatogr ograma ama"" es un gr)co gr)co o represe representa ntació ción n de la respues respuesta ta del detec detector tor(( de la concentración del analito en el elu*ente o de otra magnitud utilizada para medir una propiedad del e6uente rente el +olumen de e6uente o tiempo. 3n cromatogra! cromatogra!a a en plano( 7cromatogr 7cromatograma8 ama8 puede ser el papel o capa con zonas separadas. m. Agente re+elado re+elador" r" es una sustancia sustancia o método #ue permite +isualizar +isualizar las zonas zonas en #ue se encuentre los compuestos *a separados( cuando estos no poseen color intr!nseco. n. unto unto de aplicac aplicación ión"" lugar donde donde se deposit deposita a la muestra muestra en la column columna a o ase ase estacionaria o. 9olum olumen en muer muerto to"" es el +olu +olume men n del del elu* elu*en ente te #ue #ue se co cons nsum ume e sin sin #ue #ue se detecte ning:n componente p. /rente rente de disol+ente" disol+ente" es es el 'orde 'orde delantero delantero de de la ase mó+il mó+il cuando cuando atra+iesa atra+iesa el medio plano. 3n todas las ormas de desarrollo( ecepto en el radial( el rente de la ase mó+il es esencialmente( una l!nea recta paralela a la super)cie de la ase mó+il. 1


#. /rente 'eta" es el 'orde delantero del componente ms desplazado a lo largo de la placa cromatogr)ca. r. ;ndice de retención( < " es el cociente entre la distancia recorrida por el compuesto * la distancia recorrida por el sol+ente por el sol+ente de desarrollo. e la de)nición se desprende #ue el +alor <  es siempre menor o igual a la unidad s. oder de resolución de un sistema cromatogr)co" es el parmetro #ue epresa el grado de separación #ue se puede o'tener en un sistema cromatogr)co para dos componentes dados. . ,erie eluotrópica" es una lista de disol+entes ordenados conorme a su capacidad relati+a para desplazar solutos de un adsor'ente dado. . Cromatogra!a en ase normal" procedimiento de elución en el #ue la ase estacionaria es ms polar #ue la ase mó+il. 3ste término se usa en cromatogra!a li#uida para resaltar el contraste con la cromatogra!a con ase in+ertida. *. Cromatogra!a en ase re+ersa" procedimiento de elución empleado en cromatogra!a li#uida en el cual la ase mó+il es signi)cati+amente ms polar #ue la estacionaria por e%emplo un material micro poroso de 'ase sil!cea con cadenas de al#uilo unidas #u!micamente. z. CC anal!tica o comparati+a" técnica anal!tica #ue permite la separación de los componentes de una mezcla de'ido a la in6uencia de dos eectos contrapuestos( retención * desplazamiento. aa. 3lución" es el enómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la ase estacionaria( impulsados por la ase mó+il. a'. 3lución isocrtica" es un procedimiento en el #ue la composición de la ase mó+il permanece constante durante el proceso de elución ac. 3lución por gradiente" procedimiento en el #ue la composición de la ase mó+il se cam'ia( de orma continua o en etapas( a lo largo del proceso de elución. ad.
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ai.

c ,eparación por tamao molecular @Cromatogra!a de permeación de gel( de tamiz molecular o de eclusión por tamaos. armetros de columna" -

Inter+alo de tra'a%o" inter+alo de  #ue pueden ser separados &!mite de eclusión"  m!nimo a partir del cual las macromoléculas no eperimentan retención.

d ,eparación por Intercam'io iónico &a separación se 'asa principalmente en la dierente a)nidad para el intercam'io de iones de los componentes de la muestra. H. ¿Cómo se mide * cómo se calcula el !ndice de retención( Rf ( desde el registro de las manc$as en el cromatograma de una CC? Rf se

puede de)nir como el cociente entre la distancia recorrida por la sustancia ( * la distancia recorrida por el sol+ente. ,e puede medir en el cromatograma la distancia desde el origen $asta la manc$a respecti+a * eectuar la operación como se ilustra en la imagen F. ¿Cómo se determina mediante CC #ue dos muestras distintas corresponden a un mismo compuesto? A partir del cromatograma de CC para dos compuestos se puede calcular el !ndice de retención. 3l !ndice de retención se utiliza como criterio de identi)cación por su +alor negati+o( es decir si la sustancia incógnita * el patrón con la #ue se compara en la misma corrida cromatogr)ca dan +alores de <  distintos( se descarta #ue sean el mismo compuesto. 3n cam'io si dan el mismo +alor de <  no se puede asegurar #ue sean el mismo compuesto. ,olo puede garantizarse la identidad de un compuesto cuando adems de datos de propiedades )sico#u!micas * cromatogr)cas pueden analizarse * asignarse datos espectroscópicos del mismo. J. ¿Qué actores determinan o aectan el +alor del < #ue se mide en un cromatograma CC? &as +aria'les #ue aectan el !ndice de retención son"       

