CONFERENCIA
ESTRUCTURA DE LA CROMATINA, CROMATINA, EL DNA EXTRACROMOSOMICO EXTRACROMOSOMICO Sumario Estructura de la cromatina DNA extracromosómico
Bibliografia Friefelder Molecular Biology (1983) Pag. 196-205, 702-706
Estructura de la cromatina En las células eucarióticas el DNA se encuentra en el material cromosomal llamado cromatina. Su organización es compacta y en ella la mayoría de las secuencias de DNA son inaccesibles estructuralmente y funcionalmente inactivas, dentro de esta esta masa está la minoría de secuencias secuencias activas. La cromatina cromatina se encuentra dividida en 2 tipos de material: Heterocromatina: Heterocromatina: Regiones densamente empaquetadas con las fibras, cambia poco a través del ciclo celular Eucromatina: Eucromatina: Son los genes activos, no condensada. Esta dispersa en el núcleo, ocupa la mayor parte de la región nuclear. No toda la cromatina es activa transcripcionalmente. transcripcionalmente. La misma fibra fibra puede tener los 2 estados y la eucromatina presenta cambios cíclicos en su empaquetamiento. En la interfase la célula tiene 2 clases de heterocromatina: Constitutiva (estructural): regiones particulares que no se expresan, incluyen los satélites y pueden tener un papel estructural dentro de los cromosomas. Se puede encontrar alrededor del centrómero. Facultativa: Facultativa: Son cromosomas enteros que son inactivos en una línea celular, pero se pueden expresar en otras. otras. Ej Cromosoma Cromosoma X de mamíferos mamíferos,, una copia del cual (selecciona (seleccionada da al azar) es inactiva inactiva en una hembra (esto compensa el que haya 2 en las hembras y 1 solo en los machos). El cromosoma X inactivo es perpetuado en un estado heterocrómati heterocrómatico, co, mientras mientras que el activo activo es parte de la eucromatina eucromatina.. Aquí es posible ver una correlación entre la actividad actividad transcripcional y la organización estructural estructural cuando secuencias de DNA idénticas están involucradas en ambos estados. También se habla de eucromatina: Sincrónica: Sincrónica: Activa al mismo tiempo en diferente lugar. Diacrónica: Diacrónica: Activa en un momento dado de la ontogenia. La condensación del material genético esta asociado con su inactividad, lo contrario no es cierto, los genes activos están contenidos en la eucromatina, pero esta no es la única condición para que se expresen. La cromatina activa es bioquímicamente diferente: 1. H1 parece unirse con menos fuerza a al menos algún tipo de cromatina activa. 2. Las 4 histonas histonas aunque aunque están en cantidade cantidades s normales normales parecen parecen estar altamen altamente te acetiladas acetiladas.. 3. La H2B en la cromatina inactiva esta menos fosforilada. 4. La activa esta muy enriquecida por una forma variante menor de h istonas H2A. 5. Los nucleosomas de la activa se unen selectivamente a 2 pequeñas proteínas cromosomicas similares HMG14 y HMG17 (HMG signific significa a High Mobility Mobility Group). Group). Se unen 1 de cada 10 nucleosomas. nucleosomas. Presentan Presentan secuencias de aminoácidos muy conservadas durante la evolución.
Cada cromosoma contiene 1 sola y muy larga molécula de DNA de doble cadena, que se encuentra plegada en la fibra de 30 nm.
La subunidad fundamental de la cromatina tiene el mismo tipo de designio en todos los cromosomas eucarióticos. El nucleosoma, este contiene ~200 pb de DNA, organizadas por un octámero de pequeñas proteínas básicas en estructura en forma de cuentas. La masa de la cromatina contienen hasta 2 veces más proteína que DNA. Las proteínas son de 2 tipos:
Histonas: igual masa que DNA No histonas, en menor proporción, pero comprenden un número mayor de proteínas. incluye el control de la expresión genética y de la estructura superior de la cromatina.
