veštačka oplodnja

S LOBODAN RADULOVI]

ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA U HUMANOJ REPRODUKCIJI

SLOBODA N RADULOVI]


Prvo izdanje

ELI T • MEDICA

ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA U HUMANOJ REPRODUKCIJI Autor Slobodan R. RADULOVI]

Izdava~ ELIT • MEDICA Simina 9a, Beograd, Tel/fax: 011/ 2185-340 e-mail: elitmed @ sezampro.yu Direktor Milu tin Gavrilovi} Urednik Dr Milena Gavrilovi} Lektor i korektor Zora Tvrtkovi} Priprema za {tampu Zo ra Tvrtkovi} Tira` 500 primeraka [tampa ,,Grafolib’’ ISBN 978-886-77222-0073-55

SLOBODAN R. RADULOVI]


ELIT • MEDICA

RECENZENTI: Prof.dr Radmilo Jovanovi} Prof.dr Ratomir Ganovi} Prof.dr Tomislav \oki}

O d l u k o m N a u ~ n o -n nastavnog ve}a Unuverziteta u Pri{tini br.513 od 14. 04. 2005.god. ova knjiga je odobrena kao ud`benik za specijalisti~ku, subspecijalisti~ku i poslediplomsk u nastavu humane reprodukcije.

CIP – Katalogizacija u publikaciji Narodna biblioteka Srbije, Beograd 618 ( 075 . 8 ) RADULOVI] , Slobodan R . Asistirana reproduktivna tehnologija u humanoj reprodukciji / Slobodan R. Radulovi} ; [ saradnici Bojana Savi}evi} ... et al . ]. - Beograd : Elit - Medica, 2007 (Uìce : Grafolib) . - XIV , 407 str . : ilustr . ; 24 sm Tira` 500. - Bibliografija: str. 387 - 401. - Registar . ISBN 978-86-7222-073-5 a) Humana reprodukcija COBISS. SR-ID 143582988

SARADNICI

BOJANA SAVI]EVI], dr sci {ef embriolo{ke laboratorije Specijalne ginekoloske bolnice za le~enje steriliteta, Beograd MARKO BABI], dr sci profesor Stomatolo{kog fakulteta u Beogradu Katedra za biologiju SLAVI[A STANI[I], dr sci profesor ginekologije Medicinskog fakulteta u Pri{tini MIROSLAV OPRI], dr sci profesor patologije KBC "Beànijska kosa" Beograd

IZ R E C E N Z I J E Knjiga ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA U HUMANOJ REPRODUKCIJI predstavlja monumentalno delo, rekao bih enciklopedijsko, iz domena humane reprodukcije. Iako se naslovom vezuje najvi{e za asistiranu reproduktivnu tehnologiju, ono je znatno vi{e i znatno {ire od toga. U knjizi se nalaze sakupljeni podaci iz oblasti reprodukcije ~oveka koji poti~u iz vremena Starog veka, pa se ona prati sve do dana{njih dana. Najzna~ajniji deo knjige, koji je po mi{ljenju recenzenta prvi put kompletno, potpuno i savremeno obra|en u na{oj literaturi, odnosi se na mesto reproduktivne tehnologije u humanoj reprodukciji. Kako se i sam autor ovim metodama dugo godina bavi, jedan od prvih u na{oj zemlji, on je sa posebnom stru~nom ozbiljno{}u, kao veliki znalac, rekao bih, ~ak, sa posebnom ljubavlju pristupio obradi ovog zna~ajnog problema, ne samo za ginekologiju, nego i za dru{tvo, i za dràvu u celini. Uradio je to na najbolji na~in i osvetlio je i prikazao metode koje danas postoje. Kako i sam primenjuje sve ove metode, on je bez te{ko}a ovu materiju pribliìo svim lekarima koji se bave le~enjem steriliteta, ali i svim drugim, koji se za reprodukciju interesuju. Recenzent Prof. dr Radmilo Jovanovi} Predsednik Akademije medicinskih nauka Srpskog lekarskog dru{tva

VI

PREDGOVOR

Knjiga "Asistirana reproduktivna tehnologija u humanoj reprodukciji" pojavljuje se kao rezultat dugogodi{njeg bavljenja tematikom i problematikom plodnosti i ra|anja, i to, u vreme kada se u na{oj medicinskoj literaturi, namenjenoj edukaciji medicinskih stru~njaka, ose}ala velika potreba za jednom knjigom takvog obima i sadràja u kojoj bi obiman materijal iz ove oblasti bio sistematizovan i stru~no - nau~no izloèn. Prate}i veoma sloèna zbivanja na nivou organa, tkiva, }elije, pre svega, spermatozoida i jajne }elije, knjiga zadire u domen molekularne biologije, gde se prikazuje stvaranje, razvoj i funkcija reproduktivnih ~inilaca bez ~ega se ne moè zamisliti razumevanje nastanka novog bi}a homo sapiens-a. Ova knjiga izlazi u trenutku kada u na{oj zemlji, kao i u mnogim drugim dolazi do opadanja broja novoro|ene dece, vi{e osoba umre nego {to se rodi. Depopulacija je problem ne samo ène, porodice i njihovog bliskog okruènja, ve} i zna~ajan, ~ini nam se najva`niji dru{tveni, ali i dràvni problem. U Srbiji se godi{nje ra|a oko 65 000 dece, a umire oko 90 000 lica. Ovaj podatak zabrinjava i sugeri{e neizvesnu budu}nost i opstanak srpskog naroda. Ovo je okvir u koji treba smestiti ovu knjigu, koja nudi ne samo informacije, znanja i predloge, nego ukazuje i put kojim treba usmeriti dalji rad. Danas je preko 15% brakova infertilno. To je podatak koji zabrinjava. Ako medicina uspe da taj procenat smanji, u~ini}e mnogo u borbi protiv depopulacije. Prvi deo knjige posve}en je istorijatu neplodnosti. Predstavljena su prva saznanja iz domena reprodukcije ~oveka. Ovaj problem je interesovao i najzna~anije predstavnike iz stare Gr~ke i starog Rima. Lekari starog Egipta su shvatili da neplodnost moè da se pojavi i kod mu{karaca i kod èna. Prepoznali su ulogu mu{kog ejakulata u nastajanju trudno}e. Treba pomenuti Soranosa iz Efesa koji je bio vode}i ginekolog svog vremena. Radio je u Rimu i pisao je o porodiljstvu i bolestima èna. Lekari ranog Srednjeg veka su se, tako|e, bavili ginekologijom i aku{erstvom, kao Abu Bakr i Avicenna, koji je autor kanona iz domena medicine, ginekologije i aku{erstva. Smatrao je da neplodnost moè nastati i zbog problema psihi~kog porekla ène ili mu{karca. Tu navodi strah, melanholiju i zabrinutost, {to se i danas uzima u obzir kada se razmatraju uzroci neplodnosti. De Graf (1672. god.) je prvi opisao testise, jajnike i folikule, a Leeuwenhoek je 1694. godine otkrio spermatozoide u semenu mu{karca. Pri tome je koristio mikroskop, koji je sam konstruisao i izradio. VII

Razmatraju}i razvoj medicinske nauke posve}ene neplodnosti ukratko su predstavljeni radovi i dostignu}a velikog broja autora: Spallanzani-ja, Hunter-a, Von Baer-a, Sims-a, G. Mendel-a, O. Hertwig-a, H. Fol-a, R. Dickinson-a, Spemann-a, W. Sutton-a, W. Johannsen-a, G. Pinkus-a, O. Avery-a, J. Rock-a, J. Watson-a, F. Crick-a, pa sve do Roberta Edwards-a, embriologa koji je u~estvovao u stvaranju prve bebe iz programa vantelesne oplodnje, zajedno sa Patrick-om Steptoe-m, {to je rezultiralo ra|anjem Louise Brown 1978. godine. O daljem razvoju IVF - in vitro fertilizacije, kao i mnogim modifikacijama te osnovne metode bi}e re~i u ~etvrtom delu ove knjige. U delu o humanoj reprodukciji obra|ena je anatomija reproduktivnih organa sa posebnim osvrtom na reprodukciju }elije i organizma, i u okviru toga, gametogeneza, oogeneza, oocit, folikulogeneza, spermatogeneza, spajanje gameta, oplodnja, ovulacija, kao i transport oplo|ene jajne }elije, sa opisom hormonskih balansa u toku menstrualnog ciklusa, posebno u vreme ovulacije. Pa`nja se posve}uje stvaranju zigota i formiranju embriona, implantaciji sa detaljnim opisom embrionalnog razvoja budu}eg ploda. U tre}em delu o sterilitetu obra|uju se svi danas poznati uzroci bra~ne neplodnosti. Kod ène se navode klasi~ni, ve} dugo poznati etiolo{ki faktori, kao {to su anomalije genitalnih organa, posebno uterusa, koji mogu da poremete, pa ~ak, i onemogu}e reproduktivnu funkciju, zatim miomi materice, endometrioza, infekcije bakterijske i virusne, sindrom policisti~nih ovarijuma, anovulacija, hiperprolaktinemija, hiperandrogenizam, ali i drugi endokrini poreme}aji kao {to su dijabetes melitus, poreme}aj funkcije tireoidne `lezde, poreme}aj na nivou imunoglobulina. Posebno su obra|eni stres, gojaznost i psihosomatski poreme}aj kao etiolo{ki faktor neplodnosti ène. Uzroci neplodnosti kod mu{karca dele se prema mestu nastajanja na pretestikularne poreme}aje, testikularne i posttestikularne uzroke. Posebno se izu~avaju infekcije kod mu{karca, ali i hroni~ne intoksikacije kao {to su pu{enje, alkoholizam i narkomanija. Dijagnostika steriliteta je naredno poglavlje u ovom delu knjige. Primenjuje se i kod mu{karca i kod ène. Postupci su klasi~ni i dobro poznati, moraju da budu kompleksno primenjeni, jer se ~esto otkrivaju udruèni etiolo{ki faktori steriliteta. Pominju se metode: HSG-a, laparoskopija, testovi ovulacije, primena UZ dijagnostike u otkrivanju poreme}aja u funkciji ovarijuma i u otkrivanju anomalija i tumora na materici. Posebno mesto u dijagnostici ima otkrivanje infekcije kod oba partnera. U zadnjem delu ovog poglavlja obra|eno je ispitivanje spermatogeneze, spermograma, kao i mogu}nost mu{karca za optimalni seksualni zivot. Terapija steriliteta zavisi od faktora koji su do njega doveli. Treba odstraniti negativne uticaje koji onemogu}avaju koncepciju i razvoj oplo|ene jajne }elije. Terapija je hirur{ka, medikamentozna. Sve ove metode su obra|ene u svetlu dana{njih savremenih saznanja i savremenih mogu}nosti le~enja: mikrohirurgije, laserske operativne metode, primene hormona i drugi terapijski postupci. êtvrti deo - Asistirana reproduktivna tehnologija obuhvata prikaz svih savremenih postupaka, koji su bitno pobolj{ali rezultate le~enja neplodnosti. VIII

U knjizi se ukazuje i na sve ~e{}e kori{}enje metode transfera embriona u stadijumu blastociste, a posebno se ukazuje na mogu}nosti preimplantacionih genetskih ispitivanja, {to bitno smanjuje incidencu ra|anja plodova sa hromozomskim aberacijama. Obra|ena je i krioprezervacija spermatozoida, oocita, embriona i ovarijalnog tkiva. U knjizi se tretira problem starenja i ìvotnog doba partnera u odnosu na mogu}nosti primene asistirane reproduktivne tehnologije. Pri tome se ukazuje na metode koje se sve vi{e koriste kao {to je donacija gameta i kori{}enje surogat majke. Poglavlje u ~etvrtom delu knjige se odnosi na komplikacije u programu asistirane reproduktivne tehnologije. O svim komplikacijama se otvoreno i op{irno govori. Na vlastitom materijalu u vremenu od 2000. do 2005. godine analiziraju se otkrivene hromozomske aberacije u 0,83% slu~ajeva, u odnosu na op{tu populaciju, gde je aberacija bilo 0,10%. Zna~ajno poglavlje ovog dela knjige je pregled rezultata asistirane reprodukcije u okviru parametara visokog kvaliteta ESHRE. Poseban odeljak knjige je posve}en prostoru, opremi, za{titi i uslovima rada laboratorije za primenu asistirane reproduktivne tehnologije. Svi propisani uslovi u laboratoriji moraju biti do detalja ispunjeni da bi se mogao ostvariti o~ekivani uspeh. Selektivnoj redukciji fetusa kod nastale plurifetalne trudno}e posve}ena je u knjizi posebna pa`nja. Obra|ena su nova saznanja o stem }elijama, koje }e imati sve ve}i zna~aj u re{avanju posebnih oblika neplodnosti. Na kraju ~etvrtog dela knjige obra|en je eti~ki pristup programu asistirane reproduktivne tehnologije. Izraàvam svoju duboku zahvalnost saradnicima koji su zajedno sa glavnim urednikom uloìli maksimum truda, znanja, sopstvenog iskustva u postizanju vidnih rezultata u ovoj zna~ajnoj oblasti ~ovekovog ìvota. Po Hipokratu, "svaka bolest ima fizi~ki i racionalni razlog, a telo se mora tretirati kao celina". [irenje lekarske pomo}i kroz razvoj medicine kao nauke, sve vi{e uliva nadu i optimizam neplodnim ènama, i mu{karcima, da lek i lekarska pomo} postoji, a stru~nim poslenicima omogu}ava sticanje novih saznanja, u ~emu se o~ituje pun doprinos svih autora u stvaranju ovog dela. Svoju zahvalnost dugujem eminentnim recenzentima, ~iji su saveti zna~ajno uticali pobolj{anju kvaliteta knjige. I na samom kraju, posebno se zahvaljujem izdava~koj ku}i Elit - Medica, koja je uloìla dosta rada i sredstava, kako bi ova knjiga, na obostrano zadovoljstvo, ugledala svetlo dana.

Dr sci. dr Slobodan R. Radulovi}

IX

SADR@AJ

DEO I ISTORIJAT ..................................................................................................... 3

DEO II HUMANA REPRODUKCIJA ................................................................... 21 A. REPRODUKCIJA ]ELIJE ........................................................................... 21 B. REPRODUKCIJA ORGANIZMA ................................................................ 23 1. GAMETOGENEZA ........................................................................................... 23 1.1. Oogeneza .................................................................................................24 1.1.1. M i t o z a ............................................................................................... 24 1.1.2. M e j o z a ...............................................................................................26 1.1.3. H r o m o z o m i u t o k u m e j o t i ~ k e d e o b e ...............................................30 1.1.4. K o m p e t e n t n o s t i s a z r e v a n j e o o c i t a ................................................. 34 1.1.5. A p o p t o z a } e l i j a o v a r i j u m a .............................................................. 41 1.2. Folikulogeneza .......................................................................................42 1.3. Interakcije oocit - granuloza .................................................................. 44 1.4. Spermatogeneza ..................................................................................... 56 2. SPAJANJE GAMETA - OPLODNJA ................................................................... 57 2.1 . Ovulacija ............................................................................................... 58 2.2. Transport oocita .................................................................................... 59 2.3. Cervikalni kanal u vreme ovulacije ...................................................... 60 2.4. Promene na spermatozoidu u toku oplodnje ........................................ 61 2.5. Formiranje ovuma ................................................................................. 64 2.6. Formiranje zigota ................................................................................... 64 2.7. Formiranje embriona ............................................................................. 66 2.8. Spontani hatching ................................................................................. 67 2.9. Migracija embriona kroz tubu .............................................................. 68 2.10. Genomski imprinting ............................................................................ 68 3. IMPLANTACIJA ........................................................................................... 77 3.1. Molekularni aspekti implantacije ......................................................... 86 4. EMBRIONALNI RAZVOJ ................................................................................ 89 XI

DEO III STERILITET ................................................................................................. 93 1. POREME]AJI @ENSKE PLODNOSTI .................................................... 94 1.1. Miomi i sterilitet .................................................................................... 95 1.2. Endometrioza i sterilitet ......................................................................... 97 1.3. Infekcije kod ène i njihov zna~aj u sterilitetu ......................................100 1.4. Gojaznost, poreme}aji ishrane i sterilitet ..............................................112 1.5. PCO- policisti~ni ovarijumi i PCOS - policisti~ni ovarijalni sindrom .....119 1.6. Disfunkcija lutealne faze i sterilitet ......................................................126 1.7. Tiroidna `lezda i neplodnost .................................................................127 1.8. Zna~aj hiperprolaktinemije kod neplodnih èna ....................................128 1.9. Imunoglobulini, njihova funkcija i sterilitet .........................................129 1.10. Stres i sterilitet ...................................................................................... 132 1.11. Psihosomatski aspekti steriliteta ............................................................133 2. POREME[AJI MU[KE PLODNOSTI .....................................................135 2.1. Pretestikularni uzroci ............................................................................136 2.2. Testikularni uzroci ................................................................................140 2.3. Posttestikularni uzroci ...........................................................................145 2.4. Infekcije kod mu{karca i njihov zna~aj za sterilitet .............................146 3. DIJAGNOSTIKA STERILITETA ............................................................150 3.1. Dijagnostika steriliteta kod ène ...........................................................150 3.1.1. Trodimenzionalna transvagina lna sonografija u reproduktivnoj medicini ........150 3.1.2. Histerosalpingografija .........................................................................154 3.1.33. Laparoskopija .....................................................................................155 3.1.4. Histeroskopija .................................................................................... 161 3.1.5. Sonohisterosalpingografija ..................................................................162 3.2. Analiza ejakulata .................................................................................. 162 3.3. Pregledi oba partnera ............................................................................167 3.33.1 . Molekularno biolo{ka dijagnostika .....................................................167 3.4. EBM - evidenciono bazirana medicina .................................................167 4. TERAPIJA STERILITETA .......................................................................168 4.1. Operativna terapija ...............................................................................168 4.2. Alternativne i fizikalne metode le~enja ................................................173

DEO IV ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA 1. IN VITRO FERTILIZACIJA .............................................................................177 1.1. Stimulacija folikulogeneze ...................................................................178

XII

1.2. Endometrijum u stimulisanom ciklusu ..................................................182 1.3. Punkcija i aspiracija folikula i kompentencija oocita ...........................186 1.4. Identifikacija oocita ...............................................................................187 1.5. Priprema sperme ....................................................................................188 1.6. Fertilizacija ............................................................................................197 1.7. Procena embriona i fragmentacija .........................................................198 1.8. Asistirani hatching .................................................................................203 1.9. Preimplantaciona genetska dijagnostika ................................................205 1. 10. Embriotransfer ........................................................................................210 1.11. Luteal support ........................................................................................ 211 2. ARTEFICIJALNA INSEMINACIJA ....................................................................213 3. ICSI - INTRA CITOPLASMATIC SPERM INJECTION ........................................216 4. TESE - TESTICULAR SPERM EXTRACTION .....................................................224 5. IVM - IN VITRO MATURATIO .........................................................................226 6. GENETIKA MUSKE NEPLODNOSTI, EVOLUCIJA X I Y HROMOZOMA I MOGU]NOST PRENOSA NEPLODNOSTI NA BUDU]E GENERACIJE .......................234 7. BIOHEMIJSKI PREDIKTORI ISHODA IN VITRO FERTILIZACIJE .......................251 8. KRIOPREZERVACIJA SPERMATOZOIDA ........................................................ 272 9. KRIOPREZERVACIJA OOCITA, EMBRIONA I OVARIJALNOG TKIVA ...............277 10. VITRIFIKACIJA OOCITA, EMBRIONA I OVARIJALNOG TKIVA .........................283 11. PROCES STARENJA I ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA .................288 12. PROCENA OVARIJALNE REZERVE .................................................................307 13. POF - PREMATURE OVARIAN FAILURE ..........................................................311 14. DONACIJA GAMETA I EMBRIONA .................................................................. 313 15. SUROGAT MAJKA ..........................................................................................315 16. KOMPLIKACIJE PROGRAMA ASISTIRANE REPRODUKTIVNE TEHNOLOGIJE ... 317 17. OHSS - OVARIAN HYPERSTIMULATION SYNDROME ....................................318 18. HIDROSALPINKS I ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA ................329 19. ELEKTIVNA REDUKCIJA FETUSA .................................................................. 331 20. UÊSTALOST HROMOZOMSKIH ABERACIJA KOD NA[IH PACIJENATA U PERIODU 2000 - 2005 GODINE ................................................332 21. STATISTI^KI PREGLED REZULTATA ASISTIRANE REPRODUKTIVNE TEHNOLOGIJE U EVROPSKIM ZEMLJAMA .........................341 22. PROFILAKSA INFEKCIJE U PROCEDURI ASISTIRANE REPRODUKTIVNE TEHNOLOGIJE ...................................................................356 23. KLINI^KA IN VITRO FERTILISATION LABORATORIJA ...................................359 24. POLSCOPE - SPINDLE VIEW IMAGING SYSTEM ............................................. 372 25. STEM ]ELIJE ..................................................................................................376 26. ETI^KI PRISTUP PROGRAMIMA ASISTIRANE REPRODUKTIVNE TEHNOLOGIJE ....382

SKRA]ENICE ..................................................................................................383 LITERATURA ..................................................................................................387 INDEX ................................................................................................................402 XIII

I DEO ISTORIJAT

3

ISTORIJAT Istorija bra~ne neplodnosti po~inje u trenutku kada je ~ovek postao svestan prirodnog procesa reprodukcije i suo~io se sa problemima u vezi sa tim. Prate}i po~etke razumevanja ovog procesa kroz istoriju kao i prve korake razvoja lekarske pomo}i, idemo u korak sa razvojem medicine i civilizacije od samoga po~etka do dana{njeg dana. Plodnost i ra|anje su oduvek bile oblasti ìvota koje su zaokupljale ~ovekovo interesovanje. Prate}i kroz razli~ite periode istorije poku{aje shvatanja reprodukcije i ra|anja do dana{njeg dana, mi istovremeno u~imo, ne samo o razvoju civilizacije i tehnologije, ve} i o velikim ljudima svoga doba, vizionarima i nau~nicima, koji su nam, gledaju}i u budu}nost uz ~este individualne `rtve i nerazumevanje okoline, omogu}ili da budemo u medicinskoj nauci gde smo sada. To je isto tako i uputstvo

mladim lekarima o humanosti i po`rtvovanju. Ako mi danas, posle toliko vekova, ponavljamo i verujemo Hipokratovim re~ima, pozivaju}i se na ista na~ela i ideje, u vremenu tehnolo{ke ekspanzije i neverovatnog nau~nog huka, revolucionarnih otkri}a i svakodnevnih promena u ìvotu svakog pojedinca i sveukupne nauke, shvati}emo da je to zahvaljuju}i na{im korenima iz pro{lih vekova i na{im precima koji su nam to omogu}ili. Mi koji smo danas tu, moramo isto tako da se okrenemo budu}nosti koju otvaramo svakodnevnim predanim radom i u~enjem. Lekari starog Egipta su shvatali da neplodnost moè da se pojavi i kod mu{karaca i kod èna. Tako|e su prepoznali ulogu mu{kog ejakulata u trudno}i. Ve}ina njihovih lekova za neplodnost je, neznatno modifikovana, kori{}ena vekovima.

Sl. 1.1.- Lekari starog Egipta

4

Asistirana reproduktivna tehnologija u humanoj reprodukciji

Hipokrat (460-377 p.n.e.) se smatra ocem medicine. On je verovao da svaka bolest ima fizi~ki i racionalni razlog i da telo mora da se tretira kao celina. Objavio je dela koja uklju~uju prirodu èna i ènskih bolesti. Tretmani koji su opisani u ovim delima su brojni.

Sl. 1.2.- Hipokrat

Aristotel (384-322 p.n.e.) je bio poznat po postavljanju pitanja, da li embrion oduvek postoji, ili se stvara seksualnim ~inom reprodukcije.

Sl. 1.3.- Aristotel

Soranus iz Efesa (98-177 n.e.) je bio vode}i aku{er i ginekolog svog vremena. U~io je u Aleksandriji, radio u Rimu, pisao o aku{erstvu i bolestima èna i ginekologiji. Verovao je u nau~no istraìvanje, a ne u oslanjanje na magiju i rituale. Prvi je pisao o kontracepciji. Njegova knjiga je preporu~ivala vaginalne vunene ~epove i primenu maslinovog ulja, meda, smole kedra, aluma, smole balzamovog drveta ili belog olova radi spre~avanja prolaska sperme do uterusa. Galen (129-199) je deo svog ìvota proveo u Rimu kao lekar imperatora. On je priznat kao najbolji lekar antike posle Hipokrata. Njegove anatomske studije ìvotinja i zapaànja o funkcionisanju ljudskog tela su dominirale medicinskom teorijom i praksom tokom 1400 godina. Posedovao je i znanja iz filozofije koja su imala veliki uticaj na njegove tretmane i medicinsku praksu.

Sl. 1.4.- Galen

5

I Deo: Istorijat

Abu Bakr Muhammad Bin Zakarya ArRazi, Rhazes (864-930) je bio verovatno najve}i lekar islamskog sveta u ranom srednjem veku. Bio je doktor koji je pisao i istraìvao razne medicinske teme, uklju~uju}i i aku{erstvo. Njegovo najzna~ajnije delo je Al-Havi, medicinska knjiga koja se bavi svim znanjem o bolestima i le~enju iz njegovog vremena. Abu Ali Al-Hussain Ibn Abdallaj Ibn Sina – Avicenna (981-1037) je autor al-quanun fi al-Tibb medicinskih kanona koji predstavljaju veliki rad medicinske nauke. Rad je preveo na latinski Gerard iz Kremone u XII veku. Ovaj rad je bio osnovna medicinska knjiga sve do XVII veka. Knjiga je sadràla vredne informacije o ginekologiji. On je shvatio da neplodnost moè biti mu{kog ili ènskog porekla, povezano sa abnormalno{}u semena mu{karca, ili raznih patolo{kih stanja kod ène. Smatrao je da uzrok toga moè biti poreme}aj genitalnog trakta, ili psiholo{ki problemi, melanholija, strah, pa je prepisivao brojne lekove inspirisane egipatskim.

Sl. 1.5.- Rhazes

Sl. 1.6.- Avicenna

1512. godina: Lekari srednjeg veka su neplodnost, uglavnom, posmatrali kao kaznu od Boga zbog nepo{tovanja bra~nog zaveta, ili uìvanja u seksu. Seks je po njima sluìo razmnoàvanju, a ne uìvanju. 1512. godina: Arnaud de Villeneuve je napisao „Le tresor des pauvres qui parle des maladies qui peuvent venir au corps humain“, gde je prepisao tehniku koju su prvo koristili stari Egip}ani. Identifikovao je nekoliko razloga neplodnosti. Tvrdio je da je gojaznost, jer „salo gu{i ljudsko seme“, jedan od razloga neplodnosti. Sl. 1.7.- Arnaud de Villeneuve

6


1543. godina: Andreas Vesalius je objavio atlas “Humani Corporis Fabrica’’, gde je prikazao popre~ni presek ènske anatomije i pravilno opisivao vezu izme|u deteta i majke kroz pup~anu venu.

Sl. 1.8.- Andreas Vesalius

Sl. 1.9.- Bartolomeo Eustachio

Sl. 1.10.- Villiam Harvey

1552. godina: Bartolomeo Eustachio, Vesalius-ov u~enik je opisao uterus i njegove sudove.

1651. godina: Villiam Harvey, anatom i lekar, je izneo novu teoriju, slede}i Aristotela, prema kojoj se specijalizovane strukture pojedinca razvijaju korak po korak iz nespecijalizovanih prete~a u jajetu, ali koje ljudi moraju da reprodukuju kroz spajanje jajeta i sperme. Ovo je bilo poznato kao teorija epigeneze. Sumirao je svoje istraìvanje kao „ex ovo omnia“ (sve poti~e iz jajeta). Ovo otkri}e se pojavilo 200 godina pre nego {to je otkrivena jajna }elija sisara, ali Harvey-eva teorija je bila toliko dobro promi{ljena da je ~itav svet pretpostavio da je on u pravu mnogo pre nego {to je do{lo do stvarnog otkri}a.

1663. godina: Robert Hooke je prvi opisao }elije.

Sl. 1.11.- Robert Hooke

7

I Deo: Istorijat

1672. godina: Regnier de Graaf (De Mullerium Organis, 1672) je prou~avao anatomiju mu{kih genitalija pravilno opisuju}i testise. U isto vreme je opisao jajnik i folikularnu funkciju. Jedina njegova gre{ka u ovom predstavljanju je ta {to je pogre{no interpretirao folikul kao jaje.

Sl. 1.12.- Regnier de Graaf

1677. godina: Anton von Leeuwenhoek je prona{ao mikroskop. Kada je njegov student doneo uzorak, otkrio je spermatozoide.

Sl. 1.13.- Anton von Leeuwenhoek

1694. godina: Niklas Hartsoeker (16561725) je nacrtao spermatozoid koji je otkrio Fon Leuvenhek. Hartsoeker je, me|utim, izjavio da su spermatozoidi sadràvali ve} formiran embrion.

Sl. 1.14.- Prva slika spermatozoida Niklas Hartsoeker

8


1707. godina: Martin Nabot je objavio raspravu o neplodnosti “De Sterilitate’’, u kojoj je tvrdio da ovarijalna skleroza i blokada tuba mogu biti uzroci neplodnosti.

Sl. 1.15.- Jajna }elija prikaz Albrecht von Haller

Sl. 1.16.- Pierre Louis Moreau de Maupertius

1751. godina: Pierre Louis Moreau de Maupertius (1698-1759) je napisao „Systeme de la nature“ koji je sadràvao teorijsku raspravu o prirodi biparentalnog nasledstva zasnovanu na njegovoj studiji pojave polidaktilije kod nekoliko generacija jedne berlinske porodice. Pokazao je da polidaktilija moè da se prenese, bilo sa oca ili sa majke, i objasnio ovu naslednu crtu kao rezultat mutacije u naslednim ~esticama koje poseduju roditelji. Tako je pruìo prvi nau~ni zapis prenosa dominantnih naslednih osobina kod ljudi. 1759. godina: Nema~ki anatom Kaspar Friedrich Wolff je prou~avao razvoj pili}a i izvestio je da organi poti~u od nepromenljivog materijala.

Sl. 1.17.- Kaspar Friedrich Wolff

Osnovni potencijal i organizaciona struktura organizma su odre|eni genetskom konstitucijom oplo|enog jajeta.

1769. godina: Giovanni Battista Morgagni u „Izvori{tu i uzroku bolesti“, identifikuje razli~ite razloge neplodnosti, uklju~uju}i folikularno odsustvo, ageneziju, abnormalnosti vagine ili spoljnih genitalnih organa i aplaziju uterusa. Sl. 1.18.- Giovanni Battista Morgagni

I Deo: Istorijat

9

1780. godina: Italijanski sve{tenik i nau~nik, Lazzaro Spallanzani (1729-1700) je razvio tehnike ve{ta~ke inseminacije pasa. Identifikovao je proces reprodukcije kod ìvotinja. On je, tako|e, bio prvi koji je istraìvao uticaje niske temperature na ljudsku spermu.

1785. godina: Prve poku{aje humane inseminacije obavio je John Hunter (17281793), {kotski hirurg. Rezultat je bio ro|enje deteta iste te godine. Kod londonskog trgovca ode}om, koji je patio od hipospadije, Hunter je predloìo da prikupljenu spermu injektuje u vaginu njegove ène, pomo}u {prica. 1827. godina: Karl Ernst von Baer je prvi pokazao jajnu }eliju sisara. ]elije sperme je smatrao za entozoe, tj. parazite i nazvao ih je spermatozoidima.

Sl. 1.19.- Lazzaro Spallanzani

Sl. 1.20.- John Hunter

1840. godina: Martin Barry (18021855) je objavio rad u kome je utvrdio da spermatozoid ulazi u jajnu }eliju. 1866. godina: Marion Sims (18131883), opisan kao jedan od o~eva ameri~ke ginekologije, je objavio klini~ke bele{ke hirurgije materice sa posebnim osvrtom na sterilitet. U ovom radu Sims je objasnio da neplodnost i dismenoreja imaju zajedni~ko poreklo, cerviksnu stenozu, pa je preporu~io da sterilitet treba tretirati buìranjem cerviksa. Smatrao je da lo{a pozicija materice doprinosi neplodnosti i preporu~io je manualni tretman. Sims je obavio 55 inseminacija kod 6 èna sa abnormalnim cerviksima i kod jedne je do{lo do trudno}e.

Sl. 1.21.- Karl Ernst von Baer

Sl. 1.22.- Marion Sims

10


Nizak stepen uspe{nosti je bio rezultat ~injenice da je spermu njihovih muèva bez kontrole smatrao normalnom, a inseminacije nisu obavljene u optimalnom trenutku ovulacije.

Sl. 1.23.- Gregor Mendel

1886. godina: Gregor Mendel objavljuje „Teoriju nasle|ivanja“ gde navodi da su fizi~ke karakteristike pod kontrolom naslednih faktora datih u paru. Ti faktori se tokom stvaranja gameta razdvajaju i slobodno kombinuju sa naslednim faktorima drugog roditelja, daju}i potomstvo koje li~i na roditelje. 1875. godina: Oscar Hertwig je zaklju~io nakon ispitivanja reprodukcije morskog jeà da se oplodnja, i kod ìvotinja i kod biljaka, sastoji od fizi~kog ujedinjenja dva nukleusa koje obezbe|uju mu{ki i ènski roditelj.

Sl. 1.24.- Oscar Hertwig

1877. godina: Herman Fol (1845-1892) je posmatrao kako spermatozoid morske zvezde ulazi u jajnu }eliju. Mogao je da vidi transfer netaknutog nukleusa spermatozoida u jajnu }eliju gde je postao mu{ki pronukleus, o ~emu je objavio rad.

Sl. 1.25.- Herman Fol

Sl. 1.26.- Robert Latou Dickinson

1884. godina: William Pancoast (18151883) je obavio prvi potvr|eni slu~aj terapeutske inseminacije donorskom spermom. 1890. godina: Robert Latou Dickinson je po~eo da eksperimenti{e sa donorskom spermom, mada je njegov rad, uglavnom, obavljan u tajnosti. Napisao je brojne radove o reproduktivnom sistemu i tehnikama pora|anja, uklju~uju}i „Podizanje i manipulisanje matericom kroz abdominalni zid radi kontrole postpartalnog krvarenja“ 1899. godine.

I Deo: Istorijat

11

Walter Heape (1855-1928) je bio prvi koji je izvukao preimplantacioni embrion zeca i prebacio ga u surogat majku u kojoj je nastavljen normalni razvoj. Smatra se pionirom reproduktivne tehnologije. Njegov rad „Preliminarna bele{ka o transplantaciji i rastu jajne }elije sisara u materici surogat majke“ je ohrabrio druge da ispitaju mogu}nosti uzgajanja embriona u laboratoriji. 1901. godina: Hans Spemann (18691941) je podelio dvo}elijski embrion na dva dela, uspe{no stvaraju}i dve larve. Kasnije, 1938. godine Spemann je teoretisao da ìvotinje mogu da se kloniraju spajanjem }elije embriona sa jajnom }elijom.

Sl. 1.27.- Hans Spemann

1902. godina: Hromozomalna teorija nasle|ivanja je objavljena od strane Walter Sutton-a (1877-1916), zasnovana na zapaànjima da tokom mejoze svaki spermatozoid ili jajna }elija prima po jedan hromozom svakog tipa. 1906. godina: Objavljen je termin genetika. Sl.1.28.- Walter Sutton

1909. godina: Danski botani~ar Wilhelm Ludwig Johannsen (1857-1927) je prvi upotrebio re~ gen da opi{e Mendelian-ovu jedinicu nasle|ivanja. Gen je nastao od gr~ke re~i koja ozna~ava ro|enje. 1937. godina: Ideja in vitro oplodnje tj. IVF - in vitro fertilisation je predloèna u uvodnom ~lanku „Za~e}e u staklenoj posudi“ u medicinskom ùrnalu Nove Engleske. 1938. godina: Uspe{no zamrznuta sperma.

Sl. 1.29.- Wilhelm Ludwig Johannsen

12


1939. godina: Gregory Goodwin Pincus (1903-1967) je bio prvi koji je objavio kako oociti raznih ìvotinja prolaze kroz fazu sazrevanja u in vitro uslovima. Poku{ao je da isto uradi sa ljudskim oocitima uz predvi|anje da }e sazrevanje trajati 12 ~asova. Njegov rad „Jajne }elije sisara“ je objavljen 1936. godine.

Sl. 1.30.- Gregory Goodwin Pincus

1941. godina: Termin „genetski inènjering“ je iskovan od strane danskih mikrobiologa.

1943. godina: Oswald Avery (18771955) demonstrira da hemijsku prirodu gena ~ini DNK molekul.

Sl. 1.31.- Oswald Avery

1944. godina: Harvardski istraìva~ John Rock (1890-1984) je oplodio ~etiri ljudska oocita u laboratorijskoj posudi. Iako embrioni nikada nisu bili vra}eni u matericu, ovaj eksperiment je bio prva in vitro oplodnja u istoriji.

Sl. 1.32.- John Rock

1949. godina: Linus Pauling (19011994) pokazuje da je srpasta anemija nasledno oboljenje koje nastaje mutacijom na genu koji kontroli{e sintezu hemoglobina. Otkri}em iz 1957.god. ispostavilo se da zamena samo jednog nukleotida u genu dovodi do zamene jedne amino kiseline u polipeptidnom lancu, ~ime se zna~ajno naru{ava izgled eritrocita i transportna funkcija hemoglobina. 1951. godina: Otkrivena je kontraceptivna pilula.

Sl.1.33.- Linus Pauling

13

I Deo: Istorijat

1953. godina: Objavljen je izve{taj od strane Raymond G. Bunge (1908-1998) i Jerome K. Sherman-a sa detaljima prve ~etiri uspe{ne trudno}e nakon upotrebe zamrznutih spermatozoida koji su ~uvani u suvom ledu na -80°C, zamrznutih uz pomo} glicerola kao krioprotektanta. Struktura DNK - deoksiribonukleinske kiseline, kao dvostruke spirale, je otkrivena od strane James Watson-a (1928- ), Francis Crick (1916-2004) i Rosalind Franklin (1920-1958). Watson i Crick su dobili Nobelovu nagradu 1962. godine.

Sl. 1.34.- Jerome K. Sherman

Sl. 1.36.- James Watson

Sl. 1.37.- Francis Crick

Sl. 1.35.- Prvi model DNK– deoksiribonukleinske kiseline Sl. 1.38.- Rosalind Franklin

14


Sl. 1.39.- Joe Hin Tjio

Sl. 1.40.- Jerome Lejeune

Sl. 1.41.- Robert Edwards

Sl. 1.42.- Patrick Steptoe

1955. godina: Joe Hin Tjio (1916-2001) otkriva da postoji 23 para ljudskih hromozoma {to se smatra po~etkom moderne humane citogenetike. 1959. godina: Jerome Lejeune (19261944), francuski lekar i geneti~ar, otkriva da kod Down-ovog sindroma u somatskim }elijama postoji jedan hromozom vi{e. Kasnije je na|eno da je u pitanju vi{ak hromozoma 21. 1964. godina: Jerome K. Sherman je izvestio o prvim trudno}ama koje su rezultat upotrebe sperme koja je zamrznuta u te~nom azotu na - 196°C, umesto u suvom ledu. 1966. godina: Ljudski oociti su prikupljeni laparotomijom. Utvr|eno je da je {ifra za sintezu proteina, geneti~ki kod, sadràna u tripletima azotnih baza i da su razli~ite kombinacije samo ~etiri azotne baze u tripletima odgovorne za razli~it redosled amnokiselina svih proteina. 1969. godina: Enzim je po prvi put sintetizovan in vitro. Robert Edwards (1926- ), engleski embriolog koji }e u~estvovati u stvaranju prve „bebe iz epruvete“, objavljuje ~lanak o arteficijalnoj oplodnji humanih jajnih }elija. 1972. godina: Napravljeni prvi snimci ènske karlice pomo}u ultrazvuka, ~ime se pomoglo u identifikaciji morfologije materice i jajnika. 1973. godina: Prva IVF - in vitro fertilisation trudno}a na svetu objavljena u Australiji, ali se okon~ala ranom smr}u embriona. 1978. godina: Louise Brown, prva „beba iz epruvete“, je ro|ena u Engleskoj. To je bio 104. poku{aj doktora Patrick-a Steptoe-a (1913-1988) i embriologa Robert-a Edwards-a.

15

I Deo: Istorijat

1980. godina: Prvi me|unarodni sastanak o IVF - in vitro fertilisation, odràn u Nema~koj. 1982. godina: Planiraju se prvi eksperimenti sa transferom ljudskih gena u kojima se nova DNK - deoksiribonukleinska kiselina inkorporira u genom }elije jednog organizma. Namenjeni kao terapija za le~enje bolesti, novi geni se ubacuju u somatske }elije pacijenata. Prva odobrena procedura genske terapije se desila osam godina kasnije, 1990. godine, na detetu sa te{kom kombinovanom imunolo{kom deficijencijom. Formira se prva Gen banka, sa bazom podataka genske sekvence koja je javno dostupna nau~nicima. 1983. godina: Ostvarenje prve trudno}e koja je rezultat doniranja oocita. Sperma mu{kog partnera bra~nog para le~enog od steriliteta je uba~ena u cerviks ènskog donora jajne }elije. Kada je do{lo do oplodnje, embrion je transferiran u matericu ènskog partnera. Dve trudno}e su rezultovale iz pet transfera embriona. Tako|e je obavljen prvi uspe{an transfer ljudske sperme i oocita u falopijeve tube radi oplodnje GIFT - gamete intrafallopian transfer. Tretirane su ~etiri ène, a dve su zatrudnele. Jedna je pobacila, a jedna iznela trudno}u. Razvijen je prvi genetski test za Huntington-ovu bolest. Ovo je bilo prvo nasledno oboljenje koje je mapirano. Utvr|eno je da se mutirani gen, odgovoran za nastanak ove bolesti, nalazi na ~etvrtom hromozomu. Gen je izolovan 10 godina kasnije. Lucinda L. Veeck je objavila ro|enje prve bebe nakon IVM – in vitro maturation sa stimulisanim ciklusom. 1984. godina: Ostvarena prva trudno}a kao rezultat upotrebe zamrznutog embriona

u bolnici Queen Victoria u Melburnu od strane Alan-a Trounson i Linda-e Mohr. Ime bebe je Zoe Leyland.

Sl. 1.43.- Alan Trounson

1985. godina: U Australiji ro|eni prvi IVF - in vitro fertilisation blizanci iz zamrznutih embriona. 1986. godina: Na sastanku ESHRE – european society for human reproduction and embryology koji je odràn u Briselu, predsedavaju}i Jean Cohen je rekao: Govor stvaralaca beba iz epruveta je neobi~na me{avina etike i embriologije, politike i tehnologije. Evropski lekari se sada trude da se dogovore o svemu ovome, jer su ubrzani strahom od pojave zakonske regulative. Zapo~eto je zamrzavanje humanih jajnih }elija radi oplodnje. Blizanci, de~ak i devoj~ica, su ro|eni kao rezultat upotrebe zamrznutih jajnih }elija u Adelaidi, u Australiji. Proces je prvi izveo Dr Christopher Chen u Flinders medical centre. Ameri~ka Administracija za hranu i lekove odobrava prvu humanu vakcinu dobijenu genetskim inènjeringom za spre~avanje hepatitisa B.

16


1987. godina: Predloèn je projekat ljudskog genoma za identifikaciju svih ljudskih gena. Patentirana je procedura transfera embriona ~ime je zapo~eo trend patentiranja procesa i produkata manipulacije ljudskim tkivom me|u stru~njacima za plodnost, a kasnije i me|u geneti~arima. 1988. godina: Zabeleèna je prva trudno}a upotrebom metode SUZI - subzonalna inseminacija, tehnike putem koje se jedan spermatozoid injektuje direktno kroz zonu pelucidu. 1989. godina: Lociran genski lokus odgovoran za nastanak cisti~ne fibroze. 1991. godina: @ena stara 42 godine postaje majka, rodiv{i sopstveno unu~e. Arlette Schweizer postaje surogat majka svojoj }erci. Koreanski lekar Cha K.Y. objavljuje ro|enje prve IVM – in vitro maturation bebe iz nestimulisanog ciklusa. William French Anderson (1936- ) po~inje sa prvim eksperimentima transfera ljudskih somatskih gena koje ubacuje u }elije osobe sa genetskim oboljenjem.

Sl. 1.44.- William French Anderson

1996. godina: Barnes F.L. 1996. godine je utvrdio da je razvojna kompetentnost in vitro sazrelih humanih oocita niska zbog gubitka normalnih mehanizama folikularne kontrole koji reguli{u ovu etapu razvoja. 1997. godina: Ro|eno je prvo dete upotrebom nove procedure asistirane reprodukcije, citoplazmatskog transfera, na Institutu za reproduktivnu medicinu i nauku Medicinskog centra Saint Barnabas u Njujorku. Kod citoplazmatskog transfera se citoplazma donorske jajne }elije ubacuje u jajnu }eliju ène recipijenta. Po{to citoplazma ima mitohondrijsku DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu, pokazalo se da rezultuju}i embrion nosi genetski materijal spematozoida i obe ène. Citoplazmatski transfer je prvi korak u genetskoj manipulaciji. Bobbi McCaughey postaje prva majka sedmorki koje su rezultat procedura tretmana neplodnosti. 1998. godina: Na Univerzitetu u Wisconsin-u se izoluje i uzgaja embrionalna stem }elija. 1999. godina: Istraìva~i sa Sismer odeljenja za reprodukciju u Bolonji su otkrili na~in pregleda aneuploidnih embriona pomo}u tehnike koja se zove FISH fluorescence in situ hybridization. Ova tehnika omogu}ava genetsku analizu iz jedne }elije koja se izvla~i iz embriona i ozna~ava po~etak PGS - preimplantation genetic screening-a. Odre|ena je kompletna sekvenca ljudskog hromozoma 22. Istraìva~i u Seulu su uspeli u kloniranju ljudske }elije kod infertilne ène stvaraju}i ~etvoro}elijski embrion, ali je eksperiment zaustavljen zbog eti~kih i pravnih okolnosti. 2000. godina: Ro|en je Adam Nash kao prva beba ro|ena nakon genetskog skrininga.

I Deo: Istorijat

Njegovi roditelji su obavili ovu proceduru radi stvaranja brata spasioca za njihovu }erku koja je imala Fanconi-jevu anemiju, retku krvnu bolest koja nastaje kao rezultat defektnog mehanizma popravke DNK. Beba je za~eta u epruveti, a potom je PGS -preimplantation genetic screening tehnikom od nekoliko embriona izabran embrion koji je najvi{e odgovarao i omogu}io da beba bude donor stem }elija iz pup~ane vrpce za svoju bolesnu sestru. 2001. godina: Doktori Univerziteta u Bolonji su predstavili nove tehnike zamrzavanja koje }e pobolj{ati stepen oplodnje zamrznutih jajnih }elija.

17

Objavljen je prvi nacrt ljudskog genoma koji sadrì oko 30 000 gena. Avigen Inc dobija odobrenje od nacionalnih zdravstvenih instituta da sprovede probu genskog transfera radi ubacivanja korektivnog gena u pacijente sa hemofilijom B, uprkos mogu}nosti da gen moè u}i u polne }elije. U Engleskoj se zabranjuje implantiranje kloniranih embriona u matericu. 2003. godina: Projekat ljudskog genoma je kompletiran. îtava sekvenca ljudskog genoma je de{ifrovana, i to, dve godine pre roka.

II DEO HUMANA REPRODUKCIJA

HUMANA REPRODUKCIJA A. REPRODUKCIJA ]ELIJE Kontinuitet odrànja ìve materije i njeno {irenje u prostoru sa preno{enjem genetskih informacija sa roditelja na potomstvo, predstavlja reprodukciju. Reprodukcija je prisutna u svakoj }eliji. Mitotskom deobom reprodukuju se }elije vi{e}elijskih organizama, a spajanjem gameta, osnovnih reproduktivnih jedinica, dolazi do razvi}a novog organizma. Interfaza u kojoj }elija provede dve tre}ine svoga ìvotnog ciklusa, predstavlja period izme|u nastanka }elije i njene ponovne deobe. Za to vreme }elija metaboli~ki aktivno prolazi kroz tri stadijuma. Stadijum G 1: vr{i se transkripcija gena, sinteza RNK sa delova DNK, i kasnija sin-

teza proteina neophodnih za normalan metabolizam }elije, Stadijum S: sinteza DNK replikacija, Stadijum G 2: vr{i se sinteza proteina uklju~enih u strukturu hromozoma, kao i sinteza proteina koji ulaze u sastav deobnog vretena. Mitoza ili deoba }elije predstavlja drugi osnovni proces ìvota }elije. Sastoji se iz ~etiri faze: profaze, metafaze, anafaze i telofaze. Profaza: Po~etak mitoze u profazi je definisan spiralizacijom i skra}enjem hromozoma kao i formiranjem deobnog vretena koje u~estvuje u povla~enju hromatida hromozoma ka polovima }elije.

Sl. 2.1- Profaza

Sl. 2.2- Metafaza

22


Sl. 2.3- Anafaza

Sl. 2.4- Telofaza

Metafaza: Formira se ekvatorijalna, metafazna plo~a. Anafaza: Razdvajaju se hromatide i kre}u prema polovima. Telofaza: Izduìvanje deobnog vretena i dolazak hromatida na suprotne polove

}elije. Dolazi do despiralizacije hromozoma, podele citoplazme i }elijskih organela, i formira se deobna brazda. Opisani ìvotni ciklus }elije traje oko 16 do 20 ~asova u interfazi i oko jednog ~asa u fazi mitoze.

23

II Deo: Humana reprodukcija

B. REPRODUKCIJA ORGANIZMA 1. GAMETOGENEZA Humani reproduktivni proces prolazi kroz dva stadijuma. Gametogeneza je prvi stadijum u kome se iz germinativnih }elija stvaraju visoko diferencirane polne }elije, gameti, koji predstavljaju reproduktivne jedinice. Spajanje gameta je drugi stadijum. Od dve razli~ite jedinke, spajanjem njihovih polnih }elija, gameta, omogu}ava se repro-

dukcija organizma i geneti~ka raznovrsnost. Gametogeneza je prvi stadijum reproduktivnog procesa kada iz nediferencirane germinativne }elije nastaje visoko diferencirana polna }elija, gamet. Formiranje ènskih polnih }elija naziva se oogeneza, a mu{kih spermatogeneza. Sastoji se iz tri faze: faze razmnoàvanja, faze rasta i faze sazrevanja.

Sl. 2.5 - [ematski prikaz oogeneze

24


1.1. OOGENEZA

1.1.1. Mitoza

Oogeneza je proces formiranja ènskih polnih }elija u jajnicima kada oogonije nastale od primordijalnih germinativnih }elija dostiù stadijum primarnih oocita u toku sedmog lunarnog meseca, pre ro|enja koji zaustavljen u svom razvoju u profazi prve mejoti~ke deobe ostaje tako u neaktivnom jajniku kao {to se vidi na datoj slici. Nastavak procesa zapo~inje pubertetom, sazrevanjem folikula, kada se posle prve mejoti~ke deobe formira haploidan sekundarni oocit ostaju}i u stadijumu metafaze do momenta oplodnje.

Proces oogeneze se de{ava u ovarijumima po~ev od tre}e nedelje nakon fertilizacije kada primordijalne germinativne }elije migriraju ameboidnim kretanjem od epitela ùman~ane kese preko vezivnog tkiva do genitalne brazde pri ~emu se brzo razmnoàvaju. Genitalna brazda je formirana izme|u sredine ~etvrte i pete nedelje gestacije u vidu ~vori}a mezenhima koje prekriva epitel. Oko sedme nedelje gestacije, }elije koje poti~u od mezonefrosa i epitela migriraju ka unutra{njoj strani genitalne brazde formiraju}i primitivnu medularnu vrpcu i seksualnu vrpcu.

Sl. 2.6 - Oogeneza


Faza razmnoàvanja Primitivna vrpca je kolonizovana primordijalnim germinativnim }elijama iz kojih se mitoti~kom deobom stvaraju oogonije, stem }elije. To je prva faza gametogeneze, faza razmnoàvanja. Oogonije su u ovoj fazi jo{ uvek me|usobno povezane intercelularnim vezama. Primitivna medularna vrpca degeneri{e da bi bila zamenjena jako vaskularizovanom ovarijalnom stromom. ]elije vrpce proliferi{u, a mezenhimalne }elije se kondenzuju, formiraju}i individualne primordijalne folikule. Formacije primordijalnih folikula nalazimo u unutra{njem delu ovarijuma blizu rete ovarii izme|u 16. i 18. nedelje fetalnog ìvota. Mezenhimalne }elije sekretuju spolja{nju bazalnu membranu, a od njih }e pote}i i granulozne }elije rastu}eg folikula. Primordijalni folikuli su locirani u slabo vaskularizovanom sloju debljine oko 2mm ispod tunice albugine. Poznato je da su folikuli, uklju~uju}i razvoj od primordijalnih do primarnih, nezavisni od gonadotropina i njihov rast je regulisan intraovarijalnim faktorima.

Faza rasta U drugoj fazi gametogeneze, fazi rasta, oogonije rastu zbog akumulacije hranljivih materija, vitelusa, diferenciraju}i se u primarne oocite sa repliciranom DNK. Hromozomi primarnih oocita sastavljeni su iz dve hromatide i svaka hromatida sadrì identi~ni DNK molekul. U trenutku poro|aja primarni oociti su okruèni jednim tankim slojem folikularnih epitelnih }elija koje predstavljaju primordijalni folikul.

Primarni oocit se okruùje slojem folikularnih }elija formiraju}i primarni

25

folikul. Tokom perioda rasta op{ti nivo metilacije DNK se pove}ava, sa razvojem folikula od preantralnih etapa do pune zrelosti {to za posledicu ima inhibiciju genske aktivnosti. U proces metilacije uklju~ene su razli~ite forme enzima Dnmtdeoxyribonukleik ACID methyltransferase, koje su aktivne u razli~itim stadijumima oogeneze, a tako|e i kasnije tokom embriogeneze. Tokom postnatalnog rasta oocita registruje se sinteza tri proteina koji u~estvuju u metilaciji DNK, metiltransferaze iz familije Dnmt 3, forme Dnmt 3a, Dnmt 3b i Dnmt 31. Zapaèno je da je nivo ekspresije gena koji kontroli{e sintezu Dnmt 31 vi{i od nivoa ekspresije gena za druge dve forme, ali je tako|e utvr|eno da forma Dnmt 31 sama ne poseduje kataliti~ka svojstva ve} svoju funkciju ostvaruje formiranjem kompleksa sa formama Dnmt 3a ili Dnmt 3b. DNK metiltransferaze iz familije 3, prisutne su kod oba pola i mutacije na nekim od gena koji kontroli{u sintezu ovih enzima izazivaju poreme}aje u procesima spermatogeneze i embriogeneze. Tako mutacija na genu za Dnmt 31 koja je dominantne prirode, ispoljava se u heterozigotnom stanju, kod mu{karaca izaziva sterilnost, po{to je zbog prisustva mutiranog Dnmt 31 proteina onemogu}eno sazrevanje spermatozoida. Kod èna mutirani Dnmt 31 protein nema uticaja na normalan rast oocita i njegovu oplodnju, ali je letalan za embrion zbog ~injenice da je metilacija DNK embrionalnih }elija zna~ajno smanjena. Pored DNK metiltransferaza iz familije 3, u proces metilacije DNK uklju~ene su i forme Dnmt 1 i Dnmt 10. Obe forme nastaju kao rezultat prepisivanja istog gena, razli~itom obradom istog primarnog transkripta, tzv. alternativnim splajsingom. Dok je forma Dnmt 1 aktivna u ranijim stadijumima oogeneze, forma Dnmt 10

26


prisutna je kod rastu}ih oocita u citoplazmi i germinalnom vezikulu, kod zrelih oocita u citoplazmi, kao i kod preimplantacionih embriona. Dominantno prisustvo Dnmt 10 u kasnijim stadijumima oogeneze moè se objasniti ~injenicom da je transkript gena sa koga }e se translatovati Dnmt 10, zrela iRNK, znatno stabilniji od i-RNK koja }e se translatovati u enzim Dnmt 1. Iako se translacija DNK metiltransferaze 10 odvija u ranoj fazi razvoja oocita, aktivnost ovog enzima ostaje o~uvana i kod embrionalnih }elija. Ovaj podatak ukazuje na zna~aj koji Dnmt 10 metiltransferaza ima u blokiranju aktivnosti gena, kako tokom oogeneze tako i tokom rasta embriona. Uprkos rastu}oj metilaciji tokom rasta oocita, odre|eni delovi genoma ostaju nemetilisani. Primer epigenetskog delovanja, aktiviranje specifi~nih gena u odre|eno vreme, potkrepljuje eksperiment u kome su analizirani embrioni dobijeni partenogenezom putem transfera nukleusa oocita iz razli~itih etapa razvoja folikula. Na osnovu rezultata ovog eksperimenta utvr|eno je da se transkripcija gena: Snrpn- small nuclear ribonucleoprotein polypeptide n, Znf 127zinc finger, i Ndn - nectin encoding, de{ava u ranom razvoju folikula u periodu prelaska primordijalnog u primarni folikul. Geni kao {to su Peg 3 - paternally expressed, i Igf 2r - insulin like growth factor, prepisuju se kod sekundarnog folikula. Prepisivanje nekih gena odvija se i u kasnijim fazama razvoja folikula, sve do antralne faze, Peg 1- paternally expressed, a postoje i geni ~ija je aktivnost specifi~na samo za fazu antralnog folikula. Do ranog antralnog perioda delovi genoma ozna~eni kao diferencijalno metilisane regije DMR - differentially methylated DNK, skoro su u potpunosti metilisani. Izuzetak predstavlja gen Peg1 - paternally

expressed, ~ija aktivnost biva blokirana metilacijom kod zrelih oocita. Na osnovu svega izloènog moè se uo~iti da proces selektivnog blokiranja genoma putem metilacije DNK traje do stadijuma zrelog folikula koji je spreman da ovulira. Kod razli~itih tehnika asistirane reprodukcije u kojima se sazrevanje oocita i folikula arteficijalno stimuli{e, od posebnog je zna~aja uzimanje u obzir kompleksnog biolo{kog programa oocita koji podrazumeva vremenski preciznu aktivaciju i inhibiciju genoma {to kasnije predstavlja klju~ za normalno odvijanje procesa oogeneze, oplo|enja i embriogeneze.

1.1.2. Mejoza Prva mejoti~ka deoba Faza sazrevanja U tre}oj fazi gametogeneze, fazi sazrevanja, dolazi do dve deobe i taj proces nosi naziv mejoza. Prva mejoti~ka deoba je redukciona, jer od jedne }elije sa diploidnim brojem hromozoma nastaju dve }erke }elije sa dvostruko manjim brojem hromozoma, haploidni broj. Prva profaza mejoti~ke deobe je podeljena u pet podfaza:

leptonema - hromozomi postaju vidljivi; zigonema - homologi hromozomi se sparuju - sinapsis, formiraju se bivalenti; pahinema - uo~avaju se hromatide sparenih homologih hromozoma, tetrade. Razmenjuju se geni izme|u nesestrinskih hromatida homologih hromozoma - rekombinacija ili krosingover; diplonema - dolazi do razdvajanja sinapti~kog kompleksa, homologi hromo-


zomi ostaju vezani samo na hijazmama. Nastavlja se geneti~ka razmena izme|u nesestrinskih hromatida homologih hromozoma, naj~e{}e izme|u dve unutra{nje ili spolja{nje; dijakineza - i{~ezava jedrova membrana, dolazi do pomeranja hijazmi ka krajevima hromozoma, tzv. terminalizacija hijazmi. Profaza prve mejoti~ke deobe, kao duga neaktivna faza, traje od ro|enja, tokom de~ijeg doba do reproduktivnog doba kada se nastavlja zapo~eti proces. Pod uticajem hormona, gonadotropina i estrogena, jednom mese~no u samo jednom od jajnika desi}e se sazrevanje dominantnog folikula. Prva mejoti~ka deoba zavr{ava se nastankom dve haploidne }elije, oocitom II i prvim polarnim telom i ovaj proces predstavlja ovulaciju. Hromozomi su dekondenzovani, odnosno despiralizovani i

27

spakovani unutar nukleusa poznatog kao germinativni vezikul. Maksimum od oko 7 miliona primordijalnih folikula nalazi se u korteksu ovarijuma u 20-toj nedelji graviditeta. Nakon poro|aja broj se smanjuje na oko 1 do 2 miliona. Tokom detinjstva jajnik ostaje endokrinolo{ki neaktivan i broj folikula i dalje opada. Procenjeno je da na po~etku puberteta preostaje najvi{e 250 hiljada folikula na svakom ovarijumu. U jajniku folikul ima dve opcije, moè nestati atrezijom ili biti regrutovan u "pool" rastu}ih folikula. Dok atrezija predstavlja sigurnu smrt, sudbina rastu}eg folikula je tek malo bolja. Kona~no, tokom svakog menstrualnog ciklusa samo jedan folikul preìvi ovaj proces dostiù}i punu zrelost. Ovulira pribli`no 400 oocita, od oko po~etnih 7 miliona. Na kraju dolazi do menopauze.

Sl. 2.7 - Primarni oocit u De Grafovom folikulu: 1.Theca interna i externa, 2. bazalna membrana, 3. granuloza, 4. De Grafov folikul, 5. primarni oocit, 6. cumulus oophorus, 7. ovarijalno tkivo, 8. tunica albuginea ovarijuma, 9. peritonealna {upljina, 10. zona pellucida, 11. jedro u podfazi dijakinezis profaze prve mejoti~ke deobe, 12. granulozne }elije, 13. zavr{etak granuloznih }elija, 14. mikrovile

28


Po zavr{etku profaze prve mejoti~ke deobe spareni homologi hromozomi, jedan poreklom od oca, drugi od majke, postavljaju se u ekvatorijalnu ravan i obrazuje se segmentaciono vreteno, metafaza prve mejoti~ke deobe. Pozicija sparenih homologih hromozoma odredi}e geneti~ku specifi~nost gameta, jer od nje zavisi koje }e kombinacije maj~inskih i o~evih hromozoma krenuti ka jednom od polova. S obzirom da primarni oocit sadrì 23 para homologih hromozoma broj mogu}ih razdvajanja, a samim tim i broj razli~itih kombinacija o~evih i maj~inskih hromozoma u gametima iznosi 223. Treba ista}i da geneti~koj raznovrsnosti gameta doprinosi i razmena gena izme|u homologih hromozoma, crossing-over ili rekombinacija, koja se desila u profazi prve mejoti~ke deobe. U anafazi prve mejoti~ke deobe homologi hromozomi se razdvajaju i kre}u ka suprotnim polovima segmentacionog vretena. Svaki hromozom sastoji se iz dve hromatide, tzv. dijade, a svaka hromatida sadrì jedan molekul DNK. Telofazu prve mejoti~ke deobe karak-

teri{e dolazak celih hromozoma, dijada, na jedan od polova. Formiraju se nova jedra budu}ih }elija sa haploidnim brojem hromozoma, 23 hromozoma. Promene koje se de{avaju na primarnom oocitu pra}ene su promenama i na folikulu. Granulozne }elije se povla~e sa zonom pelucidom {to omogu}ava formiranje perivitelinskog prostora u koji se osloba|a polarno telo na zavr{etku prve mejoti~ke deobe. Podelom primarnog oocita nosioca diploidnog broja hromozoma, redukcionom deobom formira se sekundarni oocit u kome ostaje skoro sva citoplazma sa haploidnim jedrom i primarna polocita sa malo citoplazme i haploidnim jedrom. Promene kumulusnih }elija koje postaju rastresite omogu}avaju odvajanje jednog njihovog dela zajedno sa oocitom koji slobodno pliva u folikularnoj te~nosti pred po~etak rupture. Ovulacija predstavlja zavr{etak prve mejoti~ke deobe kada dolazi do prskanja tercijarnog folikula i osloba|anja sekundarnog oocita i primarnog polocita, ili prvog polarnog tela, u jajovod.

Sl. 2.8 - Zavr{etak prve mejoze i nastanak sekundarnog oocita: 1. zona pellucida, 2. perivitelinski prostor, 3. deobno vreteno u anafazi prve mejoze, 4. zavr{etak granuloznih }elija, 5. mikrovili, 6. granuloza }elije, 7. polocit


29

Sl. 2.9 - Sekundarni oocit u predrupturiraju}em folikulu: 1. peritonealna {upljina, 2. folikul, 3. kumulus (corona radiata) sa oocitom, 4. rastresiti kumulus, 5. sekundarni oocit, 6. corona radiata, 7. ovarijalno tkivo

Druga mejoti~ka deoba ekvaciona, izmenjena mitoza Profaza druge mejoze traje veoma kratko i u njoj hromozomi sadrè dve sestrinske hromatide, diade, spojene centromerom. Druga mejoti~ka deoba nastavlja se metafazom, u kojoj su pojedina~ni hromozomi postavljeni u ekvatorijalnu ravan. U ovoj fazi sekundarni oocit ostaje sve do momenta fertilizacije, kada prodiranje spermatozoida inicira nastavak mejoze. U slede}oj fazi do}i }e do podele centromera repliciranih hromozoma i svaka hromatida hromozoma krenu}e ka jednom od polova, anafaza druge mejoti~ke deobe. Stizanjem hromatida na polove, obrazovanjem novih jedara zavr{i}e se proces mejoze, telofaza druge mejoti~ke deobe. Nasta}e dve }elije, obe sa haploidnim brojem hromozoma, jedna sa skoro celokupnom koli~inom citoplazme nasle|enom od sekundarnog oocita, ootida, i druga sa

veoma malom koli~inom citoplazme, sekundarna polocita. Ootida predstavlja reproduktivnu }eliju.

Sl. 2.10.- Sekundarni oocit u drugoj metafazi: 1. deobno vreteno sa hromozomima postavljenim u ekvatorijalnu ravan, 2. deobno vreteno polarnog tela 3. perivitelinski prostor

30


Sumiraju}i proces mejoze moè se konstatovati da od jedne }elije sa diploidnim brojem hromozoma, primarni oocit, na kraju nastaju ~etiri }elije sa haploidnim brojem hromozoma kod kojih se koli~ina DNK ~etiri puta smanjila u odnosu na }eliju koja je u{la u mejozu.

mejoti~ke deobe. Smatra se da je za nerazdvajanje bivalenata jedan od glavnih razloga pove}ana brzina mejoti~ke rekombinacije.

1.1.3. Hromozomi u toku mejoti~ke deobe Za dobijanje gameta sa normalnom hromozomskom konstitucijom neophodno je da se tokom obe mejoti~ke deobe izvr{i pravilna distribucija naslednog materijala. Gre{ke koje se de{avaju prilikom razdvajanja homologih hromozoma u mejozi I, ili gre{ke koje nastaju usled nerazdvajanja hromatida hromozoma u mejozi II vode ka nastajanju aneuploidnih gameta i uzrok su stvaranja embriona sa numeri~kim aberacijama hromozoma. Kriti~na faza u prvoj mejoti~koj deobi je pravilno postavljanje bivalenata u ekvatorijalnu ravan. U nekim slu~ajevima sinapti~ki kompleks se uop{te ne formira, asinapsis, ili se spareni homologi hromozomi pre postavljanja u ekvatorijalnu ravan prevremeno razdvoje, desinapsis. U oba slu~aja pojedina~ni homologi hromozomi, univalenti, mogu krenuti ka istom polu prouzrokuju}i na kraju mejoze I nastanak dve haploidne aneuploidne }elije, sa dizomijom i nulizomijom. Kada se dogode gre{ke u prvoj mejoti~koj deobi na kraju procesa nikad se ne dobija ootida sa normalnim hromozomskim komplementom. Za prou~avanje gre{aka koje se de{avaju u mejozi veoma je bitna metafaza II. U toj fazi mogu}e je na osnovu analize broja hromozoma utvrditi da li se desilo nerazdvajanje bivalenata tokom prve

Sl. 2.11- Hromozomi u metafazi druge mejoti~ke deobe snimljeni elektronskim mikroskopom

Sa pojavom IVF - in vitro fertilisation, postalo je mogu}e prou~avanje hromozoma kod neoplo|enih oocita. Abnormalnosti u broju hromozoma koje su se registrovale u metafazi II nisu predstavljale dovoljno pouzdan pokazatelj na osnovu kojih bi se predvidela u~estalost ootida sa aneuploidnim kariotipom, jer su se gre{ke u mejozi de{avale i posle ovog stadijuma. U zavisnosti od primenjene tehnike kojom je analiziran kariotip, kao i od faze mejoze u kojoj su hromozomi analizirani, u literaturi postoje veoma razli~iti procenti o u~estalostima aneuploidija kod oocita, koji se kre}e od 8,1% do 54,2%. Analiza hromozoma dobijenih pretvaranjem mejoti~kih hromozoma u mitoti~ke putem partenogene aktivacije podstaknute puromicinom pokazala je da hipohaploidnosti kod druge mejoti~ke deobe oocita nisu izazvane arteficijalno.


Do nedavno je postojalo verovanje da aneuploidne ootide nastaju, uglavnom, kao posledica nerazdvajanja bivalenata u prvoj mejoti~koj deobi. Me|utim, nedavne studije nagovestile su da nerazdvajanje hromatida zna~ajno doprinosi ukupnom broju gre{aka u procesu mejoze, pokazuju}i zavisnost u~estalosti gre{aka od starosne dobi majke. Da bi se stekla kompletna slika u kom momentu se de{avaju gre{ke u mejozi veoma su bitne informacije o podudarnom setu hromozoma prvog polarnog tela PB1 polar body. Naime, svaki poreme}aj u broju hromozoma sekundarnog oocita koji je nastao kao rezultat gre{ke u mejozi I mora biti pra}en odgovaraju}om aneuploidijom prvog polarnog tela. Zbog toga se analizom kariotipa PB1 indirektno dobijaju informacije o mogu}im aneuploidijama sekundarnog oocita. Novije studije su pokazale da hromozomi PB1 - polar body postaju prepoznatljivi i prebrojivi posle 2-3 ~asa u in vitro uslovima i tokom slede}ih 2 do 3 ~asa, sa degeneracijom koja sledi posle 6-7 ~asova nakon ekstruzije. Ipak, analiza kariotipa prvog polarnog tela, PB1, ~esto je veoma oteàna zbog hromozomskog preklapanja. Kao pomo}no sredstvo u analizi kariotipa PB1 koristi se ~esto FISH - fluorescence in situ hybridization, metoda. Na osnovu FISH metode proverava se prisutnost broja hromatida za svaki konkretan hromozom. Za }elije koje nastaju na kraju mejoze I, kao {to su sekundarni oocit i prvo polarno telo, koje imaju haploidan broj hromozoma i kod kojih se svaki hromozom sastoji iz dve hromatide, broj signala, ta~aka, za odre|eni hromozom treba biti dva. Svako odstupanje od ovog broja, nedostatak jednog ili oba signala kao i vi{ak jednog ili oba signala govori o gre{ci koja se desila

31

tokom mejoze. Za izvo|enje FISH metode koriste se specijalne DNK probe koje fluoresciraju i koje su specifi~ne za odre|eni hromozom. Ovom metodom proverava se prisutnost hromatida hromozoma za jedan ili vi{e hromozoma, pa se ne dobija uvid o eventualnim poreme}ajima kompletnog kariotipa. U prvim analizama hromozoma kori{}ene su fluoroscentne alfa-satelit DNK, sonde za hromozome 18 i X. Svi podaci koji su dobijeni analizom hromozoma PB1 klini~ki su primenjeni tako {to su kori{}eni za predselekciju oocita, koji nemaju aneuploidnosti, kod IVF in vitro fertilisation starijih pacijenata. Iskustvo je pokazalo da su informacije o kariotipu PB1 ipak nedovoljne da bi se utvrdilo da ne postoji abnormalnost oplo|enog oocita. Precizne informacije mogu se dobiti tek kada se sa sigurno{}u utvrdi krajnji ishod druge mejoti~ke deobe, na osnovu analize kariotipa drugog polarnog tela PB2 - polar body. Sekvencijalno uklanjanje PB1 - polar body i PB2 - polar body se koristi za testiranje poreme}aja gena, PCR - polymerase chain reaction ili FISH - fluorescence in situ hybridization analizom. Biopsirani oociti se vra}aju u kulturu, posle provere postojanja deobe i obavlja se transfer u zavisnosti od genotipa oocita. Embrioni se transferi{u u implantacionom periodu. Kako se PB1 i PB2 izbacuju iz oocita tokom normalnog procesa sazrevanja, njihovo uklanjanje nema biolo{ku ulogu u razvoju embriona. Kompetentnost embriona se nije promenila nakon uklanjanja PB1. Studije koje su pratile rast i razvoj ovih embriona kroz implantacioni i postimplantacioni period kao i prate}e studije kod dece ro|ene nakon ove procedure, potvrdile su da nema {tetnih uticaja ove metode.

32


Podaci o hromozomskim abnormalnostima oocita u mejozi II dobijeni indirektno na osnovu analize kariotipa PB1 pokazali su se od velikog zna~aja. Upotrebom specifi~nih fluoroscentnih sondi za hromozome 13, 16, 18, 21 i 22, detektovan je stepen aneuploidnosti od 41,7%. Verlinsky sa saradnicima uradio je op{irnu studiju ~iji se rezultati uklapaju sa ostalim studijama iz ove oblasti. Tabelarni prikaz je slede}i: Tabela 2-1: Pregled FISH - fluorescence in situ hybridization analize prvih polarnih tela PB1 - polar body druge metafaze

PB1 FISH podaci Normalni Abnormalni Ukupno

Broj 3399 2432 5831

% 58,3 41,7 100

Kao {to se moè videti iz donje tabele ve}ina abnormalnosti druge metafaze oocita su rezultat poreme}aja broja hromatida u procentu od 63,5%. Tabela 2-2: Tipovi hromatidnih i hromozomskih promena u prvoj mejoti~koj deobi

Tip gre{aka

Broj

%

Dodatna hromatida Nedostaju}a hromatida Dodatni hromozom Nedostaju}i hromozom Sloène gre{ke Ukupno

375

15,4

1169

48,1

12

0,5

144

5,9

732 2432

30,1 100

Hromatidne gre{ke u~estvuju u abnormalnostima druge metafaze sa ve}om

frekvencijom od frekvencije hromozomskih gre{aka. Odnos hromatidne - hromozomske abnormalnosti je 9:1. Nema sumnje da su gre{ke prve mejoze dovele do aneuploidnosti embriona. Frekventnost nedostaju}e u odnosu na frekventnost dodatne hromatide je tri puta ve}a: 48,1% i 15,4%. Sli~na korelacija postoji i kod nedostaju}ih i dodatnih hromozoma: 5,9% i 0,5%, {to se obja{njava zadràvanjem dodatnog hromatidnog ili hromozomskog materijala u drugoj metafazi sekundarnog oocita. Taj podatak se slaè sa ve}om frekventno{}u trizomija nad monozomijama kod preimplantacionih i postimplantacionih embriona. Ukupno posmatrano od 2.432 promena hromozoma 387 (15,9%) su bile monozomije, a 1.313 (54%) trizomije/dizomije. Jedan broj promena kod PB1 - polar body moè biti svojstven tehni~kim gre{kama, kao {to je neuspeh hibridizacije. Mogu}e je da postoji i mehanizam prolaznih ta~aka u prvoj mejozi koje spre~avaju istiskivanje dodatnog hromozomnog materijala u PB1 - polar body kada se mejoti~ke gre{ke dogode tokom procesa sazrevanja oocita. Testiranja na poreme}aje druge mejoze oocita, pokazuju da i do 41,7% abnormalnih oocita moè biti detektovano testiranjem ishoda prve mejoti~ke deobe analizom prvog polarnog tela PB1. Tabela 2-3: Tipovi abnormalnih oocita bazirani na FISH - fluorescence in situ hybridization analizi prvog polarnog tela PB1 i drugog polarnog tela PB2

Tipovi abnormalnih Broj oocita PB1 + PB2 965

%

PB1

1467

41,7

PB2

1077

30,7

Ukupno

3509

100

27,6

33


Kao {to se vidi u tabeli, 39,5% ispitanih oocita (965 od 2.432 oocita druge mejoze sa hromozomskim abnormalnostima) je bilo normalno posle druge mejoti~ke deobe {to je zaklju~eno iz testiranja PB2. Posle druge mejoti~ke deobe 1.077 (52,7%) oocita je postalo abnormalno. Da je testiranje bilo ograni~eno samo na PB1 polar body dobili bi pogre{ne rezultate. Da bi identifikovali sve oocite sa hromozomskim abnormalnostima morali bi ishod prve i druge mejoti~ke deobe ispitati analiziranjem prvog polarnog tela PB1 i drugog polarnog tela PB2. Tabela 2-4: Tipovi hromozomskih abnormalnosti kod drugog polarnog tela PB2

Tipovi gre{aka Broj Dodatana hromatida 842 (dizomije) Nedostaju}a hromatida 748 (nulizomije)

%

Sloène gre{ke

452

22,14

Ukupno

2042 100

41,23 37,63

U tabeli je dat prikaz tipova hromozomskih abnormalnosti kod 2.042 analize drugog polarnog tela PB2 - polar body detektovanih kod 5.808 oocita FISH - fluorescence in situ hybridization tehnikom. Nije bilo razlike u u~estalosti pojave poreme}aja nedostaju}ih ili dodatnih hromatida posle druge mejotske deobe. Ukupno gledano, od 5.808 testiranih oocita 2.042 (35,2%) imalo je gre{ke druge mejoze od kojih je u 842 (41,2%) slu~aja bio pove}an broj hromatida, u 748 (36,6%) slu~ajeva smanjen broj hromatida i 452 (22,4%) slu~aja sa sloènim gre{kama. Hromozomi 21 i 22 (20,8% i 18%) su naj~e{}e u~estvovali u mejoti~kim gre{kama.

U~estvovanje u mejoti~kim gre{kama hromozoma 13, 16 i 18 je bilo dvostruko manje (10,7%, 8,6% i 13,3%) i njihovi {abloni gre{aka nisu bili identi~ni. Gre{ke hromozoma 16 su poticale, uglavnom, iz druge mejoze, 55,9% prema 28,8% kod prve mejoze. Promene hromozoma 13 i 18 su ~e{}e poticale iz prve mejoze 47,4% i 61,8% u odnosu na drugu mejozu 36,5% i 28,5%. Ukupan broj hromozomskih gre{aka drugog polarnog tela PB2 - polar body od 35,2% gre{aka, utvr|enih kod druge mejoti~ke deobe oocita, kao i kod oocita nakon same deobe, moè biti obja{njen starosnim uticajima na frekventnost rekombinacije ili gre{kama u formiranju niti deobnog vretena za koje je utvr|eno da se pove}avaju sa staro{}u. Najnoviji podaci o molekularnim mehanizmima kohezije sestrinskih hromatida u mejozi, su od zna~aja za razumevanje prirode pove}anja mejoti~kih gre{aka u toku procesa starenja. Pribli`no jedna tre}ina ovih aneuploidija je predstavljena sloènim gre{kama, {to nagove{tava da bi testiranje samo pet naj~e{}e pogo|enih hromozoma pokrilo ve}inu hromozomskih abnormalnosti oocita. Primena dodatnih hromozom-specifi~nih sondi verovatno }e rezultirati proporcionalnim porastom broja sloènih gre{aka. Zna~aj genetskih analiza polarnog tela je veliki. Genetska dijagnoza druge mejoze oocita omogu}ava detekciju ve}ine abnormalnosti oocita. Testiranje prvog polarnog tela, PB1, bi trebalo da smanji broj aneuploidija kod embriona za dve tre}ine. S obzirom na ~injenicu da }e pribli`no jedna tre}ina ovih oocita biti aneuploidna i posle druge mejoti~ke deobe, testiranje PB1 moè da pove}a broj trudno}a kod pacijenata sa

34


lo{om prognozom u IVF - in vitro fertilisation, primenom ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike oplodnje oocita kod kojih nema aneuploidije prvog polarnog tela. Treba naglasiti da je samo polovina genetskih abnormalnosti detektovana putem analize PB1 - polar body kao sloèna gre{ka, a u cilju izbegavanja svih embriona koji su nastali iz aneuploidnih oocita, neophodno je testiranje PB1 i PB2. Kako se PB1 - polar body i PB2 - polar body u normalnom procesu sazrevanja gube, mogu}e je da se iskoriste za testiranje oocita, {to bi pomoglo u selekciji oocita i zna~ajnom pobolj{anju efikasnosti IVF - in vitro fertilisation.

diplonemi, profaze prve mejoti~ke deobe. U daljoj fazi hromozomi se podvrgavaju redukcionoj deobi do zaustavljanja u metafazi druge mejoti~ke deobe. Istovremeno sa nuklearnim - hromozomnim sazrevanjem se de{avaju i molekularne }elijske promene na nivou citoplazme. Proces sazrevanja citoplazme je neophodan za sticanje razvojne kompetentnosti. Do podsticanja nastavka druge mejoze, uz pomo} gonadotropina, LH - luteinizing hormone / HCG - human chorionic gonadotropin, koja prethodi ovulaciji, ooplazma se priprema za ovulatorne doga|aje.

1.1.4. Kompetentnost i sazrevanje oocita Kompetentnost oocita je sposobnost formiranja embriona koji se kasnije razvija na normalan na~in. Nezreli oociti koji su nesposobni za normalnu oplodnju su po definiciji nekompetentni. Kada se dostigne funkcionalna zrelost, oociti koji imaju neki poreme}aj, kao npr. hromozomne anomalije, ili insuficijenciju citoplazme su nekompetentni. Na kompetentnost oocita uti~u mnogi faktori, pa je temeljno razumevanje dugog i sloènog procesa razvoja oocita neophodno za bilo kakvo bavljenje potencijalnim uzrocima i posledicama nekompetentnosti oocita. Za sada se zna da je nekoliko aspekata razvoja oocita kriti~no za kompetentnost, ali su oni jo{ uvek slabo ispitani. Kod prirodnog ciklusa sazrevanje oocita se odvija pod dejstvom pituitarnih gonadotropina. Nezreli oociti ne dostiù kompetentnost, jer njihov genetski materijal ostaje u

Sl. 2.12- Kompetentan oocit

Preovulatorno sazrevanje oocita se odvija unutar De Grafovog folikula kao veoma efikasan proces, jer je pri ovulaciji veliki deo oocita u odgovaraju}oj fazi mejoze sposoban za oplodnju. Razvojnu kompetentnost oocita je prakti~no nemogu}e utvrditi, ali se procenjuje da je bar 50% oocita sposobno da proizvede normalne rane embrione mada ovaj broj moè biti i ne{to manji kada se oplodnja i preimplantacioni razvoj odvijaju u in vitro uslovima. Kompetentnih oocita posle in vitro sazrevanja je manje sa usporavanjem ranog razvoja i zastoja u daljem razvoju embriona.


Kompletan razvoj oocita se odvija samo kod dominantnog folikula unutar kohorta folikula koji po~inju da se razvijaju sa svakim menstrualnim ciklusom. Iako nekompetentni oociti mogu poticati i od dominantnog folikula pretpostavlja se da su osobine dominantne intrafolikularne sredine unapre|ene evolucijom u cilju optimizacije uslova koji pobolj{avaju sazrevanje kompetentnog gameta. [ta su determinante kompatibilnosti, pitanje je od centralnog zna~aja za razumevanje reproduktivne biologije ènskog gameta. Razvoj kompatibilnih oocita, koji rezultuje normalnim embrionima je dug proces koji po~inje tokom fetalnog ìvota kada se formira pool primordijalnih folikula. Primordijalni oociti ostaju u profazi prve mejoti~ke deobe i nisu u mogu}nosti daljeg razvoja, osim ako folikul ne poraste i pruì sredinu koja vodi ka nastavku razvoja oocita. Iako folikul raste kontinuirano od ro|enja pa sve do kraja reproduktivne sposobnosti, folikul ne dostiè ovulatornu veli~inu i ne proizvodi zna~ajne koli~ine estrogena tokom detinjstva. U pubertetu koordinisana cikli~na stimulacija gonadotropina iz pituitarne `lezde inicira sazrevanje oocita i ovulaciju. Utvr|eno je da je folikul koji }e postati dominantan i koji }e ovulirati, obi~no najve}i folikul pre~nika od 5,5 - 8,2 mm na po~etku folikularne faze. Smatra se da njegove granulozne }elije najvi{e reaguju na FSH - follicle stimulating hormone. Modulacija osetljivosti na FSH - follicle stimulating hormon, moè da bude postignuta lokalnim faktorima rasta, npr. faktor -1 rasta sli~an insulinu. Dominantan folikul po~inje da sinteti{e estradiol. Sa sazrevanjem folikula granulozne }elije sti~u LH - luteinizing hormone

35

receptore kao odziv na stimulaciju FSH follicle stimulating hormon, prisvajaju}i sposobnost reagovanja na LH - luteinizing hormone. Sa nastavkom preovulatornog sazrevanja folikula, pove}ava se vaskularitet folikula i time se pove}ava isporuka gonadotropina folikulu koji sazreva, kao i sistemska dostupnost njegovih produkata, naro~ito steroida. Preovulatorni ve}i dotok LH - luteinizing hormona, stimuli{e sazrevanje oocita, ekspanziju kumulusa i reinicijaciju mejotskog sazrevanja koje napreduje iz prve profaze ka drugoj metafazi za otprilike 36 ~asova. Promene u ooplazmi, koje su istovremene sa mejotskim promenama i koje odlikuju sazrevanje citoplazme, uklju~uju i pove}an kapacitet emitovanja intracelularnog kalcijuma, izmene preformirane informacione, iRNK, potrebne za podupiranje razvoja embriona pre kompletne aktivacije genoma i migraciju u subplazmalemalnu citoplazmu kortikalnih granula koje u~estvuju u prevenciji polispermi~ne penetracije. Ekspanzija kumulusa se odvija kao rezultat sekrecije matrice proteglikana bogate hijaluronskom kiselinom, od strane }elija kumulusa koje okruùju oocit. Ova ra{irena matrica drì oocit - kumulus kompleks koji olak{ava folikularnu ekstruziju u ovulaciji, penetraciju spermatozoida i oplodnju. Mejoza je jedinstven tip }elijske deobe koja se odvija samo u gametogenezi i rezultuje redukcionom deobom, podelom broja hromozoma za pola, radi omogu}avanja rekonstituisanja normalnog broja hromozoma nakon oplodnje. Mejoza potpomaè genetsku varijaciju kroz rekombinaciju hromozoma i odgovaraju}ih podudarnih gena. Oogonije fetusa ulaze u

36


mejozu tokom drugog tromese~ja trudno}e, ali oocit ostaje u diplotenskoj podfazi profaze prve mejoti~ke deobe napreduju}i samo do druge metafaze u kojoj dolazi do ovulacije i oplodnje, tokom sazrevanja oocita kod odrasle osobe. Tokom produènog zastoja u diplotenskoj podfazi prve profaze, hromozomi oocita su se kondenzovali, spojili sa svojim homologim parovima i podvrgli rekombinaciji odvajaju}i se po njihovoj duìni, osim na mestima ukr{tanja poznatim kao hijazme. Oociti mogu ostati u ovoj etapi tokom mnogo godina sve do ovulacije. Efikasno odràvanje ovog stanja zastoja je od najve}eg zna~aja za osiguravanje efikasnog tro{enja zalihe oocita tokom reproduktivnog ìvota kao i za ostanak pojedina~nih oocita u stabilnom stanju sve do iniciranja daljeg folikularnog rasta. Okruùju}e granulozne }elije su odgovorne za odràvanje oocita, ali su ta~ni reg-

ulatorni mehanizmi jo{ uvek nepoznati. Pre nastavka mejoze nezreli oociti se podvrgavaju zna~ajnom rastu da bi pre{li prag veli~ine sazrevanja i etapne promene hromatinskih konfiguracija. Reinicijacija mejoze uklju~uje uobi~ajenu putanju signaliziranja izme|u oocita i njegovih granuloznih }elija, bez obzira da li je oocit odre|en da ovulira, ili da degeneri{e. Prime}eno je la`no sazrevanje kod atreti~nih folikula kao rezultat degenerativnih promena koje rasparuju komunikaciju oocit - granulosa. Pri sazrevanju oocit nastavlja prvu mejozu i napreduje kroz metafazu, anafazu i telofazu izbacuju}i prvo polarno telo koje sadrì polovinu hromozomnog komplementa, zajedno sa minimalnom koli~inom citoplazme. Asimetri~na deoba ooplazme se odvija kao posledica periferne pozicije vlakana deobnog vretena {to dozvoljava hromozomu da bude prepolovljen bez zna~ajnog gubitka ooplazme.

