VIROLOGÍA - Interacción virus-célula Curva de crecimiento en un solo paso para el fago T4: Ellis y Delbruck demostraron que era el virus el que infectaba a la bacteria y que provocaba la aparición de calvas de lisis, para ello hicieron el siguiente experimento: Infectaron con una cantidad de virus concreta ya que la cantidad por célula debe ser la adecuada. El virus se adsorbe a la superficie de la bacteria por un determinado determinado receptor. Por centrifugación las bacterias se van al fondo, quedándose en el sobrenadante los virus no adsorbidos, que se eliminan. Se resuspende en medio fresco y se hacen tubos por duplicado y a cada uno se le aplica un tratamiento para analizar: o Virus extracelulares: Los que han infectado y han liberado los viriones. Sólo se centrifuga. o Virus totales: Se añade cloroformo que lisa a las bacterias y luego se centrifuga. Se toman muestras en pequeños periodos de tiempo y se siembran en césped de bacterias y se halla la cantidad de virus en PFU/cel. Si representaron representaron las u.f.p. a lo largo del tiempo se obtienen las siguientes fases: o F. Eclipse: A tiempos cortos a la infección, todavía no existen viriones formados (no se han dado calvas). Se están produciendo produciendo las proteínas para producir las cápsulas y el ADN. o F. Latencia: No hay virus extracelulares Vtotal = Vintracelular . Aumenta los intracelulares porque comienza la formación de partículas virales pero aun no han lisado a las células. (son viriones activos). o F. Acumulación: En esta fase hay bacterias bacterias con muchos fagos dentro pero todavía no tienen fagos suficientes suficientes para lisar. F. Liberación: Todas las bacterias han lisado. V total = Vextracelular . No existen virus o intracelulares. •
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Los virus extracelulares van aumentando porque las células acaban siendo lisadas a medida que pasa el tiempo. Esto demostraba las fases que lleva el virus en una bacteria. En el caso de los virus con envuelta los tiempos aumentan porque tienen que recuperar la cápsula. Virus desnudo
Como los animales son más complejos el proceso de infección es más lento: lo medimos en horas y no en minutos como antes. El ciclo es bastante equivalente al fago T4, teniendo la fase eclipse, fase latencia y a partir de t = 16 h se da el ensamblaje de las partículas virales infectivas que salen al exterior. Los virus extracelulares nunca llegan a ser los virus totales. Virus con envuelta
Aquí no existen virus intracelulares intracelulares activos. Para ser activos necesitan salir de la célula que ha infectado y llevarse parte de ella. Por ello la cantidad de virus extracelulares extracelulares y totales solapan. La curva intracelular de esta gráfica se corresponde con errores cometidos en la medida, contaminación de virus extracelulares, problemas técnicos… no debemos tenerla en cuenta.
Etapas en la infección viral 1. Inicio de la infección 1.1. Fijación del virus a la célula
En principio cualquier molécula presente en la superficie celular puede actuar de receptor viral, para cada virus será diferente. Generalmente suelen ser glicoproteínas integrales de membrana, aunque algunos reconocen glicolípidos, fosfolípidos... Estos receptores interaccionan interaccionan con otras muchas cosas, no están ahí para ser reconocidos por virus.
Algunos receptores de membrana a) ICAM 1 Es el receptor utilizado por el rinovirus. Esta proteína tiene 5 dominios extracelulares unidos por puente disulfuro, unida por el extremo carboxilo a la membrana plasmática. Proteínas extracelulares extracelulares del rinovirus (HRV) reconoce el dominio más extracelular (D1) de esta proteína. Este virus tiene otras zonas de interacción con otras sustancias, como el Lfa-1 reconocido por los linfocitos.
El receptor por el D1 interacciona con el virus e interacciona con una hendidura (cañón) específica al virus. Si al rinovirus interacciona por el otro cañón con un anticuerpo, se bloquea y no puede reconocer la zona a infectar. Cuando la entrada del virus se hace exclusivamente por un único receptor, podemos bloquear la entrada fácilmente usando anticuerpos monoclonales que se unan al cañón y bloqueen la interacción virus-célula. La parte variable del anticuerpo se construye con la misma proteína del virus.
b) Receptor de ácido siálico Receptor de membrana utilizado por el virus de la influenza. Es reconocido por la hemaglutinina, presente en la cápsida. Ésta reconoce y se une residuos de ácido siálico que se encuentra en glicoproteínas y glicolípidos de las membranas celulares. Este virus también tiene integrada la neuraminidasa (NA) que rompe el enlace y libera el virus del receptor, ya que el virus después de infectar no quiere quedarse unido, sino liberarse para poder colonizar otras células. Este receptor es menos específico específico porque podría interaccionar interaccionar con otros azúcares.