Adsor'ente 3structura del soluto ,ol+ente de desarrollo =emperatura ,aturación de la cu'a Coe)ciente de partición Cantidades relati+as de las dos ases

K. ¿Qué es una serie eluotrópica? uestre un e%emplo con los disol+entes comunes en un la'oratorio. 4


3n una lista de disol+entes ordenados seg:n su capacidad relati+a para desplazar solutos de adsor'ente dado en columnas de s!lice( el poder elu*ente disminu*e as!"  AguaLmetanolLetanolLacetonaLacetato de car'onoLciclo  3tiloLcloroormoL'encenoLtoluenoLtetracloruro $eanoL$eano M. ¿Cules son las caracter!sticas desea'les de una ase mó+il para CC o CC? 3l sol+ente @ase mó+il óptimo para lle+ar a ca'o una CC ser a#uel #ue produzca un < de 0.H para el componente :nico( o #ue separe el ma*or n:mero de componentes de la muestra. ,e toma un !ndice de retención de 0.H *a #ue si es ma*or pudo $a'erse superpuesto la manc$a principal con alguna de otra impureza poco polar( si es menor pudo $a'erse superpuesto la manc$a principal con alguna otra impureza ms polar( en cam'io s! es de 0.H puede inerirse #ue la muestra tiene un solo componente. 10. ¿Qué es un agente re+elador? ¿Cómo se clasi)can los agentes re+eladores #ue se usan en CC? 3numere algunos agentes re+eladores com:nmente empleados en CC. &os re+eladores cromatogr)cos se usan en cromatogra!a de capa )na o =&C. 3n esta técnica se coloca la muestra a analizar @una gota so're una placa de s!lica-gel. 3sta placa se introduce +erticalmente en un +aso donde $a* un disol+ente @o una mezcla de disol+entes( de orma #ue el disol+ente no to#ue la muestra. &a s!lica de la placa ira a'sor'iendo el disol+ente @capilaridad * la muestra tam'ién su'ir por la placa. &a altura #ue alcance la muestra depender del disol+ente empleado @su polaridad * de #ue se componga la muestra. Normalmente las muestras estn compuestas de +arias cosas( de orma #ue se o'tienen una serie de manc$as a distintas alturas. ara identi)car las muestras se usa el < #ue consiste en medir * di+idir la altura #ue $a alcanzado la manc$a entre la altura #ue $a alcanzado el disol+ente * $a* #ue decir siempre #ue disol+ente $as utilizado. 3%emplo" Acetato de etilo @disol+ente usado su'e 10 cm( * la manc$a a analizar su'e F cm. 3l < ser de 0.F en acetato de etilo. ero para calcular el < $a* #ue +er la manc$a. &as placas de s!lica #ue se usan en la'oratorio tienen un indicador 6uorescente * al introducirlas 'a%o una lmpara de ra*os ultra+ioleta 'rillan con color +erde. ,i $a* alg:n compuesto acti+o en el ultra+ioleta e+ita #ue el indicador a'sor'a luz en la zona en la #ue se encuentra * como resultado se +er como una manc$a negra * *a podemos medir el <. Otras +eces( $a* #ue emplear re+eladores. 3l re+elador es un compuesto #ue $a de reaccionar con los compuestos analizar de orma #ue se o'tenga una manc$a coloreada a simple +ista. &os re+eladores ms usados son"    

cido osomoli'dico @para compuestos cilmente oida'les *odo @para compuestos aromticos e insaturados nin$idrina @para aminocidos( aminas * aminoazucares permanganato potsico @compuestos insaturados o cilmente oida'les.