Sl. 2.13 - Prikaz etapa folikularnog razvoja i sticanja kompetentnosti oocita


Oociti napreduju direktno do druge metafaze bez replikacije DNK - deoksiribonukleinske kiseline ili formiranja nukleusa i ponovo se zaustavljaju. Ova ta~ka zastoja je manje stabilna od prve profaze i oociti mogu ostati najvi{e 24 ~asa funkcionalni i spremni za normalan razvoj nakon oplodnje. Druga mejoza se nastavlja nakon penetracije spermatozoida i partenogene aktivacije. Morfolo{ki dokaz nastavka mejoze je nestajanje nukleusa oocita i jedarne membrane germinalnog vezikula putem procesa koji je nazvan GVBD - germinal vesicle breakdown. Pretpostavlja se da se sazrevanje nukleusa odvija po izbacivanju polarnog tela. îm se formira sekundarni folikul granulozne }elije razviju FSH - follicle stimulating hormone receptore, a teka }elije se diferenciraju oko bazalne membrane. Sa formiranjem teka }elija ispolje se i LH luteinizing hormon receptori. U toku stvaranja sekundarnih folikula dolazi do migracije ka medularnom delu ovarijuma, gde se formira rani sloj teke eksterne i po~inje vaskularizacija folikula. Tako|e se pojavljuju gonadotropni i steroidni receptori. Kao {to je poznato, LH - luteinizing hormon stimuli{e teka }elije da proliferi{u i diferenciraju i inicira produkciju androgena. Preìvljavanje teka }elija nije zavisno od LH-luteinizing hormona. Androstenedion koji poti~e iz teka }elija je zavistan od LH - luteinizing hormona i deluje na granulozne }elije da citodiferenciraju odgovor na FSH - follicle stimulating hormone. Dokazano je da je faza rasta do preantralnog folikula gonadotropin nezavisna. Tako se folikuli od 2 - 5 mm pre~nika identifikuju u ovarijumu i u odsustvu FSH - follicle stimulating hormone (Kallmanov sindrom).

Sazrevanje nukleusa oocita se moè nezavisno nastaviti. Me|utim, puna razvoj-

37

na kompetentnost se sti~e samo kada su procesi sazrevanja nukleusa i citoplazme blisko integrisani. Sazrevanje nukleusa oocita je od posebnog zna~aja. Faktor unapre|enja sazrevanja MPF maturation promoting factor u~estvuje u mejoti~koj deobi oocita. Naime, mnogi proteini koji reguli{u mitozu tako|e reguli{u i mejozu. Tranzicija G2 i M-faze kod potpuno zrelih oocita je pokrenuta delovanjem MPF - maturation promoting factor-a pa se on smatra primarnim molekulom koji u~estvuje u napretku }elijskog ciklusa mejoze. MPF - maturation promoting factor je heterodimer serinsko-treoninskog kinaznog proteina sastavljen od regulatorne podjedinice ciklina B i kataliti~ke podjedinice p34cdc2. Ciklin B i p34cdc2 postaju povezani i defosforizacija p34cdc2, katalisana fosfatazom koja je kodirana genom cdc2 se odvija na ostacima tirozina-15 i treonina-14. Aktivan MPF - maturation promoting factor je potreban za inicijaciju nuklearnog sazrevanja i kondenzaciju hromozoma u prvoj metafazi. Aktivnost MPF maturation promoting factor-a se moè detektovati pre, ili za vreme GVBD - germinal vesicle breakdown. Ulazak u prvu anafazu je istovremen sa inaktivacijom MPF - maturation promoting factor-a, zbog proteoliti~ke degradacije ciklinske jedinice MPF - maturation promoting factor-a. Ulazak u drugu mejoti~ku deobu zahteva drugo pove}anje aktivnog MPF - maturation promoting factor-a i kako c-mos odràva MPF - maturation promoting factor na visokom nivou, napredak }elijskog ciklusa je u zastoju do oplodnje, kada penetracija spermatozoida rezultuje pove}anjem intracelularnog slobodnog Ca2+ koji podsti~e aktivnost MPF - maturation promoting

38


factor-a i dovodi do degradacije ciklina B {to dozvoljava kompletiranje mejoze. MAP - mitogen activated protein kinaze je serinsko-treoninska kinaza koja se aktivira putem kaskade proteinske kinaze na po~etku sazrevanja oocita. MAP - mitogen activated protein kinaza, iako aktivirana pre po~etka sazrevanja oocita, nije obavezno potrebna za GVBD - germinal vesicle breakdown. Kod oocita je p42ERK2 glavni oblik MAP - mitogen activated protein kinaze. MAP - mitogen activated protein kinaza nije aktivna kod nezrelih oocita, ve} samo kod zrelih i pokazuje smanjenu aktivnost nakon pronuklearnog formiranja.

Purini su va`ni faktori u procesu sazrevanja oocita. Purin cAMP, cikli~ni adenozin monofosfat, u~estvuje u mejoti~kom zastoju i moè spre~iti GVBD - germinal vesicle breakdown inhibicijom aktiviranja MPF maturation promoting factor-a, ili deregulacijom defosforizacije p34CdC2, smanjuju}i se ispod nivoa praga pre nastavka mejoze. Druga dva purina, hipoksantin i adenozin spre~avaju in vitro GVBD - germinal vesicle breakdown oocita potpomaù}i visoke nivoe cAMP - cyclic adenosine monophosphate. Hipoksantin spre~ava degradaciju cAMP - cyclic adenosine monophosphate, dok adenozin potpomaè generisanje cAMP - cyclic adenosine monophosphate stimulisanjem adenilata ciklaze deluju}i kao supstrat za proizvodnju cAMP - cyclic adenosine monophosphate. DMAP6 - dimetilaminopurin inhibira GVBD - ger minal vesicle breakdown i napredak }elijskog ciklusa inhibiranjem post-translacione defosforizacije p34cdc2 koja pokre}e aktivnost MPF - maturation promoting factora, ali se ne me{a u sintezu proteina.

Sazrevanje citoplazme se odnosi na procese koji pripremaju oocit za oplodnju, aktivaciju, formiranje pronukleusa i preimplantacioni razvoj. Kao i kod sazrevanja nukleusa, kompetentnost sazrevanja citoplazme se sti~e sekvencijalnim koracima tokom sazrevanja, dok oocit napreduje od faze germinalnog vezikula. Za ve}inu deficijencija oocita, koje uti~u na kompetentnost, veruje se da su u vezi sa defektima u reprogramiranju citoplazme tokom sazrevanja, a ne sa napretkom mejoze. Citoplazmati~ne aberacije se normalno manifestuju tokom preimplantacionih i perimplantacionih etapa i javljaju se kao }elijska iregularnost, spora deoba, prerani zastoj, nizak broj }elija ili kao neuspeh implantacije. Sinteza proteina nastaje u rastu}im oocitima iz transkripata kodiranih nuklearnih i mitohondrijskih genoma. U zavisnosti od njihovog porekla i regulatornih osobina mogu biti upotrebljeni za komunikaciju sa okolnim granuloznim }elijama od strane oocita i za potporu ranom razvoju embriona.

Kalcijum Penetracija spermatozoida potpomaè promene koje zavise od Ca2+, a koje rezultuju aktivacijom oocita. Ca2+ se osloba|a iz intracelularnih zaliha putem mehanizma signalne transdukcije koji zavisi od IP3independent pathway. Kapacitet oocita da oslobodi intracelularni Ca2+ je relativno nizak tokom raznih etapa sazrevanja, a dostiè maksimum u mejoti~koj deobi. Osloba|anje Ca2+ je neophodno za aktivaciju oocita i formiranje pronukleusa i de{ava se u isto vreme sa oplodnjom. Defekti u sposobnosti oocita da odgovore na signale koji mobili{u Ca2+ ili na signale koji tokom sazrevanja citoplazme rezultuju neadekvatnim skladi{tenjem Ca2+ ili

39


sekvestracijom, mogu indicirati razvojnu nekompetentnost.

Produkcija glutationa Tokom sazrevanja oocita pove}ava se produkcija glutationa. Glutation je agens redukcije koji pomaè dekondenzaciju spermatozoida i ima ulogu u formiranju mu{kog pronukleusa, a moè pruìti za{titu od patolo{ke oksidacije slobodnih radikala.

Kortikalne granule Kod zrelih oocita zauzimaju perifernu poziciju ispod ooleme. Penetracija spermatozoida u oocit pokre}e osloba|anje kortikalnih granula putem ekscitoze i blokira polispermiju, smanjivanjem penetrabilnosti zone pellucide, da bi se spre~ila penetracija drugih spermatozoida. Egzocitoza kortikalnih granula moè biti podstaknuta Ca2+ jonoforama, a reagovanje oocita se pove}ava sa napretkom sazrevanja. Nedostatak egzocitoze usled nekompletnog sazrevanja citoplazme moè dovesti do polispermije, dok preuranjeno osloba|anje, zbog neodgovaraju}eg ili produènog kultivisanja, moè smanjiti permeabilnost zone pellucide za penetraciju spermatozoida, a time i oplodni potencijal.

Veli~ina folikula Veli~ina folikula iz koga poti~e oocit uti~e na njegov razvojni kapacitet, po{to se kriti~ni aspekti razvojne kompetentnosti sti~u tokom folikularnog rasta. Endokrini milje se menja kroz menstrualni ciklus i moè uticati na rast folikula koji je osetljiv na gonadotropin, a moè uticati i na ostale aspekte folikula i razvoja oocita. Utvr|eno je da zna~ajno ve}i procenat oocita, dobijen iz folikula veli~ine 9-15 mm tokom folikularne faze menstrualnog

ciklusa, podleè GVBD - germinal vesicle breakdown u odnosu na procenat oocita dobijenih od folikula koji su imali 3-4 mm u pre~niku tokom lutealne faze. Smatra se da folikuli sa pre~nikom < 10mm sadrè manje razvojno kompetentnih oocita, a minimalni pre~nik folikula potreban za oocite koji }e biti sposobni za in vitro sazrevanje je 5mm.

Veli~ina oocita Uti~e direktno na sposobnost oocita da nastavi mejozu i zavr{i sazrevanje. Utvr|eno je da pre~nik oocita mora biti ve}i od 115 µm da bi napredovao od GVBD - germinal vesicle breakdown, do druge mejoti~ke deobe.

Faktor rasta Faktor rasta je protein koji se pona{a kao signalni molekul izme|u }elija, vezuju}i se za specifi~ne receptore na povr{ini ciljne }elije, potpomaù}i diferencijaciju i sazrevanje }elije. Najpoznatiji faktori rasta su: - G-CSF - granulocyte colony stimulating factor, faktor stimulacije granulocitne kolonije; - GM-CSF - granulocyte macrophage colony stimulating factor, faktor stimulacije granulocitno makrofagne kolonije; - NGF - nerve growth factor, faktor rasta nerava; - Neurotrofin; - PDGF - platelet derived growth factor, faktor rasta dobijen od trombocita; - EPO - eritropoetin; - GDF8 - growth differentiation factor, miostatin; - GDF9 - growth differentiation factor 9, faktor diferencijacije rasta 9; - bFGF - fibroblast growth factor ili FGF2 - fibroblast growth factor, bazni faktor rasta fibroblasta.

40


Citokini su se nekada dovodili u vezu sa hematopoeti~kim }elijama i }elijama imunog sistema (npr. limfociti i }elije iz jetre, timusa i limfnih ~vorova). U sistemu cirkulacije i ko{tane srì gde se }elije mogu javiti u te~nom rastvoru, a ne vezane u ~vrstom tkivu, potpuno je razumljivo da one komuniciraju sa rastvorljivim cirkuli{u}im molekulima proteina. Me|utim, u kasnijim istraìvanjima se pokazalo da neke od signalnih proteina, koje su koristili hematopoeti~ki i imuni sistem, tako|e koriste i ostale vrste }elija i tkiva tokom rasta kao i u odraslom organizmu. Neki citokini mogu biti faktori rasta kao {to je G-CSF - granulocyte colony stimulating factor i GM-CSF - granulocyte macrophage colony stimulating factor. S druge strane neki citokini se koriste kao signali smrti kao {to je FAS - ligand koji primorava ciljne limfocite na programiranu smrt }elija ili apoptozu. Faktor rasta fibroblasta FGF - fibroblast growth factor je prona|en u ekstraktu kravljeg mozga od strane Gospadarowich-a i testiran je u biolo{kom eksperimentu izazivaju}i brzi rast fibroblasta. Kasnijim delovanjem kiselim i baznim pH, izolovana su dva neznatno razli~ita oblika koji su nazvani kiseli faktor rasta fibroblasta aFGF- fibroblast growth factor i bazni faktor rasta fibroblasta bFGF - fibroblast growth factor. Ovi proteini su imali zajedni~ki vrlo visoki stepen identi~nih sekvenci amino kiselina. Trenutno postoje 23 ~lana FGF - fibroblast growth factor familije koji su po svojoj strukturi signalni molekuli (FGF1 - fibroblast growth factor, FGF2 fibroblast growth factor, FGF3 - fibroblast growth factor, itd.) i koji se vezuju za familiju receptorskih molekula koja se sastoji od 4 ~lana; FGFR1 - fibroblast growth factor receptor, FGFR2 - fibroblast growth

factor receptor, FGFR3 - fibroblast growth factor receptor i FGFR4 - fibroblast growth factor receptor. I pored svih ovih saznanja jo{ uvek se ne zna precizno {ta radi FGF fibroblast growth factor. U najnovijim istraìvanjima izolovan je par faktora rasta koji se vezuje za heparin i nazvani su HBGF1 - heparin binding growth factor i HBGF2 - heparin binding growth factor. U drugom istraìvanju izolovan je drugi par faktora rasta koji izaziva brzi rast endotelijalnih }elija krvotoka ECGF1 - epithelial cell growth factor i ECGF2 - epithelial cell growth factor. Jedna od najva`nijih funkcija bFGF fibroblast growth factor, tako|e poznatog kao FGF-2 - fibroblast growth factor je da potpomaè ubrzani rast endotelijalnih }elija, fizi~ku organizaciju endotelijalnih }elija u tubi i formiranje novih krvnih sudova. Ovaj proces je poznat kao angiogeneza, a utvr|eno je da je bFGF - fibroblast growth factor potentniji angiogeni faktor od VEGF - vascular endothelial growth factor-a, ili od PDGF - platelet derived growth factor-a. Osim stimulisanja formiranja krvnih sudova, bFGF - fibroblast growth factor ima va`nu ulogu u zarastanju rana izazivanjem ubrzanog rasta fibroblasta. Pojedina~ni proteini faktora rasta imaju tendenciju da se pojavljuju kao ~lanovi ve}ih familija strukturno i evoluciono povezanih proteina. Gornji primer govori o FGF - fibroblast growth factor-a, ali postoje na desetine familija faktora rasta kao {to su TGF-beta - transforming growth factor, BMP - bone morphogenic protein, NGF nerve growth factor, BDNF - brain-derived neurotrophic factor i NT3 - neurotrofin itd. Tokom poslednjih dvadeset godina faktori rasta se sve vi{e koriste u tretmanu hematolo{kih i onkolo{kih bolesti kao {to


su neutropenija, MDS - mijelodisplasti~ni sindrom, leukemija, aplasti~na anemija. S obzirom na njihovu veliku ulogu i zna~aj za uspeh in vitro oplodnje putem utvr|ivanja fiziolo{ke kompetentnosti oocita, intenzivno se nastavljaju istraìvanja radi postavljanja analiti~kih merila za procenu. Dana{nja nemogu}nost razlikovanja kompetentnih od nekompetentnih oocita ima uticaj na stepen uspe{nosti tretmana. Ne samo {to nekompetentni oociti mogu gre{kom biti izabrani za fertilizaciju umesto kompetentnih, ve} je jo{ va`nije da pacijenti koji imaju nedostatak kompetentnih oocita ne mogu biti identifikovani tokom rane procene neplodnosti.

1.1.5. Apoptoza }elija ovarijuma Apoptoza }elija ovarijuma je proces od posebnog zna~aja kao i njegova regulacija.

Sl. 2.14 - Apoptoza }elije

Otkriveno je da se apoptoza odvija kod tri razli~ita tipa ovarijalnih }elija; kod oocita, granuloznih }elija i lutealnih }elija. Apoptoza je najintenzivnija tokom razvoja embriona. Apoptoza oocita uti~e na neona-

41

talni ovarijalni razvoj. In vitro i in vivo eksperimenti su pokazali da agensi koji o{te}uju DNK, kao {to su cikli~ni poliaromatski ugljovodonici i citostatici, podsti~u apoptozu oocita. Na osnovu ovih rezultata je jasno da su oociti jajnika odraslih jedinki zadràli svoju sposobnost apoptoze pod patolo{kim uticajem. Transgenski i ìvotinjski modeli su razjasnili kako se reguli{e smrt oocita. Iz velikog broja eksperimentalnih radova na ìvotinjama dobijeni su slede}i podaci. Za gene Bc12 kod Bc 12-associated X protein nock-out mi{eva je otkriveno da imaju zna~ajno manje oocita od ìvotinja sli~nog starosnog doba. Bcl2 - B-cell non Hodgkin s lymphomas gen se, tako|e, moè detektovati kod E 12,5 - embryo i E 15,5 embryo oocita mi{eva. Jo{ jedan ~lan antiapoptotske Bcl2 - B-cell non Hodgkin s lymphomas familije gena, Bcl-xl - B-cell non Hodgkin s lymphomas ima ulogu u odre|ivanju sudbine }elija zametka. Iako Bcl-xl - B-cell non Hodgkin s lymphomas nock-out mi{evi umiru u veoma ranoj etapi fetalnog razvoja, postoji jasan gubitak }elija zametka kod E 11,5 - embryo u pore|enju sa ostalim kontrolnim ìvotinjama. Mi{evi koji su imali nedostatak gena Bax Bc 12-associated X protein, koji je ~lan proapoptotske Bcl2 - B-cell non Hodgkin s lymphomas familije gena, su imali normalan broj oocita pri ro|enju, ali na po~etku puberteta je pool folikula bio trostruko ve}i u pore|enju sa mi{evima sli~nog starosnog doba. Tokom folikulogeneze je apoptoza zapaèna, uglavnom, kod granuloznih }elija jajnika. îni se da je ovaj proces u osnovi kontrolisan hormonima. Testosteron podsti~e, a estradiol inhibira apoptozu granuloznih }elija kod jajnika glodara. Pokazalo se da su i gonadotropini faktor preìvljavanja

42


za ljudske granulozne }elije u in vitro uslovima. Osim toga, ~ini se da visok odnos androgen/estrogen predodre|uje }elijsku smrt granuloznih }elija. Apoptoza granuloznih }elija je posredovana od strane gena Bcl2 - B-cell non Hodgkin s lymphomas familije faktora koji reguli{u }elijsku smrt. Apaf-1 - apoptotic peptidase activating factor gen se tako|e ekspresuje u granuloznim }elijama i aktivira osloba|anjem citohroma-C uz posredovanje Bcl2 B-cell non Hodgkin s lymphomas familije. Geni supresori tumora TP53 - thymidine phosphorylase i WT1 - Wilms tumors imaju ulogu u regulisanju apoptoze granuloznih }elija kod glodara. Sve vi{e se potvr|uje da apoptoza igra va`nu ulogu u regresiji CL - corpus luteuma kod ìvotinja i kod ljudi. Nedavna zapaànja, tako|e, odraàvaju ekspresiju ~lanova Bcl2 - B-cell non Hodgkin s lymphomas familije koji reguli{u apoptozu u ljudskom CL - corpus luteum: Bcl 2 - Bcell non Hodgkin s lymphomas, Bcl x - Bcell non Hodgkin s lymphomas i gen Bax Bc 12-associated X protein. Eksperimenti sa uzgajanim granuloznim lutealnim }elijama nagove{tavaju da se kaspaze 3 i 9 aktiviraju kod apoptoze podstaknute staurosporinom u luteiniziranim ljudskim granuloznim }elijama.

1. 2. FOLIKULOGENEZA U momentu ro|enja preostali primarni oociti su okruèni tankim slojem folikularnih epitelnih }elija i bazalnom membranom odvojeni od ovarijalne strome. To su primordijalni folikuli. U kasnijem periodu do menopauze neki od njih pod delovanjem hormona mogu da se aktiviraju.

Na slici je prikazan prelaz primordijalnog u primarni folikul sa zadebljanjem folikularnih epitelnih }elija.

Sl. 2.15 - Prelaz primordijalnog (A) u primarni folikul (B): 1. primarni oocit; 2. folikularni epitel

Sl. 2.16 - Primarni folikul snimljen elektronskim mikroskopom

Ukoliko primarni folikul opstane, prelazi u sekundarni folikul sa zadebljanjem folikularnog epitela koji postaje vi{eslojni i naziva se stratum granulosum. Izme|u oocita i stratum granulosum-a formira se glikoproteinski sloj - zona pellucida. Izvan bazalne membrane organizuje se stroma ovarii u theca folliculi.


43

Oocit se okruùje kumulusom sastavljenim od granuloznog epitela - cumulus oophorus.

Sl. 2.17 - Sekundarni folikul: 1. primarni oocit; 2. zona pellucida; 3. stratum granulosum granuloza; 4. theca folliculi

Sl. 2.20 - Tercijalni folikul: 1. oocit; 2. zona pellucida; 3. stratum granulosum; 4. theca interna; 5. theca externa; 6. antrum folliculi; 7. cumulus oophorus; 8.bazalna membrana

Ovarijalna stroma - theca oko folikula se deli na unutra{nji sloj theca interna, koji je dobro prokrvljen sa }elijama bogatim lipidima koje produkuju hormone i spolja{nji sloj - theca externa. Sl. 2.18 - Sekundarni folicul i zona pellucida

U daljoj folikulogenezi formira se tercijalni folikul sa likvorom ispunjenom {upljinom - antrum folliculi.

Sl. 2.21 - Tercijalni folicul, theca interna i externa

Sl. 2.19 - Cumulus oophorus

Tercijalni folikul nastavlja da raste do veli~ine od oko 22 mm, pred samu rupturu sa folikularnom te~no{}u od oko 5 ml i naziva se De Graff -ov folicul.

44


Sl. 2.22 - De Graff - ov folicul

Po~inje odvajanje cumulus oophorus sa oocitom od granuloze, pri ~emu se formira corona radiata koja slobodno pliva u folikularnoj te~nosti antruma folliculi. Primarni oocit koji je do tada sve vreme bio u profazi prve mejoti~ke deobe nastavlja deobu prelaze}i u sekundarni oocit sa haploidnim brojem hromozoma. Proces deobe se ponovno zaustavlja u metafazi druge mejoti~ke deobe do oplodnje.

1.3. INTERAKCIJE OOCIT - GRANULOZA Osnova razumevanja procesa reprodukcije sve vi{e se fokusira na otkrivanje i tuma~enje interakcija izme|u oocita i granuloze koje koordini{u procesima oogenoze i folikulogeneze. Praksa asistirane reproduktivne tehnologije je traìla na~in da svede sloènosti ljudskog reproduktivnog procesa na njegove osnovne elemente; folikularnu stimulaciju, antralni rast, indukciju ovulacije, in vitro fertilizaciju i transfer embriona u receptivni uterus. Kod zna~ajanog dela dobijenih embriona utvr|eno je da je razvojno nekompetentan uprkos normalnoj

morfologiji i normalnom pona{anju u in vitro uslovima razvoja tokom preimplantacionih faza. Dalji razvoj i pobolj{anje tehnika IVF - in vitro fertilisation jedino je mogu} uz dalje re{avanje i razumevanje molekularnih i }elijskih interakcija koje se de{avaju u svakom folikulu izme|u oocita i granuloznih }elija. Uklanjanje kumulusa kombinacijom enzimskih i mehani~kih metoda omogu}ava direktnu observaciju prvog polarnog tela i utvr|ivanje stadijuma mejotske maturacije. Multiparametarska procena kvaliteta oocita se moè posti}i pore|enjem sa ostalim merama folikularne maturacije uklju~uju}i i morfologiju kumulusa i endokrini status. Tako, mehani~ke manipulacije oocitima zauzimaju fundamentalnu ulogu u praksi klini~kog ART - assisted reproductive technology. Iako je {iroko rasprostranjeno mi{ljenje da kumulus i korona }elije nemaju dodatnu ulogu u razvoju posle ovulacije, prevremena disrupcija oocitnosomatskih }elijskih kontakata moè kompromitovati razvojnu kompetenciju oocita kroz mehanizme koji nisu razja{njeni. Novije studije sistema animalnih modela skre}u pa`nju na strukturnu sloènost izme|u somatskih folikularnih }elija i oocita koja se menja kod raznih sisara na razli~itim stadijumima folikularnog razvoja. Genetska i molekularna disekcija multipliciteta sekretornih faktora receptora i signalnih putanja, direktno ukazuje na postojanje sofisticiranih bidirekcionih komunikacionih sistema unutar ovarijalnog folikula koji uti~u na upotrebljivost folikula kao i kompetenciju ovuma. Da je regulacija bidirekcione komunikacije dinami~ka i direktno modulisana endogenim gonadotropinima ili egzogeno COH - controled ovarian hyperstimulation postaje o~igledno.

45


Spojevi izme|u }elija Strukturna osnova }elijskih interakcija oocit - granuloza bazira se na sposobnosti svake }elije da se specijalizuje i organizuje u tkiva koja se mogu dalje organizovati u organe i sisteme organa. Ovakva vrsta udruìvanja i kooperativnosti zahteva da se sli~ne }elije drè na okupu u me|usobno bliskom i direktnom fizi~kom kontaktu. Postoje dva glavna na~ina po kojima se }elije u tkivima drè na okupu; ekstracelularne matrice makromolekula formiraju re{etku za }elije da mogu da se kre}u i menjaju poziciju i okvir u kome }elije mogu me|usobno reagovati, a }elijski spojevi kreiraju ~vrste, direktne i specijalizovane ta~ke spoja izme|u dve }elije koje su u direktnom fizi~kom kontaktu. Spojevi izme|u }elija se, uglavnom, javljaju na plazma membrani, ili veoma blizu plazma membrane }elije, ali se moè uklju~iti i veoma mali prostor izme|u }elija, a ponekad i sloj citoplazme koji leì neposredno ispod plazmi membrane. Ovi spojevi se mogu podeliti u tri kategorije zavisno od funkcije koju obavljaju: Komunikacioni spojevi - ovi tipovi spojeva obi~no pomaù malim molekulima da pre|u sa jedne na drugu }eliju. Primeri su: - hemijska sinapsa - gap spoj Impermeabilni spojevi - ovi spojevi odràvaju }elije u kontaktu sa svojim susedima, ali spre~avaju razmenu sadràja. Primeri su: - ~vrst - tight spoj - septalni spoj Adherentni spojevi - prosto mehani~ko pri~vr{}ivanje izme|u dve }elije; primeri su: - pojasni desmozom - ta~kasti desmozom - hemidesmozom

Gap spojevi, komunikacioni spojevi, su naj~e{}i tip spajanja dve }elije i mogu se na}i u skoro svakom ìvotinjskom tkivu.

a)

b) Sl. 2.23 a) i b) - Gap veza izme|u dve }elije: gj - gap veza; aj - adherentna veza

Svaki spoj dozvoljava malim molekulima, rastvorljivim u vodi, da se kre}u direktno izme|u citoplazmi dve }elije koje su u kontaktu, {to zna~i da obe }elije dele metabolite pa ~ak i elektri~ne osobine. Ovi tipovi spojeva su formirani od proteina koji potpuno prelaze plazma membranu jedne }elije i ostvaruju kontakt sa identi~nim proteinom koji prelazi plazma membranu susedne }elije. Mala grupa ovih proteina zajedno formira kanal - connexon

46


kroz membranu. Materijali rastvorljivi u vodi se mogu kretati kroz membranu pomo}u ovog kanala i mogu pro}i direktno u connexon u naspramnoj membrani susedne }elije. Po{to proteinski connexoni formiraju spoj, membrane }elija ostaju odvojene malim zarezom - gap od oko 3 nanometra. Ujedinjeni connexon-i formiraju grupe u membranama }elija u broju koji se kre}e od 2 do 300 kanala po grupi - cluster. Proteini u ovim connexon kanalima i grupe gap spojeva su isti i locirani u plazma membrani kao pojedina~ne podjedinice. Kada je potrebno one se udruùju bo~nim pomeranjem u plazma membrani, formiraju}i kanal i spajaju}i jednu }eliju sa drugom.

^vrsti - tight spojevi Ove veze spadaju u impermeabilne spojeve. Mnoge povr{ine na telu ~oveka i u unutra{njosti tela se sastoje od slojeva }elija koje deluju kao veoma selektivne barijere u odnosu na prolazak materijala u bilo kom pravcu. Ovi }elijski spojevi odvajaju dve strane organa ili dve strukture, unutra{nju i spolja{nju, jer imaju razli~ite hemijske sastave koji moraju ostati odvojeni i udaljeni jedan od drugog. Na primer, epitelijalne }elije koje oblaù tanko crevo kod ljudi su pore|ane u sloj koji odvaja sadràj creva i unutra{nju {upljinu organa koja se prazni u krvne sudove. Dok se pona{a kao barijera koja spre~ava polusvarenu hranu da se pome{a sa telesnim te~nostima, ovaj sloj epitelijalnih }elija, tako|e, mora delovati kao veoma selektivna pumpa koja upumpava potrebne hranljive sastojke iz hrane koja se vari u krvotok. Specijalni ~vrsti spojevi izme|u }elija epitela su veoma va`ni, jer omogu}avaju

}elijama da se odrè na okupu kao sloj, drè ih jednu uz drugu i pomaù }elijama da se pona{aju kao veoma selektivna barijera. Kontinualni nizovi spojenih proteina formiraju vezu izme|u plazma membrana dve susedne epitelijalne }elije na takav na~in da prave veoma ~vrst kontakt izme|u dve plazme membrane, prelaze}i intercelularni prostor i potpuno zatvaraju}i prostore izme|u njih. Ovi nizovi proteina se proteù skoro oko cele }elije formiraju}i potpun krug. Na ovakvim spojevima re{etka nizova spojenih proteina ujedinjuje dve membrane toliko blisko da nema intercelularnog prostora. Kada absorbuju hranljive molekule na njihovim spoljnim povr{inama molekuli se prebacuju kroz epitelijalne }elije i iz }elije prelaze u krv. Na ovaj na~in ~vrsti spojevi izme|u epitelijalnih }elija spre~avaju hranljive molekule da se difunduju i izme|u susednih }elija, spre~avaju}i transportne proteine da kre}u sa povr{ine jedne }elije na povr{inu druge i ujedinjuju epitelijalne }elije u kontinuirani sloj.

Transzonalna projekcija Interakcija oocit - granuloza postoji u vi{e oblika unutar rastu}eg folikula. Ovo podrazumeva pored direktnog }elijskog kontakta putem gore opisanih spojeva i izmenu zna~ajnih parakrinih signala, kao {to su GDF 9 - growth differentiation factor i kit - ligand. Somatske granulozne }elije koje okruùju oocit podleù periodi~nim promenama u strukturi i funkciji koje sledstveno prate potrebe razvijaju}eg oocita. Sveobuhvatni odnos oocita i okolnih granuloznih }elija naziva se TZP - transzonal projections. Poznato je da na nivou primordijalnih folikula postoje gap spojevi izme|u oocita i granuloznih }elija. Jednom kada je folikulogeneza inicirana


postepeno deponovanje zone pelucide na povr{ini }elije stvara permanentnu, ali vrlo podlo`nu uticajima, ekstracelularnu barijeru izme|u germinativne }elije i granuloznih }elija. Posebna karakteristika granuloznih }elija je sposobnost prodiranja kroz zonu pellucidu i u~vr{}ivanje citoplazmatskih projekcija za povr{inu oocita da bi se odrào fizi~ki kontakt na ovoj heterocelularnoj povr{ini. Transzonalne projekcije su prisutne kod preantralnog folikula gde one duboko invaginiraju oocit, ponekad penetriraju}i vrlo blizu germinalnog vezikula. U kasnijoj fazi razvoja folikula na|eno je da se transzonalne projekcije zavr{avaju mnogo povr{nije na oocitu i da se njihov broj postepeno smanjuje sa sazrevanjem folikula.

Citoskelet Citoarhitektura, odnosno citoskelet, podrazumeva postojanje aktinskih filamenata koji su organizovani u vidu paralelnih tvorevina.

Sl. 2.24- Citoskelet oocita: -mikrotubule (crvene); - F - actin (zeleno) -myosin 2 (plavo)

Agregati F aktina su koncentrisani u transzonalnim projekcijama. Intermedijarni filamenti, tipi~ni markeri }elija mezenhimalnog porekla, detektovani su u granu-

47

loznim }elijama. Epitelijalni keratini su tako|e prisutni u granuloznim }elijama, a njihovo mesto nagomilavanja je u vidu visoko diferenciranih formi }elijskih adhezija poznatih kao desmozomi. Transzonalne projekcije uklju~uju i mikrotubule kao najve}e citoskeletne formacije. Mikrotubuli su sastavljeni od heterodimeri~kih subjedinica alfa i beta. Nedavna istraìvanja su dokazala prisustvo molekula koji su ina~e uklju~eni u neurotransmisiju na nivou oocit - granulozna }elija, {to ukazuje da transzonalne projekcije sluè kao aksonu sli~ni provodnik za makromolekularnu izmenu. Karakteristike transzonalne penetracije se menjaju sa rastom folikula, kako u pogledu gustine, tako i u pogledu obima penetracije ooleme. Broj gap spojeva je zavistan od estrogena i FSH - follicle stimulating hormone-a. Iz svega do sada navedenog je jasno da oocit, da bi mogao da u~estvuje u promenama koje po~inju sa penetracijom sperme, prolazi kroz ~itav niz molekularnih i celularnih zbivanja koji defini{u njegov razvojni potencijal. To podrazumeva inicijaciju mitoze i kompletiranje mejoze, podr{ku monospermi~noj fertilizaciji, aktivaciju oocita i obezbe|ivanje vremenski zavisnog prelaza od oslanjanja na genski sistem oocita do embrionalnog genoma. Kako je poznato da je u in vivo uslovima mejoti~ka deoba uslovljena inhibiraju}im faktorima koje stvaraju somatske }elije unutar ovarijalnog folikula, postavlja se pitanje kada u toku procesa folikulogeneze oocit sti~e sposobnost da nastavi mejoti~ku deobu i to kroz M fazu do aresta u metafazi druge mejoti~ke deobe. Ove promene uklju~uju strukturno remodeliranje specifi~nih nukleolarnih - nucleolus i citoplazmatskih - mikrotubularnih struktura. Tako progresivna kondenzacija hromati-

48


na u toku rasta oocita kulminira SN - surrounded nucleolus konfiguracijom u vreme stvaranja antruma, {to je morfolo{ka manifestacija sveop{te transkripcione represije. Remodeliranje hromatina oocita koje se de{ava u antralnom folikulu koincidira vremenski sa stvaranjem materinskih alela, lokalizovanjem dimetiltransferaze neophodne za metilaciju embrionalnog genoma i sticanjem mejoti~ke kompetencije. Esencijalni doga|aji za kompletiranje }elijskog mejoti~kog ciklusa ispoljavaju se relativno rano u folikularnom razvoju i imaju zna~ajan uticaj na remodeliranje hromatina u kasnijem embrionalnom razvoju. Promene u }elijskom metabolizmu u toku procesa maturacije imaju uticaj na nuklearno remodeliranje nakon fertilizacije. Sa nastavkom mejoti~ke deobe de{avaju se velike promene u mikrotubularnom citoskeletu koje su u vezi sa ispoljavanjem

}elijskog polariteta uspostavljanjem animalno-vegetativne ose. Remodeliranje mikrotubularnog citoskeleta kao odgovor na signal primljen preko spojeva somatskim }elijama za oolemu, stabilizuje kortikalni citoskeleton ograni~avaju}i nakupljanje molekula, ili organela koje ispoljavaju afinitet za mikrotubule ili centrozome. Mogu}nost osloba|anja kortikalnih granula i sposobnost da se generi{e i odraàva oscilacijama kalcijuma, moè tako|e da bude veoma vaàn ~inilac u sazrevanju oocita. Ovu sposobnost oocit sti~e kasno u toku oogeneze. Na{a saznanja u ovoj oblasti su jo{ uvek limitirana. FSH - follicle stimulating hormoni i LH - luteinizing hormoni su samo akteri finalne maturacije oocita i ovulacije deluju}i u kratkom periodu u pore|enju sa mesecima neophodnim sa rast i sazrevanje oocita, odnosno, folikula.

Tabela 2-5: Razvojne etape pri kojima funkcioni{u interakcije oocit - granuloza

Etapa Pre-antralni folikuli

TZP Gustina Visoka

Preovulatorni antralni folikuli

Umerena

Ovularni folikuli

Visoka

Funkcije - Podrška rastu i nutriciji oocita - Trans}elijska razmena parakrinih faktora - Stvaranje polariteta oocita - Odràvanje transkripcione/translacione aktivnosti u oocitu - Podrška pribavljanju mejoti~ke kompetencije - Podrška transkripcionalnoj represiji - Medijacija u odràvanju mejotskog zastoja - Potiskivanje spontane luteinizacije - Olakšavanje razmene parakrinih faktora - Medijacija u~vrš}enja korone za kumulus - Remodeliranje matrice zone pelucide - Olakšavanje hiperaktivacije penetracije sperme - Odràvanje polariteta oocita - Spre~avanje gubitka perivitelinskih faktora - Poja~avanje matrice hialuroni~ne kiseline - Uspostavljanje molekularne filtracije grani~nih faktora zone - Regulisanje depozicije i dispozicije faktora u oocitu


Nasuprot dokaza koji prikazuju ekstenzivnu sekreciju i signaliziranje kojim posreduju parakrini faktori rasta na nivou oocit - granulosa, TZP - transzonal projections obavlja vitalnu ulogu u parakrinoj komunikaciji u jajniku i daje podr{ku metaboli~kim i biosinteti~kim potrebama oocita koji raste i sazreva. Dok direktni dokaz za transfer ATP adenosine triphosphate iz kumulusa u oocite nedostaje, sekrecija somatskih }elija i endocitoti~ko hranjenje oocita, ili direktni transfer kroz gap spojeve predstavlja mogu}e mehanizme za metaboli~ku potporu somatskih }elija. Studije in vitro sazrelih oocita su pokazale da smanjeni nivoi ATP - adenosine triphosphate u oocitima ne uti~u na mejoti~ki progres, ali uti~u na razvoj embriona. Da li ovi kasniji deficiti u razvoju poti~u od ugroènih ATP - adenosine triphosphate zaliha u oocitima, ili od somatske }elije, ostaje da se utvrdi. Sa aktiviranjem gena koji kodiraju proteine za zonu pellucidu za vreme tranzicije iz primordijalnog u primarni folikul, zona postaje perzistentna, stalna i velika barijera za kontakt oocit - granulosa. Poznato je da stvaranje zone pelucide predstavlja nusprodukt specifi~ne ekspresije gena oocita i sekrecije razli~itih zona proteina kojoj posreduju granulozne }elije kroz, za sada, nejasno definisane mehanizme. Sposobnost granuloznih }elija da razviju TZP - transzonal projections i formiraju stabilne adhezione i gap kontakte sa oolemom, oslanja se na brz preokret i ponovno modeliranje zone sa nastankom folikulogeneze. Gustina i organizacija TZP - transzonal projections se menja dramati~no za vreme folikulogeneze sa ve}om ra{ireno{}u ovih struktura zapaènih u pre-antralnom, a ne u kasnijem stadijumu razvoja folikula. Iako

49

faktori koji reguli{u formiranje TZP - transzonal projections rano u razvoju folikula ostaju nepoznati, nedavno je sugerisano da bi ove strukture mogle da posreduju u signalizaciji ligandima, kit - ligand, dobijenih od raznih oocita GDF9 - growth differentiation factor, BMP 15 - bone morphogenic protein ili granuloze, za koje se zna da igraju bitne uloge u ovom stadijumu. Po{to je }elijska adhezija putem cadherina hormonski regulisana u ovarijalnim folikulama, relativna stabilnost kontakata izme|u granuloza }elija i zone, ili ooleme mora biti bolje odre|ena. Interesantno je naglasiti da je sposobnost formiranja gap spojeva ~esto sekundarna za }elije koje uspostavljaju kalcijumski zavisne cadherin adhezije. Po{to se gap spojevi, koji posreduju u metaboli~koj kooperaciji neophodnoj za rast oocita, uglavnom de{avaju za vreme preantralnih stadijuma razvoja folikula, o~ekivalo bi se da bi uslovi, koji ugroàvaju funkciju gap spoja rano u folikulogenezi, promenili rast oocita, a kasnije i razvojni potencijal. Selektivna disrupcija komunikacije gap spojeva ugroàva razvoj i oocita kao i folikula poja~avaju}i uzajamne zavisnosti ovih procesa i njihovog oslanjanja na komunikaciju gap spojevima. Ako su transkripcija i regulacija gena za }elijske spojeve oocit - granuloza podlo`ni hormonalnoj regulaciji, ~ini se verovatnim da naru{avanje reda u komunikacionim putanjama moè rezultirati iz izmena folikularne hormonalne sredine preovulatornog i periovulatornog stadijuma folikulogeneze. Ako takve izmene imaju negativne posledice, mogle bi da objasne jedinstvenu i diferencijalnu kompetenciju embriona unutar kohorta ~ije se pona{anje in vitro za vreme preimplantacionih stadijuma ~ini ekvivalentnim i normalnim.

50


Centralna stvar za uspe{no implementiranje in vitro strategija za dobijanje razvojno kompetentnih oocita je identifikacija gena koji u~estvuju u posredovanju pri interakcijama oocit - granuloza i razumevanje njihove regulacije i funkcije za vreme folikulogeneze. Ovo je posebno va`no kod in vitro sazrelih oocita gde je klini~ki stepen uspeha niì od oocita sazrelih in vivo. Uloga interakcije oocit - granuloza za vreme ovulacije i maturacije oocita je najvi{e prou~avana. Varijacije u stepenu ekspanzije kumulusa, retencija korona }elija, veli~ina perivitelinskog prostora, granularnost oocita i morfologija kumulusa ili oocita su determinante koje odre|uju kvalitet oocita kod selekcije za IVF - in vitro fertilisation. Uklanjanje kumulusa radi utvr|ivanja statusa sazrevanja oocita koristi se u konvencionalnoj IVF - in vitro fertilisation ili ICSI - intra citoplasmatic sperm injection proceduri. Mogu}e {tete zbog toga nisu do kraja prou~ene s obzirom na nedostatak pouzdanih neinvazivnih metoda odre|ivanja kvaliteta oocita. Ranije studije su pokazale da ova manipulacija nije {tetno uticala na trudno}e. Ovo indicira da uklanjanje korone nije {tetno za oocite sazrele in vitro pod standardnim COH - controled ovarian hyperstimulation uslovima, ali ne i za kvalitet i kompentenciju oocita sazrelih in vitro upotrebom skra}enih COH - controled ovarian hyperstimulation protokola. Podaci iz skorijih studija ukazuju na fiziolo{ku ulogu kumulusa tokom periovulatornog perioda kada dolazi do reinicijacije i zavr{etka mejoze i kada kompleks kumulusa podleè ekspanziji. Ekspanzija kumulusa je kompleksan niz signalnih pojava u koje su uklju~ene aktivne transkripcione i metaboli~ke modifikacije koje

predstavljaju funkcionalan nastavak komunikacije oocit - granuloza zapo~et za vreme folikulogeneze. Za vreme sazrevanja oocita se de{avaju metaboli~ke promene u nivoima ATP adenosine triphosphate molekula kod proteinske forforilacije, translacije nagomilane mRNK - messenger ribonucleic acid i smanjenje ekvivalenata, kao na primer glutationa GSH - glutathione.

Sl. 2.25 - ATP - adenosine triphosphate

Za ove modifikacije u metabolizmu oocita se veruje da podràvaju progresiju embrionskih }elija, {tite embrion od oksidativnog stresa i podràvaju pronuklearni razvoj nakon aktivacije oocita. Efikasnost sa kojom se oociti podvrgavaju unapre|enim aktivnostima ove vrste je kompromitovana odsustvom }elija kumulusa. Odràvanje veze sa kumulusom kroz period sazrevanja je va`no za potporu metabolizma oocita i drugih biosinteti~kih aktivnosti neposredno pre i posle fertilizacije, a mo`da i za preimplantacionu fazu. Bilo kakav prekid metaboli~ke kooperacije i komunikacije izme|u oocita i granuloze moè ugroziti funkciju oocita, a posledice ovakvog o{te}enja se otkrivaju tek u kasnijim stadijumima razvoja embriona.


Postavlja se pitanje do kakvih promena dolazi na oocitima i granuloznim }elijama za vreme ekspanzije kumulusa u odnosu na }elijske konekcije i signalizacije i kakvu ulogu igra ekstracelularna matrica kumulusa u fiziolo{koj aktivaciji oocita ili kompleksa kumulusa. Najnovija istraìvanja indiciraju da se sposobnost oocita za normalan rast i razvoj i razvojni potencijal oslanja na va`ne modifikacije u }elijskom signaliziranju i sekreciji faktora koji se de{ava za vreme periovularnog perioda kada dolazi do ekspanzije kumulusa. Na~in konekcija za vreme sazrevanja oocita in vitro je modifikovan na gonadotropin zavisni na~in. TZP - transzonal projections se pove}ava po pitanju gustine i zapremine kod in vitro sazrevanja ljudskih oocita u prisustvu FSH - follicle stimulating hormone-a. Pitanje kako se ove projekcije formiraju kao odgovor na gonadotropine ostaje bez odgovora, ali novi uvid u aktivaciju sistema signaliziranja pokazuje direktnu modifikaciju stabilnosti citoskeletnih elemenata. Mikrotubule koje sadrè TZP - transzonal projections formiraju staze za kretanje organela kao {to su mitohondrije i endozomi. Mikrotubule formiraju jezgro citoskeletnih elemenata u TZP - transzonal projections, a subpopulacije mikrotubula su posttranslaciono modifikovane radi pobolj{anja njihove stabilnosti. Do danas nije ispitano da li citoskeletne modifikacije pobu|ene gonadotropinima u~estvuju u pobolj{anju kvaliteta oocita. Kumulus aktivno u~estvuje u adekvatnom generisanju ATP - adenosine triphosphate za vreme sazrevanja oocita. Priliv mitohondrija unutar TZP - transzonal projections predstavlja mehanizam za lokalnu produkciju i isporuku ATP - adenosine

51

triphosphate oocitima za vreme metaboli~kog zahtevnog procesa sazrevanja oocita. Nedavni dokazi da }elije kumulusa i oociti razmenjuju parakrine faktore za vreme periovulatornog perioda, omogu}ava pravovremeni prolaz supstanci izme|u dve }elijske komore odeljka. Da li ove konekcije i dalje sluè za uspostavljanje asimetrija u distribuciji molekula unutar oocita, ostaje da se vidi. Nedavni radovi su jasno pokazali da su TZP - transzonal projections granuloza }elija mesta produkcije STAT3 - signal transducers and activator of transcription leptina i da generi{u asimetri~ne {ablone depozicije ovih i drugih faktora u oocitima i embrionima. Postaje jasno da sloèni {abloni signaliziranja u oocitima i granuloza }elijama posreduju u procesu ovulacije, ekspanzije kumulusa i sazrevanju oocita. Prostaglandini i steroidi izazivaju promene u metabolizmu kumulusa potrebne za samu ovulaciju i neutrali{u oksidativne i inflamatorne reakcije pravovremeno. Da li ove promene metaboli~ke aktivacije kumulusa uklju~uju i depoziciju faktora rasta koji se koriste u kasnijim stadijumima razvoja, nije poznato, ali s obzirom na ~injenicu da disruptivne tehnike, koje se trenutno koriste u praksi, elimini{u }elije kumulusa i uni{tavaju va`nu arhitekturu baziranu na matriksu, mogu}e je da moè do}i do ozbiljnih poreme}aja. U ove poreme}aje su uklju~eni gubici usled difuzije faktora zone, ili faktora ograni~enih oolemom, kao rezultat pove}ane poroznosti zone. Ovo je naro~ito va`no za normalno funkcionisanje oocita, jer se proces ekspanzije kumulusa odvija u prisustvu remodelovanja matriksa zone posle povla~enja TZP - transzonal projections.

52


Tabela 2-6: Kori{}ene metode i mogu}e posledice uklanjanja kumulusa

USLOV

CILJ

POSLEDICE

Hijaluronidaza

Matriks kumulusa

Enzimska disocijacija matriksa osloba|a spojeve }elija - }elija i }elija-zona; pove}ava poroznost zone i poja~ava odliv perivitelinskih faktora; odvaja oolemu od zone

Mehani~ko skidanje

Spoj granuloznih }elija i zone (integrin/citoskelet)

Procedura skidanja probija membranu plazme, gubitak organela uzrokuje proteolizu, povla~enje TZP pove}ava poroznost zone, pove}anje gubitka i degradaciju perivitelinskih faktora; moè do}i do proteolize površine oocita.

Divalentna katjonska kelatacija

gap spojevi

Brzo rasparivanje eliminiše komunikaciju gap spojeva i gubitak metaboli~ke podrške kumulusa

Hipertoni~ki šok - sukroza

Adhezioni spojevi

]elijska disocijacija onemogu}ava aktiviranje signaliziranja na mestima kontakta

Adhezioni agonisti, kadherinski fragment

Adhezioni spojevi

]elijska disocijacija inaktivira signaliziranje na mestima kontakta.

Alternative

Navedene fundamentalne osobine strukturnih osnova komunikacija granuloza - oocit uti~u na sticanje razvojne kompetentnosti oocita. U daljim istraìvanjima treba dobiti odgovor na pitanja: koja je uloga gap veza u odràvanju mejotskog zastoja, obnavljanju periovulatorne mejoze i mejoti~ke progresije ka drugoj metafazi, zatim razja{njenje mehanizama koje kumulusu omogu}uju transport faktora somatskih

}elija ka oocitima i njihovo o~uvanje u polarisanom obliku, na povr{ini oocita ili u kortinalnim delovima. Isto tako potreban je odgovor koji su to faktori koji najpre odràvaju homeostatsku sredinu u izolovanim oocitima, a kasnije ponovo uspostavljaju aktivnost parakrinih faktora koji mogu izmeniti metabolizam oocita i embriona i poja~ati razvojni potencijal. O~igledno da sve dok se vi{e ne nau~i o strukturnim i funkcionalnim osnovama

53


komunikacije granuloza - oocit, praznine u na{em razumevanju intraovarijalnog potpornog sistema za razvoj oocita ne}e do}i do napretka programa asistirane reproduktivne tehnologije. Od zna~aja za dalje ispitivanje je da li se fragmentacija blastomere koja uti~e na jedan deo embriona u stadijumu rane deobe u kohortima, moè povezati sa preuranjenim prekidom signaliziranja izme|u zametka i somatskih }elija. Rizik dana{njih tehnika uklanjanja kumulusa u programima asistirane reprodukcije nas navodi na razmi{ljanja o potencijalno manje {tetnim na~inima, kao {to je tretman sa adhezionim agonistima, malim peptidima koji se koriste za pomeranje selektivnih tipova }elijskih adhezija. Neke od kombinacija ovih pristupa bi mogle dovesti do manipulacija koje nanose manju {tetu oocitima, a koje zadràvaju odgovaraju}e }elijske veze potrebne za optimiziranje kvaliteta oocita. Upoznavanjem vrsta interakcija oocit granuloza koje koordini{u procesima oogeneze i folikulogeneze omogu}ava se dalje unapre|enje metoda ART - assisted reproductive technology, sa ciljem neugroàvanja kompetentnosti razvoja oocita i embriona. Ovo je mogu}e zato {to se bar tri slede}a fiziolo{ka procesa, koja se vezuju za in vivo produkciju ljudskih oocita, me{aju usled na~ina manipulacija kojima je ovaj materijal podvrgnut u rutinskoj proceduri: - disrupcija TZP - transzonal projections koja je potrebna za bidirekcionu razmenu faktora sekretovanih od strane oocita, ili granuloza }elija, - pogor{anje transporta metabolita i drugih molekula od granuloze ka oocitima putem gap spojeva, i

- prekidanje mehanizma kori{}enog za utvr|ivanje asimetri~nih gradijenata organela i proteinskih faktora koji posreduju u odgovaraju}oj prostornoj alokaciji materijala unutar blastomere. Kada bude dostignuto i omogu}eno uspostavljanje i odràvanje ovih organizacionih principa oocita zna~ajno }e se pobolj{ati ishod klini~kog IVF - in vitro fertilisation.

Faktori rasta i interakcije oocit-granuloza Tokom reproduktivnog ìvota jajnik se oslanja na folikule u stadijumu mirovanja. Mali broj folikula napu{ta ovaj pool folikula i po~inje da raste. Rane faze folikulogeneze de{avaju se veoma polako. Onkogeni c-myc i erb-A lokalizovani u oocitu primordijalnog folikula i okolnim }elijama mogu imati ulogu regulisanja autonomnog rasta. C-kit koji je prisutan u primordijalnim oocitima ima va`nu ulogu kao inhibitor interakcije C-kita sa kit ligandom koji poti~e iz granuloznih }elija, blokiraju}i rast. Tkivo koje okruùje primordijalne folikule nesumnjivo ima ulogu u koordinaciji inicijacije rasta. ^lanovi familije transformiraju}ih faktora rasta TGF-beta - transforming growth factor; aktivin A, AMH -anti-Mullerian hormon, su va`ni faktori koji uti~u na stimulaciju rasta folikula. Faktori vaskularnog porekla, periciti, kao {to je Thy 1 - diferentiation protein, mogu da signalizuju oocitu da ukloni hipoteti~ki arresting factor koji poti~e iz samog oocita i deluje preko granuloznih }elija. Sve vi{e je dokaza da neki neurotropini imaju ulogu u inicijaciji folikularnog razvoja; nervni faktor rasta NGF - nerve

54


growth factor, BDNF - brain derived neurotrophic factor, neurotrophini 3 i 4, kao i VIP - vasoactive intestinal polypeptide. Dok je ta~no vreme koje je potrebno folikulu da dostigne preantralnu fazu za sada nepoznato, pretpostavka je da ovaj proces traje vi{e od 300 dana. Jedan od razloga je dugo vreme dupliranja granuloznih }elija koje traje oko 250 sati. Nakon regrutovanja, folikul po~inje da pove}ava svoju veli~inu usled proliferacije granuloznih }elija i rasta oocita. Ovaj proces je kontrolisan genom nazvanim faktor diferencijacije rasta GDF-9 - growth differentiation factor. Gen GDF-9 - growth differentiation factor je ~lan super familije transformi{u}eg faktora rasta TGF-ß transforming growth factor u koju su uklju~eni svi TGF - transforming growth factor, morfogeneti~ki proteini kostiju BMPs - bone morphogenetic proteins, MISS - meiotic spindle stability protein, aktivini i inhibin. Zapaànja da se gen GDF-9 - growth differentiation factor ekspresuje na oocit tokom rane folikulogeneze, nagove{tava da neki drugi gen tako|e moè da igra va`nu ulogu kod promena u jajniku. Smatra se da je odgovaraju}a interakcija izme|u C-kit i kit liganda neophodna za ovaj proces. Kada folikul dostigne veli~inu pri kojoj sadrì od 3 do 6 slojeva granuloznih }elija, okruùju}e tkivo se uslojava i diferencira na dva dela. Spoljni deo, theca externa je u osnovi sli~na stromalnom tkivu koje ga okruùje. U unutra{njem delu, theca interna stromalne }elije se diferenciraju u epitelialne }elije. U ovoj fazi folikul je definisan kao preantralni folikul. Zna~ajan deo rastu}ih folikula ne uspeva da preìvi i oni degeneri{u procesom folikularne atrezije. Apoptoza je mehanizam folikularne atrezije.

Nakon faze primarnog folikula, gonadotropini, naro~ito FSH - follicle stimulating hormoni, imaju sve ve}u ulogu u podràvanju folikularnog rasta. Folikularni rast i razvoj su podràni kombinovanim delovanjem FSH - follicle stimulating hormone-a i LH - luteinizing hormone-a na folikularne }elije. FSH - follicle stimulating hormone i LH - luteinizing hormone se vezuju za svoje specifi~ne receptore na povr{ini granuloze i tekalnih intersticijalnih }elija. Aktivacija FSHR follicle stimulating hormone receptor i LHR - luteinizing hormone receptor stimuli{e mitozu i odgovor granuloze i theca interna }elija. Nakon preantralne faze folikularni fluid po~inje da se gomila u folikulu {ire}i ga relativno brzo. Dominantni folikul se odabira iz cohort-a folikula i ~itava faza folikularnog rasta, koja zavisi od hormona, }e biti zavr{ena za oko 40-50 dana. Ovaj proces je hormonski kontrolisan. Estrogeni i gonadotropini inhibiraju, a androgeni podsti~u smrt ovarijalnih }elija. Procenjeno je da je do starosti od 30 godina gubitak folikula i oocita u ovarijumu uzrokovan atrezijom folikula. Posle dostizanja kriti~nog praga u broju folikula, procenjeno na 25.000, regrutovanje rastu}ih folikula se pove}ava dvostruko. Prema teoriji dve }elije - dva gonadotropina }elije granuloze i theca interne, kao i oba gonadotropina, su neophodni za ispravnu ovarijalnu steroidogenezu. Zbog LH - luteinizing hormone-a stimulacije, theca }elije proizvode androgene de novo. Aromatizacija androgena u estrogene se odvija u susednim granuloznim }elijama pod uticajem FSH - follicle stimulating hormone-a. Tokom lutealne faze, CL - corpus luteum proizvodi progesteron i estrogene.


Fiziolo{ke aktivnosti estrogena su regulisane enzimom 17ß HSD - hydroxysteroid dehydrogenaze. Tip 1 - 17ß HSD - hydroxysteroid dehydrogenaze je odgovoran za konverziju polnog steroida niske aktivnosti estrona E1 u potentniji oblik estradiol E2, dok enzim tipa 2 katali{e suprotnu reakciju. Enzim 17ß HSD - hydroxysteroid dehydrogenaze tip 1 se ekspresuje u granuloznim }elijama i u CL - corpus luteum-u, dok prisustvo enzima tipa 2 nije utvr|eno. Uloga ovih enzima u CL- corpus luteum-u tokom ~itave lutealne faze je jo{ uvek nesigurna. Nedavno otkrivene mutacije FSH - follicle stimulating hormone-a i FSHR - follicle stimulating hormone receptor-a kod ljudi, su zna~ajno pro{irile na{e znanje o ulozi FSH - follicle stimulating hormone u reprodukciji. FSH - follicle stimulating hormone je apsolutno neophodan za ispravno funkcionisanje jajnika kod ène. @ene koje su homozigotne na inaktiviraju}u mutaciju FSHR - follicle stimulating hormone receptor gena pokazuju hipergonadotropnu ovarijalnu disgeneziju, amenoreju i neplodnost. Osim toga, uzorci biopsije ovarijuma homozigotnih èna pokazuju veliki broj primordijalnih i primarnih folikula sa jako retkim znacima daljeg folikularnog razvoja. Me|utim, mu{karci koji su homozigotni na FSHR - follicle stimulating hormone receptor mutaciju su slabije plodni uz niì broj spermatozoida i manju veli~inu testisa, {to nagove{tava da FSH - follicle stimulating hormone nije apsolutno neophodan za iniciranje spermatogeneze u pubertetu.

Perifolikularna vaskularnost Perifolikularni protok krvi je pokazatelj folikularne heterogenosti i oocitne kompetencije i prediktor implantacije.

55

Angiogeneza, razvoj novih krvnih sudova, je opisana kao feto-onkogeni doga|aj po{to je osobina fetalnog razvoja koja se dovodi u vezu sa razvojem tumora. Kontrolisana cikli~na angiogeneza je na jedinstven na~in iskazana u reproduktivnom traktu odrasle ènske osobe. Angiogeneza, u ènskom traktu, se iskazuje u jajniku i endometrijumu. U jajniku se perifolikularna angiogeneza iskazuje progresijom folikula ka antralnom stadijumu, nastavlja posle ovulacije razvojem CL - corpus luteum i u odsustvu trudno}e, prestaje sa regresijom corpus luteum-a. Prekid angiogenskih doga|aja na jednom mestu jajnika je pra}en inicijacijom angiogenskih doga|aja na drugom mestu i razvojem novih folikula. Angiogeneza u endometrijumu prati implantaciju embriona. To je programiran doga|aj koji vodi ka razvoju placente, ali se povla~i, regresira u slu~aju neuspeha rane trudno}e. Primordijalni i preantralni folikuli su avaskularni. Razvoj antralnog folikula iz primordijalnog je pra}en diferencijacijom skvamoznih }elija primordijalnog folikula u karakteristi~no kubi~ne granulozne }elije i diferencijacijom slojeva tekalnih }elija iz ovarijalne strome. Ovi slojevi }elija, razdvojeni laminom su bitni za funkcionisanje folikula i daju veliki doprinos intra-folikularnoj sredini intereaguju}i u hormonalnoj kontroli folikularnog razvoja. Bezbrojne studije izve{tavaju o sloènom nizu aktivnosti granuloznih }elija; steroidogenim aktivnostima, produkciji faktora rasta citokina, enzima, regulisanju proteina koji daju doprinos promenama mikrosredine oocit - folikul. Sa napretkom folikula ka antralnom stadijumu theca interna i eksterna sti~u vaskularizaciju koja sadrì u sebi mreù

56


kapilara. Ova mreà kapilara, u folikularnoj fazi je potpuno ekstrafolikularna. Nakon ovulacije, dominantni folikul rupturira i po~inje formiranje CL - corpus luteum. Glavna funkcija CL - corpus luteum je da proizvodi progesteron u cilju pripreme endometrijuma za implantaciju. Tokom normalnih menstrualnih ciklusa je ovaj proces pod kontrolom pituitarnog LH - luteinizing hormone-a. U slu~aju trudno}e trofoblasti ranog embriona po~inju da proizvode HCG - human chorionic gonadotropin za odràvanje CL - corpus luteum dok se ne okon~a luteo-placentalno pomeranje. Ako ne do|e do oplodnje, dolazi do regresije CL - corpus luteum-a u cilju omogu}avanja folikularnog razvoja i ovulacije u slede}em ovarijalnom ciklusu.

1.4. SPERMATOGENEZA Kao i kod oocita, dolazi do reprogramiranja aktivnosti genoma tokom razvoja spermatozoida uz pove}anje nivoa metilacije DNK. Proces metilacije obuhvata razli~ite sekvence DNK koje su bile prepisivane, vezane za geneti~ku informaciju poreklom od oca, ili za one koje nisu uop{te bile aktivne kao {to su intracistenalne A ~estice IAP - intracisternal A particle. Humani MEST - PEG1 - mesoderm specific transcript - paternally expressed gene, demetili{e se tokom fetalnog ìvota ostaju}i nemetilisan kroz sve etape razvoja spermatozoida u zrelom dobu. Neki su analizirali nivo metilacije H19 - hystocom-

patibility gena kod mu{kih }elija zametka i otkrili da se H19 - hystocompatibility gen aktivira rano u razvoju }elija zametka pre nego {to do|e do mejoze. Isti rezultat je otkriven i kod ljudi gde je H19 - hystocompatibility gen postao metilisan pre mejoze u spermatogonijskoj etapi razvoja. Uop{teno gledano, manje je informacija o regulaciji genske aktivnosti za vreme razvoja spermatozoida u pore|enju sa onim {to se zna o oocitima. Nastavak mitotske deobe mu{kih }elija zametka u pubertetu se vremenski poklapa sa pove}anjem nivoa enzima DNK metil transferaze - Dnmt1 deoxyribonucleic acid methyltransferase u spermatocitima. Tokom ranih etapa mejoze, nivo Dnmt1s - deoxyribonucleic acid methyltransferase u spermatocitima je visok, ali je smanjenje nivoa Dnmt1 enzima bilo prime}eno u pahitenskoj etapi spermatocita. DNK metil transferaza Dnmt1s se u spermatozoidu normalno moè na}i u nukleusu i citoplazmi. Ekspresija DNK metil transferaze Dnmt3a - deoxyribonucleic acid methyltransferase u testisu se pove}ava pre ro|enja i tokom ranog postnatalnog ìvota, {to je suprotno sa nivoom ekspresije enzima DNK metil transferaze Dnmt3b - deoxyribonucleic acid methyltransferase koji je niì tokom embrionalnog ìvota i raste postnatalno. Enzim Dnmt3l deoxyribonucleic acid methyltransferase je potreban da bi do{lo do normalne mejoze i smirivanja retro transpozona. Gubitak Dnmt3a - deoxyribonucleic acid methyltransferase rezultuje sli~nim fenotipom.

57


2. SPAJANJE GAMETA - OPLODNJA Fertilizacija je proces spajanja mu{ke i ènske polne }elije - gameta, pri ~emu nastaje oplo|ena jajna }elija - zigot, koji se sloènim procesima razvija u novi organizam. Pripreme za oplodnju se de{avaju u ènskom genitalnom traktu.

Sazrevanje folikula i ovulacija su pod direktnom hormonskom kontrolom. Na slici br. 2.27 je prikaz koncentracija FSH follicle stimulating hormone-a, LH luteinizing hormone-a, estradiola i progesterona u krvi ène, koji u~estvuju u ovim procesima, u toku samoga ciklusa.

Sl. 2.26- Genitalni trakt ène: 1. ovarium, 2. orifitium externi tubae, 3. fimbriae, 4. tuba, 5. pars ampularis tubae, 6. miometrium uteri, 7. endometrium uteri, 8. cervix uteri, 9. portio uteri, 10. vagina, 11. lig.ovarii proprium, 12. lig.suspensorium ovarii, 13. stadijumi folikula ovarijuma

58


Sl.2.27 - Koncentracije hormona u toku ciklusa: FSH - folikul stimuliraju}i hormon, E 2 estradiol, Pr progesteron, LH - luteiniziraju}i hormon

Koncentracija luteiniziraju}eg hormona oko 38 ~asova pre rupture De Graff ovog folikula naglo se pove}ava grade}i LH - luteinizing hormone peak {to ima za posledicu izazivanje ovulacije i postizanje optimalne sredine za oplodnju. Pove}ava se i koncentracija FSH - follicle stimulating hormone-a. LH - luteinizing hormone peak u oocitu aktivira zavr{etak prve mejoze i po~etak druge.

Ovulacija je osloba|anje sekundarnog oocita iz De Graff - ovog folikula nakon rupture zida.

2.1. OVULACIJA U folikulu istovremeno dolazi do pove}anja rastresitosti granuloznih }elija i postepenog osloba|anja cumulus oophorus - a, pove}anja koncentracije progesterona u folikularnoj te~nosti i do pove}anja vaskularizacije perifolikularnog tkiva. Kao posledica ovih promena ostium tuba se plasira na ovarijalnu povr{inu, dolazi do rupture folikula i izlivanja folikularne te~nosti sa oocitom u njen kanal. Razvoj ostalih folikula se zaustavlja.

Sl.2.28 - De Graff - ov folikul: 1. tuba, 2. fimbrije, 3. ovarium, 4. folikul, 5. stigma

Granulozne }elije osloba|aju hijaluronsku kiselinu {to dovodi do naglog pove}anja folikularne te~nosti i uz dodatno dejstvo liti~nog enzima do rupture zida

59


Sl. 2.29 - Mehanizam prihvatanja oocita: 1. ovarium, 2. folikul pred rupturom, 3. orificijum tube, 4. fimbrije, 5. tuba, 6. lig.ovarii proprium, 7. lig.suspensorium ovarii

folikula. Pred samu rupturu prime}uje se na zidu beli~asta ta~ka, stigma koja nastaje zbog kompresije krvnih sudova zida folikula. Fimbrije tube se postavljaju oko stigme {to je omogu}eno prethodnom rotacijom tube uz pomo} lig.suspensorium ovarii i lig.ovarii proprium. Nakon rupture folikula folikularna te~nost sa oocitom ulazi u tubarni kanal ~ime je faza ovulacije zavr{ena. To je omogu}eno pripajanjem fimbrija uz ovarijum.

2.2. TRANSPORT OOCITA

Sl. 2.31 - Oocit - kumulus kompleks prihva}en od tube: 1. tuba, 2. fimbrije, 3. folikularna te~nost, 4. sekundarni oocit sa corona radiata, 5. ovarium sa atreti~nim folikulima, 6. zona pellucida, 7. prvo polarno telo, 8. sekundarni oocit, 9. corona radiata, 10. deobno vreteno u arestu

Sl. 2.30- Fimbrije tube

U tubi je sekundarni oocit okruèn coronom radiatom i folikularnom te~no{}u sa hialuronskom kiselinom koja je zbog toga lepljiva. Frekvencija ciliarnog trakta CBF - ciliary beat frequency detektovana nakon ovulacije pomaè odvajanje oocita i transport

60


du` Falopijeve tube. Stimulus je nepoznat, mada se zna da na CBF - ciliary beat frequency imaju uticaj hormoni. Kako se za vreme ovulacije osloba|a folikularni fluid i ulazi u Falopijevu tubu pretpostavka je da je ovaj fluid stimulus pove}anja CBF - ciliary beat frequency koje se prime}uje nakon ovulacije. Ispitivanja pomo}u tehnike koja snima promene intenziteta svetlosti su pokazala da se u kontaktu tube sa folikularnim fluidom pove}ava frekvencija epitelijalnih }elija CBF - ciliary beat frequency Falopijeve tube. Tako|e je postojala i zna~ajna razlika pove}anja CBF - ciliary beat frequency epitela tube potopljenog u sekretorni u pore|enju sa peritonealnim fluidom iz proliferativne faze.

2.3. CERVIKALNI KANAL U VREME OVULACIJE Nakon ejakulacije samo manji broj spermatozoida uspeva da do|e do oocita. Seminalna plazma je blago alkalna i delom za{ti}uje spermatozoide od kisele sredine vagine na putu do cervikalnog kanala gde su ponovno alkalni uslovi. Cervikalni kanal koji je van ovulacije uzan sa `lezdama i isprepletenom sluzi se menja u strukturi pod dejstvom estradiola postaju}i {iri sa pro{irenjem `lezda omogu}avaju}i prolaz spermatozoidima.

Sl. 2.32- Oocit nakon ovulacije: 1. sekundarni oocit u metafazi druge mejoze, 2. corona radiata, 3. folikularna te~nost, 4. kumulusne }elije

Oocit u tubi ~eka na oplodnju spermatozoidom lokalizovan matriksom hialuronske kiseline. Postepeno veza slabi i oocit se pomera ka uterusu cilijarnim pokretima tubarnog epitela. Do oplodnje dolazi u nekoliko narednih ~asova.

Sl. 2.33- Cervikalni kanal pre i u vreme ovulacije: 1. spermatozoidi, 2. sluz jako isprepletana, 3. kripte cervikalne `lezde, 4. rastresita sluz, 5. ulaz u cerviks

61


Sluz postaje rastresita i te~nija sa alkalnim pH vrednostima. Smatra se da pasaà cerviksa ima selektivnu ulogu, jer zadràva biolo{ki manje vredne spermatozoide.

Sl. 2.35 - Spermatozoid snimljen elektronskim mikroskopom

Na putu do oocita spermatozoid nailazi najpre na kumulusne }elije.

Sl. 2.34- Histolo{ki presek cervikalnog kanala u vreme ovulacije: 1. epitel koji stvara mukus, 2. cervikalni kanal, 3. nabori sluzokoè, 4. kripte

Nabori cervikalnog epitela formiraju kripte u kojima se skuplja sluz i nazivaju se cervikalnim `lezdama. U fazi ovulacije su pro{irene i produbljene, pa se u njima ~esto zadràvaju spermatozoidi i po nekoliko dana.

2.4. PROMENE NA SPRMATOZOIDU U TOKU OPLODNJE Na svom putu kroz genitalni trakt u kontaktu sa sekretima u njemu, u spermatozoidima dolazi do funkcionalnog sazrevanja koje se naziva kapacitacija. Membrana spermatozoida se menja sa promenom glikoproteinskog sloja, pove}anjem motiliteta i pripremama za proceduru oplodnje. Sl. 2.37- Penetracija kumulusa od strane spermatozoida

Sl. 2.36- Prvi kontakt spermatozoida sa kumulusnim }elijama

Hiperaktivnost spermatozoida ste~ena u fazi kapacitacije mu omogu}ava sve dalju penetraciju u pravcu zone pellucide.

62


Spermatozoid istovremeno osloba|a enzim hialuronidazu koja rastvara intercelularni matriks izme|u kumulusnih }elija prodiru}i sve dublje kroz kumulus.

U daljem prodiranju kroz zonu pellicidu oocita va`nu ulogu igra enzim akrozin. Ostaci spolja{nje membrane se otklanjaju hiperaktivnim pokretima spermatozoida.

Sl. 2.40- Akrozomska reakcija - otklanjanje ostataka spolja{nje membrane: 7 ostaci spolja{nje membrane

Sl. 2.38- Spermatozoidi u toku penetracije kumulusa

Kada spermatozoid dodirne zonu pellucidu prednjim delom glave, akrozomom, inducira se osloba|anje enzima - zona protein 3 i uspostavlja akrozomska reakcija. Pri tome se spolja{nja membrana spermatozoida razara i kroz formirane pore izlazi enzimski sadràj akrozomne vezikule.

U zavr{noj fazi akrozomske reakcije akrozom spermatozoida je samo pokriven unutra{njom membranom, sa aktiviranim postakrozomskim delom membrane radi spajanja sa samom jajnom }elijom.

Sl. 2.41- Akrozomska reakcija - formiranje postakrozomske membrane: 8 postakrozomska membrana

Potpunom penetracijom zone pellucide spermatozoid ulazi u perivitelinski prostor oocita. Sl. 2.39- Akrozomska reakcija - osloba|anje liti~kih enzima: 1. pore spoljašnje membrane, 2. osloba|anje akrozomskog sadràja, 3. unutrašnja akrozomska membrana, 4. enzimski sadràj akrozomske vezikule, 5. spoljašnja akrozomska membrana, 6. }elijska membrana, A glava spermatozoida, B vrat spermatozoida, C srednji deo spermatozoida

Sl. 2.42- Spermatozoid u perivitelinskom prostoru oocita: 1. postakrozomski deo membrane, 2. oolemma, 3. perivitelinski prostor, 4. zona pellucida


63

Postakrozomski deo membrane spermatozoida se spaja sa oolemom aktivacijom obostranih receptora.

Sl. 2.43 - Spajanje spermatozoida i ooleme: 1. postakrozomski deo membrane, 2. oolemma, 3. perivitelinski prostor, 4. zona pellucida

Sadràj spermatozoida prelazi kompletno u citoplazmu oocita. U daljem procesu dolazi do formiranja fertilizacione opne promenom zone pellucide i ooleme ~ime nastaje polispermi~ni blok. U oocitu se zavr{ava druga mejoti~ka deoba i po~inje aktivacija, na molekularnom nivou oocita, o~eve DNK - deoksiribonukleinske kiseline.

Sl. 2.45- Polispermi~ni blok: 1.zona pelucida, 2. perivitelinski prostor, 3. kortikalni vezikuli, 4. oolemma

Na spermatozoidu dolazi do gubitka }elijske membrane glave i srednjeg dela, a kod oocita nestaje oolemma {to omogu}ava spajanje struktura spermatozoida i oocita, {to se naziva impregnacija oocita. Membrana repa spermatozoida ostaje.

Sl. 2.44- Invaginacija spermatozoida: 5. kortikalni vezikul oocita

Da bi se onemogu}io prodor drugih spermatozoida u oolemi dolazi do trenutne depolarizacije sa promenom povr{ine membrane i aktiviranjem vezikula koji izbacuju svoj sadràj u perivitelinski prostor {to dovodi do zadebljanja zone pellucide koja postaje nepropustljiva za ostale spermatozoide ~ine}i polispermi~ni blok.

Sl. 2.46- Impregnacija oocita: 1.oolemma, 2. }elijska membrana spermatozoida, 3. kinozillium, 4. kompaktno jedro spermatozoida, 5. centrozom spermatozoida

U glavi spermatozoida se nalazi kondenzovan DNK - deoksiribonukleinska kiselina. Centrozom koji je popre~no postavljen je citoplazmati~na organela koja u kasnijim

64


fazama igra va`nu ulogu. Kinozilium ostatak repa spermatozoida nestaje u kasnijoj fazi. Smatra se da sve mitohondrije sa o~eve strane bivaju eliminisane, tako da su sve mitohondrije novog organizma u normalnim uslovima maj~ine. U trenutku impregnacije oocita sekundarni oocit je u metafazi druge mejoti~ke deobe sa aretiranom podelom deobnog vretena. Signal koji nastaje pri tome aktivira nastavak druge mejoze.

U narednih 2 sata nakon impregnacije oocita zavr{ava se podela sa formiranjem ovum-a, zrelog oocita i drugog polarnog tela koji ostaje u perivitelinskom prostoru i podele prvog polarnog tela na dva dela.

2.5. FORMIRANJE OVUMA

Sl. 2.48 - Formiranje ovum-a: 1. prvo polarno telo, 2. jedro spermatozoida, 3. centrosom, 4.drugo polarno telo, 5. deobno vreteno sa hromozomima

2.6. FORMIRANJE ZIGOTA

Sl. 2.47 - Sekundarni oocit u vreme procesa impregnacije: 1. deobno vreteno, 2. prvo polarno telo, 3. zona pellucida, 4. perivitelinski prostor, 5. } e l i j s k a memb ran a s p e rma to zo ida, 6. kinozillium, 7. kompaktno jedro spermatozoida, 8. centrozom spermatozoida

DNK - deoksiribonukleinska kiselina spermatozoidnog jedra po~inje da se dekondenzuje. U ovoj fazi dekondenzovanja DNK - deoksiribonukleinska kiselina jedra spermatozoida i oocita se nazivaju pronukleusi. Mu{ki pronukleus sadrì dekondenzovanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu i obavijen je membranom.


65

Sl. 2.50 - Mikrotubuli snimljeni elektronskim mikroskopom

Formirani aster trasira stazu kopulacije, odnosno put pribliàvanja oba pronukleusa.

Sl. 2.49 - Stadijum pronukleusa: 1. mu{ki pronukleus, 2. ènski pronukleus, 3. centrozom, 4. polarno telo

Spajanje mu{kog i ènskog pronukleusa se de{ava u narednih 12 do 18 ~asova. Sinteza DNK - deoksiribonukleinske kiseline omogu}ava me|usobnu kombinaciju naslednih faktora roditelja - amphimixis, sa formiranjem novonastalog jedra amphinucleus - a. Pribliàvanje oba pronukleusa de{ava se uz pomo} mikrotubula koji se formiraju odmah nakon impregnacije oocita. Neposredno uz mu{ki pronukleus iz centrozoma formira se aster iz vi{e mikrotubula i zvezdasto projektuje. Proteini iz kojih se stvaraju mikrotubuli su iz citoplazme oocita.

Sl. 2.51 - Formiranje astera: 1. mu{ki pronukleus, 2. ènski pronukleus, 3. centrozom, 4. inner bodies, 5. aster

Pronukleusi se pribliàvaju i uve}avaju, jer po~inje sinteza DNK - deoksiribonukleinske kiseline u oba pronukleusa sa dupliranjem hromozoma, koja traje oko 12 ~asova. Oba pronukleusa nose diploidan broj hromozoma. Istovremeno se deli centrozom.

66


Oba pronukleusa gube svoje jedarne membrane, diploidni broj hromozoma od svakog roditelja se raspore|uje u deobno vreteno u ekvatorijalnoj ravni i po~inje formiranje zigota, prve }elije embriona sa svojim individualnim genomom. To se de{ava nakon 22 ~asa od trenutka oplodnje. (Sl. 2.54)

2.7. FORMIRANJE EMBRIONA Sl. 2.52- Po~etak sinteze DNK - deoksiribonukleinske kiseline: 1. mu{ki pronukleus, 2. ènski pronukleus, 3. podeljeni centrozom, 4. inner bodies

Mu{ki pronukleus je ne{to ve}i, ali u praksi je to dosta te{ko razlikovati.

Nakon 23 sata od oplodnje deobno vreteno nastalo iz oba pronukleusa se nalazi u anafazi. Mitoza se nastavlja do dvo}elijskog stadijuma kada se formiraju prve dve }elije embriona. Ova faza od oplodnje do dvo}elijskog stadijuma traje u proseku izme|u 22 i 26 ~asova.

Sl. 2.53- Mu{ki i ènski pronukleus

Sl. 2.55- Mitoza zigota

Sl. 2.54- Zigot: 1. jedarna membrana pronukleusa nestaje, 2. mikrotubuli deobnog vretena

]elijska deoba se nastavlja u ritmu od oko 12 ~asova tako da oko ~etvrtog dana od oplodnje nastaje morula koja ima oko 30 }elija blastomera. Morula je jo{ uvek okruèna zonom pelucidom tako da ukupna veli~ina nije velika. Svaka novonastala }elija je upola manja od }elije iz koje nastaje. U daljoj fazi deobe novoformirane }elije postaju sve kompaktnije povezuju}i se tight vezama i gap vezama. U unutra-


67

{njosti se stvara {upljina ispunjena te~no{}u. Na blastocisti koja se formira jasno se raspoznaje embrioblast - unutra{nja }elijska masa i trophoblast - spolja{nja }elijska masa.

Sl. 2.58 - Blastocista sa vidljivom inner cell mass

2.8. SPONTANI HATCHING Sl. 2.56- Morula: 1. zona pellucida, 2. blastomere, 3. polarno telo

Sl. 2.57- Blastocista: 1. embrioblast (ICM - inner cell mass), 2. zona pellucida, 3. trophoblast, 4.{upljina blastociste - blastocoel

Na kraju petog dana od oplodnje pod delovanjem enzima i ekspanzionih kontrakcija rupturira zona pellucida i embrion izlazi iz nje. To je hatching.

Sl. 2.59- Spontani hatching: 1. zona pellucida, 2. trophoblast, 3. hypoblast deo unutra{nje }elijske mase, 4. {upljina blastociste - blastocoel, 5. epiblast

68


2.9. MIGRACIJA EMBRIONA KROZ TUBU

2.10. GENOMSKI IMPRINTING

Za vreme deobnih faza kroz koje prolazi embrion se transportuje tubom uz pomo} pokreta fimbrija epitela i kontrakcija tube, pa se na kraju 5-og dana od oplodnje nalazi u cavumu uterusa.