Su función
Una pequeña cantidad de RNA que constituye menos del 10% de la masa del DNA. Las histonas son pequeñas proteínas básicas, alrededor de las cuales se organizan 200 pb del DNA. Su PM oscila entre 11 000 - 21 000. Existen 2 copias de las histonas H2A, H2B H3 y H4 que forman el núcleo de histonas y la H 1, las características de las 5 clases mayores de histonas se muestran en la tabla. (23.3 Lehninger 1993) Histona H1 H2A H2B H3 H4
Aminoácidos básicos Lys Arg 29% 1% 11% 9% 16% 6% 10% 13% 11% 14%
Aminoacidos Acidos Básicos/ácidos
PM
3% 15% 13% 13% 10%
23 000 13 960 13 774 15 342 11 282
5.4 1.4 1.7 1.8 2.5
Las histonas pueden existir en diferentes formas porque las cadenas laterales de aas pueden ser metiladas, sufrir ADP ribosilación, fosforilación y acetilación, tales modificaciones cambian la carga neta, forma y otras propiedades cuyo significado funcional no se entiende bien, cuando los cromosomas son sometidos a un tratamiento que los despliega se forma una estructura en la cual el DNA está enlazado fuertemente como un collar con cuentas. Las H3 y H4 son casi idénticas en secuencia de aas en todos los eucarióticos lo que sugiere una conservación de sus funciones. Los tipos H2A y H2B se reconocen en todos los eucariontes, pero sus secuencias varían con la especie. La histona H1 comprende un set de proteínas relacionadas (la variante de eritrocitos le llaman H3). La H3 muestra variación entre tejidos y entre especie y está aparentemente ausente de las levaduras, es la de mayor PM. El nucleosoma es la unidad de toda la cromatina. Cada nucleosoma tiene 8 moles de histonas 2 copias de H2A, H2B, H3, H4. El espaciado del nucleosoma a lo largo del DNA define una unidad de casi 200pb que se repite, de los cuales 146 pb están enlazados fuertemente alrededor del núcleo de histonas y el resto sirve como un ligamiento entre nucleosomas. La histona H1 no es parte del núcleo, pero generalmente está enlazada al DNA ligador. Cuando la cromatina es tratada con nucleasa micrococal, el DNA es clivado en múltiplos enteros de la unidad de longitud. En la Fig. 27.8 Genes VI se muestra la electroforesis de esta digestión. De igual forma el nucleosoma fraccionado sobre un gradiente de sacarosa da una serie de picos discretos que corresponden a monómeros, dímeros, trímeros, etc. Cada partícula contiene 146 pb de DNA enlazado protegido de la digestión. El resto de la unidad repetido lo constituye el DNA ligador. Su longitud varía desde 8 pb a 114 pb por nucleosoma. Al estudiar por Difracción de Rayos X esta partícula está hecha de 8 moles de histona con el DNA enrollado alrededor del nucleosoma en forma de una superficie solenoidal que gira hacia la izquierda que da 1,8 vueltas alrededor del octámero de histonas. Las puntas en las que el DNA entra y deja el nucleosoma están cercanas entre sí.
Es por esto que el DNA nucleosomal se divide en 2 regiones:
DNA central: de 146 pb y resistente a la digestión por nucleasas DNA ligador : Su longitud varía desde 8 a 114 pb por nucleosoma.
Esta estructura puede explicar porque el DNA eucariótico está subenrollado aunque a las células eucarióticas le falten las enzimas que subenrollan el DNA. Esta es una forma de producir superarrollamiento negativo. El patrón de 2 vueltas tiene una posible importancia funcional, ya que una vuelta alrededor del nucleosoma toma 80 pb, 2 puntos separados por 80 pb en el DNA libre estarán cercanos en la superficie del nucleosoma (Fig. 27.6 Genes VI; Fig. 23-25) Esta sucesión de nucleosomas se conoce como la fibra de 10 nm (diámetro del hilo), pero esta fibra se organiza para formar una estructura llamada simplemente la fibra de 30 nm (se forma un solenoide levógiro). El empaquetamiento requiere 1 mol de la histona H1 por nucleosoma, aunque no está claro donde se enlaza. Esta organización no se extiende por el cromosoma entero sino por regiones que están enlazadas por secuencias específicas en que se unen proteínas no-histonas al DNA. La estructura observada también parece depender de la actividad transcripcional de la región del DNA. Las regiones con genes en transcripción están aparentemente en un estado menos ordenado, que contiene poco (si hay alguna), histona H1.