c) Unión del HIV a CD4 Este virión tiene envuelta, en ella hay antígeno, (glicoproteína SU ), ), que está normalmente formando dímero o tetrámeros (en la imagen sólo se ve uno). Posee tanto dominios constantes como variables. SU interacciona con CD4 (tipo I6) con 4 dominios globulares unidos por puentes disulfuros, presente en linfocitos T4. Esta unión produce un cambio conformacional en la glicoproteína viral que permite su posterior interacción con uno de los receptores de quimioquininas (CCR), que actúan como correceptores del virus. La unión de SU-correceptor conduce a la exposición de un dominio de la glicoproteína TM, la que promoverá la fusión de las dos membranas y la entrada de la nucleocápsida dentro de la célula. Muchos retrovirus desarrollan un proceso de interferencia, una vez que el virus interacciona con receptores se bloquean el resto de CD4 (sólo infecta un virión).
Podríamos añadir CD4 lo que bloquearía parte de los virus e impediría la entrada. Cuando se hicieron ensayos clínicos, se degradaba CD4 antes de llegar al virus por la inestabilidad de CD4 en sangre. De esta forma se disminuye la cantidad de virus (es la vía de entrada principal), pero no se bloquea la entrada a la célula debido a que el virus tiene vías alternativas de entrada: existen hasta 8 receptores distintos aparte del CD4. Cuando intentamos infectar células de ratón con CD4 iguales a los humanos, los virus HIV de humanos no pueden infectar infectar esas células de ratón. Se necesitan necesitan correceptores para que el virus entre más eficientemente. En el ratón los correceptores son diferentes. 1.2. Entrada
La entrada supone un coste energético (a diferencia de la unión, interacción electrostática entre dos proteínas) y la célula debe estar metabólicamente activa. La energía es requerida para que se desencadenen 3 mecanismos principales: Translocación:
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Utilizada por virus desnudos. Está mediado por un receptor específico de la membrana y una proteína de la cápsida. Tras la unión específica se produce un cambio de conformación de la proteína que hace que entre el virus (no se generan poros). El receptor es finalmente reciclado a la membrana citoplasmática. Este mecanismo es poco frecuente y no está muy caracterizado. •
Endocitosis mediada por receptor:
Es utilizada por la mayoría de virus animales tanto desnudos como con envuelta. o El virus se ancla a un receptor específico de membrana y se produce una invaginación recubierta por clatrina ( coated pit ) que da lugar al endosoma ( coated vesicle ). o Se produce una bajada de pH mediada por la protón ATPasa vacuolar de la membrana del endosoma que bombea protones al interior, provocando la maduración del mismo. o Posteriormente se pierde la cubierta de clatrina. o
En virus con envuelta o La bajada de pH desorganizan los componentes proteicos de la envuelta y además activa proteínas con actividad fusogénica de la superficie de virus. Esto genera la fusión de la membrana viral y del endosoma permitiéndose permitiéndose la liberación. liberación. o El ácido nucleico entra rápido en el núcleo para que no le afecten las endonucleasas.
En virus desnudos
Una vez el virus dentro del endosoma se han propuesto dos posibilidades: Lisar al endosoma liberando el contenido al citoplasma (adenovirus), pero la cápsida protege al DNA hasta el núcleo que penetra por un poro. La partícula viral o genoma pasan al citoplasma con una perturbación de la membrana pero sin lisis, como formación de un poro. o En ambos casos existe un proceso secuencial de decapsidación, en el que se liberan los ácidos nucleicos. o
Entrada del virus influenza La entrada es por endosoma mediada por receptor (HA-ácido siálico). A la bajada del pH, la hemaglutimina cambia de conformación. Cuando se produce la unión al ácido siálico se expone un domino de ésta con actividad fusiogénica y permite la fusión de las membranas, permitiendo la salida del material génico al exterior y la posterior entrada al núcleo. •
Fusión:
Solamente virus con envuelta ya que se produce una fusión directa de la membrana del virus con bicapa lipídica. Este proceso se lleva a cabo por la acción de proteínas fusogénicas situadas en la envuelta de la partícula viral. Una vez fijado el virus al receptor se activan cambios conformacionales que dispara la actividad fusogénica que permiten la fusión entre dos membranas y penetra la nucleocápsida nucleocápsida portando el material genético. Puede haber coreceptor o no, y no se requiere un pH bajo.