3l re+elado puede di+idirse en dos" métodos !sicos #ue utilizan propiedades particulares de los compuestos( tales como la 6uorescencia * los métodos #u!micos #ue consiste en $acer reaccionar a las sustancias con alg:n agente #u!mico con el #ue ormen alg:n compuesto coloreado. 11. iscuta la a)rmación" 7La CCD constituye un criterio parcial de identicación para un compuesto; es decir, no puede dar la identicación total del compuesto 8. 5


A tra+és del cromatograma de CC es posi'le calcular el !ndice de retención #ue permite la identi)cación parcial de un compuesto. Al elegir el a'sor'ente * el sol+ente de elución pueden lograrse +alores de <  reproduci'les para cada soluto. Aun as! esta reproduci'ilidad no es lo su)cientemente con)a'le( puede ocurrir #ue dos compuestos tengan el mismo +alor de <  aun pro'ando distintos sol+entes de desarrollo por eso el < de la CC se usa como criterio de identi)cación por su +alor negati+o( en otras pala'ras este !ndice se emplea para descartar compuestos si el +alor es dierente pero si son iguales no asegura #ue se trate del mismo. 12. ¿Cómo se aecta la separación cromatogr)ca a causa de cada uno de los siguientes actores? a. la a/licació+ d& )u&stra &+ &0c&so o en mu* alta concentración en la placa o en la columna de cromatogra!a. ,i se so'resatura el a'sor'ente en la zona de siem'ra( $a'r soluto #ue estén a'sor'idos desde el primer momento( si esto ocurre en una placa se o'ser+aran manc$as deormadas #ue di)cultaran su interpretación. ,i esto ocurre en una columna se o'tendr una zona de siem'ra demasiado anc$a o si se siem'ra en pastilla se tapara la columna al pretender eluir con un sol+ente poco polar en el cual se muestra insolu'le. '. el uso de una as& )ó2il d& alta /olaridad en un sistema cromatogr)co en as& +or)al. 3n la ase normal( se tiene como 'ase una ase estacionaria polar( por lo tanto un sol+ente polar tendr uerza elu*ente ma*or con lo cual los solutos con rente sol+ente * no se lograra la separación. c. 3l uso de una as& )ó2il d& alta /olaridad en un sistema cromatogr)co en as& r&2&rsa. 3l sistema cromatogr)co de ase in+ersa implica #ue la ase mó+il es ms polar #ue la estacionaria( eso ocasionara #ue se desplacen los componentes polares * los ligeramente polares o apolares #ueden retenidos( todo lo contrario al resultado de una cromatogra!a en ase normal. d. &a disposición de una ca+tidad &0c&si2a d& as& )ó2il &+ la cá)ara de desarrollo cromatogr)co ascendente en una CC. 3sto puede ocasionar #ue el sol+ente supere la l!nea de siem'ra por tanto la ase mó+il disol+er solutos en +ez de arrastrarlos a tra+és de la ase estacionaria. e. &a a/licació+ d& la )u&stra )u# c&rca d&l &0tr&)o de la placa para CC u& s& su)&r*& en la ase mó+il. Al aplicar la muestra mu* cerca al 'orde #ue se sumerge la ase mó+il puede ocurrir #ue la siem'ra #uede sumergida en el sol+ente * este disuel+a la muestra en +ez de desarrollar la cromatogra!a . &a a/licació+ d& la )u&stra )u# c&rca d& alguno de los %ord&s +erticales de la placa para CC. 3ste e+ento propiciar!a el eecto de 'orde. g. 3l uso de una )&4cla &t&ro*6+&a de l!#uidos con polaridad dierente co)o as& )ó2il. ,i la ase mó+il consta de l!#uidos inmisci'les( se registrar ms de un rente de sol+ente $aciendo inteligi'le el cromatograma * malogrando la separación. $. 3l a*ri&ta)i&+to o la or)ació+ d& *ru)os o d& %ur%u7as d& *as en la ase estacionaria. Pna capa irregular ocasionara recorridos ms rpidos o ms lentos dependientes de la orma de la ase estacionaria( implicando un +alor de !ndice de retención aleatorio e irreproduci'les. i. 3l ta)a8o, la or)a # la /orosidad d& las /art(culas u& co+stitu#&+ la as& &stacio+aria . Al disminuir el tamao de part!cula( el n:mero de centros acti+os por unidad es ma*or * la capacidad de adsorción se incrementa( adems me%ora la resolución. 6


