BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Belakang Tantangan antangan terberat terberat di peternakan peternakan ayam adalah munculnya munculnya penyakit, penyakit, sehingga sehingga
pengelolaannya perlu dilakukan secara efisien dan profesional. Penyakit yang menyerang ayam banyak ragam dan seringkali gejalanya hampir sama. Oleh karena itu, peternak membut membutuhk uhkan an pengal pengalama aman n tentang tentang penyeb penyebab ab penyak penyakit it secara secara umum umum sehing sehingga ga dapat dapat membedakan membedakan penampilan ayam yang sakit dengan dengan ayam sehat. Penyebab Penyebab penyakit pada ayam ayam berm bermaca acama mam m maca macam, m, salah salah satu satuny nyaa adala adalah h viru virus. s. Newcastle Disease, Disease, Avian Avian Influenza, Inflamatory Bowl Disease Disease adalah beberapa penyakit yang disebabkan oleh virus dan sering terjadi pada peternakan ayam. Virus merupakan agen infeksi yang dapat menyerang semua hewan. Virus yang menyerang ternak akan mengakibatkan terjadinya penurunan produksi, gangguan sistem reproduksi, reproduksi, dan kematian. kematian. Banyaknya Banyaknya virus yang dapat menginfeksi menginfeksi hewan sehingga diperlu diperlukan kan pemerik pemeriksaan saan serolog serologis. is. Pemerik Pemeriksaan saan serolog serologis is merupa merupakan kan suatu suatu metode metode mendiagnosa mendiagnosa etiologis virus penyebab penyebab infeksi infeksi pada hewan. Pemeriksaan Pemeriksaan serologis serologis dapat dimanf dimanfaatk aatkan an untuk untuk mendet mendeteks eksii antibo antibodi di dengan dengan menggu menggunak nakan an antigen antigen yang yang telah telah diketahui. diketahui. asar dari uji serologis serologis ialah mereaksikan mereaksikan antara antigen antigen dan antibodi dengan menggunakan serum yang merupakan dasar pada reaksi imunologis !"ims, #$$%&. 'ingga 'ingga kini kini ( masih masih merupa merupakan kan penyak penyakit it endemis endemis di beberap beberapaa wilaya wilayah h di )ndonesia. )ndonesia. Berdasarkan laporan inas Peternakan, Peternakan, kejadian yang menonjol menonjol di )ndonesia )ndonesia hing hingga ga kini kini adal adalah ah ( meru merupa paka kan n peny penyak akit it yang yang sang sangat at pato patoge gen n dan dan ting tingka katt mortali mortalitasn tasnya ya masih masih juga juga tinggi tinggi pada pada petern peternaka akan n ayam sektor %. *ecara *ecara umum, umum, ( mengakibatkan depresi, diare, prostration, diare, prostration, oedema kepala dan pial, gejala syaraf, seperti paralysis dan tortikolis, dan gangguan pernafasan !"+-/( dan "++/+0-(, 1233&. 1233&. Turunny urunnyaa produk produksi si telur, telur, diawal diawalii dengan dengan hambat hambatan an produk produksi si telur, telur, bisa bisa juga juga diawali dengan tanda klinis dan kematian pada ayam yang sedang bertelur. 4alur virus ganas mungkin masih bereplikasi bereplikasi pada ayam yang divaksinasi, divaksinasi, tetapi tanda klinis klinis sering tidak kelihatan dalam hubungannya dengan tingkat kekebalan yang dicapai !/55/( dan 5/(+/*T-, 1263&. Tidak ada gejala patologik yang patognomonis !"+-/( dan "++/+0-(, 1233&. Perubahan patologi anatomik yang terlihat nyata biasanya ada perdarahan
pada saluran pencernaan
terutama
proventrikulus, pada permukaan
mukosa mukosanya nya terliha terlihatt bintik bintik7bi 7binti ntik k merah merah dan perdar perdarahan ahan pada pada beberap beberapaa organ organ dalam dalam seperti limpa, jantung, indung telur, dan beberapa organ lainnya.