Genomski imprinting je ekspresija specifi~nih gena i predstavlja vitalni mehanizam razvoja i ìvota odraslog ~oveka. To je istovremeno i mehanizam kontrole transkripcije gena. Osnovni elemenat mehanizma genomskog imprintinga je metilacija DNK - deoksiribonukleinske kiseline kontrolisana DNK - deoksiribonukleinske kiseline metiltransferaznim enzimima. ]elije zametka se podvrgavaju reprogramiranju da bi se osiguralo iniciranje polno specifi~nog genomskog imprintinga, {to dozvoljava napredak normalnog razvoja embriona nakon oplodnje. U nekim slu~ajevima su gre{ke u genomskom imprintingu smrtonosne za embrion, dok u drugim vode ka poreme}ajima u razvoju i bolestima. Genomski imprinting, kao ekspresija specifi~nih gena, odre|en je epigenetskom modifikacijom gena tako da je samo transkripcija gena izmenjena, dok stvarna sekvenca gena ostaje nepromenjena. Genomski imprinting rezultuje ekspresijom u embrion samo jedne nasle|ene kopije relevantnog otisnutog gena. Kod mu{kih otisnutih gena, o~inski alel je epigenetski modifikovan da spre~i transkripciju, osiguravaju}i da embrion dobije samo monoaleli~nu ekspresiju iz maj~inske nasle|ene kopije. Obrnuto vaì za maj~ine otisnute gene kada je ekspresovana samo kopija nasle|ena od oca. înjenica da se odre|eni geni diferencijalno ekspresuju, u skladu sa roditeljskim poreklom, zna~i da su tokom razvoja roditeljski genomi funkcionalno neekvivalentni. Genomski imprinting je vitalan za normalne modele ekspresije gena kod poje-

Sl. 2.60- Migracija embriona kroz tubu: 1. ovarium, 2. tuba, 3. endometrium, 4. myometrium, 5. cavum uteri, A dan 0 koncepcija oocita, B dan 1 dvo}elijski stadijum, C dan 2 ~etvoro}elijski stadijum, D dan 3 osmo}elijski stadijum, E dan 4 morula, F dan 6 blastocista nakon hatching - a

Sl. 2.61- Embrion u tubi

69


Sl. 2.62- Genomski imprinting

dinca uz gre{ke koje ponekad rezultuju neodgovaraju}om transkripcijom gena i represijom. U genomu sisara, ve}ina ostataka citozina prona|ena kao CpG dinukleotidi citozini pozicionirani pored ostataka guanina, ima dodatu metil grupu na poziciji njihovih ugljenika 5. Ovo dodavanje metil grupe, koje se naziva DNK - deoksiribonukleinske kiseline metilacija je klju~ni mehanizam regulacije imprintinga. Va`no je naglasiti da ve}ina metilisanih DNK - deoksiribonukleinske kiseline genoma nema u~e{}e u genomskom imprintingu. Metilacija DNK - deoksiribonukleinske kiseline rezultuje kondenzovanijom strukturom koja je otporna na transkripciju. Ako se nasledi metilisana kopija gena od majke i nemetilisana kopija od oca, maj~inska kopija }e represovati svoju transkripciju ostavljaju}i o~evu kopiju kao jedini aktivni gen. DNK - deoksiribonukleinska kiselina metilacija je epigenetska modifikacija koja se moè naslediti na stabilan na~in, ali je

tako|e mogu}a i reverzibilna, dozvoljavaju}i da se polno specifi~ni modeli iniciraju u }elijama zametka. Genomski imprinting je evoluirao. Teorija koja obja{njava razvoj genomskog imprintinga je genetski konflikt, ili teorija roditeljskog ulaganja, investmenta. Ova teorija je proizi{la iz zapaànja da je veliki broj imprintiranih gena upleten u rast i razvoj fetusa. Isto tako imprintirani geni ispoljavaju direkcionalnost u svom delovanju, jer ve}ina o~inski ekspresovanih gena, kao {to su Igf 2 - insulin like growth factors i Peg 3 - polyethylene glycol potpomaù rast fetusa i konzumiranje hranljivih supstanci, dok su maj~inski ekspresovani geni, kao {to su Igf 2R - insulin like growth factors i GNAS - guanine nucleotide binding protein alpha stimulating, skloni ko~enju rasta fetusa. @ene koje bi mogle ograni~iti rast fetusa i koje bi mogle proizvesti vi{e potomaka iz ograni~enih resursa bi, dugoro~no gledano, bile mnogo

70


uspe{nije. Suprotno ovome, mu`jaci bi imali dugoro~ne koristi od njihovih potomaka, koji bi bili brojniji i ve}i, pa ~ak iako su ovo ostvarili na {tetu ènke tako {to se koriste ve}e koli~ine maj~inih hranljivih suspstanci. Alternativna teorija koja uklju~uje i prisustvo imprintiranih gena u genomu je model evolutivnosti. Ova teorija polazi od toga da su vrste kod kojih postoji genomski imprinting sposobnije da evoluiraju kao odziv na pritiske okoline, po{to mogu podstaknuti brze promene putem izmene alela

koja je umirena i one koja je ekspresovana. Pojedina~ni organizam moè nositi alel koji potpomaè rast i koji dok se imprintira nema fenotipne uticaje. Ako poja~ani rast postane prednost, relevantni alel je ve} prisutan u pool-u gena i brzom reverzijom imprintinga alel moè biti ekspresovan. Postoji i teorija koja smatra da je genomski imprinting evoluirao da za{titi ènku od oboljenja jajnika. Imprinting bi mogao ograni~iti rast i razvoj bilo kog partenogenetskog embriona unutar jajnika i na taj na~in spre~io formiranje malignog trofoblasta.

Sl. 2.63- Promene u metilaciji DNK tokom razvoja


Modeli metilacije DNK - deoksiribonukleinske kiseline su razli~iti. DNK - deoksiribonukleinske kiseline metiltransferaze Dnmts - deoxyribonucleic acid methyltransferase obavljaju metilaciju DNK - deoksiribonukleinske kiseline. Mogu se uop{teno podeliti na familije; Dnmt 1 - deoxyribonucleic acid methyltransferase, Dnmt 2 - deoxyribonucleic acid methyltransferase i Dnmt 3 - deoxyribonucleic acid methyltransferase. Ove tri familije su povezane, ali ne blisko i veruje se da su se odvojile od zajedni~kih predaka pre separacije na ìvotinjski i biljni svet. ^lanovi familije Dnmt 1 - deoxyribonucleic acid methyltransferase i Dnmt 2 deoxyribonucleic acid methyltransferase su identifikovani kao oni koji imaju aktivno delovanje transmetilaze i njihove funkcije su delimi~no razja{njene, a familija Dnmt 3 - deoxyribonucleic acid methyltransferase je primarno uklju~ena u postavljanje novih modela metilacije. Smatra se da je familija Dnmt 1 - deoxyribonucleic acid methyltransferase uklju~ena u odràvanje ovih modela tokom deobe }elija. Inicijalne studije kod familije Dnmt 2 - deoxyribonucleic acid methyltransferase nisu na{le nikakvu aktivnu funkciju metilacije, ali je nedavno istraìvanje otkrilo da ovaj enzim moè da deluje kao metiltransferaza koja je odre|ena za veoma specifi~nu sekvencu DNK - deoksiribonukleinske kiseline {to obja{njava nizak nivo aktivnosti koju je mogu}e identifikovati. Iako je sposobna da se veè za metilisanu DNK - deoksiribonukleinska kiselina, definitivna specifi~nost vezivanja Dnmt 2 - deoxyribonucleic acid methyltransferase tek treba da bude utvr|ena. Postavljanje modela metilacije je bilo posebno ispitivano. Da bi dozvolio reprogramiranje }elije

71

zametka, genom se mora podvrgnuti demetilaciji. Kada se uklone inicijalni otisci, novi odgovaraju}i modeli moraju biti uspostavljani da bi se osiguralo postavljanje o~inskih i maj~inskih specifi~nih otisaka u spermatozoide i oocite. Enzimi koji su sposobni za postavljajne novih metil grupa na prethodno nemetilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu su iz familije Dnmt 3 - deoxyribonucleic acid methyltransferase. ^lanovi ove familije koji imaju aktivno transmetilazno delovanje su Dnmt 3a - deoxyribonucleic acid methyltransferase i Dnmt 3b - deoxyribonucleic acid methyltransferase. Oba enzima imaju visok stepen homologije sekvenci, ali razli~ite modele ekspresije i vremena pojavljivanja tokom razvoja. Tre}i ~lan ove familije, Dnmt 3l - deoxyribonucleic acid methyltransferase, ima istu homologiju sekvenci kao i ostali enzimi, ali nema kataliti~ki domen koji je potreban za dodavanje metil grupa na DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu. Smatra se da ima ulogu u uspostavljanju maj~inskih otisaka u oocitu. Odràvanje metilacije je dodavanje metil grupe na ve} nemetilisanu DNK deoksiribonukleinsku kiselinu tokom replikacije }elija, {to je neophodno da bi }elije }erke odràvale model metilacije u }eliji koja se podvrgla mitozi. Dnmt 1 - deoxyribonucleic acid methyltransferase je primarno odgovorna za odràvanje metilacionog statusa DNK deoksiribonukleinske kiseline. Uobi~ajeni oblik ove metiltransferaze je onaj koji se nalazi kod svih somatskih }elija i to je Dnmt 1 - deoxyribonucleic acid methyltransferase. Postoje dve spojne varijante koje su identifikovane i koje su specifi~ne za }elije zametka i rani embrion. Dnmt 1p deoxyribonucleic acid methyltransferase je

72


prona|en kod spermatozoida, dok je Dnmt 10 - deoxyribonucleic acid methyltransferase mogu}e identifikovati samo kod oocita i preimplantacionog embriona. Tek nakon sedmog dana, E7, embrion je sposoban da proizvede protein Dnmt 1s deoxyribonucleic acid methyltransferase u punoj duìni. Zanimljivo je da, iako je Dnmt 1 - deoxyribonucleic acid methyltransferase identifokovan kao glavna metilaza za odràvanje in vivo u in vitro uslovima, studije su pokazale da ovaj enzim ima vi{u metilaznu aktivnost od Dnmt 3 - deoxyribonucleic acid methyltransferase i Dnmt 3b - deoxyribonucleic acid methyltransferase. Metilacija vodi ka represivnoj transkripciji gena. Postoje dva glavna mehanizma putem kojih metilacije DNK - deoksiribonukleinske kiseline mogu spre~iti transkripciju gena. Kod prvog mehanizma metil grupa izaziva direktne smetnje i spre~ava odre|ene faktore transkripcije da se veù za metilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu. Drugi mehanizam rezultuje iz vezivanja metilvezivnih domenskih proteina MBD methyl cytosine guanine binding domain za metilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu. Od svih MBD - methyl cytosine guanine binding domain proteina do danas su identifikovani MBD 1 - methyl cytosine guanine binding domain, MBD 2 - methyl cytosine guanine binding domain, MBD 3 methyl cytosine guanine binding domain i MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein. Oni u~estvuju u represiji transkripcije, dok se za MBD 4 - methyl cytosine guanine binding domain protein misli da ima ulogu proteina za popravku pogre{nog uparivanja. MBD 1 - methyl cytosine guanine binding domain i MeCP 2 - methyl

cytosine guanine binding protein sadrè transkripcione represione domene koji deluju preko HDAC - histone deacetylase. HDAC - histone deacetylase izaziva lokalnu deacetilaciju histonske pratnje {to rezultuje remodeliranjem hromatina u ne{to kondenzovaniju strukturu koja je otporna na transkripciju. MBD 1 - methyl cytosine guanine binding domain posreduje u transkripcionoj represiji putem regrutovanja histonmetilaze sposobne da se veè za HDAC - histone deacetylase, dok MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein deluje na vezivanje korepresorskog kompleksa koji sadrì HDAC - histone deacetylase, mada se pokazalo da MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein izaziva represiju transkripcije u odsustvu aktivnosti HDAC - histone deacetylase. MBD 2 - methyl cytosine guanine binding domain i MBD 3 - methyl cytosine guanine binding domain su komponente velikog proteinskog kompleksa MeCP 1 methyl cytosine guanine binding proteina koji vezuje DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu na nesekvenciono specifi~ni na~in. Vezivanje MECP 1 - methyl cytosine guanine binding proteina za metilisanu DNK deoksiribonukleinsku kiselinu je omogu}eno prisustvom MBD 2 - methyl cytosine guanine binding domain u kompleksu. Zanimljivo je da se MBD 3 - methyl cytosine guanine binding domain ne vezuje direktno za metilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu. MeCP 1 - methyl cytosine guanine binding protein kompleks vezuje metilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu manje ~vrsto nego MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein {to nagove{tava da dugoro~na transkripciona represija moè biti odràvana stalnim vezivanjem MeCP 2 - methyl cytosine gua-


nine binding proteina uz jo{ kratkotrajnije transkripciono smirivanje koje je odre|eno vezivanjem MeCP 1 - methyl cytosine guanine binding protein kompleksa. Osim MBD - methyl cytosine guanine binding domain familije postoji jo{ jedan vezuju}i protein nazvan Kaiso ~ija represija transkripcije gena zavisi od metilacije. Iako ovaj protein ne sadrì MBD methyl cytosine guanine binding domain sposoban je da se veè za metilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu pomo}u cinka koji sadrì. Transgenske studije pokazuju da kod nedostatka MBD 1 - methyl cytosine guanine binding domain dolazi do poreme}aja u nervnom sistemu na molekularnom nivou. Bez MBD 2 - methyl cytosine guanine binding domain mogu} je rast i razvoj. Mutacije bez MBD 3 - methyl cytosine guanine binding domain su smrtonosne po embrion. Abnormalni fenotip bez MeCP 2 methyl cytosine guanine binding proteina po~inje da se razvija pri starosti od nekoliko nedelja i postaje smrtonosan do 8. nedelje. Nedostatak MBD 1 - methyl cytosine guanine binding domain, MBD 2 - methyl cytosine guanine binding domaini MBD 3-methyl cytosine guanine binding domain nagove{tava postojanje odre|enog stepena suvi{nosti u sistemu MBD - methyl cytosine guanine binding domain posredovane transkripcione kontrole. Iako je nedostatak MBD 2 - methyl cytosine guanine binding domain i MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein pokazao da oba ova proteina funkcioni{u odvojenim putanjama, ovo ne odbacuje kooperaciju izme|u ostalih ~lanova MBD - methyl cytosine guanine binding domain familije. Genomski imprinting kod primordijalnih germinativnih }elija zametka je detaljno ispitan. Kada se primordijalne

73

}elije zametka PGC - primordial germ cells, prvi put vide kod embriona sedmog dana od oplodnje, one kao i okruùju}e somatske }elije, nose nasle|ene modele otisaka majke i oca. Ovaj DNK - deoksiribonukleinske kiseline metilacioni model se odràva u PGC - primordial germ cells dok migriraju u gonade koje su u razvitku. PGC - primordial germ cells podleù globalnoj demetilaciji od E 11, 5 dana, da bi se uklonili nasle|eni imprinting modeli. Tokom ovog perioda odràva se DNK deoksiribonukleinske kiseline metilacija somatskih }elija. O~igledno je da je demetilacija }elija zametka od vitalnog zna~aja za kasnije postavljanje ta~ne polno specifi~ne epigenetske informacije tokom sazrevanja oocita i spermatozoida. Demetilacija je kompletirana do E 13 - 14 dana, {to odgovara periodu kada mu{ke i ènske PGC primordial germ cells po~inju da ulaze u mitotski i mejotski zastoj. Smatra se da mitotski i mejotski zastoj moè slediti demetilaciju, jer replikacija nemetilisane DNK - deoksiribonukleinske kiseline ima povi{en rizik od kretanja nerepresovanih retrotranspozona i izazivanja mutacija. îni se da je vreme u kojem se odvija ova demetilacija, kao i koli~ina izgubljene metilacije, identi~na bez obzira na pol embriona. Da li se gubitak metilacije odvija pasivnim ili aktivnim mehanizmom ili kombinacijom oba, jo{ uvek nije poznato, mada bi brzina kojom se ovo odvija nagovestila u~estvovanje aktivnog mehanizma. Materinski i o~inski imprinti se postavljaju tokom razvoja }elija zametka tako da je, do trenutka kada su oociti i spermatozoidi potpuno sazreli, ta~an {ablon DNK - deoksiribonukleinske kiseline metilacije prisutan na genomu kao {to je prikazano na slici br.2.64.

74


Sl. 2.64- Globalna demetilacija neotisnutih sekvenci

Nakon oplodnje se oba roditeljska genoma podvrgavaju globalnoj demetilaciji sekvenci koje nisu imprintovane. Imprintovani geni su za{ti}eni od ovog procesa. Tokom ranog razvoja embriona imprintovani geni somatskih }elija i PGC - primordial germ cells zadràvaju roditeljske imprinte. Od E 11 dana se primordijalne }elije zametka podvrgavaju demetilaciji radi brisanja nasle|enih roditeljskih imprinta, ali somatske }elije embriona zadràvaju roditeljske imprinte tokom razvoja embriona sve do odraslog doba. Proces demetilacije PGC - primordial germ cells je kompletiran do E 13 dana. Reprogramiranje }elija zametka, koje }e uslediti, po~inje da se odvija kada se jo{ jednom postave polno specifi~ni modeli imprintinga. Gre{ke u genomskom imprintingu se mogu desiti prirodnim putem, ili tokom

ljudske intervencije, jer je genomski imprinting osnovni mehanizam koji je od vitalnog zna~aja za mnoge aspekte razvoja. Tokom poslednjih nekoliko godina porasla su genomska istraìvanja kod dece ro|ene uz pomo} neke od tehnika asistirane reprodukcije. Otkriveno je nekoliko slu~aja dece ro|ene sa AS - Angelman - ovim sindromom kao i BWS - Beckwith Wiedemann syndrome. Kod dece koja su imala BWS - Beckwith Wiedemann syndrome je bio uspostavljen metilacioni status na genima H 19 i LIT 1 latroinsectotoxins, dok je samo jedno dete pokazivalo normalne metilacione modele na oba ova gena. Uzrok veze izme|u ART -assisted reproductive technology i poreme}aja imprintinga trenutno nije poznat. Mogu}e je da je uzrok u nekom aspektu tehnike asistirane reprodukcije koja je u


odre|enom slu~aju primenjena. Odgovor treba traìti u izloènosti jedne, ili obe grupe }elija zametka izmenjenom hormonalnom reìmu in vivo, vremenskom periodu uzgajanja, i mehani~koj manipulaciji. Bilo kakve izmene normalnog okruènja oocita, ili spermatozoida mogu rezultovati izmenama nekog aspekta njihovih mehanizama imprintinga. Me|utim, uzrok moè biti i gre{ka u samim }elijama zametka koje su kori{}ene, s obzirom da parovi koji su u programima ART - assisted reproductive technology imaju smanjenu prirodnu plodnost. Potencijalni problemi se ne zavr{avaju sa }elijama zametka. Kod preimplantacionog embriona u periodu boravka u kulturi moè se izmeniti epigenetsko reprogramiranje koje se odvija u ovim ranim etapama. Ako spermatozoidi kori{}eni za in vitro oplodnju imaju niè globalne nivoe metilacije, nema izmena ni u broju oplodnji ni u kvalitetu ranog embriona. Ali kako postoji smanjenje broja trudno}a to ukazuje na zna~aj normalne metilacije DNK - deoksiribonukleinske kiseline gameta za razvoj embriona i kona~an ishod ART - assisted reproductive technology. Pokazalo se da spermatozoidi dobijeni od mu{karaca sa malim brojem spermatozoida usled abnormalne spermatogeneze, imaju neispravan genomski imprinting, mada se takvi spermatozoidi mogu upotrebiti u ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Neki istraìva~i su otkrili da je, iako su maj~inski imprintinzi obrisani iz svih spermatozoida, o~inski metilisani gen H 19 bio nedovoljno metilisan kod nekih spermatozoida dobijenih od oligozoospermi~nih mu{karaca. Svaki embrion dobijen od hipometilisanih spermatozoida bi mogao imati neodgovaraju}u ekspresiju imprintovanih gena H 19 i IGF 2 - insulin like growth factor.

75

U nekim slu~ajevima se mogu pojaviti gre{ke imprintinga koje nisu smrtonosne po embrion, ali izazivaju abnormalne fiziolo{ke procese i bolesti. Takve bolesti se mogu pojaviti kada imprintovani gen ostane hipermetilisan ili hipometilisan. Dejstvo nije uvek ograni~eno na gubitak funkcije jednog gena i neki imprintovani geni uti~u na ekspresiju drugih gena, kao {to su H 19 i IGF 2 - insulin like growth factor. PWS - Prader-Willi syndrome i AS Angelman syndrome su primeri poreme}aja koji se mogu pojaviti kada do|e do gubitka pravilnog imprintinga. Gubitak jednog, trenutno neidentifikovanog, imprintovanog gena rezultuje Prader-Willijevim sindromom kada je brisanje o~inski nasle|eno, dok iste gre{ke izazivaju Angelmanov sindrom prilikom maj~inskog prenosa. Ostali primeri oboljenja, koja su rezultat nepravilnog otiskivanja, uklju~uju BWS - Beckwith Wiedemann syndrome, Silver-Russel-ov sindrom i prolazni neonatalni dijabetes mellitus. Bolesti, tako|e, mogu biti rezultat defekata mehanizama koji reguli{u imprinting. Jedna od klju~nih grupa enzima sa ulogom u genomskom imprintingu su Dnmt deoxyribonucleic acid methyltransferase enzimi koji su odgovorni za dodavanje metil grupa na DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu. Kada se pojave problemi u ovom aspektu mehanizma imprintovanja, to moè dovesti do bolesti. Jedna od mogu}nosti je nestabilnost centromerske regije i sindrom facijalnih anomalija koji je rezultat mutacije na Dnmt 3b - deoxyribonucleic acid methyltransferase. Jo{ jedna va`na komponenta mehanizma imprintinga je familija metil-vezuju}ih domenskih proteina. MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein je protein

76


koji sadrì metil-vezuju}i domen. On ima ulogu u kontrolisanju transkripcije imprintovanih gena putem njegove sposobnosti da se veè za metilisanu DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu. Zna~aj ovog proteina za normalan razvoj i fiziolo{ku funkciju je postojanje Rett-ovog sindroma kada MeCP 2 - methyl cytosine guanine binding protein pro|e kroz mutiranje. Postoje neke bolesti sa vi{estrukim uzrocima kod kojih su samo u nekim slu~ajevima upletene gre{ke mehanizma imprintinga, ili izmene imprintovanih gena. Kancer je jedna takva bolest i neki slu~ajevi su identifikovani sa uzrokom koji je povezan sa genomskim imprintingom, dok su brojne ostale karakteristike ove bolesti zbog drugih problema. Otkriveno je da su }elije tumora preterano ekspresovale jedan, ili vi{e Dnmt 1s deoxyribonucleic acid methyltransferase 1s, 3a i 3b. Najvi{e ekspresovan je bio Dnmt 3b - deoxyribonucleic acid methyltransferase. Ovi rezultati podupiru prethodna zapaànja

o abnormalnim nivoima metilacije koji se mogu videti kod }elija tumora. Kancer koji pokazuje vi{e nivoe Dnmt - deoxyribonucleic acid methyltransferase je akutna milejoidna leukemija. Mogu}e je da je ova preterana ekspresija Dnmt - deoxyribonucleic acid methyltransferase enzima va`na za hiper metilaciju i smirivanje gena supresora tumora. Genomski imprinting je mehanizam kontrole transkripcije gena i od vitalnog je zna~aja za normalno i zdravo potomstvo. Iako je poslednjih nekoliko godina preduzet ogroman rad na rasvetljavanju mehanizama koji se kriju iza genomskog imprintinga, jo{ uvek ima puno pitanja na koja ne postoje odgovori. Pored toga, znanje o genomskom imprintingu moè pomo}i u razumevanju nekih bolesti kod ljudi i moè ponuditi potencijalne terapije. Tehnike asistirane reprodukcije}e ,tako|e, imati koristi od boljeg razumevanja genomskog imprintinga {to }e rezultirati ve}im stepenom uspeha i najva`nije, bezbednijim ishodom.

77


3. IMPLANTACIJA Osnovna uloga uterusa je prihvatanje embriona i kasnije odràvanje fetusa u toku trudno}e. Uterus se sastoji od troslojnog zida, spolja{njeg - tunica seroza ili perimetrium, srednjeg - tunica muscularis ili miomet-

rium i unutra{njeg epitelnog-endometrium. Endometrium je mesto implantacije. U njemu se odigravaju cikli~ne morfolo{ke i funkcionalne promene koje su direktno zavisne od seksualnih hormona.

Sl. 2.65- Uterus: 1. corpus uteri, 2. cavitas uteri, 3. cervix uteri, 4. canalis cervicis, 5. isthmus uteri, 6. pars interstitialis, 7. tuba uterina, A- epithel endometri, B - epithel cervicis, E - endometrium, M -myometrium

78


Sl. 2.66- Relacija folikula, hormona i endometriuma

Endometrium sadrì mnogobrojne `lezde, glandulae uterinae. Epitel je jednoslojan, prizmati~an i ~ine ga tri razli~ita tipa }elija: sekretorne }elije, cilijarne }elije i bazalne }elije. Ispod se nalazi stroma sa

krvnim sudovima. Endometrium se za vreme fertilne faze ìvota ène cikli~no menja pod direktnim delovanjem hormona hipotalamusa, hipofize i ovariuma.

Sl. 2.67- Endometrium: 1. prizmati~ni jednoslojni epithel, 2.basalna membrana, 3. glandulae uterinae, 4. stroma, 5. krvni sudovi, A - funkcionalna zona, B - bazalni sloj, C - myometrium

79


Menstruaciona faza traje u proseku 1 do 4 dana. Kada izostane implantacija dolazi do regresije corpus luteum-a i opadanja koncentracija estrogena i progesterona u krvi sa odbacivanjem funkcionalne zone endometriuma.

bilitet na cikli~ne hormonske promene. Radialne i bazalne arteriole ne reaguju na hormonske promene ve} samo spiralne arteriole.

Folikularna ili proliferativna faza traje od 4 do 14 dana ciklusa. Poja~ana sekrecija estrogena iz folikula koji raste izaziva proliferaciju endometriuma sa intenzivnim mitozama glandularnog epitela. U epitelu se raspoznaju cilijarne }elije. @lezde se izduùju kao i spiralne arteriole strome. Kraj proliferativne faze ozna~ava porast LH - luteinizing hormona nakon ~ega u periodu od 35 do 44 ~asova dolazi do ovulacije.

a)

Sl. 2.68 - Endometrium u menstruacionoj fazi: A funkcionalni sloj, B - bazalni sloj, C - myometrium, 1. cavum uteri sa epitelnim }elijama, krvlju i ostacima sluzokoè, 2. glandulae uterinae, 3. intaktni bazalni sloj, 4. bazalna membrana, 5. stroma, 6. krvna zrnca, 7. slobodne }elije strome

Vaskularni mehanizmi su osnova za nastajanje menstruacije kao reakcija na pad koncentracija estradiola i progesterona. Kontrakcije tunice medie spiralnih arterija izazivaju ishemiju funkcionalne zone endometriuma i njenu nekrozu. Krvni sudovi uterusa pokazuju selektivni senzi-

b) Sl. 2. 69 - a) Endometrium u po~etnoj i b) Glandulae uterinae u proliferativnoj fazi: 1. `lezdani epitel, 2. endometrium, 3. glandulae uterinae, 4. myometrium, 5. stroma endometriuma, 6. epitelne }elije glandule

80


Sl. 2.70 - Kasnija proliferativna faza i glandulae uterinae: 1. `lezdani epitel, 2. zadebljao endometrium, 3. glandulae uterinae, 4. myometrium, 5. stroma endometriuma, 6. epitelialne }elije gl.uterinae sa mitozama

U kasnoj folikularnoj fazi zadebljava endometrium sa razvojem zone spongioze, {irenjem `lezda i mitozom.

Lutealna ili sekretorna faza traje od 14 do 28. dana menstruacionog ciklusa. Pod delovanjem corpus luteum - a progesteron izaziva fazu pune zrelosti endometriuma. @lezde sluzokoè i arteriole se izvijaju. Jedra epitelnih }elija su okrugla i poloèna bliè lumenu zbog produkcije i

lagerovanja glikogena na bazalnom polu. Endometrium dostiè u sredini sekretorne faze potpunu zrelost. Glikogen se preme{ta sa bazalnog na apikalni pol, a }elijska jedra prelaze na bazalni pol. Sekret bogat glokogenom skuplja se u lumenima `lezda. Faza endometriuma izme|u 20. i 23. dana ciklusa je optimalna za implantaciju embriona i naziva se implantacioni prozor. Po nekim drugim autorima taj period nastaje ranije, izme|u 17. i 19. dana.

Sl. 2.71 - Endometrium u po~etnoj sekretornoj fazi i glandulae uterinae: 1. `lezdani epitel, 2. zadebljao endometrium, 3. glandulae uterinae, 4. myometrium, 5. stroma, 6. epitelijalne }elije gl.uterinae sa glikogenom u bazalnom polu

81


Sl. 2.72- Endometrium u sredini sekretorne faze i gl.uterinae: 1. `lezdani epitel, 2a. stratum compactum, 2b. stratum spongiosum, 2c. stratum basale, 3. glandulae uterinae, 4. myometrium, 5. stroma, 6. epitelne }elije gl.uterinae sa glikogenom na apikalnom polu

Sl. 2.73- Implantacione zone: 1. cavum uteri, 2. isthimus tube, 3. tuba uterina, 4. cervix uteri

Implantacione zone Nakon sinhronizovanih promena endometriuma i blastociste i odgovaraju}e interakcije, izme|u dolazi do implantacije embriona na superiornom, ili posteriornom delu corpus-a uteri.

Implantacione etape [ematski se mogu razlikovati tri implantacione etape: - Adplantacija ili apozicija blastociste na endometrijum - Adhezija ili prihvatanje blastociste na endometrijum - Invazija ili usa|ivanje trofoblasta

Adplantacija ili apozicija blastociste Kada blastocista iza|e iz zone pelucide petog dana, dolazi u kontakt sa uterinskom sluzokoòm i usa|uje se u endometrijum pomo}u svog embrionalnog pola. Do apozicije dolazi kada uterus blagovremeno u|e u sekretornu, ili luteiniziraju}u fazu. Faza endometrijuma u kojoj je optimalno spreman za prijem embriona traje 4 dana, od 20. do 23. dana i naziva se implantacioni prozor. Taj period je oko 6 dana nakon LH - luteinizing hormone peak - a i karakteri{e ga pojava malih uzvi{enja na apikalnom polu epitelijalnih }elija endometrijuma. Jedan od zadataka ovih

82


uzvi{enja se sastoji u absorpciji uterinskog fluida {to dovodi blastocistu bliè endometrijumu i mobili{e je u isto vreme. Uo~ena je pojava membranoznih projekcija poznatih kao pinopodi koje su progesteron zavisne }elijske organele i javljaju se kao apikalne celularne protruzije i postaju vidljive izme|u 20. i 21. dana prirodnog menstrualnog ciklusa. Mehanizam delovanja pinopoda nije sasvim jasan, ali se pretpostavlja da spre~avaju }elije da uni{te blastocistu i pomaù povla~enje uterinih fluida, olak{avaju}i adheziju blastociste za molekule pinopoda, ili uterodoma kako ih nazivaju drugi autori. Formacija i regulacija pinopoda je uslovljena koncentracijom progesterona i smanjenom koncentracijom receptora B i njihove ekspresije. Poslednji

rezultati su pokazali da je trajanje pinopoda ograni~eno na manje od 48 sati. U toku ovog perioda endometrijum i embrion, tako|e, proizvode molekule koji dovode do prihvatanja embriona za uterusnu mukozu i koji su poznati kao adhezioni molekuli. Najpoznatiji su mucini i integrini. Mucini ~ine }elijsku povr{inu otpornom na enzimska delovanja i mogu da oslabe inter}elijsku i }elija-ekstracelularni-matrix adheziju. MUC-1 deluje kao barijera implantaciji i zato mora da bude uklonjen da bi se omogu}ila interakcija blastociste sa endometrijumom. Me|utim, imaju}i u vidu da koncentracija MUC-1 raste jo{ 7 dana nakon LH - luteinizing hormone pika i traje do 13 dana, njegova prava uloga tek treba da se utvrdi.

Sl. 2.74- Implantacioni prozor: 1. menstruacija, 2. proliferaciona faza, 3. sekreciona faza, 4.implantacioni prozor


U ovoj etapi blastocista jo{ uvek moè biti eliminisana. Tako|e postoji mi{ljenje da su progesteron i estrogen odgovorni za edem koji ve} ispunjava poravnatu uterinsku {upljinu.

Sl. 2.75 - Hatching: 1. zona pellucida, 2. trophoblast, 3. hypoblast, 4. {upljina blastociste blastocoel, 5. epiblast

Pored mnogih aspekata sinhronizacionog procesa, uloga steroidnih hormona je najbolje poznata. Za implantaciju je potrebno preovulatorno pove}anje sekrecije 17 beta estradiola koji istovremeno stimuli{e proliferaciju i diferencijaciju uterusnih epitelijalnih }elija.

83

Produkcija progesterona od strane corpus-a luteum-a stimuli{e duboke celularne i molekularne promene u endometrijumu. Uspostavljanje normalne endometrijalne receptivnosti povezano je sa down regulacijom progesteronskih receptora koja koincidira sa vremenom implantacije embriona. Delovanje progesterona na endometrijalni epitel je posredovano putem endometrijalne strome koja ostaje progesteron-receptor pozitivna u toku trudno}e. Ove specifi~ne hormonske promene indukuju i promene u endometrijalnoj biosinteti~koj aktivnosti i osloba|anju ~itavog miljea lokalno produkovanih proteina u mikrosredini reproduktivnog trakta. Tokom celog perioda od ovulacije do implantacije, oocit je okruèn zonom pelucidom ~ija se uloga menja. Prvobitno je u kontaktu sa }elijama corone radiate tokom transporta oocita u Falopijevoj tubi. U trenutku oplodnje ona olak{ava akrozomnu reakciju }elija sperme. Kona~no, po{to je kortikalna reakcija zavr{ena, podleè fizi~kim i hemijskim promenama. Zona pellucida ne poseduje HLA - human leukocyte antigen, pa deluje kao imunolo{ka barijera. Njena uloga je i prevencija prerane implantacije embriona u regiji tube.

Adhezija ili prihvatanje blastociste na endometrijum

Sl. 2.76- Hatching

Nakon apozicije slobodne blastociste sa uterinskim epitelom mikrovili na povr{ini najudaljenijih }elija trofoblasta intereaguju sa epitelnim }elijama uterusa.

84


Sl. 2.77- Po~etak nidacije

U ovoj etapi blastocista vi{e ne moè biti eliminisana prostim ispiranjem. Adhezija blastociste sa endometrijumom podsti~u glukoproteini na povr{ini }elije specifi~nih mehanizmima.

Citotrofoblast, unutra{nji deo trofoblasta se sastoji od nepravilnog sloja jajastih }elija sa jednim nukleusom. Ovo je mesto gde se odvija intenzivna mitoti~ka aktivnost. Sinciciotrofoblast, spolja{nji deo trofoblasta, formira sincitium vi{ejedarni sloj bez }elijskih granica koji poti~e od fuzije }elija citotrofoblasta. Sinciciotrofoblast stvara liti~ke enzime i lu~i faktore koji izazivaju apoptozu endometrijalnih epitelijalnih }elija. Sinciciotrofoblast prolazi kroz bazalnu membranu penetriraju}i u stromu i erodiraju}i kapilarni zid. Sa implantacijom blastociste u endometrijum sinciciotrophoblast se brzo razvija i kompletno }e okruìti embrion ~im se ovaj potpuno usadi u endometrijum.

Sl. 2.78- Adhezija blastociste

Sl. 2.79- Po~etna faza implantacije

]elije sinciciotrofoblasta urastaju izme|u }elija epitela uterusa.

Epitel zida uterusa reaguje na implantaciju decidualnom reakcijom. ]elije sinciciotrofoblasta fagocituju apoptotske decidualne }elije endometrijuma i resorbuju proteine, {e}ere i lipide koji su tamo formirani. Tako|e, erodiraju kanale endometrijalnih `lezda i kapilare strome.

Invazija ili usa|ivanje trofoblasta Trofoblast se diferencira na dve razli~ite }elijske mase pre kontakta sa endometrijumom: - Spoljni ST - syncytiotrophoblast - Unutra{nji CT - citotrophoblast


85

Nakon erozije kapilara, njihova krv ispunjava lakune koje se kasnije razvijaju u intervilozne prostore. Invanzivni rast sinciciotrophoblasta ST - syncytiotrophoblast se zaustavlja u zoni compakta endometrijuma. Oko 13-og dana se pojavljuje primitivni utero-placentarni krvni sistem.

Sl. 2.80- a)Implantacija 6 - 7 dan b) Implantacija 7 8 dan: 1. epitel sluzokoè uterusa: 2.hypoblast ektoderm, 3. syncytiotrophoblast, 4. citotrophoblast, 5. epiblast - endoderm, 6. {upljina blastociste blastocoel

Sl. 2.82- a) Implantacija 8 dan b) Implantacija 9 dan: 1. ST -syncytiotrophoblast, 2. epiblast - ektoderm, 3. hypoblast - endoderm, 4. {upljina blastociste, 5. maj~ini kapilari, 6. amnionska {upljina, 7. amnioblasti, 8. fibrin, 9. trophoblast lakuna

Sl. 2.81- Implantacija u srednjoj fazi

Sredinom druge nedelje se ekstracitoplazmati~ne vakuole pojavljuju u ST - syncytiotrophoblast-u. Udruùju se formiraju}i lakune. Prvobitno su ove lakune ispunjene fluidima tkiva i uterinim sekretom.

Na kraju druge nedelje, kada je implantacija zavr{ena, imamo dve hemisferne {upljine koje leè jedna na drugoj: amnionska {upljina, dorzalna i umbilikalna, ventralna. Podlogu amnionske {upljine formira epiblast, a gornji deo umbilikalne formira hipoblast. Ova dva sloja, koji leè jedan na drugom formiraju embrion.

86


ECM - extra-cellular matrix-a, adhezione molekule, intergrin, kadherin i hormone. Decidualne }elije i endometrijalne `lezde lu~e faktore rasta i razne druge faktore neophodne za implantaciju embriona. Blastocista lu~i svoj sopstveni faktor rasta i ekspresuje brojne receptore koji omogu}avaju interakcije tkiva sa uterinim epitelom. Posmatrano {ematski, molekularne interakcije izme|u blastociste i maj~inog organizma se odvijaju na tri nivoa: 1. razmena signala tokom preimplantacije; 2. interakcije izme|u blastociste i epitela uterusa, adplantacija; 3. interakcije izme|u blastociste i endometrijuma, invazija trofoblasta.

Razmena signala tokom preimplantacije

Sl. 2.83- a) Implantacija 9 - 10 dan; b) Implantacija 10 - 11 dan: 1. hypoblast, 2. erodirani kapilari majke, 3. extraembrionalni retikul, 4. membrana, 5. amnionska {upljina, 6. citotrophoblast, 7. syncytiotrophoblast, 8. lakune ispunjene krvlju

3.1. MOLEKULARNI ASPEKTI IMPLANTACIJE Molekularne promene u toku implantacije blastociste podrazumevaju sloène kaskadne interakcije izme|u }elija embrionskog trofoblasta, epitelijalnih }elija, decidualnih }elija, }elija odgovornih za imune reakcije i ekstra}elijskog matriksa, ECM-extra-cellular matrix-a endometrijuma. Ove }elijske interakcije zahtevaju razne medijatore kao {to su faktori rasta, proteinaze i njihovi inhibitori, komponentne

Embrion i endometrijum komuniciraju me|usobno i pre apozicije embriona u epitel uterusa. Blastocista stvara molekule koji uti~u na aktivnost jajnika, mobilnost Falopijeve tube i endometrijuma. U stadijumu morule, pojavljuju se receptori faktora stimulacije kolonije - colony stimulating factor, receptori epidermalnog faktora rasta EGF - epidermal growth factor, leukocitnog inhitornog faktora LIF - leukocit inhibitory factor i E - kadherina. Kadherini su }elijski adhezioni molekuli koji zavise od kalcijuma i igraju ulogu u pri~vr{}ivanju blastociste za endometrijum. U ovoj etapi i embrion proizvodi interleukin IL - interleucin 1α i ß koji }e preuzeti klju~nu ulogu u orijentisanju embriona prema endometrijumu. Faktor aktivacije trombocita PAF platelet activating factor se tako|e proizvodi u embrionu. Interleukin IL - 1 - interleucin tj. receptori koji su lokalizovani na epitelijalnim }elijama endometrijuma tokom faze lu~enja, je neophodan za proizvodnju LIF - leukocytes inhibitory factor-a u uterusu.


Tokom faze preimplantacije gustina povr{inskih proteina - glikokaliks, kao i elektrostati~ka repulzija izme|u balstociste i endometrijuma se smanjuje {to olak{ava implantaciju.

Interakcije izme|u blastociste i epitela uterusa Apozicija i adhezija blastociste za epitel uterusa zahtevaju lu~enje faktora koji se vezuju za specifi~ne receptore. Jedno od tkiva mora da lu~i ligande, a ostala bi trebala da formiraju receptore. Citokini i faktori rasta su }elijski polipeptidi i proteini koji imaju sposobnost vezivanja za specifi~ne receptore na }elijskoj povr{ini deluju}i kao potentni intracelularni signali, reguli{u}i funkciju endometrijalnih }elija. Oni uti~u na }elijsku proliferaciju, diferencijaciju i apoptozu, autokrinim, parakrinim i endokrinim mehanizmom. Citokini produkovani od strane endometrijalne mukoze i embriona imaju ulogu u matero-embrionalnoj interakciji, poja~avaju}i uterinu receptivnost i kontroli{u}i ekspresiju adhezionih i antiadhezionih proteina. Kao {to je ve} pomenuto, poznati su brojni faktori implantacije: interleukin IL-1 - interleucin, inhibitorni faktor leukocita LIF - leukocytes inhibition factor, kolon stimulacioni faktor CSF - colony stimulating factor, kao i epidermalni faktor rasta EGF - epidermal growth factor i njegovi receptori EGF-R - epidermal growth factor receptor. Tokom implantacije se embrionalni IL1 - interleucin vezuje za svoje receptore na povr{ini epitelijalnih }elija endometrijuma. Interleukin-1 je vaàn polipeptid koji ima direktan efekat na transformaciju epitelijalne membrane. IL-1- interleucin je prvi citokinin aktivan u matero-embrionalnom cross-talk.

87

LIF - leukocytes inhibition factor glikoprotein iz grupe citokina, sintetizuju uterine epitelijalne }elije od 18-og dana menstrualnog ciklusa. Ima ulogu u diferencijaciji CT - citotrophoblast ka ST - syncytiotrophoblast i pomaè lu~enje HCG human chorionic gonadotropina. Isto tako se smatra da LIF - leukocytes inhibition factor moè da posreduje u interakciji izme|u endometrijalnih leukocita i trofoblasta i da kontroli{e angiogenezu u placentarnim resicama. Ekspresija LIF leukocytes inhibition factor receptora je va`na i u formaciji pinopoda. EGF - epidermal growth factor receptori se mogu vezati za brojne ligande. EGF-R epidermal growth factor receptor se osloba|a od ~etvrtog dana od strane }elija iz unutra{nje }elijske mase i od trofoblasta. Izme|u ~etvrtog i sedmog dana je njegovo osloba|anje ograni~eno na unutra{nju }elijsku masu i embrionalni pol trofoblasta. Ovo moè biti obja{njenje za orijentisanje blastociste koja se usa|uje u endometrijum embrionalnim polom. HB - EGF - heparin binding epidermal growth factor direktno uti~e na implantaciju embriona, na sam proces prihvatanja i invaziju trofoblasta preko parakrino autokrinih signala u toku }elijske penetracije strome. HB-EGF - heparin binding epidermal growth factor inhibira apoptozu i u humanom endometrijumu indukuje invazivni trofoblastni fenotip. Dokazano je da je HB-EGF - heparin binding epidermal growth factor ekstremno nizak kod eklampsije. Pad nivoa HB-EGF - heparin binding epidermal growth factora moè da dovede do poreme}aja u celularnom sistemu koji {titi od oksidativnog stresa kao i do endotelijalne disfunkcije. CSF-1 - colony stimulating factor ima va`nu ulogu u procesu ovulacije u prvom trimestru trudno}e.

88


IGFB 1 - insulin like growth factor binding protein reguli{e delovanje EGF epidermal growth factora na endometrijalne }elije, imaju}i va`nu ulogu u }elijskoj proliferaciji i diferencijaciji neophodne za proces decidualizacije. KGF - keratinocyte growth factor stimuli{e rast spiralnih arterija i inhibira glandularnu apoptozu. Postoji sigurno jo{ ~itav niz potencijalnih faktora ~ija uloga tek treba da se utvrdi me|u kojima treba pomenuti calcitonin i HOX - homeobox gene, kao i vitamin D.

Interakcije izme|u blastociste i endometrijuma, invazija trofoblasta Trofoblast se pona{a kao pseudo tumorno tkivo koje se infiltrira u endometrijum. Posle uni{tenja bazalne membrane, trofoblast urasta u decidualna tkiva uterusa. ]elije trofoblasta lu~e proteoliti~ki aktivne enzime koji uti~u na ECM - extra-cellular matrix tako da postaje porozniji za invaziju embriona. Ovi enzimi su, uglavnom, matri~ne metaloproteinaze MMP - matrix metalloproteinase i plazmogenski aktivatori. ]elije trofoblasta izbacuju integrine, molekule }elijske adhezije na svojim }elijskim membranama. ]elije sa povr{ine izbacuju integrine α5ß1 i α1ß1 koji stupaju u interakciju sa epitelom uterusa, dok }elije iz dubljih slojeva osloba|aju lance integrina α6. Urastanje trofoblasta u endometrijum i raspadanje ECM - extracellular matrix-a su kontrolisani endometrijalnim faktorima koji lu~e epitelijalne }elije, fibroblasti, makrofage i leukociti. Ovi faktori stvaraju autokrine i parakrine efekte u cilju olak{avanja invazije trofoblasta. Invazija trofoblasta u endometrijum izaziva interakciju izme|u }elija i ekstracelularnog matrix-a. ]elijski adhezioni molekuli i ekstracelularno matriksna met-

aloproteinaza iniciraju kompleksnu interaktivnu kaskadu u toku implantacije i ranog embrionalnog razvoja. Trofoblastna invazija je aktivan enzimski proces. Humane citotrofoblastne }elije sekretuju MMP matrix-a metalloproteinase endopeptide koji su sposobni da degradiraju komponente ECM - extra-cellular matrix-a. Citokini i faktori rasta tako|e uti~u na produkciju MMP - matrix metalloproteinase. MMP 2 matrix metalloproteinase i MMP 9 - matrix metalloproteinase u stanju su da dovedu do digestije glavnih konstituenata ECM - extracellular matrix-a. Danas je poznato da je uterusni imuni sistem veoma vaàn za kontrolu normalne blastocitne invazije, rasta trofoblasta i njegove diferencijacije. Vi{e od 40% decidualnih }elija su imune }elije. Vi{e od 70% decidualnih limfocita su CD 56 - cyclodextrin bright i CD 16 - cyclodextrin naturaliler, dok T - }elije ~ine samo 10% decidue. Infiltracija uterinih NK - natural killer }elija je deo cikli~nih promena endometrijuma i pod uticajem je steroida, posebno progesterona. Nedavno je potvr|eno da su endometrijalni IL 15 - interleucini prolaktin uklju~eni u proliferaciju i diferencijaciju ovih }elija. Pretpostavlja se da ove }elije, ~ija se morfologija i koncentracija menja u toku trudno}e, u~estvuju u regulaciji maternalne mukozne funkcije i kontrole obima trofoblastne invazije. Neki MHC - major histocompatibility complex klase molekuli: HLAg - human leukocyte antigen, HLAc human leukocyte antigen, HLAe - human leukocyte antigen, koji su detektovani u trofoblastu, mogu da deluju kao NK - natural killer }elija ligandsi, obezbe|uju}i potentni molekularni mehanizam za prepoznavanje trofoblasta od strane majke. Implantacija embriona je jedan od primera da je neophodan veoma sloèn mehanizam da bi se obezbedilo produènje vrste.

89


4. EMBRIONALNI RAZVOJ Gonade nastaju iz dva razli~ita tipa }elija PGC - primordial germ cells i somatskih }elija. PGC - primordial germ cells u~estvuju u gra|i spermatozoida i oocita i poti~u iz ektoderma. Iz embrionalnog dela plica genitalis po}inju da se pomeraju u pravcu vesicula umbilicalis ameboidnim pokretima i delovanjem hemotakti~nih faktora, formiraju}i na kraju sa }elijama mezenhima chordae gonadales.

Sl. 2.84- PGC - primordial germ cells u 4 - 6.nedelji: 1.darm, 2. ductus omphalomesentericus, 3. allantois, 4. prabubreg leiste (crveno), 5. gonadalna leiste (zeleno), 6. PGC - primordial germ cells, 7. poloàj srca

Embrionalne }elije ekspresuju receptor tirozin kinaze - C-kit na svojoj povr{ini. Njen ligand, faktor stem }elija ili kit ligand, tako|e se ekspresuje du` cele migratorne putanje. îni se da je interakcija izme|u Ckit i njegovog liganda - kit liganda od fundamentalnog zna~aja za migraciju }elija zametka. Poznato je da su i drugi genetski faktori od velikog zna~aja za razvoj gonada. Vilmsov gen tumora WT1 - Wilms tumor je od velikog zna~aja za razvoj jajnika. Bez delovanja WT1 - Wilms tumor }elije zametka normalno migriraju, ali urogenitalni greben ne uspeva da se razvije {to vodi ka ageneziji gonada i bubrega. Poznato je da se po~etak mu{ke diferencijacije aktivira putem seks determini{u}eg faktora enkodiranog u Y hromozomu SRY - sex determining region. Nedavna istraìvanja pokazuju da ènski razvojni put zahteva aktivno u~e{}e Wnt-4 - wingless-int signalne putanje. Ovarium se morfolo{ki diferencira tokom 11. ili 12. nedelje razvoja. Pre toga po~inje umnoàvanje broja embrionalnih }elija mitoti~kom deobom. Jedan deo embrionalnih }elija putem atrezije nestaje. Proces se nastavlja sve do menopauze. Ova degeneracija u fetalnim gonadama se odvija putem apoptoze.

90


Nakon 10. nedelje dolazi do formiranja prve folikularne strukture koje okruùju nekoliko oogonija. Ova labava mreà po~inje da o~vr{}uje i granulosa }elije okruùju ve}inu oocita do 24. nedelje, a ostale oocite do ro|enja. Broj oogonija se stalno pove}ava sve do po~etka mitoze. Po~etak mitoze ozna~ava transformaciju oogonije u oocit. Ovaj proces po~inje oko 15. nedelje, a broj oocita dostiè svoj maksimum oko 20. nedelje. Mejoza oocita zastaje u profazi prve mejoti~ke deobe. Ulaskom u mejozu, oociti gube sposobnost uve}anja svog broja putem mitoze. Ovo prebacuje ravnoteù u korist atrezije embri-

onalnih }elija i od tog trenutka broj oocita po~inje da opada. Za razliku od spermatogeneze kod mu{karaca gde se spermatogonije pona{aju kao stem }elije i konstantno se dele da bi proizvele gamete, ovarijum ima kona~nu zalihu oocita koja se odre|uje na ro|enju. U indiferentnom stadijumu polnih organa postoje dva para polnih kanala, ductus mesonephriticus - Wolff - ov i ductus paramesonephriticus - Mullerov kanal. Wolff-ovi kanali se razvijaju samo kada se iz indiferentnog stadijuma diferencira mu{ka polna `lezda, a Muller-ovi kod ènskog pola.

Sl. 2.85- Genitalni organi u indiferentnom stadijumu u 6. nedelji: 1. gornja genitalna traka, 2. mesonephros, 3. ductus paramesonephricus - Muller, 4. ductus mesonephricus - Wolff, 5. tuberculum sinuale, 6. indiferentna gonada, 7. donja genitalna traka, 8. sinus urogenitale, 9. insercio genitalne trake

III DEO STERILITET

STERILITET Nemogu}nost da se imaju sopstvena deca je problem, koji {irom sveta poga|a oko 80 miliona parova. Smatra se da je oko 15 procenata op{te populacije pogo|eno ovim problemom. Medicinski se razlikuju dve vrste steriliteta: - O primarnom sterilitetu se govori onda, kada èna, uprkos seksualnim odnosima bez za{tite, nikada nije bila trudna. O sterilitetu mu{karca se govori, kada nikada nije oplodio ènu i tako doveo do trudno}e. - Sekundarni sterilitet postoji onda, kada je èna ve} bila trudna, ali uprkos èlji da ima dete, ne moè da do|e do druge trudno}e. Statisti~ka istraìvanja su pokazala, da je mu{karac gotovo isto tako ~esto pogo|en sterilitetom. Kod parova bez dece se pokazuje slede}a podela steriliteta po polovima: - 45 procenata èna - 40 procenata mu{karac - 15 procenata nepoznati uzrok. êsto se kod oba partnera sre}e smanjena plodnost, u oko 35 procenata. Bra~ni par se posmatra kao celina od samog po~etka, zna~i od faze ispitivanja do kasnije faze le~enja.

Problem neplodnosti dobija sve vi{e u zna~aju zbog stalnoga porasta broja parova koji ne mogu da imaju dece. Prihva}eno mi{ljenje da odgovor treba traìti u na~inu i sve lo{ijim uslovima ìvota i ìvotne sredine, tek treba da pro|e kroz ozbiljno istraìvanje. Problem }e sve vi{e dobijati u zna~aju u narednom periodu koji nam predstoji, {to zahteva dodatni anga`man i napor organizatora i realizatora zdravstvene slu`be. U poslednjih dvadeset godina dijagnostika i terapija u ovoj medicinskoj oblasti su izuzetno napredovale i u pore|enju sa drugim medicinskim oblastima svakako su pri samom vrhu. Tendencija je dalji nastavak razvoja, a dokaz za to su svakodnevne novine i nove metodologije rada. Biomedicina, nova nauka XXI veka, neke od svojih korena dobija iz osnova tehnike in vitro fertilizacije. Humana mati~na }elija, baza budu}ih saznanja i odgovora, po~inje da se prati i strukturalno analizira prvi put u dinami~kom procesu u in vitro uslovima. Nova saznanja iz ove oblasti re{ava}e probleme neplodnosti, ali istovremeno davati odgovore i na mnoga druga nau~na pitanja.

94


1. POREME]AJI @ENSKE PLODNOSTI Postoji vi{e na~ina i tabela podela ènskoga steriliteta. Naj~e{}e kori{}ena podela je klasifikovanje u skladu sa op{tim opisima ovulatornih poreme}aja koji su dati od strane „Svetske zdravstvene organizacije“.

I Smetnje na osovini hipotalamuus – hipofiza – ovarijuumi 1. Uzroci u hipotalamusu: idiopatska insuficijencija hipotalamusa, hroni~ne stresne situacije, anorexia nervosa, bulimia nervosa, promene telesne teìne, intenzivan telesni trening; 2. Uzroci u hipofizi: hiperprolaktinemija, jatrogena hiperprolaktinemija kao sporedno delovanje medikamenata, insuficijencija hipofize (Sheehan-Syndrom), tumori hipofize; 3. Ovarijalni uzroci: genetski uzroci, smetnje u razvoju, disgenezija gonada, climacterium praecox, PCOS - polycystic ovarian syndrome, cisti~ne promene jajnika, tumori jajnika, ovarijalna endometrioza; 4. Poreme}aji ciklusa kao posledica osovinskih smetnji: izostanak ovulacije, anovulatorni ciklusi, insuficijencija corpus luteuma, primarna i sekundarna amenoreja.

II Tuubarni i uteruusni sterilitet 1. Tubarni uzroci: endometrioza tuba, salpingitis isthmica nodosa, postinfektivne promene, opturacija jajovoda, ograni~ena pokretljivost fimbrija, o{te}enje muskulature jajovoda sa smetnjama peristaltike kao posledica salpingitisa sa o{te}enjem zida. 2. Materi~ni uzroci: uro|ene anomalije uterusa, posttraumatska o{te}enja sluzokoè materice, Asherman-ov sindrom, postinfektivne promene sluzokoè materice, miomatozna materica, uterusna amenoreja.

III Vaginalni, vangenitalni i psihogeni uzroci 1. Vaginalni uzroci: uro|ene anomalije, himenalna atrezija ili stenoza, atrezija ili stenoza vagine, posttraumatske i postinfektivne promene, kolpitis, dyspareunie. 2. Vangenitalni uzroci: poreme}aji {titne `lezde, hipo- ili hipertireoza, poreme}aji kore nadbubre`ne `lezde; M.Cushing, M.Addison, tumori, androgenitalni sindrom, diabetes mellitus, kori{}enje droga, alkohola, nikotina. 3. Psihogeni uzroci: gubitak libida i anorgazam, vaginizam, problemi u partnerskom odnosu, socijalne konfliktne situacije, hroni~ne stresne situacije, sportski intenzivan trening, anorexia nervosa.

95

III Deo: Sterilitet

1.1. MIOMI I STERILITET Zna~aj mioma kao uzroka steriliteta je vi{estran i dobija u zna~aju zbog sve ve}eg procenta èna koje se u kasnijim godinama odlu~uju da ra|aju, zna~i u periodu kada je ~e{}a pojava miomatoznih promena na uterusu. Prihva}eni parametri mioma kao uzroka steriliteta su: - submukozni miomi veli~ine 5 santimetara - intersticijalni miomi veli~ine 2–3 santimetara. Posledice pojave mioma direktno povezane sa poreme}enom fertilno{}u su slede}e: - poreme}en transport gameta sa antinidacionim efektom na implantaciju blastociste, - distorzija kavuma uterusa, - abnormalno snabdevanje krvlju endometrijuma i poreme}aj intramiometralne vaskularizacije sa posledi~nim promenama endometrijuma, sa ~e{}om pojavom submukoznih lezija, - hiperkontraktilnost uterusa uzrokovana miomom zbog arhimetralnog hiperestrogenizma koji interferira sa ovarijalnim upravljanjem peristalti~ke aktivnosti. Sve su to razlozi koji su direktno odgovorni za poreme}aj implantacije u programima asistirane reprodukcije, naro~ito IVF – in vitro fertilisation, kod pacijenata sa fibroidima. Poznato je da uterus poseduje sopstvenu kontraktilnost koja se posebno odnosi na unutra{nju tre}inu miometrijuma koja je povezana sa prate}im kretanjem endometrijuma. Ova uterusna peristaltika igra jednu od zna~ajnih uloga u transportu sperme i o~uvanju rane trudno}e i zavisna je od faze ciklusa. Nepobitno je dokazano da je procenat trudno}a i implantacija zna~ajno smanjen kod pacijenata sa intra-

muralnim i intramukoznim miomima, ~ak i kada ne postoji deformitet kavuma. Procenat trudno}a do kojih dolazi nakon miomektomije, kre}e se u literaturi i do 60%. Stav u svim ve}im centrima koji se bave problemom steriliteta je obavezno otklanjanje mioma pre ulaska u program asistirane reprodukcije. Kod pacijenta se uz veli~inu i lokalizaciju mioma, pri odlu~ivanju uzimaju i ostali faktori u obzir, kao godine starosti, predvi|ena metoda le~enja, etiologija, prethodni poku{aji.

Sl. 3.1- Miom zadnjeg zida uterusa

Metode tretiranja mioma su: - abdominalna miomektomija - kod èna sa multiplim miomima i ve}im intramuralnim miomima, - laparoskopska miomektomija - u slu~ajevima prisustva manje od tri mioma, i prisustva mioma manjeg od 6 cm. Laparoskopska procedura obezbe|uje manji postoperativni bol, kra}i boravak u bolnici, brzi oporavak, i smanjeno stvaranje postoperativnih adhezija za oko 40%. Intraoperativni ve}i gubitak krvi smanjuje procenat operativnog uspeha za vi{e od 20%. Opisani rizik od rupture uterusa u toku trudno}e nakon laparoskopske miomektomije usled uterusnog defekta ili lo{eg oìljavanja iznosi 1%,

96


Sl. 3.2- Laparoskopska miomektomija

- histeroskopska miomektomija - je standardna procedura za submukozne miome manje od 5 cm u pre~niku. Eventualne komplikacije ove metode su stvaranje postoperativnih adhezija u oko 10% slu~ajeva. Kod èna sa submukoznim miomima ve}im od 3 cm u pre~niku preporu~uje se upotreba gonadotropin releasing hormon analoga pre operacije,

- vaginalna miomektomija - se moè primeniti i kod ve}ih, ili intramuralnih mioma, - UFE - uterusna fibroidna embolizacija, uterine fibroid embolization, predstavlja noviju metodu u le~enju mioma. Primena ove metode je rutinirana u slu~ajevima potrebe smanjenja veli~ine mioma kao i zaustavljanja ekscesivnog krvarenja.

Sl. 3.3- Histeroskopski nalaz intrakavitarnog mioma

Sl. 3.4- [ematski prikaz UFE - uterusna fibroidna embolizacija metode

97

III Deo: Sterilitet

Koriste se preparati PVA - polyvinyl alcohol particles za embolizaciju.

Sl. 3.5- Embolizacija mioma

U slu~ajevima poreme}ene fertilnosti ène, mi{ljenja o primeni ove metode su podeljena. Kako je u odre|enom procentu tretiranih èna usled embolizacije utero-ovarijalne kolateralne cirkulacije, opisana pojava ovulacione disfunkcije sa hipergonadotropnom amenorejom do prematurne menopauze, zatim infekcije uterusa sa endometritisom, piometre, pa i slu~ajevi anaerobne pelvi~ne sepse, ova metoda se ne savetuje ènama u reproduktivnoj fazi. - laparoskopska bipolarna koagulacija uterusne arterije kao alternativa UFE - uterine fibroid embolization. Grupa lekara sa Tajvana opisala je smanjenje mioma za 76% nakon primene laparoskopske bipolarne koagulacije krvnih sudova uterusa, - laparoskopska mioliza - vr{i se koagulacijom centralnog dela mioma sa dugom bipolarnom iglom ili laserom. Koagulaciona nekroza mioma rezultira vaskularnim o{te}enjem i promenama u kolagenu, {to dovodi do smanjena mioma. Opisano smanjenje mioma iznosi oko 40 %. Glavni nedostaci ove metode su stvaranje adhezija koje mogu da dovedu do infertiliteta.

1.2. ENDOMETRIOZA I STERILITET Endometrioza je oboljenje pojave i usa|ivanja endometrijuma van kavuma uterusa sa cikli~nim hormonskim promenama, koje se javlja kod oko 7 do 15 procenata svih èna u hormonski aktivnoj fazi. Oko 35 procenata obolelih nema nikakvih tegoba, a oko 65 procenata obolelih èna pati od razli~itih tegoba, zavisno od mesta i teìne oboljenja. Endometrioza je ~est uzrok nemogu}nosti ra|anja dece. Oko 40 procenata èna obolelih od endometrioze boluje od delimi~ne, ili potpune neplodnosti.

Sl. 3.6- Endometriozna àri{ta: 1. Ovarium, 2. Tube, 3. Ligamentum teres uteri, 4. Peritoneum, 5. Uterus, 6. Vesica urinaris, 7. Fornix vaginae, 8. Klitoris, 9. Vagina, 10. Vestibulum vagninae, 11. Labium majus, 12. Douglas – ov prostor, 13. Rectum

Endometriozna àri{ta su razli~ito lokalizovana. - Endometriosis genitalis externa: kada su àri{ta u oblasti organa male karlice, ovarijuma, na vezivnom aparatu uterusa, peritoneumu, na zidu be{ike, rekto vaginalna.

98


- Endometriosis genitalis interna: endometrioza koja nastaje urastanjem bazalnog sloja endometrijuma u intersticijalni deo mi{i}nog sloja zida materice ili u zid jajovoda, endometriosis isthmica nodosa. - Endometriosis extragenitalis: kada se àri{ta endometrioze nalaze u okolini male karlice, ili u delovima tela i u organima, koji su udaljeni od polnih organa. Uprkos intenzivnom istraìvanju o na~inu nastanka bolesti jo{ od njenog otkri}a 1860.god. od strane Von Rokitansky, danas jo{ uvek nijedna od teorija ne pokriva sve forme endometrioze koje postoje.

Teorija o prenosu - ili teorija transplantacije pretpostavlja preno{enje tkiva endometrijuma iz uterusa retrogradnom menstruacijom limfnim i krvnim sudovima. Menstrualna krv moè preko jajovoda da donese deli}e endometrijuma. Imunolo{ki sistem bi u normalnim okolnostima prepoznao ove strane }elije i uni{tio ih. Ali, ako je imunolo{ki sistem oslabljen, ili poreme}en, onda moè da do|e i do njihovog rasta. ]elije endometrijuma mogu preko krvnih puteva ili limfnih sudova da dospeju na bilo koje mesto u organizmu. Na ovaj na~in bi moglo da se objasni prisustvo endometrioze u udaljenim organima. Pri operacijama na materici, mogu neopaèno da se prenesu sitni deli}i }elija endometrijuma. Teorija metaplazije - ili preobraàja }elija koja obja{njava razvoj bolesti kao proces kontinuirane diferencijacije tkiva celomske opne putem metaplazije. Pri formiranju polnih organa ènskog embriona moè da do|e do odvajanja nespecifi~nog tkiva. Ove nespecijalizovane }elije se naj~e{}e nastanjuju u dubokom prostoru abdomena. Putem metaplazije ove }elije se transformi{u u endometrijalno tkivo.

Sl. 3.7- Mikroskopski presek endometrioznog àri{ta

Najnovija istraìvanja baziraju se na ~injenici da se fiziolo{ki efekti progesterona ostvaruju putem dve izoforme PR progesteronskih receptora A i B. Progestini se dugo koriste u le~enju endometrioze, ali na àlost efekti su kratkotrajni. Uz to, oko 9% èna sa endometriozom ne reaguju na progesteronsku terapiju. Prime}ena je tendencija rezistencije unutar eutopi~nog i ektopi~nog endometrijuma kod èna sa endometriozom kao i smanjenje PR-B progesteronskog receptora B, ali ne i PR-A - progesteronskog receptora A. Na|eno je da je promoter region PR-B - progesteronski receptor, ali ne i PR-A - progesteronski receptor A hipermetilisan kod endometrioze u pore|enju sa kontrolom. Uz to je ekspresija PR-B- progesteronskog receptora B zna~ajno redukovana u ektopi~nom endometrijumu. Ovo sugeri{e da je rezistencija na progesteron kao i smanjenje PRB - progesteronskog receptora B, ali ne i PRA - progesteronskog receptora A, rezultat promoter hipermetilacije PR-B - progesteronskog receptora B, ali ne i PR-A - progesteronskog receptora A. Povezano sa metilacijom HOXA10 – homeoboxA10 gena u eutopi~nom endometrijumu èna sa endometriozom, ukazuje da je endometrioza epigenetsko oboljenje, {to otvara novo vi|enje patogeneze endometrioze i nove vidove le~enja.

99

III Deo: Sterilitet

Kod èna sa endometriozom sre}u se slede}e tegobe: Tabela 3-1: Simptomi endometrioze

Simptomatika Menstrualni bolovi Bolovi u malom stomaku, mu~nina, simptomi u crevima Sl. 3.8- PR izoform B receptori uterusa

U~estalost lokalizacije po podacima iz literature je slede}a: - 60 % Douglas-ov prostor i lig. sacrouterinum - 50 % ovarijumi - 15 % vesica urinaria - 10 % tube - 8 % peritoneum bez zahvatanja organa male karlice - 20% creva sa endometriozom polnih organa - Retki su slu~ajevi endometrioze na plu}ima, na plu}noj maramici, pleuri pulmonalis, àri{ta u podru~ju ruku ili nogu, u kanalu ki~mene mo`dine i u operativnim oìljcima.

Sl. 3.9- Endometriozna àri{ta

Sl. 3.10- Endometrioza u po~etnoj fazi

Meno-metroragije Dyspareunia, glavobolja, vrtoglavica, problemi sa èlucem Sterilitet

U~estalost u % preko 90 % 80 % preko 60 % 50 % preko 40 %

êste infekcije

40 %

Subfebrilne temperature

30 %

U~estala je pojava nespecifi~nih hroni~nih tegoba: - psihi~ke promene, koje su prouzrokovane ìvotom sa hroni~nim bolovima, - promene raspoloènja, - nekarakteristi~ne tegobe u stomaku, - ose}aj nadutosti, - op{ta nelagodnost, - gubitak libida. Ove tegobe ~esto dovode do pogre{nih dijagnoza i primene neefikasne terapije. Neretko se tegobe pogre{no ocenjuju kao psihosomatske. Suverena dijagnosti~ka metoda kod endometrioze je laparoskopija kojom se ta~no defini{e stadijum i samim tim na~in le~enja. Klasifikacija stepena bolesti je revidirana klasifikacija “Ameri~ke asocijacije za fertilitet” kojom se deli na ~etiri stadijuma, bazirano na bodovnom sistemu u zavisnosti od veli~ine àri{ta, prodiranja u dubinu tkiva, broja i postojanja adhezija.

100


Polaze}i od incidence bolesti i podataka da je oko 40 % èna sa endometriozom sterilno, jasan je medicinski i socijalni zna~aj ove bolesti. Mehanizmi delovanja endometrioze na fertilitet se jo{ uvek istraùju. Do sada su utvr|eni slede}i mehanizmi: - ovarijalna disfunkcija, anovulacija, poreme}aj funkcije ùtog tela, poreme}aj LH - luteinizing hormone pika, LUFS–luteinizing unruptured follicle sindrom, nerupturiranje luteiniziranog folikula, - hiperprolaktinemija zbog stvaranja prolaktina u endometrioznim àri{tima, - pove}anje peritonealne te~nosti sa povi{enim koncentracijama prostaglandina i pove}anim motilitetom tuba i uterusa kao i luteoliti~kim efektom. Peritonealna te~nost ima i toksi~ni efekt sa pove}anjem broja makrofaga, - autoimuni odgovor na endometriozna àri{ta sa alteracijom humoralnog imuniteta sa padom T }elijskog i porastom B }elijskog reaktiviteta, sa prisustvom IgA i IgG autoantitela u odnosu na endometrijum i antigene ovarijuma, - kod teìh formi endometrioze prisustvo adhezija, razaranje tubarnog i ovarijalnog tkiva. Metode le~enja su: - hirur{ka terapija - medikamentozna, hormonska terapija - terapija bola - alternativne metode le~enja

}ava otkrivanje i uklanjanje i najmanjih endometrioznih promena. U slu~aju velikih endometrioznih promena metoda izbora je laparotomija. Uklanjanje kompletnih organa je potrebno samo u izuzetnim slu~ajevima.

Medikamentozna terapija Kod medikamentozne terapije primenjuju se gestageni, danazol, GnRH - gonadotropin releasing hormon analozi i GnRH - gonadotropin releasing hormon antagonisti, po poznatim protokolima u vremenu od 6 do 12 meseci.

1.3. INFEKCIJE KOD @ENE I NJIHOV ZNAÂJ U STERILITETU Bakterijska vaginoza Bakterijska vaginoza, ozna~ena kroz disbalans izme|u laktobacila i razli~itih anaerobnih mikroorganizama sa vode}om klicom Gardnerella vaginalis, postoji kod svake dvadesete pacijentkinje u tretmanu steriliteta, ali samo kod polovine obolelih izaziva simptome. Postoje dokazi da cervikalno vaginalna flora ima veliki uticaj na uspeh IVF - in vitro fertilisation.

Hirur{ka terapija Laparoskopska operativna tehnika se uvek primenjuje kada je to mogu}e zbog minimalne invazivnosti. Odskora se koristi laparoskopska operativa sa prethodnim ubrizgavanjem odre|ene aktivne supstance koja se vezuje za endometriozne }elije i pri osvetljavanju plavim svetlom àri{ta svetle {to omogu-

Sl. 3.11- E.colli

101

III Deo: Sterilitet

Brojne studije pokazuju {tetan uticaj patogenih bakterija koje su kultivisane sa vrha katetera nakon ET – embrio transfera kao sto su: E.coli, streptokoke, posebno Streptococcus viridans, kao i anaerobi. Nasuprot tome, dijagnostika hidrogen peroksid produkuju}ih laktobacila sa vrha katetera pokazuje pozitivnu korelaciju sa pove}anjem procenta uspeha IVF - in vitro fertilisation. H2O2 laktobacili pomaù odrànju zdrave vaginalne flore. Bakterijska vaginoza predstavlja nalaz vaginalne flore koji karakteri{e gubitak H2O2 produkuju}ih laktobacila, {to je pra}eno pove}anjem koncentracije anaeroba i Gardnerella vaginalis.

Sl. 3.12- Lactobacilli

IVF - in vitro fertilisation pacijenti u 30 - 40% slu~ajeva imaju dijagnostikovanu patogenu vaginalnu floru. Nedavno je dokazano da je bakterijska vaginoza u ranoj trudno}i povezana sa ranim poba~ajem kod spontanih trudno}a kao i kod trudno}a nakon IVF - in vitro fertilisation procedure. Smanjenje uspeha IVF - in vitro fertilisation u slu~ajevima dokazane bakterijske vaginoze moè biti uzrokovano, bilo smanjenom koncepcijom, bilo ranim gubitkom trudno}e. Moè se pretpostaviti da infekcija uti~e na uspeh IVF - in vitro fertilisation na najmanje dva na~ina.

Prvi mehanizam koji uti~e na procenat uspeha je da subakutni endometritis koji je postojao i pre IVF - in vitro fertilisation umanjuje direktno procenat implantacije. Uzroci preegzistiraju}eg subakutnog endometritisa mogu da budu i prethodne intrauterine procedure koje dovode do uvo|enja patogenih bakterija u uterus. @ene u programu IVF - in vitro fertilisation su ~esto prethodno bile podvrgnute brojnim dijagnosti~kim i terapijskim intrauterinim procedurama. Drugi razlog smanjenja uspeha kod ART –assisted reproductive technology zbog intrauterine inflamacije je pove}anje procenta ranih poba~aja. Intrauterini inflamatorni proces moè da bude odgovor na unos patogenih bakterija u endometrijalnu {upljinu putem katetera za embrio transfer. Ova imflamacija, nedovoljna da uti~e na koncepciju, moè da dovede do pove}anog procenta ranih poba~aja. Poznato je da su citokini va`ni u procesu implantacije. Patogene bakterije une{ene kateterom za embrio transfer uzrokuju disbalans citokina, {to se negativno odraàva na proces implantacije. Bolje razumevanje efekata cervikovaginalne flore i kontaminacije kateterom u IVF - in vitro fertilisation proceduri dove{}e do optimizacije svih procedura u toku procesa IVF - in vitro fertilisation. Isto tako, mora se biti obazriv i pri upotrebi antibiotika {irokog spektra koji uti~u na vaginalnu floru i smanjuju broj H2O2 produkuju}ih laktobacila, {to na duge staze paradoksalno smanjuje procenat uspeha IVF - in vitro fertilisation.

Gardnerella vaginalis Dijagnoza infekcije Gardnerella vaginalis se smatra sigurnom kada postoji naj-


102

manje tri od slede}ih nalaza: vaginalna pH > 4,5; miris na amin posle alkalizacije sa 10% kalijumovim baznim rastvorom i prisustvo clue – cells u faznom kontrasnom mikroskopu, ili u preparatu obojenom metilenskim plavim.

Streptokoke Pojava streptokoka grupe B se sre}e kod 10% do 15% svih pacijentkinja. Stoga se kao profilaksa eventualne sepse kod novoro|en~adi predlaè screening u trudno}i i kao konsekvenca preporu~uje intrapartalna hemoprofilaksa.

Sl. 3.13- Gardnerella vaginalis

Sl. 3.15- Streptokoke

Poreme}ena flora vagine je predispozicija za ascedentne infekcije.

Prekonceptualan screening se naprotiv smatra nepotrebnim, po{to smanjenje klica po svim pravilima ne uspeva.

Chlamydia trachomatis Chlamydia trachomatis je naj~e{}i seksualno prenosivi bakterijski uzro~nik u zapadnim zemljama sa prevalencom do 5% me|u ènskom populacijom u dobi od 15 do 29 godina.

Sl. 3.14- Clue cells kod Gardnerella vaginalis

Ona ima manji uticaj na procenat uspeha posle ART - assisted reproductive technology, ali pove}ava rizik od prevremenih poba~aja. U trudno}i postoji pove}an rizik od prevremenog pucanja vodenjaka, horioamnionitisa i prevremenog poro|aja. Bakterijska vaginoza treba prekonceptualno da se sanira.

Sl. 3.16- Chlamydia trachomatis

103

III Deo: Sterilitet

Infekcija ~esto proti~e sa slabim simptomima sa slikom zapaljenja grli}a materice, cervicitisom. U procesima intrauterinih manipulacija kao {to je inseminacija, ili transfer embiona, postoji opasnost da se prenesu klice i razvije adneksitis sa njegovim posledi~nim pojavama. Pregled svih pacijentkinja pre po~etka procedure ART – assisted reproductive technology, nije vaàn samo zbog mogu}nosti preno{enja ascedentnih infekcija, ve} i ro|enja zdravog deteta. Infekcija hlamidijom pove}ava rizik od preranog poro|aja. Kod novoro|en~adi inficiranih majki u 20% do 50% razvija se konjuktivitis koji retko moè da dovede ~ak i do slepila. U 10% do 20% nastaje neonatalna pneumonija. Dokazivanje klica pomo}u genskih amplifikacionih tehnika mogu}e je iz prvog jutarnjeg urina ili iz brisa grli}a materice. U slu~aju postojanja infekcije Chlamydia trachomatis le~e se oba partnera, da bi se spre~ila reinfekcija.

Gonokoke Gonoreja je jedna od naj~e{}ih polnih bolesti. [irom sveta se godi{nje inficira izme|u 25 i 60 miliona ljudi. Bolest izazivaju bakterije Neisseria gonorhoeae i postoji obaveza prijavljivanja bolesti.

Iz tog razloga se skoro sve infekcije prenose polnim odnosom. Razlikuje se genitalna gonoreja i vangenitalna gonoreja. Kod genitalne gonoreje nekoliko dana posle infekcije dolazi do upale sluzokoè koja se ispoljava kao upala mokra}nog kanala. Stvara se gnojni ù}kasto-zeleni iscedak. Infekcija u polovini slu~ajeva proti~e bez posebnih propratnih pojava. Na iscedak se ne obra}a pa`nja, jer se ~esto smatra normalnim sekretom. Nele~ena gonoreja moè da dovede do steriliteta zbog {irenja na unutra{nje genitalne organe. Kod vangenitalne gonoreje se upala {iri izvan genitalnih organa kao posledica seksualnog pona{anja. Mogu}a su zapaljenja na sluzokoì usta i anusa. Poseban slu~aj predstavlja infekcija kod novoro|en~adi kada je majka obolela u vreme poro|aja. Gonoreja se prenosi na ve`nja~u deteta, sa po~etkom simptoma nekoliko dana posle ro|enja. Zato je propisana, takozvana Credesche profilaksa. Retko dolazi do pro{irenja bolesti na celo telo preko krvi sa povi{enjem telesne temperature, bolovima u zglobovima i stvaranja gnojnih mehuri}a na rukama i nogama. Da bi se postavila sigurna dijagnoza iscedak se bakteriolo{ki pregleda. Terapija gonoreje se sastoji u davanju antibiotika. Bra~ni par mora da se le~i istovremeno i tek po proverenom izle~enju je mogu} po~etak procedure IVF – in vitro fertilisation.

Treponema pallidum Sl. 3.17- Neisseria gonorrhoeae

Po{to su bakterije osetljive na isu{ivanje i niske temperature preno{enje gonoreje je mogu}e samo u vla`noj i toploj sredini.

Sifilis je bolest koja je poznata vekovima. Godine 1495. opisana je prva epidemija ove bolesti. Bolest koja se po pravilu prenosi polnim odnosom izaziva bakterija


104

Treponema pallidum. Sifilis se razvija u stadijumima. Moè da napadne sve organe i ako se ne le~i moè dovesti do smrti pacijenta.

Sl.3.18- Treponema pallidum

Ako je majka obolela od sifilisa, u toku trudno}e se preko placente inficira i dete. To je mogu}e tek posle 4. meseca trudno}e. Ako je majka pre ili u toku prva tri meseca trudno}e uspe{no le~ena, dete ne}e biti o{te}eno. Zavisno od stepena teìne maj~ine infekcije, mogu}e je da u 7. ili 8. mesecu trudno}e do|e do ro|enja mrtvog novoro|en~eta. Ako je infekcija majke trajala duè unazad, inficirano dete moè da pokazuje simptome drugog stadijuma. Mogu}e je i da se prvi simptomi razviju tek godinama ili decenijama kasnije.

I Stadijum: Posle dve do tri nedelje nastaje bezbolan ~vori} ili ~ir na ulaznom mestu bakterija - ulcus durum, sa regionalnim oticanjem limfnih ~vorova, koji se povu~e posle nekoliko dana do nekoliko nedelja. II Stadijum: Druga faza po~inje otprilike 9 nedelja posle infekcije sa povi{enjem telesne temperature, bolovima u zglobovima, osipom po telu – syphilid, uve}anim limfnim ~vori}ima. Tegobe se povla~e, a zatim sledi period bez tegoba vi{e godina, decenija ili do kraja ìvota.

III Stadijum: Ako posle 2 – 5 godina do|e do tre}eg stadijuma, bolest zahvata unutra{nje organe, srce, krvne sudove i nervni sistem. Guke, zapaljenske izrasline koje izgledaju kao ~ir izlaze po celom telu, na koì, u organima, u kostima, u krvnim sudovima i u centralnom nervnom sistemu. Na tim mestima dolazi do razaranja tkiva koje, zavisno od poloàja guka, izaziva odgovaraju}e tegobe. IV Stadijum: Nele~en lues, ili neurosifilis dovodi do demencije i smrti. Poslednji stadijum sifilisa nastupa naj~e{}e posle 10 do 20 godina kada su pogo|ene mo`dane opne, nervni ~vorovi i nervne ganglije. Napad bolesti se ispoljava op{tim i progresivnim oduzetostima, napadima bolova, smetnjama u ose}anjima i ispadima refleksa. Na kraju, ovaj poslednji stadijum dovodi do demencije i smrti. Dijagnoza sifilisa se postavlja specifi~nim testovima na antitela bakterija. Terapija je antibiotska. Bolest mora da se prijavi. Infekcija u svakom periodu trudno}e moè da se prenese na dete, posebno u drugom stadijumu i da izazove poba~aj. Smrtnost kongenitalno inficirane dece je visoka. Pacijenti u aktivnoj fazi bolesti se isklju~uju iz programa asistirane reprodukcije do izle~enja. Testovi nisu rutinski, ve} samo kod suspektnih slu~ajeva.

Candida albicans Pribli`no 75% èna u toku ìvota bar jednom }e imati vulvovaginitis izazvan candidom, a 5% èna ima}e rekurentne infekcije. Incidenca vulvovaginalne kandidijaze je najve}a u reproduktivnoj dobi izme|u 20. i 40. godine ìvota, a retka u prepubertalnoj, odnosno, postmenopauzalnoj dobi.

105

III Deo: Sterilitet

Sl. 3.19- Candida albicans

Pretpostavlja se da visok nivo estrogena pogoduje razvoju ove infekcije. Estrogen pove}ava nivo sadràja glikogena u vagini {to ima direktan uticaj na rast kandide i pove}anje njene adherentnosti za vaginalni epitel. Vulvovaginalna kandidijaza je naj~e{}e izazvana candidom albicans, a zatim se sre}e candida glabrata.

ciju podrazumeva dupliranje standardnog tretmana. Efekti infekcije C. albicans na ishod le~enja infertiliteta, kao i na parametre sperme, jo{ uvek nisu dovoljno jasni. Ono {to je za sada inidikativno, pokazuje da, iako C.albicans ne uti~e direktno na parametre sperme, infekcija ovom gljivicom moè da prouzrokuje porast hromatinskog o{te}enja sperme i apoptozu, {to moè da dovede do poreme}aja fertilizacije nakon ART- assisted reproductive technology.

Trichomonas vaginalis Vaginalna infekcija izazvana Trichomonas vaginalis - om igra zna~ajnu ulogu u slu~ajevima infertiliteta. Infekcija cervikalnog kanala spre~ava transport sperme toksi~nim metaboli~kim produktima ovih organizama, a intrauterina infekcija ima za posledicu neadekvatan razvoj endometrijuma, koji ugroàva uspeh neke od ART assisted reproductive technology postupaka.

Sl. 3.20- Candida glabrata

Nekomplikovana vulvovaginalna kandidijaza je definisana kao sporadi~ni vaginitis, izazvan naj~e{}e C.albicans i osetljiv na antifugalnu terapiju. Terapija podrazumeva poliene, azole, gde spadaju imidazol i triazol, te druga sredstva kao {to su intravaginalne kapsule borne kiseline, te flukotisin. Kod èna sa rekurentnom vulvovaginalnom kandidijazom adekvatni tretman za inicijalnu infek-

Sl. 3.21- Trichomonas vaginalis

Na infekciju Trichomonas vaginalis – om nailazimo kod 20% infertilne populacije. Treba imati u vidu da je vi{e od 50% ovih infekcija kod èna, kao i ve}ina infekcija kod mu{karaca, asimptomatska. Uz uobi~ajene dijagnosti~ke postupke kod


106

simptomatske infekcije trichomonasom koje su pozitivne u 85% slu~ajeva, posebnu pa`nju treba obratiti kod asimptomatskih slu~ajeva, gde je jedino pogodno vreme za utvr|ivanje prisustva trichomonasa u uzetom uzorku vreme ovulacije, kada poja~ana sekrecija cervikalnog mukusa omogu}ava spiranje ove protozoe iz dubokih delova cervikalnih `lezda. Iste ène ~esto imaju pozitivan nalaz u endometrijalnom uzorku. Metoda izbora u le~enju infekcije je upotreba Metronodazola, bilo oralno, {to je naj~e{}e, bilo u kombinaciji sa lokalnom upotrebom kod rezistentnih oblika.

Toxoplasma gondii Ukoliko do infekcije toxoplazmom do|e u trudno}i, oboleva fetus. Profilaksa vakcinacijom jo{ uvek nije na raspolaganju. Na osnovu podataka iz literature 50 do 80% svih pacijentkinja su seronegativne. Kod 20 do 50% èna pregledom je dokazano postojanje imuniteta, odnosno inaktivne infekcije.

antitela mogu da perzistiraju do 3 godine. Diferencijalna dijagnoza zahteva dodatne preglede, ili tokove titra, radi potvr|ivanja akutne faze bolesti. Prekoncepcijskom dijagnostikom ne mogu da se spre~e slu~ajevi toksoplazmoze u trudno}i {to ostavlja otvoreno pitanje, da li bi screening na toksoplazmozu pre ART – assisted reproductive technology trebao da se preporu~i samo radi isklju~enja kasnijih te{ko}a u interpretaciji rezultata pregleda.

Virusne infekcije Hepatitis B Imunitet na hepatitis B moè da se proveri odre|ivanjem anti - HBs, da bi se u nedostatku antitela ponudila za{titna vakcinacija. Kontrola uspeha vakcinacije se vr{i 4 do 8 nedelja posle tre}e vakcinacije odre|ivanjem anti - HBs.