Resumen de la ENTRADA A través de la membrana plasmática
A través de endosomas
Entrada directa
Fusión directa
Endocitosis mediada por receptor
1.3. Decapsidación viral
Término que engloba los procesos que tienen lugar después de la entrada, en los que la cápsida se desprende del virión dejando el complejo nucleoproteico expuesto. La cápsida se rompe y los ácidos nucleicos quedan expuestos. Una vez que el genoma está en el citoplasma (más expuesto a la degradación) o entra en el núcleo, el proceso de replicación y expresión depende del virus. Los virus de RNA (+) suelen ser citoplasmáticos citoplasmáticos porque usan los ribosomas del citoplasma citoplasma para comenzar directamente la traducción. Si se trata de virus de DNA irán al núcleo (la mayoría). Entre las fuerzas que desestabilizan desestabilizan a la partícula viral se pueden destacar: Los cambios conformacionales e incluso la pérdida de la cubierta externa durante las etapas de fijación y de entrada. Las condiciones intracelulares, que suelen ser bien distintas a las extracelulares (diferencia de concentraciones de cationes, pH…). •
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Entre los distintos métodos de decapsidación destacamos: Virus del bosque de Semliki: Es un virus de RNA que entra por endocitosis. Cuando rompe la envuelta por el bajo pH, sale la cápsida con el RNA dentro para evitar ser degradado hasta que encuentre los ribosomas celulares. Adenovirus: Reconoce un receptor y entra por endocitosis. La bajada de pH desetabiliza proteínas de la cápsida, pero todavía protege al RNA, siendo transportada por microtúbulos al núcleo, al cual entra por un poro. Poliovirus: El mecanismo de entrada de este virus parece ser: se une a la célula produciendo un cambio conformacional en el virus que forma un poro en la membrana a través del cual el RNA viral es inyectado dentro del citoplasma.
2. Expresión y replicación del genoma viral
La estrategia en la replicación depende de cada familia viral en función del material genético que tenga. Se irá estudiando caso por caso, pero en líneas generales generales podemos decir que: Virus DNA: expresan en primer lugar los genes que codifican proteínas implicadas en replicación; la replicación comienza simultáneamente mientras se siguen transcribiendo genes que codifican las proteínas estructurales que conformarán el virión. Virus RNA: La replicación del genoma y la expresión del material genético están profundamente profundamente imbricados. •
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3. Morfogénesis
Reunión de los componentes necesarios para formar el virión. Puede tener lugar en el núcleo (adenovirus, poliomavirus y parvovirus), en el citoplasma (picornavirus, poxvirus y reovirus). El ensamblaje comienza cuando se alcanzan unos niveles adecuados de los componentes virales (genomas, proteínas y a veces otras moléculas).
Ensamblaje:
Es la etapa en la que el virus pasa a ser infeccioso. Tienen lugar cambios estructurales como consecuencia de procesamiento de proteínas de la cápsida, o cambios conformacionales durante el ensamblaje. Intervienen proteasas virales aunque también pueden jugar un papel otras actividades celulares. La maduración interfiere con la antigenicidad del virión. Maduración:
Virus desnudos:
El ensamblaje se inicia de fuera a dentro. Una vez están las proteínas bien ensambladas cogen el DNA y lo introducen en la cápsida. HSV . Proteínas estructurales estructurales en el citoplasma citoplasma pero se sintetizan sintetizan en el núcleo. Se requiere gran señalización para que luego todas se ensamblen formando la cápsida. Una vez formada toma el DNA que estará en el núcleo. Adenovirus . Se traducen secuencialmente las proteínas en el citoplasma. Se ensamblan en forma de trímeros, adoptando la forma de precápsida. Se irán adicionando proteínas y entrará el material genético para originar el virión maduro. •
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Virus con envuelta:
Virus de la influenza (gripe):
El ensamblaje se produce en el citoplasma. A la vez que hay ensamblaje algunos fragmentos de RNAm traducen HA y NA
que tienen que pasar por el R.E y por el Golgi para poder ir a la membrana y pueda salir el virus (el ensamblaje y maduración es simultáneo). La partícula viral infectiva es la forma madura, una vez que ha salido de la célula y ha adquirido la envuelta. Es un virus de RNA . Se integra en el núcleo y se mantiene latente. En un cierto momento empieza a replicarse y a producir partículas virales. Se encapsida en el citoplasma y se dirige a la membrana donde se envuelve y sale. Para hacerse infectivo tiene que adquirir adquirir la envuelta.