47
8ji yang relatif mudah untuk mengidentifikasi virus ialah menggunakan uji /gar 4el Presipitation Test !/4PT&. /gar 4el Presipitation Test merupakan uji yang sering digunakan untuk mendeteksi antibodi. Prinsip /4PT ialah mereaksikan antigen yang telah diketahui dengan antibodi yang diuji. Terbentuknya presipitasi merupakan bentuk pengendapan yang menandakan telah terjadi ikatan antara antigen dan antibodi secara spesifik. Oleh karena itu uji serologis dapat digunakan untuk mempelajari penyakit pada unggas yang disebabkan oleh virus dengan cara mengisolasi, mengidentifikasi virus penyebab wabah penyakit pada unggas.
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimana cara prosedur pengujian /4PT test9 #. Bagaimana aplikasi test /4PT sebagai uji serologis pendukung diagnosa9 1.3 Tujuan
1.
8ntuk mengetahui cara prosedur pengujian /4PT test
#. 8ntuk menetahui aplikasi /4PT test sebagai uji serologis pendukung diagnosa
48
BAB 2 TINAUAN PU!TA"A 2.1
Uj# Pres#$#tas# Agar %UPA& atau Agar 'el Pre(#$#tat#)n Test %A'PT&
Tujuan dilakukannya 8P/ adalah untuk mengetahui adanya antigen virus dan antibodi tubuh. Prinsip dari uji 8P/ yaitu adanya ikatan antibodi spesifik dengan antigen yang ditandai dengan adanya garis presipitat. 'al ini disebabkan karena antigen virus berdifusi melalui pori7pori purified semisolid agar dan bereaksi dengan antibodi. Presipitasi antigen oleh antibodi dapat pula terjadi pada medium semisolid yang biasa dipakai
yaitu pure
dengan Double
agar dari Euchemia
Immunodifusion
spinosum.
8ji
Test atau uchterlowy!s
ini
dapat
Double
disebut
juga
Difusion yang
menempatkan antigen antibodi pada agar murni yang terpisah dalam cawan petri. apat ditemukan bahwa antigen7antibodi !/g7/b& menyebar ke dalam agar murni. an pada awal pembentukan pita presipitasi disebabkan karena adanya keseimbangan rasio antara /g7/b. :ika terjadi kelebihan antigen, maka pita presipitasi yang terbentuk akan bergerak mendekati sumuran antibodi. "eskipun terjadi difusi yang radial dari sumuran, pita presipitasi tampak seperti lengkungan diantara sumuran /g7/b. aktor7faktor yang dapat mempengaruhi kondisi pertumbuhan virus adalah ; Ph
49
apat terjadi presipitasi jika media berada pada p' 6,$76,#, sedangkan pada p' <,$7<,< tidak menyebabkan terjadinya presipitasi. 0onsentrasi antigen dan antibodi /danya konsentrasi antibodi yang sesuai dengan konsentrasi antigen dapat menyebabkan terjadinya presipitasi atau immunodifusi di luar sumuran. *uhu Temperatur inkubasi pada reaksi aglutinasi bervariasi, kurang lebih < $7<=$ +. *edangkan pada yang lain pada suhu #6 $ +. 0elembaban "edia agar tidak disimpan dalam lemari es karena agar akan menjadi kering, pada temperature panas media menjadi cair. *ehingga tempat penyimpanan dibuat menyerupai lembah dengan nampan yang diberi kapas dan air. "edia agar "edia yang digunakan adalah media agar semisolid, dapat juga dipakai agar gelatin> silika. ?ang paling umum digunakan adalah agar7agar. /gar7agar menjadi larut atau cair bila dipanaskan pada suhu hampir 1$$$ + dan tetap berbentuk cair bila didinginkan hingga kurang lebih %@$ +. Pada gelatin, jika telah padat dan dipanaskan 1$$$ + untuk mencairkan kembali. Tidak dianjurkan membiarkan medium agar menjadi padat lalu mencairkannya kembali lebih dari # kali karena dapat memberikan hasil yang kurang baik. :arak sumuran :ika jarak terlalu jauh atau tidak sama antara kiri dan kanan dapat mengakibatkan tidak terbentuknya presipitat. 