Sl. 3.23- Hepatitis B virus Sl. 3.22- Toxoplasma gondii

Kod èna kod kojih je titar antitela toksoplazme pozitivan, utvr|uje se prisustvo IgG i IgM antitela. Ako pored IgG moè da se dokaè i prisustvo IgM, to ne dokazuje jo{ uvek akutnu infekciju po{to IgM

U praksi pacijentkinje koje su u programu za sprovo|enje ART - assisted reproductive technology retko se odlu~uju da sa~ekaju kompletiranje vakcinisanja nakon jedne godine. Posebno je va`no pitanje hroni~nog oblika hepatitisa B.

107

III Deo: Sterilitet

Odre|ivanje HBs - antigena sluì za isklju~ivanje hroni~ne infekcije hepatitisom B. Ako je èna HBs – Ag - pozitivna, seronegativan partner bi trebalo da bude za{ti}en vakcinisanjem. Trudno}a i hroni~ni virus hepatitisa nemaju me|usobni uticaj. Verovatno}a vertikalne transmisije virusa sa majke na fetus korelira sa dokazom Hbs – Ag, odn. HBV DNK - deoksiribonukleinske kiseline u krvi. Po{to neposredno post partum sprovedena simultana HBV-imunoprofilaksa i HBV vakcinacija {titi skoro 95% svih novoro|en~adi, Hbs – Ag - screening je obavezni deo pripreme za program. Po{to su mnoge HBs – Ag pozitivne ène inficirane konatalno i ne opaàju nikakvo ograni~enje kvaliteta ìvota, te{ko pristaju na odlaganje programa ART assisted reproductive technology. Adekvatnim razja{njenjem se uklanjaju i nedoumice pravne odgovornosti. Kod hroni~no agresivnih tokova i visokog optere}enja virusom trebalo bi da se razmisli o terapiji interferonom.

Hepatitis C

Hroni~ni hepatitis C i trudno}a ne uti~u jedno na drugo. Materno-fetalna transmisija je zavisna od maj~inog optere}enja virusom i u proseku iznosi 3% do 5%. Kod HCV – DNK - deoksiribonukleinske kiseline koji mogu da se dokaù, ra~una se sa oko 1%, kod >106 kopija genoma/ml. Pri koinfekciji sa HIV-om dolazi do 25% fetalnih infekcija. Pre po~etka programa sprovode se hepatolo{ke opcije terapije radi smanjenja optere}enja virusom. To uspeva kod oko 50% svih le~enih pacijentkinja kroz kombinovano le~enje sa alfa-interferonom i ribavirinom. Program ART – assisted reproductive technology se odlaè za 12 do 18 meseci. Inficirana novoro|en~ad su dugo vremena bez simptoma, nisu retka spontana izle~enja i virus perzistira u 50% do 60% slu~ajeva do odraslog doba. Hroni~na infekcija naj~e{}e dovodi samo do minimalnog o{te}enja jetre sa sporom postupno{}u.

HIV - Human imunodeficijentni virus

Efikasnost vakcinacije stalno se smanjuje kod HVC zbog izraènih pojava mutacija pojedina~nih genotipova i subtipova.

U slu~ajevima napretka antiretrovirusne terapije kod ène, èlja za sopstvenim detetom moè opet da spada u plan ìvota.

Sl. 3.24- Hepatitis C virus

Sl. 3.25- Human imunodeficijentni virus

108


Trudno}a ne uti~e na tok HIV - human imunodeficijentni virus infekcije, koja nije uznapredovala, ali infekcija pove}ava verovatno}u komplikacija u trudno}i. Individualni materno-fetalni rizik transmisije ne moè da se ta~no utvrdi, ali su prognosti~ki povoljniji slu~ajevi sa niskim optere}enjem virusom, stabilnim tokom infekcije i nedostatkom aku{erskih faktora rizika. Po{to se virus prenosi prete`no u toku poro|aja, fetalni rizik od infekcije se smanjuje putem antiretroviralne terapije u trudno}i, odlu~ivanjem za poro|aj carskim rezom bez po~etka trudova, neonatalnom antiretroviralnom profilaksom i odustajanjem od dojenja. Time se postiè smanjenje procenta obolevanja novoro|en~eta sa oko 20% na ispod 2%. Nejasne su mogu}e kasne posledice intrauterinske ekspozicije antiretroviralnim lekovima, posebno kod kombinovanih terapija, jer o najve}em broju supstanci postoje pojedina~na iskustva sa malim brojem dece pra}enih duè od 5 godina od ro|enja. Postoji mogu}nost samo-inseminacije u ku}nim uslovima bez opasnosti od infekcije za zdravog partnera. Primena asistirane reprodukcije eksplicitno u prvi plan postavlja dobrobit deteta i zato, pre po~etka terapije mora bri`ljivo da se proceni rizik svakog pojedina~nog slu~aja uz uklju~enje nadle`ne eti~ke komisije.

Sl. 3.26- Herpes simplex virus tip 1 HSV - 1

Herpes kao seksualno prenosivo oboljenje uzrokovano je infekcijom herpes simplex virusom. ê{}e se javlja kod èna, jer je preno{enje sa mu{karca na ènu ~es}e nego sa ènskog na mu{kog partnera. Herpes virus se prenosi direktnim kontaktom, bilo da je re~ o seksualnom kontaktu, poljupcu ili kontaktu putem koè. Simptomi mogu da budu vrlo blagi i u nekim slu~ajevima infekcija moè da bude asimptomatska, umerena ili izraèna. Nakon primarne infekcije, rekurentne epizode su naj~e{}e prve godine. Dijagnoza se postavlja uz pomo}:

Herpes simplex virus tip 1 HSV – 1 Herpes simplex virus tip 2 HSV – 2

- testova krvi - mikroskopskog pregleda tkiva nakon skarifikacije - virusne kulture }elija - imunih testova - drugih testova kao {to su antigen test i Papa test.

Postoji preko 80 poznatih tipova herpes virus-a od kojih osam izazivaju oboljenja kod ljudi. Me|u njima su naj~e{}i Herpes simplex tip 1 i 2. HSV – 1 i HSV - 2 izgledaju skoro identi}no pod mikroskopom i oba tipa mogu da izazovu infekcije usta ili genitalija.

Dijagnoza genitalnog HSV- herpes simplex virus tip 1 infekcije je te{ka zbog toga {to se ova vrsta infekcije retko javlja, mnogo re|e nego infekcija HSV – herpes simplex virus tip 2. Zato se ~esto HSV – herpes simplex virus tip 2 ozna~ava kao herpes genitalis virus.

109

III Deo: Sterilitet

Porodica herpes virusa je velika. Ona obuhvata: - Epstain - Barrov virus - HSV - herpes simplex virus tip 1 i HSV - herpes simplex virus tip 2 - humani citomegalo virus - varicella zoster virus

Epstein – Barr virus EBV

Sl. 3.27- Herpes simplex virus tip 2 HSV – 2 Herpes genitalis virus

Infekcija ovim virusom iz porodice herpes virusa se javlja kod dece i mladih. Oporavak obi~no prolazi bez posledica.

HSV - herpes simplex virus u 1% do 5% moè da dovede do infekcije novoro|en~eta sub partum. Po{to stopa recidiva u poodmakloj trudno}i moè znatno da se smanji antivirusnom profilaksom indikovan je carski rez. Dokazivanje HS - herpes simplex virusa nema relevantnost za reproduktivnu medicinu. Tabela 3-2: Infektolo{ka osnovna dijagnostika oba partnera pre ART – assisted reproductive technology Sl. 3.28- EBV - Epstein – Barr virus

@ena bris vaginalni, vaginalna-pH hlamidije-do amplifikacije gena razmaz iz grli}a materice rubeola-HAH, po potr. Rubeola-IgG

Muškarac spermogram sa spermokulturom Hlamidije

Vari~ela-antitela HBs-Ag, po potr. anti-HBsscreening

HBs-Ag, po potr. anti -HBs screening

anti-HVC

anti-HVC

anti-HIV

anti-HIV

VZV - Varicella zoster virus Herpes zoster je akutno unilateralna ili segmentalna inflamacija korena dorzalnih ganglija koja je uzrokovana infekcijom herpes virusom. Ukoliko se infekcija ne pro{iri na centralni nervni sistem oporavak pacijenta je potpun. Smatra se da herpes zoster nastaje reaktivacijom varicella virusa koji leì u cerebralnim ganglijama, ili ganglijama korena posteriornih nerava nakon infekcije. Virus se multiplicira u ganglijama uni{tavaju}i nerv i pruàju}i se niz senzitivne nerve do koè, ukoliko nema efektivnih antitela preostalih nakon primarne infekcije.


110

tivnu medicinu, jer oni pri infekcijama u trudno}i dovode do fetalnih oboljenja i za njih ne postoji profilaksa vakcinacijom.

Sl. 3.29- VZV - Varicella zoster virus

Za{titne vakcinacije su najdelotvorniji i najsigurniji instrument za smanjenje materno-fetalnih opasnosti od infekcije odre|enim virusima. U pripremi postupka asistirane reprodukcije u posebnoj meri se obra}a pa`nja na kompletiranje za{tite vakcinacijom prema starosnom dobu. U okviru prekoncepcijskog savetovanja treba da bude proveren status vakcinacije protiv vari~ela. U datim okolnostima se razja{njava poloàj imuniteta kroz kontrolu antitela, a seronegativne ène se vakcini{u protiv vari~ela.

HCMV Human cytomegalo virus Infekcija ovim virusom prenosi se humanim kontaktom i smatra se da 4 od 5% ljudi preko 35 godina je u toku ìvota imalo kontakt sa ovim virusom. U ve}ini slu~ajeva oboljenje je blago ili ponekad asimptomatsko. HCMV - human cytomegalo virus infekcija u toku trudno}e moè biti opasna po fetus i moè da dovede do o{te}enja mozga, raznih o{te}enja i oboljenja ploda kao i mrtvoro|enosti. HCMV - human cytomegalo virus se identifikuje u krvi, mleku, cervikalnoj i vaginalnoj sekreciji, fecesu, urinu i spermi. Virusi kao HCMV - human cytomegalo virus su va`ni u aku{erstvu i perinatalnoj medicini, a nisu relevantni za reproduk-

Sl. 3.30- HCMV - human cytomegalo virus

Rubeolla Sve pacijentkinje u programu ART – assisted reproductive technology bi trebalo da budu vakcinisane protiv rubeole i da pokazuju dovoljan titar na antitela od 1:32 u testu HAH - hemoaglutinacije. Kod grani~nih titara ovog testa od 1:8 do 1:16 stanje imuniteta se razja{njava odre|ivanjem IgG rubeole pomo}u HIG – hemolysis in gel testa ili ELISA - enzyme linked immunosorbent assay testa. Kod titara antitela ispod 1:8 sprovodi se MMR – measles, mumps, rubella vakcinacija sa kontrolom uspeha vakcinisanja posle 4 do 6 nedelja.

Sl. 3.31- Virus rubeole

III Deo: Sterilitet

Radi spre~avanja embrionalnih infekcija vakcinom trebalo bi da pro|e najmanje tri meseca izme|u davanja ìve vakcine i po~etka le~enja nekom od metoda asistirane reprodukcije. Prilikom davanja mrtvih inokulisanih materija nije potreban period ~ekanja izme|u davanja vakcine i po~etka le~enja.

HPV Human papilloma virus Postoji preko sto tipova humanog papiloma virusa. HPV- human papilloma virus infekcija moè da se javi na bilo kom delu tela. Vi{e od trideset tipova HPV - human papilloma virusa izaziva infekciju genitalnog trakta.

Sl. 3.32- HPV - human papilloma virus

Infekcije mogu da se jave u klini~koj, subklini~koj ili latentnoj formi. Klini~ka forma infekcije HPV - human papilloma virus-om su genitalne bradavice. Subklini~ka infekcija nije vidljiva golim okom, ali moè da bude prepoznata kolposkopskim pregledom cerviksa, vagine, vulve ili penisa. Tako|e, moè da se dijagnostikuje citolo{ki Papa testom, ili histolo{ki biopsijom. Latentna forma infekcije moè da se dijagnostikuje kori{}enjem molekularnih tehnika.

111

Faktori koji odre|uju u kojoj formi }e se infekcija javiti, jo{ uvek nisu jasni, ali je imuni mehanizam sigurno od velikog zna~aja. Vidljive anogenitalne bradavice izazvane HPV - human papilloma virus-om su tipa 6 i 11 i mogu se na}i na vulvi, cerviksu, vagini skrotumu ili anusu. Tipovi HPV - human papilloma virus 6 i 11 imaju nizak onkogeni potencijal i retko su povezani sa skvamoznim invazivnim karcinomom genitalnog trakta. Drugi anogenitalni tipovi HPV - human papilloma virus 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41-45 povezani su sa intraepitelnim neoplazijama i karcinomom skvamoznih }elija. Pretpostavlja se da je najmanje 80% odraslih seksualno aktivnih osoba u toku ìvota bilo inficirano sa jednim, ili vi{e tipova HPV - human papilloma virus. Oko 1% ima vidljivu infekciju, a oko 15% odraslih ima subklini~ku ili latentnu infekciju. Najve}i procenat HPV - human papilloma virus infekcija dijagnostikuje se kod odraslih ìvotne dobi izme|u 18 -28 godina. Posebno treba ista}i da HPV - human papilloma virus infekcije ~esto bivaju eliminisane spontano reakcijom imunog sistema i da jednom savladana HPV - human papilloma virus infekcija ostavlja imunitet na isti tip HPV- human papilloma virusa, ali ne i na eventualne budu}e infekcije drugim tipovima HPV - human papilloma virus. Infekcija se prenosi direktnim kontaktom, ali ne i putem krvi, ili telesnih te~nosti, kao {to je semena te~nost. Vertikalno preno{enje, auto ili heteroinokulacija se javljaju retko. Mesto infekcije su, pre svega, mukozne membrane i okolna koà genitalija. Latentni period varira. Obi~no se simptomi jave nakon tri do {est meseci od infekcije, ali je opisan i latentni period od vi{e meseci.

112


Treba posebno ista}i da }e se samo kod jednog broja èna koje su bile izloène infekciji nekog od tipova HPV - human papilloma virus-a razviti neoplazija na epitelu genitalnog trakta. HPV - human papilloma virus infekcija je samo jedan od multiplih faktora koji vode pojavi kancera i malo je verovatno da je izolovano ova infekcija dovoljna za izazivanje maligne transformacije epitela anogenitalnog trakta. Udruèni sa jo{ uvek nedovoljno poznatim faktorima infekcija HPV - human papilloma virus tipovima 16,18,31 i 45 su izraèno povezani sa anogenitalnim intraepitelijalnim displazijama i karcinomom skvamoznih }elija. HPV - human papilloma virus 16 je povezan sa dijagnostikovanjem cervikalnog i vulvarnog kancera, dok je tip 18 povezan sa dijagnostikovanjem adenokarcinoma cerviksa. Najve}i broj kancera skvamoznih }elija cerviksa prolazi prethodno kroz seriju takozvanih preinvazivnih mikroskopskih abnormalnosti. Savremena dijagnostika je pokazala prisustvo HPV - human papilloma virus-a DNK - deoksiribonukleinske kiseline u 100% biopsijskog materijala u slu~ajevima kancera. HPV - human papilloma virus je tako|e dokazan u 50 - 90% slu~ajeva vaginalnih kancera ili kancera penisa kao i kancera vulve kod mla|ih èna. Posebno treba ista}i porast incidence VIN - vulvarnih intraepitelnih neoplazija. Zna~aj ranog dijagnostikovanja ovih promena je od izuzetne va`nosti s obzirom da je vreme od dijagnostikovanja VIN - vulvarnih intraepitelnih neoplazija III do pojave invazivne neoplazije manje od 8 godina. Iz ovih podataka jasno je da u slu~ajevima pozitivnog nalaza human papilloma

virus- a pre po~etka primene neke od metoda ATR – assisted reproductive technology, treba sanirati infekciju i tek nakon ponovljene negativne kontrole u}i u program.

1.4. GOJAZNOST, POREME]AJI ISHRANE I STERILITET Gojaznost se dovodi u vezu sa ~itavim nizom metaboli~kih poreme}aja i ima reproduktivne posledice koje su sloène i jo{ uvek ne do kraja ispitane. Pojava gojaznosti nastavlja da eskalira {irom sveta, jer pogre{no regulisana energetska homeostaza poti~e od smanjenja fizi~ke aktivnosti, pove}ane dostupnosti i prevelikog uìvanja u energetski bogatoj hrani u kombinaciji sa genetskim faktorima.

Sl. 3.33- Masno tkivo

Mehanizmi koji kontroli{u energetski metabolizam i masu telesnog masnog tkiva su nerazdvojno povezani sa onima koji upravljaju plodno{}u i koji imaju korene u evolucionom nagonu za preìvljavanjem u trenucima sa ograni~enim izvorima hrane. Pove}ana pojava gojaznosti i metaboli~kih poreme}aja koji su povezani sa gojazno{}u, zna~e gubitak kontrole u ovom homeostatskom sistemu koji direktno uti~e na reprodukciju.

III Deo: Sterilitet

Poreme}aj metabolizma, kao {to je razvoj insulinske rezistentnosti, rezultuju iz sve ~e{}e pojave gojaznosti i imaju ozbiljan uticaj na porast zdravstvenih problema kao {to su dijabetes tip 2, kardiovaskularna oboljenja, dislipidemija i hipertenzija. Zna~ajan deo neplodne i subfertilne populacije je gojazno, ili ima vi{ak telesne teìne uz obilje reproduktivnih komplikacija, uklju~uju}i menstrualnu disfunkciju, anovulaciju i spontani poba~aj. Razvoj gojaznosti i insulinske rezistencije ~esto idu zajedno sa razvojem problema infertiliteta. Adipozno tkivo funkcioni{e kao visoko specijalizovan endokrini i parakrini organ koji proizvodi niz adipokina i izaziva }elijski posredovane efekte preko proinflamatornih i antiinflamatornih }elija. Takvi faktori imaju lokalno i sistemsko biolo{ko dejstvo i uti~u na insulinsku osetljivost i razvoj bolesti kao {to je ateroskleroza. Adipokini i ènska plodnost su u sloènoj interakciji sa energetskim metabolizmom na nivou hipotalamusa, pituitarne `lezde i perifernih tkiva, uklju~uju}i gonade, skeletne mi{i}e i adipozno tkivo. Mehanizmi koji doprinose pogor{anom fiziolo{kom uticaju insulina, koji obi~no idu uz gojaznost, mogu se manifestovati periferno u mi{i}ima, u adipoznom tkivu, ili u jetri. Metaboli~ke posledice sa razvojem insulinske rezistencije, uklju~uju pove}anje cirkulacije slobodnih masnih kiselina putem povi{ene lipoze i triglicerida u adipoznom tkivu i lipoproteina bogatih trigliceridima u ostalim tkivima. Isto tako, dolazi do smanjene potro{nje glukoze u mi{i}ima i adipoznom tkivu, zatim prevelikoj proizvodnji glukoze u jetri i insulina u b }elijama pankreasa. Stanje gojaznosti se karakteri{e osobinama hroni~ne inflamacije, naro~ito povi{enim nivoima citokina i inflamatornih

113

markera kao {to je C-reaktivni protein. Razni inflamatorni citokini, kao {to je interleukin 6 IL6 - interleukin i faktor-a nekroze tumora, TNFa - tumor necrosis factor a i nuklearni receptori, uklju~uju}i PPARg - peroksizom proliferatorno aktivirani receptor g, u~estvuju u etiologiji insulinske rezistencije koja se dovodi u vezu sa gojazno{}u. Veliku ulogu igraju i adipokini, leptin, rezistin i adiponektin u gojaznosti i insulinskoj rezistenciji. Postoje dokazi koji podupiru vezu izme|u insulina i plodnosti. Rezistin i adiponektin moduli{u homeostazu glukoze i masti, uti~u}i na delovanje insulina. Pove}ana produkcija i lu~enje leptina je u korelaciji sa koli~inom masnog tkiva. Leptin smanjuje uzimanje hrane i odràva energetsku homeostazu, ali kod gojaznosti razvoj rezistentnosti na leptin rezultuje disfunkcionalnim energetskim stanjem. Gojazne osobe imaju povi{ene nivoe rezistina u serumu, ali su adipozni nivoi mRNK - messenger ribonucleic acid rezistina generalno niì, ili nepromenjeni kod ovih modela, {to se moè objasniti izmenjenim translacionim ili posttranslacionim modifikacijama proteina rezistina, ili izmenjenim metaboli~kim uklanjanjem rezistina. Gojazni ljudi i oni sa ve}im indeksom telesne mase BMI - body mass index, imaju ve}e serumske i adipozne nivoe ekspresije rezistina. Na{e razumevanje biolo{kog zna~aja i funkcija leptina i rezistina je jo{ uvek u za~etku. Potencijalne interakcije izme|u adipokina i energetske homeostaze se obja{njavaju time da pro{ireno adipozno tkivo kod gojaznosti uti~e na pove}anje produkcije leptina i rezistina i na smanjenje produkcije adiponektina. Interakcije izme|u ovih adipokina i adipoznog tkiva, skeletnih mi{i}a, jetre i pankreasa mogu


114

imati direktno i indirektno dejstvo na energetsku homeostazu.

Leptin Leptin se uglavnom proizvodi u adipoznom tkivu kao signal zasi}enosti u regulisanju uzimanja hrane i tro{enja energije. Leptin, hormon zasi}enja, se vezuje za duga~ki oblik leptinskog receptora Ob-Rb u hipotalamusu u cilju smanjenja NPY - neuropeptida Y i pove}anja POMC pro opiomelanokortina i neuronske aktivnosti kokainsko-amfetaminskog proteina, CARP - cocaine amphetamine related proteine, efektivno smanjuju}i apetit i uzimanje hrane. Smatra se da nedostaci u signaliziranju leptinom i funkcionisanja u hipotalamusu doprinose razvoju gojaznosti.

Sl. 3.34- Leptin u tkivu

Veza izme|u insulinske rezistencije i plodnosti je opisana kod mi{eva sa nedostatkom leptina. Oni ispoljavaju ozbiljnu insulinsku rezistenciju i umanjenu plodnost. Leptin ima ulogu u metabolizmu masti u perifernim tkivima uz ograni~eni direktan uticaj na metabolizam glukoze. On deluje nasuprot insulinu i smanjuje njegovu produkciju u b }elijama pankreasa indirektno uti~u}i na metabolizam glukoze, na transport glukoze do skeletnih mi{i}a preko hipotalamusa i centralnog nervnog sistema. Leptin pove}ava lipolizu u adipoznom tkivu i }elijama i u skeletnim mi{i}ima.

Signalizacija leptinskih receptora u perifernim tkivima uklju~uje razne transkripcione faktore, kao {to je aktivacija transdjusera signala i aktivatora transkripcije 1 STAT signal transducers and activator of transcription 1 i STAT - signal transducers and activator of transcription 3 u adipoznom tkivu i STAT 3 - signal transducers and activator of transcription i AKT – protein kinase B (PKB) u skeletnim mi{i}ima. Pove}anje oksidacije masnih kiselina, putem leptina, u skeletnim mi{i}ima je pripisano aktivaciji }elijske signalne putanje proteinske kinaze osetljive na hranljive sastojke i aktivirane sa AMP - adenosine monophosphate-om.

Adiponectin Adiponektin, prvobitno nazvan ACRP 30 – adiponektin-adipocyte complement related protein of 30kDa, AMP - adenosine monophosphate 1 i gbp 28 je prvi put opisan kod kultivisanih murinskih adipocita 3T3L1 pre desetak godina. Proizvodi se u velikim koli~inama u adipoznom tkivu. Adiponektinski gen se nalazi na hromozomu 3q27 u regiji koja je nedavno mapirana kao locus suscebtibilnosti za tip 2 dijabetesa i adipoznosti. Smatra se da povezuje gojaznost sa insulinskom rezistencijom. Receptori adiponektina, adipo R1 i adipo R2, su nedavno otkriveni kod mi{eva, dok je identifikovan i tre}i receptor, T– cadherin. Adiponektin funkcioni{e kao agens, osetljiv na insulin, putem smanjivanja produkcije glukoze i pobolj{avanjem delovanja insulina u jetri. Osim toga, adiponektin smanjuje aktivnost glukoneogenih enzima fosfoenolpiruvat karboksikinaze PEPCK – phosphenolpyruvate carboxykinase, gluko ze-6 fosfataze i smanjuje oksidaciju masnih kiselina u jetri. Direktno dejstvo na produk-

115

III Deo: Sterilitet

ciju insulina tek treba utvrditi. Adiponektin pove}ava oksidaciju masnih kiselina u jetri, putem smanjenja ekspresije CD36 cyclodextrin i smanjuje dotok masnih kiselina i triglicerida jetre. Smanjenje akumuliranja triglicerida u skeletnim mi{i}ima uklju~uje pove}ano izbacivanje proteina koji transportuju lipide CD36 - cyclodextrin, pove}anu oksidaciju acyl-CoA oksidaze i pove}anje energije rasparuju}i protein 2, UCP2 – uncoupling protein. Iako nije potpuno definisana, postreceptorska signalizacija, u koju su uklju~eni AMPK – activated protein kinase i acetil-CoA karboksilaza ACC – aminocyclopropane 1 carboxylic acid, p38 mitogenaktiviraju}a proteinska kinaza AMPK activated protein kinase i PPARα - peroksizom proliferatorno aktivirani receptor je opisana kod skeletnih mi{i}a, jetre i adipocita i smatra se da reguli{e metabolizam glukoze i lipida. Transgenski mi{ji model kod koga se generi{e dvostruko ili trostruko vi{e cirkuli{u}eg adiponektina je pobolj{ao hepatsku osetljivost na insulin, mada studije koje koriste adiponetske nok-out modele tek treba da pokaù jasnu vezu sa homeostazom glukoze kod raznih kontrolnih i dijetskih tretmana.

Rezistin Otkri}e rezistina poznatog kao FIZ3 – found inflammatory zone 3 i kao adipocitnog specifi~nog sekretornog faktora ADSF – adipocyte specific secretory factor je bilo zajedni~ko kod tri odvojene grupe. S obzirom na po~etna o~ekivanja da }e rezistin biti veza izme|u gojaznosti i dijabetesa, otkri}e niske me|uvrsne sekventne homologije tj. razli~itih hromozomnih lokacija gena kod razli~itih vrsta i razli~itih mesta sinteze je rezultovalo konfuzijom o ulozi rezistina u razvoju gojaznosti i insulinske rezistencije.

Sl. 3.35- Rezistin

Ekspresija rezistinske mRNK - messenger ribonucleic acid je kod humanih adipocita niska. Iako proliferacija uzgajanih ljudskih adipocita, koja je izmenjena rezistinom, nije uticala na tro{enje glukoze, ili na fosforilaciju AKT - protein kinase B (PKB), pove}ava se verovatno}a da kod ljudi rezistin ne u~estvuje direktno u homeostazi glukoze u adipocitima. Rezistin se izbacuje kod makrofaga i monocita {to nagove{tava da moè da uti~e na insulinsku rezistenciju putem dejstva na inflamaciju. Prema tome, direktna uloga rezistina kod gojaznosti i u kori{}enju glukoze nije sasvim potvr|ena, jer se kod ~oveka moè povezati sa funkcionisanjem adipoznog tkiva, a ne sa insulinskom rezistencijom.

Adipokini i plodnost Dokazi koji podupiru vezu izme|u adipokina, izlu~enih iz adipoznog tkiva, i ènske plodnosti se mogu razmatrati na ~etiri nivoa; - centralno dejstvo na hipotalamus i pituitarnu `lezdu; - periferni uticaj na jajnike i reproduktivni trakt; - direktno dejstvo na oocite i embrion; - uticaj tokom trudno}e.


116

Sl. 3.36- Potencijalne interakcije izme|u adipokina i ènskog reproduktivnog trakta

Pro{ireno adipozno tkivo izaziva pove}anje produkcije leptina i rezistina i smanjenje produkcije adiponektina. Potencijalne interakcije izme|u ovih adiponektina i hipotalamusa, pituitarne `lezde, jajnika, oocita, embriona i ènskog reproduktivnog trakta, mogu imati direktne i indirektne uticaje na ènsku reprodukciju.

Centralno dejstvo adipokina na hipotalamus i pituitarnu `lezdu Tokom puberteta su nivoi leptina povi{eni i u pozitivnoj korelaciji sa dobom prve menstruacije kod èna. Iako postoje neki izuzeci, generalno se pretpostavlja da povi{eni leptin, do nivoa praga, dozvoljava aktivaciju hipotalamus – pituitarne ose i po~etak puberteta. Sli~no serumskim nivoima leptina, ekspresija rezistina u adipoznom tkivu i pituitarnoj `lezdi se pove}ava u periodu prepuberteta. Serumski nivoi opadaju kod de~aka i devoj~ica tokom celog puberteta. îni se da su mehanizmi, koji su odgovorni

za pove}anje, zajedni~ki za oba pola. Prema tome, postoji delovanje adipokina na centralnom nivou hipotalamusa i pituitarne `lezde u regulisanju pubertetskog razvoja i cikli~ne ènske plodnosti. Centralna uloga leptina u plodnosti je da uti~e na lu~enje GnRH - gonadotropin releasing hormon-a iz hipotalamusa i na lu~enja LH - luteinizing hormone-a i FSH follicle stimulating hormone-a iz pituitarne `lezde. Dostupnost hranljivih supstanci uti~e na ovo centralno dejstvo, dok uzdràvanje od hrane izaziva smanjenje nivoa leptina i LH - luteinizing hormona. Eksperimenti sprovedeni in vitro kada se koristilo tkivo od dobro hranjenih glodara i svinja pokazali su da je leptin stimulisao osloba|anje GnRH - gonadotropin releasing hormona iz }elija hipotalamusa, kao i osloba|anje LH - luteinizing hormona i FSH - follicle stimulating hormona iz adenohipofizalnih }elija, {to nagove{tava da su hipotalamus i pituitarna `lezda centralna mesta delovanja leptina.

117

III Deo: Sterilitet

Centralna uloga leptina i interakcije me|u vrstama i nutricioni status tek treba da budu dalje ispitani, ali nagove{tavaju mogu} razvoj centralne leptinske rezistencije kada je energetski balans pozitivan, ili neutralan. Bilo kakva predikcija centralne uloge adiponektina, ili rezistina u interakciji sa GnRH - gonadotropin releasing hormonom i produkcijom gonadotropina kao i u regulisanju energetskog metabolizma je za sada preuranjena. Eksperimentalne studije koje su koristile uzgajane neurone hipotalamusa nisu pokazale stimulativni uticaj adiponektina na produkciju raznih neuro-transmitera koji u~estvuju u centralnom energetskom metabolizmu. Ekspresija rezistinske mRNK messenger ribonucleic acid je bila lokalizovana na pituitarnu `lezdu i hipotalamus, ali nije bilo ekspresije adiponektina iz ovih tkiva. Nivoi ekspresije rezistina su bili niski kod pituitarnih `lezda mi{eva pri ro|enju i pove}avali su se do najve}e vrednosti u pubertetu {to je suprotno od dosledne ekspresije iz }elija hipotalamusa tokom ~itavog razvoja. Promene u ekspresiji pituitarne `lezde, u vreme puberteta, zahteva signale iz hipotalamusa {to je bilo demonstrirano odsustvom ekspresije rezistina kod prepubertalnih mi{eva sa uklonjenim }elijama hipotalamusa. Osim toga, smanjenje pituitarnih nivoa rezistina kod gojaznih mi{eva, u pore|enju sa kontrolnim mi{evima, daju teìnu vezi izme|u rezistina i centralne kontrole hranjenja i gojaznosti. Iako izve{taj o mu{kim glodarima nagove{tava da je ekspresija rezistina u testisu regulisana pituitarnim hormonima LH - luteinizing hormone-a i FSH - follicle stimulating hormone-a, sli~ne studije ènskog reproduktivnog tkiva tek treba da budu dokumentovane. Dalje istraìvanje uloge rezistina u centralnom

energetskom metabolizmu i produkciji gonadotropina }e nesumnjivo pruìti uvid u njegovu funkciju u dostizanju puberteta i u regulaciji ènske plodnosti. Centralna ekspresija adiponektina i njegovih receptora u hipotalamusu i pituitarnoj `lezdi tek treba da bude ispitana. Kao {to je re~eno, adiponektin funkcioni{e u perifernim tkivima preko AMPK activated protein kinase. Leptin, tako|e, funkcioni{e preko ovog puta i u hipotalamusu inhibira AMPK - activated protein kinase aktivaciju izazivaju}i smanjenje uzimanja hrane. Nasuprot ovom centralnom delovanju, leptin stimuli{e AMPK - activated protein kinase aktivaciju u skeletnim mi{i}ima, a ovu stimulaciju odraàva i adiponektin u raznim perifernim tkivima. Po{to oba adiponektina funkcioni{u u cilju stimulisanja AMPK - activated protein kinase u perifernim tkivima, razumljivo je da adiponektin uti~e centralno na kori{}enje energije preko istog AMPK activated protein kinase mehanizma kao i leptin u hipotalamusu. Uzrok neplodnosti kod gojaznosti je u vezi sa smanjenom ekspresijom leptinskog receptora i povi{enim nivoima neuropeptida-Y u hipotalamusu, odnosno smanjene centralne leptinske osetljivosti i smanjene GnRH - gonadotropin releasing hormon pulsativnosti.

Periferni uticaj adipokina na jajnike i reproduktivni trakt Smanjen stepen ovulacije u in vivo eksperimentima u kojima je leptin dat zdravim mi{evima i in vitro studije uzgajanja ~itavih jajnika koji su perfuzirani leptinom, ukazuju na direktnu ulogu leptina u procesu ovulacije koja je nezavisna od bilo kakve promene u produkciji steroida. Nedavni izve{taji ukazuju na dejstvo

118


leptina na ovulaciju koja je nezavisna od GnRH - gonadotropin releasing hormona i LH - luteinizing hormona i od lokalne funkcije u jajniku kao {to je indukcija ADAMTS 1- a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1, mada se ne mogu isklju~iti i neke druge putanje delovanja hipotalamusa. Podaci koji se ti~u serumskih i lokalnih nivoa adiponektina u ovarijumu, u odnosu na anovulatorni poreme}aj kod sindroma policisti~nih jajnika, nisu ba{ uvek jasni. Ovo ostaje zna~ajno polje za budu}e istraìvanje. Steroidni hormoni rastvorljivi u mastima se proizvode steroidogenezom }elija jajnika, a adipokini koji poti~u od adipocita mogu imati lokalizovanu funkciju u ovom procesu. Ekspresija leptinske mRNK - messenger ribonucleic acid i proteina u granuloznim i teka }elijama, podupire ovu mogu}nost. Leptin uti~e na steroidogenezu u izolovanim }elijama ovarijuma modulisanjem metaboli~kog delovanja insulina i IGF-1 - insulin like growth factor i stimulatornog delovanja gonadotropina kod ljudi. Nivoi leptina u krvi su u bliskoj korelaciji sa nivoima progesterona tokom ~itavog menstrualnog ciklusa kao i sa estradiolom i HCG - human chorionic gonadotropin-a tokom trudno}e. Uloga adiponektina u ovarijalnoj steroidogenezi je verovatna s obzirom na negativne uticaje testosterona na cirkulaciju adiponektina. Takvu interakciju je pokazao rezistin koji ima stimulativni uticaj na produkciju testosterona od strane uzgajanih theca }elija koje deluju zajedno sa insulinom. Rezistin je, u zavisnosti od doze, pove}ao produkciju testosterona u uzgajanom testisu mi{a a adrenalni androgen dehidroepiandrosteron DHEA - dehydroepiandrosterone je smanjio mRNK -

messenger ribonucleic acid ekspresiju rezistina u adipoznom tkivu uzetom od mi{a. Leptin i njegovi receptori mRNK - messenger ribonucleic acid i protein se ekspresuju u jajovodu i endometrijumu {to nagove{tava mogu}e u~estvovanje u receptivnosti endometrijuma za embrion koji se razvija.

Direktno dejstvo adipokina na oocite i embrion Otkri}e ekspresije leptina kod zrelih oocita u kombinaciji sa post ovulatornim nivoima, pokazuju da i leptin moè uticati na sazrevanje oocita i rani razvoj embriona. Studije su pokazale ekspresiju mRNK messenger ribonucleic acid-a i proteina za leptinske receptore u oocitima i embrionima koji su bili u ranom razvoju, kao i ekspresiju leptina u blastocisti. Adiponektinski receptori R1 i R2 se slabo ekspresuju u ovarijumu. Po{to je aktivnost AMPK - activated protein kinase opisana kod oocita, istovremeno sa GVBD - germinal vesicle breakdown i indukcijom mejoze u pripremi za oplodnju, adiponektin moè biti uklju~en u regulisanje osetljivosti oocita na hranljive sastojke preko putanje AMPK - activated protein kinase. Nema jasnih dokaza o ekspresiji rezistina u jajniku, oocitu ili embrionu, pa ostaje praznina u na{em znanju o tome kako adipokini mogu regulisati upotrebu hranljivih supstanci u oocitu i embrionu.

Uticaj adipokina tokom trudno}e Trudno}a izaziva velike promene u maj~inskom metabolizmu radi obezbe|enja odgovaraju}e hranljive supstance fetusu i fiziolo{ke pripreme za laktaciju. Ispitivanje adipokina u ovim metaboli~kim promenama

119

III Deo: Sterilitet

je vaàn aspekt plodnosti koji je preispitivan, uglavnom, zbog uloge leptina. Placenta koja se razvija ekspresuje leptin i njegov receptor, a potvr|ena je i produkcija rezistina. Nivoi serumskog i placentarnog razistina se pove}avaju sa napretkom trudno}e {to je u suprotnosti sa nivoima leptina. Ovi nivoi su u uzajamnoj vezi sa stanjem smanjene insulinske osetljivosti koja se ~esto pojavljuje u kasnijim etapama trudno}e, doprinose}i uspe{nom razvoju fetusa. Adiponektin i njegovi receptori R1 i R2 su tako|e lokalizovani na placenti. Placentarna ekspresija adiponektinske mRNK messenger ribonucleic acid pove}ana je tokom trudno}e i smanjuje se kao reakcija na ograni~enja u ishrani, dok je ekspresija adipo R2 receptora smanjena tokom trudno}e, ali ostaje nepromenjena u slu~aju slabije ishrane, {to jasno govori o ulozi adipokina u odràvanju normalne trudno}e. Adipokini, leptin, adiponektin i rezistin koje proizvodi adipozno tkivo i menja se sa gojazno{}u, uti~u na energetsku homeostazu i na ènsku plodnost. Leptin menja produkciju GnRH - gonadotropin releasing hormon-a i gonadotropina i ima sloènu ulogu u funkcionisanju jajnika i endometrijuma kao i u razvoju embriona. Uticaj leptina na ènsku plodnost ima potencijalne implikacije i na ostale adipokine koji i sami sli~no funkcioni{u u regulisanju energetskog metabolizma. Rezistin u~estvuje u funkcionisanju placente i jajnika, a njegova lokalizacija u mozgu negove{tava mogu} periferni i centralni uticaj u kontroli energetskog metabolizma i plodnosti. Dana{nji dokazi ne potvr|uju sasvim centralnu ulogu adiponektina, ali nedavno utvr|ena ekspresija njegovih receptora u jajniku i signalizacija putem AMPK - acti-

vated protein kinase putanje za detektovanje hranljivih supstanci u drugim perifernim tkivima, pokazuje budu}e na~ine za ispitivanje adiponektina.

1.5. PCO - POLICISTI^NI OVARIJUMI I PCOS - POLYCYSTIC OVARIAN SYNDROME Policisti~ni jajnici se prezentuju u dve forme: a) Klasi~ni PCOS - polycystic ovarian syndrome, Stein Leventhal Syndrom sa: - pove}anjem telesne teìne, - hirzutizmom sa pove}anim nivoom mu{kog polnog hormona testosterona, - iregularnom menstruacijom, - odsustvom ovulacije i sterilitetom, - ovarijumima sa brojnim malim cistama, - insulin resistencijom i ve}im rizikom pojave dijabetesa.

Sl. 3.37- Ultrazvu~ni izgled ovarijuma kod PCOS - polycystic ovarian syndrome

b) Neklasi~ni PCO - polycystic ovarian ili PCO - polycystic ovarian varijante Ovo stanje se mnogo ~e{}e javlja nego klasi~na forma obolenja. Pacijenti imaju samo neku od opisanih manifestacija, ali ne sve.


120

Pacijenti sa PCO - polycystic ovarian imaju poreme}aj nekoliko hormonskih sistema koji vode do abnormalne ovulacije, hirzutizma i insulin resistencije.

Dijagnosti~ki kriterijumi Osnove dijagnosti~kih kriterijuma su prvi put postavljene 1990. godine i nekoliko puta dopunjene. Tabela 3-3: Dijagnosti~ki kriterijumi sindroma policisti~nih jajnika

Kriterijumi iz 1990. godine (1 i 2) 1. 2.

1. 2.

3.

Hroni~na anovulacija Klini~ki i/ili biohemijski znaci hiperandrogenizma i isklju~enje ostalih etiologija Revidirani kriterijumi iz 2003. godine (2 od 3) Oligo ili anovulacija Klini~ki i/ili biohemijski znaci hiperandrogenizma Policisti~ni jajnici i isklju~enje ostalih etiologija, kongenitalna adrenalna hiperplazija, tumori koji lu~e androgen, Kušingov sindrom

Gore navedeni dijagnosti~ki kriterijumi nisu pogodni za ispitivanja koja se fokusiraju samo na klini~ke ishode kod èna sa sindromom policisti~nih jajnika. Ispitivanja koja se fokusiraju na trudno}u kao ishod, mogu vi{e da naglase anovulaciju kao simptom identifikacije umesto prisustva policisti~nih jajnika, ili klini~kog hiperandrogenizma. Sli~no tome, ispitivanja u slu~ajevima hirsutizma mogu manje da naglase osnovnu ovulatornu funkciju. @ene sa hroni~nom anovulacijom i hiperandrogenizmom i/ili policisti~nim

jajnicima izloène su zna~ajno ve}em riziku od insulinske rezistencije od onih sa hiperandrogenizmom i redovnim ciklusima. U skladu sa tim, veoma je va`no da studije metaboli~kih osobina sindroma policisti~nih jajnika defini{u ène u skladu sa ovulatornom funkcijom, na primer, hroni~na oligo/amenorea naspram redovnih ciklusa. Genetske studije su va`ne za razumevanje spektra fenotipa i za identifikovanje susceptibilnih gena sa sindromom policisti~nih jajnika. U studijama se mogu koristiti uì dijagnosti~ki kriterijumi radi identifikacije pogo|enih pojedinaca, kao {to je samo prisustvo policisti~nih jajnika, ili hiperandrogenizam per se. Kruta definicija sindroma policisti~nih jajnika zasnovana na dana{njim ili nekada{njim dijagnosti~kim kriterijumima moè sputavati na{e razumevanje ovog heterogenog poreme}aja.

Isklju~enje sli~nih poreme}aja Da bi se uspostavila dijagnoza sindroma policisti~nih jajnika, va`no je isklju~iti ostale poreme}aje sa sli~nom klini~kom slikom, kao {to su kongenitalna adrenalna hiperplazija, Ku{ingov sindrom i tumori koji lu~e androgen. Isklju~enje 21 hidroksilazne deficijentne neklasi~ne adrenalne hiperplazije se moè utvrditi odre|ivanjem nivoa bazalnog jutarnjeg 17-hidroksiprogesterona. Grani~ne vrednosti su 2-3 ng/ml. Pregled hiperandrogeni~nih pacijenata na neklasi~nu adrenalnu hiperplaziju treba da uzme u obzir i preovla|ivanje ovog autozomnog recesivnog poreme}aja u populaciji koja se studira. Rutinsko isklju~enje tiroidne disfunkcije kod pacijenata koji su se smatrali hiperandrogeni~nim ima ograni~enu vrednost po{to pojavljivanje ovog poreme}aja

121

III Deo: Sterilitet

kod pacijenata nije ~e{}e od pojavljivanja kod normalnih èna u reproduktivnom dobu. Pregled èna koje ispoljavaju oligo ili anovulaciju uklju~uje i procenu FSH - follicle stimulating hormone seruma i nivoe E2 - estradiola da bi se isklju~io hipogonadotropni hipogonadizam, tj. centralno poreklo ovarijske disfunkcije, ili prerana insuficijencija ovarijuma koja se karakteri{e niskim E2 - estradiolom i visokim FSH - follicle stimulating hormone koncentracijama, u skladu sa klasifikacijom. Sindrom policisti~nih jajnika je deo spektra normogonadotropno normoestrogenske anovulacije. Treba naglasiti da su koncentracije LH - luteinizing hormona ~esto povi{ene kod ovih pacijenata, o ~emu }e kasnije biti re~i. Rutinsko merenje PRL - prolaktina u procenjivanju hiperandrogenih pacijenata se obavlja zbog isklju~enja hiperprolaktinemije uz napomenu da kod mnogih hiperandrogenih pacijenata nivoi PRL prolaktina mogu biti na gornjoj granici normale ili neznatno iznad nje. Treba isklju~iti insulinsku rezistenciju koja se javlja i kod sindroma hiperandrogenske insulinsko rezistentne acanthosis nigricans, Ku{ingov-og sindroma i androgenske sekretne neoplazme.

Hiperandrogenizmi Klini~ko odre|ivanje fenotipa sindroma policisti~nih jajnika uklju~uje utvr|ivanje prisustva klini~kog i/ili biohemijskog vi{ka androgena, hiperandrogenizma uz istovremeno isklju~ivanje poreme}aja koji se sa njima povezuju.

Klini~ki hiperandrogenizam Primarni klini~ki indikator vi{ka androgena je prisustvo hirsutizma.

Potrebno je naglasiti da jo{ uvek nedostaju normativni podaci velikih populacija, da je procena hirsutizma relativno subjektivna, da mali broj lekara u klini~koj praksi koristi standardizovane metode procenjivanja i da se hirsutizam ~esto le~i mnogo pre nego {to se pacijent endokrinolo{ki ispita. Hirsutizam moè biti zna~ajno manje ra{iren kod hiperandrogenih èna koje poti~u iz isto~ne Azije, kao i kod adolescenata. Za samo prisustvo akni se smatralo da je potencijalni marker hiperandrogenizma, mada su rezultati studija po pitanju ta~ne ra{irenosti vi{ka androgena kod ovih pacijenata razli~iti. Samo prisustvo androgene alopecije kao indikatora hiperandrogenizma je daleko manje prou~avano. Izgleda da je ona relativno lo{ pokazatelj vi{ka androgena osim, ako je prisutna kod oligoovulatornog pacijenta. Ukupno posmatrano, klini~ki dokazi hiperandrogenizma su va`na osobina pacijenata sa sindromom policisti~nih jajnika i pored gore pomenutih ograni~enja.

Biohemijski hiperandrogenizam Ve}ina pacijenata sa sindromom policisti~nih jajnika ima dokaze o hiperandrogenemiji i najnovija zapaànja pokazuju da cirkulatorni nivoi androgena, tako|e, mogu da predstavljaju nasle|eni faktor vi{ka androgena. Deo pacijenata sa sindromom policisti~nih jajnika ne mora da prikazuje abnormalnost cirkulatornih androgena. Definisanje vi{ka androgena merenjem serumskog androgena su ~esto neprecizna zbog promenljivosti laboratorijskih metoda merenja, jer postoji vi{e androgena koji se ne mogu uzimati u obzir. Tako|e, postoji

122


{iroka varijabilnost u populaciji, normativni kriterijumi nisu precizno utvr|eni, nisu uzimani u obzir starost i indeks telesne mase i postoji malo normativnih podataka o adolescentima, kao i o starijim ènama. Koncentracija androgena se smanjuje brè hormonalnom supresijom i moè ostati suprimirana ~ak i nakon prestanka hormonskog tretmana. I pored ovih ograni~enja, smatra se da su merenja slobodnog testosterona, ili indeksa slobodnog T, slobodni androgen, osetljivije metode procene hiperandrogenemije. Preporu~ene metode za procenu slobodnog androgena uklju~uju ravnote`nu dijalizu, prora~un slobodnog T-testosterona iz merenja polno vezuju}eg globulina i ukupnog T - testosterona, ili taloènje amonijum sulfata. Utisak uniformnosti trenutno dostupnih direktnih testova slobodnog T-testosterona ima ograni~enu vrednost, naro~ito u proceni hiperandrogene ène. Napomenuto je da samo merenje ukupnog T - testosterona ne moè biti osetljiv marker vi{ka androgena. Mali deo pacijenata sa sindromom policisti~nih jajnika mogu imati izolovano povi{enje nivoa DHEAS - dehydroepiandrosterone sulfate. Neki su smatrali da je merenje ukupnog T - testosterona i DHEAS- dehydroepiandrosterone sulfate imalo neku vrednost u detekciji pacijenta sa tumorom koji lu~i androgen, mada noviji podaci pokazuju da je najbolji prediktor ovih neoplazmi klini~ka prezentacija. Kona~no, na raspolaganju je malo podataka o vrednosti rutinskog merenja androstenediona kod hiperandrogenih pacijenata, mada je napomenuto da on moè biti malo povi{en kod pacijenata sa 21hidroksilazno deficijentnom neklasi~nom adrenalnom hiperplazijom u odnosu na pacijente sa sindromom policisti~nih jajnika. Bez obzira na to, malobrojnost normativnih

i klini~kih podataka sa androstenedionom spre~ava njegovu preporuku za rutinsku procenu hiperandrogenemije.

Policisti~ni jajnici Na osnovu dosada{njih istraìvanja stav je da policisti~ni jajnici treba da se smatraju kao jedan od mogu}ih kriterijuma sindroma policisti~nih jajnika. Prema dostupnoj literaturi, kriterijumi koji imaju dovoljnu specifi~nost i osetljivost da defini{u policisti~ne jajnike su slede}i: - prisustvo 12 ili vi{e folikula pre~nika 2 - 9 mm u svakom jajniku i/ili pove}ana zapremina jajnika, preko 10 ml. Subjektivni izgled policisti~nih jajnika ne treba biti zamenjen ovom definicijom. Raspodela folikula treba biti izostavljena kao i pove}anje stromalne ehogeni~nosti i zapremine. Iako pove}ana stromalna zapremina predstavlja osobinu policisti~nih jajnika, pokazalo se da je merenje zapremine jajnika dobar surogat kvantifikaciji stromalne zapremine u klini~koj praksi. Ova definicija ne vaì za ène koje oralno uzimaju kontraceptivne pilule po{to njihova upotreba modifikuje morfologiju jajnika kod normalnih èna i èna sa policisti~nim jajnicima. Samo jedan jajnik koji odgovara ovoj definiciji je dovoljan da defini{e policisti~ne jajnike. Ako postoje dokazi o dominantnom folikulu, preko 10 mm, ili corpus luteum, skeniranje treba ponoviti tokom slede}eg ciklusa. Prisustvo abnormalne ciste ili asimetrije jajnika, {to moè da nagovesti homogenu cistu, zahteva dalje ispitivanje. @ene sa regularnom menstruacijom treba da se pregledaju u ranoj folikularnoj fazi, 3 – 5. dana ciklusa. Prora~un zapremine jajnika se obavlja pomo}u pojednostavljene formule produènog elipsoida, 0.5 x duìna x {irina x debljina.

123

III Deo: Sterilitet

Vrednost praga od 10 cm3 za OV - ovarijalni volumen odre|ena je na internacionalnom Kongresu o sindromu policisti~nih jajnika odrànom u Roterdamu 2003.godine. Bazirana je na odgovaraju}im studijama analize krive ROC - reciever operator characteristic. Pored srednjeg ovarijalnog volumena, odre|uju se i ovarijalna povr{ina OA - ovarian area i broj folikula FN - follicle number. Ultrazvu~ni pregled jajnika daje karakteristi~an nalaz koji se u svim diferencijalno dijagnosti~ko sumnjivim slu~ajevima proverava laparoskopskim pregledom.

Sl. 3.38- Laparoskopski nalaz policisti~nog ovarijuma

Broj folikula treba da se proceni u uzdu`nom i antero-posteriornom popre~nom preseku jajnika. Veli~ina folikula do 10 mm treba da bude izraèna kao srednja vrednost pre~nika merenih na dve sekcije.

Insulinska rezistencija Insulinska rezistencija se dovodi u vezu sa reproduktivnim abnormalnostima kod èna sa sindromom policisti~nih jajnika. Pobolj{anje insulinske osetljivosti kroz na~in ìvota i farmakolo{ku intervenciju moè popraviti ove abnormalnosti. Insulinska rezistencija, definisana kao smanjeno kori{}enje glukoze posredovano insulinom, se ~esto pronalazi u ve}oj popu-

laciji 10 - 25 % po obavljenim dinami~kim studijama delovanja insulina. Kriterijumi definisanja grani~ne ta~ke abnormalnosti se razlikuju. Insulinska rezistencija kod èna sa sindromom policisti~nih jajnika se javlja i do 50 %, kako kod gojaznih tako i kod negojaznih èna. Izve{taji o preovla|ivanju insulinske rezistencije kod èna sa sindromom policisti~nih jajnika variraju u zavisnosti od osetljivosti i specifi~nosti primenjenih testova i heterogenosti sindroma. Trenutno ne postoji punova`ni klini~ki test za detekciju insulinske rezistencije u op{toj populaciji. Dinami~ki invazivni testovi, kao {to je euglikemijska veza i test tolerancije glukoze su naj}e{}e dijagnosti~ke procedure. Postoji nekoliko ograni~enja za njihovu {iru klini~ku upotrebu zbog mogu}e promene funkcije beta }elija sa razvojem dijabetesa {to menja osetljivost testova, kao i normalno fiziolo{ko kolebanje nivoa insulina i nedostatak standardizovanog univerzalnog testa insulina. Isto tako, razvijeni su kriterijumi za definisanje metaboli~kog sindroma koji uklju~uju komponente koje se dovode u vezu sa sindromom insulinske rezistencije, uklju~uju}i centripetalnu gojaznost, hipertenziju, hiperglikemiju i dislipidemiju. Tabela 3-4: Kriterijumi metaboli~kog sindroma kod èna sa sindromom policisti~nih jajnika

Faktor rizika Abdominalna 1 gojaznost (obim struka)

Grani~na vrednost >88 cm

2 Trigliceridi

>150 mg/dL

3 HDL-C

<50 mg/dL

4 Krvni pritisak tolerancije 5 Test glukoze

>130/ >85 110-126 mg/dL i/ili 2-h glukoza 140-199 mg/dL

124


Neki autori su preporu~ili dodavanje ovim testovima i test tolerancije glukoze radi procene nivoa glukoze po kriterijumima „Svetske zdravstvene organizacije“. IGT - impaired glucose tolerance test je dugo bio priznat kao metoda odre|ivanja faktora rizika za dijabetes. Pored toga, IGT - impaired glucose tolerance test identifikuje i pojedince koji su izloèni riziku visokog mortaliteta, naro~ito kod èna. Me|u gojaznim ènama sa sindromom policisti~nih jajnika, preporu~uje se testiranje ovom metodom. Trenutno ima malo podataka koji bi potvrdili da markeri insulinske rezistencije mogu da predvide uspeh terapije. Prema tome, uloga ovih markera u dijagnostikovanju sindroma policisti~nih jajnika, kao i u izboru specifi~nih tretmana, nije do kraja definisana. Potrebne su dodatne studije za identifikovanje prediktivnih faktora, ili faktora pokazatelja uspeha le~enja sindroma policisti~nih jajnika.

Luteiniziraju}i hormon Apsolutni nivo cirkuli{u}eg LH luteinizing hormone-a, kao i njegova veza sa nivoima FSH - follicle stimulating hormone-a, su zna~ajno povi{eni kod èna sa sindromom policisti~nih jajnika u pore|enju sa kontrolnim ènama usled pove}ane amplitude i frekvencije osloba|anja LH - luteinizing hormona. Povi{ene koncentracije LH - luteinizing hormone-a iznad 95% od normalnog se mogu primetiti kod pribli`no 60% èna sa sindromom policisti~nih jajnika. Odnos LH - luteinizing hormona /FSH - follicle stimulating hormona moè biti povi{en kod 95% pacijenata. Na nivoe LH - luteinizing hormona moè uticati vremenska veza sa ovulacijom koja prolazno normalizuje LH - luteinizing hormone.

Potencijalno negativno dejstvo LH luteinizing hormona na ljudsku reprodukciju je veoma kontraverzno. Neki istraìva~i su tvrdili da visoki nivoi LH - luteinizing hormone-a mogu imati {tetan uticaj na zrelost oocita i oplodnju, a mogu rezultovati i manjim brojem trudno}a i ve}im brojem poba~aja. Me|utim, druge studije nisu pokazale nepovoljne uticaje LH - luteinizing hormone-a na kvalitet oocita i embriona, oplodnju, implantaciju i broj trudno}a. Smanjenje nivoa endogenog LH - luteinizing hormone-a sa GnRH - gonadotropin releasing hormon agonistima je, tako|e, dalo opre~ne rezultate, po{to su neke studije nagovestile da bi se tako mogao da smanji broj poba~aja, dok su druge dovodile u pitanje ovaj terapeutski uticaj. Na osnovu gore pomenutih podataka, smatra se da merenje nivoa seruma LH luteinizing hormona nije neophodno za klini~ku dijagnozu sindroma policisti~nih jajnika. Nivoi LH - luteinizing hormone-a mogu biti korisni kao sekundarni parametar, naro~ito kod mr{avih èna sa amenorejom, ili u istraìvanju. Potrebno je dodatno istraìvanje radi daljeg razja{njenja klini~kog zna~aja LH luteinizing hormona kod sindroma policisti~nih jajnika kao i potencijalnog uticaja supresije LH - luteinizing hormona sa GnRH - gonadotropin releasing hormon analozima.

Dugoro~ni rizici po zdravlje @ene sa sindromom policisti~nih jajnika imaju vi{estruke faktore rizika za dijabetes uklju~uju}i gojaznost, porodi~nu istoriju dijabetesa tipa 2 i abnormalnosti u dejstvu insulina (insulinska rezistencija i disfunkcija beta }elija). Postoje jasni dokazi da su ène sa sindromom policisti~nih jajnika pod pove}anim rizikom 3-7 puta za razvoj

III Deo: Sterilitet

dijabetesa tipa 2 i kardiovaskularnih bolesti. Stanja insulinske rezistencije uti~u na pove}anje incidence koronarne bolesti srca, a kod èna sa sindromom policisti~nih jajnika ima dokaza o dislipidemiji i prisustvu markera abnormalne vaskularne funkcije. U drugim studijama nisu potvr|eni direktni dokazi za pove}anje pojave koronarne sr~ane bolesti, mada je pojava mo`danog udara neznatno pove}ana. Za ène sa sindromom policisti~nih jajnika se, tako|e, misli da su pod pove}anim rizikom za dobijanje endometrijalnog karcinoma. Epidemiolo{ki dokazi koji bi potkrepili ovu pretpostavku su ograni~eni. Potrebna su dodatna istraìvanja radi procene nivoa rizika, omogu}avanja identifikacije pacijenata koji su izloèni riziku, pruànja longitudinalnog naknadnog pra}enja èna sa sindromom policisti~nih jajnika u njihovim kasnijim godinama i odre|ivanja mesta, vremena i efikasnosti intervencionih mera.

Le~enje PCO - polycystic ovaries Le~enje PCO - polycystic ovaries-a ima razli~ite forme. Regulisanje telesne teìne je ~esto oteàno zbog visokog nivoa testosterona. Regulacija menstrualnog ciklusa se postiè redovnom primenom progesterona, ili oralnih kontraceptiva sa niskim nivoom androgena. Indukcija ovulacije se postiè davanjem klomifen citrata, ili gonadotropina uz eventualnu primenu GNRH-gonadotropin releasing hormon agonista, odnosno antagonista. Obavezan je ultrazvu~ni monitoring radi spre~avanja nastanka hiperstimulacije. Dexametazon moè da se koristi radi sniàvanja adrenalne produkcije androgena. Rezistencija na insulin sa prate}om kompenzatornom hiperinsulinemijom se

125

tretira regulisanjem telesne teìne i upotrebom antidijabetika. Usmeravaju}i le~enje na ove metaboli~ke abnormalnosti pospe{uje se uspeh indukovanja ovulacije i le~ena infertiliteta kod ovih èna. Stoga se do{lo na ideju uvo|enja lekova koji se koriste u terapiji dijabetesa u kombinaciji sa klomifenom. Primenjuje se terapija oralnim antidijabetikom Metformin-om koji deluje na redukciju hepati~ne glukoneogeneze stimuli{u}i enzim AMP-activated protein kinase. Podaci iz literature o rezultatima le~enja su jo{ uvek kontraverzni. Opse`na multicentri~na studija Legro-a iz 2007. godine, nije podràla hipotezu upotrebe insulin ,,senztizer-a”, bilo samostalno, ili u kombinaciji sa klomifen citratom, niti dokazala pove}anje procenta uspeha u le~enju. Sli~ne rezultate objavio je i Moll u svojoj studiji, za razliku od studije objavljene od strane Palomba i saradnika. Ova grupa tvrdi da kod pacijenata koji primaju metfromin dolazi do pove}anja osetljivosti na insulin, uklju~uju}i efekte na BMI, proinsulin i insulin nivoe, kao i insulin rezistenciju, u pore|enju sa klomifen grupom. Me|utim, ovi efekti se ne odnose na pove}anje broja ìvoro|ene dece. Dosada{nja istraìvanja su do sada potvrdila da je prva faza u le~enju infertiliteta kod èna sa PCO sindromom, primena clomiphene citrate. Nije potvr|ena signifikantno zna~ajna prednost kombinovane terapije sa upotrebom metformina u odnosu na klomifen u smislu pove}anja broja ìvoro|ene dece. Hirzutizam se tretira upotrebom oralnih kontraceptiva spironolaktona i kozmeti~kim tretmanima. U rezistentnim slu~ajevima neophodna je laparoskopska hirurgija uz upotrebu YAG – neodymium doped yttrium aluminium

126


garnet lasera, ili CO2 – carbon dioxide lasera, radi redukovanja produkcije testosterona. @ene sa sindromom policisti~nih jajnika ispoljavaju mikrovaskularnu endotelijalnu disfunkciju koja se indicira inhibiranim vazodilatornim odzivom na Ach - acetil holin. Mikrovaskularna funkcija se procenjuje merenjem laser dopler ure|ajima mikrovaskularnog protoka eritrocita na koì podlaktice, kumulativnih jontoforetskih doza 1% W/V Ach - acetylcholine i 1% W/V natrijum nitroprusida SNP- sodium nitroprusside.

Sterilitet i PCO -polycystic ovaries i PCOS - polycystic ovarian syndrome Problem steriliteta se ~esto sre}e kod pacijenata sa PCO - polycystic ovaries i PCOS - polycystic ovarian syndrome-a. Oteàno funkcionisanje folikula izaziva izostanak ovulacije, jer se antralni folikuli koji su pre~nika 3–8 mm i akumulirani u korteksu policisti~nog jajnika, nalaze u sredini u kojoj dominira androgen, zbog pove}ane sekrecije androgena od strane tekalnih }elija i blokiranja aromatizacije u granulozi. U mnogobrojnim radovima iz literature dokazano je zna~ajno smanjenje sazrevanja oocita, oplodnje i razvoja embriona kod èna sa sindromom policisti~nih jajnika PCOS - polycystic ovarian syndroma. Abnormalna endokrina sredina i staza folikularnog rasta kod pacijenata sa PCOS - polycystic ovarian syndrome-om ne moè poremetiti oocit, a folikularna atrezija ne smanjuje razvojnu kompetentnost oocita.

1.6. DISFUNKCIJA LUTEALNE FAZE I STERILITET Doktorka Dòrdìna Dòns je 1949. godine prva opisala deficijenciju lutealne faze

LPD - luteal phase dysfunction, ili luteal phase deficiency, ili luteal phase defect. Neadekvatna sekretorna transformacija endometrijuma, koja rezultuje iz nedovoljne proizvodnje progesterona je jedan od faktora neplodnosti i rekurentnog gubitka trudno}e. Deficijencija lutealne faze je dijagnozirana kod 3 - 20% pacijenata koji su neplodni i 5 - 60% pacijenata koji su doìveli rekurentan gubitak trudno}e. Kod 6 - 10% èna koje su fertilne postoji neadekvatna lutealna faza usled normalnih varijacija menstrualnog ciklusa. Slede}i patofiziolo{ki mehanizmi mogu izazvati neadekvatan odziv endometrijuma na hormonalnu stimulaciju tokom lutealne faze:

Abnormalan folikularni razvoj Abormalan folikularni razvoj rezultuje iz neadekvatne sekrecije FSH - follicle stimulating hormona i LH - luteinizing hormona iz anteriorne pituitarne `lezde. FSH follicle stimulating hormon stimuli{e granulozne }elije folikula koji se razvija u cilju stvaranja estradiola iz konverzije njihovog supstratnog androstenediona. Smanjenje osloba|anja FSH - follicle stimulating hormona rezultuje smanjenim rastom granuloznih }elija i niìm nivoima estradiola. Po{to corpus luteum nije de novo struktura, on pokazuje uticaje abnormalne folikulogeneze sa smanjenom produkcijom progesterona.

Abnormalna luteinizacija Neadekvatno osloba|anje LH - luteinizing hormona moè izazvati smanjenje androstenediona teka }elija. Manji supstrat rezultuje smanjenjem estradiola i niìm nivoima progesterona. Pored toga, suboptimalna

III Deo: Sterilitet

koncentracija LH - luteinizing hormona pri ovulaciji izaziva nedostatak progesterona zbog neadekvatne luteinizacije granuloznih }elija.

Materi~ne abnormalnosti Materi~ne abnormalnosti izazivaju promene vaskularizacije endometrijuma uprkos normalnim nivoima progesterona. Miomi, septumi uterusa i endometritis su odgovorni za neadekvatne sekretorne promene u endometrijumu.

Hipoholesterinemija Hipoholesterinemija organizma inicira steroidnu deficijenciju koja rezultuje niskom produkcijom progesterona i defekt lutealne faze.

Ultrazvu~no merenje endometrijalne debljine se nije pokazalo efikasnim u predvi|anju disfunkcije lutealne faze.

Biopsija endometrijuma Nojs, Hertig i Rok su 1950. godine utvrdili da je dijagnoza deficijencije lutealne faze mogu}a histolo{kim pregledom endometrijuma. Vreme kada se radi biopsija moè u velikoj meri da uti~e na nalaze endometrijalne biopsije. Biopsija na sredini lutealne faze je najbolja za precizno dijagnostikovanje deficijencije lutealne faze. Biopsije iz fundusa uterusa daju bolje histolo{ke uzorke u pore|enju sa onima koji su uzeti iz nièg segmenta materice. Histolo{ki posmatrano, kod defekta lutealne faze razvoj endometrijuma zaostaje za 3 ili vi{e dana od normalno razvijenog endometrijuma. Hiperprolaktinemija i hipotiroidnost izazivaju deficijenciju lutealne faze kroz hipotalamusno-pituitarne disfunkcije.

127

Kod èna bez hiperprolaktinemije i hipotiroidnosti se preporu~uje vaginalni progesteron kao dopuna endogene produkcije progesterona. Dopunski progesteron podiè niè nivoe u lutealnoj fazi. Vaginalni supozitorijum ili gel su bolja opcija u odnosu na oralne i intramuskularne oblike zbog postizanja boljih koncentracija endometrijalnog progesterona. U terapiji se koriste klomifen citrat (klomifen citrat pobolj{ava folikularni razvoj i na taj na~in podiè nivoe progesterona lutealne faze), gonadotropini i HCG - human chorionic gonadotropin. Defekt moè biti i na molekularnom nivou, pa je potrebno utvrditi specifi~ne markere. Istraìvanje o molekularnim defektima je utvrdilo abnormalnosti endometrijuma èna sa endometriozom, sindromom policisti~nih jajnika i hidrosalpinksom. Tejlor je pokazao oslabljenu HOXA10 – homeo box region A ekspresiju gena kod ovih èna. Endometrijalna receptivnost moè zavisiti od ekspresije gena koja moè biti regulisana estrogenom i progesteronom. Dok istraìva~i ne re{e ova pitanja, primenjuje se gore opisana terapija.

1.7. TIROIDNA @LEZDA I NEPLODNOST Tiroidna disfunkcija je stanje organizma sa smanjenom mogu}no{}u za~e}a i nepovoljnim uticajem na ishod trudno}e. Tiroidna disfunkcija je stanje koje ometa normalnu ovarijalnu funkciju i ~e{}a je kod èna sa pozitivnim TPO Abs– thyroid peroxidase antibodies. Kasnije pra}enje cohort-a neplodnih èna koje se podvrgavaju asistiranoj reprodukciji pokazuje zna~ajno povi{en rizik od poba~aja kod èna sa pozitivnim anti - TPO Abs – thyroid peroxidase antibodies-om u pore|enju sa


128

ènama bez tiroidne auto-imunosti, nakon {to je klini~ka trudno}a uspostavljena ART -assisted reproductive technology procedurom.

Sl. 3.39- Hormoni tiroidne `lezde

Povezivanje prisustva anti-TPO-Abs thyroid peroxidase antibodies-a i poba~aja je hipoteti~ki obja{njeno ~injenicom da organsko specifi~ne autoimune bolesti mogu biti sekundarne nekim osnovnim }elijskim abnormalnostima koje direktno uti~u na ishod trudno}e. Alternativno, ène sa tiroidnim autoimunitetom mogu pro}i kroz ve}e promene nivoa slobodnog tiroksina tokom ART - assisted reproductive technology-e, a kasnija trudno}a moè uticati na fiziologiju genitalnog trakta i razvoj fetusa. Utvr|ivanje prisustva tiroidnih antitela pre ART - assisted reproductive technology-e procedure je zbog toga korisno za identifikaciju èna koje su izloène riziku od kasnijeg klini~kog poba~aja. Prema tome, treba uraditi pregled TSH, slobodnog T4 i TPO-Ab - thyroid peroxidase antibodies-a kod svih infertilnih èna. Kod èna je hipotireoza naj~e{}e posledica autoimunog procesa. Ha{imotova bolest je stanje kada dolazi do postepenog o{te}enja tkiva koje proizvodi tiroidni hormon.

Simptomi su slede}i: povi{eni nivoi krvnog TSH i niski nivoi slobodnog T3/T4, opipljivo uve}ana tiroidna `lezda, pove}anje teìne, slabost, netolerantnost prema hladnom vremenu, letargija, depresija, hiperholesterolemija, arterioskleroza, koronarna vaskularna bolest srca, suvo}a koè, gubitak kose, smetnje vida, neregularni i mu~ni menstrualni periodi, rekurentan gubitak trudno}e i neplodnost. Autoimune krvne promene su skoro uvek prisutne u obliku antitiroidnih antitela –ATA, kao {to su antitiroglobulinska i antimikrozomalna antitela. Va`nost ATA antitiroidnih antitela, bez obzira na to da li se hipotiroidnost biohemijski ili klini~ki manifestuje, leì u ~injenici da }e kod 50% èna sa ATA - antitiroidnim antitelima da postoji imunolo{ki problem implantacije koji se manifestuje kao neplodnost, ili rekurentan gubitak trudno}e RPL - recurrent pregnancy loss. Veruje se da je ovo izazvano pove}anjem broja T - }elija ili aktivacijom prirodnih }elija ubica.

1.8. ZNAÂJ HIPERPROLAKTINEMIJE KOD NEPLODNIH @ENA Primetno povi{eni nivoi krvnog prolaktina, preko 30 ng/ml mogu ometati endometrijalnu proliferaciju i folikularni rast i razvoj i tako smanjiti verovatno}u pojave trudno}e. Umereno povi{eni nivoi 20-30 ng/ml ne zahtevaju medikamentni tretman radi sniènja koncentracije prolaktina u serumu. Povi{eni nivoi prolaktina u serumu mogu da budu posledica pituitarnog tumora, adenoma koji stvara prolaktin, ili drugih intrakranijalnih tumora, kraniofaringioma, meningioma, itd.

129

III Deo: Sterilitet

Upotreba nekih lekova, sredstava za smirenje, antihipersenzitiva za blokiranje ganglija, antidepresiva, tiazida i narkotika, moè da povisi nivo prolaktina u krvi. Umereno povi{eni nivoi prolaktina ~esto predstavljaju jedan od najranijih znakova predstoje}eg, ili postoje}eg hipotiroidnog stanja. Prema tome, povi{eni nivo prolaktina u krvi, bez obzira na stepen, zahteva ispitivanje. Na àlost, isuvi{e ~esto se te ène empirijski tretiraju bromokriptinom radi sniàvanja prolaktina u krvi bez razmi{ljanja o {irim implikacijama. Pituitarni adenomi koji izazivaju pove}anje nivoa prolaktina u krvi se obi~no efikasno tretiraju produènom medikamentoznom terapijom, ~ak i tokom trudno}e. Ve}i makroadenomi mogu zahtevati transsfenoidalnu hirur{ku resekciju, ablaciju. Ostale intrakranijalne lezije koje izazivaju hiperprolaktinemiju se obi~no tretiraju hirur{ki. U situacijama hipotiroidnosti, hiperprolaktinemija obi~no ima dobar odziv na odgovaraju}u zamensku terapiju tiroidnim hormonom koja ima za cilj da odrì serumske koncentracije TSH - thyroid stimulating hormona u normalnom opsegu.

slovima. Govori se o GAMDE -podeli, ~ime se misli na slede}e grupe: - Imunglobulin G ili IgG - Imunglobulin A ili IgA - Imunglobulin M ili IgM - Imunglobulin D ili IgD - Imunglobulin E ili IgE

Imunglobulin G IgG se formira posle 3 nedelje od pojave antigena. Od svih antitela 75 procenata je imunglobulin G – IgG.

Sl. 3.40- Imunoglobulin G (IgG)

Kod reinfekcije IgG antitela se stvaraju veoma brzo i u velikoj koli~ini, da bi spre~ila ponovno izbijanje bolesti.

1.9. IMUNGLOBULINI I NJIHOVA FUNKCIJA I STERILITET Imunolo{ki sistem prepoznaje strane uzro~nike patolo{kih stanja – antigene i kao za{titu protiv njih proizvodi specifi~na antitela. Antitela se nazivaju imunoglobulini i jedni od drugih se razlikuju po svojoj gra|i i funkciji, jer se sastoje od belan~evina razli~itog sastava i iz tog razloga se dele na razli~ite grupe koje se ozna~avaju

Sl.3.41- IgG antitela


130

Posebnost IgG je da oni u toku trudno}e mogu da prodru kroz placentu. Dete je tako za{ti}eno pre i posle ro|enja od infekcije. Ova za{tita traje samo oko tri meseca.

Imunglobulin A IgA je specijalizovan za odbranu od antigena na povr{inama sluzokoà npr. u nosu, grlu, crevu. Njegov udeo u celokupnoj koli~ini antitela iznosi otprilike 17 procenata.

ovog mehanizma je mogu}a specijalna laboratorijska dijagnostika: - Ako postoji sumnja na infekciju, koju je prouzrokovao odre|eni uzro~nik, onda pri elektroforezi mora da se dokaù IgM antitela; - Ako je infekcija prva, onda proizvodnja IgM raste brzo; - Ako je infekcija ponovljena, onda IgM koncentracija ostaje mala; - Ako je prevazi|ena akutna faza infekcije, koncentracija IgM antitela opet opada.

Sl. 3.42- IgA antitela

Sl. 3.43- IgM antitela

Imunglobulin A

Uzro~nici bolesti i alergeni bivaju spre~eni i neutralizovani ve} sa IgA antitelima. IgA dospeva u mleko majke koja doji, koja tako svom dojen~etu moè da prenese odbrambene materije.

Imunoglobulin M IgM je brzistarterme|u imunoglobulinima. Kada neki strani uzro~nik bolesti dospe u organizam, telo kao prvo reaguje sa imunglobulinom M (IgM). Po{to je IgM tako brzo na raspolaganju, on se ozna~ava kao rano antitelo. IgM i IgG funkcioni{u zajedno. Proizvodnja IgM se smanjuje nekoliko nedelja od po~etka infekcije. Onda se radi za{tite organizma poja~ano formiraju IgG antitela, koja pruàju za{titu. Upravo zbog

Imunglobulin D IgD aktivira B-limfocite. Imunglobulin D IgD u serumu moè da se dokaè samo u veoma malim koli~inama. O njegovoj ta~noj funkciji mnogo toga nije poznato. Ima ulogu pri aktiviranju B-limfocita, jer se nalazi na povr{ini B-limfocita i sa njima kruì u krvotoku.

Imunglobulin E Imunglobulin E IgE je jako specijalizovan i ima ulogu kod alergija. Poti~e iz limfnog tkiva, koje se nalazi u blizini disajnih puteva i digestivnog trakta. Odatle dospeva u krv. IgE moè da se dokaè u veoma malim koli~inama, samo 0,001 procenat svih imunoglobulina su IgE.

131

III Deo: Sterilitet

Sl. 3.44- IgE antitelo i IgE receptor

Uprkos tome ima va`nu ulogu kod preko 90 procenata svih alergijskih procesa. IgE je otkriven mnogo kasnije nego drugi imunglobulini. Ve} se ranije znalo, da telo reaguje odre|enom materijom na prisustvo alergena, naro~ito kod alergijskih reakcija. Ova materija je nazvana reagin. IgE dovodi do izbacivanja mediatora, koji izazivaju reakciju zapalenja. Nalazi se u koì i u sluzokoàma, koje u~estvuju pri alergijskim reakcijama na alergene. Ako alergeni do|u u dodir sa IgM na koì i na sluzokoàma dolazi do promena u funkciji razli~itih }elija {to dovodi do izbacivanja materija iz }elija - medijatora, koje izazivaju reakciju upale. Najpoznatiji mediator je histamin. Sperm IgA i sperm mar IgG se koriste kao testovi za detekciju ASA - anti spermatozoidnih antitela u spermi i serumu. ASA - antispermatozoidna antitela se produkuju kada je prekinuta krv - testis barijera, obstrukcijom, infekcijom ili traumom. Krv – testis barijera izoluje u fiziolo{kim uslovima tkivo testisa od imunokompetentnih }elija. Imunglobulini IgG klase su obi~no prisutni i u serumu i u spermi. IgG antitela su vezana za spermatozoide. ASA - anti spermatozoidna antitela

IgA klase se sekretuju od strane akcesornih seksualnih `lezda i nalaze se samo u spermi. Mogu da budu detektovana u semenoj plazmi, ali tu obi~no nema slobodnog IgA. Antispermatozoidna antitela IgA gotovo nikad se ne javljaju bez IgG antitela. Ako vi{e od 40% mobilnih spermatozoida pokazuju prisustvo ASA - anti spermatozoidna antitela IgG klase, savetuje se kompetitivni test za IgA antitela. Imunolo{ki faktor smanjuje verovatno}u spontanog za~e}a, posebno ako su prisutna ASA- anti spermatozoidna antitela IgAklase. Prisustvo antitela kompromituje usmereno kretanje spermatozoida kroz ènski genitalni trakt, vezivanje spermatozoida za zonu pelucidu i interakciju spermatozoida i oocita onemogu}avaju}i oplodnju. Metoda izbora le~enja je ICSI - intra citoplasmatic sperm injection.

Imunolo{ko uslovljen sterilitet Na imunolo{ki uzrok se ~esto sumnja pri neuspehu dugogodi{njih dijagnosti~kih i terapeutskih napora, ili kod neadekvatnih ishoda PCT - postkoitalnog testa. PCT - postkoitalni test je kao screening – test pogodan za ispitivanje lokalne kompatibilnosti, ali mora da se pazi na standardizovano sprovo|enje, vreme ~ekanja, tehniku uzimanja i mikroskopsku procenu. Od velikog zna~aja su hormonski efekat na kvalitet sluzi grli}a materice, ili pH-vrednost. Patolo{ki ishod PCT - postkoitalnog testa se ~esto zasniva na promenama ovih parametara. Pri sumnji u postojanje neke smetnje lokalne kompatibilnosti pri in vivo pregledima, radi dalje diferencijacije se preporu~uje in vitro test penetracije sperme kroz sluz grli}a materice SCMPT – standardized determinations of the sperm-cervical mucus penetration test. U ukr{tenom sprovo|enju

132


testa SCMPT - standardized determinations of the sperm-cervical mucus penetration testa omogu}ava se razgrani~enje patolo{kog faktora grli}a materice i faktora sperme. Poreme}ena interakcija sperma - sluz grli}a materice moè da se zasniva na prisustvu antitela spermatozoida u genitalnom sekretu. Radi dokazivanja lokalnih ASA anti spermatozoidnih antitela dolaze u obzir direktan MAR - mixed antiglobulin reaction test i IMB - immunobead test kao i indirektan test-indirektan MAR - mixed antiglobulin reaction test u cervikalnom sekretu. Uz pomo} markiranih ~estica indikatora moè da se postigne razgrani~avanje antitela IgG i IgA. Lokalna ASA - antispermatozoidna antitela se ~e{}e sre}u u ejakulatu i na povr{ini spermatozoida u oko 10%, nego u sluzi cerviksa < 2 %. Antitela sperme lgG i IgA pokazuju jasno pozitivnu korelaciju, ali i sama mogu da se na|u u razli~itom obimu. Ona nisu ni u kakvoj direktnoj vezi sa ASA - anti spermatozoidnim antitelima u serumu. Redak uzrok steriliteta predstavljaju lokalna IgA antitela sperme koja pokazuju izrazito negativan uticaj na stepen plodnosti. Posebno se razmatra delovanje imunog odgovora sa formiranjem antitela sperme kod genitalne infekcije kod mu{karca zbog ukr{tene reaktivnosti izme|u mikroorganizama i spermatozoida. Povezanost lokalnih ASA - anti spermatozoidnih antitela IgG i IgA u spermi sa mikrobnim naseljavanjem ejakulata kao i masa leukocita u spermi nije dosada mogla da se dokaè kod klini~ki asimptomatskih pacijenata. To vaì i za lokalna ASA - anti spermatozoidna antitela i druge parametre kod subklini~kih genitalnih infekcija.

Odre|ivanje cirkuli{u}ih antitela u serumu ène ili mu{karca ASA - anti spermatozoidnih antitela ne daje klini~ki relevantnu informaciju o stanju plodnosti bra~nog para. Pozitivno dokazivanje cirkuli{u}ih ASA - anti spermatozoidna antitela pomo}u TAT - tray agglutination testa, RIA - radioimmunoassay ili ELISA – enzyme linked immunosorbent assay, nije u korelaciji sa PCT - postkoitalnim testom, ili sa SCMPT standardized determinations of the spermcervical mucus penetration testom i procentom trudno}a. ASA - anti spermatozoidna antitela u serumu mu{karca ili ène, koja su dokazana ovom metodom, ne pokazuju nikakav negativan uticaj na prognozu plodnosti. Ona ne opravdavaju primenu sistemske terapije kortikosteroidima. Odre|ivanje ASA - anti spermatozoidnih antitela u serumskim probama, naro~ito putem ~esto kori{}enog, komercijalno dostupnog ELISA - enzyme linked immunosorbent assay testa ne moè da se preporu~i u okviru dijagnostike plodnosti.

1.10. STRES I STERILITET Jedan od faktora poreme}aja plodnosti, o kojima se razmi{lja, je stres. Postoje tri faze stresa: - alarmna reakcija - faza otpora - faza iscrpljenosti.

Alarmna reakcija Alarmna reakcija je posledica poreme}aja unutra{nje ravnoteè, kojoj se organizam suprotstavlja aktiviranjem simpatikusa. Kao posledica dolazi do aktiviranja

III Deo: Sterilitet

kore nadbubre`ne `lezde sa poja~anim lu~enjem hormona adrenalina, noradrenalina, kao i hormona stresa kortizola i kortikosterona. To ubrzava frekvenciju rada srca, pove}ava vrednost {e}era u krvi, ubrzava disanje i pove}ava krvni pritisak. Postoji porast slobodnih masnih kiselina i koncentracije èluda~ne kiseline. Posledice ovih promena su pobolj{ana prokrvljenost mi{i}a, bolja ventilacija plu}a, porast oksigenacije mozga, ali i suènje krvnih sudova, usporavanje rada èluca, creva i mokra}ne be{ike, manje lu~enje pljuva~ke i skupljanje krvnih sudova koè. Ako ovo stanje duè potraje, to negativno uti~e na razmenu ugljenih hidrata i masnih materija i pove}anje nivoa {e}era u krvi i acidoza krvi. Sveukupno se pobolj{ava prokrvljenost srca, mozga i mi{i}a, pove}ava se transport kiseonika i nastupa promena u aktivnosti mo`danih talasa.

Faza otpora Telo posle nekog vremena reaguje suprotnom reakcijom radi smanjenja potro{nje energije. U stanju stresa, koji traje duè aktivira se parasimpatikus {to dovodi do skupljanja bronhija, pove}anog lu~enja pljuva~ke kao i pove}anje aktivnosti èluca, creva i be{ike. Adrenalin, noradrenalin i kortizol ostaju visoki {to slabi funkciju {titaste `lezde. Za problem neplodnosti je interesantno da reproduktivni organi u ovoj fazi pokazuju smanjenje otpornosti prema zapaljenskim procesima.

Faza iscrpljenosti Postaju vidljivi znaci jake iscrpljenosti. Zbog velikog lu~enja energetski relevantnih materija, dolazi do problema sa stvaranjem energije. Mogu}nost prilago|a-

133

vanja je izgubljena, funkcije imunolo{kog sistema i polnih `lezda su optere}ene, apetit je poreme}en i reproduktivni organi i proces rasta, vi{e ne funkcioni{u normalno. Dugotrajne posledice su delom te{ka oboljenja kao: - hipertonija, - sr~ana oboljenja, oboljenja krvnih sudova i bubrega, - alergije i zapaljenske bolesti.