Cuando se utiliza el a'sor'ente de grano ms )no( el espacio entre grnulos es ms pe#ueo( el e#uili'rio adsorción-desorción se esta'lece rpido. %. &a 2iscosidad d& la as& )ó2il . &a +iscosidad de la ase mó+il determinara la rapidez con la #ue atra+iesan la ase estacionaria( * por lo tanto el tiempo dura el desarrollo cromatogr)co. 5. 3l 9u7o d& la as& )ó2il . ,i la +elocidad de 6u%o es mu* rpida no se alcanza a esta'lecer el e#uili'rio adsorción-desorción * el rente de las 'andas aparece deormado( * si es mu* lenta se propiciara una alta diusión * remezcla de componentes. l. &a alta d& saturació+ co+ 2a/or d& la as& )ó2il dentro de la cmara de desarrollo cromatogr)co en CC. ,i la cmara no est de'idamente saturada( el sol+ente( en +ez de ascender por capilaridad continuamente( tendera a e+aporarse de la capa de a'sor'ente( para e#uili'rar al l!#uido con su presión de +apor. 3sto implicara un ascenso $omogéneo del rente de sol+ente. m. &a distri%ució+ irr&*ular d& la as& &stacio+aria en la tra*ectoria de la ase mó+il * las 2ariacio+&s irr&*ular&s d&l 9u7o d& as& )ó2il durante la elución en el desarrollo cromatogr)co. 3sto ocasiona #ue el rente de sol+ente corra inclinado $aciendo irreproduci'les los +alores de !ndice de retención. n. Pn ca)%io &0a*&rado d& la /olaridad &+ la as& )ó2il de'ido a un gradiente intenso o a un paso de gradiente mu* alto. 3l cam'io en la polaridad ocasionara #ue el sol+ente aumente o disminu*a su uerza elu*ente( determinando el grado de separación de los componentes de la muestra. 1G. ¿Cómo se adaptan la placa( la aplicación * la cmara de desarrollo para $acer cromatogra!a en capa preparati+a @CC? ueden $acerse en micro placas o placas ms grandes. Am'as ormas se preparan con adsor'ente de tamao de granulo entre 10 * 40 micrones. ara cu'rir el soporte con la capa se puede" suspender adsor'ente en sol+ente +oltil( donde se sumerge la placa( * luego se seca el aire( o se puede suspender adsor'ente en agua( aplicarlo con etendedor * luego acti+ar las placas de siem'ra por medio de un capilar cargado( a'ierto en los etremos( u'icados en puntos de 1(H cm del 'orde inerior. 14. ¿Cómo se aplica una muestra en placa para CC? Pna +ez preparadas las placas para CC( se siem'ra la solución a la #ue se le practicara la cromatogra!a( por medio de un capilar o una pipeta capilar controlando gota a gota su drena%e. &a siem'ra se realiza colocando puntos de solución contiguos en +arias pasadas( de tal orma( #ue #uede una l!nea de siem'ra de 1(H cm de 'orde inerior de la placa. 3ntre cada secuencia de siem'ra se de'e de%ar e+aporar el sol+ente #ue est saturando el adsor'ente en esa zona. 1H. ¿ara #ué se recomienda disponer dentro de la cmara de desarrollo cromatogr)co para CC un papel )ltro con un etremo sumergido en la ase mó+il? ,e recomienda recu'rir las paredes de la cmara con papel )ltro cu*o 'orde este sumergido en el sol+ente de desarrollo con el )n de lograr una perecta saturación de la cmara de desarrollo. ,e de%a #ue el sol+ente ascienda por el papel * después de un tiempo puede considerarse #ue la cmara est saturada. 1F. ¿Cómo se controla la elución en el desarrollo cromatogr)co de una CC mediante CC? 3n la ase in+ersa la ase )%a solida es generalmente de part!culas de gel s!lice( a los #ue se in%ertan cadenas C 1KGJ o C1K1J. A dierencia en ase normal( las part!culas 7


orman una ase lipó)la #ue retiene moléculas poco polares. 3n ase re+ersa( los componentes ms polares son eluidos preerentemente * los menos polares elu*en en :ltimo lugar. 1J. 3n un mismo es#uema( muestre comparati+amente el resultado de la separación por CC de una mezcla de solutos operando un desarrollo cromatogr)co

Cromatogra)a en columna.

/raccion 1

/raccion 2

An-lisis mediante CC

/raccion G


Fracción 1 (fracciones 1 y 2) Compuestos menos polares

/raccion 4



Fracción 1 (fracciones 1 y 2) Compuestos menos polares

3l proceso consiste en e+aluar cada una de las racciones o'tenidas mediante la cromatogra!a de columna para identi)car si se trata del mismo compuesto o similares * de esta orma poder reunir las racciones con las mismas caracter!sticas para simpli)car el proceso. 3n el control de una elusión en cromatogra!a en columna en ase re+ersa el proceso es similar( sin em'argo se tendr #ue las primeras racciones corresponden a los compuestos ms polares * las :ltimas sern los compuestos menos polares.

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