5ama inkubasi Pembentukan ikatan antibodi7antibodi membutuhkan waktu sekitar #7@ hari. :adi jika kurang dari waktu yang ditentukan kemungkinan presipitat belum terbentuk. )nterpretasi dari garis presipitat antara lain ; apat teridentifikasi :ika ikatan antibodi dengan antigen yang sama determinannya pada tiap antigen sampel atau bisa juga dikatakan dua antigen tersebut identik sehingga mereka akan berdifusi dengan kecepatan yang sama dan daerah proporsi optimal akan terdapat pada lokasi yang sama. )dentifikasi parsial 50
:ika terjadi reaksi silang, yaitu dua antigen dapat serupa dan memiliki determinan bersama, sehingga menghasilkan pembentukan pita berbentuk tapal kuda. Tidak teridentifikasi Tidak teridentifikasi terhadap antibodi terpilih sehingga tidak terjadi garis presipitasi yaitu dengan difusi antigen atau antibodi lebih lanjut, pembentukan kompleks solubel akan terjadi, tetapi penyatuan akan dipertahankan, karena pita7 pita terus terbentuk dan larut dengan kecepatan yang sama. :ika sebaliknya dua antigen tersebut berbeda sama sekali, pita7pita akan bersilang.
BAB 3 MET*DE 2.1 +aktu Pelaksanaan
Pemeriksaan identifikasi penyakit secara serologis dilakukan di 5aboratorium Virologi akultas 0edokteran 'ewan 8niversitas /irlangga. Pelaksanaan kegiatan di laboratorium berlangsung mulai tanggal =71@ ebruari #$16. 2.2 Uj# A'PT 2.2.1 Alat ,an Bahan
/lat dan bahan yang digunakan untuk pengujian agar presipitasi ini adalah cawan petri, gelas obyek, gel punch dan kertas hisap. *edangkan bahan yang digunakan antara lain adalah larutan agar !3 gram (a+lA 1,< gram agar (o.1 !ooid&, Buffer *orensen !1$& ditambah 1$$ ml&, antigen dan antibodi standard, antigen dan antibodi yang akan diuji. 2.2.2 Met),e
5arutan agar dituang pada cawan petri dan dibiarkan mengeras. *etelah mengeras dibuat lubang pada agar menggunakan gel punch dengan pola yang sudah ditentukan. *etelah 51
lubang terbentuk, lubang diisi dengan antibodi !/s& !berupa serum& sebanyak $.$#< ml dan pada lubang lainnya diisi dengan antigen !/g& sebanyak $.$#< ml di tepi sesuai pola. *etelah semua lubang terisi, gel diinkubasi selama #% jam pada suhu kamar. *etelah itu dilakukan pengamatan.
BAB - HA!IL DAN PEMBAHA!AN -.1 Has#l Tael -.1 'asil 8ji /4PT
N)
Plate
Reagen
Has#l
1. "late #
/g C
/s (
D
#. "late $
/g (
/s C
D
@. "late %
/s C
/g (
D
52
%. "late &
/g C
/g /)
7
/s (
D
/s /)
D
<. "late '
/g /)
/s C
7
=. "late (
/g C
/s /)
7
6. "late )
/g -*
/s
7
3. "late *
/g C
/s -*
7
-.1.1 Has#l A'PT P)s#t#/
'asil uji /4PT sampel positif ditunjukkan pada /ntigen Newcastle Disease !/g(& yang direaksikan dengan diduga /ntiserum Newcastle Disease !/s(&, /ntiserum Newcastle Disease + /s(& yang direaksikan dengan diduga /ntigen Newcastle Disease !/g(& !lihat 'amar -.1 dan 'amar -.2&. Pada plate /gC yang direaksikan dengan /s( menunjukkan terbentuknya garis presipitasi berwarna putih. 4aris presipitasi tersebut terbentuk akibat adanya reaksi antigen yang homolog dengan antibodi dan menandakan terjadinya ikatan komplek antara antigen dengan antibodi tersebut !lihat 'amar 3.1& !*yukron, #$1@&. 4aris presipitasi tersebut menandakan bahwa /g C yang direaksikan dengan /s( merupakan /g terhadap (.