Posición del núcleo de histonas sobre el DNA. Los nucleosomas son reconstituidos in vitro sin relación a la secuencia del DNA, pero in vivo se han realizado experimentos con enzimas de restricción y nuclease micrococal, que han permitido plantear, que la ubicación del núcleo de histonas sobre el DNA, no es al azar, sino esta relacionado con la secuencia. La ubicación de los nucleosomas puede llevarse a cabo de 2 formas: Intrínseco: Cada nucleosoma se deposita específicamente en una secuencia particular del DNA. Extrínseco: El primer cromosoma se ubica en una región preferencial y a partir de este se une el resto. Esta unión resulta de la interacción de otras proteínas con el DNA o las histonas. Ciertas características estructurales del DNA afectan la ubicación del octámero de histonas. El DNA tiene tendencia intrínseca a curvarse en una dirección mas que en otra; así zonas ricas en A-T se localizan donde el surco menor de la hélice hace contactos con el octámero, el fuerte enrollamiento del DNA en torno al núcleo de proteínas requiere comprensión del surco menor hacia estos puntos y un cluster de AT hace más fácil este contacto mientras zonas ricas en G-C se localizan hacia los lugares donde es menor el contacto DNA núcleo histonas. (Fig 23-26 Lehninger 1993). Largas hileras de dA-dT (>8 bp) nunca se encuentran en la vuelta de superhélice central. Todavía no es posible sumar todos los efectos estructurales relevantes y predecir la localización de una secuencia de DNA particular con relación al nucleosoma. El siguiente nivel de plegamiento no se entiende bien pero parece que ciertas regiones se asocian con una armazón “scaffold” nuclear. Las regiones asociadas a esta armazón, se separan por lazos de DNA con 20,000 a 100 000 pb. el DNA en estos lazos parece tener un “set” de genes relacionados. Por ej. en Drosophila están los genes que codifican las diferentes histonas. la armazón parece contener varias proteínas y cantidades notables de Histona H1. Hay evidencias para niveles de organización mayores que incrementa el grado de compactación multiplicativamente. ¿Como las histonas interactúan una con otra? Hay evidencias acerca de que se forman interacciones estables histona-histona. Existen 2 tipos de complejos:
H3 y H4 formán un tetrámero H2A y H2B forman varios complejos, pero en particular un d ímero
Cuando se obtiene el octámero de Histonas dejándolas asociar "in vitro" por aumento de [sal] y [proteína] Por extracción de la cromatina se puede disociar: 8
6 H2A.H2B
Tetrámero H2A.H2B
Esto argumenta a favor de que forman un núcleo central. En la Fig 27.21 se muestra un modelo para explicar la organización de este núcleo de histonas En el ensamblaje del DNA con las Histonas el octámero se forma y se ensambla el DNA, el núcleo H3 – H4 se une al DNA y luego se le añaden H2A y H2B. El autoensamblaje in vitro es un proceso lento limitado por la tendencia a precipitar de las partículas ensambladas. Es difícil conocer que condiciones mimifican las fisiológicas ya que ambos mecanismos tienen lugar in vitro. (Fig 27-26) Se han aislado proteínas accesorias que pueden ayudar a las histonas a asociarse con el DNA. En huevos de Xenopus se han aislado 2 proteínas, nucleoplasmina que se une a H2A y H2B y N1 que se une a H3 y H4. Anticuerpos contra estas proteínas inhiben el ensamblaje. Se piensa que estas proteínas pueden actuar como chaperonas moleculares que se unen a las histonas y las van liberando al DNA individuales o en complejos de una forma controlada. Esto pudiera ser necesario porque las histonas son proteínas básicas con alta afinidad por el DNA. Nucleoplasmina y N1 son proteínas acídicas que reducen su carga neta +. Tales interacciones permiten a las histonas formar los nucleosomas sin ser atrapadas en otro intermediario cinético (otro complejo inespecífico que resulte de la afinidad DNA-Histona).
DNA extracromosómico La primera evidencia de la presencia de genes fuera del núcleo eucariótico fue la herencia no Mendeliana en plantas. El caso extremo de este tipo de herencia es la herencia uniparental, que tiene lugar cuando el genotipo de solo un padre se hereda y el del otro se pierde siempre. Usualmente es el genotipo materno, por lo que algunas veces se describe este fenómeno como herencia maternal. La herencia maternal resulta de la presencia en mitocondrias y cloroplastos de DNA, el que se hereda independientemente de los genes nucleares. El genoma de los organelos comprende un segmento de DNA que ha sido secuestrado en una parte de la célula y sometido a sus propias formas de expresión y regulación. Este genoma típicamente codifica para todos los RNAs, pero solamente algunas proteínas necesarias para perpetuar el organelo. Una consecuencia de la herencia maternal es que la secuencias del DNA mitocondrial es más sensible que las del DNA nuclear a la reducción en el tamaño de la población (deriva genética) y por este motivo el DNA mitocondrial es un marcador molecular muy popular para diversos estudios evolutivos de animales, los que incluyen inferencia filogenética, identificación de especies, filogeografía, análisis de estructura y dinámica poblacional y evolución molecular (Zhang y Hewitt (1996)
DNA mitocondrial Esta representado en 1-10 copias por organelo. Se encuentra usualmente en forma circular, doble cadena y superenrollado. Aunque hay excepciones en el Tetrahymena y Paramecium, que presentan moléculas lineales. En los mamíferos no está empaquetado en nucleosomas. Su longitud varía de ≅ 15 Kb y codifican para 15-20 proteínas. Algunas levaduras tienen moléculas mas grandes como Saccharomyces, que muestra moléculas de 75 Kb, el de las plantas es mucho más grande. Con un mínimo de ~100 kb, la función de este DNA adicional no ha sido definida, pero parece probable que es no codificador. El tamaño hace difícil su aislamiento. El origen del aparato genético en mitocondrias se resume en la siguiente tabla: Componente Molde Ribosoma Adaptador
Sintetizado en Mitocondria ~10 mRNAs 2 rRNAs 22 tRNAs
Sintetizado en citoplasma RNA polimerasa ~75 proteínas 22 tRNA sintetasas
El 60 % de la capacidad codificadora se usa para codificar 7 subunidades de la NADH-Q reductasa y 13 proteínas, involucradas la mayor parte en el transporte electrónico. En la mayoría de las especies estudiadas hasta ahora posee una sola región no codificadora, la región D-loop, que se plantea está involucrada en la regulación de la replicación y la trascripción. El DNA de las plantas aparentemente mucho más complejo, consiste de permutaciones de una estructura básica que se relaciona entre sí por recombinación. Una teoría sobre el origen de la mitocondria sugiere que ellas eran procariontes simbiontes que proveían del metabolismo
oxidativo a sus hospederos. A través de la evolución los genes fueron transferidos desde el simbionte al DNA nuclear del hospedero, dejando sólo los remanentes que encontramos hoy.