1.11. PSIHOSOMATSKI ASPEKTI STERILITETA Parovi koji nemaju decu u najve}em broju slu~ajeva su skloni tome, da uzrok nemogu}nosti roditeljstva posmatraju kao ~isto medicinski problem. To je jednostavnije od suo~avanja sa sopstvenom ìvotnom situacijom i mogu}im psihi~kim uticajima. Posmatranje telesnih uzroka neplodnosti pokazuje, da va`nu ulogu igraju psihi~ki aspekti, kao na primer kod hormonskih disfunkcija. Strah, tuga, ose}aji krivice i prebacivanje krivice na drugoga su ~este reakcije, koje zahtevaju psiholo{ku podr{ku bra~nom paru. Dijagnoza neplodnosti je za mnoge ljude potpuno iznena|enje {to ~esto dovodi od razli~ito jakih faza o~aja i frustracije. Parovi ostaju nemo}ni pred tom ~injenicom i ose}aju strah i tugu. Moè da do|e do pojave ose}anja krivice, a mogu}e je da parovi reaguju i sa najrazli~itijim direktnim i indirektnim prebacivanjem krivice. Le~enje steriliteta bi trebalo da uzme u obzir razli~ite psihi~ke aspekte. Lekari koji se bave le~enjem steriliteta, trebalo bi da poznaju psiholo{ke i psihosomatske uticaje i da ih uzmu u obzir. Parovima kod kojih su konstatovane takve reakcije trebalo bi da se savetuje psiholo{ka pomo}.

134


Va`no je suo~avanje sa motivima èlje za decom. Tek u detaljnom razgovoru mogu da se sagledaju motivi. Tu spada motivacija: - da moè ne{to da voli - samoostvarenje preko deteta - èlja da se doìvi trudno}a - da se manifestuje identitet kao ène i majke - ìvot bez deteta nije mogu} - u~vr{}uje se ili se upotpunjava odnos sa partnerom - ne{to moje ìvi dalje - daje smisao ìvotu. @elja za decom moè da ima i egoisti~ne razloge. Psihi~ka optere}enja tokom terapije pove}avaju se sa vremenom ~ekanja. êsto se psihi~ko optere}enje ne povezuje sa neophodnim pregledima i zahvatima. Optere}enje se pokazuje naro~ito kod neophodnog vremena ~ekanja izme|u pojedina~nih medicinskih postupaka. To moè da dovede do vi{estrukih konflikata u

partnerskom odnosu, koji mogu negativno da se odraze. Za mnoge parove je le~enje steriliteta psihi~ki veoma optere}uju}e. Zbog toga je razumno psihi~ko zbrinjavanje i savetovanje za vreme ovog perioda. Psiholo{ko stanje je mereno PGWB psychological general Well-Being indeksom kod pacijenata u programima asistirane reprodukcije radi ispitivanja uticaja psiholo{kog stresa na ishod IVF - in vitro fertilisation. Analizirane su psiholo{ke promene kod èna koje su ostale trudne i èna koje nisu bile trudne. U obzir su uzimani parametri ukupnog broja embriona, njihov kvalitet kao i broj transferisanih embriona. Nisu na|eni dokazi da psiholo{ki stres ima bilo kakav uticaj na ishod IVF - in vitro fertilisation tretmana. Prilikom savetovanja sa neplodnim parovima mogu}e je smanjiti stres koji doìvljavaju tokom tretmana, informi{u}i ih, izme|u ostalog, i o ovim nalazima.

135

III Deo: Sterilitet

2. POREME]AJI MU[KE PLODNOSTI Uzroci mu{kog steriliteta se mogu podeliti prema lokalizaciji osnovnog uzroka na: pretestikularne, testikularne i posttestikularne. Testikularni uzroci se javljaju kod 75% slu~ajeva, pretestikularni 10% i posttestikularni 15%. Pretestikularni uzroci su ekstragonadalni endokrini poreme}aji koji se de{avaju u hipotalamusu-hipofizi ili nadbubrezima.

Testikularni uzroci se odnose na primarne promene u samim testisima, a posttestikularni uzroci se, uglavnom, odnose na opstrukcije izvodnih kanala testisa i epididimisa, kao i na poreme}en motilitet spermatozoida, najverovatnije zbog neadekvatne maturacije. Za odre|ivanje mesta promene koristi se biopsija testisa, metoda koju su uveli Charny i Hotchkiss, kao i odre|ivanje urinarnih

Tabela 3-5: Podela uzroka mu{kog steriliteta

Pretestikularni uzroci

Testikularni uzroci

HYPOPITUITARIS MUS - PREPUBERTETSKI PO~ETAK - POSTPUBERTETSKI PO~ETAK VIŠAK ESTROGENA - TUMORI KOJI STVARAJU ESTROGEN (KORA NADBUBREGA) - CIRRHOSIS HEPATIS - EGZOGENI ESTROGEN VIŠAK GLUKOKORTIKODA - ENDOGENI (CUSHING) - EGZOGENI (LE~ENJE) ULCEROZNOG KOLITA, ASTME I SL)

MATURACIONI ZASTOJ HYPOSPERMATOGENESIS (PROPORCIONALNAHIPOPLAZIJA SVIH GERMINATIVNIH }ELIJA) ODSUSTVO GERMINATIVNIH ]ELIJA (SINDROM PRISUSTVA SAMO SERTOLIJEVIH }ELIJA) KLINEFELTER-OV SINDROM (SKLEROZIRAJU}A TUBULARNA DEGENERACIJA)

HYPOTHYROIDIS MUS DIABETES MELLITUS

ANOMALIJE SEKSUALNIH HROMOZOMA I POREME]AJI SEKSUALNE DIFERENCIJACIJE CRYPTORRHISMUS OŠTE]ENJE ZRAÊNJEM VIRUSNI ORHITISI

Posttestikularni uzroci BLOK DUKTUSNOG SISTEMA KOJI VODI SPERMU OD TESTISA A. KONGENITALNI - ATRESIA VAS DEFERENSA I/ILI EPIDIDIMISA B.

STE~ENI - INFEKCIJE:GONOREJA, TBC, LEPRA,GRANULOMATOZNI ORCHITIS C. TRAUMA D. PODVEZIVANJE

136


gonadotropina. Kori{}enjem ove dve metode moè se odrediti osnovna promena koja je uzrok steriliteta. Zavisno od nivoa gonadotropina u urinu sterilitet se moè podeliti u tri kategorije: 1. Hipogonadotropni 2. Hipergonadotropni 3. Normogonadotropni. Ova biohemijska klasifikacija je, tako|e, va`na za razja{njenje mu{kog steriliteta. Kao primer pretestikularnog steriliteta navodi se hipopituitarizmus gde je snièn nivo gonadotropina, a povi{en nivo cirkuli{u}eg estrogena (estrogen stvaraju}i tumori kore nadbubrega, ciroza jetre, egzogeni estrogen). Vi{ak estrogena dovodi do supresije stvaranja gonadotropina {to je pra}eno sekundarnom insuficijencijom testisa.

2.1. PRETESTIKULARNI UZROCI Kod 10% pacijenata uzroci steriliteta su pretestikularni. Naj~e{}e se radi o hipopituitarizmu.

Hipopituu itarismuu s Naj~e{}i uzrok pretestikularnog steriliteta je hipopituitarismus. Svejedno o kom se vidu pituitarne insuficijencije radi, uvek je prisutna testikularna insuficijencija. Ovi slu~ajevi se dele prema tome da li je hipopituitarizam nastao pre ili posle puberteta.

a) Prepubertalni hipopituitarismus Ovi pacijenti imaju male, nezrele seminiferne tubule koji li~e na tubule prepubertalnih testisa. Tubuli su obloèni nediferentovanim germinativnim elementima i nezrelim Sertolijevim }elijama. Nema

znakova maturacije germinativnih }elija preko stadijuma spermatogonija, ili primarnih spermatocita. Tunika proprija je fina i tanka. Kao i u prepubertalnim testisima nema peritubularnih elasti~nih elemenata, jer se isti javljaju samo pod adekvatnom stimulacijom gonadotropinima u pubertetu. Leydigove }elije su nezrele i slabo razvijene. One li~e na nediferentovane mezenhimske }elije. Klini~ki gonadalna insuficijencija nastala zbog prepubertalnog hipopituitarizma moè biti izazvana organskim lezijama, u ili oko hipofize, ili zbog genetskog defekta u sekreciji gonadotropina. U organske lezije spadaju tumori, ciste, ili trauma u predelu sellae turcicae ili supraselarne regije. Ovi pacijenti su seksualno infantilni, ne pokazuju somatski rast i ispoljavaju razne stepene hipofunkcije tiroideje i nadbubrega. Nasuprot tome, pacijenti sa genetskim defektima u sekreciji gonadotropina su po pravilu visoki i evnuhoidni i ne pokazuju znake defekta somatotropina, tireotropina ili adrenokortikotropina. Zato se ovakav sindrom naziva hipogonadotropni evnuhoidizam. Karakteristi~no je da se u hipofizi ne dijagnostikuju organske promene. Sindrom je ~esto udruèn sa kongenitalnim anomalijama kao {to su anosmia, rascepljena usna, rascepljeno nepce i kraniofacijalna asimetrija. Postoje najmanje dve varijante hipogonadotropnog evnuhoidizma. Prva, klasi~na forma pokazuje deficit FSH - follicle stimulating hormone-a i LH - luteinizing hormone-a. Ovi pacijenti nikada nisu imali normalan pubertet. Oni su evnuhoidne gra|e sa dugim nogama, oskudnim dlakama na licu i telu, istanjenim, slabo razvijenim mi{i}ima, malim genitalijama i odsustvom ejakulacije. Histolo{ka slika testisa odgovara prepubertetskim testisima.

137

III Deo: Sterilitet

U drugom obliku hipogonadotropnog evnuhoidizma lu~enje FSH - follicle stimulating hormona je normalno, ali postoje deficiti razli~itog intenziteta lu~enja LH luteinizing hormona. Koli~ina LH luteinizing hormona nije dovoljna da odrì produkciju normalnog nivoa androgena i da dovede do razvoja sekundarnih seksualnih karakteristika. Prisutni FSH - follicle stimulating hormon je dovoljan da izazove spermatogenezu razli~itog stepena tako da se u spermi mogu na}i spermatozoidi u razli~itom broju. Zbog toga se ovi pacijenti nazivaju “fertilni evnuhoidi”. Biopsije testisa pokazuju ve}i stepen razvoja seminifernih tubula, a Leydigove }elije su slabije razvijene.

b) Postpubertalni hipopituitarismus Ako se hipopituitarizam javi posle puberteta, seminiferni tubuli, koji su

dostigli normalne dimenzije, ne regresiraju na prepubertetsko stanje. Oni pokazuju maturacioni arest, gubitak germinativnih }elija, redukciju dijametra tubula, progresivno zadebljanje i hijalinizaciju tunike proprije. Vremenom se tubuli transformi{u u hijalinisane kolagene trake. Specijalnim bojenjem se identifikuju elasti~na vlakna oko skleroti~nih tubula {to ukazuje da su tubuli imali prethodno normalan razvojni put i da su bili normalno stimulisani gonadotropinima. Leydigove }elije su uglavnom deformisane i neprimetne i ~esto sadrè lipohrom i Reinkeove kristale. Klini~ki ove promene su ~esto posledica adenoma hipofize, naj~e{}e hromofobnog adenoma, a nekad i kraniofaringioma. Do istih promena mogu dovesti i acidofilni adenomi. Kao slede}i uzrok se navodi trauma ove regije.

Sl. 3.45- Hormonska regulacija

138


Hormonska regulacija hipofizno-testikularne osovine koja zahvata interreakcije izme|u hipotalamusa, prednjeg re`nja hipofize, testisa i duktusa je prikazano na prethodnoj slici. Sekrecija GnRH - gonadotropin releasing hormon od strane hipotalamusa stimuli{e sintezu i osloba|anje FSH follicle stimulating hormona i LH luteinizing hormona od strane hipofize. FSH - follicle stimulating hormon deluje direktno na Sertolijeve }elije u tubulima testisa i pove}ava sintezu androgen vezuju}eg proteina. FSH - follicle stimulating hormon omogu}uje {irenje tubula. LH luteinizing hormon indukuje Leydigove }elije da sinteti{u testosteron koji difunduje u susedne tubule i pove}ava spermatogenezu. Testosteron deluje preko feedback mehanizma na hipotalamus i, mogu}e, na prednji reànj hipofize i na taj na~in ograni~ava sekreciju LH - luteinizing hor-

mona. Inhibin koga stvaraju Sertolijeve }elije deluje na hipofizu ograni~avaju}i FSH - follicle stimulating hormona sekreciju i tako|e deluje na hipotalamus ograni~avaju}i sekreciju GnRH - gonadotropin releasing hormona i posledi~no FSH - follicle stimulating hormona. Intracelularni efekti testosterona su posredovani androgenim receptorima u androgen reaguju}im }elijama. Kompleks hormon-receptor se veè za promotornu regiju androgen stvaraju}eg gena stimuli{u}i transkripciju mRNK - messenger ribonucleic acid-a i sintezu proteina.

Vi{ak estrogena Vi{ak estrogena suprimira sekreciju gonadotropina i dovodi do sekundarne insuficijencije testisa. Ima i mi{ljenja da estrogen moè imati i direktno dejstvo. Vi{ak estrogena se sre}e kod ciroze jetre,

Sl. 3.46- Intracelularni efekti testosterona

139

III Deo: Sterilitet

tumora koji stvaraju estrogen, tumora kore nadbubrega. Tumori Sertolijevih }elija, ili tumori Leydigovih }elija mogu, tako|e, da stvaraju estrogen. Najzad, davanje estrogena kod pacijenata sa karcinomom prostate, dovodi do insuficijencije testisa. Ovo se, uglavnom, sre}e u postpubertalnom periodu i uslovljava defekt u maturaciji germinativnih }elija, pa se i germinativni epitel smanjuje, a seminiferni kanali zadebljavaju i hijalinizuju. Vremenom se razvije kompletna skleroza tubula. Leydigove }elije atrofiraju.

Vi{ak androgena Vi{ak androgena, sli~no vi{ku estrogena, suprimira sekreciju gonadotropina i dovodi do insuficijencije testisa. Endogeni vi{ak androgena moè biti udruèn sa raznim biohemijskim varijantama adronogenitalnog sindroma. Vi{ak endogenog androgena moè biti posledica androgen stvaraju}ih tumora kore nadbubrega i testisa. Nalaz u testisima zavisi od toga da li se tumor javio pre ili posle puberteta. Ako se razvio pre puberteta vide se virilizam i nezreli testisi. Ako je tumor nastao postpubertalno, testisi pokazuju progresivni gubitak germinativnih }elija i sklerozu tubula. Kada se tumor odstrani nema oporavka. Egzogeni androgeni se pona{aju kao endogeni.

Vi{ak glukokortikoida Vi{ak glukokortikoida se javlja kod Cushingovog sindroma. Egzogeni glukokortikoidi se unose iz terapijskih razloga kod ulceroznog kolitisa, astme i reumatoidnog artritisa i rezultiraju oligospermijom, maturacionim zastojem i hipospermatogenezom. Nakon korekcije nivoa sledi oporavak.

Hypothyroidismus Ovi pacijenti imaju redukovan fertilitet. Na biopsiji testisa se konstatuje hipospermatogeneza. Kada se tiroksin izbalansira fertilitet se oporavlja.

Diabetes mellitus Kod ovih pacijenata je smanjen fertilitet zbog arterioskleroze testikularnih arterija i njihovih grana, {to dovodi do hipospermatogeneze, zadebljanja tunike proprije i seminifernih tubula. Ovi pacijenti imaju i neuropatiju {to je pra}eno impotencijom.

Cisti~na displazija testisa To je redak kongenitalni defekt koji rezultira stvaranjem brojnih nepravilnih cisti~nih prostora u medijastinumu testisa. Intratestikularne ciste, za razliku od paratestikularnih cisti (hidrocele), su retke. Diferencijalna dijagnoza intratestikularnih cisti~nih lezija uklju~uje izolovane proste ciste, ciste tunike albugine, sekundarne ciste zbog traume ili inflamacije, epidermoidne ciste, cisti~ne neoplazme i cisti~nu displaziju testisa. Cisti~na displazija testisa je redak kongenitalni defekt koga su Leissering i Oppenheimer 1973. godine nazvali “ectasia rete testis”. Cisti~na displazija testisa je ~esto udruèna sa abnormalnostima bubrega ili kolektornog sistema. Makroskopski se u medijastinumu testisa vidi cisti~na formacija bez znakova nekroze i hemoragije. Lezija je jasno ograni~ena. Mikroskopski se vide mulptipli, nepravilni i me|usobno anastomozirani cisti~ni prostori razdvojeni fibroznim vezivnim tkivom. Lezija se fokalno moè pro{iriti u okolni deo testisa izme|u seminifernih kanala u vidu prstastih produètaka.

140


Cisti~ni prostori fokalno sadrè acelularni sekret i obloèni su spljo{tenim }elijama, ili niskim kubi~nim }elijama. Sekret je negativan na mucin i alcian plavo. Nekada su prisutni mikrokalcifikati. Lezija je naj~e{}e unilateralna, re|e bilateralna, a pacijenti pokazuju skrotalnu masu ili uve}anje testisa. Cisti~ni prostori mogu komprimirati testis tako da ovaj atrofira. Ova anomalija nastaje kao rezultat defektnog povezivanja ili nepovezivanja izme|u eferentnih duktusa i rete testisa i seminifernih kanala. Ova hipoteza je izvedena na embriolo{kim osnovama. Eferentni duktusi nastaju od mezonefri~kih duktusa, dok rete testis i seminiferni tubuli nastaju od gonadalnog blastema. Kod odraslih se opisuju ste~ene promene u rete testis kada je evidentna i opstrukcija. Opstrukcija epididimisa je naj~e{}i nalaz kod ovih pacijenata.

2.2. TESTIKULARNI UZROCI Maturacioni zastoj Pod maturacionim zastojem se podrazumeva zaustavljanje maturacije spermatozoida na odre|enom stupnju spermatogeneze. U Sertolijevim }elijama nema promena, kao ni u tunici propriji, seminifernim tubulima i Leydigovim }elijama. Dijametar tubula je normalan. Klini~ki pacijenti su oligospermi~ni ili azoospermi~ni. Urinarni gonadotropini, urinarni 17 ketosteroidi i fruktoza u spermi su normalni.

Hypospermatogenesis To je proporcionalna hipoplazija svih germinativnih }elija. U ovom stanju svi }elijski tipovi, uklju~uju}i spermatogonije, spermatocite, spermatide i spermatozoide su prisutni u odgovaraju}im proporcijama, ali je broj smanjen. Kao posledica se vidi op{te istanjenje germinativnog epitela. Sertolijeve i Leydigove }elije su normalne. Dijametar tubula je u granicama normalnog. Klini~ki pacijenti su oligospermi~ni, sa normalnim urinarnim gonadotropinima i 17 ketosteroidima kao i normalnom koli~inom fruktoze u spermi.

Odsustvo germinativnih }elija, sindrom prisustva samo Sertolijevih }elija U ovom stanju tubuli testisa pokazuju umereno smanjenje dijametra i u njima nema germinativnih }elija. Tubule oblaù jedino Sertolijeve }elije. Sertolijeve }elije izgledaju rascvetane. One stoje vertikalno u odnosu na bazalnu membranu tubula. Nekad su vrhovi pomereni u jednu stranu. U citoplazmi Sertolijevih }elija se ~esto vide masne vakuole. Leydigove }elije su normalne. Klini~ki pacijenti imaju dobro razvijene sekundarne polne karakteristike. Oni su potentni, ali sterilni. Testisi su lako smanjene veli~ine, a azoospermija je po pravilu prisutna, mada se nekada mogu na}i retki spermatozoidi, jer neki tubuli pokazuju znake spermatogeneze. Urinarni 17 ketosteroidi su obi~no normalni. Urinarni FSH follicle stimulating hormon je uvek visok kao odgovor na odsutnu spermatogenezu.

III Deo: Sterilitet

141

Klinefelterov sindrom, skleroziraju}a degeneracija tubula.

Sl. 3.47- Atrophia tubulorum testis gradus maioris

Sl. 3.48- Atrophia tubulorum gradus mediocris

Sl. 3.49- Atrophia tubulorum gradus levioris

Sl. 3.50- Sertoly cell syndrom only

Testisi u klasi~nom Klinefelterovom sindromu pokazuju progresivni defekt u spermatogenezi, {to je pra}eno sklerozom tubula i nazna~enim pove}anjem broja Leydigovih }elija. Najranija promena je redukcija spermatogenezne aktivnosti {to dovodi do postepenog i{~ezavanja germinativnih }elija. Vremenom gubitak germinativnih }elija prati atrofija Sertolijevih }elija i zadebljanje tunike proprije. Na kraju i germinativne i Sertolijeve }elije i{~ezavaju, a lumeni bivaju obliterisani zadebljanom, hijalinom tunikom proprijom. Tubuli se na kraju pretvaraju u kolagene trake. Ove promene ne napadaju sve tubule istovremeno u ranim fazama ovog sindroma ve} je zahvatanje parcijalno, tj. fokalno. Me|utim, na kraju ceo testis biva skleroziran. Broj Leydigovih }elija se pove}ava. Ovo pove}anje je prava hiperplazija. Bojenjem na retikulin se vidi da se ne radi o kolapsnoj fuziji ovih }elija. Retikulinska vlakna okruùju svaku Leydigovu }eliju. Elasti~na vlakna su odsutna oko skleroti~nih tubula, {to ukazuje na kongenitalnu prirodu ovog entiteta, jer se peritubularna elasti~na vlakna normalno javljaju u pubertetu. Klini~ki pacijenti sa klasi~nim Klinefelterovim sindromom imaju male i ~vrste testise, slabo razvijene sekundarne seksualne karakteristike i ginekomastiju. Ovi se znaci uglavnom javljaju nakon puberteta kada testisi ne mogu da odgovore na stimulaciju gonadotropinima. Testisi se ne pove}avaju ve} postaju manji i ~vr{}i zbog fibroze i hijalinizacije seminifernih tubula. Funkcija Leydigovih }elija je, tako|e, poreme}ena. Nivo plazma testosterona je nizak, {to je uzrok nerazvijanja sekundarnih seksualnih karakteristika, pa je izgled evnuhoidan.


142

Prisutna je azoospermija. Ako je defekt androgena nagla{en onda je nivo fruktoze nizak. Urinarni gonadotropini su povi{eni i zahvataju FSH - follicle stimulating hormon i LH - luteinizing hormon. êsto je prisutna subnormalna inteligencija. Klasi~ni Klinefelterov sindrom pokazuje XXY hromozomski tip.

na povi{enu temperaturu razvijaju se normalno kao rezultat stimulacije gonadotropinom i nagla{enije. Nekada pokazuju nazna~enu vakuolizaciju citoplazme. Klini~ki pacijenti sa bilateralnim kriptorhizmom u postpubertalnom periodu imaju normalne urinarne 17 ketosteroide i LH - luteinizing hormon, {to ukazuje da je funkcija Leydigovih }elija normalna. Urinarni FSH - follicle stimulating hormon je povi{en, a spermatogeneza odsutna. U slu~ajevima neoperativnog tretmana i intraabdominalnog zadràvanja testisa pove}ava se rizik maligne degeneracije. Smatra se da je relativni rizik 20 – 40 %.

Sl. 3.51- Klinefelter-ov sindrom Fokalna hiperplazija intersticijalnih }elija i hijalinizacija tubula

Cryptorrhismus Kriptorhizam ima brojne uzroke. U nekim slu~ajevima testisi ne silaze u skrotum zbog anomalija ingvinalnog kanala. U drugim slu~ajevima nenapu{tanje ingvinalnog kanala je posledica insuficijentne stimulacije gonadotropinima. Nekada je posledica nasle|enih defekata. Anatomski kriptorhizam se deli na abdominalni i ingvinalni, gornji i donji, jednostrani i obostrani. Od donjeg ingvinalnog kriptorhizma treba razlikovati retraktilni testis. Histolo{ki kriptorhini testisi pokazuju male nezrele tubule sa razli~itim brojem spermatogonija zavisno od duìne zadràvanja u ingvinalnoj ili abdominalnoj poziciji. Nakon puberteta, germinativne }elije u kriptorhinim testisima postepeno i{~ezavaju sve dok kompletno ne i{~eznu, pa su tubuli obloèni jedino Sertolijevim }elijama. Leydigove }elije koje su rezistentnije

Sl. 3.52- Seminoma in situ u kriptorhiznom testisu

Sl. 3.53- Maligne }elije u spermi

143

III Deo: Sterilitet

O{te}enje zra~enjem Zra~enje testisa preko odre|enih doza dovodi do permanentne destrukcije germinativnih }elija. Nasuprot njima Leydigove }elije su relativno rezistentne. Histolo{ki germinativne }elije podleù degeneraciji i dolazi do njihovog gubitka. Tubuli su obloèni Sertolijevim }elijama. Dijametar tubula se smanjuje, a tunika proprija progresivno zadebljava. Vremenom svi tubuli skleroziraju, ali su Leydigove }elije o~uvane. Klini~ki pacijenti su oligospermi~ni, a kasnije azoospermi~ni. Urinarni FSH - follicle stimulating hormon je pove}an zbog gubitka germinativnih }elija, ali po{to su Leydigove }elije intaktne, urinarni 17 ketosteroidi i LH - luteinizing hormon su u granicama normale.

Mumps orchitis Kada se mumps orchitis javi pre puberteta pacijenti se oporavljaju bez posledica. Me|utim, kada infekcija nastane posle puberteta kod jednog broja pacijenata se javljaju promene. U akutnoj fazi mumps orhitisa vidi se edem intersticijuma, mononuklearni i granulocitni infiltrat, degeneracija i lju{tenje germinativnih }elija. Nakon akutne inflamacije razvijaju se hroni~ne promene koje se ispoljavaju kao gubitak germinativnih }elija, hijalinizacija i skleroza seminifernih kanala. Po{to hroni~ne promene progrediraju to se kompletno razaranje zavr{ava za 10 do 20 god-

ina nakon akutne infekcije. Zahvatanje testisa nije uniformno i varira od dela do dela testisa. Leydigove }elije su otpornije na o{te}enje i obi~no su o~uvane. Klini~ki opseg o{te}enja varira, a testisi postaju manji. Pacijenti su prvo oligospermi~ni, a kasnije azoospermi~ni. Urinarni FSH - follicle stimulating hormon je povi{en dok su 17 ketosteroidi i LH - luteinizing hormon normalni.

Hemijski agensi i drugo Od hemijskih agenasa koji dovode do poreme}ene spermatogeneze va`ni su olovo, toksi~ne pare, naro~ito benzina i nekih lekova, kao i povi{ena temperatura i uska ode}a. Poseban efekat imaju varikokele na spermatogenezu. Misli se da se ovaj efekat ostvaruje povi{enjem temperature zbog zastoja krvi, dok neki smatraju da se nagomilavaju toksi~ni metaboliti. Ligiranje spermatocele dovodi do pobolj{anja kod odre|enog procenta mu{karaca. Povi{ena temperatura ima dokazano {tetan efekat na spermatogenezu i ako se skrotum drì u toploj vodi koja ima za 7 stepeni vi{u temperaturu od temperature tela, nakon 10 minuta se javlja aspermija. Isti mehanizam je i u kriptorhinim testisima. Sli~na situacija se vidi i u febrilnim bolestima. Histolo{ki kao posledica hiperpireksije javlja se hipospermatogeneza do kompletnog i{~ezavanja spermatogeneze.


144

Tabela 3-6: Anomalije testikularnih funkcija kod odraslih

Sterilitet sa hipoandrogenizcijom HIPOTALAMO-HIPOFIZNI UZROCI - PANHIPOPITUITARISMUS - IZOLOVANI DEFICIT GINADOTROPINA - CUSHING SINDROM - HYPERPROLACTINEMIA - HEMOCHROMATOSIS

TESTIKULARNI UZROCI RAZVOJNI I STRUKTURNI DEFEKTI - KLINEFELTEROV SINDROM - XX MUŠKARCI

STE~ENI DEFEKTI - VIRUSNI ORHITISI - TRAUMA - ZRA~ENJE - LEKOVI (SPIRONOLAKTON, ALKOHOL, KETOCONAZOL, CIKLOFOSFAMID) - TOKSINI IZ SPOLJNE SREDINE - AUTOIMUNITET - GRANULOMATOZNE BOLESTI - SISTEMSKE BOLESTI - BOLESTI JETRE - BUBRE`NA INSUFICIJENCIJA - ANEMIJA SRPASTIH }ELIJA - NEUROLOŠKE BOLESTI (MIOTONI~NA DISTROFIJA I PARAPLEGIJA) - REZISTENTNOST NA ANDROGENE

TRANSPORT SPERME OPSTRUKCIJA EPIDIDIMISA ILI VAS DEFERENSA (CISTI~NA FIBROZA, DEJSTVO DIETHYLSTILBESTROLA) KONGENITALNO ODSUSTVO.

Sterilitet sa normalnom virilizacijom - IZOLOVANI DEFICIT FSH - KONGENITALNA ADRENALNA HIPOPLAZIJA - HYPERPROLACTINEMIA - UPOTREBA ANDROGENA

APLAZIJA GERMINATIVNIH }ELIJA CRYPTORRHISMUS VARICOCELA SINDROM NEPOKRETNIH CILIJA MYCOPLASMA INFEKCIJA ZRA~ENJE LEKOVI (CICKLOFOSFAMID) TOKSINI SPOLJNE SREDINE AUTOIMUNITET FEBRILNE BOLESTI CELIJAKIJA

NEUROLOŠKE BOLESTI (PARAPLEGIJA) REZISTENCIJA NA ANDROGENE

III Deo: Sterilitet

2.3. POSTTESTIKULARNI UZROCI Posttestikularni uzroci su, uglavnom, opstruktivne prirode i javljaju se u odvodnim kanalima testisa. U ovu grupu spadaju i slu~ajevi sa poreme}enim motilitetom koji je najverovatnije posledica poreme}aja u maturaciji, deponovanju spermatozoida za vreme boravka u epididimisu, ili posledica biohemijskih anomalija u seminalnoj plazmi.

Blok kanalikularnog sistema Opstrukcija moè biti ili kongenitalna ili ste~ena.

a) Kongenitalna opstrukcija Kongenitalna opstrukcija je naj~e{}e posledica atrezije vas deferensa ili epididimisa. Kada je pojava obostrana onda je prisutna azoospermija i sterilitet. Nespajanje vas deferensa i epididimisa je drugi uzrok, ali je to retka pojava.

b) Ste~eni blok Ste~ena opstrukcija je posledica infekcija ili hirur{kog podvezivanja. Naj~e{}a infekcija je gonorea. Opstrukcija se vidi u predelu repa epididima ili u proksimalnom delu vas deferensa. Po{to je ova infekcija obostrana onda, nastaju azoospermija i sterilitet. Drugi uzrok je tuberkuloza koja ~e{to zahvata epididimis. Ona nastaje {irenjem infekcije sa prostate, ili iz seminalnih vezikula i ejakulatornih duktusa. Nespecifi~ne gnojne infekcije koje su posledica {irenja gnojnog prostatitisa tako|e dovode do opstrukcije izvodnih kanala. Hirur{ka okluzija moè da se javi akcidentno, ili zbog èljenog podvezivanja u

145

cilju kontrole nataliteta. Ove opstrukcije nemaju {tetan efekat na germinativni epitel i Leydigove }elije, ako se nije razvio orchitis. O~uvanost germinativnog epitela je posledica ~injenice da epididimis u infekciji postaje pove}an i akomodira se na situaciju, a prispele germinativne }elije razara i fagocitira i resorbuje raspadne produkte. Klini~ki tubuli epididimisa su dilatirani proksimalno od opstrukcije. U seminifernim tubulima se vidi blaga dilatacija i hipospermatogeneza {to je posledica atrofije usled pritiska.

Poreme}en motilitet spermatozoida Poreme}en motilitet spermatozoida je ~esto pra}en oligospermijom. Termin poreme}en motilitet se odnosi na one slu~ajeve gde je broj spermatozoida adekvatan, biopsija testisa normalna, a poreme}en je motilitet spermatozoida u spermi. Ovaj fenomen se naziva necrospermia. Misli se da su ti slu~ajevi posledica pogre{ne maturacije, ili deponovanja spermatozoida u epididimisu, ili pak posledica biohemijskih anomalija u plazmi sperme koja se najve}im delom stvara u prostati i seminalnim vezikulama. Diskineti~ni cilijarni sindrom, poznat i kao imotil cilia syndrom, podrazumeva razne ultrastrukturne anomalije koje se vide u aksonemama spermatozoida. Ultrastrukturna kvantitativna studija humanih spermatidnih flagela sa poreme}enim motilitetom ukazuje na gubitak jednog ili vi{e mikrotubularnih dubleta u 43% slu~ajeva. Aksonemalne abnormalnosti podrazumevaju izostanak, ili poreme}en raspored mikrotubularnih dubleta u aksonemalnom omota~u i opisuju se u nazalnim cilijama, flagelama spermatozoida i kod nekih osoba sa retinitis pigmentosa. Spermatozoidi kod

146


ovih pacijenata pokazuju poreme}en motilitet. Bez obzira na tip, opstrukcija nema {tetnog efekta na germinativni epitel, ili na Leydigove }elije. Ako do|e do ligiranja vaskulature onda nastaju promene u germinativnom epitelu. Opstrukcija se tretira hirur{kom korekcijom. Korekcija uro|enih opstrukcija je uglavnom bezuspe{na, dok je korekcija ligiranja, ili ste~enih opstrukcija uspe{nija.

Hlamidije, Mikoplazma, Ureaplazma Hlamidia trahomatis, Micoplasma hominis i Ureaplasma urealyticum mogu da promene direktno funkciju spermatozoida.

2.4. INFEKCIJE KOD MU[KARCA I NJIHOV ZNAÂJ ZA STERILITET Bakteriospermije Bakterijski uzro~nici iz ejakulata ne samo da mogu da se prenesu, ve} i da kroz infekciju in vitro kulture ugroze uspeh ART - assisted reproductive technology terapije. Kod leukocitospermije treba identifikovati bakterije i uraditi obavezno antibiogram. Izrazita bakteriospermija postoji, kada se po ml ejakulata dokaè vi{e od 10 3 KbE - }elija koje formiraju koloniju i kada je kultura nastala u toku maksimalno tri sata. Pri tom je naj~e{}e u pitanju enterobakterija. Dokaz nepatogenih klica dermalne i perinealne flore; staphylococcus epidermidis, streptokoka ili druge, ukazuje na kontaminaciju i treba da bude povod za kontrolni pregled. Ako standardne metode kultura ne dovedu do identifikacije klica, trebalo bi da se urade pregledi na ureaplazmu i klamidije. Izrazite bakteriospermije kao izraz infekcije puteva sperme se le~e antibioticima po antibiogramu do kontrolnog negativnog brisa pre po~etka bilo kakve procedure programa ART- assisted reproductive technology.

Sl. 3.54- Micoplasma hominis

Navedeni mikroorganizmi deluju na funkcionalni integritet spermatozoida.

Sl. 3.55- Ureaplasma urealyticum

Hlamidija ima visoku prevalencu. Klica moè da se dokaè u ejakulatu do 5% kod svih 15 -29 - godi{njaka.

Gonokoke, Treponema pallidum U ejakulatu mogu da se na|u i Neisseria gonorrhoeae i Treponema pallidum. @ena je redovno izloèna spektru klica svog partnera.

147

III Deo: Sterilitet

Kako nisu dokazana negativna dejstva na procenat uspeha programa asistirane reprodukcije, nije obavezan screening na gonoreju ili na lues kod asimptomatskih mu{karaca. U po~etnoj fazi dolazi do prostatitisa, sa mogu}no{}u preno{enja upale na glandulu veziculozu. Na kraju moè da do|e do epididimitisa sa trajnom neplodno{}u.

Virusi Za vreme akutne virusne infekcije organizma i u ejakulatu moè da se dokaè prisustvo virusa. Za reproduktivnu medicinu relevantni su, pre svega, uzro~nici hroni~nih infekcija. Tu se ubrajaju posebno HBV hepatitis B virus, HCV- hepatitis C, HIV human imunodeficijentni virus, HPV - humanes papilloma virus i CMV-citomegalo virus.

Hepatitis B - HBV Kao {to je napred navedeno screening hepatitisa B se sprovodi odre|ivanjem Hbs-Ag. Virus se nalazi u slobodnom obliku u semenoj plazmi. Integrisani HBVhepatitis B genom moè da se dokaè u leukocitima i spermatozoidima. Ova integracija se obja{njava obrnutom transkriptaznom aktivno{}u virusne DNK - deoksiribonukleinske kiseline polimeraze. Hipoteza o vertikalnoj transmisiji putem germinalne linije traì nova istraìvanja. Integrisani HBV - hepatitis B u leukocitima se zna~ajno elimini{e u postupku pripreme sperme, ali penetracijom zaraènih spermatozoida moè da do|e do infekcije fetusa. U literaturi nema izve{taja o slu~aju paterno-fetalnih infekcija u postupku asistirane reprodukcije, ali su opisani slu~ajevi konatalnih infekcija dece iz spontanih trudno}a kod Hbs-Ag negativnih

majki. Ukoliko ve} nije inficirana visoko kontamiranim virusom, partnerka moè pouzdano da bude za{ti}ena aktivnom imunizacijom. Kada titar dostigne nivo od 10 ml U/ml, ona je za{ti}ena i moè da bude podvrgnuta postupku IVF - in vitro fertilisation.

HCV Hepatitis C Efikasna HCV- hepatitis C vakcina ne}e biti na raspolaganju u bliskoj budu}nosti zbog izraènih mutacija pojedina~nih genotipova i subtipova. U slu~ajevima prisustva virusa u ejakulatu u koncentraciji od 50 do 200 ekvivalenta genoma po ml je te{ko sa sigurno{}u dokazivanje virusa tehnikama amplifikacije genoma, pa je stopa detekcije virusa u spermi viremi~nih mu{karaca u literaturi opisana u procentima od 5 do 57%. Virus moè da se dokaè jedino u semenoj plazmi i u okruglim }elijama, ali ne na spermatozoidima, ili u njima. Va`no je naglasiti da virusi mogu pouzdano da se izdvoje i neutrali{e mogu}nost preno{enja, sekvencijalnom pripremom sperme pomo}u gradijentne separacije centrifugiranjem i swim-up metodom. U programu ART – assisted reproductive technology redukuje se ionako niska stopa horizontalne transmisije, koja u dugogodi{njim monogamnim partnerskim vezama iznosi samo oko 2,5% . Preno{enje infekcije sa mu{karca je malo verovatno, ali ne moè u potpunosti da se isklju~i. Kod serolo{kog dokazivanja anti HCV - hepatitis C kod mu{kog partnera negativan rezultat nije siguran dokaz, jer u dana{nje vreme nije prona|en nijedan visoko senzitivni sistem dokazivanja za HCV - hepatitis C na spermatozoidima. Alternativno bi trebalo da se provere hepatolo{ke terapijske opcije za eliminaciju

148


virusa sa pegyliertem a-interferonom i Ribavirinom.

HIV - human imunodeficijentni virus Poslednjih godina kod obolelih osoba je podrobno ispitano prisustvo HIV - human imunodeficijentnog virusa u ejakulatu. Postoji saglasnost o tome, da u frakciji okruglih }elija moè da se dokaè proviralni DNK - deoksiribonukleinska kiselina i viralni RNK - ribonukleinska kiselina u semenoj plazmi. Da li i frakcija spermatozoida moè da pokaè viralni genom, odnosno progenom, nije jo{ dokazano, kao i odgovor na pitanje, da li virus u in vitro uslovima vantelesne oplodnje moè da se veè za spermatozoide i da prodre u oocit. Pri izolovanom ispitivanju pokretljivih, vitalnih spermatozoida kod HIV - human imunodeficijentnog virusa obolelih, uz primenu razli~itih elektronsko-opti~kih i molekularno-biolo{kih metoda, do sada nije dokazano prisustvo ni elementarnog dela virusa, a ni genoma virusa. Klonalna infekcija }elija spermatogeneze je mogu}a, ali ne kod pokretljivih spermatozoida. Po{to je u HIV - human imunodeficijentnog virusa partnerskim vezama, gde je inficiran samo jedan partner, radi za{tite zdravog partnera obavezan coitus condomatus, u ovoj situaciji èlja za detetom moè da se interpretira kao poseban oblik androlo{ki uslovljenog steriliteta. Ovim parovima moè se pod definisanim uslovima ponuditi ART - assisted reproductive technology sa pripremljenim, pokretljivim spermatozoidima, koji nisu nosioci virusa. Osim toga, pripremljeni spermatozoidi moraju da se testiraju neposredno pre primene, radi isklju~ivanja virusne kontaminacije amplifikacijom gena.

Do danas, posle vi{e od desetogodi{nje primene ove metode, nisu zabeleène infekcije majke ili deteta.

Papilloma virus, herpes virus i cytomegalo virus Kao DNK - deoksiribonukleinske kiseline virusi HPV – human papiloma virus i CMV – citomegalo virus mogu svoj genom da integri{u u humani DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu.

Sl. 3.56- HPV - humani papilloma virus

Prisustvo odgovaraju}ih sekvenci je dokazano u spermatozoidima inficiranih mu{karaca, {to dozvoljava mogu}nost pojavljivanja paterno-fetalne infekcije embriona. U literaturi nema dokaza za to, kao i opisa mogu}ih klini~kih slika. Rutinsko dokazivanje HSV - herpes simplex virus i CMV - citomegalo virus u fazi pripreme je diskutabilno, jer protiv navedenih uzro~nika nisu na raspolaganju ni etablirane terapije eliminacije, a ni prevencija vakcinacijom, tako da pozitivan nalaz screeninga ostaje bez terapijske konsekvence. U homolognom sistemu se u ovom trenutku stoga ne preporu~uje generalni screening infekcije na HPV - humani papilloma virus, HSV - herpes simplex virus i CMV - citomegalo virus.

III Deo: Sterilitet

Postupci asistirane reprodukcije skrivaju potencijalni rizik, da se pacijentkinji, ili ro|enom detetu, ali i osoblju koje radi u laboratoriji, prenesu neki od navedenih virusa. Da bi se ovi rizici spre~ili, moraju da budu poznati potencijalni putevi infekcije i da se izrade standardi za prevenciju od infekcije. Preporuke u uputstvima za rad i

149

njihova kontrola, ali posebno savetovanje bra~nih parova o individualnim konstelacijama rizika, su u odgovornosti ordiniraju}ih lekara koji se bave reprodukcijom. Kao osnova za ovo treba da sluè postoje}e preporuke, koje reflektuju aktuelno infektolo{ko stanje znanja u reproduktivnoj medicini.


150

3. DIJAGNOSTIKA STERILITETA Postavljanje dijagnoze je prvi korak u le~enju steriliteta. Ukoliko se dijagnostika ne uradi kompletno, kompromituju se svi naredni postupci u le~enju. Ispitivanje bra~nog para je kao {to je ve} re~eno nedeljiva celina, zna~i istovremeno se rade osnovni pregledi oba partnera.

3.1. DIJAGNOSTIKA KOD @ENE Dijagnostika neplodnosti kod ène podrazumeva specificne dijagnosti~ke metode za ovu oblast, i to: - ultrazvu~ni pregled - histerosalpingogram - histerosalpingosonografija - hysteroskopija - laparoskopija Sve ove dijagnosti~ke metode se primenjuju ve} dugo u dijagnostici steriliteta tako da je nepotrebno obja{njavati osnovne tehnike i primene. Ono {to je primarno je rezimirati procenat ta~nosti i odre|ivanje mesta u dijagnostici steriliteta kod ène, histerosalpingografije, histerosalpingosonografije i laparoskopije. Pregledom literature dobijeni su slede}i podaci:

Histerosalpingosonografska dijagnoza jajovodi prohodni, ta~na je u oko 85% slu~ajeva - jajovodi obturirani, ta~na u oko 50% slu~ajeva, sa ve}om precizno{}u kod terminalnih obturacija u odnosu na proksimalne. Podaci o ostalim nalazima u maloj karlici, na primer prisustvo adhezija, endometrioze, peritonealnih promena, nije bilo mogu}e ta~no dijagnostikovati.

3.1.1. Trodimenzionalna transvaginalna sonografija u reproduktivnoj medicini Osnovne primene trodimenzionalne sonografije uklju~uju procenu materi~nih anomalija, intrauterine patologije, tubarne prolaznosti, dijagnostiku policisti~nih jajnika, pra}enje ovarijalne aktivnosti i endometrijalne receptivnosti. Tako|e je va`na dijagnostika ektopi~ne trudno}e. Trodimenzionalna kolor dopler sonografija pruà va`ne podatke o uterinoj, endometrijalnoj i ovarijalnoj vaskularnosti. Konvencionalna sonografija pruà dvodimenzionalni nalaz trodimenzionalnih struktura koji mora dinami~ki da se pregleda da bi se kreirala trodimenzionalna predstava organa. Nasuprot ovome, trodimenzionalna sonografija dozvoljava istovremenu

III Deo: Sterilitet

procenu sekcionih ravni koje se u zavisnosti od odre|enog polja interesa, pregledaju na jedan od nekoliko razli~itih modaliteta posmatranja u cilju maksimizovanja dostupnih informacija i pobolj{anja utiska prostora. Trodimenzionalna sonografija na jedinstven na~in dozvoljava prikaz koronalne ravni normalne na lice transdjusera olak{avaju}i prepoznavanje povr{inskih neregularnosti koje se mogu uzeti u obzir tokom merenja volumena. Digitalna tehnologija omogu}ava trodimenzionalno snimljenim slikama kori{}enje u telemedicini, jer dozvoljava memorisanje velikih nizova podataka, bez gubitka informacija, koji se kasnije mogu analizirati off-line i proceniti od strane stru~njaka u virtuelnom konsultovanju u realnom vremenu. Dvodimenzionalna kolor dopler sonografija pruà subjektivnu procenu uterine i ovarijalne vaskularnosti. Ona je ograni~ena pruànjem opisa u jednoj ravni naspram uzorka volumena koji se dobija trodimenzionalnim prikazom. Trodimenzionalna sonografija pruà slede}e prednosti u pore|enju sa dvodimenzionalnom: - Precizno merenje dimenzija organa i volumena, - Pobolj{ane informacije o anatomiji i protoku krvi, - Pobolj{ana procena sloènih anatomskih anomalija, - Bolja specifi~nost u pogledu potvrde normalnosti, - Standardizacija procedure sonografskog pregleda, - Smanjeno vreme pregleda efikasnom upotrebom opreme i vremena, - Telemedicinske i tercijarne konsultacije.

151

Analiza trodimenzionalnih podataka Kod trodimenzionalnog prikaza slike u pogledu sposobnosti merenja, najo~igledniji parametar koji se posmatra je volumen. Iako se zapremina moè proceniti iz merenja napravljenih konvencionalnom dvodimenzionalnom sonografijom, takva merenja koriste razne formule zasnovane na izvesnim geometrijskim pretpostavkama. Procena volumena zasnovana na trodimenzionalnoj sonografiji jo{ uvek uklju~uje izvestan stepen geometrijskih pretpostavki, jer se podaci rekonstrui{u na osnovu njihove najverovatnije pozicije unutar Dekartovog sistema, ali koristi mnogo vi{e informacija. Postoje dva osnovna metoda koji se koriste za izra~unavanje volumena iz trodimenzionalnog niza podataka: konvencionalni planarni ili konturni metod i nedavno predstavljeni rotacioni metod koji je mogu} pomo}u programa VOCAL - virtual organ computer-aided analysis (analiza virtuelnih organa uz pomo} ra~unara) koji, tako|e, generi{e trodimenzionalni model objekta od interesa. Izra~unavanje volumena bilo kojom od ovih tehnika se pokazalo veoma pouzdanim i validnim, kako in vitro tako i in vivo. Obe tehnike uklju~uju manuelno crtanje organa na multiplanarnom displeju koji prikazuje tri me|usobno normalne ravni karakteristi~ne za trodimenzionalnu sonografiju. Postoje i druge prednosti rotacione tehnike u pogledu olak{avanja procene protoka krvi na nov na~in, putem kvantifikacije signala doplera unutar definisanog volumena i okolnog tkiva, kroz primenu forme koja je paralelna sa originalno definisanom konturom povr{ine. Izra~unavaju se tri indeksa vaskularnosti:

152


VI - vaskularizacioni indeks, odraàva odnos informacija sa doplera unutar ukupnih podataka u odnosu na kolor i sive informacije, FI - flow index, indeks protoka koji predstavlja srednju vrednost intenziteta doplerovog signala, i VFI - vascularisation flow index, indeks vaskularizacionog protoka koji predstavlja kombinaciju prethodna dva. Ta~na veza ovih indeksa sa stvarnim protokom i vaskularno{}u in vivo tek treba da se utvrdi, ali se pokazalo da su promenljivi, kako unutar pojedina~nih tako i me|u razli~itim subjektima, {to govori da mogu imati veoma va`nu ulogu u identifikovanju i kategorizaciji razlika me|u grupama pacijenata. Veoma je va`no da se indeksi mogu izra~unati na na~in koji se moè reprodukovati nakon pribavljanja trodimenzionalnih podataka sa doplera {to se pokazalo pouzdanim.

Klini~ke primene trodimenzionalne sonografije u sterilitetu Opisane osobine i prednosti trodimenzionalne sonografije u pogledu sposobnosti merenja i pobolj{ane prostorne percepcije primenjene su u dijagnostici subfertiliteta i u kasnijem nadgledanju tretmana.

Ispitivanje steriliteta Trodimenzionalni ultrazvuk se koristi za dijagnostikovanje materi~nih anomalija, procenu tubarne prolaznosti i isklju~enje intrauterine i ovarijalne patologije.

Anomalije uterusa Kongenitalne anomalije uterusa se dovode u vezu sa povi{enim rizikom od ponovljenog poba~aja u prvom i tre}em tromese~ju i preranim poro|ajem. Metaanaliza objavljenih retrospektivnih podata-

ka upore|enja ishoda trudno}a pre i posle histeroskopske septoplastike je pokazala primetno pobolja{nje nakon operacije. Precizna i pouzdana dijagnoza je va`na, jer dozvoljava identifikaciju pacijenata izloènih riziku od ovih komplikacija i pravovremenu hirur{ku intervenciju. Nesumnjivo je da je ovo podru~je na kome je trodimenzionalna sonografija najvi{e doprinela i postala prva linija ispitivanja u centrima u kojima je na raspolaganju. Ovo odraàva njenu sposobnost da istovremeno prikaè endometrijalnu {upljinu i miometrijum u koronalnoj ravni. Po postoje}im statisti~kim podacima do 24% èna sa ponovljenim gubitkom trudno}e moè imati materi~ne anomalije, {to je pet puta ve}i broj u odnosu na kontrolnu grupu. U pogledu tipa anomalije naj~e{}a je uterus arcuatus, zatim sledi subseptalna i bikornualna materica sa sloènijim anomalijama kao {to je uterus didelphys, dok je unikornualna materica najre|a. @ene sa subseptalnom matericom imaju zna~ajno ve}i udeo poba~aja u prvom tromese~ju, a ène sa uterus arcuatis-om zna~ajno ve}i udeo poba~aja u drugom tromese~ju i u prevremenom poro|aju u pore|enju sa ènama koje imaju normalnu matericu. U ura|enim studijama se pokazalo da je ishod povezan sa stepenom defekta i duìnom {upljine, koja je zna~ajno manja kod uterus arcuatis-a i subseptalne materice èna sa ponovljenim poba~ajem. Upotrebljene tehnike merenja i klasifikacije dozvoljavaju pore|enje me|u studijama u skladu sa upotrebljenim stepenom standardizacije, na osnovu merenja distorzije fundusa od sredi{ne ta~ke imaginarne horizontalne linije koja spaja gornje aspekte kornuata sa gornjim aspektom materi~ne {upljine. Trodimenzionalna sonografija nudi

153

III Deo: Sterilitet

pouzdan i standardizovan metod dijagnostikovanja, razlikovanja i kvantifikovanja materi~nih anomalija. Trodimenzionalna sonografija je zna~ajno doprinela na{em razumevanju materi~nih anomalija kvalifikuju}i njihov uticaj na reproduktivni ishod.

Intrauterina patologija La Tore je uporedio trodimenzionalnu sonografiju sa konvencionalnim na~inima vizuelizacije sa i bez kontrasta. Standardna dvodimenzionalna sonografija je pokazala relativno lo{u specifi~nost od samo 69,5 % ta~nosti. Pobolj{ano je na 94,1% kada je dvodimenzionalna sonografija kori{}ena u kombinaciji sa salinskom infuzijom. Trodimenzionalna sonografija se pokazala skoro jednako dobro i dijagnostikovala je prisustvo polipa sa ta~no{}u od 88,8% i kasnije je ta~no identifikovala kompletnu intrauterinu patologiju kada je kori{}ena u kombinaciji sa salinskom infuzijom.

Prolaznost tuba Kombinacija kontrastnih medijuma i trodimenzionalne sonografije je tako|e kori{}ena za procenu tubalne prohodnosti. Trodimenzionalna salinska sonohisterosalpingografija na osnovu dosada{njih studija prikazuje ~itavu konturu uterinske {upljine kod 96% slu~ajeva, u pore|enju sa samo 64% pomo}u konvencionalne rentgenske histerosalpingografije, pa je ona dovedena u vezu sa pozitivnom prediktivnom vredno{}u i specifi~no{}u predvi|anja tubarne prolaznosti od 100% kod nasumi~no odabranih neplodnih pacijenata. Potvr|eno je da trodimenzionalno prikazivanje slike doplerom pokazuje slobodnu te~nost skoro dvostruko ~e{}e od konvencionalnog na~ina kada se koristi tokom histerosalpingosonografije.

U nekim drugim studijama, kao kod Sankpal-a objavljeni su manje obe}avaju}i rezultati iste tehnike pri proceni tubarne prolaznosti.

Policisti~ni jajnici Nekoliko grupa je koristilo trodimenzionalnu sonografiju da prikaè ovarijalni volumen i vaskularnost koji su pove}ani kod sindroma policisti~nih jajnika. Trodimenzionalna sonografija, tako|e, dozvoljava merenje stromalnog volumena putem izra~unavanja i oduzimanja ukupnog folikularnog volumena od ovarijalnog volumena. Koriste}i ovu tehniku, KyeiMensah je pokazao da je stromalni volumen u pozitivnoj korelaciji sa koncentracijama serumskog androstenediona kod èna sa klini~kim dokazima policisti~nih jajnika. Me|utim, koriste}i sli~an pristup, Nardo nije mogao da utvrdi vezu izme|u serumskog FSH - follicle stimulating hormona, LH - luteinizing hormona, ili testosterona i ovarijalnog stromalnog volumena kod neplodnih èna sa PCOS - polycystic ovarian syndrome rezistentnim na klomifen-citrat u istoj fazi menstrualnog ciklusa.

Tretman asistirane reprodukcije Transvaginalna sonografija se koristi za svakodnevnu folikulometriju, transvaginalnu punkciju i kasniji transcervikalni transfer embriona. Trodimenzionalna sonografija se koristi, posebno, kao prediktor odgovora ovarijuma i kao determinanta endometrijalne receptivnosti. Va`no je ista}i bolju rezoluciju slike u odnosu na standardne aparate, {to je od posebnog zna~aja zbog preciznosti merenja razli~itih parametara u toku programa asistirane reproduktivne tehnologije.

154


Trodimenzionalni markeri odre|ivanja ovarijalne rezerve Od sonografskih markera koji su ozna~eni kao prediktivni za odre|ivanje ovarijalne rezerve, tri markera su pod posebnom pa`njom studija trodimenzionalne sonografije, i to: broj antralnih folikula, ovarijalni volumen i ovarijalni protok krvi. Pelicer je bio me|u prvima koji su koristili trodimenzionalnu sonografiju kao dopunu konvencionalnim markerima ovarijalne rezerve. O ovim parametrima }e biti posebno re~i kasnije u poglavlju o proceni ovarijalne rezerve.

Trodimenzionalni markeri endometrijalne receptivnosti Merenja endometrijalne debljine i volumena na dan punkcije folikula i dobijanja oocita pokazala su da nije bilo zna~ajnih razlika izme|u pacijentkinja koje su za~ele i èna koje nisu zatrudnele, u pogledu srednje endometrijalne debljine (10,8 ± 2,3 mm naspram 11,8 ± 3,4 mm), ili volumena (4,9 ± 2,2 cm3 naspram 5,8 ± 3,4 cm3). Raga je, mere}i grani~nu vrednost endometrijalnog volumena pacijenata na dan transfera embriona, u svojoj studiji objavio da je broj implantacija bio zna~ajno niì kod onih èna kod kojih je endometrijum manji od 2 cm3 a nijedna trudno}a nije zabeleèna pri volumenu manjem od 1 cm3. Konvencionalno merenje endometrijalne debljine ve} ima sli~nu negativnu prediktivnu vrednost, jer se pokazalo da je za~e}e manje verovatno kod pacijenata kod kojih je endometrijum manji od 5 mm u pre~niku. Procena prediktivne informacije u vreme transfera embriona kada se trodimenzionalni dopler koristi da kvantifikuje

endometrijalnu vaskularnost je pokazala da su uspe{ni ciklusi za~e}a povezani sa zna~ajno ve}im endometrijalnim indeksom protoka. Subendometrijalni vaskularizacioni indeks protoka VFI - vascularisation flow index se pokazao kao najbolji prediktor za~e}a, jer je superiorniji od vaskularizacionog indeksa VI - vascularisation index, indeksa protoka FI - flow index i endometrijanog volumena u analizi krive radnih karakteristika primaoca. Trodimenzionalna sonografija se moè koristiti za pregled endometrijalne vaskularnosti i odre|ivanje endometrijalne receptivnosti pre stimulacije jajnika. Postoji dovoljno dokaza koji podupiru mi{ljenje da su teorijske prednosti trodimenzionalne sonografije prevedene u klini~ku praksu na polju reproduktivne medicine. Prostorna orijentacija i dodatne informacije koje se mogu dobiti iz pojedina~nih sekcionih ravni su veoma pobolj{ale na{e znanje o anomalijama uterus-a i doprinele razumevanju uticaja ovih anomalija na ishod trudno}e. Kvantitativna trodimenzionalna analiza volumena i vaskularnosti se pokazala manje preciznom u klini~koj praksi. Uloga trodimenzionalne sonografije se jo{ uvek istraùje u oblastima normalne fiziologije i kod patofiziolo{kih promena.

3.1.2. Histerosalpingografija HSG - histerosalpingogram je rentgenska procedura koja se obavlja radi utvr|ivanja da li su Falopijeve tube prolazne i da se vidi da li je oblik {upljine materice normalan, sa ta~no{}u nalaza prohodnosti tuba u oko 90% slu~ajeva. Ono

155

III Deo: Sterilitet

{to je nedostupno ovoj metodi su ostali podaci o stanju u maloj karlici, prisustvo adhezija ili endometrioze. U preoperativnoj pripremi za operativnu korekciju anomalija uterusa histerosalpingografija je neophodna radi procene operativne tehnike i pristupa.

Krvarenje se obi~no javlja u prvom ili drugom danu nakon HSG – histerosalpingograma kao posledica traume u toku intervencije.

Sl. 3.57- Kanila kroz koju se ubrizgava boja

HSG - histerosalpingogram se smatra veoma bezbednom procedurom. Komplikacije se javljaju u manje od 1% slu~ajeva. Naj~e{}i ozbiljan problem sa HSG - histerosalpingogramom je pelvi~na infekcija. Ovo se obi~no de{ava u prisustvu prethodne tubarne bolesti. U retkim slu~ajevima infekcija moè o{tetiti Falopijeve tube. Izlaganje zra~enju je veoma nisko, manje nego kod pregleda bubrega, ili stomaka i nije bilo negativnih efekata od ovog zra~enja, ~ak i ako do|e do za~e}a tokom istog meseca. HSG – histerosalpingogram ne treba obaviti ako se sumnja na trudno}u. Retki su slu~ajevi kada pacijent moè imati alergijsku reakciju na jodni kontrast koji se koristi kod HSG - histerosalpingograma. Pacijenti koji su alergi~ni na jod mogu da urade sonohisterogram po{to ta procedura koristi te~nosti koje ne sadrè jod. Sonohiste rogrami daju dobre podatke o {upljini uterusa, a ograni~ene o Falopijevim tubama.

Sl. 3.58- Hysterosalpingogram

3.1.3. Laparoskopija Laparoskopija je najpreciznija dijagnosti~ka metoda u oblasti steriliteta. Uzimaju}i u obzir izuzetno male rizike i komplikacije, ova metoda se primenjuje u ve}ini centara koji se posebno bave problemima steriliteta. Dana{nji stav je da se pacijent ne moè smatrati potpuno ispitanim i pripremljenim za po~etak terapije bez laparoskopske dijagnostike.

Sl. 3.59- Normalan laparoskopski nalaz

156


Preventiva povreda Pribli`no polovina svih komplikacija laparoskopske metode se javljaju tokom aplikacije instrumenata, pa je va`na primena bezbedne tehnike. U ve}ini slu~aja se koristi pneumoperitoneum pre ubacivanja primarnog troakara. Druga mogu}nost je otvoreni laparoskopski pristup, ili Hason-ova tehnika. Ne postoje ubedljivi dokazi da je jedan pristup bolji od drugog. Preventivne mere koje se primenjuju radi izbegavanja mogu}ih povreda su slede}e:

Pozicija pacijenta: operacioni sto treba da bude ravan, bez naginjanja glave sve dok se troakar ne uvede u abdominalnu {upljinu. Ako je pacijent suvi{e rano stavljen u Trendelerburgov poloàj, moè do}i do nepravilnog poloàja lumbalnog dela ki~me sto dovodi velike krvne sudove bliè umbilikusu ~ime se pove}ava rizik od povrede Veresovom kanilom, ili troakarom. Veresova kanila i troakar treba da budu uvedeni pod uglom od 45° u odnosu na sakrum, ali ne previ{e vertikalno. Na ovaj na~in se izbegava povreda u srednjoj liniji velikih krvnih sudova, aorte i vene kave. Veresova kanila i troakar moraju da budu uvedeni du` sredi{ne linije: ne sme se dozvoliti da igla ode u stranu, jer to sa sobom nosi opasnost povrede ilija~nih sudova. Kod gojaznih pacijenata treba koristiti dovoljno duga~ku Veresovu kanilu ili troakar. Ako je neophodno, instrumenti treba da budu uvedeni kroz umbilikus, umesto tradicionalnim subumbilikalnim putem. Prilikom ubacivanja Veresove kanile proveriti da ne izlazi krv, {to bi zna~ilo da je u nekom krvnom sudu. Pre spajanja Veres kanile sa sistemom za ugljen dioksid potrebno je izbaciti iz cevi sav atmosferski vazduh. Zapremina

vazduha u cevi moè biti preko 100 ml. Ovo je neophodno iz dva razloga. Prvo, embolija ugljen dioksidom je manje opasna od embolije vazduhom i drugo, kako je vazduh manje resorptibilan od ugljen dioksida, duè }e ostati u peritonealnoj {upljini sa ve}om iritacijom dijafragme i postoperativnim bolom u ramenu. Pritisak insuflacije treba da bude manji od 15 mm Hg, izmedju 10 do 12 mm Hg. Nizak pritisak insuflacije manje naru{ava vensku cirkulaciju smanjuju}i rizik venske tromboze, jer je pritisak u ilija~noj veni <10 mm Hg. Ako je igla perforirala u ilija~nu venu, onemogu}ava se gasna embolija. Postoji nekoliko metoda za proveru pravilne aplikacije Veresove kanile u peritonealnu {upljinu, kao test aspiracije. Danas retko koristimo ove testove, pa se umesto njih oslanjamo na pra}enje pritiska i protoka. Kada je pritisak insuflacije pode{en na 10 do 12 mm Hg, a protok gasa na ve}u brzinu, ako je Veresova kanila pravilno postavljena, protok treba pribli`no da iznosi 2 L/min, a pritisak insuflacije 8 do 10 mm Hg. Ako je protok manji od 1 L/min, Veresova kanila je mo`da pogre{no postavljena. Kada se uvede laparoskop uradi se pa`ljiv pregled abdomena, uklju~uju}i i gornju abdominalnu {upljinu. Kada je potvr|eno da se laparoskop nalazi u peritonealnoj {upljini pacijent se tek onda poloì glavom naniè da bi se olak{ao pregled pelvi~nih organa. Uvo|enje sekundarnih troakara je pod vizuelnom kontrolom. Lokalizacija povr{inskih epigastri~nih krvnih sudova treba da bude proverena transiluminacijom abdominalnog zida pomo}u svetla koje dolazi sa vrha laparoskopa. Lokalizacija inferiornih epigastri~nih sudova se identifikuje vizuelnim pregledom.

157

III Deo: Sterilitet

Komplikacije laparoskopije Dok operativna laparoskopija postaje sve {ire prihva}ena, razvijaju se nove tehnike i sve ve}i broj hirurga usvaja ovaj tip terapije, pa se moè o~ekivati da }e broj komplikacija po~eti da raste. Frekventnost pojavljivanja komplikacija je 1,1% do 5,2% kod manjih procedura i 2,5% do 6% kod velikih. Sve vi{e je o~igledno da, u cilju smanjivanja broja komplikacija, programi obuke moraju uklju~ivati nadgledanje na svim nivoima razvoja i mora postojati vi{i stepen svesti o potencijalnim rizicima laparoskopske hirurgije. Komplikacije u toku laparoskopije se mogu dovesti u vezu sa: 1. Anestezijom, 2. Indukcijom pneumoperitoneuma, 3. Uvo|enjem primarnih i sekundarnih troakara, 4. Termalnim instrumentima, 5. Mehani~kim instrumentima, 6. Drugim okolnostima.

Komplikacije anestezije Komplikacije koje se mogu direktno pripisati op{tem anestetiku se ne razlikuju od onih koje se mogu pojaviti kada se obavlja bilo koji drugi tip operacije. Neke osobine laparoskopske hirurgije imaju predispozicije prema specifi~nim anestetskim komplikacijama. Upotreba Trendelenburgove pozicije i distenzija abdomena mogu smanjiti ekskurziju dijafragme. Ugljen-dioksid se moè apsorbovati naro~ito tokom produènih operacija. Nadgledanje oksimetrijom pulsa, upotreba endotrahealne intubacije i asistirana ventilacija pozitivnim pritiskom smanjuju rizik od hiperkarbije na minimum. Ako do|e do aritmije, anesteziolog }e biti odgovoran za njenu kontrolu i on

ima slobodu da naredi hirurgu da pacijenta vrati u po~etni poloàj, evakui{e pneumoperitoneum i prekine operaciju. Vazovagalni refleks moè da izazove {ok i kolaps, naro~ito ako anestezija nije dovoljno duboka. I ovo se moè spre~iti efikasnom anestezijom i isklju~enjem ostalih uzroka {oka.

Uvo|enje kanile i troakara Neke od najozbiljnijih povreda koje se javljaju tokom laparoskopije su izazvane ubacivanjem kanile i troakara. Plasiranje kanile se obavlja naslepo. Izazivanje povreda primarnim troakarom je sli~no onima izazvanim Veresovom kanilom, ali je nivo povrede ve}i. 1. Povreda krvnih sudova abdominalnog zida Povr{insko krvarenje iz reza retko kada zabrinjava i uvek se zaustavlja kompresijom. Krvarenje usled povredjivanja duboke inferiorne epigastri~ne arterije je ozbiljnije. Arterija je izloèna riziku tokom ubacivanja sekundarnih troakara. Ovo se kod mr{avog pacijenata spre~ava osvetljavanjem abdominalnog zida pre ubacivanja, ili laparoskopskom vizuelizacijom arterije i njenog lateralnog dela prema umbilikalnoj arteriji. Dijagnoza se postavlja lociranjem mesta krvarenja. Pojava velikog hematoma na abdominalnom zidu ukazuje na povredu duboke inferior epigastri~ne arterije. Tretman je rutiniran. Troakar se ostavlja in situ da bi posluìo kao marker. Folijev kateter gurnut niz kanilu i napumpan moè da posluì za kompresiju mesta krvarenja. Ukoliko se ne zaustavi krvarenje, rez treba pove}ati na 2 cm duìne da bi se oslobodio prednji omota~ rektusa. Iglom se prodje ~itavom debljinom abdominalnog zida do peritoneuma pod laparoskopskom kontrolom.

158


^vor se vezuje na povr{ini ispod koè, jer ostavlja manji oìljak i manje je bolno u postoperativnom toku. Kada primarna ligatura nije efikasna neophodno je pro{iriti ranu da bi se locirala arterija koja krvari. 2. Povreda intra-abdominalnih krvnih sudova Povrede manjih krvnih sudova se mogu sanirati bipolarnom elektro-koagulacijom. O{te}enje velikih krvnih sudova naneto troakarom je teè od povreda Veresovom kanilom zbog veli~ine vrha i moè rezultovati obilnim krvarenjem. Povreda krvnih sudova omentuma moè ugroziti vitalnost dela creva. Kod ovog tipa povreda neophodna je laparotomija sa hemostazom krvnog suda i revizijom creva od strane hirurga. Ako se sumnja na povredu aorte, vene cave inferior, ili iliake, instrument kojim je u~injena povreda treba ostaviti da bi se ozna~ilo mesto povrede. Obi~no postoji veliki hematom koji skriva mesto same povrede. Dramati~an kolaps nastaje penetracijom velikog krvnog suda, ali krvarenje ne mora biti odmah o~igledno, ako se radi o retroperitonealnom krvnom sudu. Nakon obavljene hemostaze neophodna je temeljna inspekcija kompletne trbu{ne duplje sa pomeranjem creva radi pregleda aorte oko bifurkacije gde su naj~e{}e povrede. Propu{tanje obavljanja ove procedure moè rezultovati nastavljanjem krvarenja i formiranjem velikog hematoma koji i nekoliko ~asova kasnije moè da dovode do hemoragi~nog {oka. Prema tome, prilikom zavr{etka bilo koje laparoskopske procedure moraju se proveriti veliki krvni sudovi i potraìti hematomi. Ovo se naro~ito odnosi na operativni tretman endometrioze na bo~nom karli~nom zidu gde su locirani veliki krvni sudovi.

Komplikacije induu kcijom pneuu moperitoneuu ma Ekstra-peritonealna insuflacija gasa Neuspeh uvo|enja Veresove kanile u peritonealnu {upljinu moè izazvati ekstra peritonealni emfizem. Ovo se de{ava kod oko 2% slu~ajeva, naj~e{}e kod manje uve`banih lekara. Palpacijom se potvrdjuje prisustvo krepitacija koja je izazvana potko`nim mehuri}ima CO2 . Treba uvek poku{ati da se otkloni gas i ako se to postigne kanila se aplikuje kroz isto ili drugo mesto. Alternativno se troakar i kanila mogu uvesti otvorenom laparoskopijom sa pro{irenjem reza na koì.

Medijastinalni emfizem Medijastinalni emfizem moè izazvati sr~ane smetnje koje }e dijagnostikovati anesteziolog. Laparoskopija se mora prekinuti i poku{ati da se evakui{e {to ve}a koli~ina gasa. Pacijent mora biti pod intenzivnom kontrolom sve dok se gas ne apsorbuje.

Pneumotoraks Pneumotoraks nastaje ubacivanjem Veresove kanile u pleuralnu {upljinu. Zato je va`no da se kod visoke aplikacije kanila usmeri {to dalje od dijafragme. Na pneumotoraks treba posumnjati uvek kada se jave te{ko}e kod ventilacije pacijenta. Intervencija se prekida i poku{ava da se elimini{e {to vi{e gasa. Kod teìh slu~ajeva je potrebna asistirana ventilacija i ubacivanje pleuralne tube.

Pneumo-omentum Omentum se perforira Veresovom kanilom u oko 2% slu~ajeva. Pogre{na aplikacija se prepoznaje povi{enjem insuflacionog pritiska. Stanje je obi~no bezopasno, osim ako do|e do perforacije krvnog suda.

159

III Deo: Sterilitet

Gasna embolija Intravaskularna insuflacija gasa moè dovesti do gasne embolije, pa ~ak i smrti. Ovo se moè desiti samo ako se penetracija Veresovom kanilom ne prepozna i zapo~ne insuflacija. Ovo se moè spre~iti aspiracionim testom i rutinskim kori{}enjem niskoga pritiska insuflacije gasa. Gasna embolija je mogu}a, ali se retko de{ava, jer je gas lako rastvorljiv i brzo se resorbuje tako da se, ~ak i ako je postojao umeren embolus, cirkulatorne promene vra}aju u normalu u roku od nekoliko minuta, a pacijent se oporavlja. Kod masivne embolije pacijenta treba okrenuti u levu lateralnu poziciju i ukoliko ne do|e do trenutnog oporavka, uraditi punkciju srca radi oslobadjanja gasa.

Komplikacije od distenzionog medijuma Ugljen-dioksid je distenzioni medijum koji se naj~e{}e koristi kod laparoskopije. Sr~ana aritmija moè biti rezultat prevelike apsorpcije CO2. Va`no je nadgledati intra-abdominalni pritisak tokom ~itave intervencije i koristiti automatski pneumoinsuflator. Endotrahealna intubacija i respiracija pozitivnim pritiskom, tako|e, pomazu u spre~avanju komplikacija od insuflacije CO2. Post-operativni bol je uobi~ajen sa insuflacijom CO2 zbog peritonealne iritacije koja je rezultat konverzije CO2 u ugljenu kiselinu. Bol u grudima se moè zameniti koronarnom sr~anom bole{}u i moè se neodgovaraju}e tretirati anti-koagulantima. Azotni oksid N2O se koristi u nekim centrima, jer ima manje nuspojava u odnosu na CO2.

Azotni oksid pomaè sagorevanje i postavlja se pitanje rizika pri kori{}enju visoko-frekventne monopolarne struje.

Povreda gastro-intestinalnog trakta Do penetracije èluca moè do}i pri visokoj aplikaciji laparoskopa ili kada je èludac dilatiran tokom uvo|enja u anesteziju. Gastri~na distenzija se, tako|e, moè pojaviti ako se anestezija odràva maskom. U ovom slu~aju èludac treba aspirirati nazo-gastri~nom sondom. Dijagnoza gastri~ne perforacije Veresovom kanilom se potvrdjuje laparoskopskom potvrdom. Pod uslovom da zid èluca nije {ire povre|en, nije potreban nikakav hirur{ki tretman uz davanje antibiotika {irokog spektra. Izvesne okolnosti pove}avaju rizik povredjivanja Veresovom kanilom kao kod slu~ajeva adhezije creva za abdominalni zid. Aspiracija koja sledi nakon inicijalnog ubacivanja igle treba da omogu}i rano prepoznavanje perforacije creva. Na penetraciju creva treba posumnjati, ako postoji asimetri~na abdominalna distenzija, podrigivanje, izbacivanje gasova ili fekalnog mirisa. Kanila se preme{ta radi pravilnog uvo|enja pneumoperitoneuma. Gastrointestinalni trakt treba pa`ljivo pregledati na prisustvo perforacije. Va`no je pregledati obe strane creva, jer izlazna rana moè biti ve}a od ulazne. Jednostavna penetracija ne zahteva operativni tretman, ali pacijent treba da bude pod kontrolom i antibiotskom za{titom. Kada se inspekcijom perforiranog mesta utvrdi prisustvo fekalija pristupa se hitnoj laparotomiji. Ponekada je nemogu}e otkriti mesto povrede nastale laparoskopijom. U ovom slu~aju je obavezna laparotomija da bi se

160


prona{la i tretirala povreda creva i spre~avanje nastajanja pelveoperitonitisa.

Povreda be{ike Rutinsko pra`njenje be{ike pre intervencije trebalo bi da spre~i povredjivanje be{ike. Ako je prime}ena pneumaturija, iglu treba delimi~no povu}i, a stvaranje pneumoperitoneuma nastaviti. Peritoneum be{ike treba pa`ljivo pregledati da bi se proverilo da nije izazvana ozbiljnija povreda. Tretman jednostavne perforacije je konzervativan uz postoperativnu drenaù be{ike. Posekotine be{ike mogu nastati tokom mobilizacije be{ike kod karli~nih operacija. Be{ika bi trebala da bude za{ivena u dva sloja uz aplikaciju Folijevog katetera.

Perforacija jetre i slezine Jetra i slezina se mogu perforirati Veresovom kanilom kod visoke aplikacije ili ako postoji hepatomegalija ili splenomegalija. Aspiracioni test i visok insuflacioni pritisak }e u~initi o~iglednim lo{e pozicioniranje kanile, pa se ona u tom slu~aju treba povu}i.

Termalna o{te}enja Monopolarna elektri~na struja ulazi u telo pacijenta iz elektrode koja se koristi u toku intervencije. Na povratnoj putanji ka neutralnoj elektrodi struja moè da pro|e preko male povr{ine gde se dodiruju dva organa. Gustina energije u toj ta~ci moè biti velika. Na ovaj na~in dolazi do opekotina izvan vidnog polja hirurga. Postoji i opasnost od lateralnog {irenja toplote kod primene monopolarne ili bipolarne struje. Va`no je osigurati da nijedan drugi organ nije u dodiru ili u blizini organa koji se tretira. Creva su organ koji se naj~e{}e povre|uje. Povreda se moè kretati od

manjeg deseroziranja do vidljive perforacije. Perforacija zahteva laparotomiju, uklanjanje o{te}enog tkiva i hirur{ku korekciju. U slu~aju neprepoznavanja povrede nastaje ishemi~na nekroza na mestu opekotine. U samom po~etku simptomi nisu izraèni. Pacijent se obi~no àli kako se ne ose}a dobro i ima nejasne abdominalne simptome, neprijatnost, anoreksiju i mogu}u pireksiju. Peritonitis se polako razvija tokom nekoliko narednih dana. Uvek se mora imati na umu da je elektri~na struja potencijalno opasna i da se sva pravila koja se ti~u njene upotrebe moraju strogo po{tovati.

Ostale komplikacije Posekotine cerviksa Uobi~ajeno je da se pri fiksiranju cerviksa napravi manja posekotina prednje usne. Cerviks uvek treba da bude pregledan na kraju procedure. Krvarenje se obi~no moè zaustaviti kompresijom krvnog suda, ali je ponekada potrebno staviti ligaturu.

Perforacija materice Perforacija materice moè biti izazvana manipulacijom kanile ili tokom dilatacije i kiretaè. Perforaciju uvek treba pregledati laparoskopom na kraju procedure. Krvarenje je obi~no neznatno i komplikacija obi~no ne zahteva dalji tretman.

Bol u ramenu Ugljen-dioksid se pretvara u ugljenu kiselinu kada je u kontaktu sa telesnim te~nostima. Ovo iritira peritoneum. Peritonealna iritacija dijafragme izaziva bol koji se prenosi na rame freni~nim nervom. Ovaj bol se moè zameniti sr~anim bolom i tretirati na neodgovaraju}i na~in.

161

III Deo: Sterilitet

Pelvi~na inflamacija Postoji mali rizik od stvaranja pelvi~ne infekcije uterinskom kanilom i hromopertubacijom. Postoperativna pelvi~na infekcija je manje ~esta nakon laparoskopske hirurgije nego nakon laparotomije.

Omentalna i Rihterova hernija Ako se primarna kanila izvu~e sa zatvorenim ventilom, mogu}e je povu}i komad omentuma u umbilikalnu ranu negativnim pritiskom koji se stvara na ovaj na~in. Ovo se obi~no prepoznaje odmah i omentum se lako reponira.

Povrede od operativnog stola Prilikom pozicioniranja pacijenta na operacionom stolu se uvek mora obratiti pa`nja. Povreda se moè izazvati na nervima noge kao i na kuku i sakro-ilija~nim zglobovima. Pritisak vene na nozi moè inicirati vensku trombozu. Brahijalni pleksus se moè povrediti ako se ruka silom pomera. Ruke mogu da zapnu u pokretne delove stola. Va`no je da pacijent ne dodiruje metalne delove stola, ako }e biti kori{}ena elektri~na energija.

skladu sa sloèno{}u laparoskopske procedure o kojoj se radi. Sredstva dijagnoze i tretmana komplikacija su analizirana zajedno sa zna~ajem stepena iskustva hirurga. Stepen mortaliteta je bio 3,33 na 100 000 laparoskopija. Ukupni stepen komplikacija je bio 4,64 na 1000 laparoskopija. Stepen komplikacija koje su zahtevale laparotomiju je bio 3,20 na 1000. Stepen komplikacija je bio u zna~ajnoj korelaciji sa sloèno{}u laparoskopske procedure. Jedna od tri komplikacije (34,1%) se desila tokom pripreme za laparoskopiju, a jedna od ~etiri (28,6%) nije dijagnostifikovana tokom operacije. Dok su se pojavljivale nove indikacije za laparoskopsku hirurgiju u ginekologiji, postojalo je paralelno i statisti~ki zna~ajno pove}anje stepena urolo{kih komplikacija. Pove}ano iskustvo hirurga je imalo tri posledice: statisti~ki zna~ajan pad broja povreda creva, pad broja komplikacija koje zahtevaju laparotomiju onih laparoskopskih hirur{kih procedura koje su dobro definisane i promenu na~ina na koji su komplikacije tretirane uz zna~ajno smanjenje udela incidenata tretiranih laparoskopijom.

Strana tela Ponekada se delovi instrumenata mogu nenamerno ispustiti i izgubiti u peritonealnoj {upljini. Uklanjaju se laparaskopski, ako se pronadju ili laparatomijom.

Analiza komplikacije U sedam francuskih centara je obavljena studija o laparoskopskoj ginekolo{koj dijagnosti~koj i operativnoj hirurgiji. Studija obuhvata period od devet godina tokom kojih je obavljeno 29 966 dijagnosti~kih i operativnih laparoskopskih operacija. Rizik od komplikacija je procenjen u

3.1.4. Histeroskopija Histeroskopija se ne primenjuje rutinski u fazi dijagnostike steriliteta. U slucajevima sumnje na odredjene patoloske promene u kavumu uterusa u prethodnim nalazima, pristupa se histeroskopiji. Naj~e{}a patologija koju sre}emo u ovoj oblasti, a koja se dijagnostikuje i terapeutski re{ava histeroskopijom su polipi uterusa, malformacije uterusa, manji intrakavitarni miomi, sinehije, stenoze cerviksa uterusa. U skorije vreme se i neki slu~ajevi tubarnih


162

okluzija re{avaju histeroskopskim pristupom.

Studije koje direktno upore|uju rezultate sonohisterosalpingografije sa rezultatima dobijenim putem HSG - histerosalpingograma su dale neusagla{ene rezultate.

3.2. ANALIZA EJAKULATA

Sl. 3.60- Normalan histeroskopski nalaz

3.1.5. Sonohisterosalpingografija Za sonohisterografiju se smatra da ima ve}u osetljivost od HSG - histerosalpingograma u detekciji intrauterinske patologije Sonohisterosalpingografija se bazira na detekciji akumulacije fluida u cul-de-sac kao indikacije tubarne prohodnosti. Ova metoda ne daje precizne podatke o tubarnoj anatomiji i ne moè da utvrdi da li je samo jedna ili su obe tube prohodne. Novi sonografski kontrastni medijum, koji se sastoji od surfaktanta koji stvara mikro-mehuri}e kada se stimuli{e ultrazvukom je pobolj{ao osetljivost ove metode. Tehnolo{ki napredak ultrasonografije je pro{irio mogu}nosti sonohisterosalpingografije. Trodimenzionalni transvaginalni ultrazvuk je pobolj{ao generisanje koronalnih slika, a doplerova tehnika vizualizaciju kretanja fluida kroz Falopijeve tube. Me|utim, ~ak i sa ovim pobolj{anjima je malo verovatno da }e uskoro sonohisterosalpingografija zameniti tradicionalni HSG histerosalpingogram.

Po~etni korak ispitivanja steriliteta je odredjivanje spermograma i jedan od najzna~ajnih dijagnosti~kih testova kod mu{karca. Analiza uzorka ejakulirane sperme pruà va`ne informacije o kvalitetu sperme. Parametri kao {to su koncentracija, pokretljivost i morfologija doprinose definisanju normaliteta uzorka sperme. Normalni parametri, utvr|eni od strane Svetske zdravstvene organizacije, su prikazani u slede}oj tabeli. Tabela 3-7: Parametri normalne sperme

Volumen

> =2.0 ml

pH Koncentracija sperme Ukupan broj spermatozoida

>= 7.2 ml >=20 miliona spermatozoida/ml > = 40 miliona spermatozoida /ml

>=50% pokretnih (stepen a+b) ili Prokrvljenost >=25% pokretnih (stepen a), 60 minuta od ejakulacije Morgologija >=15% Vitalnost

>=75% isklju~uju}i boju

Bela krvna zrnca

<1 milion }elija/ml

<50% pokretnih spermatozoida sa zadrànim mehuri}ima Immunobead <50% pokretnih spermatozoida sa test adherentnim ~esticama Mar test

163

III Deo: Sterilitet

Sve ve}i broj klini~kih studija se bavio utvrdjivanjem grani~nih vrednosti radi klasifikacije subfertilnih i fertilnih pacijenata. Predloène grani~ne vrednosti za subfertilne pacijente su prikazane u narednoj tabeli. Tabela 3-8: Grani~ne vrednosti kod subplodnih mu{karaca

Ombelet 1997 Koncentracija 14.3 x sperme 106/ml

Guzick Gunalp 2001 2001 13.5 x 6 106/ml 9x10 /ml

Pokretljivost stepen a

28%

32%

14%

Morfologija strogi kriterijum

5%

9%

5%

Procenjivanje uzoraka sperme treba da bude standardizovano od trenutka prikupljanja do kona~nog brojanja normalnih spermatozoida u fiksiranom uzorku. Kontinuirana kontrola kvaliteta ove analize je od

najve}eg zna~aja. Razne dràve su utvrdile objektivan sistem kontrole kvaliteta. Ovi sistemi su ~esto pod direktnom kontrolom ministarstva zdravlja. Prikupljanje sperme je prva faza u radu. Uzorak se uzima u laboratoriji u posebnu sterilnu posudu nakon perioda apstinencije od 2-3 dana. Kao alternativa, uzorak moè biti donet u laboratoriju u roku od jednog ~asa od ejakulacije odràvan na telesnoj temperaturi tokom transporta. Lubrikacija se ne koristi prilikom pribavljanja uzorka po{to moè biti toksi~na po spermatozoide. Kada se uzorak pribavlja u toku odnosa obezbe|uje se poseban kondom dizajniran za ovu svrhu. Dve analize se obavljaju u razmaku od nekoliko nedelja, jer se broj spermatozoida moè menjati. Makroskopska procena je druga faza. Tokom inicijalnog makroskopskog ispitivanja uzorka, volumen, boja, pH, viskoznost i koncentracija se beleè kao {to je prikazano u slede}oj tabeli.