Retrovirus:
4. Liberación de viriones La salida de virones maduros se produce mediante dos mecanismos: Virus líticos (la mayoría de los desnudos): Cuando hay gran cantidad de ellos en el interior celular (núcleo o citoplasma) lisan a la célula y salen. Esta lisis es un proceso gradual, se requieren proteínas virales (se han propuesto las viroporinas ) que modifican y desestabilizan las membranas celulares. Virus con envuelta: Adquieren la envuelta al salir por gemación. Las proteínas proteínas han sido dirigidas por el virus a esa zona de la membrana, para al salir obtenerlas. obtenerlas. •
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5. Tipos de infección viral Se produce la lisis celular con liberación de la progenie viral y la muerte celular. Para que se de esta infección, la célula tiene que ser permisiva, es decir tiene que ser capaz de reconocer e interaccionar interaccionar específicamente con el virus. a) Infección lítica:
La progenie viral producida es muy pequeña o casi nula. En estas infecciones el virus se fija y libera el genoma en el interior de la célula, pero algo falla en las fases posteriores que hacen poco eficiente la formación de partículas virales. El estudio de estas interacciones nos sirve para comprender mejor el funcionamiento de determinados procesos virales. Algunas aplicaciones son: El virus chickenpox infecta células de pollo y produce infecciones abortivas en humanos, por lo que se puede manipular genéticamente y usarse como vector para la vacunación contra distintos parásitos. b) Infección abortiva:
La infección viral provoca el paso de una célula de normal infectada a oncogénica. Los efectos que se producen son: En células que crecen adheridas a un soporte sólido (como los fibroblastos), producen una inhibición por contacto , y dejan de dividirse cuando han alcanzado la confluencia. Se altera su citoesqueleto y la matriz extracelular. Se acidifican el medio. Producen tumores si estas células se inyectan en animales. Los virus que producen estos se llaman virus oncogénicos ( oncogen = gen cuya expresión provoca la transformación transformación celular), los hay tanto de DNA como de RNA. c) Transformación celular: •
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El virus en el interior celular no expresa todo su genoma, con un solo gen (oncogen) es suficiente suficiente para generar la transformación celular. Las células no mueren sino que se induce su división y proliferación descontrolada.
d) Infección crónica:
tipos de infecciones: •
El virus se perpetúa en el huésped sin llegar a matarlo. Se dividen en dos
Persistente
Las células infectadas producen de forma constante viriones infectivos. o Para que el virus se establezca de forma constante ejerce un control sobre el sistema inmune. Desarrollan estrategias que limitan la apoptosis celular. Se generan variantes atenuadas. Infectan células parcialmente permisivas.
o
o o o •
Latente
No se producen viriones infectivos. o El virus libera el material genético al interior celular, pero éste sólo se expresa en parte o incluso permanece totalmente silencioso. o
6. Alteraciones celulares durante la infección viral Alteración celular, bioquímica o morfológica causada en una célula a consecuencia de la infección de un virus:
Efecto citopático (ECP):
1. Cambios morfológicos: •
Estos son muy variados y ocurren prácticamente en cada orgánulo y
estructura celular: Lisis Muerte celular. Cuerpos de inclusión Formación de vesículas en el citoplasma, normalmente el virus engloba allí complejos replicativos, transcripcionales, de ensamblaje… Formación de sincitios Grupos de células fusionadas. Está relacionado con cambios en distintas proteínas de la membrana. Transformación celular. •
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2. Cambios bioquímico:
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Se ven afectados gran cantidad de procesos metabólicos y enzimas a
lo largo de la infección. Inhibición de la síntesis de proteínas celulares. Inhibición de la síntesis del DNA celular. Inhibición de la síntesis del RNA celular. Alteraciones en las membranas celulares.
o o o
Cambios en la actividad de las enzimas. Modificación en el sistema vesicular. Alteración en la permeabilidad de la membrana plasmática.
3. Muerte celular: apoptosis y necrosis
Apoptosis: Muerte celular programada. Se puede ver estimulada estimulada o inhibida según virus. Este proceso consiste en eliminar las células que ya no son necesarias, siendo las caspasas las enzimas que la ejecutan. Las proteínas p53 o E2F1 regulan varios componentes implicados en ciclo celular y estimulan la apoptosis. Consecuencias: Condensación de la cromatina en la periferia del núcleo, reducción del tamaño celular formación de protuberancias en la membrana plasmática disminución en la adhesión celular. La membrana celular no se rompe pero se forman cuerpos apoptóticos. apoptóticos. •
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Necrosis: La célula muere a causa de una agresión externa que provoca un daño en la membrana plasmática: Ruptura de mitocondrias. Cese de la síntesis proteica y ácidos nucleicos. Desorganización general y lisis celular. • • •