Dna cloroplástico Es mucho mas grande que el mitocondrial, con PM ≅ 100 millones Daltons (121-155 Kb). Tiene un mayor número de copias por organelo, en algunos casos mas de 100. Como en el caso del DNA mitocondrial lleva la información para los componentes esenciales de la membrana del tilacoide, enzimas de la fotosíntesis, tRNA y rRNA. El genoma codifica para: 4 rRNAs 30 tRNA 50 proteínas identificadas 29 proteínas no identificadas Todas las moléculas del DNA cloroplástico conocidas son circulares y superenrolladas. Todas presentan una secuencia de 10-20 Kb, en dos copias idénticas como repeticiones invertidas (los genes en estas secuencias estén dobles). Entre ellas se puede producir recombinación y generar inversiones en las secuencias únicas. Hay presencia de intrones, tal vez se introdujeron como simbiontes a partir de procariontes primero en la evolución.
Plásmidos Son pequeños elementos extracromosómicos desplazables presentes en las bacterias que llevan genes que codifican para funciones tales como resistencia a drogas, son usualmente circulares y pueden estar presentes en una o varias copias por células. En esencia, los plásmidos son cromosomas accesorios, que se diferencian del cromosoma bacteriano en que, bajo condiciones determinadas nos resultan impredecibles. Contienen su propio origen de replicación y se replican de modo autónomo. Son moléculas de DNA duplohelicoidal superenrollado con rango de tamaño desde 2.5 x 106 a 1.5 x 108 Daltons (de 2 a varios centenares de kb), constituyen elementos estables, presentes en bacterias y en algunos eucariontes. Hay diferentes tipos de plásmidos:
Plásmidos sexuales o F (Factor F) +
F es macho, induce a la bacteria a hacer un tubo, el pilus, por el cual se une a una bacteria hembra, en que se lleva el factor F.
Plásmidos de resistencia a drogas o R Llevan genes que confieren resistencia a drogas (una o más). La resistencia es el resultado de la producción de enzimas que modifican o degradan la droga. Los factores R pueden o no llevar genes que codifican la habilidad de formar un pilus para ser transferidos a otra bacteria, se les llama genes tra (transferencia). Muchos de estos genes están presentes sobre elementos transponibles.
Plásmidos que sintetizan colicinas y factores colicinogénicos Las colicinas son sustancias químicas tóxicas a la bacteria. Los mas grandes pueden ser transferidos por conjugación, pero las mas pequeñas tales como factor Col E, no codifican para enzimas que llevan a cabo su transición. Los plásmidos, especialmente los mas pequeños existen con alto número de copias y se usan como vehículo de clonaje en ingeniería genética y la presencia de marcadores de resistencia a drogas es saludable en los regímenes de selección usados. Son muy comunes los derivados de Col E1, así el pBR322 fue construido eliminando algunas regiones e insertando otras (e.g. el gen de resistencia a tetraciclina de pSC101) para dar un plásmido autónomo de 2.7 x 106 de PM. Se pueden construir plásmidos híbridos. Ej: pBR322 pBR322
+ +
plásmido pequeño de levadura (2 u) segmento de un virus circular (e.g. SV40)
Estos plásmidos son capaces de crecer ambos en bacterias en levaduras o en células animales y se han utilizado mucho en el estudio de la expresión de genes eucariontes.