Tabela 3-9: Makroskopske karakteristike uzorka sperme

2ml Volumen

> 2ml

Normalan Mogu} retrogradni ejakulat ili deficijencija prostate

Dug period apstinencije >> 2ml Siva opalescentna Normalna jasna èlatinazna tela Boja

@uta Crvenkasto-braon

Viskoznost posle likvifikacije

Visoka > =7.2

pH

< 7.2

Dug period apstinencije Uzimanje B vitamina Eritrociti - Smetnje u prokrvljenosti spermatozoida - Nedostatak homogenosti uzorka Normalna - Azoospermija - Opstrukcija ejakulatornih vodova - Bilateralno kongenitalno odsustvo vas deferens


164

Mikroskopska procena je tre}a faza pregleda sperme. Prva mikroskopska procena uzorka uklju~uje procenjivanje pokretljivosti i aglutinacije spermatozoida i prisustva }elijskih elemenata, eritrocita i belih krvnih zrnca i epitelnih }elija. Pojava bakterija, tako|e, mora biti evidentirana. Koncentracija spermatozoida se odre|uje hemocitometrom ili specijalnim tipovima komora za brojanje, kao {to je Maklerova komora. Uzorci u kojima nisu detektovani spermatozoidi se centrifugiraju radi utvr|ivanja spermatozoida u talogu. Preporu~uje se centrifugiranje > 3000g u trajanju od 15 minuta. Ako se spermatozoidi ne na|u u talogu, uzorak se kvalifikuje kao azoospermi~an. Razli~ite klasifikacije uzorka sperme prema broju, prokrvljenosti i morfologiji su prikazane u slede}oj tabeli.

Procena morfologije sperme je ~etvrta faza pregleda. Prave se dva razmaza od sveèg uzorka za dvostruku procenu. Razmaz obojen po Papanikolau je najrasprostranjeniji metod kori{}en u androlo{kim laboratorijama, jer pruà dobru obojenost spermatozoida i drugih }elija. Postiè se obojenost akrozomalnih i postakrozomnih regija glave spermatozoida, citoplazmi~nih kapljica kao i srednjeg dela i repa spermatozoida. Treba pregledati i proceniti 2 X 200 spermatozoida po svakom uzorku. Glava, vrat, srednji deo i rep se pa`ljivo procenjuju.

Tabela 3-10: Podela terminologije prema Svetskoj zdravstvenoj organizaciji – WHO

Normoazoospermi~an Normalan ejakulat Oligospermija

Koncentracija spermatozoida manja od referentne vrednosti

Pokretljivost Astenozoospermija manja od referentne vrednosti Normalne forme Teratozoospermija manje od referentne vrednosti* Azoospermija

*nije definisano u WHO

Spermatozoidi nisu prisutni

Sl. 3.61- Spermatozoid - spermium: 1. akrozom; 2. spolja{nja membrana ; 3. haploidno jedro; 4. vrat sa centriolama i mitohondrijom; 5. rep

Normalni spermatozoid ima ovalnu glavu duìne 4 - 5.5 µm i {irine 2.5 - 3.5 µm. Odnos duìne i {irine treba da bude 1.5 1.75. Srednji deo bi trebao biti {irok, manji od 1 µm, oko 1.5 puta duì od glave i aksijalno spojen. Citoplazmi~ne kapljice su upola manje od normalne glave.

165

III Deo: Sterilitet

< Sl. 3.62- Centrozoma spermatozoida, snimljeno TEM –transmission electron micrograph-ijom

Sl. 3.63- Mitohondrija spermatozoida, snimljena TEM - transmission electron micrograph-ijom >

Rep treba da bude prav, uniforman, tanji od prednjeg dela i duga~ak pribli`no 45µm. Svi grani~ni oblici se smatraju abnormalnim.

U tabeli su prikazane sumirane morfolo{ke karakteristike koje se ispituju kod tipi~ne analize sperme.

Tabela 3-10: Morfolo{ki defekti po kriterijumima WHO

Defekti glave

Defekti vrata i srednjeg dela

Defekti repa

Citoplazmi~ne kapljice

- Velika, mala, zašiljena, piriformno-okrugla - Amorfne glave - Vakuolirane glave (>20% glave zauzimaju nezamrljana vakuolarna podru~ja) - Malo akrozomalno podru~je (<40% glave) - Veliko akrozomalno podru~je (>70% glave) - Dvostruke glave - Bilo koja kombinacija ovih defekata - Savijen vrat: vrat i rep formiraju ugao ve}i od 90% u odnosu na dugu osu glave - Asimetri~no umetanje srednjeg dela u glavu - Debeo ili nepravilan srednji deo - Abnormalno tanak srednji deo - Bilo koja kombinacija ovih defekata - Kratak - Višestruki repovi - Ukosnica - Neravni repovi - Savijeni repovi (>90°) - Repovi nepravilne širine, uvijeni repovi - Bilo koja kombinacija ovih defekata Ve}e od 1/3 prostora normalne glave spermatozoida; kapljice se obi~no nalaze na boku srednjeg dela

166


Povremeno se de{ava da brojni spermatozoidi imaju specifi~ne strukturalne defekte, kao {to je poreme}aj razvoja akrozoma koji uzrokuje defekt nazvan globozoospermija. Neuspeh spajanja bazalne plo~e sa nukleusom, na polu koji je naspram akrozoma, uzrokuje odvajanje glave i repova. Glave bivaju apsorbovane, pa se u spermi mogu na}i samo repovi, {to ovim strukturama daje defekt. Ovaj defekt je nazvan pinhead (glava ~iode) i ne spada u defekte glave, jer vrlo retko poseduje hromatin ili neke druge strukture glave. Transmisiona elektronska analiza sa preporu~uje u slu~ajevima kada postoji totalna astenozoospermija. Ovaj dodatni korak se preduzima radi definisanja porekla nepokretljivosti, kao {to moè biti sindrom nepokretnih cilia. Procena pokretljivost je peta faza pregleda sperme. Preporu~uje se jednostavan sistem procene pokretljivosti. Sloèni sistemi bazirani na ra~unaru koji koriste softver za analizu slike CASA - computer aded sperm analysis nisu neophodni. Procenjuje se pet mikroskopskih polja radi analize oko 200 spermatozoida. Hiperaktivni spermatozoidi nisu uklju~eni u standardni protokol, prikazan u slede}oj tabeli, ali oni daju kvalitativne informacije. Ovi spermatozoidi imaju veoma brzu progresivnu pokretjlivost > 50mm/s. Tabela 3-11: Gradacija pokretljivosti prema standardima WHO

>=25mm/s; STEPEN Brzo 1 okvir plo~ice ili progresivan 5 duìna glave A spermatozoida Sporo STEPEN 5-24mm/s progresivan B STEPEN Neprogresivan 5mm/s C STEPEN Nepokretan _ D

Biohemijske analize i odredjivanje biohemijskih markera funkcije spermatozoida su dodatne analize. Pojava biohemijskih testova mu{kog faktora neplodnosti omogu}ava standardizovana ispitivanja sa koeficijentom varijacije karakteristi~nim za klini~ku hemiju, za razliku od sistema biolo{kih testova koji mogu biti veoma promenljivi. Biohemijski parametri se mogu koristiti u klini~koj praksi za procenu oplodne sposobnosti spermatozoida. Tu spadaju testovi akrozina, anilin plavog, odre|ivanje nivoa ROS- reactive oxygen species. Testovi procene funkcije mu{ke polne `lezde su odredjivanje koncentracije fruktoze (13 mmol ili vi{e), alfa-glukozidaze (20mU ili vi{e) i specifi~ni markeri prostate kao {to je PSA- prostate cancer screening. Identifikacija mu{karaca sa hroni~nom inflamacijom genitalnog trakta testira se odredjivanjem granulocitne elastaze, C3 komplementne komponente, ceruloplazmina, IgA - immunoglobulina, IgG - immunoglobulina, ROS - reactive oxygen species. Treba pomenuti jo{ neke testove koji se sre}u u praksi kao na primer: odre|ivanje koncentracije karnitina (0,8 - 2.9 mmol), cinka (2,4 mmola ili vise), citric acida (52 mmola ili vi{e), kisele fosfataze (200 U ili vi{e). Dalja dodatna ispitivanja su: SPA sperm penetration assay / hamster egg penetration test, HOS - hypoosmotic swelling test, vezivanje spermatozoida sa zonu pellucidu, imunolo{ki testovi: imunobead test (manje od 20 % spermatozoida sa adherentnim partikulama), MAR - test (manje od 10 % spermatozoida sa adherentnim partikulama), Penetrak test - cervical mucus test, PCT - postkoitalni test, SCSA - sperm chromatin structural assay koji podrazumeva analizu fragmentacije DNK - deoksiribonukleinske kiseline spermatozoida kao pokazatelja redukovanog fertilizacionog kapaciteta.

III Deo: Sterilitet

3.3. PREGLEDI OBA PARTNERA Pregledi koji se rutinski primenjuju u fazi dijagnostike su nezaobilazni i smatra se gre{kom zapo~injati terapiju pre zavr{etka kompletnog ispitivanja oba partnera. Obavezno je uraditi dijagnostiku i mu{karca i ène zbog sve ve}eg procenta obostranog steriliteta. Osnovni pregledi oba partnera su: - mikrobiolo{ka ispitivanja - hormonski testovi - genetska ispitivanja - histopatolo{ka ispitivanja – biopsija.

3.3.1. Molekularno biolo{ka dijagnostika ]elijsko i molekularno biolo{ko istraìvanje i rekombinantna DNK-deoxyribonucleic acid tehnologija poslednjih godina nisu revolucionizovali samo dijagnostiku, terapiju i prevenciju oboljenja, ve} su pruìli i dodatan uvid u njihovu molekularnu patogenezu. Tako je sa savremenim molekularno biolo{kim i biohemijskim metodama mogu}e, da se istovremeno analizira vi{e desetina hiljada gena ili proteina DNK - deoxyribonucleic acid, RNK ribonucleic acid ili proteinskih grupa i za pacijenta odredi specifi~an profil. Na bazi ovih podataka mogu dodatno da se naprave relevante i individualne dijagnostike. Farmakogenomika dozvoljava pove}ano razumevanje individualnog metabolizma lekova, a time i predvi|anja o èljenim i neèljenim dejstvima medikamenata. Tako je za o~ekivati, da }e u budu}nosti, na

167

bazi molekularnih markera mo}i da bude definisan dodatno precizan individualni profil gena sa prognosti~kom i predikativnom relevantno{}u kao po~etak personalizovane medicine. Ove nove tehnologije ce na}i svakako i svoje mesto u oblasti steriliteta i posebno u domenima asistirane reprodukcije.

3.4. EBM - EVIDENCIONO BAZIRANA MEDICINA U svim medicinskim oblastima po~elo se sa postepenim uvodjenjem EBM sistema dijagnostike i terapije. Primena ima za osnovni cilj uvodjenje sigurnih medicinskih saznanja u klini~ko odlu~ivanje i isklju~ivanje mogu}nosti odstupanja od prose~nog medicinskog delovanja do kojih dolazi zbog nepouzdanosti u samom medicinskom sistemu i kod pojedina~nih lekara. Metodologija EBM - evidencione bazirane medicine podrazumeva definisanje najbolje evidencije, programiranje i kona~nu primenu u klini~koj praksi. Rezultati nasumi~nih kontrolisanih studija, klini~kih studija po slu~ajnom uzorku RCT – randomized controlled trial imaju u okviru EBM - evidencione bazirane medicine najve}u verodostojnost, prvi nivo evidencije. U klini~koj situaciji odlu~ivanja lekar za sistematski prikupljena saznanja u konkretnom slu~aju mora medicinsko znanje da dovede u vezu sa konkretnim pacijentom, a EBM - evidenciono bazirana medicina osigurava uvo|enje tipizirane primene verifikovanog medicinskog znanja u klini~ko odlu~ivanje.

168


4. TERAPIJA STERILITETA

Zahtevi koji se postavljaju pred lekare koji se bave humanom reprodukcijom u odnosu na komunikaciju sa pacijentima mogu u potpunosti da se svrstaju u slede}e oblasti: korektne informacije o procesu i kompetentno obave{tenje, organizaciono besprekorno sprovo|enje dijagnostike i terapije u skladu sa aktuelno vaè}im reproduktivno medicinskim standardom i psihosocijalna pomo} u procesu savladavanja psihosocijalnih kriza. Infertilni parovi nemaju nerealne i neostvarive zahteve prema lekarima koji se bave reprodukcijom. Velika potreba za informacijama moè da se zadovolji kroz procesuirano otklanjanje nejasno}a i organizaciju kontinuirane informisanosti na svim nivoima rada. Naravno da se o~ekuje visoka reproduktivno medicinska kompetentnost, ali oni kojih se to ti~e, ne mogu da je procenjuju. Oni od lekara koji se bave reprodukcijom o~ekuju komplementarnu i uravnoteènu individualnu psihosocijalnu pomo} u procesu savladavanja krize zbog svojih problema sa sterilitetom. Stoga je za lekare koji se bave reprodukcijom apsolutno potrebna kompetentnost u psihosocijalnom savetovanju i intervencijama kod kriza i kod formulisanja indikacija za specifi~ne intervencije.

4.1. OPERATIVNA TERAPIJA Sredinom sedamdesetih godina pro{log veka u terapiji steriliteta je dominirala operativna terapija, zahvaljuju}i razvoju novih tehnologija ~ija je primena u operativi uvela mnogo vi{e kriterijume i dovela do osetnog pove}anja procenta uspeha. Pored mikrohirur{ke operativne tehnike najvise se primenjivala laserska tehnika. Novi tipovi lasera su koristili te~an materijal, ~vrst, poluprovodni~ki materijal, zatim slobodne elektrone, eksimere, jone, kristalni i amorfni materijal. Osnovne prednosti dobijene kori{}enjem ovih novih tehnika su bile: krvarenje je bilo svedeno na minimum, postupak je bio sterilan zbog baktericidnog svojstva laserskog zraka, postizala se maksimalna preciznost i dostupnost, a operativna rana je zarastala brè uz minimalni postoperativni otok, bol i oìljavanje. U medjuvremenu su se razvijale nove operativne tehnologije i metode, pa je operativa zadràla i danas va`no mesto u terapiji steriliteta. Rekonstruktivna operativna tehnika je prepustila primat metodama asistirane

169

III Deo: Sterilitet

reprodukcije zbog slabijih rezultata i ve}e traume za pacijenta. Posebno poglavlje u operativi danas zauzima prevencija adhezija nastalih pri hirur{kim intervencijama, kada lokalizovani nedostatak kiseonika operativnog polja, hipoksija, izaziva fibrinolizu sa skupljanjem fibrina na traumatizovanoj povr{ini. Zna~aj priraslica je izuzetan kod ginekolo{kih operacija i to u otvorenoj, ali i u endoskopskoj tehnici. U sada{nje vreme prevencija adhezija se sprovodi aplikacijom takozvanih proizvoda za blokadu. Na raspolaganju su lokalno deluju}e viskozne supstance, zatim proizvodi od polietilenglikolne i hijaluronske kiseline i preparati regenerisane oksidirane celuloze. Dobre rezultate zbog svoje raspodele i delovanja u celokupnom peritonealnom prostoru pokazuje i icodexsin.

Mikro-endoskopski postupak spada u novije metode operativnog le~enja. Spektar endoskopski izvodljivih operacija se poslednjih godina kontinuirano pro{irivao i u me|uvremenu obuhvata i kompleksne zahvate. Razvoj fiber-endoskopa sa pre~nicima ispod jednog milimetra otvara i pristup do unutra{njosti tuba, koje uprkos svom klini~kom zna~aju dosada uop{te nisu bile pristupa~ne za endoskopski pregled i terapiju. Danas su na raspolaganju fleksibilni mikro endoskopi sa rezolucijom od 3000 piksela i sa pre~nikom od 0,5 mm. Primenom fiber opti~ke tehnologije u budu}nosti }e mo}i da se uspe{no pro{ire dijagnosti~ke i terapeutske mogu}nosti pregleda i le~enja unutra{njosti jajovoda.

Sl. 3.64- Cistektomija laparoskopijom

Mogu}nosti reproduktivne hirurgije Uprkos uspehu tehnika in vitro oplodnje u prevazilaènju neplodnosti izazvane mehani~kim faktorom postoje slu~ajevi gde operativna terapija daje bolje rezultate. Podrazumeva se da je dobra hirur{ka tehnika osnova hirurgije. Ovo je dobro ilustrovano izve{tajima o rezultatima salpingostomija. Godine 1999. Votson je objavio rezultate salpingostomija radjene u dve ne-specijalisti~ke bolnice u Lidsu. Broj postoperativnih trudno}a je iznosio samo 5%. Nasuprot tome Singal je u svojoj studiji 2000. godine objavio procenat uspeha od 29%. Vinston i Margara su u isto vreme izvestili o sli~nom procentu uspeha. Ovi autori su ostvarili mnogo bolje rezultate jer su koristili mikrohirur{ke tehnike koje uklju~uju: - atraumatski rad, - preciznu hemostazu, - minimalnu povredu tkiva, - pa`ljivu anatomsku rekonstrukciju, - konstantnu irigaciju radi izbegavanja povreda od desikacije.


170

Druga oblast gde se prioritet daje hirurgiji u odnosu na asistiranu reproduktivnu tehnologiju je laparoskopska ovarijalna dijatermija kod policisti~nih jajnika. Danas je ova hirur{ka metoda prihva}ena kao efikasan tretman ovog stanja. Optimalna tehnika podrazumeva ~etiri mesta vaporizacije na svakom jajniku, u trajanju od po 5 sekundi primenom energije od 30W.

Indikacije za operativni tretman Hirur{ka intervencija je indicirana ako su ispunjeni slede}i uslovi: 1. jasna operativna indikacija; 2. prethodne opcije tretmana su bile neuspe{ne; 3. ne postoje kontraindikacije za operaciju. Analizirajuci dana{nje stavove o mio-

mima kroz ve}i broj radova dolazi se do zaklju~ka da nema potpunog konsenzusa o tome koji tipovi intramuralnih fibroida treba da se uklone. Mnogi autori razmatraju uklanjanje, ako je fibroid ve}i od 5 cm, dok drugi kompletiraju operativnu indikaciju postojanjem neplodnosti. Na osnovu sprovedenih meta-analiza ~ini se jasnim da prisustvo intramuralnih fibroida, ~ak i manjih od 5 cm, uzrokuje smanjenje stepena klini~ke trudno}e kao i zna~ajan porast broja poba~aja nakon IVF in vitro fertilisation tretmana u pore|enju sa ènama bez mioma. Istovremeno nema ubedljivih podataka koji bi pokazali da njihovo uklanjanje u ovoj grupi èna zna~ajno pobolj{ava stepen za~e}a i smanjuje stepen poba~aja.

Tabela 3-12: Meta-analiza uticaja intramuralnih mioma na broj trudno}a nakon IVF tretmana

Studija

Intramuralni miom

Kontrola

Eldar-Geva (1998)

TE 55

BT/TE 9/55 (16%)

TE 318

BT/TE 98/318 (30%)

Hart (2001)*

85

20/86 (23%)

322

110/322 (34%)

Ng i Ho (2002)

77

20/77 (26%)

312

74/312 (24%)

êk (2002)**

61

26/61 (43%)

61

32/61 (52%)

Ukupno**

279

75/279 (27%)

1013

314/1013 (31%)

TE=transfer embriona; BT=broj trudno}a; *Fibroidi manji od 5 cm; **p<0.05

Tabela 3-13: Meta-analiza uticaja intramuralnih mioma na broj poba~aja nakon IVF tretmana

Studija

Fibroid

Kontrola

Eldar-Geva (1998)

3/9 (33%)

20/98 (20%)

Hart (2001)*

7/20 (35%)

19/110 (17%)

Ng i Ho (2002)

4/20 (20%)

6/74 (8%)

êk (2002)*

10/24 (43%)

7/31 (23%)

Ukupno**

24/73 (33%)

52/313 (17%)

*Fibroidi manji od 5 cm; **p<0.01

171

III Deo: Sterilitet

Jasna indikacija za operativni tretman je od posebnog zna~aja kod mikrohirur{kih rekonstruktivnih zahvata na tubama. Uspeh salpingostomije direktno zavisi od stepena o{te}enja jajovoda. Kod slu~ajeva sa blaìm oblikom bolesti, stepen postoperativnih trudno}a je do 39%. Prognosti~ki dobre promene za salpingostomiju uklju~uju: - minimalni hidrosalpinks, - minimalne peritubarne adhezije, - normalnu mukozu, - normalan ili tanak zid tube, - parcijalnu okluziju. Hirurzi koji ne selektiraju pa`ljivo i stru~no slu~ajeve za operacije ostvaruju lo{ije rezultate i ~esto kompromituju dobre operativne metode.

Kontraindikacije za operativni zahvat Uobi~ajne kontraindikacije uklju~uju: - starost preko 44 godine; - FSH - follicle stimulating hormone preko 15 IU/L; - tubarna o{te}enja ireverzibilna; - partner sa abnormalnom spermom. Ovde se treba posebno osvrnuti na dono{enje odluke o operativnom tretmanu. Obaveza lekara je da pruì objektivne i precizne mogu}nosti tretmana i da je pacijent uklju~en u proces dono{enja odluke. Na primer, u slu~aju tubarnog o{te}enja nakon uradjene dijagnosti~ke laparoskopije kada se utvrdi mogu}nost dve opcije tretmana – tubarne hirurgije i IVF – in vitro fertilisation obja{njenje pacijentu mora da uklju~i detaljno obja{njenje prednosti i mana i jedne i druge metode kao i stepen mogu}ih komplikacija. Na kraju, pacijentu treba dozvoliti da napravi izbor. Danas se o~ekuje da komplikacije svake metode budu dokumentovane u formularu za pristanak za operaciju.

Ako se uzme kao primer formular za saglasnost za oreraciju mioma, on bi trebao da sadrì i slede}e podatke o mogu}im komplikacijama: - transfuzija (oko 20%); - histerektomija (oko 2%); - intrauterinske adhezije; - ruptura uterusnog oìljka tokom kasnije trudno}e (do 1%); - recidiv mioma (oko 27% u prvih 10 godina). Za hirurgiju postoje tri zlatna pravila i ona glase: bezbednost, bezbednost i bezbednost. Bezbednost pacijenta mora da bude najva`nija stvar kod svih tipova operacija.

Laparoskopija ili laparotomija Kao {to je vec re~eno, ve}ina reproduktivnih operacija se danas obavlja laparoskopski. Hirurzi ~esto ose}aju potrebu da svojim pacijentima i kolegama dokaù da su sposobni da obave laparoskopsku operaciju. Na primer, u slu~aju vi{estrukih intramuralnih mioma, rektovaginalne endometrioze i {irokih adhezija koje su dobro vaskularizovane mnogo je bezbednije obaviti potrebnu operaciju laparotomijom umesto laparoskopski. Kod takvih slu~ajeva i procenat uspe{nosti je na strani laparotomije.

Bezbedna upotreba elektri~ne energije Svi hirurzi treba da poseduju osnovno tehni~ko znanje o bezbednoj upotrebi razli~itih izvora energije koji se koriste u aparatima u operacionoj sali. Hirurg bi morao da razume i da donosi odluke o slede}em: - Izvor energije: elektri~ni, laserski ili harmonijski skalpel. Ve}ina hirurga bi se sloìla da je elektri~na energija daleko sves-

172


tranija. Pod uslovom da se po{tuju pravila bezbednosti, elektri~na energija je efikasnija i manje skupa od ostalih oblika energije; - Tipovi elektri~ne energije: monopolarna ili bipolarna. Kada je potrebna hemostaza, a operativno polje je blizu creva, bipolarna dijatermija je bezbednija od monopolarne, jer je manji rizik slu~ajne opekotine; - Monopolarna elektri~na energija se koristi za: se~enje, koagulaciju ili njihovu kombinaciju. Prilikom se~enja avaskularnog tkiva, ako se èli izbe}i koagulaciona povreda ise~enih ivica (npr. dva kraja Falopijeve tube), moè se koristiti ~isto se~enje elektri~nom energijom. Prilikom se~enja tkiva koje sadrì male krvne sudove, koristi se kombinovani na~in, jer omogu}ava istovremeno se~enje i koagulaciju tkiva. Iako se koagulacioni na~in, tako|e, moè koristiti za se~enje tkiva, obi~no se ne preporu~uje; - Pode{avanje snage i gustina snage: izbor pode{avanja snage veoma zavisi od veli~ine i oblika vrha instrumenta. Ako instrument sa ravnim ili zaobljenim vrhom sa velikom kontaktnom povr{inom koristimo za odre|eni nivo snage, koristi se manja gustina snage. S druge strane, kada imamo o{tri instrument, ista snaga }e proizvesti mnogo ve}u gustinu snage. Zato je neophodno smanjiti snagu kada se koristi o{tri instrument da bi se izbegle nepotrebne opekotine okolnog tkiva zbog stvaranja {irokog elektri~nog luka; - Da li vrh instrumenta treba da bude u dodiru sa tkivom. Kada se koristi monopolarni elektricitet, ako je vrh instrumenta u dodiru sa tkivom do}i }e do efekta su{enja, pa je ovo naro~ito pogodno za dijatermiju dubljih lezija i hemostazu. Me|utim, ako vrh instrumenta nije u direktnom dodiru sa

tkivom, do}i }e do stvaranja varnica. Struja moè da pre|e sa elektrode na tkivo preko provodnog medijuma tj. vazduha. Ovaj prustup je pogodan za povr{insko uklanjanje endometrioznih naslaga ili za se~enje tkiva vaporizacijom. Va`no je da se bezkontaktni metod ne koristi kada je operativno polje blizu creva ili uretre; - Brzina pomeranja }e odrediti kona~an uticaj na tkivo. Prilikom kori{}enja o{trog kompleta za dijatermiju, brzi pokreti }e rezultovati efektom povr{inskog se~enja dok }e spori pokreti dozvoliti dublju penetraciju sa izvesnim stepenom koagulacije; - Moraju se izbe}i nenamerne opekotine koje se mogu javiti kao posledica probijanja izolacije, kapacitivne sprege i direktne sprege. [to se ti~e direktne sprege, ako aktivna elektroda dodiruje drugi metalni instrument, elektricitet se moè preusmeriti u drugi deo tela {to bi rezultovalo nenamernim opekotinama. Zbog toga je va`no ne dozvoliti aktivnom elementu da dodirne bilo koju drugu metalnu strukturu. U ovom pogledu je instrument sa kratkim aktivnim elementom bezbedniji od onog sa dugim aktivnim elementom. Kapacitivna sprega se javlja kao posledica elektromagnetnog fenomena da kada struja te~e kroz cevastu strukturu stvara elektromagnetno polje i sekundarnu struju koja moè da podstakne elektri~no pra`njenje. Ako se naelektrisanje stalno prazni kroz abdominalni zid nije opasno. Me|utim, ako je instrument izolovan do}i }e do kumulacije naelektrisanja do zna~ajnog nivoa, pa pri dodiru intra-abdominalnog organa, na primer creva, moè do}i do stvaranja opekotine. Da bi se izbegla kapacitivna sprega potrebno je izbegavati upotrebu hibridnog sistema kanila; drugim re~ima, plasti~ni izolator metalne unutra{njosti.

173

III Deo: Sterilitet

Reproduktivna hirurgija, kao i ostale grane medicine i hirurgije, je pod stalnim i drasti~nim promenama. Napredak op{te tehnologije sa razvojem sve bolje aparature pruà hirurgu mogu}nost preciznijeg rada, ve}u atraumati~nost i skra}enje vremena operacije. To zahteva kontinuiranu edukaciju kao i uostalom u ukupnoj medicinskoj nauci.

4.2. ALTERNATIVNE I FIZIKALNE METODE LEÊNJA Efikasnost alternativnih i fizikalnih metoda je individualno veoma razli~ita Kao podr{ka klasi~noj terapiji, koja je kombinacija medikamentozne i hirur{ke terapije, danas se vi{estruko primenjuju i alternativne metode le~enja i fizikalne terapije. U ovoj oblasti postoji veoma mnogo metoda i mogu}nosti, od kojih nisu sve priznate. Efikasnost je individualno veoma razli~ita.

Masaè Mogu}nost da se otkloni napetost postoji u primeni klasi~ne masaè mi{i}a, masaè vezivnog tkiva i masaè refleksnih zona.

TCM – traditional chinese medicine Iz oblasti tradicionalne kineske medicine TCM - traditional chinese medicine koriste se {ijacu, akupunktura i akupresura. Pri fizikalnim terapijama su veoma efikasne kupke i zavoji. One mogu da se primenjuju posle hirur{ke terapije ili dodatno uz medikamentoznu terapiju. I terapija kupanjem moè da ima smisla. U pojedina~ne mere spadaju:

- tople slane kupke i kupke sa ugljenhidroksidom, - kupke za noge, - postepene kupke, kod kojih se temperatura polako pove}ava, - naizmeni~ne kupke sa naizmeni~no toplim i hladnim fazama, - hladne kupke i polivanja ili ulazak u vodu po Kneipp-principu, - ango ili pakovanja sa morskim muljem, - toplo obavijanje tela, - termofori

Klasi~ne tehnike opu{tanja Postoje razli~iti klasi~ni postupci opu{tanja, koji se pored opu{tanja mi{i}a ~esto koriste i za smanjenje stresa, strahova ili depresije. Postoje tehnike, kod kojih su u prvom planu telesne ve`be. Druge rade sa snagom shvatanja obolelih: - progresivno opu{tanje mi{i}a po Jacobsonu - autogeni trening - terapija disanja - biofeedback Alternativne metode le~enja se primenjuju i u nekim slu~ajevima le~enja neplodnosti. Tu spada postupak prirodnog le~enja kao homeopatija, ali i akupunktura. Kod svih ovih metoda poku{ava se da se sprovede sveobuhvatno le~enje, pri ~emu se uti~e, kako na telesno, tako i na psihi~ko stanje. To se pozitivno odraàva na plodnost. U primenjena terapeutska sredstva spadaju: - akupunktura - masaà no`nih refleksnih zona - masaà vezivnog tkiva - autogeni trenining - le~enje lekovitim travama i biljem, na primer sa Agnus Castus - ve`be opu{tanja

IV DEO ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA

177

IV Deo: Asistirana reproduktivna tehnologija

1. IN VITRO FERTILIZACIJA U dana{nje vreme kada se posmatra sveukupna medicinska tehnologija usmerena na pojedinca, na ublaènje bolesti i pobolj{anje kvaliteta ìvota, ni{ta ne moè da se ravna sa doprinosom tehnologije asistirane reprodukcije. Ne postoji ìvotno iskustvo koje bi moglo da se ravna sa ro|enjem bebe u pogledu zna~aja i va`nosti. Odgovornost odgajanja i vaspitanja dece ima dugoro~ni i bitan uticaj na pojedince, porodicu i dru{tvo. Tako se asistirana reprodukcija ne moè uzimati kao jo{ samo jedan oblik invazivne medicinske tehnologije, ve} se mora tretirati sa po{tovanjem i odgovorno{}u prema najosnovnijim delovima ljudskog ìvota.

biolog Robert Edwards prvi uspeli da epohalnom realizacijom oplodnje van tela ène postignu ro|enje prve bebe. Oni su omogu}ili da primenom njihove metode, milioni èna rode koje nisu mogle spontano da ostanu gravidne. Njihova saradnja i rad su trajali deset godina i najve}im delom se odvijali u Bolnici u Oldhamu.

Sl. 4.2- Louise Joy Brown

Sl. 4.1- Louise Joy Brown

Istorija medicine se promenila kada su zajedni~ki, ginekolog Patrick Steptoe i

Prva beba u svetu za~eta vantelesnim putem je Louise Joy (sre}a) Brown, ro|ena u 23,47 sati, 25. jula 1978. godine putem carskog reza koji je uradio Patrick Steptoe. [est meseci kasnije ro|ena je druga beba, de~ak Alastair Montgomery. Danas se procenjuje da se 1,33% ro|ene dece ra|a nakon primene neke od metoda

178


asistirane reproduktivne tehnologije. Louise Joy Brown je po~etkom 2007. godine rodila dete. Oplodnja u in vitro uslovima, osim svoje ogromne vrednosti primene u prakti~noj medicini otvorila je vrata nau~nom istraìvanju, jer je ~ovek prvi put mogao da posmatra u laboratorijskim uslovima procese po~etka ìvota sa nezamislivim nau~nim mogu}nostima daljeg istraìvanja potpuno novih oblasti. Rezultat toga je ogroman nau~ni huk novih istraìvanja i otkri}a u poslednjih dvadeset godina. Metoda vantelesne oplodnje je kompleksna i sastoji se iz nekoliko delova: - stimulacija folikulogeneze, - punkcija i aspiracija folikula, - identifikacija jajne }elije, - fertilizacija, - embrio transfer, - luteal support.

1.1. STIMULACIJA FOLIKULOGENEZE Hormonska stimulacija folikulogeneze je manipulacija ovarijalnom funkcijom u cilju dobijanja {to ve}eg broja folikula, odnosno, zrelih oocita. Razumevanje mehanizama ranog razvoja folikula omogu}ava stvaranje individualnih protokola stimulacije ovulacije, {to je zna~ajno za ukupan uspeh programa ART - assisted reproductive technology. Inicijacija rasta primordijalnih folikula podrazumeva napu{tanje resting pool-a i traje nekoliko meseci. Smatra se da svakog meseca zapo~inje rast oko 1000 primordijalnih folikula. Folikul se razvija preko primarnog i sekundarnog stadijuma do antralnog folikula ili tercijalnog. U ovom procesu u~estvuju

specifi~ni oocitni faktori i faktori koje stvaraju granulozne }elije. Morfolo{ka i endokrina merenja su pokazala da je antralni folikul, ~iji je dijametar manji do 4 mm, prisutan u toku ciklusa i da ga je mogu}e stimulisati sa FSH - follicle stimulating hormonom. Na kraju lutealne faze, dijametar najve}ih folikula kre}e se izme|u 2 - 5 mm. Granulozne }elije u ovoj fazi su osetljivije na FSH - follicle stimulating hormon stimulaciju, ukazuju}i da su spremne za slede}i ciklus. Zahvaljuju}i gubitku funkcije corpus luteum-a, te padu estrogena, koncentracija FSH - folikul stimulirajuceg hormona raste na kraju lutealne faze. Svaki folikul ima isti potencijal da dostigne potpunu maturaciju, ali samo oni folikuli koji su u odmaklom stadijumu maturacije u toku interciklusnog rasta FSH - folikul stimulirajuceg hormona, tzv. praga za ovarijalnu stimulaciju, postaju gonadotropno zavisni i nastavljaju rast. Smatra se da antralnih folikula koji su regrutovani u toku luteofolikularne tranzicije ima oko 5 - 10 po ovarijumu. Smanjenje koncentracije FSH - folikul stimulirajuceg hormona u toku folikularne faze, poznato kao FSH - follicle stimulating hormone window, odlu~uju}e je za selekciju jednog dominantnog folikula iz regrutovane grupe. Samo jedan folikul izbegne atreziju zahvaljuju}i pove}anoj senzitivnosti za stimulaciju FSH - folikul stimuliraju}eg hormona. U ovom procesu isto tako aktivno u~estvuju faktori, pove}an broj granuloznih }elija, sticanje LH - luteinizing hormone receptora, pove}anje FSH - follicle stimulating hormone receptora na granuloznim }elijama kombinovano sa autokrinom i parakrinom regulacijom multiplog intraovarijalnog growth factor sistema. Jedan od mehanizama koji obja{njava ovu pojavu, bazira se na identifikovanju nekoliko izoformi FSH - folikul stimuliraju}eg


hormona, od kojih svaki pokazuje razli~iti stepen biopotencijala koji dominira u toku folikularne faze. Upotreba preparata gonadotropina u tretmanu problema neplodnosti bila je poznata od prve polovine dvadesetog veka. Inicijalno su kori{}eni preparati dobijeni iz seruma gravidne kobile, svinje i ekstrakti humane {titne `lezde za stumulaciju ovarijuma. Po~etkom pedesetih godina, HMG - human menopausal gonadotrophin je postao gonadotropinski preparat prvog izbora i dobijao se iz urina èna u menopauzi. HMG - humani menopauzalni gonadotropin je inicijalno kori{}en u cilju indukcije ovulacije kod èna sa anovulacijom. Sa uvo|enjem metode IVF - in vitro fertilizacije krajem sedamdesetih godina, HMG - humani menopauzalni gonadotropin dobija va`nu ulogu u stimulaciji multiplog razvoja folikula. Slede}a faza u razvoju gonadotropina za klini~ku upotrebu bilo je uklanjanje LH luteinizing hormona iz HMG - humanog menopauzalnog gonadotropina primenom imunoafinitetnih metoda. U-FSH - urinarni folikul stimuliraju}i hormon je sadrào FSH - folikul stimuliraju}i hormon zajedno sa koekstrahovanim urinarnim proteinima. Krajem osamdesetih godina dobija se visoko pre~i{}eni HP U-FSH - high purity urinarni folikul stimuliraju}i hormon koji se sastojao od 9000 IU FSH - folikul stimuliraju}eg hormon aktivnosti / mg proteina i 1% urinarnih proteina. U daljem razvoju poku{avano je da se dobije i visoko pre~i{}eni HMG - humani menopauzalni gonadotropin sa definisanim vrednostima FSH - folikul stimuliraju}eg hormona i LH - luteinizirajuceg hormona. Dobijeni preparat je imao oko 2000 IU specifi~ne aktivnosti / mg proteina. LH

179

komponenta je morala biti dodata upotrebom HCG - humanog horionskog gonadotropina, koji ima ve}i poluìvot nego LH luteiniziraju}i hormon. Prisustvo varijabilnih koli~ina HCG - humanog horionskog gonadotropina u HMG - human menopauzalnog gonadodotropina preparatima je moglo da dovede do pove}anja varijacija izme|u razli~itih serija sa posledi~nom folikularnom atresijom. Analize tako dobijenog visoko pre~i{}enog HP HMG - high purity - human menopauzalnog gonadotropina su pokazivale prisustvo od najmanje 30% proteinskih ne~isto}a, uklju~uju}i leukocitni inhibitor elastaze, protein C inhibitor i cink alfa 2-glikoprotein. Izolovanje gena koji kodira sintezu beta subjedinice humanog FSH - folikul stimulirajuceg hormona 1983. godine omogu}ilo je realizaciju proizvodnje ~istog FSH folikul stimuliraju}eg hormona uz kori{}enje rekombinantne tehnologije. Prvi humani r-FSH - rek o mbinantni folikul stimuliraju}i hormon bio je odobren za klini~ku upotrebu 1995. godine. To je bio folitropin alfa. Drugi r-FSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormon, folitropin beta, odobren je 1996. godine. Alfa i beta folitropin su sli~ni u smislu imunopotencije, in vitro biopotencije i unutra{njeg karbohidratnog sastava. Folitropin alfa poseduje ve}i sadràj acidnih glikoformi. Princip protokola ovarijalne stimulacije sastoji se u davanju gonadotropnih preparata sa ciljem stimulacije multiplog razvoja folikula. Prematurni skok LH - luteiniziraju}eg hormona kupira se davanjem GnRH - gonadotropin releasing hormon agonista i u novije vreme antagonista, po~inju}i pre po~etka ciklusa, ~ime se postiè hipofizna down regulacija.

180


Izazivanje mejoti~ke deobe oocita postiè se bolus injekcijom HCG - humanog gonadotropnog hormona, ili primenom r-LH - rekombinantnog luteiniziraju}eg hormona, ili GnRH - gonadotropin releasing hormon antagonista, ukoliko su u protokolu stimulacije kori{}eni GnRH gonadotropin releasing hormon agonisti. Corpus luteum se u lutealnoj fazi podràva primenom egzogenog progesterona. Kori{}ene grupe lekova su slede}e:

GnRH agonisti

GnRH antagon Antagonisti imaju potencijalnih prednosti u odnosu na agoniste zbog brèg dejstva i odsustva simptoma koji nastaju usled pada nivoa hormona.

FSH Rekombinantni hormon FSH je identi~an prirodnom hormonu, ali budu}i da je rekombinantni ne moè da prenosi nijedan infektivni agens. Koristi se za stimulisanje rasta i razvoja folikula.

HMG

Ovu grupu predstavljaju sintetski lekovi, analozi prirodnih substanci koji mogu biti agonisti ili antagonisti po svom delovanju. Oni na po~etku kratko stimuli{u hipofizu, a potom izazivaju kontinuiranu supresiju - down regulaciju, omogu}avaju}i bolju kontrolu hormonske stumulacije kupiraju}i prematurni skok LH - luteiniziraju}eg hormona. Analiza vi{egodi{njih klini~kih studija pokazala je da njihova upotreba pove}ava procenat klini~kih trudno}a, smanjuje procenat prekida ciklusa i pove}ava broj dobijenih oocita u pore|enju sa ciklusima bez agonista. Deluju jo{ 10 - 18 dana od poslednje doze.

COS - kontrolisana stimulacija ovarijuma se postiè primenom odre|enih protokola dugog, kratkog i ultrakratkog, kao i protokola stimulacije sa antagonistima.

Sl. 4.3- Dugi protokol

Sl. 4.4- Kratak protokol

HMG - humani menopauzalni gonadotropin je ekstrahovan iz urina èna u postmenopauzi i sadrì me{avinu FSH - folikul stimuliraju}eg hormona i LH - luteiniziraju}eg hormona zajedno sa urinarnim proteinima.

HCG Humani horionski gonadotropin se inicira 36 - 38 sati pre punkcije folikula radi maturacije folikula i izazivanja ovulacije.

181


Sl. 4.5- Ultrakratki protokol

Sl. 4.6- Protokol sa antagonistima

Po~etne doze pri kori{}enju protokola stimulacije se odre|uju jo{ uvek empirijski, mada statisti~kom analizom velikog broja klini~kih studija pokazuje se da je mogu}e i ovu oblast regulisati tipizacijom modela zasnovanim na ~etiri osnovne karakteristike pacijenata: godina starosti, BMI - body mass index-a, vrednosti FSH - folikul stimuliraju}eg hormona i broja antralnih folikula. Doze preparata gonadotropina kao i drugih peptida i proteina koji se koriste u farmakolo{koj praksi se tradicionalno iskazuju u IU - internacionalnim jedinicama koje predstavljaju aktivnost merenu u in vivo biolo{kim parametrima po Steelman-Pohley bioeseju ve} preko 50 godina. Procedure za sakupljanje i interpretaciju podataka su velike, a koeficijent varijacije moè biti 10 - 20%, {to moè imati za posledicu neravnomernu stimulaciju. Nedavni napredak u procesu proizvodnje kao i razvoju validnih fizi~ko-hemijskih metoda za odre|ivanje strukture gonadotropina omogu}ilo je da se u procesu proizvodnje rekombinantnih gonadotropina r-FSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormon, r-LH - rekombinantni luteiniziraju}i hormon i r-HCG - rekombinantni humani horionski gonadotropin, upotrebi

FbM - filled by mass tehnika. FbM - filled by mass tehnikom gonadotropini su ta~no dozirani, kvantifikovani HPLC - high performance liquid chromatography, visoko efikasnom te~nom hromatografijom, metodom podrànom mapiranjem glikana, izo-elektri~nim fokusiranjem i podacima o specifi~noj aktivnosti koji demonstriraju fizi~ko-hemijsku postojanost produkta. COS - kontrolisana ovarijalna stimulacija se postiè, uz primenu odre|enog protokola, svakodnevnim pra}enjem razvoja folikula ultrazvu~nom sonografijom i dozaòm hormona.

Sl. 4.7- Ultrazvu~na folikulometrija

182


Dominantni folikul se identifikuje na osnovu: dijametra ve}eg od 10 mm, intrafolikularnih endokrinih promena i indukcije enzimske aromatozne aktivnosti. Utvr|en je porast inhibina B neposredno nakon interciklusnog rasta FSH - folikul stimulirajuceg hormona. Inhibin B limitira trajanje rasta FSH - folikul stimuliraju}eg hormona skra}uju}i FSH - folikul stimuliraju}eg hormona window, putem negativnog feed back-a sa hipofizom i moè da bude odlu~uju}i za monofolikularni razvoj. Primena malih doza egzogenog FSH folikul stimuliraju}eg hormona u toku sredine folikularne faze moè da poremeti ovaj mehanizam spre~avaju}i pad njegovih vrednosti pro{irenjem FSH - folikul stimuliraju}eg hormona window. Ovo ukazuje da se selekcija dominantnog folikula de{ava relativno kasno u toku folikularne faze oko 7 dana. U toku sedam dana preovulatornog LH - luteinizing hormone peak-a, folikul raste linearno u proseku 1,1 mm dnevno, dostiù}i prose~nu preovulatornu veli~inu od oko 20,5 mm.

Uticaj pretretmana kontraceptivnim pilulama OCP - oral contraceptive pill na broj teku}ih trudno}a kod pacijenata u programima stimulisanih ciklusa u pore|nju sa pacijentima u tretmanima bez predtretmana nisu pokazali nikakvu signifikantnu statisti~ku razliku u broju trudno}a. Ono {to se u svim klini~kim radovima pokazalo zna~ajno je ve}i broj gubitaka rane trudno}e kod pacijenata sa predtretmanom kontraceptivnim pilulama OCP oral contraceptive pill.

1.2. ENDOMETRIJUM U STIMULISANOM CIKLUSU Endometrijalna funkcija u smislu receptivnosti u IVF - in vitro fertilisation ciklusima je dosta kontraverzna imaju}i u vidu da ne postoji jedinstveni marker receptivnosti koji je definisan u prirodnom ciklusu. IVF - in vitro fertilisation tretman generalno podrazumeva primenu visokih doza gonadotropina, i s tim u vezi suprafiziolo{ke

Sl. 4.8- Folikuli snimljni 4 D ultrazvukom


183

koncentracije serumskog estradiola i progesterona, {to direktno ima uticaj na kvalitet endometrijuma. Danas, najve}i broj protokola stimulacije podrazumeva upotrebu GnRH - gonadotropin releasing hormon analoga i gonadotropina. Histolo{ke promene endometrijuma u toku menstrualnog ciklusa opisane su jo{ pre 50 godina. Histolo{ka maturacija u prirodnom i stimulisanom ciklusu u lutealnoj fazi nultog dana i 7. dana je data na slede}im slikama. Sl. 4.11- Lutealna faza, prirodni ciklus, 7. dan

Sl. 4.9- Lutealna faza, prirodni ciklus, nulti dan

U prirodnom ciklusu na dan ovulacije pseudostratificirani epitel je bez vakuola.

Sl. 4.10- Lutealna faza, stimulisani ciklus, nulti dan

U stimulisanom ciklusu na dan punkcije i va|enja oocita glandularne }elije pokazuju subnuklearnu vakuolizaciju i veoma malo mitoti~kih figura.

Sl. 4.12- Lutealna faza, stimulisani ciklus, 7. dan

U lutealnoj fazi sedmog dana stimulisanog ciklusa endometrijum pokazuje glandularno stromalnu disinhroniju sa perzistiraju}im vakuolama u `lezdama. Histolo{ki nalazi u preovulatornoj fazi ciklusa pokazuju proliferativne i rane sekretorne promene, ~ak i pre nego {to do|e do po~etka rasta progesterona. U preovulatornoj fazi registruje se op{te odmakla maturacija endometrijuma. Na dan punkcije oocita vidi se dalji progres maturacije endometrijuma. Dva dana nakon punkcije oocita, registruje se diskordinantna stromalna maturacija sa edemom i vaskularnom hipertrofijom. Nije na|ena zna~ajna razlika izme|u stimulisanih i prirodnih ciklusa.

184


U ranoj srednjoj lutealnoj fazi i 4. dana nakon punkcije oocita, glandularni razvoj ne pokazuje razlike izme|u stimulisanog i spontanog ciklusa. U ciklusima gde je primenjen luteal support sa HCG - human chorionic gonadotropinom ili vaginalnim progesteronom na|ena je normalna histologija bez razlike, zbog primene luteal support-a. U lutealnoj fazi od 11 - 13. dana nakon HCG - human chorionic gonadotropin injekcije na|en je normalni endometrijum. [to se ti~e pore|enja endometrijuma u preovulatornoj fazi izme|u 2 i 4. dana u ciklusima sa primenom agonista i antagonista, uzorci biopsije pokazuju sli~ne endometrijalne promene. U srednjoj lutealnoj fazi u pore|enju sa ciklusima sa agonistima, po~etni rezultati pokazuju manje ka{njenje kod primene antagonista ukoliko se ne primenjuje luteal support. S obzirom na te{ko}e proistekle iz razli~itih protokola stimulacije i primene agonista, kao i razli~itog reìma lutealne podr{ke i metoda analiza endometrijalne biopsije, te{ko je izvu}i precizan zaklju~ak. Op{te je mi{ljenje da je u peri i postovulatornom periodu prisutna uznapredovala maturacija endometrijuma, pra}ena normalnim karakteristikama endometrijuma u ranoj lutealnoj fazi rezultiraju}i u ~estoj glandularno - stromalnoj disihroniji u srednjoj i kasnoj lutealnoj fazi. Opaànja kod primene GnRH - gonadotropin releasing hormon agonista, potvr|uju klini~ku potrebu za lutealnom podr{kom u ovim ciklusima u cilju korigovanja u srednjoj lutealnoj fazi, tj. manje ka{njenje glandularnog razvoja. Posebne promene endometrijuma u IVF - in vitro fertilisation ciklusima verovatno su uzrokovane dejstvom nekoliko faktora. Rano i pove}ano izlaganje endometrijuma dejstvu progesterona moè da objasni

ranu sekretornu transformaciju, kao i sledstveni glandularni arest u sredini lutealne faze. Pove}ani serumski nivo estradiola u stimulisanim ciklusima povezan je sa ~estom glandularno - stromalnom asihronijom. HCG - human chorionic gonadotropin je mogu}i uzrok poreme}ene endometrijalne morfologije u lutealnoj fazi. Na kraju je dokazano da GnRH - gonadotropin releasing hormon i njegovi agonisti imaju antiproliferativni efekat na endometrijum. Endometrijalni steroidni receptori u stimulisanom ciklusu su od posebnog zna~aja. U stimulisanim ciklusima glandularni i stromalni progesteronski receptori su smanjeni u preovulatornoj i lutealnoj fazi. Podaci o endometrijalnim estrogenim receptorima u stimulisanim ciklusima su manje jasni, budu}i da je na|eno u razli~itim studijama i smanjenje i pove}anje glandularnih estrogenih receptora. Drugog dana nakon punkcije oocita, na|en je nizak nivo progesteronskih receptora povezan sa smanjenim brojem estrogenih receptora, kako glandularnih tako i stromalnih, {to je potvr|eno i u toku lutealne faze u stimulisanim ciklusima. Neke od studija su pokazale odsustvo razlika u steroidnim receptorima izme|u prirodnog i stimulisanog ciklusa u toku razli~itih dana lutealne faze, ali su ukazale na razli~itu regulaciju progesteron povezanih molekula, kao {to su growth faktori i ubiquitin u prirodnim i stimulisanim ciklusima. Ovi rezultati potkrepljuju zapaànja o modifikovanom endometrijalnom okruènju u stimulisanim ciklusima u pore|enju sa prirodnim. Markeri implantacionog prozora u stimulisanim ciklusima su posebno istraèni zbog njihovog zna~aja. Implantation window - implantacioni prozor je definisan kao ograni~eni period u


toku koga je uterus receptivan za implantaciju slobodne blastociste. Pretpostavlja se da u humanom prirodnom ciklusu apozicija blastociste po~inje oko LH-peak + 6 dana i zavr{ena je LH-peak + 10 dana. U toku receptivne faze endometrijum privremeno sekretuje proteine koji }e biti prepoznati od strane embriona i koji }e olak{ati njegov rast i diferencijaciju. U najzna~ajnije faktore implantacije spadaju luminalne epitelne pinopode, ekspresija adhezionih molekula i citokina.

185

toku priprodnog i stimulisanog ciklusa. Integrini su povr{inski }elijski adhezioni molekuli uklju~eni u {iroki spektar }elijskih procesa.

Sl. 4.14 - Integrin imunohistohemijski obojen

Sl. 4.13-Pinopode prominiraju iznad cilija

Pinopodi su opisani kao epitelne projekcije sa pinocitoti~kom aktivno{}u. Kod normalnih fertilnih èna, formacija i regresija pinopoda je blisko povezana sa koncentracijom serumskog progesterona kao i sa down regulacijom progesteronskih receptora B u glandularnim i luminalnim }elijama. Pinopode su dokazane na apikalnoj povr{ini luminalnih epitelnih }elija u toku postojanja implantation window-a od 20 - 22. dana. Me|utim, nedavne studije dovode u pitanje ovu pretpostavku, budu}i da pojava pinopoda varira i do 5 dana izme|u èna, kao i da direktno u~e{}e ovih struktura u implantaciji embriona nije potvr|eno. Novije studije koje su upore|ivale ekspresiju pinopoda kod istih pacijenata nisu pokazale razlike u ekspresiji u

Na slici se vidi integrin 7. dana lutealne faze u stimulisanom ciklusu. Glandularni epitel pokazuje membranozno bojenje. Pretpostavlja se da su tri integrina: alfa 1 beta 1, alfa 4 beta 1 i alfa 5 beta 3, va`na za endometrijalnu receptivnost, budu}i da se jasno ispoljavaju u toku implantation window-a. LIF -leukemia inhibitory factor je pleiotrofi~ni citokin iz gp 130 familije. LIF leukemia inhibitory factor se pojavio kao prvi citokin koji je uklju~en u razvoj i implantaciju embriona.

Sl. 4.15- LIF - leukemia inhibitory factor

186


U stimulisanom ciklusu 7. dana lutealne faze raspoznaje se intenzivno bazalno i apikalno citoplazmati~no bojenje. Razvoj endometrijuma u IVF - in vitro fertilisation ciklusima pokazuje progres koji je ve}i ili jednak za 2 dana u odnosu na prirodni ciklus na dan ovulacije. Ovaj progres je vi{e istaknut u ciklusima sa prematurnim porastom serumskog progesterona na ili pre dana injekcije HCG human chorionic gonadotropina. U GnRH - gonadotropin releasing hormon antagonist ciklusima, stepen endometrijalnog progresa se moè predvideti pomo}u visokih koncentracija LH luteinizing hormona u vreme inicijacije stimulacije rekombinovanim FSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormona i trajanjem tokom stimulacije rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormona pre antagonist inhibicije. Ova korelacija nije bila prisutna kod GnRH - gonadotropin releasing hormon agonist ciklusa, gde niska serumska koncentracija LH - luteinizing hormona nastaje kao rezultat hipofizne desenzibilizacije. Endometrijalne morfoloske karakteristike posebnih sekretornih transformacija u oba stimulatorna reìma uklju~uju pojavu uniformnih glandularnih subnukleolarnih vakuola, zamenjuju}i nukleus. Ove histolo{ke promene su povezane sa smanjenjem proliferacionog indeksa i proliferacionog sadràja i kod `lezda, i u stromi. Implantacija korelira negativno sa zna~ajnim endometrijalnim maturacionim progresom koji je ve}i od 3 dana na dan punkcije oocita. Na dan punkcije ni jedan endometrijalni marker nije povezan sa ishodom klini~ke trudno}e. Dosada{nja iskustva su pokazala da u stimulisanim ciklusima sa embriotransferom,

izmenjeni endometrijum kao posledica terapije tokom IVF - in vitro fertilisation ima manji uticaj na endometrijalnu receptivnost nego {to se ranije pretpostavljalo. Kvalitetan embrion moè u odre|enom stepenu da kompenzuje manje optimalan razvoj endometrijuma. Postoje jaki dokazi iz histolo{kih opservacija i ekspresije implantation window-a markera da ovarijalna stimulacija u toku IVF - in vitro fertilisation menja endometrijalni razvoj u lutealnoj fazi. Iz studija o IVF - in vitro fertilisation ciklusima se pokazalo da samo ekstremno devijantna endometrijalna morfologija ima uticaj na receptivnost endometrijuma za implantaciju. Dalje otkrivanje molekula uklju~enih u implantacione mehanizme neophodno je za bolje razumevanje veze izme|u nastalih promena razvoja i receptivnosti u IVF - in vitro fertilisation ciklusima.

1.3. PUNKCIJA I ASPIRACIJA FOLIKULA I KOMPETENCIJA OOCITA Klini~ka primena tehnika in vitro oplodnje kod neplodnih parova je pra}ena upotrebom egzogenih gonadotropina radi podsticanja vi{estruke folikularne maturacije. Uspeh ovih tehnika zavisi od sposobnosti odabiranja pravog trenutka za aspiraciju oocita u cilju dobijanja zrelih oocita u drugoj metafazi pre njihove ovulacije. Ve}ina IVF - in vitro fertilisation programa koriste iste, nedovr{ene, parametre zrelosti oocita za odre|ivanje trenutka za punkciju, i to, veli~inu folikularnog pre~nika merenu vaginalnim ultrazvukom i odre|ivanje serumskog oestradiola. Upotrebom ovih parametara je utvr|eno da se folikularno sazrevanje pokre}e kada folikul

187


dostigne srednji pre~nik od 16 - 18 milimetara. U kontekstu trenutne prakse asistirane reprodukcije, gde mnogi programi kombinuju ovarijalnu stimulaciju pituitarnom regulacijom sa GnRH - gonadotropin releasing hormonom, sazrevanje oocita se obi~no podsti~e u odsustvu endogenog LH - luteinizing hormone talasa pomo}u HCG - human chorionic gonadotropina kada nekoliko folikula ima srednji pre~nik ve}i od 18 mm. Mi{ljenja su podeljena o optimalnom pre~niku koji folikuli treba da dostignu pre primene egzogenog HCG - human chorionic gonadotropina, 16mm, 18mm ili vi{e od 20mm. Postoje nesumnjivi dokazi da zreli folikuli vr{e parakrini efekat unutar jajnika. Tako zreli oociti u drugoj metafazi mogu biti dobijeni iz relativno malih folikula koji imaju srednji pre~nik manji od 16 mm, pod uslovom da je bar neki od cohort-a dostigao optimalnu veli~inu. Me|utim, ne suprostavljaju}i se uspehu ovog metoda u nadokna|ivanju oocita koji su dostigli nuklearnu zrelost, postoje dokazi da je ve}ina ovih oocita manje kompetentna. Tako, bez obzira na nadoknadu mejoti~ki zrelih oocita koji imaju prihvatljiv stepen oplodnje, ve}ina embriona nema kapacitet da se implantira ili da se razvije u fetus sposoban za normalan rast i razvoj. Ovo se moè povezati sa izve{tajem o velikom padu aneuploidnosti oocita koji moè pogoditi vi{e od 25% morfolo{ki normalnih oocita. Bilo je sugerisano da poreme}aji hromozomske segregacije i spindle defekti mogu biti rezultat suptilnih promena u fiziologiji citoplazme kao {to je smanjeni intracelularni pH. Transvaginalna punkcija folikula kori{}enjem abdominalne sonde je prvi put opisana od strane Dellenbach-a 1984. godine. Mnogo direktniji i lak{i metod postiè se ne{to kasnije uvo|enjem vaginalne sonde.

Prvi put ova tehnika opisana je 1984. godine od strane Wickland-a. Prednosti ove metode su da je minimalni rizik povre|ivanja mokra}ne be{ike, ve}a preciznost lokalizacije folikula, kao i mogu}nost izvo|enja postupka u lokalnoj anesteziji.

Sl. 4.16- Transvaginalna punkcija folikula

1.4. IDENTIFIKACIJA OOCITA Identifikacija oocita se vr{i na osnovu izgleda oocit - korona - kumulus kompleksa gde se procenjuje nivo mucifikacije, rastresitost coronae radiata i cumulus-a, kao i prisustva ili odsustva nuklearne membrane, germinal vesicle i polarnog tela. Procenat zrelosti oocita zasnovanog samo na evaloaciji kumulusa i korone je dovoljna u rutinskom programu.

Sl. 4.17- Oocit u medijumu neposredno nakon punkcije

188


Zreo preovulatorni oocit karakteri{e ekstenzivno rastresit, pro{iren kumulus i coronae radiata. Prisustvo prvog polarnog tela ukazuje da je oocit u metafazi II. Oocit srednje zrelosti karakteri{e neznatno gu{}a korona radiata uz rastresit cumulus. Ne identifikuju se germinal vesicle i polarno telo. Nezreo oocit ima kompaktnu coronu, a cumulus se sastoji od samo nekoliko }elijskih slojeva. Germinal vesicle se lako prime}uje kod nezrelih oocita. Atreti~ni oocit karakteri{e oskudan, kompaktan cumulus sa crnom i nepravilno oblikovanom ooplazmom.

1.5. PRIPREMA SPERME Od po~etka primene IVF - in vitro fertilizacija se pokazala kao efikasan tretman za le~enje ènske neplodnosti, naro~ito tubarne neplodnosti. Tokom godina koje su usledile metoda je, tako|e, uspe{no primenjena kod parova sa idiopatskom neplodno{}u, a ne{to kasnije i u slu~ajevima androlo{kog steriliteta. Karakteristike sperme su odre|ene prema kriterijumima Svetske zdravstvene organizacije. Postalo je o~igledno da su rezultati konvencionalne IVF - in vitro fertilizacije bili mnogo manje efikasni kada su karakteristike sperme bile ispod referentnih vrednosti koje se odnose na koncentraciju, morfologiju i pokretljivost spermatozoida. Procenat oocita, koji je oplo|en je bio zna~ajno niì, {to je rezultovalo formiranjem mnogo manje embriona. Embrioni nisu bili pogodni za transfer. Broj parova sa manje od 500.000 progresivno pokretnih spermatozoida, nisu mogli biti uklju~eni u program. Krajem 1980-ih godina je razvijeno nekoliko procedura asistirane oplodnje i primenjene su kod parova kod kojih nije

mogla biti upotrebljena konvencionalna IVF - in vitro fertilizacija. Kod prve tehnike PZD - partial zona dissectio pravljen je mali otvor u zona pelucidi koji je dozvoljavao spermatozoidima direktan pristup oolemi. Ukupni rezultati PZD - partial zona dissectio su bili razo~aravaju}i. Slede}a tehnika koja je bila predstavljena je bila SUZI subzonska inseminacija. Nekoliko pokretnih spermatozoida je injektovano kroz perivitelinski prostor. Na ovaj na~in fertilizovano je pribli`no 20% oocita. Iskustvo sa primenom ove dve metode je pokazalo da je procenat normalnih oplodnji bio previ{e mali. U ve}ini klini~kih radova potvr|eno je da je u proseku samo jedan ili dva embriona transferirano, i to, kod oko 66% pacijenata od ukupnog broja. Procenti trudno}a i poro|aja su bili premali da bi se ove tehnike razmatrale za rutinsku klini~ku primenu. U julu 1992. godine je objavljena prva trudno}a i poro|aj nakon uvo|enja metode ICSI - intra citoplasmatic sperm inection, kada se jedan spermatozoid injektuje u oocit nakon prolaska kroz zona pellucidu i kroz membranu oocita, oolemu. U narednom periodu, do danas, istraìvanja su se fokusirala na odnos izme|u smanjene zrelosti spermatozoida i frekventnosti hromozomnih aneuploidnosti i paralelno na efikasnost raznih metoda pripreme spermatozoida koje se koriste u asistiranoj reprodukciji radi eliminacije nezrelih spermatozoida. Klju~ne ta~ke dosada{njih istraìvanja koje treba naglasiti su slede}e: - zadràvanje citoplazme kao markera nezrelosti spermatozoida i dvotalasni {ablon izbacivanja testis specifi~nog HspA2 - heat shock 70kDa protein 2 prate}eg proteina kod razvijenih spermatozoida tokom mejoze i kasne spermatogeneze;


- }elijsko sazrevanje, remodeliranje membrane i njihov doprinos funkciji oplodnje spermatozoida; - veza izme|u spermatozoida i hromozomskih aneuploidnosti; - relativne efikasnosti gustinskog gradijenta i swim-up metode pri eliminisanju aneuploidnih i diploidnih spermatozoida; - upotreba vezivanja HA - hyaluronic acid- a pri selekciji pojedina~nih zrelih spermatozoida sa niskim nivoima hromozomskih aneuploidnosti i degradacije DNK deoksiribonukleinske kiseline (DNA - deoxyribonucleic acid).

Zadràvanje citoplazme kao markera nezrelosti spermatozoida i drugi biohemijski markeri }elijskog sazrevanja spermatozoida imaju posebnu va`nost kao objektivni biohemijski markeri zrelosti koji bi predvideli mu{ku plodnost nezavisno od tradicionalnih kriterijuma koncentracije spermatozoida i njihove pokretljivosti. U merenjima spermatozoidne kreatinN-fosfotransferaze ili CK - kreatin kinaze otkriveno je zna~ajno ve}i nivo aktivnosti CK - kreatin kinaze spermatozoida kod mu{karaca sa smanjenom fertilno{cu. [abloni imuno bojenja kreatin kinaze su pokazali da je visoka aktivnost CK - kreatin kinaze spermatozoida direktna posledica pove}anih koncentracija proteina citoplazme i CK - kreatin kinaze u samom spermatozoidu. U analizi elektroforezom ekstrakta ljudske sperme na|en je jo{ jedan protein koji sadrì ATP - adenosine triphosphate i koji je bio u srazmeri sa pojavljivanjem zrelih spermatozoida, koje karakteri{e niska aktivnost CK - kreatin kinaze i nezadràvanje citoplazme. Nedavno je identifikovan ovaj razvojno regulisani protein kao 70 kDa prate}i protein koji je nazvan HspA2 recombinant protein - heat shock 70kDa protein 2. Bliska inverzna korelacija izme|u

189

broja spermatozoida sa zadràvanjem citoplazme i odnosa HspA2 - rekombinantni protein je pokazala da su eliminacija citoplazme i po~etak sinteze me|usobno povezani. Ovaj protein se pokazao kao najkorisiji objektivni biohemijski marker. U spermatogenezi istovremeno sa eliminacijom citoplazme i po~etkom sinteze HspA2 - proteina, membrana spermatozoida prolazi kroz remodeliranje vezano za sazrevanje. Ovaj korak remodeliranja olak{ava formiranje receptora koji sluè za vezivanje za zonu pellucidu i za vezivanje hialuronske kiseline kod zrelih spermatozoida. Nezreli spermatozoidi imaju povi{ene stepene peroksidacije lipida . Utvr|eno je u daljim studijama da se svi doga|aji tokom sazrevanja spermatozoida, koji su u vezi sa padom aktivnosti CK kreatin kinaze i pove}anjem ekspresije HspA2 - recombinant protein zavr{avaju do trenutka kada spermatozoidi u|u u epididimis.

]elijsko sazrevanje i remodeliranje membrane imaju uticaja na funkciju oplodnje. Prediktivne vrednosti aktivnosti kreatin kinaze koja predstavlja zadràvanje citoplazme je testirana kod parova le~enih intrauterinom inseminacijom kod kojih je suprug bio oligospermi~an. U svim slu~ajevima identi~ne koncentracije spermatozoida i parametara pokretljivosti postojala je ~etvorostruko nià aktivnost kreatin kinaze spermatozoida parova kod kojih je do{lo do trudno}e. U studijima je potvr|eno da su samo zreli spermatozoidi sa niskom kreatin kinazom bili sposobni da se veù za zonu pelucidu. Spermatozoidi sa zadrànom citoplazmom se nisu vezivali za oocite. U daljem prou~avanju se pokazalo da se remodeliranje membrane kod spermatozoida odvija istovremeno sa istiskivanjem citoplazme

190


tokom spermatogenetskog sazrevanja. Ovo je demonstrirano bliskom korelacijom izme|u koncentracije kreatin kinaze ili odnosa HspA2 - heat shock 70kDa protein 2 recombinantnog proteina i gustine enzima plazme spermatozoida β1,2 -galaktosiltransferaze kod spermatozoida razli~ite zrelosti. Ovaj nalaz obja{njava dve va`ne karakteristike nezrelih spermatozoida: zadràvanje citoplazme i deficijenciju u vezivanju sa zonom pelucidom. Izbacivanje HspA2 - heat shock 70kDa protein 2 proteina se odvija istovremeno sa kretanjem spermatozoidnih proteina, koji je u osnovi istiskivanja citoplazme i remodeliranja plazma membrane spermatozoida. Ovo omogu}ava vezivanje spermatozoida za zonu pelucidu. Sinteza Hsp70 - 2 - heat shock 70kDa protein 2 familije proteina reguli{e se u toku razvoja i Hsp70-2 - heat shock 70kDa protein 2 se pojavljuje tokom profaze mejoze. Protein Hsp70 -2 - heat shock 70kDa protein 2 koji osloba|a testis, prvo se sinteti{e kod pahitenskih spermatocita tokom mejotske faze spermatogeneze i istrajava u spermatidima i zrelim spermatozoidima. Funkcije Hsp70 - 2 - heat shock 70kDa protein 2 su odràvanje sinaptonemalnih kompleksa i pomaganje kreatanju hromozoma tokom mejoze i razvoja spermatocita. Prema tome, ciljano inaktivacija Hsp70 -2 - heat shock 70kDa protein 2 gena izaziva zastoj sazrevanja spermatozoida i azospermiju, {to moè biti povezano sa lo{om mejotskom rekombinacijom spermatocita, reme}enjem regulatornog mehanizma }elijskog ciklusa mejoze, ili sa direktnom degradacijom apoptoti~kog mehanizma spermatocita, ili ~ak spermatida, ili ejakuliranih nezrelih spermatozoida.

Veza izme|u nezrelosti spermatozoida i hromozomskih aneuploidija je od posebnog

zna~aja. Frekvencija hromozomskih aneuploidnosti je ve}a kod nezrelih spermatozoida u odnosu na zrele. Ra|ene su korelacione analize o zavisnosti izme|u udela nezrelih spermatozoida i zadràvanja citoplazme i frekvencije ukupnih dizomija, diploidije i ukupnih dizomija i diploidije. Me|u raznim dizomijama je dizomija Y hromozoma u najboljoj korelaciji sa incidencijom nezrelih spermatozoida. Treba posebno izdvojiti rezultate studija koje su utvrdile da nije bilo nikakve korelacije izme|u nezrelih spermatozoida i incidencije diploidije, sto zna~i da pojava diploidnosti nije u vezi sa nezrelo{}u spermatozoida.

Relativne efikasnosti gustinskog gradijenta i swim-up metode pri eliminisanju aneuploidnih i diploidnih spermatozoida su potvr|ene u mnogobrojnim istraìvanjima. Nezreli spermatozoidi imaju manju gustinu zbog zadràne citoplazme, u pore|enju sa zrelim spermatozoidima koji se sastoje od nukleusa, akrozoma, strukture repa i plazma membrane. Zbog ovog razloga se zreli spermatozoidi, bez citoplazme, taloè na dnu gustinskih gradijenata, dok se nezreli spermatozoidi zadràvaju u gornjem delu, bilo na vrhu faze gradijenata, ili u slu~aju multifaznih gradijenata, u me|uprostoru izme|u razli~itih faza gradijenta. Gradijent se sastoji od koloidnih ~estica SiO2 stabilisanih kovalentno povezanim hidrofilnim koloidalnim ~esticama silana SiH4. Rastvor sadrì EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid i glukozu. Gradijent se naj~e{}e formira postepeno u slojevima rastvora od 90%, 70% i 40% u cilju selektiranja odre|enih pre~nika }elija. Prvi sloj }e zadràti epitelne }elije i krvne }elije. Sloj sa koncentracijom od 70% }e odvojiti nezrele spermatozoide, okrugle spermatide kao i one sa abnormalno oblikovanim glavama.

191


U praksi je i dualni gradijent sastavljen od 40% i 90% rastvora podjednako efikasan u izdvajanju normalnih spermatozoida. U studijama koje su ra|ene analiziralo se da li gustinski gradijenti elimini{u nezrele spermatozoide iz delova taloga, da li se odvajaju spermatozoidi sa hromozomskim aneuploidijama i diploidijama iz dela taloga i da li postoji veza izme|u pojave nezrelih spermatozoida i spermatozoida sa hromozomskim aneuploidijama. U studijama je kori{}en Percoll gradijent i njegovi derivati. Upotrebom FISH - fluorescence in situ hybridization metodom su procenjivani nukleusi spermatozoida, u svakoj od 20 frakcija pomo}u centromerskih sondi za hromozome X, Y i 17, {to je prikazano na slici br. 4.18. U istraìvanjima je potvr|eno da je u~estalost hromozomskih aberacija kod spermatozoida, kako aneuploidija tako i diploidije, zna~ajno smanjena u 80% Percoll talogu nasuprot inicijalnim frekvencijama koje su odre|ivane u spermatozoidima ejakulata.

normalan

Ovi nalazi mogu se objasniti pove}anim brojem zrelih spermatozoida u 80% Percoll talogu. Tako|e je sa stanovi{ta zrelosti spermatozoida, uzorak izdvojen u talogu homogeniji od inicijalnih uzoraka. U~estalosti dizomije i diploidije spermatozoida u Percoll talogu smanjene su 2,8 puta u odnosu na inicijalni uzorak. Porede}i odvojeno dizomije i diploidiju, moè se konstatovati da je smanjenje bilo o~iglednije kod disomija, i to, 3,3 puta u odnosu na diploidiju, ~ije smanjenje je bilo 2,1 puta. Dizomije su u direktnoj korelaciji sa eliminacijom nezrelih spermatozoida iz ejakulata u odnosu na diploidnosti. Swim-up tehnika se ~esto koristi za pripremu spermatozoida u metodama asistirane reprodukcije. Uvo|enje fluoroscentne in situ hibridizacije FISH - fluorescence in situ hybridization sa hromozom specifi~nim DNK - deoksiribonukleinska kiselina sondama je olak{alo detekciju aneuploidija X i Y hromozoma i nekih autozoma, kao i detekciju diploidnosti. Publikacije koje su se bavile rezultatima posle

dizomija

diploidija

Sl. 4.18- FISH - fluorescence in situ hybridization dekompenzovano jedro spermatozoida (markeri centromera X, Y i 17)

192


swim-up separacije fokusirale su se na pitanje eliminacije spermatozoida sa aneuploidijama i diploidijom, ali su objavljeni rezultati protivure~ni. Postoje izve{taji koji pokazuju da nije bilo promena u frekvencijama aneuploidnosti ili diploidnosti inicijalnog ejakulata nasuprot swim-up selektiranim spermatozoidima. U drugim studijama je utvr|en pad frekvencije pojave diploidnosti nakon swim-up pripreme sperme. U nekim studijima nije bilo razlika u frekvencijama dizomije ili diploidnosti izme|u inicijalnog uzorka i swim-up separisanih spermatozoida pri koncentraciji ve}oj od 30 miliona/ml, ali je utvr|eno smanjenje broja aneuploidnih i diploidnih spermatozoida u grupi pacijenata sa brojem manjim od 30 miliona/ml. Postojale su individualne varijacije u frekvenciji dizomija polnog hromozoma zbog varijacija u broju nezrelih spermatozoida. Ove razlike me|u razli~itim studijama se obja{njavaju varijacijama u selekciji pacijenata i zbog malog broja procenjenih nukleusa spermatozoida. Za pouzdanu procenu broja aneuploidnosti i diploidnosti, s obzirom na srednju frekvenciju od 0,1% do 0,6%, ili 1 do 6 devijantnih nukleusa spermatozoida na svakih 1.000 trebalo bi proce-

niti pribli`no 6.000 -10.000 spermatozoida u svakom uzorku, {to kod ve}ine studija nije slu~aj. Od posebnog interesa je bilo pitanje stepena eliminacije hromozomskih aberacija kori{}enjem swim-up metode, jer su dosada{nje studije pokazale da je gradijentna separacija efikasnija u eliminaciji spermatozoida sa dizomijama, nego u eliminaciji spermatozoida sa diploidijom. Nezreli spermatozoidi su identifikovani prisustvom zadràne citoplazme ozna~ene pomo}u kreatin kinaze-imunocitohemije. Aneuploidnosti su detektovane pomo}u FISH - fluorescence in situ hybridization metode. U jednoj od studija analizirani su i dobijeni slede}i podaci: Efikasnost swim-up procedure je merena pore|enjem broja pokretnih spermatozoida u inicijalnom uzorku sa brojem nakon swim-up selekcije. U ovoj grupi je broj pokretnih spermatozoida bio 37,4 ± 4,3% {to je i prikazano u donjoj tabeli. Zajedno sa pove}anjem broja pokretnih spermatozoida u swim-up selektiranoj spermi, deo nezrelih spermatozoida sa zadrànom citoplazmom je tako|e opao. Odnos zrelih i nezrelih spermatozoida: inicijalni uzorak 55,5% u odnosu prema 44,5%, swim-up 71,7% u odnosu prema 28,3%.

Tabela 4-1: Swim-up studija (po Kovacs-u)

Pacijent 1 2 3 4 5 6 7 8 Ukupna srednja vrednost

Koncentracija (M/ml) 10 45,5 22,3 12,2 32,7 15,8 10,4 8,9

Pokretljivost (%) 50 42,1 46,1 30,7 48,4 42,3 43,4 59,2

19,7±4,64

45,2±2,87

Swim-up Prinos pokretnih pokretljivost (%) spermatozoida (%) 90 52 92,6 43,4 76,1 49,5 30 10 90 70,8 75 51,5 70 1,55 50 6,6 71,7±7,73

37,4±8,33

193


Analiziraju}i ostale dizomije utvr|eno je zna~ajno smanjenje dizomija polnog hromozoma, sa ukupnim smanjenjem od 1,4 puta. Frekvencija diploidnosti i njeno smanjenje je pokazalo rezultat druga~iji od onog kod dizomija. Diploidija je skoro trostruko smanjena, u~estalost diploidija kod swim-up selektiranih spermatozoida smanjena je 2,9 puta u odnosu na inicijalni uzorak. Kao {to je ranije konstatovano kod primene gradijentne i swim-up metode selektuju se i dizomije i diploidija. Swimup metoda pokazala se efikasnijom u smanjenju u~estalosti diploidija spermatozoida, dok je gradijentna metoda bila efikasnija u eliminaciji dizomija. Za razliku od selekcije gradijentnim rastvorom, nije bilo korelacije izme|u redukcije dizomija i udela nezrelih spermatozoida sa zadràvanjem citoplazme. Ovo pokazuje da zrelost spermatozoida i pokretljivost nisu u bliskoj vezi. Porede}i rezultate dobijene primenom gradijentne i swim-up metode pri eliminaciji aneuploidnih spermatozoida do{lo se do slede}ih zaklju~aka: Gradijentna separacija je veoma efikasna u smanjenju udela spermatozoida sa dizomijama, ali nije podjednako efikasna i u selekciji diploidnosti, jer gustina spermatozoida igra odre|enu ulogu. Swim-up je manje efikasna metoda u selekciji spermatozoida sa dizomijama, u odnosu na separaciju gradijentnim rastvorom, jer pokretljivost spermatozoida i zrelost nisu uvek u direktnoj korelaciji. Efekat eliminacije spermatozoida sa dizomijom kod gradijentne centrifuge u odnosu na swim-up su 2,7 puta u odnosu na 1,4 puta. Spermatozoidi sa zna~ajno sniènom zrelo{}u ostaju u talogu, kao {to je ranije pokazano da spermatozoidi sa abnor-

malnom morfologijom imaju manje efikasnu pokretljivost. Swim-up metoda je efikasnija od gradijentne separacije u eliminisanju diploidnih spermatozoida. Faktor eliminacije diploidnosti kod gradijentne centrifuge u odnosu na swim-up je 1,85 puta u odnosu na 2,86 puta. Smatra se da su diploidni spermatozoidi teì, pa je zbog toga efikasnost njihovog kretanja umanjena.

Upotreba vezivanja HA - hyaluronic acid - a pri odabiranju pojedina~nih zrelih spermatozoida sa niskim nivoima hromozomskih aneuploidnosti i degradacije DNK - deoksiribonukleinske kiseline je novijeg datuma. Zreli spermatozoidi u odnosu na hijaluronsku kiselinu pokazuju pove}anu brzinu kretanja i prolongiranu pokretljivost.

Sl. 4.19- HA - hyaluronic acid

Na osnovu veze izme|u sazrevanja spermatozoida i remodeliranja plazma membrane dokazano je prisustvo receptora HA - hyaluronic acid kod zrelih spermatozoida, za razliku od nezrelih. Na osnovu ovoga mogu}a je selekcija zrelih spermatozoida pomo}u HA hyaluronic acid-a.

194


Sl. 4.20- Selekcija sperme uz pomo} HA - hyaluronic acid-a

Postoje veze izme|u mejotskih defekata i nedostataka remodeliranja plazma membrane. Ove veze su bazirane na dualnim funkcijama HspA2 - heat shock 70kDa protein 2, prate}eg proteina koji podràva mejozu, kao komponente sinaptonemalnog kompleksa koja olak{ava remodeliranje plazma membrane i formiranje zona pellucida-e.

U mnogim studijama je istraìvana efikasnost selektiranja zdravih spermatozoida od spermatozoida sa hromozomskim aneuploidijama i diploidijom. Rezultati su pokazali da je kod spermatozoida vezanih za HA - hyaluronic acid opao broj dizomija. Pad broja dizomija kod polnih hromozoma je bio ~etvorostruk. Broj diploidnih spermatozoida je bio smanjen {est puta. Podaci pokazuju da je selekcija putem HA- hyaluronic acid eliminisala spermatozoide sa dizomijom i diploidno{}u, efikasnije od gradijentne separacije i od swim-up tehnike. Broj aneuploidnosti i diploidnosti u postupku HA - hyaluronic acid vezivanjem je smanjen u opsegu od 0,04 - 0,13%. Selekcija spermatozoida pomo}u HA hyaluronic acid-a pruà novo, bezbedno i efikasno re{enje za izdvajanje zrelih spermatozoida za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Na osnovu dosada{njih istraìvanja moè se zaklju~iti da se zreli spermatozoidi trajno vezuju za povr{ine sa HA - hyaluronic acid, da se vezivanje spermatozoida moè testirati pomo}u HAhyaluronic acid-a i da se broj spermatozoida sa hromozomskim anomalijama smanjuje pribli`no 4 - 6 puta. Tabela 4-2: U~estalost dizomije i diploidije u ejakulatu i sperme tretirane HA - hyaluronic acid-om

Dizomija 17

Diploidnost

0,35

17

0,81

0,09

0.04

0,13

4,0x

5,3x

6,1x

Polni Sl. 4.21- Aspiracija spermatozoida u programu ICSI - intra citoplasmatic sperm injection selektiranog uz pomo} HA - hyaluronic acid-a

Pove}an broj hromozomskih aberacija usled upotrebe nezrelih spermatozoida za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je od velikog zna~aja.

Inicijal ni (%) HA-vezani (%) Redukcija

<0,001 <0,001

<0,001


Analiziraju}i radove pokazalo se da su uzro~ne veze izme|u stepena aneuploidija i infertiliteta posledica neadekvatne definicije mu{ke neplodnosti. Konvencionalna definicija je bazirana na koncentraciji i pokretljivosti spermatozoida, koja kod zna~ajnog dela oligospermi~nih ili, ~ak normospermi~nih mu{karaca ne odraàva pravi status oplodnog potencijala spermatozoida. Aktivnost kreatin kinaze, nasuprot tome, bolje prikazuje prose~nu zrelost spermatozoida u odnosu na zadràvanje citoplazme. Podaci o aktivnostima kreatin kinaze nisu merilo stvarne zrelosti pojedina~nih spermatozoida zbog velike varijacije u stepenu zadràvanja citoplazme. Relativna frekvencija spermatozoida sa umanjenom zrelo{}u, koja je va`na u odnosu na podatke dobijene FISH - fluorescence in situ hybridization analizama za pojedina~ne nukleuse spermatozoida je odre|ena procenjivanjem pojedina~nih spermatozoida putem imunocitohemije. Veza izme|u pokretljivosti i morfologije i selektivna eliminacija dizomi~nih spermatozoida pomo}u gradijentne selekcije su dobro dokumentovani zna~ajnim redukcijama broja spermatozoida sa citoplazmom, kao i zna~ajnim smanjenjem aktivnosti CK kreatin kinaze u gradijentnim talozima. Tako su objektivni biohemijski podaci potvrdili pretpostavku koja se odnosi na vezu izme|u nezrelosti spermatozoida i njihove umanjene gustine koja je posledica zadràvanja citoplazme kod nezrelih spermatozoida. Zbog toga je u pripremi za asistiranu reprodukciju, swim-up metod veoma efikasan u smanjenju dela diploidnosti. Suprotno ovome, kod smanjenja dizomije gradijentna selekcija je metoda izbora. Uloga aneuploidnih spermatozoida sa neadekvatnim remodeliranjem plazma

195

membrane, nije bila va`na kod klasi~ne oplodnje zbog prisustva barijere zone pelucide. Uvo|enjem ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode se premo{}ava konvencionalni proces prirodne selekcije spermatozoid - zona. Selekcija spermatozoida pomo}u HA - hyaluronic acid-a pruà priliku za oplodnju zrelim spermatozoidima. Osim toga, upotreba slajdova prevu~enih sa HA - hyaluronic acid-om dozvoljava istovremeno testiranje svakog pacijenta i na udeo zrelih spermatozoida i na ukupan broj pokretnih zrelih spermatozoida. Ovi podaci su veoma va`ni kod procenjivanja parova sa mu{kom neplodno{}u i kod slu~ajeva idiopatskog steriliteta, kao i u utvr|ivanju modaliteta asistirane reprodukcije koji moè biti optimalno primenjen u tretmanu datog para. Intracitoplazmi~na injekcija sperme sa testikularnim spermatozoidima je od dodatnog zna~aja, jer se danas sve ~e{}e primenjuje u praksi. Osim zrelih spermatozoida, testikularni uzorci ~esto sadrè ostatke }elija i nepoèljne }elije kao {to su nezreli spermatozoidi, okrugli spermatidi, spermatociti i spermatogonije, kao i somatske }elije, uklju~uju}i i nukleaze Sertolijevih }elija, crvena krvna zrnca, ostatke seminifernih tubula, citoplazmu okruglih spermatida i netaknute Sertolijeve i Leydigove }elije. Priprema testikularnih uzoraka je sloènija od one koja se obavlja kod epididimalnih spermatozoida. Standardni metod za izbacivanje spermatozoida iz seminifernih tubula za kori{}enje u ICSI intra citoplasmatic sperm injection je priprema uzorka dobijenog biopsijom, razvla~enjem pomo}u igala ili staklenih slajdova. Spermatozoidi se dobijaju bilo iz otvorene biopsije ili putem punkcije iglom.