AsND
AgND
'amar -.1 'asil positif uji /4PT antara /g( dengan /s( yang ditandai dengan adanya garis presipitasi !*umber ; okumentasi pribadi&
Pada plate /sC yang direaksikan dengan /g( menunjukkan terbentuknya garis presipitasi berwarna putih. 4aris presipitasi tersebut terbentuk akibat adanya reaksi antigen yang homolog dengan antibodi dan menandakan terjadinya ikatan komplek antara antigen dengan antibodi tersebut !lihat 'amar -.2& !*yukron, #$1@&. 4aris presipitasi tersebut menandakan bahwa /g C yang direaksikan dengan /s( merupakan /g terhadap (.
53
AgND
As ND
'amar -.2 'asil positif uji /4PT antara /s( dengan /g( yang ditandai dengan adanya garis presipitasi !*umber ; okumentasi pribadi&
Pada plate /sC yang direaksikan dengan /g( dan /g/) menunjukkan hanya terbentuknya garis presipitasi berwarna putih antara sumuran /sC dengan /g(. 4aris presipitasi tersebut menandakan bahwa /s C yang direaksikan dengan /s( merupakan /s yang homolog terhadap /g(, namun /s tidak homolog dengan /g/) sehingga menandakan terjadinya ikatan komplek antara antigen ( dengan antibodi ( !lihat 'amar -.3&
AgND Ag AI
As ND
'amar -.3 'asil positif uji /4PT antara /s( dengan /g( yang ditandai dengan adanya garis presipitasi !*umber ; okumentasi Pribadi&.
Pada plate /gC yang direaksikan dengan /s( dan /s/) menunjukkan terbentuk garis presipitasi antara sumuran yang diisi /s( dengan /gC dan juga terbentuk garis presipitasi antara sumuran yang diisi /s/) dengan /gC. 4aris yang terbentuk sama7sama kuat dan menyambung tanpa ada titik persilangan yang menandakan bahwa antara sumuran yang berisi /s ( dengan /gC dan /s/) dengan /g C memiliki konsentrasi yang sama kuat !lihat 'amar -.-&. Berdasarkan hasil tersebut, terjadi kejanggalan dimana sumuran /s/)
membentuk garis presipitasi dengan /gC sama kuat dengan garis presipitasi yang terbentuk antara sumuran /s( dengan /gC. 'al ini menunjukkan bahwa /s/) selain memiliki /ntibodi terhadap /) juga memiliki /ntibodi terhadap (, atau /gC yang digunakan untuk diuji /4PT memiliki /ntigen terhadap /) dan (. *etelah dianalisa maka hasil /4PT 54
menunjukkan bahwa /gC memiliki antigen ( dan bereaksi dengan /s(. Pada /s/) selain memiliki antibodi terhadap /) juga memiliki antigen terhadap ( sehingga dapat bereaksi dengan /gC yang diduga sebagai /g(. 'al ini sesuai dengan pendapat (atih dkk. !#$1$& yang menyatakan bahwa uji /4PT akan menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan terbentuknya garis presipitasi antara antiserum dan antigen yang homolog, sedangkan tidak terbentuk garis presipitasi pada antiserum dan antigen yang tidak homolog. Pada hasil 8:) /4PT ini disimpulkan bahwa /gC yang direaksikan dengan /s( dengan /s/) menunjukkan bahwa /gC !/g(& homolog dengan /s(.