196


Modifikacije ove tehnike su smek{avanje, maceracija pomo}u mikro-mlinova, enzimski tretman ili tretiranje uzorka eritrocitnim lizing puferom - lysing buffer. Izme|u ove dve metode nema razlike {to se ti~e procenta oplodnje, razvoja embriona i implantacije. Uzorci sperme, tako|e, mogu biti dobijeni filtriranjem kroz filter od 40µm radi uklanjanja }elijskih i tubularnih ostataka. U nekim embriolo{kim laboratorijama se razmotavanje pojedina~nih tubula postiè forcepsom i kompresovanjem fragmenata tubula, po~ev od srednjeg dela ka krajevima. Uzorci testikularne sperme mogu dalje biti obra|ivani jednostavnim ispiranjem u medijumu ili neprekidnom centrifugom radi uklanjanja ostataka i dobijanja suspenzije testikularnih spermatozoida. Radi za{tite spermatozoida od potencijalne {tete uticaja ROS - reactive oxygen species-a, duplira se koncentracija serumskog albumina ili ceo serum za vreme pripreme spermatozoida. Ve}e koncentracije proteina ili seruma, tako|e, smanjuju mogu}nost prijanjanja spermatozoida za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection iglu tokom rada. Pribli`no polovina testikularnih spermatozoida ne pokazuje pokretljivost u vreme pripreme, ali se i nepokretni spermatozoidi mogu upotrebiti za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection po{to imaju isti potencijal za oplodnju kao i pokretni spermatozoidi, posle pribli`no 4 sata kultivacije. Kada se testikualarni uzorak stavi u kulturu, udeo pokretnih spermatozoida je obi~no najve}i, 91% posle 24 ~asa od inkubacije. Zbog toga se biopsija zakazuje jedan dan pre punkcije i dobijanja jajnih }elija. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection sa testikularnim spermatozoidima je sli~na sa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection

sa ejakuliranim spematozoidima. Posle izdvajanja morfolo{ki normalih i pokretnih spermatozoida spermatozoidi se imobili{u u PVP - polyvinyl pyrrolidone i ubacuju se u oocit. Iako su kondenzacija hromatina i nuklearno sazrevanje nedovr{eni kod testikularnih spermatozoida, rezultat oplodnje sa testikularnim spermatozoidima je sli~an ishodu ICSI - intra citoplasmatic sperm injection sa ejakularnim spermatozoidima. TESE - testicular sperm extraction u kombinaciji sa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je metod izbora u slu~ajevima mu{ke neplodnosti sa opstruktivnom ili neopstruktivnom azoospermijom. Procenat dobijanja spermatozoida kod mu{karaca sa neopstruktivnom azoospermijom se kre}e od 40% do 70%. Postoji direktna korelacija izme|u mogu}nosti dobijanja testikularnih spermatozoida i histopatologije testisa. U pore|enju sa sindromom samo Sertolijevih }elija, Sertoly cell syndrom, {anse za uspe{no nalaènje spermatozoida su bile 44,3 puta ve}e kod slu~ajeva ozbiljne hipospermatogeneze i 8,4 puta ve}e kod mu{karaca sa zastojem sazrevanja. Mogu}nost dobijanja spermatozoida kod azoospermi~nih pacijenata je u direktnoj vezi sa etiologijom poreme}aja. Kada je testikularna histologija normalna, kao kod mu{karaca sa opstruktivnom azoospermijom ili hipoplazijom germinativnih }elija, dobijanje spermatozoida je skoro uvek uspe{no. Kod mu{karaca sa aplazijom germinativnih }elija ili zastojem u spermatogenezi, rezultat je nepredvidljiv i promenljiv. [to se ti~e mu{karaca sa neopstruktivnom i opstruktivnom azoospermijom, podaci koji se odnose na kvalitet i kvantitet spermatozoida su kontraverzni. Nekoliko izve{taja opisuje zna~ajno smanjenje uspe{nih oplodnji i trudno}a u

197


slu~ajevima neopstruktivne azoospermije. Dokazan je manji broj implantacija posle ICSI - intra citoplasmatic sperm injection sa testikularnim spermatozoidima kod neopstruktivne azoospermije u pore|enju sa odgovaraju}om kontrolnom grupom sa ejakularnim spermatozoidima i u slu~ajevima sa opstruktivnom azoospermijom uz normalnu spermatogenezu. Broj trudno}a po broju transfera embriona je zna~ajno smanjen kod pacijenata kod kojih su kori{}eni ejakulirani 21% ili epididimalni 22% spermatozoidi za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection {to je u suprotnosti sa nalazima opisanim u drugim izve{tajima koji pokazuju niì broj oplodnji kod slu~ajeva neopstruktivne azoospermije. Bez obzira na smanjenu fertilizaciju kod ovih slu~ajeva, broj trudno}a se nije promenio. Postoji jasna korelacija izme|u broja dobijenih spermatozoida i oplodnje u slu~ajevima neopstruktivne azoospermije. Na procenat oplo|enih oocita, tako|e, mogu uticati razni tipovi spermatogenetskih defekata prisutnih u neopstruktivnoj grupi. U slu~ajevima ozbiljnih spermatogenetskih defekata, kao {to je sindrom Sertoly cell only, ozbiljna hipospermatogeneza ili zastoji u sazrevanju mogu se pojaviti spermatozoidi koji nisu zavr{ili citoplazmatsko sazrevanje. Pretpostavlja se da zastoj sazrevanja i aplazija germinativnih }elija imaju genetsko poreklo. Genetski faktori bi, tako|e, mogli objasniti i smanjenje fertilizacije. U nekim studijama je potvr|eno ~e{}e pojavljivanje hromozomskih abnormalnosti, od kojih je preovla|uju}a aneuploidija polnog hromozoma, kod spermatozoida mu{karaca sa neopstruktivnom azoospermijom. Ovi podaci ilustruju va`nost razmatranja potencijalnih genetskih rizika. Jedan od na~ina minimizacije broja hirur{kih procedura na testisu je krioprez-

ervacija biopsiranog testikularnog tkiva i spermatozoida koji nisu iskori{}eni u ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusu. Ako ne do|e do trudno}e posle ICSI intra citoplasmatic sperm injection sa sveìm testikularnim spermatozoidima, odmrznuti spermatozoidi mogu biti upotrebljeni u kasnijim ciklusima. âk, i u slu~ajevima dijagnosti~ke testikularne biopsije, krioprezervacija testikularnih spermatozoida elimini{e potrebu za drugom biopsijom, {to je od naro~ite koristi pacijentima sa neopstruktivnom azoospermijom i malim testisima. Dijagnosti~kim testikularnim biopsijama treba dati prednost i treba da se planiraju pre po~etka tretmana stimulacije ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Ukoliko je biopsija negativna, druga opcija je upotreba donorske sperme.

1.6. FERTILIZACIJA U fazi fertilizacije, zavisno od broja spermatozoida i njihove pokretljivosti, odlu~ujemo se za primenu standardnog programa IVF - in vitro fertilisation, ili metode ICSI - intra citoplasmatic sperm injection.

Sl. 4.22- Zigot: dva pronukleusa u centru, polarno telo na 1 sat, ovarijalne kumulusne }elije okolo

198


Zreli preovulatorni oocit se obi~no inkubira 2-8 ~asova pre oplodnje. U nekim slu~ajevima se nezreli oociti inkubiraju i do 36 ~asova pre inseminacije, da bi se omogu}ilo sazrevanje. Svaki oocit se inseminira zavisno od kvaliteta sperme sa 50.000 - 200.000 pokretnih spermatozoida po oocitu. Spermatozoidi i oociti se koinkubiraju 12 do 18 ~asova u bioinkubatoru. Oociti se potom pregledaju u smislu prisustva pronukleusa kao dokaza oplodnje i ekstruzije drugog polarnog tela. Va`no je obratiti pa`nju na eventualnu polispermi~nu fertilizaciju koju karakteri{e prisustvo vi{e od dva pronukleusa.

Pojava polispermije kod konvencionalne IVF-in vitro fertilizacije se sre}e u oko 10% slu~ajeva.

1.7. PROCENA EMBRIONA I FRAGMENTACIJA Humani preimplantacioni embrioni se u relativno malom procentu implantiraju. Uzroci ove pojave su mogu}e o{te}enje DNK - deoksiribonukleinske kiseline ili metabolizma embriona kao i suboptimalni uslovi kulture in vitro. Brojni dokazi pokazuju da je sudbina }elije u smislu preìvljavanja, diferencijacije ili njene smrti, odre|ena ishodom specifi~nih intracelularnih interakcija izme|u pro i anti apoptoti~kih proteina, od kojih se mnogi ispoljavaju u fazi razvoja oocita ili preimplantacionog embriona. Kvalitet embriona predstavlja zna~ajan faktor u prognoziranju uspeha IVF - in vitro fertilisation-a.

Sl. 4.23- Patolo{ka tri pronukleusa

Poliploidni embrion kasnije moè da se deli, te identifikacija anomalije moè pro}i nezapaèno, ukoliko se ne registruje u fazi pronukleusa.

Sl. 4.25- Embrion dobrog kvaliteta

Sl. 4.24- Multipli pronukleusi

Fragmentacija blastomera je jo{ jedna zagonetka u ranoj humanoj embriogenezi. In vitro fertilisani embrioni ~esto pokazuju abnormalnu ili odloènu deobu }elija, pra}enu }elijskom fragmentacijom ili razvojnim arestom.


Pojava fragmentacije u IVF - in vitro fertilisation proceduri name}e pitanje da li je ovaj fenomen indikativan za nekvalitetan embrion, ili je fragmentacija normalan proces koji je vezan sa ranu embriogenezu, odnosno, da je to artefakt vezan za suboptimalne uslove in vitro kulture. Fragmentisani embrioni obi~no sadrè blastomere razli~ite veli~ine.

Sl. 4.26- Fragmenti embriona (na 12 i 1 sat )

U najve}em broju slu~ajeva ovi anuklearni }elijski fragmenti sadrè }elijske organele i druge }elijske proteine. Veli~ina blastomere je obi~no smanjena stepenom fragmentacije i sa umanjenjem }elijskog sadràja pokazuju}i negativan efekat na budu}u masu embriona. Fragmentacija moè da predstavlja osnovnu razvojnu sposobnost embriona za samokorekciju eliminacijom defektnih }elija u toku ranog razvoja ili samodestrukciju, ako se prepozna postojanje letalnog defekta koji obuhvata neke ili sve blastomere. Novije studije podràvaju hipotezu da celularna fragmentacija koju sre}emo kod preimplantacionih embriona moè da bude regulisana odre|enim komponentama genetskog programa smrti }elije, apoptoze. Formacija fragmenata moè da bude meha-

199

nizam putem kojeg se apoptoti~ni genski produkti uklanjaju iz embriona u cilju ~uvanja embriona od {tetnih efekata poreme}aja balansa pro i anti apoptoti~kih genskih produkata. Sama fragmentacija ne mora da bude letalna, budu}i da u nekim uslovima fragmenti mogu da budu resorbovani i njihovo prisustvo ne mora da ugroàva dalji razvoj embriona. Ukoliko se poku{aj eliminacije pokaè neuspe{nim, embrion podleè arestu. Dokazano je da fragmentacija moè biti izazvana i neadekvatnim in vitro uslovima kulture embriona. Name}e se pitanje da li se ovaj proces odigrava i u toku rane embriogeneze in vivo. Bez obzira da o fragmentaciji obi~no govorimo u ranim fazama deobe, ona se tako|e, mada u veoma niskom procentu, javlja i kod oocita, odnosno embriona u stadijumu pronukleusa. Mehani~ko uklanjanje fragmenata zna~ajno pobolj{ava procenat implantacije, sugeri{u}i da je sposobnost pove}ane implantacije izraèna fragmentisano{}u embriona zbog ponovnog uspostavljanja normalnog, od stadijuma zavisnog, prostornog odnosa izme|u blastomera, koji je neophodan za kompaktnost i od eliminacije potencijalno toksi~nog uticaja koji se ispoljava u toku degeneracije ekstracelularnih fragmenata. Ova metoda ne pomaè u slu~ajevima kada fragmenti obuhvataju vi{e od 30% ukupnog volumena embriona, budu}i da ovakvi embrioni nastavljaju sa fragmentacijom i nakon tretmana. Mogu}e je da je fragmentacija normalni mehanizam u razvoju embriona i da je lokalizacija, odnosno, obim fragmentacije faktor koji negativno uti~e na razvojni potencijal embriona. Jedan od mehanizama nastanka fragmenata je i proces onkoze.

200


Isto tako {irok spektar celularnih defekata kao {to je redistribucija mitohondrija ili abnormalna sublokalizacija nekih proteina, moè da bude uzrok razvojnog aresta. Kvalitet embriona, odnosno progresija fertilisanog oocita u toku deljenja, formiranje blastociste kao i implantacija, uveliko zavisi od specifi~nih genetskih i razvojnih programa. Jasno je da kvalitet oocita kao i depozicija maj~inih produkata u formi translatovanih proteina i organela, tako|e, uti~u na kvalitet embrionalnog razvoja. Poznato je da je rani razvoj embriona zavistan od citoplazmatskih komponenata, a ne od novoformiranog nukleusa. Sl. 4.27- Oncosis

Ovu formu smrti }elije karakteri{e stvaranje citoplazmatskih formacija bez organela koje mogu da budu resorbovane od strane }elije i oslobo|ene u uslovima hipoksije. Kako se embrioni kultivi{u u sredini bogatoj kiseonikom pretpostavlja se da se de{avaju sli~ne morfolo{ke promene u blastomerama koje nemaju mitohondrijalni potencijal sposoban da zadovolji energetske zahteve.

Razvojni arest embriona je slede}i fenomen zapaèn u razvoju embriona. Mehanizam koji dovodi do ove pojave je nejasan, mada je interesantno da razvojni stadijum embriona na kome se prvi put detektuju proteini zavisni od transkripcije koincidira sa pikom incidence aresta deljenja, ukazuju}i da razvojni arest moè da bude uzrokovan poreme}ajem procesa transkripcije. Jedan od uzroka razvojnog aresta mogu da budu hromozomske anomalije koje doprinose poreme}aju sinteze informacione RNK, RNK - messenger ribonucleic acid, onemogu}uju}i sintezu proteina i uti~u}i na razvoj embriona.

Klasifikacija stepena fragmentacije embriona je zavisna od protokola koji se koriste u IVF - in vitro fertilisation laboratorijama, a numeri~ka gradacija je od 1 do 4, ili gradacija upotrebom slova od A do D, koja predstavlja stepen fragmentacije. Tabela 4-3: Klasifikacija stepena fragmentacije embriona

Tip A

0% -5% fragmentacija

Tip B

gde je fragmentacija zastupljena do 20%

Tip C

gde je fragmentacija zastupljena od 21% - 50%

Tip D

gde je fragmentacija zastupljena vi{e od 50%

Na snimcima je prikaz dvo}elijskog i ~etvoro}elijskog embriona tipa A sa minimalnom fragmentacijom od 0 - 5 % fragmentacije.


201

Tip C fragmentacije predstavlja embrione kod kojih je 21 - 50% }elije fragmentirano. Na slici je ~etvoro}elijski embrion.

Sl. 4.28- Dvo}elijski embrion tip A fragmentacije

Sl. 4.31- êtvoro}elijski embrion tip C fragmentacije

Kod tipa D fragmentacija zauzima vi{e od 50% }elije. Na slici je prikazan dvo}elijski embrion.

Sl. 4.29- êtvoro}elijski embrion tip A fragmentacije

Stepen fragmentacije B podrazumeva prisustvo }elijske fragmentacije do 20%. Na slici je ~etvoro}elijski embrion. Sl. 4.32- Dvo}elijski embrion tip D fragmentacije

Kultivacija embriona do stadijuma blastociste imala je za cilj selekciju najkvalitetnijih embriona, uz smanjenje broja transferiranih embriona, bez kompromitovanja procenta implantacije.

Sl. 4.30- êtvoro}elijski embrion tipa B fragentacije

Klasifikacija blastociste je dvojaka: podela embriona koja se bazira na kvalitetu same blastociste i gradacija u odnosu na kvalitet inner cell mass i trophoectoderma.

202


Prolongirana kultivacija embriona do stadijuma blastociste omogu}ava dalju selekciju embriona. Embrioni u stadijumu blastociste se dele po svom kvalitetu na ~etiri grupe obeleène slovima od A do D na slede}i na~in: Stadijum A: Blastocista sa po~etnom kavitacijom.

Sl. 4.35- Stadijum C blastociste

Stadijum D: Ekaspandirana blastocista sa ili bez ICM - inner cell mass.

Sl. 4.33- Stadijum A blastociste

Stadijum B: Blastocela koja ~ini maksimalno 50% volumena embriona sa ili bez unutra{nje }elijske mase ICM - inner cell mass. Sl. 4.36- Stadijum D blastociste

Uz ovu podelu po kvalitetu blastocista, moè se uraditi i gradacija u odnosu na kvalitet inner cell mass i trophoectoderma, te se na osnovu toga blastociste mogu podeliti u tri grupe:

Dobrog kvaliteta: veliki broj }elija sa dobrom me|u}elijskom adhezijom; Srednjeg kvaliteta: mali broj }elija sa slabim adherentnim vezama Sl. 4.34- Stadijum B blastociste

Stadijum C: Blastocela zauzima najve}i deo blastociste sa ili bez ICM - inner cell mass.

Slabog kvaliteta: nema vidljive inner cell mass, ve} su prisutne retke granulirane, degenerativne }elije trophoectoderma ili trophoblasta.

203


Sl. 4.37- Blastocista dobrog kvaliteta ICM - inner cell mass; C - {upljina blastociste; T - trophoblast

Sl. 4.38- Blastocista slabog kvaliteta

1.8. ASISTIRANI HATCHING Uspe{nost asistirane reprodukcije zavisi od sloène veze izme|u transferisanog embriona i endometrijuma. Neuspeh implantacije embriona moè biti rezultat vi{e faktora od kojih ve}ina nije utvr|ena. In vivo hatching (hatching - u srpskom ne postoji adekvatan prevod) embriona u fazi blastociste je perforacija zone pelucide.

Sl. 4.39- Spontani hatching blastociste

îni se da gubitak uniformnosti i istanjivanje zona pellucida prethodi in vivo hatching-u. Pokazalo se da se stepen implantacije menjao od 10 do 29% kod embriona zavisno od kvaliteta zona pellucida od uniformne i zadebljale, nasuprot embriona sa nepravilnom i tankom. U nekim studijama je utvr|eno da izlaganje embriona in vitro okruènju moè rezultovati o~vr{}avanjem zona pellucida koja postaje otporna na istanjivanje sa kasnijim {tetnim uticajem na proces hatching-a. Iako je te{ko proceniti i kvantifikovati tvrdo}u zona pellucida, njena debljina se moè izmeriti pod invertnim mikroskopom. Smatra se da kod oko 15% IVF - in vitro fertilisation embriona postoji zona pellucida deblja od 15µm. U toj grupi je pobolj{an stepen implantacije primenom asistiranog hatching-a zona pellucida kiselim Tyrode medijumom. Metod je definisan kao AH - assisted hatching. U mnogobrojnim studijama koje su usledile od po~etka primene ove metode rezultati su bili promenljivi zbog razli~itih koncepcija, kriterijuma odabira pacijenata i tehnika asistiranog hatching-a. Tokom godina je usavr{eno nekoliko tehnika.

204


Mehani~ki asistirani hatching ili parcijalna disekcija zona pellucida-e se danas re|e primenjuje.

Sl. 4.41- Asistirani hatching kiselim Tyrode rastvorom Sl. 4.40- Mehani~ki asistirani hatching

Parcijalna disekcija zona pellucida-e se obavlja na embrionu pozicioniranim holding pipetom mikroiglom kroz zona pellucida-u na mestu najve}eg perivitelinskog prostora. Embrioni se potom vra}aju u medijum kulture i kultivi{u do transfera. Asistirani hatching je zapo~et parcijalnom resekcijom zone pelucide. Ova metoda je temeljno procenjena u vi{e studija. Osnovno ograni~enje ove tehnike je te{ko}a stvaranja rupe odre|ene veli~ine.

Asistirani hatching laserom Koristi se diodni laser talasne duìne 1480 ηm u ra~unarski kontrolisanom bezkontaktnom modu rada sa tri nivoa pode{avanja intenziteta energije, i to: slabo 35mW, srednje 45mW i jako 55mW, koja se moè emitovati jednim impulsom trajanja 25 ms.

Asistirani hatching kiselim Tyrode rastvorom Embrioni se stabilizuju holding pipetom, a 10 µm pipeta koja sadrì kiseli Tyrode rastvor je orijentisana na povr{inu na kojoj nema perivitelinskog prostora. U zona pellucida-u se napravi defekt pre~nika oko 30 µm na spoljnoj povr{ini. Embrioni se potom nekoliko puta isperu da bi se uklonio vi{ak Tyrode rastvora i vra}aju u standardni medijum kulture do transfera. Primena ove tehnike dozvoljava formiranje ve}eg i postojanijeg otvora na zona pellucida-u. Me|utim, varijabilnost i izlaganje kiselini, sa njenom mogu}om embriotoksi~no{}u ostaju potencijalni problemi.

Sl. 4.42- Asistirani hatching laserom

Niska snaga se koristi za perforiranje veoma tanke zona pellucida-e do 10µm, srednja snaga se koristi za perforaciju zona pellucida-e ve}ine embriona 10 - 15µm, a najve}a snaga se koristi za perforiranje debele, preko 15µm zona pellucida-e. Infracrvena laserska dioda talasne duìne 1.48 µm se ~ini najpogodnijom za upotrebu u laboratoriji. Ovaj sistem dozvoljava


bezkontaktni mikroskopski pristup laserskog snopa do embriona uz minimalnu absorpciju od strane medijuma. Laserski hatching je predloèn kao metoda koja se lak{e ponavlja, kontroli{e i koja je tehni~ki lak{a u pore|enju sa mehani~kim i hemijskim sredstvima. Ne postoji op{ta saglasnost u radovima u vezi sa efikasno{}u asistiranog hatching-a. U studijama su dati opre~ni rezultati. Promenljivi kriterijumi selekcije pacijenata i razli~ite metodologije rada oteàvaju interpretiranje podataka. Postoje slaganja u izve{tajima da je proces asistiranog hatching-a dao pozitivne rezultate kod pacijenata sa lo{om morfologijom embriona, kod pacijenata sa povi{enim nivoom FSH - follicle stimulating i kod pacijata sa embrionima koji su imali deblju zona pellucida. Stepen implantacije nije zna~ajno pobolj{an kod pacijenata sa normalnim bazalnim nivoom FSH - follicle stimulating hormone. Ameri~ko dru{tvo reproduktivne medicine je zauzelo stav da asistiran hatching moè biti klini~ki koristan kod odre|enih pacijenata, a da rutinsko ili univerzalno obavljanje u tretmanu svih IVF - in vitro fertilisation pacijenata u ovom trenutku se ~ini neopravdanim. Videokinematografska procena varijacija debljine zona pellucida ZPTV - zona pellucida thickness variation je u korelaciji sa procentima uspe{nosti. Srednja vrednost ZPTV - zona pellucida thickness je iznosila 28.6 kod neimplantiranih embriona u odnosu na 17.9 kod implantiranih embriona. Upore|ivanjem razli~itih tehnika asistiranog hatching-a pokazalo se da ne postoji razlika u procentu uspe{nih trudno}a. Potencijalne komplikacije primene asistiranog hatchinga, kao {to su degeneracija embriona i pojava monozigotskih blizanaca,

205

moraju biti pa`ljivo procenjene i upore|ene. Velika frekventnost vi{estrukih trudno}a zahteva obazrivost kod broja transferiranih embriona. Trebalo bi pomenuti i metodu uklanjanja zone pelucide pronazom sa idejom pobolj{anja procenta implantacije embriona. Koristi se razre|eniji rastvor pronaze 10IU/ml koji se razredi 10 X u medijumu. Embrioni se prebacuju u rastvor pronaze u medijumu pod uljem tokom pribli`no 60 sec. za inicijalno rastvaranje i potom se prebacuju u sveì medijum i isperu. Enzimati~ne metode rastvaranja i uklanjanja zona pellucida su najkasnije primenjene. Rastvor pronaze se koristi da ukloni zona pellucida-u po obimu. Bezbednost metode je potvr|ena u nekoliko studija.

1.9. PREIMPLANTACIONA GENETSKA DIJAGNOZA Sve {to mi jesmo fizi~ki je odre|eno i zapisano u otprilike 30 000 gena koji su sme{teni u DNK - deoksiribonukleinskoj kiselini. Celokupno telo je sastavljeno od mnogo hiljada razli~itih proteina ~ija struktura i raspored odre|uju na koji na~in na{e telo i mozak funkcioni{u. Ove hiljade proteina su sastavljene od svega 20 amino kiselina koje su apsolutno identi~ne kod svih ìvih bi}a na zemlji. Ako se analiziraju insekti ili ìvotinje, biljke, ili ~ovek, kod svih se nalazi istih 20 amino kiselina, bez obzira na sloènost organizma koji se analizira. Razlika izme|u ìvih stvorenja je sadràna u razlikama redosleda ovih dvadeset amino kiselina u proteinima od kojih su sastavljena razli~ita ìva stvorenja. Redosled amino kiselina je odre|en strukturom DNK - deoksiribonukleinskom

206


kiselinom. Ve}ina }elijske DNK - deoksiribonukleinske kiseline je inkapsulirana u jedru, manji deo nalazi se i u mitohondrijama. Ukupni humani genom ~ini oko 3 milijarde baznih parova, ili parova nukleotida u DNK - deoksiribonukleinskoj kiselini, sme{tenih na 22 para autozomnih hromozoma ili autozoma i jednom paru polnih hromozoma u svim somatskim }elijama. Tripleti nukleotida na DNK, razli~ite kombinacije tri azotne baze, predstavljaju geneti~ku {ifru ili kod, od koje zavisi aminokiselinski sastav proteina. Specifi~an aminokiselinski sastav odredi}e biolo{ku funkciju proteina, bilo da se radi o njihovoj ulozi u izgradnji }elijskih elemenata ili o funkciji u regulisanju sloènog dinamizma u }eliji. Geneti~ki kod je bio potpuno de{ifrovan 1967. godine. Celokupan humani genom je de{ifrovan 2000. godine. Dve individue koje imaju isti broj gena mogu se zna~ajno razlikovati u nukleotidnom sastavu DNK molekula i razlike u nukleotidnom sastavu mogu iznositi i do 10% od ukupnog boja nukleotida. Fizi~ka razlika izme|u ljudi i svih drugih ìvotinja nije vezana za promenu u univerzalnom genetskom kodu, ili u univerzalnoj komponenti DNK - deoksiribonukleinske kiseline, ili u univerzalnih 20 amino kiselina. Ona je jedino vezana za redosled nukleotida na datom hromozomu. Jedna jedina gre{ka u redosledu amino kiseline u nekom proteinu moè da dovede do dramati~nih promena u njegovoj strukturi, a onda i do ozbiljnih zdravstvenih implikacija. Ve}ina genetskih bolesti su prouzrokovane malim tipografskim gre{kama koje sa~injava genetski kod sa~injen od ~etiri osnovna nukleotida. Mi{i}na distrofija je ili prouzrokovana malom delecijom od nekoliko nukleotida u genu za mi{i}nu distrofiju na hromozomu X, ili u jednoj drugoj varijanti,

sa ne{to ve}im defektom, u kome su iste baze ponovljene nekoliko stotina puta na hromozomu 19 umesto samo deset do pedeset puta u normalnim slu~ajevima. To zna~i da od 6 milijardi nukleotida na DNK, koliko postoji u somatskim }elijama, poreme}aj samo stotinak izaziva te{ko obolenje. Zbog navedenih razloga nakon vi{egodi{nje primene asistirane reproduktivne tehnologije sa pove}anjem primene iz godine u godinu, postajemo svesni i rizika koji prate svakodnevnu klini~ku primenu. Tako u zna~aju posebno mesto dobija procedura PGD - preimplantation genetic diagnosis. PGD - preimplantation genetic diagnosis se primenjuje kod nosioca specifi~nih genetskih defekata, polnih poreme}aja ili hromozomskih poreme}aja. PGD - preimplantation genetic diagnosis procedura se sastoji od faza prikazanih u donjoj tabeli. Tabela 4-4: Procedura preimplantacione genetske dijagnostike

Centar za reproduktivnu medicinu

Centar za medicinsku genetiku Dijagnoza • Savetovanje: - geneti~ari - tok le~enja •

IVF-ICSI

genetska dijagnoza FISH • PCR •

Biopsija embriona

•

Transfer embriona Ako se posle genetskog savetovanja o prednostima i nedostacima PGD - preimplantation


genetic diagnosis, nasuprot prenatalnoj dijagnozi, bra~ni par odlu~i za PGD preimplantation genetic diagnosis, onda se upu}uje na dalju evaluaciju koja se sastoji od reproduktivne anamneze para, ginekolo{kog pregleda ène, ispitivanja krvi ène, uklju~uju}i i proveru estradiola, LH luteinizing hormone-a i FSH - follicle stimulating hormone-a. Pregled na infektivne bolesti ponekad kompletira ovu procenu. Kod nekih klinika, odre|ivanje kariotipa oba partnera spada u standardne procedure, ~ak i kada se FISH - fluorescence in situ hybridization ne koristi u preimplantacionoj genetskoj dijagnozi. Dodatni testovi se obavljaju prema potrebi. Kod skoro svih centara biopsija embriona za PGD - preimplantation genetic diagnosis se obavlja tre}eg dana ranog razvoja embriona.

207

spermatozoida koji moè biti zaka~en za zonu pelucidu. Tre}eg dana posle oplodnje se vr{i biopsija jedne ili dve blastomere iz embriona koji su dostigli osmo}elijski stadijum. ]elije se analiziraju putem FISH - fluorescence in situ hybridization, ili se ekstrahuje DNK - deoksiribonukleinska kiselina iz koje se multiplikuju PCR metodom, polymerase chain reaction, odre|eni delovi, da bi se kasnije analizirali.

Sl. 4.44- FISH - fluorescence in situ hybridization Trizomija 21 - Down - ov sindrom prisustvo tri plavo obojena hromozoma

Sl. 4.43- Biopsija embriona za PGD - preimplantation genetic diagnosis

Da bi se dobili embrioni u ovoj ranoj fazi razvoja, neophodna je IVF - in vitro fertilisation, sa ili bez ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Radije se koristi tehnika ICSI - intra citoplasmatic sperm injection umesto konvencionalne IVF - in vitro fertilisation kod monogenih poreme}aja koji zahtevaju DNK dijagnozu baziranu na PCR - polymerase chain reaction u cilju spre~avanja kontaminacije od strane

Iako je ova druga tehnika teà, metod detekcije na nivou jedne }elije je u principu isti kao i metode primenjene na ostala tkiva za prenatalnu dijagnozu, mada rad sa blastomerama ima specifi~ne te{ko}e, uklju~uju}i lizu, multinukleaciju i ispadanje alela kada se jedan od dva alela koji se ispituju multiplicira. I drugi dijagnosti~ki problemi se mogu pojaviti zbog embrionske mozai~nosti. Kontaminacija DNK - deoksiribonukleinske kiseline od strane }elija sperme zaka~enih za zona pellucida-u posle IVF - in vitro fertilisation se moè prevazi}i pomo}u ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Neki centri savetuju pregled dve }elije. Samo kod embriona sa usagla{enim rezul-

208


tatima radi se embriotransfer ili krioprezervacija. Vrlo ~esto se bra~nim parovima savetuje da obave i prenatalnu dijagnozu putem horiocenteze, CVS - chorionic villus sampling, ili amniocenteze.

Sl. 4.45- Tehnika CVS - chorionic villus sampling: A - transabdominalno; B - transvaginalno

Prema najnovijim podacima prikupljenim od strane ESHRE - european society for human reproduction and embryology, od ukupnog broja pregledanih pacijenata sa razli~itim indikacijama, oko 25% parova ima jedno ili vi{e bolesne dece, dok je i ve}i procenat parova imao spontane abortuse ili prekide trudno}a posle prenatalne dijagnoze. Genetski rizik je jo{ uvek najva`niji razlog za PGD - preimplantation genetic diagnosis. Pribli`no jednoj ~etvrtini parova je potreban tretman asistirane reprodukcije i oni èle da ga kombinuju sa PGD - preimplantation genetic diagnosis. Ostali razlozi za PGD - preimplantation genetic diagnosis su bili ponovljeni spontani abortusi. Ove indikacije se mogu podeliti na dve velike grupe: hromozomske aberacije i monogenske bolesti. Oboljenja izazvana mutacijama mitohondrijske DNK indikovana su u manje od 0.5% slu~ajeva.

Hromozomski poreme}aji se mogu podeliti na dve grupe: strukturne i numeri~ke abnormalnosti. Recipro~na translokacija je jo{ uvek najva`nija abnormalnost u prvoj grupi. Svi ovi slu~ajevi imaju sporadi~nu prirodu osim recipro~ne translokacije (11; 22) za koju se zna da se ponavlja. Recipro~nih translokacija ima ~etiri puta vi{e od Robertsonovih translokacija. Inverzije i delecije su razlozi za savetovanje kod manje od 1% slu~ajeva. Pregled na aneuploidnost se obavlja iz razli~itih razloga: starosti majke, ponovljeni neuspeh IVF - in vitro fertilisation, neuspeh implantacije, ponovljeni spontani abortus ili kombinacija ovih razloga. U~estalost monogenskih poreme}aja se neznatno promenila u odnosu na prethodne godine. Postoji relativno pove}anje dominantnih poreme}aja i smanjenje bolesti vezanih za X hromozom. Tri glavna poreme}aja u svakoj grupi su konstantni tokom godina: cisti~na fibroza, talasemija i spiralna muskularna atrofija kao autozomne recesivne bolesti; miotoni~ka distrofija, Hantingtonova bolest i CharcotMarie-Tooth bolest kao autozomne dominante; Duchenne-ova muskularna distrofija, fragilni-X sindrom i hemofilija kao poreme}aji vezani za X hromozom. Tabela 4-5: Genska oboljenja koja se mogu diagnostikvati PGD-om:

Adrenoleukodystrophy Alpha-1-Antitrypsin Alpha Thalassemia Alport Disease Alzheimer's disease Becker muscular dystrophy Beta Thalassemia Charcot Marie Tooth


Chromosomal aneuploidies by FISH Chromosomal translocations Cystic Fibrosis Duchenne muscular dystrophy Dystonia Epidermolysis Bullosa Fanconi Anemia Familial adenomatous polyposis (FAP) Familial dysautonomia Fragile-X syndrome Gaucher's Disease Hemophilia A HLA typing HSNF5 mutations Huntington disease Hurler syndrome Kell disease Lesch Nyhan Syndrome Long Chain Acyl-Co A Dehydrogenase (LCHAD) deficiency Multiple Epiphysial Dysplasia Myotonic Dystrophy Myotubular myopathy Neurofibromatosis type I Neurofibromatosis type II Osteogenesis imperfecta OTC Deficiency P53 Oncogene Phenylketonuria Polycystic kidney disease (Autosomal Dominant types I and II) Retinitis Pigmentosa SCA 6 Sickle Cell Disease Sonic hedgehog mutations Tay-Sachs Disease Translocations by FISH Tuberous sclerosis X linked Disease by sexing X-linked hydrocephalus X-linked hyper IgM syndrome

209

Biopsija je uspe{na kod oko 95% slu~ajeva, a dijagnoza dobijena kod oko 85% biopsiranih blastomera. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje je kori{}ena kod ve}ine slu~ajeva.

PGD - AS - preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening su novije metode. Uvedene su nove tehnike, jer upotreba sekvencijalnih medija omogu}ava razvoj do stadijuma blastociste i analiziranje statusa nekoliko hromozoma pre transfera. Postoji podela mi{ljenja da li treba razlikovati PGD - preimplantation genetic diagnosis za nasle|ene genetske bolesti i za detekciju sporadi~nih hromozomskih abnormalnosti radi pobolj{anja uspe{nosti ART - assisted reproductive technology. Ovo je razlog za{to je ova druga procedura odre|ena kao PGD - AS - preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening od strane ESHRE - european society for human reproduction and embryology. Poznato je da se aneuploidnost pove}ava sa staro{}u majke i da je u uzajamnoj vezi sa smanjenom implantacijom i ve}im brojem spontanih abortusa. [to se ti~e kona~ne procene PGD-ASpreimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening, jo{ uvek postoji puno sumnji. Iako je izloèno nekoliko indikacija, postoji nedostatak nau~nih dokaza koji bi bio potvr|en prospektivnim studijama. Pored indikacije starosti majke, predloèni su i drugi razlozi, kao ponovljeni poba~aji, vi{e neuspelih implantacija i neopstruktivne azoospermije. Do sada nije objavljena nijedna prospektivna studija - randomized controlled trial kod gore navedenih indikacija. PGD - preimplantation genetic diagnosis kod slu~ajeva pacijenata sa Klinefelter

210


sindromom kod kojih postoji fokalna spermatogeneza u testisu, moè se realizovati primenom tehnike ICSI - intra citoplasmatic sperm injection u kombinaciji sa PGD preimplantation genetic diagnosis. Objavljeni su slu~ajevi ro|enja zdrave dece.

Na snimku toka embriotransfera kateter se vidi u cerviksu i uterusnoj {upljini ispod ùte linije. Aplikuje se iz vagine u cerviks. Embrioni se osloba|aju iz vrha katetera {to se vidi neposredno desno od oznake L. Treba obratiti pa`nju da ugao izme|u cerviksa i uterusa, zelena linija, nije veliki.

1.10. EMBRIOTRANSFER Izuzetno brz razvoj tehnika IVF - in vitro fertilisation rezultirao je pove}anjem procenta implantacija kao i pove}anjem procenta multiplih trudno}a, sa svim rizicima koje one sa sobom povla~e. Najva`niji faktor koji uti~e na stepen multiplih trudno}a je broj transferiranih embriona. Strategija koja podrazumeva transfer samo jednog embriona rezultira, uglavnom, trudno}ama sa jednim plodom, ali tako|e moè da dovede i do smanjenja sveukupnog procenta uspeha. U dosada{njim retrospektivnim studijama na|eno je da su jedine varijabile na osnovu kojih se moè predvideti eventualna multipla trudno}a, starosna dob majke i broj transferiranih embriona dobrog kvaliteta. Na osnovu istraìvanja odre|en je cutoff limit u odnosu na starosnu dob pacijentkinje radi smanjenja multipnih trudno}a. ET - embryo transfer je procedura ubacivanja oplo|ene jajne celije u uterus.

Sl. 4.46- Sonografski prikaz embriotransfera: C cervix; B - vesica urinaria; L - uterusna {upljina; V - vagina

Sl. 4.47- Kateter za embrio transfer ultrazvukom

Na trì{tu postoje kateteri za embrio transfer pod kontrolom ultrazvuka. Dana{nji stav je da nije potrebna ultrazvu~na kontrola embrio transfera.

Sl. 4.48- Blastocista na vrhu katetera


Po nekim autorima poja~ana sekrecija u uterusu moè biti {tetna za implantaciju i odràvanje trudno}e. Uterinska te~nost se naj~e{}e vi|a pomo}u ultrazvuka nakon oplodnje. Ova te~nost se samostalno smanjuje u roku od 24 - 48 ~asova. U nekim radovima opisan je postupak intramuskularnog davanja oksitocina pre embriotransfera. Istraìvanje je pokazalo da vi{e doze oksitocina rezultuju univerzalnom kontrakcijom glatkog mi{i}a, dok niè doze rezultuju metaboli~kim kontrakcijama koje po~inju u distalnom delu i nastavljaju se kaudalno, {to rezultuje kompletnijom i sistemati~nijom evakuacijom te~nosti. U daljim istraìvanjima neophodno je proveriti ispravnost dosada{njih radova.

1.11. LUTEAL SUPPORT Nakon ovulacije endometrijum prolazi kroz niz sekretornih promena radi pripreme za implantaciju embriona. Lutealna faza je pod kontrolom progesterona koji se produkuje u corpus luteumu. Hipofizni LH - luteiuniziraju}i hormon, odgovoran je za odràvanje produkcije progesterona, a nakon implantacije HCG human chorionic gonadotropin-a, produkovanog od strane trofoblasta, preuzima ovu ulogu. Ukoliko je produkcija progesterona neadkevatna, razvija se insuficijencija lutealne faze, {to smanjuje {anse za uspe{nu trudno}u. Sa ART - asistiranom reproduktivnom tehnologijom, neadekvatna lutelna faza je ~esto rezultat samog tretmana. Ovo je delom uzrokovano suprafiziolo{kim nivoima steroidnih hormona, a delom upotrebom analoga gonadotropin realising hormona.

211

Potreba za luteal support, podr{kom lutealne faze, prouzrokovana je, s jedne strane, aspiracijom granuloznih }elija u toku punkcije folikula, odnosno, blokadom sekrecije LH - luteinizing hormone-a, upotrebom GnRH - gonadotropin releasing hormon agonista. Ova blokada traje najmanje deset dana nakon prestanka primene GnRH - gonadotropin releasing hormona, {to ima za posledicu poreme}aj sekrecije progesterona od strane corpus luteuma. Ovo uti~e na odnos estrogen - progesteron, {to moè da inhibira implantaciju embriona. Razli~ita su mi{ljenja koji tip luteal supporta je najadekvatniji u IVF - in vitro fertilisation ciklusima. Najpre je primenjivan parenteralni progesteron u ulju, zatim oralni, vaginalni progesteron ili HCG - human chorionic gonadotropin koji se ne primenjuje kod high responder - a zbog rizika od OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-a. Progesteron primenjen vaginalno predstavlja metodu izbora, jer se izbegavaju bolne i zahtevne intramuskularne injekcije. Diskrepancija izme|u endometrijalnih efekata i relativno niske koncentracije serumskog progesterona nastaje kao posledica lokalnog direktnog transporta ili funkcionalnog portal sistema iz vagine u uterus. Razli~iti mehanizmi mogu da objasne direktni vagina - uterus transport i delovanje terapije, uklju~uju}i difuziju kroz tkivo, intraluminalnu transcervikalnu pasaù i transport kroz venozni ili limfati~ni cirkulatorni sistem. Druga mogu}nost je olak{ana difuzija sa protiv strujnim arterijsko - venskim izmenama u kojima progesteron difunduje iz utero - vaginalnih limfnih sudova ili vena, u uterusni arterijalni sistem. Krvni sudovi dele zajedni~ku, izmenjiva~ku povr{inu i

212


imaju tok koji ide u suprotnim smerovima. Substance u visokim koncentracijama u venskim i limfnim sudovima mogu da difunduju u obli`nje arterije, gde }e njihova koncentracija rasti iznad one u organima. Vi{a je koncentracija progesterona u uterusnoj arterijalnoj krvi u pore|enju sa perifernom cirkulacijom. Radijalna arterija nakon vaginalne primene progesterona sna`no podràva ovaj mehanizam. Brojni su primeri u oganizmu protivstrujne izmene, u bubrezima Henleova petlja ili izmena toplote u sinusu cavernosus-u izme|u karotida i venske drenaè u nazofaringealnoj arei.

Postojanje lokalnog vagina - uterus transportnog sistema name}e pitanje njegovog fiziolo{kog zna~aja. Razumno je pretpostaviti da je primarna funkcija transport prostaglandina prisutnih u spermi. Oni }e aktivirati kontraktilnost uterusa u smislu olak{avanja transporta sperme bez podizanja nivoa prostaglandina u cirkulaciji, izbegavaju}i uzgredne efekte. Ovaj na~in primene lekova, koji je poznat kao first uterine pass effect, potvr|en primenom progesterona, otvorio je put za budu}u upotrebu lekova vaginalnim putem.

213


2. ARTEFICIJALNA INSEMINACIJA Na odluku koju metodu asistirane reprodukcije primeniti uti~e rezultat analize sperme i drugih mu{kih i ènskih faktora kao {to je prisustvo ovulatornih defekata, endometrioze, tubarnih faktora, endokrine disfunkcije ili abnormalnosti, antispermatozoidnih antitela, itd. Kod bra~nog para sa normalnim nalazom kod ène i redovnim ovulatornim ciklusima i subfertilnim mu{karcem po~etak terapije moè da bude planirani odnos u bar tri ciklusa sa ili bez ovarijalne stimulacije i pra}enjem ovulacije. Broj poku{aja je naj~e{}e limitiran na tri ciklusa. Kod neuspe{nog tretmana slede}i korak je arteficijalna inseminacija, ukoliko je kvalitet sperme odgovaraju}i. Potrebno je oko 5 miliona pokretnih spermatozoida IMC - inseminating motile count morfolo{ki ispravnih. Mnoge studije izve{tavaju o zna~ajnom padu uspe{nosti posle tre}eg poku{aja IUI intrauterine inseminacije, pa se savetuje drugi tretman, kao {to su IVF - in vitro fertilisation ili ICSI-intra citoplasmatic sperm injection. IUI - intrauterina inseminacija moè biti kori{}ena kao po~etni tretman kod ve}ine slu~ajeva umerene mu{ke subfertilnosti pre zapo~injanja IVF - in vitro fertilisation ili ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, pod uslovom da se moè obezbediti neophodan minimum pokretnih spermatozoida.

AI - arteficijalna inseminacija se moè razvrstati u nekoliko tehnika primene: - intravaginalna inseminacija IVI - intracervikalna inseminacija ICI - intrauterina inseminacija IUI - Fallopian tube sperm perfusion FSP - sperm intrafallopian insemination SIFI - direktna intraperitonealna inseminacija DIPI - intrafolikularna inseminacija IFI IUI - intrauterina je metoda koja se najvi{e koristi. Prednosti AI - arteficijalne inseminacije su mogu}nost selekcije pacijenata, primena kontrolisane ovarijalne stimulacije, monitoring ciklusa uz odre|ivanje individualne terapije (mogu}a primena i u nestimulisanom ciklusu), pripremanje sperme. Indikacije za primenu AI - arteficijalne inseminacije su: • nemogu}nost vaginalne ejakulacije zbog: - psihogene ili organske impotencije, - hipospadije ili retrogradne ejakulacije, - krioprezervacija sperme u slu~ajevima malignih oboljenja; • androgeni poremecaji: - oligospermia - astenospermia - teratospermia; • idiopatski sterilitet; • sterilitet uzrokovan cervikalnim faktorom; • odsustvo partnera i kori{}enje krioprotektirane sperme.

214


Uobi~ajeni protokoli stimulacije u slu~ajevima AI - arteficijalne inseminacije su stimulacija clomiphen citratom ili analognim lekovima, kao i upotreba HMG - human menopausal gonadotrophin-a ili FSH - follicle stimulating hormone-a, kao i kombinacija ovih preparata. Naj~e{}e se koristi CC - klomifen citrat u koncentraciji od 50 do 100 mg tokom pet dana za ovarijalnu stimulaciju. Uobi~ajen na~in pra}enja rasta i razvoja folikula je ultrazvu~ni monitoring uz eventualno odre|ivanje nivoa E2, kao i merenje debljine i pra}enje strukture endometrijuma.

Inseminacija se uobi~ajeno radi izme|u 13. i 16. dana ciklusa. AI - arteficijalna inseminacija se ne radi ukoliko se registruje vi{e od 6 folikula ve}ih od 15 mm, bez obzira na nivo E2, ili ukoliko je nivo E2 ve}i od 1500 pg /ml. Sperma se za proces inseminacije priprema na nekoliko nacina: - jednostavnim pranjem sperme u medijumu, - swim up tehnikom, - separacijom sperme uz pomo} tzv. density gradienta. Svrha ovog procesiranja sperme je pove}anje koncentracije progresivno pokretnih i morfolo{ki normalnih spermatozoida uz mali volumen, kao i eliminacija seminalnih PG - prostaglandins, limfokina, citokina, raznih infektivnih agenasa i broja slobodnih oksigenih radikala.

Sl. 4.49- Ultrazvu~na folikulometrija

Optimum ovarijalne stimulacije podrazumeva 2 - 4 folikula veli~ine 18 - 19 mm, nivo estradiola 150-250 pgm/ml po folikulu, sa trilaminarnim endometrijumom dijametra ve}eg od 9 mm. Sl. 4.51- Sematski prikaz IUI - intrauterine inseminacije

Sl. 4.50- Debljina endometrijuma

Uobi~ajena IUI - intrauterina inseminacija se radi 36 do 48 sati nakon davanja HCG - human chorionic gonadotropin-a, a ukoliko se inseminacija radi dva puta, 12 48 sati nakon davanja HCG - human chorionic gonadotropin-a. Nakon IUI - intrauterine inseminacije se savetuje 10 minutni odmor, i seksualni odnosi posle 12 - 18 ~asova.


Luteal support je mogu} primenom Utrogestana, Cyclogesta ili eventualno HCG - human chorionic gonadotropin-a 1500 IU 3 ili 6 dana nakon prve doze. Ukoliko se IUI - intrauterina inseminacija vr{i zbog problema od strane mu{kog partnera, mogu}e je raditi i u uslovima nestimulisanog ciklusa. Analiziraju}i rezultate od ukupnog broja trudno}a do kojih do|e, 88% trudno}a se registruje u prva tri ciklusa, a 95% u okviru prva ~etiri poku{aja.

215

Glavne prednosti AI - arteficijalne inseminacije su da je to relativno jednostavna, neinvazivna metoda koja se moè ponavljati. Preporuke su da je indikovana kod èna do 40 godina starosti. Zabeleèni su dobri rezultati u slu~ajevima idiopatskog steriliteta, kao i u slu~ajevima blagog ili umerenog poreme}aja kod mu{kog partnera. Neuspeh ove metode nakon 4 poku{aja predstavlja indikaciju za IVF - in vitro fertilisation.

216


3. ICSI - INTRA CITOPLASMATIC SPERM INJECTION Metoda je uvedena po~etkom 1990-ih godina kao procedura asistirane oplodnje kod parova sa te{kim oblikom mu{ke neplodnosti kojima se nije moglo pomo}i sa konvencionalnim IVF - in vitro fertilisation. Indikacije za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection su kasnije pro{irene na zamrznute spermatozoide, epididimalne i testikularne spermatozoide, kao i kod slu~ajeva u kojima problem nije u mu{koj neplodnosti, kao {to je idiopatski sterilitet. Osnovni principi metode ICSI - intra citoplasmatic sperm injection su do sada dobro standardizovani. Retki su slu~ajevi kada se ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ne moè primeniti, pa su rezultati u pogledu oplodnje, transfera embriona i broja klini~kih trudno}a postojani tokom poslednjih godina. Zahvajuju}i tome veliki broj parova danas moè da ima svoje biolo{ko dete umesto inseminacije sa donorskim spermatozoidima. Tehnika je danas rutinirana i podrazumeva mikroinjekciono ubacivanje jednog spermatozoida u oocit. U ovoj proceduri se bira spermatozoid, pomo}u empirijskih ili biohemijskih metoda. Koristi se injekciona pipeta sa unu-

tra{njim pre~nikom od 6µm za aspiraciju spermatozoida. Ove mikropipete su komercijalno dostupne, a mogu biti napravljene i u laboratoriji. Spermatozoid se pre aspiracije imobili{e u PVP - polyvinyl pyrolidone. Morfolo{ki normalan spermatozoid se aspiri{e u injekcionu iglu, i to, prvo repom. Imobilizacija spermatozoida, tako|e, se moè obaviti lomljenjem repa injekcionom pipetom.

Sl. 4.52- ICSI - intra citoplasmatic sperm injection holding pipetom fiksirani oocit

Injekciona pipeta se gura kroz zona pellucida-u i membranu oocita u citoplazmu sa prvim polarnim telom na poziciji 12 ili 6 sati.


Sl. 4.53- ICSI - intra citoplasmatic sperm injection injekciona igla u oocitu

Genetske ili citogenetske abnormalnosti dece dobijene primenom ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom su bile ispitivane u vi{egodi{njim istraìvanjima. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metoda se mora pokazati bezbednom kao i produktivnom. Kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je broj spontanih abortusa u blagom porastu kao i kod konvencionalne IVF - in vitro fertilisation u odnosu na spontane trudno}e. Analiziraju}i stru~nu literaturu dobija se prose~an broj spontanih poba~aja u visini od oko 15 %. Broj malformacija kod ro|enih beba se kre}e u odnosu od oko 1,5%. Teìna beba na ro|enju i broj preranih poro|aja nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode je adekvatan onima kod konvencionalne IVF - in vitro fertilisation. Iz dosada{njih istraìvanja su dobijeni podaci da je frekventnost de novo autozomnih poreme}aja 0,36% i de novo polnih hromozomnih abnormalnosti 0,83%. Oba ova rezultata su ve}a u odnosu na op{tu populaciju. Genetske ili citogenetske abnormalnosti dece iz ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode mogu nastati kao rezultat

217

nasle|ivanja mutiranog gena ili hromozomske abnormalnosti; Y - delecija DAZ deleted in azoospermia homologog gena kod oligospermi~nih mu{karaca, cisti~na fibroza potomaka koja poti~e od mu{karaca sa kongenitalnim bilateralnim odsustvom vas deferensa CBAVD - congenital bilateral absence of the vas deferens i polne hromozomske abnormalnosti potomaka mu{karaca sa Kinefelterovim sindromom 47, XXY. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje premo{}uje ve}inu molekularnih i }elijskih procedura koje u~estvuju u penetraciji spermatozoida. Selekcija spermatozoida ne bi trebalo biti nasumi~na, moraju se uzeti u obzir pokretljivost, morfologija i ostali markeri normalnog rasta i razvoja. Ve}ina parova sa ozbiljnim oblikom mu{ke neplodnosti moè biti tretirana sa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom. Potreban je spermatozoid koji sadrì funkcionalan genom i centriolu. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection se, tako|e, moè primeniti i sa spermatozoidima iz epididimisa i testisa u slu~aju opstrukcije seminalnih sekretornih kanala, kao i azoospermije, ukoliko se moè dobiti dovoljan broj spermatozoida iz testikularnog tkiva. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection koja koristi ejakulirane spermatozoide, se moè primeniti, u prisustvu oligoastenoteratozoospermije u slu~ajevima sa ponovljenim neuspehom oplodnje posle konvencionalne IVF in vitro fertilisation, u prisustvu visoke koncentracije antispermatozoidnih antitela, kod pacijenata sa kancerom u remisiji kada se spermatozoidi krioprezerviraju pre hemoterapije i radioterapije i kod povreda ki~mene mo`dine, ejakulatornih poreme}aja, retrogradnom

218


ejakulacijom i kod pacijenata kod kojih su spermatozoidi sa~uvani pre vasektomije. Kod preimplantacione genetske dijagnoze na monogenetske bolesti je, tako|e, indicirana ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metoda moè biti primenjena sa spermatozoidima iz epididimisa u slu~ajevima opstruktivne azoospermije, kod kongenitalno bilateralnog odsustva vas diferens CBAVD - congenital bilateral absence of the vas deferens, Young-ovog sindroma,

neuspele vazoepididimostomije, neuspele vazovazostomije i bilateralne, iatrogene inguinalne opstrukcije oba ejakulatorna kanala. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metoda, tako|e, moè biti primenjena sa testikularnim spermatozoidima u svim slu~ajevima kada epididimalni spermatozoidi ne mogu biti dobijeni u slu~ajevima testikularnog zastoja u sazrevanju, parcijalne aplazije germinativnih }elija ili tubularne skleroze, kao i u izuzetnom slu~aju nekrozoospermije.

Tabela 4-6: Indikacije kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode

Neuspeh oplodnje putem IVF Aglutinacija sperme Teška oligozoospermija - kriptozoospermija Teška astenozoospermija * Imunološki faktori° Opstruktivna i neopstruktivna azoospermija, paraplegija: epididimalno ili testikularno pribavljanje spermatozoida Ejakulatorna disfunkcija: retrogradski ejakulat° Pogoršana spermatogeneza ili spermiogeneza: nezreli spermatozoidi - Zreli spermatidi - Izduùju}i ili izduèni spermatidi - Okrugli spermatidi* - Sekundarni spermociti* In vitro sazreli spermatociti i spermatidi* Onkologija: krioprezervirani spermatozoidi pre hemoterapije ili radioterapije Izbegavanje polispermije kod pacijenata sa anamnezom ponovljene polispermije nakon IVF Rane preimplantacione dijagnoze In vitro sazreli oociti* *rezultati su veoma lo{i kod ovog tipa indikacije, broj oplodnji je manji od 30% i broj trudno}a je manji od 5% °konvencionalna IVF - in vitro fertilisation moè dati prihvatljive rezultate


Treba naglasiti va`nost procene rizika primene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection postupka po potomstvo, jer kao {to je ve} re~eno, postoji blago pove}anje de novo hromozomskih abnormalnosti, dok je broj ve}ih kongenitalnih malformacija sli~an kao kod IVF - in vitro fertilisation. Nedavne publikacije su objavile slu~ajeve poreme}aja imprintinga. Potrebne su dodatne studije radi procene uticaja razli~itih tehnologija asistirane reprodukcije i poreme}aja imprintinga. Epididimalni spermatozoidi mogu biti dobijeni putem mikrohirur{ke epididimalne aspiracije sperme.

MESA - microsurgical epididymal sperm aspiration. Kod ove metode se dobijaju hiljade spermatozoida kod pacijenata sa opstruktivnom azoospermijom. Vi{ak spermatozoida moè biti krioprezervisan za kasniju upotrebu.

PESA - percutaneous sperm aspiration Epididimalni spermatozoidi mogu, tako|e, biti dobijeni perkutanom aspiracijom sperme PESA - percutaneous sperm aspiration.

TESE - testicular sperm extraction Schoysman je 1993. godine opisao sposobnost testikularnih spermatozoida da oplode oocite primenom ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike. U slu~aju epididimalne fibroze, testikularni spermatozoidi mogu biti izolovani iz testikularnog tkiva dobijenog otvorenom biopsijom, metodom koja se naziva TESE testicular sperm extraction.

FNA - fine needle aspiration Kod pacijenata sa opstruktivnom azoospermijom i normalnom spermato-

219

genezom, biopsija tako|e moè biti dobijena perkutanom aspiracijom putem aspiracije finom iglom FNA - fine needle aspiration. Kod pribli`no polovine pacijenata sa neopstruktivnom azoospermijom je mogu}e na}i spermatozoide. Mogu}e je koristiti zamrznute spermatozoide: ejakulirane, epididimalne i testikularne, ~ime se izbegava ponavljanje postupaka dobijanja koji nisu bez potencijalnih rizika. Analizom dosada{njih rezultata ICSI intra citoplasmatic sperm injection procedure utvr|eno je da se ova procedura nije mogla obaviti kod 1 - 3% slu~ajeva. Ovo je naro~ito bilo zastupljeno kod parova sa neopstruktivnom azoospermijom. Prema statisti~kim podacima oko 85% ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusa je obavljeno sa sveìm i ejakuliranim spermatozoidima, a oko 15% slu~ajeva sa sveìm i zamrznutim epididimalnim i testikularnim spermatozoidima. Analizom dobijenih oocita kod ove metode oplodnje u 81,5% slu~aja utvr|eno je dobijanje oocita u metafazi 2 sa jednim polarnim telom, 9,8% je sadràlo oocite u fazi germinalnog vezikula, a kod 3,7% su bili oociti u metafazi 1. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je obavljena samo na oocitima metafaze 2. Procenti oplodnje se kontinuirano prate sa tendencijom porasta zahvaljuju}i sve ve}oj rutiniranosti medicinskih timova, savr{enijoj opremi i usavr{enim medijumima. Podaci iz literature govore da je procenat oplo|enih oocita primenom ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike oplodnje sa spermatozoidima dobijenim ejakulacijom ve}i od dve tre}ine. Broj oplo|enih oocita dobijenih hirur{kim putem u slu~aju neopstruktivne azoospermije je manji nego sa ejakuliranim spermatozoidima i u proseku je ve}i od 50%.

220


Dalji razvoj normalno oplo|enih oocita nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je procenjivan na sli~an na~in kao i kod IVF - in vitro fertilisation. Preko 80% normalno oplo|enih oocita se razvilo u embrione sa normalnim morfolo{kim kvalitetom. Odsustvo oplodnje nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je u slu~ajevima malog broja oocita, prisustva samo nepokretnih spermatozoida, spermatozoida bez akrozoma, nekompetentnih oocita i o{te}enih samom injekcijom. Prema objavljenim izve{tajima centara koji se bave asistiranom reprodukcijom u preko 40% slu~ajeva je bila primenjena ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje od ukupnog broja ciklusa. Mega analiza ura|ena kod pacijenta sa umerenom oligoastenoteratozoospermijom je pokazala da su {anse za oplodnju oocita nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection 3.9 puta ve}e nego kod klasi~ne IVF - in vitro fertilisation. Analiziraju}i samo one slu~ajeve steriliteta gde nisu bili u pitanju androlo{ki uzroci, radi objektivne komparacije ove dve metode pokazalo se da je broj implantacija bio ve}i u IVF - in vitro fertilisation grupi 30% u odnosu na ICSI - intra citoplasmatic sperm injection grupu gde je bio oko 22%. Zaklju~ak je da ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje ne pruà prednost nad IVF - in vitro fertilisation u pogledu klini~kog ishoda u slu~ajevima gde se ne radi o androloskom uzroku neplodnosti. Podràna je trenutna praksa prema kojoj ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehniku treba primeniti samo za probleme mu{kog faktora. Predlozi da ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metodu treba primeniti kod

svih ciklusa asistirane reprodukcije nisu prihvatljivi. Ako se ovo sprovede bez dodatnih studija, takva politika bi mogla imati ozbiljan uticaj na vreme rada u laboratoriji, medicinska sredstva i, iznad svega, na ukupnu bezbednost usled isklju~enja mehanizama prirodne selekcije gameta i usled invazivnosti same tehnike. Kod slu~ajeva mu{ke neplodnosti usled te{ke OAT- oligoasthenoteratozoospermia-e, ili neopstruktivne azoospermije, potrebno je uraditi analizu kariotipa iz periferne krvi i odre|ivanje AZF - azoospermia factors a, b, c. Kod mu{karaca sa CBAVD - congenital bilateral absence of the vas deferens bi trebalo iztraìti mutacije u genu cisti~nog fibroznog transmembranskog konduktanskog regulatora CFTR - cystis fibrosis transmembrane conductance regulator gena. Dobro je poznato da se konstitucionalne hromozomske aberacije pove}avaju sa smanjenjem broja spermatozoida. Tako|e je jasno da je incidencija numeri~kih aberacija polnog hromozoma, kao {to su 47, XXY i 47, XYY, povi{ena kod mu{karaca sa azoospermijom. Izgleda da strukturne hromozomske aberacije autozoma, kao {to su Robertson - ova i recipro~ne translokacije, nisu retke kod oligospermi~nih mu{karaca. Kod nekih mu{karaca sa neopstruktivnom azoospermijom histolo{ki je otkriven arest spermatogeneze {to je rezultovalo neuspehom razvoja germinativnih }elija. Poku{aji maturacije germinativnih }elija u kulturi su bili neuspe{ni. Isto tako, postoji rastu}i broj delecije Y hromozoma koje se prepoznaju kao uzrok poreme}ene spermatogeneze. Mu{ka deca ro|ena nakon primene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike }e nositi istu deleciju na Y hromozomu kao i njihov otac. Sve dok se ne dobije bolja definicija uzroka poreme}ene spermatogeneze, postoja}e


zna~ajan rizik od preno{enja genetskih defekata. Spermatozoidi mu{karaca sa neopstruktivnom azoospermijom imaju ve}u incidenciju hromozomskih aneuploidnosti, od kojih je aneploidnost polnog hromozoma naj~e{}a. Objavljeni statisti~ki podaci upore|enja metoda IVF - in vitro fertilisation i ICSI intra citoplasmatic sperm injection daju slede}e podatke: Prenatalna dijagnoza se obavlja kod oko 50% trudno}a do kojih je do{lo nakon primene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike. Kod oko 40% postoji i rizik vezan za godine starosti. Kori{}ene su metode CVS - chorionic villus sampling i amniocenteza. Abnormalni fetalni kariotip je prona|en kod oko 3% svih pregledanih beba. Od toga oko 1,6% anomalija je bilo de novo. Zna~ajno ve}i procenat od oko 2,1% de novo prenatalnih hromozomskih aberacija je prime}en kod slu~ajeva sa koncentracijom spermatozoida manjom od 20 mil /ml u pore|enju sa oko 0,24% pregledanih slu~ajeva gde su koncentracije bile ve}e od 20mil/ml. Statisti~ka razlika je konstatovana za kriterijum pokretljivosti, a ne za kriterijum morfologije. Materinske karakteristike koje su upore|ene, lekovi koji su se davali majkama tokom trudno}e i trajanje trudno}e nisu pokazali zna~ajnu razliku. Utvr|eno je da je prose~na starost majki ve}a u grupi èna le~enih ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, kao i ve}i procenat prvih trudno}a i prvih poro|aja. Teìna beba na ro|enju, broj neonatalnih komplikacija, ro|enje beba male teìne, broj mrtvoro|ene dece i broj perinatalnih smrti su sli~ni. Broj prevremenih poro|aja je ne{to ve}i kod dece ro|ene nakon primene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode, 31,8% u odnosu na IVF - in vitro fertilisation decu, 29,3%.

221

Ve}e malformacije definisane kao one koje izazivaju funkcionalna pogor{anja ili zahtevaju hirur{ku korekciju su prime}ene na ro|enju kod 3,4% dece rodjene nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode i kod 3,8% dece ro|ene nakon IVF - in vitro fertilisation metode. Broj mrtvoro|ene dece posle 20. nedelje trudno}e je bio 1,69% kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection grupe i 1,31% kod IVF - in vitro fertilisation grupe. Ukupan broj malformacija, uklju~uju}i i ve}e malformacije mrtvo-ro|ene dece, malformacije u slu~ajevima spontanih prekida trudno}e i kod ìvo-ro|ene dece je 4,2% kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection i 4,6% kod IVF - in vitro fertilisation. Iz navedenih analiza proisti~e da su neonatalni ishod i rizici nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode isti sa IVF - in vitro fertilisation metodom. Od uvo|enja ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode malo studija je pratilo dalji razvoj ro|ene dece. Upore|uju}i objavljene rezultate dosada{njih ispitivanja primenom standardnog testa razvoja kod dece ro|ene nakon IVF in vitro fertilisation metode do starosti od 2 godine, nisu prime}ene razlike u psihomotornom razvoju. U jednoj kasnijoj studiji su upore|eni medicinski i razvojni ishodi 439 dece ro|ene nakon ICSI intra citoplasmatic sperm injection metode (61 par blizanaca), sa istim rezultatima kod 207 dece ro|ene nakon IVF - in vitro fertilisation metode (69 blizanaca), pri starosti od 24 - 28 meseci. Deca su pro{la kroz formalnu procenu razvoja putem Bejlijeve skale razvoja deteta, od strane pedijatra koji nisu znali o kom se tipu tretmana radi. Nije utvr|ena zna~ajna razlika u njihovoj starosti, dobu gestacije, paritetu, teìni bebe na ro|enju, broju neonatalnih

222


komplikacija ili broju malformacija pri starosti od 2 godine izme|u IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ro|enih beba. Multi varijantna regresiona analiza je pokazala da su paritet, pol i starost imali zna~ajan uticaj na rezultat testa, dok sama procedura, IVF - in vitro fertilisation ili ICSI - intra citoplasmatic sperm injection nije uticala na rezultat testa. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection deca, od o~eva koji su imali nisku koncentraciju spermatozoida, nisku pokretljivost spermatozoida i lo{u morfologiju, su imala sli~an razvoj kao i deca od o~eva sa normalnim parametrima spermatozoida. U nekim studijama se pokazalo da je proces ICSI - intra citoplasmatic sperm injection podloàn uticaju spoljnih faktora. Naro~ito se upotreba testikularnih spermatozoida, umesto zrelih spermatozoida, smatra rizi~nijom po poreme}aje u imprintingu kako je embrion uzgajan in vitro, podloàn promenama imprintinga. Do sada je ro|eno nekoliko dece sa Angelman-ovim sindromom, usled sporadi~nog defekta imprintinga, nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection procedure. Nedostatak mutacije sredi{ta imprintinga i detekcija {ablona mozai~ne metilacije ~ini malo mogu}im nasle|ivanje defekata i ukazuje na postzigotski epigenetski defekat. Postoji mogu}nost da ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje uti~e na produkciju ili funkciju izvr{nih, transacting faktora neophodnih za imprinting maj~inskog hromozoma 15. S druge strane, drugi autori u svojim radovima nisu prona{li abnormalni {ablon metilacije na hromozomu 15. Od strane vi{e autora opisani su slu~ajevi BWS - Beckwith - Wiedemann - ovog sindroma.

Sl. 4.54- Beckwith Wiedemann syndrome histopatolo{ki nalaz

Smatra se da rasprostranjenost BWS Beckwith Wiedemann syndrome-a iznosi 1/15000. Molekularne studije su pokazale da je ve}ina prou~avane dece imala specifi~ne epigenetske izmene koje se dovode u vezu sa BWS - Beckwith Wiedemann syndrome-om, i to, mutacije imprintinga LIT 1 i H19 gena, i razli~ite izmene metilacije specifi~ne za BWS - Beckwith Wiedemann syndrome. Na osnovu ovih nalaza i zapaànja da se Angelmanov sindrom pojavio nakon primene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, postoji dovoljno dokaza da neki aspekti ICSI - intra citoplasmatic sperm injection procedure mogu pove}ati frekventnost epigenetskih anomalija {to vodi ka sindromu kongenitalne malformacije. Po{to su svi poreme}aji imprintinga veoma retki, kod BWS Beckwith Wiedemann syndrome-a poga|a ∼1/15000 dece, Angelman - ovog sindroma ∼1/30000, Praeder-Vili ∼1/15000, za detekciju manjih pove}anja je potreban ve}i uzorak. S obzirom na poznatu vezu izme|u BWS - Beckwith Wiedemann syndroma, karcinoma i pove}ane frekventnosti abnormalnosti metilacije H19, moèmo pretpostaviti da asistirana reprodukcija moè biti u direktnoj vezi sa pojavom embrionalnih


karcinoma u koje su uklju~ene abnormalnosti metilacije. Po{to je incidencija karcinoma kod dece sa BWS - Beckwith Wiedemann syndromom, mla|e od 4 godine, 0.02 na 110 pacijent - godina, o~ekivano bi bilo primetiti ove probleme od trenutka kada grupe pacijenata postanu dovoljno velike i kada je follow-up primenjen posle neonatalnog perioda ∼1/1000 pri starosti od 5 godina. Do sada je identifikovano pribli`no 50 gena kod kojih je prisutan genomski imprinting i mnogi nisu bili klonirani ili jo{ uvek imaju nepoznatu funkciju. Iz svih ovih podataka moèmo zaklju~iti da postoje dokazi za pove}an rizik od poreme}aja imprintinga kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection dece i da de~iji karcinomi mogu biti povezani sa ovim poreme}ajima, ali samo nekoliko zapaànja u literaturi pruà podatke o mogu}im frekventnostima ovih pojava. Samo sistemati~no ispitivanje, usmereno

223

ka onim sindromima i bolestima koje imaju poznat i definisan fenotip povezan sa genomskim imprintingom, moè razjasniti da li epigenetske anomalije igraju ulogu u ICSI - intra citoplasmatic sperm injection i IVF - in vitro fertilisation metodi ~e{}e nego kod op{te populacije. Kod analiziranih izve{taja o Angelman - ovom sindromu i o BWS - Beckwith Wiedemann-ovom sindromu, konstatovane su promene na maj~inskom nemetilisanom alelu. Ovo ~ini malo verovatnim povezanost problema sa diferencijacijom spermatozoida i ~ini verovatnijim da ICSI intra citoplasmatic sperm injection procedura ili neki drugi aspekti asistirane reprodukcije remete metilaciju u maj~inskom genomu ili u ranom embrionu. Potrebne su dodatne biolo{ke studije radi razumevanja patogeneze ovih pojava i odgovora na pitanje preventive njihove pojave.

224


4. TESE - TESTICULAR SPERM EXTRACTION Od predstavljanja intracitoplazmati~ne injekcije sperme do{lo je do revolucije u razmi{ljanju o mu{koj neplodnosti i re{avanju i najteìh slu~ajeva sa abnormalnom morfologijom te{kog stepena ili sa niskim brojem spermatozoida u ejakulatu. Dalji napredak je ostvaren uvo|enjem nove metode TESE - testicular sperm extraktion i MESA - microsurgical epidydimal sperm aspiration u kombinaciji sa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike oplodnje u tretmanima opstruktivne i neopstruktivne azoospermije.

Sl. 4.55- TESE - testicular sperm extraction

Opisane su razne metode hirur{kog dobijanja testikularnog tkiva.

TESE - testicular sperm extraction obi~no podrazumeva otvorenu biopsiju koja je obavljena pod lokalnom ili op{tom anestezijom na slede}i na~in: pravi se mali rez tunice albuginae i mali deo istisnutog testikularnog tkiva se ekstrahuje. Ukoliko se spermatozoidi ne prona|u, biopsija se ponavlja na drugom delu testisa, ili ~ak na drugom testisu, sve dok se ne obezbedi dovoljna koli~ina spermatozoida za ICSI intra citoplasmatic sperm injection. Kod mu{karaca sa aktivnom spermatogenezom, sa ili bez opstrukcije, ili u situacijama kada nijedan spermatozoid nije dobijen posle epididimalne punkcije, moè se poku{ati testikularna aspiracija finom iglom TEFNA - testicular fine needle aspiration. U ovom se slu~aju, igla ili pi{tolj sa iglom za biopsiju, uvodi u testis i tubularni materijal aspirira. Pregledom se utvr|uje da li su prisutni spermatozoidi i da li je potrebno uzimati dodatne uzorke. Ovom tehnikom se dobija manje spermatozoida za ICSI intra citoplasmatic sperm injection u pore|enju sa otvorenom biopsijom. Prvobitno se mislilo da }e ova tehnika biti manje invazivna po testis od otvorene biopsije. Me|utim, u daljem istraìvanju se


pokazalo da je TEFNA - testicular fine needle aspiration nanosila ireverzibilno o{te}enje i atrofiju u arhitekturi seminifernih tubula. Za razliku od ovog, TESE - testicular sperm extraction je stvarala samo lokalni oìljak i fibrozu, pa je ve}i deo testisa bio netaknut i bez o{te}enja. Uzimaju}i u obzir broj dobijenih spermatozoida i invazivnost tehnike prikupljanja, dolazi se do zaklju~ka da je procedura otvorene biopsije metoda izbora. Kao {to je ve} re~eno u poglavlju o pripremi sperme za oplodnju u programima asistirane reprodukcije krioprezervacija biopsiranog testikularnog tkiva i spermatozoida koji nisu iskori{}eni u ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusu omogu}uje smanjenje broja hirur{kih intervencija na testisu.

225

U eksperimentima opisanim na ìvotinjama transplatacija stem }elija iz germinativnih }elija, od plodnog donora u testis neplodnog primaoca, ponovo uspostavlja spematogenezu u testisu primaoca. Rezultuju}i spermatozoidi prenose donorov genotip na potomstvo primaoca. Transplantacija germinativnih }elija pomaè u rasvetljavanju biologije stem }elija dobijenih iz linije germinativnih }elija, razvoju sistema kultivacije spermatogonijskih stem }elija i ispitivanju defekata spermatogeneze. Ksenografti testisa su pogodni za ispitivanje lekova za pobolj{anje mu{ke fertilnosti. Prema tome, transplantacija }elija zametka i ksenografting tkiva testisa pruàju nove mogu}nosti za prou~avanje i le~enje mu{ke fertilnosti.

226


5. IVM - IN VITRO MATURATION Gregory Pincus 1936. godine je objavio rad u kojem je izloìo da nezreli oociti dobijeni iz folikula mogu spontano sazreti u in vitro uslovima, o ~emu je i Edwards 1965. godine istraìvao. U svojim kasnijim radovima su Lucinda L. Veeck 1983. godine, F. L. Barnes 1996. godine i Coskun 1998. godine utvrdili da je razvojna kompetentnost in vitro sazrelih humanih oocita niska zbog gubitka normalnih mehanizama folikularne kontrole koji reguli{u ovu etapu razvoja. Lucinda L. Veeck je objavila 1983. godine prvo ro|enje deteta iz uspe{ne IVM - in vitro maturation metode sa stimulisanim ciklusom. K.Y. Cha je 1991. godine objavio prvo ro|enje deteta IVM - in vitro maturation metodom sa nestimulisanim oocitima nakon ovariektomije u programu donorskih oocita. Nakon ovih izve{taja je izvestan broj studija opisao uspe{nu upotrebu IVM in vitro maturation metode koja je rezultovala klini~kim trudno}ama. Kada se oociti odvoje iz antralnih folikula u ranoj folikularnoj fazi, folikularni rast i rast oocita, nisu kompletni, a kod nekih folikula je ve} inicirana atrezija. Neatreti~ni oociti iz takvih folikula obi~no zahtevaju 48 ~asova kultivisanja radi reinicijacije mejoze, {to je ne{to duì period u pore|enju sa oocitima iz prirodnih ciklusa

kod kojih se nuklearno sazrevanje inicira LH - luteinizing hormonom. Mogu}e je da su anomalije razvoja i sazrevanja, prime}ene kod IVM - in vitro maturation oocita, svojstvene njihovoj skra}enoj fazi rasta i time nesposobnosti da kompletiraju sve neophodne transkripcione i translacione zahteve za sazrevanje i sticanje razvojne kompetentnosti. Nakon Lonergan-ove studije 1997. godine koji je postigao formiranje blastociste kod IVM - in vitro maturation oocita, Anderiesz je 2000. godine produìo fazu rasta nezrelih ljudskih oocita in vitro pomo}u DMAP - 6-dimetilaminopurina koji inhibira GVBD - germinal vesicle breakdown protein. Nagove{teno je da tretman sa DMAP - 6-dimetilaminopurina-om moè sinhronizovati sazrevanje nukleusa i citoplazme, ali nije bilo dokaza o ovome efektu kod oocita. Tretman oocita sa DMAP - 6dimetilaminopurina-om nije imao uticaj na oplodnju ili razvoj do etape blastociste i otkriveno je da pove}ava razvojni kapacitet embriona. Anderiesz je zaklju~io da produàvanje faze rasta u predsazrevanju, privremenim inhibiranjem aktivnosti kinaze pomo}u DMAP - 6-dimetilaminopurina, nije direktno pobolj{alo razvojnu kompetentnost ljudskih oocita. Zbog niske razvojne kompetentnosti IVM - in vitro maturation oocita, in vivo


sazrevanje ostaje metod koji treba izabrati radi ostvarivanja uspe{nih trudno}a, bez obzira na potrebu za velikim dozama egzogenih hormona koji imaju svoje rizike i cenu. Jedan od problema kod humanih oocita je pruànje optimalnih uslova za IVM - in vitro maturation, {to zahteva imitiranje mikro-endokrine sredine dominantnog folikula, jer se ~ini da je ovo vaàn preduslov koji je potreban nezrelim oocitima za postizanje pune kompetentnosti nukleusa i citoplazme. Kod IVM - in vitro maturation oocita, uslovi za oplodnju i kultivaciju embriona, kao i za uterinsku receptibilnost pri transferu, se mogu razlikovati od onih kod konvencionalnih ciklusa IVF - in vitro fertilisation, pa }e zbog toga morati da se optimiziraju, da bi se obavila implantacija. îni se da je IVM - in vitro maturation naro~ito zahtevna kod ~oveka kod koga se faktori, za koje se zna da imaju negativne posledice po kompetentnost, kao {to je na primer nasle|ivanje maj~ine i-RNK - messenger ribonucleic acid, komplikovano za prou~avanje. Osim toga, promene izazvane procesom in vitro maturacije imaju potencijal da izazovu negativne uticaje na razvoj koji se ne mogu uo~iti na osnovu posmatranja pona{anja embriona u in vitro uslovima tokom preimplantacionih etapa. U nekim radovima dolazi se do podataka da IVF - in vitro fertilisation metoda izlaè embrione uslovima kojih nema u in vivo uslovima, pa ovo moè rezultovati nepredvi|enim posledicama, uklju~uju}i i sindrom LOS - large offspring syndrome koji se dovodi u vezu sa pove}anim brojem spontanih abortusa, produènim trajanjem gestacije, fizi~kim abnormalnostima i pove}anim mortalitetom i morbiditetom. Dana{nji nalazi indiciraju da su izmenjeni {abloni genomskog imprintinga verovatni i neo~ekivani uzrok ovog sindroma.

227

Iako nema dokaza za poreme}aje u razvoju, koji se dovode u vezu sa IVF - in vitro fertilisation i kultivacijom embriona, poznato je da su oociti i embrioni i nakon etape blastociste ekstremno osetljivi na spolja{nju sredinu, bilo prirodnu ili ve{ta~ku, pa njihov normalni razvoj moè biti ugroèn na puno na~ina. Produèno kultivisanje, koje je potrebno za in vitro sazrevanje, se zbog toga mora smatrati potencijalno rizi~nim i mogu}im uzrokom lo{e razvojne kompetentnosti koja se obi~no dovodi u vezu sa IVM - in vitro maturation. U svom trenutnom obliku, IVM - in vitro maturation metoda je u ranoj etapi razvoja i za klini~ku upotrebu se mora primenjivati oprezno. Klini~ke trudno}e kao rezultat IVM - in vitro maturation metode su od posebnog zna~aja u sada{njoj fazi primene ove metode. Puna razvojna kompetentnost oocita i embriona se kona~no odre|uje samo ìvim ro|enjima i moè, tako|e razumljivo, zahtevati pa`ljivo pra}enje nakon ro|enja. Za ostvarivanje ovarijalne stimulacije kod IVF - in vitro fertilisation metode koriste se razli~iti protokoli o ~emu je bilo govora u poglavlju o stimulaciji folikulogeneze. Razni protokoli, uklju~uju}i delimi~nu ili minimalnu stimulaciju egzogenim hormonima, se koriste i u pripremama za IVM - in vitro maturation postupak. Kod preliminarnih studija, tretman èna tokom jednog ili tri dana rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormon rano u folikularnoj fazi, nije pokazao razliku u broju dobijenih oocita ili u frekventnosti sazrevanja, oplodnji ili razvoju embriona u kulturi. Utvr|eno je pove}anje produkcije oocita do proseka od 7,5 oocita nakon rFSH rekombinantni folikul stimuliraju}i hormon tretmana u pore|enju sa 5,2 oocita kod pacijenata koji nisu hormonski tretirani.

228


Posle 48 ~asova kultivacije, sa dodatkom FSH - follicle stimulating hormone-a i HCG - human chorionic gonadotropin-a u medijum, zna~ajno vi{e oocita je zavr{ilo sazrevanje u odnosu na oocite kod èna koje nisu tretirane, 71,1% prema 43,5%, i bilo je zna~ajno manje degenerisanih oocita. Mogu}e je da je ova in vivo stimulacija pospe{ila produkciju LH - luteinizing hormone receptora koji su bili stimulisani HCG - human chorionic gonadotropin-om dodatim u medijumu tokom IVM - in vitro maturation. Upotreba minimalne ovarijalne stimulacije sa rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormonom se primenjuje po~ev od 3. dana ciklusa kod dve grupe èna: onih sa redovnim regularnim menstrualnim ciklusima i onih sa policisti~nim ovarijalnim sindromom, PCOS - polycystic ovarian syndrome i neregularnim ciklusima. Kod prirodnog menstrualnog ciklusa u serumu FSH - follicle stimulating hormon po~inje da raste u kasnoj lutealnoj fazi. Kod èna sa anovulatornim ciklusima je inicirano krvarenje i po~eto je sa niskom dozom rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormonom devetog dana. Davanje gonadotropina je nastavljeno sve dok vode}i folikul nije dostigao oko 10mm u pre~niku. Oociti su dobijeni posle prekida davanja rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}eg hormona od 2 - 5. dana. Pretpostavljalo se da }e rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormon stimulisati rast folikula i time pove}ati broj nezrelih oocita potrebnih za IVM - in vitro maturation. Dobijeno je prose~no 11,2 prema 11,5 nezrelih oocita kod obe grupe èna, s tim da je 71% nezrelih oocita dostiglo zrelost posle 44 ~asa kultivacije, a 64% je bilo oplo|eno ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom. Ovi rezultati se nisu zna~ajno razlikovali izme|u obe grupe.