As AI Ag ND
Ag ND
'amar -.- 'asil positif uji /4PT antara /g( dengan /s( dan /s/) yang ditandai dengan sama7sama adanya garis presipitasi pada masing7masing /ntiserum %*umber ; okumen Pribadi&. -.1.2 Has#l A'PT Negat#/
Pada plate /sC yang direaksikan dengan /g/) dan /s/) yang direaksikan dengan /gC menunjukkan tidak adanya garis presipitasi setelah diinkubasi selama %3 jam !lihat 'amar 3.0&. 'al ini menunjukkan kedua plate tersebut tidak adanya reaksi antara antiserum
dan antigen yang diujikan !tidak homolog&. 'al ini menunjukkan bahwa ada beberapa factor yang mempengaruhi hasil negatif tersebut seperti jarak antar sumuran tidak sama, afinitas dan aviditas antibodi kurang, suhu inkubasi, keasaman p' dan perbandingan antara antigen dan antibodi tidak sama !-rnawati, #$$3&. Pada salah satu plate terbukti bahwa jarak antar sumuran tidak sama yang membuktikan bahwa difusi antigen dan atibodi serta reaksi ikatan Ag AI
antar keduanya As X tidak dapat terjadi dan tidak terbentuk gasris presipitasi. As AI Ag X Ag AI
Ag AI
As As XX
A
55
B
'amar -.0 'asil negatif uji /4PT, !/& /sC dengan /g/) yang ditandai dengan tidak adanya garis presipitasi, !B& /s/) dengan /gC yang ditandai dengan tidak adanya garis presipitasi !*umber; okumentasi pribadi&
Pada plate /sC yang direaksikan dengan /g-* dan /s-* yang direaksikan dengan /gC menunjukkan tidak adanya garis presipitasi setelah diinkubasi selama %3 jam !lihat 'amar -.&. 'al ini menunjukkan kedua plate tersebut tidak adanya reaksi antara antiserum dan antigen yang diujikan !tidak homolog&, akan tetapi hasil tersebut dapat menjadi false negative 0emungkinan terbesar tidak terbentuknya garis presipitasi dari hasil 8ji /4P ini adalah /ntigen -* yang digunakan merupakan antigen -* stok lama atau penyimpanannya sudah terlalu lama, sedangkan antiserum C yang digunakan masih merupakan antiserum baru. *ehingga tidak terjadi ikatan antara antigen -* dengan /ntiserum C tersebut. (amun terdapat beberapa lainnya yang mempengaruhi hasil yaitu afinitas dan aviditas antibodi, suhu inkubasi, keasaman p' dan perbandingan antara antigen dan antibodi !-rnawati, #$$3&.
56
'amar -.. 'asil negatif uji /4PT, !/& /sC dengan /g-* yang ditandai dengan tidak adanya garis presipitasi, !B& /s-* dengan /gC yang ditandai dengan tidak adanya garis presipitasi . !*umber; okumentasi pribadi& -.2 Pemahasan
/gar 4el Presipitasi Test !/4PT& atau uji imunodifusi merupakan teknik yang digunakan untuk menentukan antigen atau antibodi secara kualitatif atau semikuantitatif. *ecara kualitatif hanya mengetahui reaksi positif atau negatif, *edangkan secara semikuantitatif, mengetahui titer antigen atau antibodi dengan cara melakukan beberapa pengenceran yang masih dapat menunjukkan reaksi positif. *elain itu teknik ini juga digunakan untuk mengetahui adanya reaksi silang dari beberapa macam antigen. 4aris presipitasi yang terbentuk dapat berupa garis bersambungan yang berarti antigen identik secara imunologik terhadap serum uji, garis bercabang menandakan antigen berhubungan sebagian dan garis bersilangan menandakan antigen tidak berhubungan Eilson dan Ealker !#$$$&. 4aris presipitasi membentuk taji pada titik pertemuan akan terbentuk apabila dua jenis antigen yang diperiksa mempunyai kesamaan epitop parsial +partial identity- 'asil Agar .el "recipitation Test !/4PT& menunjukkan hasil yang positif pada sampel diduga /ntiserum Newcastle Disease !/sC& dengan /ntigen Newcastle Disease !/g(&, dan juga pada sampel diduga /ntigen Newcastle Disease !/gC& dengan /ntiserum Newcastle Disease !/s(&, dengan jarak antar sumuran sama dengan diameter sumuran, yang ditunjukkan dengan terbentuknya garis presipitasi berwarna putih ! 'amar -.1 ,an -.2&. "enurut Eilson dan Ealker !#$$$& terbentuknya garis presipitasi karena antigen dan
antibodi yang berdifusi bertemu dan membentuk antigen antibodi komplek dimana satu molekul antibodi berikatan silang dengan dua determinan antigen dalam satu waktu dan akan membentuk endapan ikatan komplek antigen antibody. 'asil ini menunjukkan adanya ikatan silang antara semua uji /s( dan /g( . 'asil Agar .el "recipitation Test !/4PT& yang menunjukan hasil negative menunjukan bahwa /ntigen C !/g C& dan /ntiserum C !/* C& tidak memliki kecendurungan homolog dengan /g/)>/s/) dan /g-*>/s-* yang ditunjukan dengan 57
tidak addanya garis presipitasi. 0eberhasilan dalam pemeriksaan dengan menggunakan /4PT dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti adanya afinitas dan aviditas antibodiA 0easamaan !p'&, presipitasi dapat terjadi antara antigen dan antibodi jika media berada pada p' 6,$76,# sedangkan pada p' <,$7<,< tidak menyebabkan terjadinya presipitasi konsentrasi antara antigen dan antibodiA *uhu, reaksi optimal dapat berlangsung pada suhu %o+ atau @6o+A Perbandingan antigen dan antibodi, adanya konsentrasi antibodi yang sesuai dengan konsentrasi antigen dapat menyebabkan terjadinya presipitasi atau immunodifusi diluar sumuranA 0elembaban, reaksi yang berl angsung pada suhu kamar dan inkubator memerlukan kelembaban yang tinggi, untuk mencegah kekeringan larutan sebelum reaksi terjadiA "edia agar, media yang digunakan adalah media agar semisolid, dapat juga dipakai agar gelatin atau silicaA :arak sumuran, jika jarak teralu jauh atau tidak sama anatara kiri dan kanan dapat mengakibatkan tidak terbentuknya presipitatA 5ama inkubasi, pembentukan ikatan antigen dan antibodi membutuhkan waktu sekitar #7@ hari. :adi jika kurang dari waktu yang ditentukan kemungkinan presipitat belum terbentukA dan 0ekuatan ion, larutan penyangga yang dipakai sebaiknya mempunya molaritas kurang dari $.1< ". 0ekuatan ion melebihi $.1< " dapat mencegah terjadinya presipitasi.
BAB 0 PENUTUP
58
0.1 "es#m$ulan
)dentifikasi pada uji /4PT menunjukkan hasil terbentuk garis presipitasi pada antiserum (>antigen ( dengan /ntiserum C>/ntigen C yang menunjukan arti bahwa /ntigenC dan /ntiserum C homolog dengan /ntigen Newcastle Disease dan /ntiserum Newcastle Disease
*edangkan
pada
uji /sC>/gC
terhadap /s/)>/g/)
dan
/s>-*>/g-* menunjukan hasil negative hal ini menunjukan bahwa /sC>/gC tidak homolog dengan /s/)>/g/) dan /s>-*>/g-*.
0.2 !aran
Perlu dilakukan ketelitian praktikan terutama pada saat membuat sumuran dan menuangkan reagen kedalam sumuran, karena ketidak telitian akan menjadikan hasil interpretasi fals negative / fals positif .
DATAR PU!TA"A
59
-rnawati, ., /.P. ahardjo, (.*ianita, ./.antam, dan *uwarno. #$1@. "etun0u1 "ra1ti1um "emeri1saan 2irologi1 dan 3erologi1 5aboratorium Virologi dan )munologi. akultas 0edokteran 'ewan. 8niversitas /irlangga. 127#%. Purchase, '.4. #$$2. A 4aboratory 5anual for the Isolation and Identification of Avian "athogens. Blackwell. Eashington. TiFard ). *erology; The detection and measurement of antibodies. )n; Pedersen , ed. 2eterinary Immunology, An Introduction Philadelphia; EB *aundersA 1233A1#271<<. Eilson 0 dan Ealker :. #$$$. Principles and TechniGues of Practical Biochemistry. -d ke <. 80; +ambridge 8niversity Press.
60