Razvoj GVBD - germinal vesicle breakdown proteina i sazrevanje do M2 se razlikuju izme|u GV - germinal vesicle oocita dobijenih iz stimulisanih i nestimulisanih jajnika. Osloba|anje GVBD - germinal vesicle breakdown proteina je zna~ajno ranije kod oocita dobijenih iz stimulisanih jajnika u odnosu na oocite iz nestimulisanih jajnika. Posle 12 ~asova kultivacije 80% oocita u GV - germinal vesicle fazi iz stimulisanih jajnika se podvrglo procesu GVBD - germinal vesicle breakdown proteina dok su oni iz nestimulisanih jajnika ostali nepromenjeni. Vreme zavr{etka sazrevanja nukleusa, prikazano osloba|anjem prvog polarnog tela, se razlikovalo: 75% oocita iz stimulisanih jajnika je stiglo do M2 za 30 ~asova kultivacije, dok je 75% oocita iz nestimulisanih jajnika dostiglo M2 fazu za 42 - 45 ~asova. Me|utim, ukupan broj sazrelih oocita dobijenih od stimulisanih i nestimulisanih jajnika nije se razlikovao. Razli~iti mehanizmi sazrevanja stimulisanih folikula sa FSH - follicle stimulating hormone-om ili HCG - human chorionic gonadotropin-om se mogu pripisati razlici reakcije GVBD - germinal vesicle breakdown proteina zbog izmenjenog profila receptora ili zbog post-receptorskih signalnih mehanizama, koje tek treba razjasniti. Terapija gonadotropinom vodi do razvoja folikula i dovodi se u vezu sa povi{enim koncentracijama estradiola. Oociti dobijeni iz stimulisanih jajnika su izloèni prete`no estrogenskom miljeu. Pored toga, dodatak estradiola medijumu za sazrevanje oocita moè direktno uticati na kvalitet oocita. Nije detektovan uticaj estradiola na GVBD - germinal vesicle breakdown protein ili dalji napredak mejoze. Estradiol podsti~e niz kratkotrajnih pove}anja koncentracije intracelularnog


slobodnog Ca2+ koji moè doprineti kompetentnosti oocita za oplodnju i za rani razvoj nakon oplodnje. Jedna od studija je nagovestila da davanje hormona rasta tokom ovarijalne stimulacije za ICSI - intra citoplasmatic sperm injection moè pomo}i in vitro sazrevanju i oplodnji, me|utim, istovremeno se dobija veliki broj nezrelih oocita, a prona|ene su razlike izme|u grupa pacijenata sa i bez hormona rasta ishoda ICSI intra citoplasmatic sperm injection. Ovaj nalaz nagove{tava da se rezultati ne moraju odnositi isklju~ivo na oocite u sazrevanju. IVM - in vitro maturation i oplodnja su, tako|e, ra|eni kod nezrelih oocita dobijenih u fazi germinal vesicle nakon primene egzogenog HCG - human chorionic gonadotropin-a in vivo. Ove studije se razlikuju u prisustvu ili odsustvu prethodne FSH follicle stimulating hormone stimulacije, broju nezrelih oocita za in vitro sazrevanje, vremenu kultivacije, sazrevanju i kori{}enom medijumu za kultivaciju, stepenu oplodnje i deobi embriona. Nezreli oociti dobijeni nakon in vivo primene HCG human chorionic gonadotropin-a mogu sazreti u kulturi bez dodatka gonadotropina ili steroida. Medijum za kultivaciju obi~no sadrì serum pacijenta i ponekad granulozne }elije dobijene od istog folikula. Mogu}e je da je HCG - human chorionic gonadotropin inicirao proces sazrevanja ~ak iako su oociti jo{ uvek u GV - germinal vesicle fazi prilikom punkcije. Postoje dokazi da izdvajanje oocita iz njihove normalne folikularne sredine, pre njihove luteinizacije, smanjuje sposobnost oplo|enja, {to se vidi na primeru promene signalizacije kalcijumom kao reakcije na spajanje spermatozoida i oocita.

229

ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje kod in vitro sazrelih oocita pove}ava verovatno}u oplodnje, jer se premo{}avaju problemi kao {to su, o~vr{}ivanje zona pellucida usled produène kultivacije i promene kortikalne reakcije, zbog neadekvatne periferne migracije kortikalnih granula tokom sazrevanja. Zbog toga se ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje rutinski koristi kod programa IVM - in vitro maturation. Neadekvatne periferne migracije kortikalnih granula se mogu smatrati dokazom nezrelosti ili abnormalnosti ooplazme sa mogu}no{}u postojanja drugih anomalija citoplazme koja poti~u, ili koja su pogor{ana, primenom IVM - in vitro maturation i koje mogu uticati na ishod ili na potomstvo. Sadràj medijuma koji se koristi za IVM - in vitro maturation metodu uti~e na ishod sazrevanja. Klju~ni eksperiment, koji je sproveden tokom 1990-ih godine, i koji je ponovo pokrenuo interesovanje za IVM - in vitro maturation tehniku, je koristio folikularnu te~nost kao dodatak medijumu za kultivaciju. Danas sa upotrebom komercijalnih medijuma kori{}enje bioloskih fluida je smanjeno. Razni hormoni i faktori rasta uklju~eni u medijum za kultivaciju, kao {to su epidermalni faktor rasta EGF - epidermal growth factor ili FSH -follicle stimulating hormon sa ili bez humanog horionskog gonadotropina HCG - human chorionic gonadotropin, mogu potpomo}i sazrevanje oocita i razvoj embriona. Ostale supstance koje imaju pozitivan uticaj na sazrevanje i oplodnju kod drugih vrsta, a koje jo{ nisu testirane kod ljudi, uklju~uju glutation i cistein koji deluju na granulozne }elije, a ne direktno na oocite. Granulozne }elije se mogu modifikovati komponentama medijuma za kultivaciju

230


uti~u}i na oocit direktno putem parakrinog dejstva ili fizi~ki putem modifikacije njihovog prisustva i orijentacije oko oocita. IVM - in vitro maturation je najuspe{nija odmah nakon punkcije, jer je oocit okruèn nera{irenim }elijama kumulusa koje ostaju u kulturi do zavr{etka sazrevanja. ]elije kumulusa su veoma metaboli~ki aktivne i na njihove produkte, kao {to su steroidi, moè se uticati dodavanjem hormona in vitro. Sazrevanje oocita se odvija, pre svega, supresijom inhibitornih uticaja granuloznih }elija, uklju~uju}i one koje su do{li do oocita preko gap spojeva. Lokalni stimulatorni faktori mogu poja~ati proces. Gonadotropini su glavni faktori za in vivo sazrevanje oocita. Delovanje gonadotropina na folikularnom nivou je sloènije nego {to se moè o~ekivati iz njihove rasprostranjenosti i predvidive primene kao sistemskog inicijatora ovulacije. Granulozne }elije sadrè mRNK - messenger ribonucleic acid za FSH - follicle stimulating hormone receptore od ranog folikularnog razvoja, dok se LH - luteinizing hormone receptori podsti~u kao reakcija na stimulaciju putem FSH - follicle stimulating hormone-a i nalaze se na periferiji velikih folikula. Dok folikul raste, javljaju se velike varijacije izme|u granuloznih }elija u razli~itim delovima folikula. Unutra{nje kumulusne }elije nastavljaju da rastu i odgovaraju na FSH - follicle stimulating hormone mucifikacijom, dok spolja{nje muralne granulozne }elije izbacuju P450 aromatazu i LH - luteinizing hormone receptore. Kumulusne }elije prisutne kod IVM - in vitro maturation kulture imaju malo LH - luteinizing hormone receptora. Zanimljivo je da izlaganje kompleksa kumulusa na FSH - follicle stimulating hormone in vitro moè rezultirati neodgovaraju}im sazrevanjem koje se dovodi u vezu

sa preuranjenom i abnormalnom ekspresijom LH - luteinizing hormone receptora. Osim toga, razli~ite izoforme FSH - follicle stimulating hormone-a imaju uticaj na odabir samog izoforma za IVM - in vitro maturation. U spontanom mejotskom sazrevanju i sazrevanju podstaknutom putem FSH - follicle stimulating hormone-a posreduju razli~ite intracelularne putanje. Bilo je nagove{teno da je sazrevanje podstaknuto sa FSH - follicle stimulating hormone-om posredovano generisanjem stimulatornog signala koji premo{}uje inhibitorni stimulus folikula. Spontano sazrevanje ne zahteva stimulatorni signal, jer rezultira uklanjanjem folikularnih inhibitora. Kod klini~ke IVM - in vitro maturation, FSH - follicle stimulating hormone i LH - luteinizing hormone, ili HCG - human chorionic gonadotropin se obi~no dodaju pri kultivisanju u poku{aju imitiranja in vivo pika i ovi hormoni se smatraju relativno bezbednim, jer se pacijent izlaè njima ranije. FSH - follicle stimulating hormone u kombinaciji sa LH -luteinizing hormone kod in vitro sazrevanja je stimulisao brì embrionalni razvoj. Epidermalni faktor rasta EGF - epidermal growth factor je prvi put opisan 1962. godine nakon izolacije iz mi{jih submaksilarnih `lezdi.

Sl. 4.56- EGF - epidermal growth factor (obojen zeleno)


Humani EGF - epidermal growth factor prvobitno nazvan urogastron, je kasnije izolovan iz ljudskog urina i ~lan je familije peptidnih faktora rasta. Kao polipeptidni lanac od 53 amino kiseline, relativno je mali i njegova veli~ina dozvoljava laku penetraciju kroz zonu pelucidu oocita, pa deluje direktno na oocit. EGF - epidermal growth factor ima mitogeno dejstvo u ~itavom nizu mezodermalnih i ektodermalnih tkiva i u~estvuje u regulisanju }elijske proliferacije. EGF epidermal growth factor se sinteti{e u malim antralnim folikulama i ima ulogu u folikularnom rastu kada se odvija brza }elijska proliferacija. TGF - transforming growth factor koji, tako|e, koristi EGF - epidermal growth factor receptor je potentan angiogeni agens koji moduli{e steroidogenezu granuloznih }elija i u~estvuje u folikularnom sazrevanju.

231

razumevanje uloge EGF - epidermal growth factor-a u razvoju folikula i oocita moè biti vaàn preduslov u razvoju klini~ki efikasnih sistema rasta i sazrevanja oocita. Sterol aktivacije mejoze MAS - meiosis activating sterol je otkrio 1995. godine Buskoy. MAS - meiosis activating sterol ima sposobnost da inicira mejozu gameta kod fetalnih testisa i da podstakne nastavak in vitro mejoze oocita koji su u hipoksantinskom zastoju.

Sl. 4.58- MAS - meiosis activating sterol biosinteza

Sl. 4.57- TGF - transforming growth factor

EGF - epidermal growth factor receptor je prisutan kod mnogih }elija jajnika, uklju~uju}i i oocite primordijalnih, primarnih i preantralnih folikula, kao i granuloznih }elija antralnih folikula. EGF - epidermal growth factor moè igrati pozitivnu ulogu u in vitro sazrevanju oocita i, tako|e, moè poja~ati sazrevanje i razvoj intrafolikularnih oocita u kulturi folikula. Bolje

Dva prirodna sterola koji podsti~u nastavak mejoze oocita bez i onih okruènih kumulusnim }elijama su tako|e identifikovani: FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol i T-MAS - testis meiosis activating sterol ekstrahovan iz testikularnog tkiva. FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol i T-MAS - meiosis activating sterol su posrednici u biosinteti~koj putanji holesterola, ali se MAS - meiosis activating sterol akumulira samo u gonadama. FSH - follicle stimulating hormone i HCG - human chorionic gonadotropin direktno uti~u na biosintezu holesterola. Za pravovremeni nastavak mejoze oocita, unutar preovulatornog folikula pretpostavljalo se da poti~e od kombinovanih uticaja izmenjene biosinteze holestreola granuloznih i kumulusnih }elija, {to je rezultovalo

232


akumuliranjem MAS - meiosis activating sterola i direktnog transfera MAS - meiosis activating sterola od kumulusnih }elija do oocita preko gap spojeva. Zato MAS meiosis activating sterol moè biti endogeni medijator uticaja gonadotropina na oocite. Nekoliko studija je testiralo uticaj pro~i{}enog ili sinteti~kog FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterola na stimulisanje in vitro sazrevanja. Stimulacija endogene produkcije moè biti efikasnija od suplementacije, jer se egzogeni MAS - meiosis activating sterol redovno konvertuje u holesterol i u druge steroide. Farmakolo{ka inhibicija ∆14 reduktaze kod kumulus - oocit kompleksa u hipoksantinskom zastoju je izazvala akumulisanje endogenog FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol-a i nastavak mejoze oocita. Isti efekat nije prime}en kod oocita bez kumulusa, {to je navelo na zakljucak da se biosinteza MAS - meiosis activating sterol-a odvija u kumulusnim }elijama, a ne u oocitu. Blokiranje metabolizma FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol-a je stimulisalo GVBD - germinal vesicle breakdown protein kod oocita okruènih kumulusnim }elijama, ali ne i kod slobodnih oocita. Zato je predloèna alternativna interpretacija, po kojoj podsticanje mejotskog sazrevanja inhibitorima enzima, koji se nalaze niè od FF-MAS folicular fluid meiosis activating sterola u biosintezi sterola, deluje spre~avanjem akumulisanja inhibitornih metabolita kao {to je holesterol. Ovo je mogu}e obja{njenje po{to kori{}eni inhibitor ima dodatno mesto delovanja na 7-reduktazi koje proizvodi holesterol iz ∆7- dehidroholesterola. Pokazalo se da holestreol poja~ava inhibitorni uticaj dbcAMP - dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, na na~in koji zavisi od veli~ine doze i kod oocita okruènih kumulusnim }elijama i kod slobodnih oocita.

Katokonazol inhibira citohromni P450 14DM enzim koji konvertuje lanosterol u FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol in vitro. Utvr|eno je da nema uticaja katokonazola koji je potentni inhibitor sinteze sterola na sazrevanje oocita, kako kod in vivo oocita stimulisanih gonadotropinom, tako i kod spontano sazrevaju}ih oocita in vitro. Stimulisanje P450 - 14DM, pomo}u gonadotropina, se suprotstavlja inhibitornom dejstvu katokonazola na ovaj enzim, pa se ravnoteà aktivnosti enzima, lokalno u kumulusu, ne moè kvantifikovati. Signalne putanje za FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol tokom nastavka mejoze oocita, su nepoznate. Sinteza proteina je neophodna za odràvanje sposobnosti odgovora oocita na MAS meiosis activating sterol, ali transkripcija nije potrebna. MAS - meiosis activating sterol receptor nije identifikovan, iako je otkriveno da specifi~no spajanje FF-MAS folicular fluid meiosis activating sterola preovla|uje u oolemi slobodnih oocita. Kontrola sazrevanja oocita na molekularnom nivou nije do kraja razja{njena kao i brojnih drugih lokalnih aktivnih faktora. Folikularni milje je bogata i sloèna me{avina hormona, faktora rasta, makromolekula i vezivnih proteina i predstavlja sredinu koja je usavr{ena evolucijom. Prema tome, nije iznena|uju}e da dodavanje razli~itih faktora medijumu za kultivaciju ne premo{}uje gubitak kompetentnosti ili nesposobnosti sticanja kompetentnosti in vitro. IVM - in vitro maturation bi mogla postati alternativa ili dopuna trenutnim protokolima stimulacije koji se koriste u IVF - in vitro fertilisation. IVM - in vitro maturation omogu}uje kori{}enje 10 - 15% nezrelih oocita dobijenih nakon ovarijalne stimulacije, smanjuju}i na taj na~in ukupan gubitak oocita. Ovo bi koristilo pacijentima sa nesinhrovanizovanom kohortom folikula kod kojih je veliki broj nezrelih oocita


dobijenih nakon stimulacije. Dok }e neki od ovih oocita spontano sazreti in vitro, {to se de{ava, ako kumulus ostane netaknut, podr{ka pomo}u odgovaraju}e in vitro sredine, u koju mogu biti uklju~eni gonadotropin ili drugi dodaci, moè biti korisna za krajnji ishod. IVM - in vitro maturation bi smanjila potrebu za stimulacijom gonadotropinom. Ovo se moè predvideti, jer je istraìvanje pokazalo da se nezreli oociti, prikupljeni iz follikula pre~nika 5 - 14 mm, mogu upotrebiti, ali trenutno ne sa optimalnom efikasno{}u. Glavni kriterijum za odre|ivanje vremena punkcije je da folikul nije pre{ao inicijalne etape atrezije, tj. dominacija folikula nije ~vrsto uspostavljena i da su folikul i oocit dostigli prag razvojne kompetentnosti. IVM - in vitro maturation naro~ito koristi pacijentima koji imaju PCO - polycystic ovarian, radi smanjenja rizika nastajanja hiperstimulacionog sindroma stimulacijom gonadotropinima i HCG - human chorionic gonadotropinom u programu IVF - in vitro fertilisation. Dok je blagi oblik OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma od malog klini~kog zna~aja, teàk oblik OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma, koji karakteri{e veliko uve}anje jajnika i skupljanje ektravaskularne te~nosti, je izuzetno rizi~an za pacijenta, o ~emu }e biti re~i u poglavlju o OHSS - ovarian hyperstimultion syndromu. Za razliku od zrelih, nezreli oociti u antralnim folikulima u kasnoj folikularnoj fazi mogu biti dobijeni lak{e od pacijenata koji bi se podvrgli ooforektomiji, ako se pa`ljivo odredi trenutak intervencije. IVM - in vitro maturation pruà {ansu za o~uvanje plodnosti kod èna sa kancerom, ili drugim malignim stanjima, ili kod èna sa kontraindikacijom za ovarijalnu stimulaciju. Kao alat za istraìvanje, IVM - in vitro maturation moè pruìti vredan model za ispitivanje uzroka mejotskih aberacija i

233

aneuploidnosti, kao i drugih anomalija koje su uobi~ajene kod zrelih oocita. Pre nego {to se IVM - in vitro maturation moè posmatrati kao rutinski tretman neplodnosti, potrebni su validni i efikasni sistemi sazrevanja, oplodnje i razvoja embriona. Bez obzira na sada{nja, jo{ uvek postoje}a ograni~enja IVM - in vitro maturation metode, nagove{teno je da potencijalne koristi IVM - in vitro maturation, u pore|enju sa konvencionalnom IVF - in vitro fertilisation i uz razvijaju}e znanje o mehanizmima kontrole rasta folikula i oocita i ranu embriologiju, pruàju povoljan trenutak za ozbiljno razmatranje kori{}enja IVM - in vitro maturation metode u svakodnevnoj praksi. U nekim radovima je utvr|eno da davanje HCG - human chorionic gonadotropin-a pre uzimanja oocita pove}ava razvojnu kompetentnost prikupljenih nezrelih oocita. U radovima se pokazalo da je oko 50% oocita ve} sazrelo kod pacijenata kojima je dat HCG - human chorionic gonadotropin i oni su zavr{ili mejozu 12 -24 ~asa pre oocita pacijenata kojima nije dat HCG - human chorionic gonadotropin. Nije prona|ena zna~ajna razlika izme|u ukupne oplodnje, razvoja embriona i broja trudno}a kod pacijenata kojima je dat HCG - human chorionic gonadotropin u odnosu na pacijente kojima nije dat HCG - human chorionic gonadotropin. Primena metode sazrevanja oocita u in vitro uslovima je potencijalno odgovaraju}a dopuna hirurgiji ili dijatermiji jajnika radi ostvarivanja trudno}e kod neplodnih èna sa PCOS - polycystic ovarian syndrome-om, dok je uspeh koji se moè o~ekivati promenljiv, sude}i prema objavljenim izve{tajima iz raznih centara. Moraju se pobolj{ati uslovi sazrevanja oocita radi zadràvanja potencijalne razvojne kompetentnosti nezrelih oocita, {to treba da bude prioritet u buducim istraìvanjima. Procenat trudno}a nakon IVM - in vitro maturation je oko 10%.

234


6. GENETIKA MU[KE NEPLODNOSTI, EVOLUCIJA X I Y HROMOZOMA I MOGU]NOST PRENOSA NEPLODNOSTI NA BUDU]E GENERACIJE Od uvo|enja metode intracitoplazmati~ne injekcije spermatozoida, 1992. godine, do{lo je do promena u razmi{ljanju o mu{koj neplodnosti. Najteì slu~ajevi mu{ke neplodnosti, sa abnormalnom morfologijom ili sa niskim brojem spermatozoida u ejakulatu, danas mogu ostvariti broj trudno}a i poro|aja koji se ne razlikuje od konvencionalne IVF - in vitro fertilisation sa normalnim spermatozoidima. Slede}e, 1993. godine uvedene su nove metode, testikularna ekstrakcija sperme TESE - testicular sperm extraction i mikrohirur{ka epididimalna aspiracija sperme MESA - microsurgical epidydimal sperm aspiration, sa primenom u tretmanu opstruktivne azoospermije u kombinaciji sa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom oplodnje. Ove tehnike su kori{}ene i kod neopstruktivne azoospermije, jer kod mnogih azoospermi~nih mu{karaca postoji jako mala produkcija sperme u testisu koja nije kvantitativno dovoljna da se prelije u ejakulat, ali je adekvatna za ICSI - tehniku oplodnje. Upravo su kod ovih slu~ajeva neopstruktivne azoospermije i te{kih slu~ajeva

oligospermije zna~ajna genetska istraìvanja, jer ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje stvara potencijalni problem progresije mu{ke neplodnosti. Zbog toga su sve va`nija molekularna ispitivanja i dobijeni podaci o spermatogenezi Y hromozomskih gena i njihovog prenosa na potomke dobijene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom oplodnje.

Sl. 4.59- Humani X hromozom

Posebna vaznost sa aspekta evolucije Y hromozoma je i razja{njenje postojanja velikog broja gena spermatogeneze koji se prostiru {irom genoma, a koji tako|e mogu

235


biti razlog za preno{enje mu{ke neplodnosti na budu}e generacije.

Sl. 4.60- Humani Y hromozom

Sl. 4.61- Humani X i Y hromozomi

Pretpostavljalo se da postoji genetska etiologija u velikom broju slu~ajeva mu{ke neplodnosti. Ova sumnja je potekla iz istraìvanja od pre 25 godina kada se do{lo do citogenetskog dokaza da kod 0,2% azoospermi~nih mu{karaca, koji su ina~e bili fenotipski normal-

ni, postoje terminalne delecije Y hromozoma. Odre|ivanje kariotipa neplodnih mu{karaca je pove}alo mogu}nosti povezivanja neplodnosti sa translokacijama autozoma. Sumirani rezultati odre|ivanja kariotipa kod novoro|enih populacija su otkrili pove}anje relativne u~estalosti uravnoteènih translokacija autozoma kod normalne novoro|ene populacije u odnosu na neplodne mu{karace od 0,25% na 1,3%. Odre|ivanjem kariotipa oligospermi~nih mu{karaca dokazana je incidencija od 3% prisustva nekih tipova autozomskih anomalija, i to, uravnoteène Robertsonove translokacije, uravnoteène recipro~ne translokacije, uravnoteène inverzije. Ove translokacije bi mogle da se prenesu na potomke kori{}enjem ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike oplodnje. Mogu}nost da je porast i sve ve}i broj slu~ajeva mu{ke neplodnosti, genetskog porekla, podràna je neuspehom klini~kih terapija kod slu~ajeva nepotpune spermatogeneze. Prva molekularna istraìvanja Y hromozoma su dovela do istraìvanja gena koji kontroli{u spermatogenezu, a koji mogu biti defektni kod mnogih ili ve}ine neplodnih mu{karaca. Nedavno je genetska etiologija mu{ke neplodnosti, koja je u vezi sa defektima u spermatogenezi, postala priznata uvo|enjem molekularne metodologije. Samom tom ~injenicom, da mu{ka neplodnost ima genetsko poreklo, mogu} je prenos na potomke u slu~ajevima uspe{no tretiranih neplodnih mu{karaca.

Tabela 4-7: Hromozomske abnormalnosti kod azospermi~nih i oligospermi~nih mu{karaca u pore|enju sa normalnom novoro|enom populacijom BROJ

POLNI HROMOZOMI

AUTOZOMI

UKUPNO

UKUPNO

7 876

295 (3,8)

104 (1,3)

399 (5,1)

NOVORO\ENÂD

94 465

131 (0,14)

232 (0,25)

366 (0,38)

236


Slede}i korak daljeg istraìvanja je bilo mapiranje Y hromozoma neplodnih mu{karaca. Kod odre|ivanja kariotipa je poznato da veoma mali broj od 0,2 % azoospermi~nih mu{karaca ima velike defekte vidljive na dugom kraku Y hromozoma koji nisu prisutni kod njihovih o~eva. Iz ovoga proizilazi postojanje azoospermi~nog faktora na dugom kraku Y hromozom, Yq . Manji defekti se ne mogu dijagnostikovati citogenetskim metodama, pa su ovi defekti na Yq smatrani retkim, ~ak i kod azoospermi~nih mu{karaca. Godine 1992. formirane su mape Y hromozoma pomo}u ve{ta~kih hromozoma YCS - yeast artificial chromosomes i sekvenciranih obeleènih pozicija STS - sequenced tagged sites, {to je stvorilo mogu}nost detaljnog prou~avanja Y hromozoma neplodnih mu{karaca. Pomo}u polimerazne lan~ane reakcije PCR - polymerase chain reaction definisanje izgubljenih delova Y hromozoma bi moglo biti dostignuto testiranjem i do 52 DNK - deoksiribonukleinska kiselina obele`ja STS - sequenced tagged sites na ~itavom Y hromozomu. Svi upotrebljeni Y-DNK markeri su sme{teni na fizi~ku mapu hromozoma predstavljaju}i sve familije gena u nerekombinuju}oj regiji Y-hromozoma. Kori{}enjem ovih tehnika molekularnog mapiranja, koje imaju mnogo ve}u rezoluciju od citogeneti~ke, ura|ena su ispitivanja na velikom broju neplodnih mu{karaca sa jasno identifikovanim fenotipom. Tako je otkriveno prisustvo delecija kod 13% azoospermi~nih mu{karaca. Kod oligospermi~nih mu{karaca je utvr|eno prisustvo 7 % delecija. Naj~e{}a regija sa pojavom delecije je locirana u distalnom delu intervala 6, kasnije nazivanim AZFc - azoospermia factors.

Sl. 4.62- Humani mapirani Y hromozom

Ve}a rezolucija mapiranja Y-hromozoma tokom odre|ivanja kariotipa je pokazala da vi{e od 0,2% azoospermi~nih mu{karaca ima defekte Y hromozoma. Zbog visoko polimorfne prirode nerekombinuju}e regije Y hromozoma NRY - non recombining segment Y chromosome gen, postoje brojne delecije koje ne izazivaju nikakve posledice. Za o~eve neplodnih mu{karaca se pokazalo da imaju netaknute Y-hromozome {to zna~i da su se delecije pojavile de novo. DAZ - deleted in azoospermia homolog genski cluster je identifikovan u naj~e{}oj regiji delecije AZFc - azoospermia factors. Pokazalo sa da su DAZ - deleted in azoospermia homolog geni prepisani u spermatogonijama i ranim primarnim spermatocitima. Otkriveno je da je kod ~oveka DAZ - deleted in azoospermia homolog gen Y hromozoma, lociran u AZFc azoospermia factors regionu, u sredini podru~ja sa vi{estrukim ponavljanjem niza nukleotida. Kasnije je otkriveno da je DAZ - deleted in azoospermia homolog gen prisutan u ~etiri, skoro identi~ne kopije u AZFc - azoospermia factors regiji. Prisustvo DAZLA - deleted in azoospermia like aut homolog gena na hromozomu 3 koji je homolog DAZ - deleted in azoospermia


homolog genu na Y hromozomu je ono {to dozvoljava da nizak stepen spermatogeneze ostaje kod mu{karaca sa delecijom ve}ine AZFc - azoospermia factors. Kod delecije izvan AZFc - azoospermia factors ne dolazi do spermatogeneze. Pokazalo se da manje delecije koje zauzimaju samo dve kopije DAZ - deleted in azoospermia homolog gen-a rezultiraju umerenijim spermatogenim defektima u odnosu na klasi~ne AZFc - azoospermia factors delecije sve ~etiri kopije DAZ - deleted in azoospermia homolog gen-a. Ovo ukazuje na postojanje poligenih efekata vi{estrukih doza gena koji bi mogli kontrolisati spermatogenezu. Nekoliko gena u razli~itim oblastima Y hromozoma igraju va`nu ulogu u spermatogenezi. Iako postoje brojne kopije i pseudogeni RBM - RNK binding motif gena na Y hromozomu, od kojih je ve}ina nefunkcionalna, postoji i funkcionalna kopija u regiji, u blizini AZFc - azoospermia factors. Ispitivanja su podràvala koncept prema kome brojni geni Y hromozoma, pored onih iz AZFc - azoospermia factors regije, tako|e uti~u na spermatogenezu. Multipli geni sprematogeneze doprinose i modifikuju stepen spermatogenih defekata kod mu{karaca sa delecijom na Y hromozomu. Delecije na Y hromozomu koje se citogenetski nisu mogle dijagnostikovati nazvane su mikrodelecije. Ta~na je bila pretpostavka da manje delecije ili ta~kaste mutacije mogu biti prisutne, kako u AZFc - azoospermia factors-u, tako i na drugim mestima. Sekvence nukleotida koje se ponavljaju i koje karakteri{u ve}i deo Y hromozoma oteàvaju standardnim STS - sequenced tagged sites markerima da defini{u manje delecije.

237

Neobi~na struktura ponavljaju}ih sekvenci AZFc - azoospermia factors regije Yhromozoma je oteàvala prve poku{aje konstruisanja fizi~ke mape pomo}u YAC yeast artifitial chromosome, jer ponavljaju}i STS - sequenced tagged sites nisu mogli biti precizno postavljeni u deletiranim intervalima 6D6F. Napori za nalaènjem ta~kastih mutacija du` Y-hromozoma su bili oteàni prisustvom vi{estrukih kopija gena u ovim regijama sa brojnim ponavljanjima, specifi~nim za Y hromozom. AZFa - azoospermia factors sekcija Yhromozoma je odabrana da bude detaljno prou~ena zbog odsustva vi{estrukih kopija gena ili specifi~nih ponavljanja Y-hromozoma u toj regiji. AZFa - azoospermia factors ima potpuno druga~iju, konvencionalnu i neponavljaju}u strukturu, za razliku od AZFb - azoospermia factors-a i AZFc azoospermia factors-a. Sekvenciranjem AZFa - azoospermia factors regija Y hromozoma su identifikovana dva funkcionalna gena USP9Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gen i DBY - dead box Y chromosome gen. Dalje sekvenciranje ova dva gena je otkrilo nekoliko varijacija sekvenci od kojih je ve}ina nesle|ena od oca i nema funkcionalne posledice. U jednom slu~aju je prona|ena de novo delecija ~etiri nukleotidna para USP9Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gena na spoju introna i egzona, {to je uslovilo nepravilan "splajsing", odnosno, pogre{no isecanje introna i nastanak i -RNK koja }e se translatovati u skra}eni protein. Ova mutacija nije bila prisutna kod plodnih ro|aka i predstavljala je prvi slu~aj mutacije koja je prouzrokovala genski defekat koji je u vezi sa spermatogenim neuspehom. Prou~avanje AZFa- azoospermia factors-a je, tako|e, pruìlo dobar model za interakciju i preklapanje funkcija vi{estrukih gena,

238


koji razja{njava poligenu prirodu genetske kontrole spermatogeneze. Kada se cela AZFa - azoospermia factors regija deletira, uzimaju}i DBY - dead box Y chromosome gen i USP9Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gene, dolazi do pojave ozbiljnijeg spermatogenog defekta i pacijent je azoospermi~an. Me|utim, kada postoji samo specifi~na ta~kasta mutacija USP9Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gena dolazi do zastoja u sazrevanju sa nekoliko pahitenskih spermatocita koji se razvijaju u zrelu spermu. Tako gubitak DBY - dead box Y chromosome gena jedinog preostalog gena u

AZFa - azoospermia factors regiji pogor{ava spermatogene posledice gubitka USP9Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gena. Ovaj nalaz u AZFa azoospermia factors regiji je paralelan sa prethodnim zapaànjima prema kojima su ve}e delecije na Y-hromozomu povezane sa manjom verovatno}om pronalaènja spermatozoida. Razvojem metode ICSI - intra citoplasmatic sperm injection sa testikularnim i epididimalnim dobijanjem sperme, mu{karci sa najteìm spermatogenim defektima, koji prouzrokuju azoospermiju u ejakulatu, su sada mogli da imaju decu.

Tabela 4-8: Rezultati ICSI - intra citoplasmatic sperm injection kod mu{karaca sa deletiranim i normalnim Y hromozomom sa te{kom oligospermijom < 2x10 6 i neopstruktivnom azoospermijom

Y-brisani (< 2 x106 ) Y-nebrisani (<2x106 ) Broj pacijenata sa spermatozoidima Broj ciklusa sa spermatozoidima Broj jaja{aca Broj ZPN Broj trudno}a Broj poro|aja Broj beba Broj de~aka Broj devoj~ica

23 45 508 (289) 57% (17) 38% (13) 29% 18 10 8

205 312 3291 (1849) 56% (112) 36% (81) 26% 9943 43 56

Tabela 4-9: Detekcija Y delecija u limfocitima periferne krvi kod 884 neplodna mu{karca S/A < 5 x10 6

Dijagnoza Ne-opstruktivna azoospermija

Prou~en broj

Prona|eno Y-brisanja

528

66 (13%)

Te{ka oligospermija

356

24 (7%)

Ukupno

884

90 (10%)


Odgovor na pitanje za{to su se inicijalni molekularni napori za definisanje genetskih uzroka mu{ke neplodnosti koncentrisali na Y hromozom leì u istoriji evolucije X i Y hromozoma. Tokom poslednjih 240 do 320 miliona godina evolucije sisara, X i Y hromozomi su evoluirali iz onoga {to je originalno bilo, par obi~nih autozoma. Za vreme te evolucije, dok se ve}ina nasle|enih X gena raspadala zbog nedostataka mejotske rekombinacije X i Y hromozoma, pojavili su se geni koji kontroli{u spermatogenezu transpozicijom ili retropozicijom od autozoma na Y hromozom. Kada su stigli u razvoju do Y hromozoma, ovi biv{i autozomski geni su se umnoìli u vi{e kopija. Ostali geni spermatogeneze na Y hromozomu su istrajali na njihovim originalnim pozicijama na X hromozomu i razvili su specifi~nu spermatogenu funkciju na Y hromozomu. Iako je DAZ - deleted in azoospermia homolog gen veoma star, dobro o~uvan gen nalazi se na Y hromozomu ljudi. Kod sisara je ina~e potpuno autozoman RBM - RNK binding motif gen i nalazi se na Y hromozomu jo{ od nastanka novog hromozoma, {to je dokazano njegovim prisustvom na Y hromozomu torbara pre razilaènja euterijskih od neeuterijskih sisara. Tako je RBM - RNK binding motif bio gen spermatogeneze koji je zapo~eo na autozomima predaka koji su evoluirali u X i Y hromozome sisara. RBM - RNK binding motif gen koji je ostao na X hromozomu RBMX - RNK binding motif X chromosome gene je zadrào svoju rasprostranjenu funkciju, dok je RBMY - RNK binding motif Y chromosome gene, koji je istrajao na Y hromozomu koji uzmi~e, evoluirao u specifi~no mu{ku funkciju u spermatogenezi. SRY - sex determining region gen, lokus koji odre|uje mu{ki pol, verovatno je originalno bio SOX3 - sulfur oxidation 3

239

gen na X hromozomu pre diferencijacije u SRY - sex determining region mu{ki gen koji odre|uje pol. Zapravo je evolucija nerekombinuju}eg mu{kog gena SRY - sex determining region zapo~ela ceo proces evolucije Y hromozoma. SOX3 - sulfur oxidation 3 je gen na X hromozomu koji inhibira SOX9 - sulfur oxidation 9 gen koji je, tako|e, na X hromozomu. SOX9 - sulfur oxidation 9 gen na X hromozomu je gen koji aktivira odre|ivanje mu{kog pola. SOX3 - sulfur oxidation 3 gen je evoluirao u SRY - sex determining region na Y hromozomu. SRY - sex determining region inhibira SOX3 - sulfur oxidation 3 gen omogu}avaju}i aktivnost SOX9 - sulfur oxidation 9 gena i tako odre|uje da li }e se desiti kaskada doga|aja koja vodi do formiranja testisa. Tako se obja{njava po~etak transformacije obi~nog para autozoma u sada{nje X i Y hromozome. Geni koji su u vezi sa nerekombinuju}om regijom SRY - sex determining region, a koji su bili naro~ito korisni kod mu{ke funkcije, su se razvijali na evoluiraju}em Y hromozomu bez {tetnog dejstva mejotske rekombinacije. Na ovaj na~in, mu{ki korisni geni su stigli i akumulirali se na evoluiraju}em Y-hromozomu tokom mnogo miliona godina pomo}u tri mehanizma: - transpozicijom od autozoma preko translokacije, - retropozicijom od autozoma preko reverzne transkripcije, i - perzistencijom, tj. mu{kom modifikacijom funkcije od onog {to je originalno bio gen na X hromozomu. Ovaj proces daje Y hromozomu vrlo jedinstven tip funkcionalne povezanosti koja nije vi|ena u ljudskom genomu. Funkcionalna reproduktivna anatomija X i Y hromozoma je od posebne va`nosti. Translokacije se de{avaju relativno ~esto kod svake vrste. Tokom evolucije ovo

240


rezultira da se o~uvani, homologni geni razli~itih vrsta nalaze u potpuno razli~itim delovima genoma i u relativno pome{anom nizu gena svakog hromozoma gde strukturna blizina ima malo ili nimalo uticaja na funkciju. Me|utim, dve nasumi~ne transpozicije koje tokom vremena rezultuju haoti~nim nedostatkom organizacije genoma su dozvolile direktno pribavljanje, od strane Y-hromozoma, gena koji imaju zajedni~ku funkciju da poja~aju mu{ku plodnost. Selektivni pritisci podsti~u proces koncentrisanja gena spermatogeneze na nerekombinuju}em delu Y-hromozoma zajedno sa mu{kim genom koji odre|uje pol, SRY sex determining region genom, naro~ito ako su ovi geni od male koristi ènskom polu. Zanimljivo je da je X-hromozom, za razliku od autozoma i Y hromozoma, izuzetno o~uvan kod svih sisara, sa malo me{anja gena sa strane radi selekcije protiv ometanja razvoja procesa inaktivacije X hromozoma u evoluciji X i Y hromozoma. Geni koji su stigli na Y hromozom, ili koji su istrajali na degeneri{u}em Y genu od preda~kog X i stekli istaknuti poloàj na Y hromozomu, pro{li su kroz paradoksne procese amplifikacije, proizvode}i vi{estruke kopije i kroz degeneraciju usled neuspeha rekombinacije. DAZ - deleted in azoospermia homolog gen, kao {to je re~eno, bio je prvi takav gen koji je identifikovan u

AZFc - azoospermia factors regiji Y hromozoma putem inicijalnog Y mapiranja kod azoospermi~nih mu{karaca. DAZ deleted in azoospermia homolog gen predstavlja prvi nedvosmislen primer transpozicije autozoma u Y hromozom gena spermatogeneze koji je predstavnik procesa koji uti~e na mnoge druge gene spermatogeneze i mo`da obja{njava relativno lo{e stanje ljudske spermatogeneze u pore|enju sa spermatogenezom kod ostalih ìvotinja. îni se da je transpozicija autozoma u Y hromozom gena mu{ke plodnosti proces koji se ponavlja u evoluciji Y hromozoma kod svih vrsta. Autozomski DAZ - deleted in azoospermia homolog gen, kod ~oveka nazvan DAZ-L - deleted in azoospermia homolog gen se nalazi na ljudskom hromozomu 3. U nekom trenutku tokom evolucije, pre oko 30 miliona godina, ovaj DAZ - deleted in azoospermia homolog gen je stigao transpozicijom na Y hromozom od onog {to se danas zove humani hromozom 3 i tu se umnoìo i proizveo ~etiri gotovo identi~ne kopije gena. Ovaj proces je prvo opisan za DAZ-L - (deleted in azoospermia) homolog gen i DAZ - deleted in azoospermia homolog gen. Me|utim, danas se zna da postoje drugi, prethodno autozomski geni ili familije gena na Y hromozomu, ~ija se ekspresija odvija samo u testisu i koji igraju veliku ulogu u spermatogenezi.

Tabela 4-10: Dolazak gena spermatogeneze na Y hromozom po Lahn - u

Transpozicija Retropozicija Perzistencija Perzistencija

Gen DAZ (AZFc) Ljudski Y DAZ (AZFc) Ljudski Y RBM (AZFb) Ljudski Y

Gen predak DAZ (Automatski) Ljudski 3 CDYL (Automatski) Ljudski 6 RBMX Ljudski X

SRY

SOX - 3

241


CDY - chromodomain protein Y chromosome gen je stigao u AZFc - azoospermia factors regiju Y hromozoma na druga~iji na~in od onog na koji je stigao DAZ - deleted in azoospermia homolog gen i to reverznom transkripcijom. Autozomski CDY - chromodomain protein Y chromosome gen, CDY1 - chromodomain protein Y chromosome 1 gen se nalazi na humanom hromozomu 6. Homologi CDY bez introna je prona{ao svoj put do humanog Y hromozoma pre dolaska DAZ (deleted in azoospermia) homolog gena, ne{to posle odvajanja prosimijske linije primata pre otprilike 50 miliona godina . To se desilo tako {to je na osnovu zrele i-RNK, nastale prepisivanjem gena sa hromozoma 6, sintetisana DNK reverznom transkripcijom koja se potom ugradila u Y-hromozom. Gen dobijen reverznom transkripcijom nije sadrào introne pa je stoga postojala i razlika u nukleotidnoj sekvenci izme|u istih gena na hromozomu 6, sa intronima i Zhromozomu. RBB - retinoblastoma binding gen u AZFb - azoospermia factors regiji Y hromozoma je imao svoje poreklo u pretku na{eg X hromozoma i tamo se pro{irio kao testis specifi~an gen. Pre 240 - 320 miliona godina, ubrzo nakon razilaènja sisara i ptica, X i Y geni su po~eli da se razilaze u identitetu sekvenci sa pojavom SRY - sex determining region Y chromosome gen i neuspehom rekombinacije u regiji SRYsex determining region Y chromosome gen. Sa raspadanjem evoluiraju}eg Y hromozoma, usled nedostatka rekombinacije, ovi geni koji su originalno bili X hromozomski su se razi{li u nizu sa Y hromozoma, a oni koji su imali mu{ke korisne funkcije su istrajali. Primer ovih gena je SRY - sex determining region Y chromosome gen koji je zapo~eo kao generi~ki SOX3 - sulfur

oxidation gen na X hromozomu, ali je razvio svoju specijalizovanu testis odre|uju}u funkciju onemogu}avaju}i ceo proces rekombinacije, koji je na kraju rezultovao degeneracijom Y hromozoma. Ovim istim procesom je RBM - RNK binding motif gen stigao do istaknutog poloàja u AZFb azoospermia factors regiji Y hromozoma. Tabela 4-11: Perzistencija RBM-X na Y hromozomu po Lahn -u i Page-u

Y - gen

Gen predak

SRY Odre|uje mu{ki pol

SOX - 3 Nema mu{ke specifi~ne funkcije

RBN - Y RBM - X Mu{ka specifi~na Nema mu{ke funkcija specifi~ne funkcije • Jedna kopija • Brojne kopije • Puno degenerata • Isti kod svih euterijskih sisara AZFa - azoospermia factors regija u NRY - non recombining segment Y chromosome genu je ne{to komplikovanija. Po~etak uzmicanja preda~kog Y, u pore|enju sa svojim parom X je bio u etapama tokom 320 miliona godina. X - Y homologija se smanjuje u skladu sa tim koliko rano u svojoj istoriji nisu uspeli da se rekombiniju X i Y hromozomi, sa posledicom razilaènja u strukturnom nizu. Evolutivno gledano, najranije odsustvo rekombinacije bilo je ograni~eno na distalni deo X hromozoma, da bi se u najnovijoj istoriji ono pro{irilo i na najproksimalniji deo X-hromozoma. AZFa - azoospermia factors regija Y hromozoma se razi{la od X hromozoma relativno skoro u svojoj evolucionoj istoriji i zbog toga ima konvencionalniju

242


strukturu sekvenci sa mnogo ve}om homologijom od one koju ima njen rival na X hromozomu. Dva gena u AZFa - azoospermia factors regiji: USP9 Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gen i DBY - dead box Y chromosome gen igraju va`nu ulogu u spermatogenezi. Delecija AZFa - azoospermia factors sekvence rezultuje potpunim odsustvom sperme. Bez obzira na metod dolaska gena spermatogeneze do nerekombinuju}eg dela Y hromozoma, ovaj region bi se neizbe`no suo~io, a verovatno i podlegao, sna`nim degenerativnim silama tokom evolucije koja }e uslediti. Pretpostavka je da brzina, odnosno, stepen pribavljanja gena mu{ke plodnosti uslovljava brzinu degeneracija koje slede, rezultuju}i stanjem neprekidne evolucije. Za razliku od ekstremne evolucione stabilnosti X hromozoma, individualni geni mu{ke neplodnosti nisu dugog ìvotnog veka, u evoluicionom smislu, na Y hromozomu. Isticanje Y hromozoma u lociranju gena spermatogeneze radi pomo}i u rasvetljavanju uzroka mu{ke neplodnosti ima smisla, jer je Y hromozom prikupio gene koji bi ina~e bili skriveni {irom celog genoma. Imaju}i u vidu istoriju evolucije X i Y hromozoma, moè se konstatovati da ima podjednako sna`nih komponenti za regulaciju spermatogeneze, lociranih tako|e na X hromozomu i na autozomima. Nestabilnost X hromozoma moè voditi ka padu produkcije sperme u evoluciji bilo koje vrste, osim ako postoji konkurencija u {ablonu sparivanja ili metod kontinualnog popunjavanja Y hromozoma novim genima spermatogeneze, sa pro{irenjem koje sledi, a koje se de{ava pre kona~ne degeneracije. Y hromozom je mesto od koga treba

zapo~eti molekularnu potragu za genima koji uti~u na mu{ku plodnost. Razlog za po~injanje od Y hromozoma pridaje naro~iti zna~aj verovatno}i nalaènja jo{ takvih gena koji se kriju {irom ~itavog genoma. Paralelna i nezavisna evolucija X i Y hromozoma i poreklo X-inaktivacije su od posebnog zna~aja. Polni hromozomi su nezavisno evoluirali puno puta kod razli~ith vrsta sa zajedni~kom osnovom. Hromozom sa genom koji odre|uje pol progresivno gubi sposobnost da se rekombinuje sa svojim parom, akumulira mutacije i zapo~inje sa pogor{avanjem. X i Y hromozomi su evoluirali potpuno zasebno i razli~ito kod svake vrste, ali su evoluirali preko zajedni~ke evolucione osnove. Ako Y hromozom Drosophila-e ima deleciju, Drosophila je sterilna. Ako Y hromozom mi{a ili ~oveka ima deleciju, mi{ i ~ovek su sterilni. Ako neka vrsta ima na Y hromozomu zna~ajne delecije, ta vrsta je sterilna. Me|utim, geni koji bi bili izgubljeni na Y hromozomu mi{a, nisu isti oni geni koji su deletirani na ljudskom Y hromozomu. Na primer, homologni gen humanog Y DAZ - deleted in azoospermia homolog gena kod Drosophila-e je autozoman kao {to je autozoman i kod mi{a DAZLA - deleted in azoospermia like autozomal gen, pa delecija ovog autozomskog gena kod Drosophila-e, ili kod mi{a, rezultuje sterilitetom podjednako kao i delecija Y hromozoma Drosophila-e ili Y hromozoma mi{a. Delecija DAZ - deleted in azoospermia homolog gena na Y hromozomu ~oveka ~esto ne rezultuje potpunim odsustvom spermatogeneze, verovatno zbog toga {to stari homologi autozomni DAZ - deleted in azoospermia homolog


gen na hromozomu 3 spa{ava spermatogenezu do nekog manjeg nivoa. Delecija AZFb - azoospermia factors gena, me|utim, obi~no rezultuje potpunim odsustvom sperme, zato {to nema autozomskih ili X homologih gena da spasu spermatogenezu kada se ovi geni izgube. Isti {ablon je prona|en kod svih prou~enih vrsta. X i Y po~inju kao par autozoma predaka gde se gen koji odre|uje mu{ki pol ne rekombinuje sa svojim homologim genom. Kod nekih Drosophila, ceo Y hromozom odsustvuje, pa je mu`jak sa takvim poreme}ajem, XO, sterilan. Iako humani Y hromozom, ili bilo koji Y hromozom sisara nema nikakvu sli~nost nukleotidne sekvence sa sekvencom Y hromozoma vo}ne mu{ice, na delu je isti mehanizam akumulacije gena spermatogeneze u raspadaju}em hromozomu koji odre|uje mu{ki pol. Tako je Y hromozom Drosophila i mi{a veoma razli~it od Y hromozoma ~oveka, ali se oni ~ine istim zbog dve zajedni~ke evolucione osnove u razvoju Y hromozoma. Jedna osnova je njegovo postepeno raspadanje od onog {to je bio njegov autozomski homolog, a sada je X hromozom, a druga osnova je njegov rast od pribavljanja i akumulacije mu{ki korisnih specifi~nih gena iz drugih delova genoma. Ovaj evolucioni mehanizam degeneracije Y hromozoma i akumulacija gena spermatogeneze moè objasniti relativno ~esto pojavljivanje mu{ke neplodnosti i lo{ kvalitet sperme kod vrsta koje imaju minimalnu konkurenciju sperme. Tako|e, moè objasniti fenomen X inaktivacije, ~esto pojavljivanje XO mrtvoro|ene dece i opstanak nekih XO za~e}a kao dece sa Turnerov-im sindromom. Autozom predak koji }e postati Yhromozom razvija proces prvo hiperaktivacijom, a potom X-inaktivacijom

243

da bi nadoknadio gubitak homologih alela, alelomorfa na onome {to sada postaje Y hromozom. Dok je X hromozom zadràvao, a Y hromozom postepeno gubio ve}inu ovih gena-predaka, stvoren je mehanizam da se izbalansira genska aktivnost me|u polovima, tako {to je kod mu{karca ekspresija gena sa X-hromozoma intenzivirana, a kod ène razvijena inaktivacija gena sa jednog od dva X hromozoma. Ovaj mehanizam je, tako|e, osigurao izuzetnu konzervaciju i sli~nost X hromozoma kod svih vrsta sisara. Razumevanje evolucije X homologih gena Y hromozoma, gubljenjem njihovih op{tih }elijskih funkcija, potrebe za pove}avanjem aktivnosti i inaktivacije X gena na jednom od dva ènska X hromozoma, pomaè razja{njavanju razli~itih etapa evolutivnog razvoja humanog Y hromozoma. RBMY - RNK binding motif Y chromosome gen je testis specifi~ni korisni mu{ki kandidatni gen spermatogeneze. Homologi gen RBM - RNK binding motif gena na Y hromozomu RBMX - RNK binding motif X chromosome gen nije razvio specifi~no mu{ku izraàjnost, ali je zadrào svoje op{te }elijske funkcije odràvanja. Zato se o~ekuje da }e se RBMX - RNK binding motif X chromosome gen pona{ati kao gen X hromozoma bez rivala u Y hromozomu i verovatno }e se podvrgnuti Xinaktivaciji. Kao srodan primer, humani ZFX - zink finger X chromosome gen i ZFY - zink finger Y chromosome gen su veoma srodni na X i Y hromozomu i oba imaju op{te }elijske funkcije odràvanja koje su kriti~ne za njihov ìvot. Prema tome, ZFX - zink finger X chromosome gen izbegava X-inaktivaciju kod èna, a ZFY - zink finger Y chromosome gen je jedan od gena aktivan kod Turner-ovog sindroma.

244


Tabela 4-12: Perzistencija X gena na Y genu

ÔVEK

MI[

ÔVEK MI[

Y gen SRY - Odre|uje mu{ki pol

X gen - predak SOX - 3 - Bez specifi~ne mu{ke funkcije

RPS4 - Y - Odràvanje - Svuda prisutan - Tarnerov gen

RPS4 - X - Odràvanje - Svuda prisutan - Nije X inaktivisan

- Nema RPS4 - Y - Evoluirao izvan prisutnosti ZFY - Odràvanje - Svuda prisutan - Tarnerov gen - Specifi~na samo mu{ka funkcija - Samo dve kopije

Sli~no tome, RPS4X - ribosomal protein S4 X chromosome gen i RPS4Y - ribosomal protein S4 Y chromosome gen su jo{ jedan homologi par gena na X i Y hromozomu i oba imaju ekvivalentne funkcije odràvanja kod ~oveka. Prema tome, kod ~oveka RPS4X - ribosomal protein S4 X chromosome gen, sli~no ZFX - zink finger X chromosome genu, nije podloàn X-inaktivaciji, jer postoje funkcionalni transkripti kod mu{karaca, iz X i Y hromozoma, a kod èna iz oba X hromozoma. Ovaj kratak pregled istorije evolucije X i Y hromozoma obja{njava za{to je Y hromozom bio dobro mesto za po~etak molekularne potrage za genima spermatogeneze. Jasno je da brojni geni sa ~itavog genoma, iako manje izu~avani, tako|e uti~u na spermatogenezu, pa se tako mogu preneti na ICSI - intra citoplasmatic sperm injection potomstvo.

- Odràvanje - Jeste X inaktivisan ZFX - Odràvanje - Svuda prisutan - Nije X inaktivisan - Odràvanje - Svuda prisutan - Jeste X inaktivisan

Od posebnog je zna~aja izu~avanje kariotipa neplodnih mu{karaca i njihovih potomaka nakon uspe{ne oplodnje ICSI intra citoplasmatic sperm injection tehnikom. Incidencija citogenski prepoznatljivih abnormalnosti hromozoma kod potomaka pacijenata podvrgnutih ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnici oplodnje je prihvatljivo veoma niska, ali je ve}a od one kod spontano novoro|ene populacije. Pra}enje stanja dece ro|ene nakon uspe{ne primene ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metode je bilo prou~avano detaljno, a rezultati su objavljivani na Briselskom Univerzitetu od 1995. godine, svake godine redovno. Rezultati kariotipa su bili slede}i: kod 0,83% su utvr|ene abnormalnosti polnog hromozoma, ulju~uju}i: 45 X Turner-ov sindrom; 47 XXY

245


Klinefelter-ov sindrom; 47 XXX i mozaike 46 XX/ 47 XXX, kao i 47 XYY. Ovo je veoma niska frekvencija abnormalnosti polnog hromozoma, ali je ipak ~etiri puta ve}a od frekvencije abnormalnosti polnog hromozoma kod novoro|ene populacije od 0,19%. O~igledno je da }e deca sa kariotipom 45 X ili 47 XXY biti neplodna, {to je oko 0,5% od ukupnog broja sa poreme}a-

jima polnog hromozoma. Dalja ispitivanja su pokazala da se kod 0,36% dece javljaju de novo balansirane translokacije autozoma ili inverzije. Ova deca su o~evidno bila normalna, ali ova incidencija de novo balansiranih autozomnih translokacija je pet puta ve}a od one kod novoro|ene populacije 0,07% i moè se pretpostaviti da }e ova deca biti neplodna u oko 0,36%.

Tabela 4-13: Anomalije kariotipa prenatalne dijagnoze

Abnormalni kariotipi kod 1082 prenatalna testa

Starost majke (godine)

Broj

Procenat

Procenat u literaturi

De novo hromozomne aberacije Polno hromozomske: 37 44 - 45, X 32,37 - 46, XX / 47, XXX 26,28,28,32 - 47, XXX (dvoje dece) 25 - 47, XXY (~etvoro dece) - 47, XYY 32,33,37,41,41 Autozomski: - Trisomija 21 30x (petoro dece) 30 Strukturne: 36 - 46, XXX, t (4;5) 39 - 46, XX, t (2;15) - 46, XX, t (2;13) - 46, XX, inv (1gh)

18 19

1,66 0,83

0,445 0,19; 0,23

9 5 4

0,83 0,46 0,36

0,21;0,61 0,14 0,07

Nasle|ene aberacije - Balansirane - Nebalansirane

10 9 1

0,92 0,83 0,09

0,47 0,45 0,023

Ukupno aberacija de novo + nasle|ene

28

2,5

0,91; 0,84

246


Bilo je 10 slu~ajeva sa translokacijama nasle|enih od neplodnog mu{karca 0,92% i ova deca }e verovatno biti neplodna. Devet od ovih deset su bile balansirane translokacije kod normalnih novoro|en~adi. Jedna, 0,09% nebalansirana translokacija je dijagnostikovana amniocentezom. Po{to pribli`no 2% oligospermi~nih mu{karaca ima hromozomske translokacije u pore|enju sa normalnom populacijom od 0,25%, nije iznena|uju}e da }e 0,9% ICSI - intra citoplasmatic sperm injection potomaka naslediti takvu translokaciju od svojih o~eva. Na osnovu citogenetskih nalaza za pribli`no 2% ICSI - intra citoplasmatic sperm injection potomaka se moè o~ekivati da }e imati o~evu neplodnost. Petostruko je pove}anje de novo balansiranih translokacija me|u ICSI potomcima 0,36% u pore|enju sa 0,07% kod spontanih za~e}a. Od toga su samo 20% balansiranih translokacija de novo, a 80% su nasle|ene. De novo balansirane translokacije poti~u od oca u 84,4% slu~ajeva. Balansirane translokacije koje su u vezi sa mu{kom neplodno{}u su prvobitno nastale de novo kod ina~e plodnog oca ili kod njegovih mu{kih predaka, u oko 0,07% kontrolne populacije. Mnogo }e{}e se de novo balansirane translokacije, mada jo{ uvek sa niskim procentom od 0,36%, pojavljuju kod neplodnih mu{karaca koji su se podvrgli ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metodi le~enja i prenose se na njihove potomke. îni se da kod patolo{ke spermatogeneze mogu da se, ne samo prenesu nasle|eni autozomski citogeneti~ki defekti, ve} se moè i proizvesti jedan broj de novo citogenetskih defekata. Incidencija kongenitalnih abnormalnosti dece dobijene primenom ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnike oplodnje od 2,3% nije ve}a od one kod ostale populacije. âk su i

potomci Klinefelterovih pacijenata bili hromozomski normalni. Nema ve}e incidencije autozomske aneuploidnosti od one koja se moè predvideti na osnovu starosti majke. Aneuploidnost polnog hromozoma od 0,83% kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection potomaka nema neprihvatljivo visoku incidenciju, iako je ve}a od normalne od 0,19%. Tako je utvr|eno citogenetskom analizom i pedijatriskim pra}enjem stanja dece ro|ene primenom ICSI intra citoplasmatic sperm injection tehnike potomka da je verovatno}a pojave neplodnosti i poreme}aja polnih hromozoma u malom procentu. Studija o Y hromozomu, daje dodatne podatke o povezanosti plodnosti mu{kih potomaka i u~estalosti pojave steriliteta kod njih, nakon uspe{no primenjene ICSI intra citoplasmatic sperm injection tehnike oplodnje njihovih oligospermi~nih o~eva. Mikrodelecije na duèm kraku Y hromozoma ne uti~u nepovoljno na rezultate oplodnje ili trudno}u kod izuzetno oligospermi~nih mu{karaca. Pretpostavka da }e rezultati vantelesne oplodnje ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom, biti lo{iji kod mu{karaca sa delecijom na Y hromozomu, nije se pokazala ta~nom. Svi mu{ki potomci koji poti~u od mu{karaca sa delecijom na Y hromozomu su imali iste delecije kao i njihovi neplodni o~evi. O~evi, bra}a i stri~evi neplodnih mu{karaca su tako|e pregledani na postojanje delecija na Y hromozomu, a ispitana je i njihova plodnost. Y delecije kod neplodnih mu{karaca su, uglavnom, bila de novo. Zapravo, plodni o~evi neplodnih pacijenata sa Y delecijama nisu imali Y delecije. Me|utim, svi mu{ki potomci iz ICSI - intra citoplasmatic sperm injection procedura u kojima su u~estvovali ovi mu{karci sa Ydelecijama su imali prenetu Y deleciju sa


njihovih o~eva bez pro{irivanja ili drugih promena. Tako je utvr|eno da su do sada svi ro|eni sinovi Klinefelterovih pacijenata imali normalan 46 XY kariotip. Iskustvo ukazuje da se Y delecija sterilnog oca zaista prenosi na sina, pa vi{e ne moramo da spekuli{emo sa tim. Ostaje da se utvrdi da li plodni mu{karci bez Y delecija ili neplodni mu{karci, imaju mozai~ne delecije. Ako je tako, onda bi se de novo Y delecije tako|e mogle ~e{}e na}i kod bra}e pacijenata sa Y delecijom, ili kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection potomaka neplodnih mu{karaca, ~ak i kod onih koji nemaju Y deleciju, nego {to bi se ina~e o~ekivalo da se desi kod ostale novoro|ene populacije. Danas znamo iz detaljnih studija AZFe azoospermia factors i AZFc - azoospermia factors regija Y hromozoma, mnogo vi{e o mehanizmima nastajanja Y delecija i preno{enja na potomstvo. Prva regija Y hromozoma koja je potpuno sekvencirana bila je AZFa - azoospermia factors, jer je to regija Y hromozoma sa veoma malo ponavljaju}ih sekvenci i relativno pristupa~na za prou~avanje. AZF - azoospermia factors regija sa velikim podru~jima ponavljaju}ih sekvenci je, tako|e, bila sekvencirana. Na|eno je da se AZFa - azoospermia factors regija rasprostire na pribli`no 800000 nukleotida, 800 KB, i da je ograni~ena sa svake strane proksimalnim podru~jem razdvajanja i distalnom ta~kom razdvajanja sa oko 10 000 nukleotida, ili 10 KB kilobaza, tako da 94% ukupne sekvence ~ine sekventni identiteti. Preciznija lokalizacija ta~aka razdvajanja uz pomo} konvencionalnog mapiranja kod ve}ine neplodnih mu{karaca sa AZFa - azoospermia factors delecijama nije bila mogu}a. Unutar ovih 10 KB regija razdvajanja, lokacija AZFa - azoospermia factors delecija

247

je skoro uniformno upadala unutar manjih domena, 447 BP, baznih parova ili nukleotida, do 1285 BP. Sekvenciranje kod ve}ine pacijenata sa AZFa - azoospermia factors delecijama je otkrilo, da usled rekombinacije izme|u identi~nih podru~ja provirusa i Y hromozoma na delu koji ograni~ava ceo region od 800 000 baza, moè do}i do gubitka celog regiona sa Y hromozoma. Podru~ja sa ponavljaju}im sekvencama proksimalno i distalno od zajedni~kog mesta delecija, nam daje predstavu o mehanizmu ovih Y - delecija. Pretpostavka je da je do umnoàvanja kopija AZFa - azoospermia factors sekvenci do{lo usled insercije retrovirusa u regiju humanog Y hromozoma. Nalazi o AZFa - azoospermia factors regiji daju naznake o tome {ta se de{ava u nekim uobi~ajenim podru~jima delecija kao {to je AZFc - azoospermia factors. Sekvenca AZFc - azoospermia factors regije otkriva isti mehanizam kao i kod AZFa azoospermia factors, ali u ve}em obimu. Veliki domeni apsolutnih sekventnih identiteta postaju mesta za lako nestajanje, drop-out velikih delova DNK, po{to se granice apsolutnih sekvenci identiteta nelegitimno me|usobno rekombinuju. Usled pro{irenja i inverzija u najstarijim podru~jima razilaènja, divergencije nerekombinuju}eg Y hromozoma, ~itava situacija je pripremljena za deleciju i degeneraciju. Ponavljaju}a priroda Y hromozoma, koja je na~inila sekvenciranje i nalaènje malih delecija ili ta~kastih mutacija toliko te{kim, je uzrok njegove nestabilnosti tokom perioda evolucije kao i kod populacije neplodnih pacijenata. Y delecije, dovoljno velike da se mogu detektovati pomo}u zastarelih mapa, se pojavljuju jednom na 2000 ro|enja upravo zbog ovih ogromnih podru~ja ponavljaju}ih sekvenci.

248


AZFc - azoospermia factors regija Y hromozoma, koja je naj~e{}e mesto delecija se prostire na 3,5 miliona baza, pa je te{ko prihvatljivo da je u pitanju mikrodelecija, kako se ~esto naziva. Sastoji se od tri velika palindroma sa~injena od 6 familija amplikona, tj. duga~kih podru~ja identi~nih sekvenci. Sadrì 19 transkripcionih jedinica sastavljenih od 7 razli~itih familija gena, od kojih je samo jedna DAZ - deleted in azoospermia homolog gen. AZFc - azoospermia factors regija od 3,5 miliona baza je ograni~ena sa svake strane sa podru~jima duga~kim 229.000, sa skoro identi~nim sekvencama, 99,9%. Za razliku od AZFa - azoospermia factors-a, ta~ke razdvajanja ponavljaju}ih sekvenci ne poti~u od drevnog retrovirusa, ve} od same prirode evolucije Y hromozoma usled odsustva rekombinacije. Postoji vi{e podru~ja na Y hromozomu, kao i u AZFc azoospermia factors-u, koja imaju ili direktna ili invertovana ponavljanja sekvenci. Sekvence sa direktnim ponavljanjem }e rezultovati obi~nom delecijom zbog homologe rekombinacije. Invertovana ponavljanja }e rezultovati izodicentri~nim translokacijama, tako|e, zbog homologne rekombinacije. Tako se moè o~ekivati da }e se na}i mnogo drugih, manjih delecija, koje su ranije izbegle detekciju nedovr{enim, nesekventno baziranim STS - sequenced tagged sites mapiranjem. Moè biti da se manje delecije, koje zauzimaju manje gena, ili ta~kaste mutacije kod samo jedne ili dve kopije identi~nih gena, koje se pojavljuju kod vi{estrukih kopija, mogu pripisati izvesnom broju slu~ajeva mu{ke neplodnosti ili mo`da umerenijim stepenima neuspeha spermatogeneze, kod slu~ajeva sa >2 X 106 do 20 X 106 spermatozoida po cm3. Velike mikrodelecije, koje su do sada opisane u literaturi,

su uglavnom de novo, ali je sigurno da neki mu{karci sa ozbiljnom oligospermijom mogu, na prirodan na~in, imati decu. Mu{karci sa umerenijim stepenima oligospermije mogu jo{ lak{e postati o~evi, pa tako manje Y delecije, koje uzrokuju mu{ku neplodnost, ne moraju toliko ~esto biti de novo. Kako se sve vi{e genetskih uzroka neuspeha spermatogeneze pojavljuje, postoja}e pove}ana svesnost mogu}eg prenosa ove neplodnosti na budu}e generacije. Mu{ka neplodnost je u odre|enoj korelaciji i sa X hromozom. Bilo je teorija po kojima Y hromozom nije jedini polni hromozom koji akumulira gene koji pomaù spermatogenezu tokom vremena evolucije. Sa diferenciranjem X i Y hromozoma, pre 240 do 320 miliona godina, teorije o polno antagonisti~kom genu daju prednost pojavi gena na X hromozomu koji, tako|e, pomaè heterogametskom polu, XY mu{kom, a koji nanose {tetu homogametskom polu, XX ènskom, ako su ovi geni recesivni. Retka recesivna evoluciona mutacija na X hromozomu, koja pomaè spermatogenezu, bi sa predno{}u bila predata mu{kom potomku, koji bi pomo}u ve}eg broja spermatozoida nastavio da dalje predaje ovu mutaciju svojim potomcima. Takva recesivna mutacija, koja podràva spermatogenezu, bi u autozomu bila izgubljena za budu}e generacije. Zato se o~ekuje akumulacija na X hromozomu, kao i na Y hromozomu, recesivnih gena koji su korisni za mu{ki pol. Studije RT-PCR - polymerase chain reaction metodom kod spermatogonija pokazale su da ve}ina gena koji su aktivni iskulju~ivo u premejotskim }elijama mu{kog zametka, zaista ima X hromozomsko poreklo. Jedanaest od 36 aktivnih gena poti~e sa X hromozoma. Po{to je X hromozom tako dobro o~uvan kod svih sisara , {to


je ranije obja{njeno univerzalnim razvojem X inaktivacije u evoluciji sisara, ~ini se veoma verovatnim da je evolucija, tako|e, dodelila humanom X hromozomu veliki deo tereta spermatogeneze. Neuspeh da se identifikuje Y delecija nimalo ne uverava da genetski uzrok neplodnosti ne}e biti prenesen na ICSI - intra citoplasmatic sperm injection potomke putem X hromozoma ili, ~ak, putem autozoma. Prisustvo delecije na Y hromozomu ne smanjuje broj oplodnji i broj trudno}a u kojima su u~estvovali azoospermi~ni i izuzetno oligospermi~ni mu{karci, <2 x 106. Za sada je odnos polova ro|ene dece jednak i deca su kariotipski normalna. Me|utim, delecija na Y hromozomu, a i neplodnost se prenosi na mu{ko potomstvo. Iako se prema standardnom STS sequenced tagged sites mapiranju, Y delecije pojavljuju kod samo 10% azoospermi~nih mu{karaca, mapiranje bazirano na sekvenciranju, koje je sada na raspolaganju, moè zna~ajno pove}ati taj procenat. Verovatno ima mnogo gena spermatogeneze koji u~estvuju u mu{koj neplodnosti i istraìvanja do danas daju samo manji

249

broj odgovora na ovaj problem. Mikrodelecije do sada istraène i opisane u literaturi, prona|ene kod neplodnih mu{kih pacijenta, ne uklanjaju mogu}nost postojanja genetskog uzroka azoospermije ili oligospermije. Ako se defektni gen, ili geni, nalaze na njegovom Y hromozomu, tada }e njegov mu{ki potomak naslediti njegov problem. Postoje, tako|e, geni na X hromozomu, i {irom genoma, koji uti~u na spermatogenezu, a koji do sada nisu identifikovani na{im trenutnim procedurama mapiranja. Ovi geni, tako|e, mogu biti odgovorni za brojne slu~ajeve mu{ke neplodnosti. Prema tome, sinovi, pa ~ak i }erke, mogu naslediti defekte, ili ih mogu samo prenositi. Prema tome, odre|ivanje kariotipa sigurno treba rutinski obavljati kod neplodnih pacijenata i zbog rizika od poba~aja i abnormalnosti potomka koji mogu biti rezultat abnormalnosti polnog hromozoma ili nebalansiranih translokacija. Testiranje na Y delecije za sada nije obavezno, jer jo{ uvek nije usavr{eno, pa negativni rezultati ne isklju~uju sigurno patologiju. Osim toga, neke delecije mogu biti samo rezultat polimorfizma i nisu od klini~kog zna~aja.

250


7. BIOHEMIJSKI PREDIKTORI ISHODA IN VITRO FERTILIZACIJE Razvoj folikula i sazrevanje oocita kao i njihova kompetentnost su predmet dosada{njih dugogodi{njih istraìvanja koja se intenziviraju sa po~etkom in vitro fertilizacije. To je opisano u prethodnim poglavljima i predstavlja bazu za istraìvanja o biohemijskim prediktorima ishoda programa asistirane reprodukcije. Tokom protekle dve decenije ispitano je nekoliko steroida i proteina kao mogu}ih prediktora ishoda IVF - in vitro fertilisation. Ispitivane su uloge ovarijalnih steroida, gonadotropina, prolaktina, CBG - corticosteroid binding globulin-a i 11 HSD - 11 -hydroxysteroid dehydrogenaze. Zna~aj otkrivanja biohemijskog prediktora ishoda IVF - in vitro fertilisation je posebno vaàn radi selekcije pre po~etka programa bra~nih parova bez izgleda za uspe{nu realizaciju programa. U praksi se pokazalo da su klinike koje su selektirale i isklju~ivale parove za koje je utvr|eno da imaju malu verovatno}u za~e}a, ostvarile broj trudno}a od preko 45%. Radi minimiziranja rizika od vi{estruke trudno}e mora biti ograni~en broj embriona koji }e biti transferisan da bi se izbegla kasnija fetalna redukcija in utero. Kod ve}ine pacijenata u programima asistirane reprodukcije, samo oni embrioni koji poti~u od

oocita koji su bili ocenjeni kao zreli, bivaju transferisani, ali je kriterijum za zrelost oocita razli~it izme|u raznih centara. Biohemijski prediktori ishoda IVF - in vitro fertilisation bi mogli pruìti objektivnu procenu verovatno}e za~e}a kod svakog para podvrgnutog IVF - in vitro fertilisation, i to, posebno za svaki ciklus pre zapo~injanja bilo kakve procedure. Dobijanje podataka, koji bi indicirali neuspeh odre|enog ciklusa IVF - in vitro fertilisation, pomoglo bi parovima u dono{enju odluke o odustajanju od tretmana. Dalja vrednost pouzdanog biohemijskog prediktora je ta da bi se dobio objektivni putokaz razvojnog potencijala oocita ili embriona i tako pomoglo u izboru embriona, jednog ili vi{e njih, za transfer. Kona~no, dobar prediktor sudbine embriona bi omogu}io embrio transfer jednog embriona sa velikom verovatno}om implantacije i razvoja, {to bi u isto vreme pobolj{alo stepen uspeha IVF - in vitro fertilisation i izbegavanje rizika vi{estruke trudno}e. Dok bi identifikacija embrionskih markera implantacije unapredila bolju selekciju embriona i potencijalno pove}ala i broj trudno}a, prednosti su na strani folikularnih markera implantacije. Kao {to je ve}


re~eno, takvi markeri bi imali potencijal da identifikuju neuspe{ne cikluse i dozvole prekid programa pre aspiracije oocita. Folikularni markeri implantacije bi mogli olak{ati modifikovanje stimulacionih reìma, daju}i podatak o fiziolo{kom statusu folikula i oocita i bolje odre|ivanje trenutka za aspiraciju oocita. U isto vreme bi pruìli objektivno merilo sposobnosti embriona za normalan rast i razvoj. Potraga za biohemijskim prediktorima ishoda IVF - in vitro fertilisation je po~ela od onih molekula za koje se zna da u~estvuju u endokrinoj i parakrinoj kontroli folikularnog razvoja, sazrevanju oocita i ovulaciji kao {to su: estradiol, progesteron, LH - luteinizing hormone, FSH - follicle stimulating hormone, prolaktin i faktori rasta.

Estradiol Koncentracije estradiola su merene u razli~ito vreme: pre, za vreme i posle primene HCG - human chorionic gonadotropin-a. Jedna grupa istraìva~a je utvrdila da je ve}i procenat trudno}a u programu kada su koncentracije estradiola niske tokom ili pre tre}eg dana IVF - in vitro fertilisation ciklusa i na dan primene HCG - human chorionic gonadotropin-a. Druga grupa istraìva~a je utvrdila da su u tretmanu IVF - in vitro fertilisation trudno}e bile u proporcionalnoj srazmeri sa ve}im koncentracijama estradiola pre ili uvreme primene HCG - human chorionic gonadotropin-a. Nasuprot ovim, dijametralno razli~itim rezultatima, u nekoliko drugih studija je objavljeno da nije prona|ena nikakva zna~ajna veza izme|u procenta za~e}a i koncentracije serumskog estradiola bilo kog dana pre primene HCG - human chorionic gonadotropin-a. U jednoj studiji je prona|eno da niske koncentracije estradiola na dan primene

251

HCG - human chorionic gonadotropin-a predvi|aju uspe{nost programa kod pacijenata sa lo{im odgovorom kod kojih je bilo manje od 4 oocita posle kontrolisane ovarijalne hiperstimulacije. Smatraju}i da izbor trenutka merenja estradiola procene funkcije ovarijuma ~ini nepouzdanim, nekoliko studija je ispitivalo vrednosti koncentracija serumskog estradiola tokom dva ili vi{e dana, bilo pre ili posle primene HCG - human chorionic gonadotropin-a. Iako su inicijalne studije izvestile da su brzina i na~in pove}avanja koncentracija estradiola tokom prve nedelje hiperstimulacije mogle predvideti uspe{nost programa, kasnije studije nisu na{le nikakvu vezu izme|u vrednosti serumskog estradiola i ishoda IVF - in vitro fertilisation. O~ito je da su koncentracije serumskog estradiola odre|ene steroidnom aktivno{}u vi{e ovarijalnih folikula, uklju~uju}i i one koji mogu biti atreti~ni, ili one koji sadrè nezrele oocite. Moglo bi se o~ekivati da koncentracija estradiola u folikularnoj te~nosti bude bolji biohemijski marker folikularnog razvoja i potencijala oocita koji je s njim u vezi, nego koncentracije serumskog estradiola. Podaci koji se odnose na koncentracije folikularnog estrogena su, tako|e, kontraverzni kao i podaci o serumu koji su ve} izneti. U nekim radovima je utvr|ena nià folikularna koncentracija estradiola kod IVF - in vitro fertilisation ciklusa koji su rezultirali trudno}om, a u drugima da slobodne i ukupne koncentracije estradiola u folikularnoj te~nosti nisu u vezi sa ishodom IVF - in vitro fertilisation. Tako|e, kada je izve{tavano da je za~e}e putem IVF - in vitro fertilisation u direktnoj vezi sa povi{enim folikularnim odnosom estradiol - testosteron, drugi autori su otkrili smanjenje folikularnog odnosa estradiol-androstenedion

252


u folikulima sa oocitima koji su se oplodili i delili u in vitro uslovima.

Progesteron Podaci vezani za serumske i folikularne koncentracije progesterona su podjednako sporni. U nekoliko studija podizanje koncentracije serumskog progesterona iznad 0.9 ng/ml, 2.68 nM, pre primene HCG human chorionic gonadotropin-a je dovedeno u vezu sa neuspehom IVF - in vitro fertilisation. U drugim objavljenim studijama nisu prona|ene korelacije izme|u ishoda, procedura asistirane reproduktivne tehnologije i koncentracije progesterona, pre ili za vreme primene HCG - human chorionic gonadotropin-a. Neke studije su utvrdile da je kod pacijenata sa povi{enim vrednostima serumskog progesterona pre primene HCG - human chorionic gonadotropin-a bio pove}an procenat trudno}a. Dokazivano je da je veza izme|u prevremenog pove}anja koncentracije serumskog progesterona i neuspeha IVF - in vitro fertilisation posledica nepovoljnog delovanja progesterona na potencijal embriona da se razvija posle ~etvoro}elijskog stadijuma. Visoke koncentracije serumskog progesterona pre primene HCG - human chorionic gonadotropin-a odraàvaju adrenalnu hiperaktivnost, po{to serumski progesteron moè u nekim slu~ajevima da bude normalizovan primenom sinteti~kog kortikosteroida, deksametazona radi suprimiranja adrenalne funkcije, olak{avaju}i za~e}e. Primena HCG - human chorionic gonadotropin-a u roku od 24 ~asa dovedi do zna~ajnog osloba|anja progesterona iz luteiniziraju}ih granuloznih }elija in vivo. Smatralo se da ovo vaì samo u slu~aju da se koristi relativno niska doza HCG human chorionic gonadotropin-a od 5000 mIU radi podsticanja finalnog folikularnog

sazrevanja i ne vaì ako se doza HCG human chorionic gonadotropin-a pove}a na 10000 mIU. Unutar folikula ve}e koncentracije progesterona u vreme aspiracije jajnih }elija se ~ine biohemijskim prediktorom oplodnje oocita i deobe koja sledi. Me|utim, pomalo paradoksalno, visoke koncentracije folikularnog progesterona su, tako|e, dovedene u nekim istraìvanjima u vezu sa neuspehom za~e}a putem IVF- in vitro fertilisation.

FSH - follicle stimulating hormone Neke studije su objavile da su koncentracije serumskog FSH - follicle stimulating hormone-a na po~etku i tokom tre}eg dana IVF - in vitro fertilisation ciklusa niè kod onih ciklusa koji su rezultovali trudno}om, dok kod ve}ine drugih nije prona|ena veza izme|u koncentracija FSH - follicle stimulating hormone-a i ishoda IVF - in vitro fertilisation.

LH -luteinizing hormone Sli~ni razli~iti podaci su dobijeni za koncentracije serumskog LH -luteinizing hormona. Dok je u novijim studijama prijavljen manji broj implantacija i trudno}a kod pacijenata sa niskim koncentracijama LH - luteinizing hormone-a i visokim odnosom FSH - follicle stimulating hormona i LH - luteinizing hormona, ranije studije su tvrdile da je smanjen broj trudno}a posledica pove}anja koncentracija serumskog LH - luteinizing hormona pre primene HCG human chorionic gonadotropin-a i pove}anim urinarnim izlu~ivanjem LH -luteinizing hormone-a. Ostale objavljene studije nisu prona{le korelaciju izme|u koncentracije serumskog LH - luteinizing hormona i bilo kog parametra IVF - in vitro fertilisation, uklju~uju}i broj oocita, procenta fertilizacija i procenta trudno}a.

253


Prolaktin Prolaktin i njegova uloga kao mogu}eg biohemijskog prediktora IVF - in vitro fertilisation ispitivani od po~etka klini~ke primene metode. Prvi radovi su potvrdili vezu izme|u broja IVF - in vitro fertilisation trudno}a i pove}anja koncentracije prolaktina posle primene HCG-human chorionic gonadotropin-a.

prediktivnu vrednost u koncentracijama prolaktina u serumu merenih u raznim etapama kontrolisane ovarijalne hiperstimulacije.

β TGF - β transforming growth factor Od razli~itih faktora rasta za koje se zna da imaju lokalno parakrino i autokrino dejstvo u jajniku, ~lanovi familije transformi{u}eg faktora rasta β TGF - β transforming growth factor, inhibin i aktivin, su privukli najvi{e pa`nje.

Sl. 4.63- Prolaktin imunoperoksidazno bojenje

Dve godine kasnije, 1991. godine Oda je objavio da su koncentracije prolaktina u serumu ve}e od 10 ng/ml pre primene HCG - human chorionic gonadotropin-a, u vezi sa pobolj{anom oplodnjom i brzinom deobe embriona in vitro.

Sl. 4.65- TGF - transforming growth factor

Osim βTGF - β transforming growth factor-a, dalje su istraìvani faktor rasta sli~an insulinu IGF - insulin like growth factor, faktor rasta koji poti~e od trombocita i epidermalni faktor rasta EGF - epidermal growth factor. Koncentracije ovih factora rasta nezavisne su od ishoda IVF- in vitro fertilisation. U nekim istraìvanjima utvr|eno je da su pove}ane koncentracije β TGF - β transforming growth factor-a povezane sa procentom trudno}a.

Inhibin

Sl. 4.64 - Prolaktin fluoroscentno oznaceni receptori

Suprotno ovome nekoliko studija sprovedenih u isto vreme nisu prona{le nikakvu

Rezultati u kojima je zaklju~eno da su koncentracije inhibina u serumu pre primene HCG - human chorionic gonadotropin-a, biohemijski prediktor za~e}a u IVF - in vitro fertilisation programima

254


naru{ena su od strane nekoliko drugih studija. Nedavno je objavljeno da su povi{ene koncentracije inhibina povezane sa rezultatima samo kod onih pacijenata koji su imali relativno niske koncentracije FSH - follicle stimulating hormona. Poja~ana sinteza inhibina in vitro uzgajanih granuloza - luteinskih }elija je bila povezana sa niskim koncentracijama serumskog FSH - follicle stimulating hormona in vivo kod pacijenata od kojih su }elije izolovane. S obzirom na endokrinu ulogu inhibina u supresiji sekrecije FSH follicle stimulating hormona iz hipofize, verovatno se veze izme|u uspe{nog ishoda IVF - in vitro fertilisation i niskih koncentracija FSH - follicle stimulating hormone-a odraàva ovarijalnom sekrecijom inhibina, {to moè imati lokalnu ulogu nezavisnu od gonadotropina na razvoj kompetencije oocita.

Perifolikularni vaskularitet Sredinom 1990-ih godina, istraìva~i su utvrdili da preovulatorni folikul koji kontroli{e nekoliko slojeva avaskularnih granuloznih }elija, mora da se pripremi za period angiogeneze da bi mogao generisati visoko vaskularizovani corpus luteum potreban za podràvanje trudno}e. ûi je 1997. godine izvestio o korelaciji izme|u perifolikularnog protoka krvi i trudno}e dobijenih putem IVF - in vitro fertilisation. Razvio je sistem kvantifikacije protoka krvi na periferiji folikula u vreme aspiracije oocita, koji se bazirao na merenju veli~ine periferije folikula koji je davao signal na power dopler angiogramu. Pomo}u ovog sistema merenja opisana su ~etiri stepena protoka krvi folikula, i to: prvi stepen sa najlo{ijim protokom, manjim

od 25%, dok ~etvrti stepen ima najbolji protok krvi, kada je preko 75% periferije folikula vaskularizovano. Ova prva zapaànja su pokazala veoma zna~ajnu povezanost izme|u neuspeha za~e}a i lo{e vaskularizovanih folikula. Kod pacijenata kod kojih ni jedan od folikula nije imao bolji stepen protoka krvi od prvog i drugog stadijuma, zna~i do maksimalno 50% vaskularizacije, nije bilo trudno}a. Rezultati su pokazali procente trudno}a od 12,5% u grupi u kojoj je protok krvi bio tre}eg stepena do 61,5% u grupi u kojoj je protok krvi bio ~etvrtog stepena. Analiza podataka o embrionima iz ovih serija je podràla zapaànja koja je napravio Nergund 1996. godine o vezi izme|u vaskularizacije folikula i verovatno}e oplodnje oocita. Stepen fertilizacije oocita je bio 58% iz folikula sa najlo{ijim prvim stepenom protoka krvi i 71 - 80% za folikule sa boljom vaskularizacijom. Interesantno je da najbolja fertilizacija oocita nije postignuta u grupi ~etvrtog stepena vaskularizovanosti folikula, iako razlike nisu bile zna~ajne za folikule od drugog do ~etvrtog stepena. Zna~ajno vi{e triploidnih embriona se razvilo iz oocita koji su poticali od prvog i drugog stepena vaskularizovanosti. Ova korelacija izme|u slabijeg perifolikularnog vaskulariteta i lo{eg ishoda IVF - in vitro fertilisation je potvr|ena u kasnijim studijama drugih autora. U interesantnoj Bhal-ovoj studiji su merene karakteristike protoka krvi folikula pri aspiraciji oocita. Podaci su bili analizirani u odnosu na vaskularitet folikula: dobar protok krvi tri i ~etiri ili lo{ protok krvi jedan i dva. Rezultati ove studije su potvrdili heterogenost folikula u istom

255


cohort-u kao i da perifolikularni protok krvi nije u vezi sa ostalim parametrima ciklusa kao {to su: starost pacijenta, trajanje neplodnosti, trajanje stimulacije ili doze FSH - follicle stimulating hormona. Kada se analizirao broj trudno}a na temelju vaskularnosti folikula od kojih su poticali izabrani embrioni za transfer, pokazao je zna~ajno ve}i broj trudno}a od 34,7% iz grupe dobro vaskularizovanih folikula, u pore|enju sa ciklusima u kojima su embrioni poticali od folikula sa srednjim vaskularitetom od 23,5% i od folikula sa lo{ijim vaskularitetom od 7,3%. U jednoj od studija smanjivanje pituitarne osetljivosti je ostvareno kratkom regulacijom pomo}u GnRH - gonadotropin releasing hormon analoga i ovarijskom stimulacijom pomo}u rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormona ili HMG human menopausal gonadotrophin-a. Egzogeni HCG - human chorionic gonadotropin je dat da inicira folikularno sazrevanje kada su jedan ili dva folikula imali srednji pre~nik ve}i ili jednak 16 mm, a perifolikularni vaskularitet je meren u vreme aspiracije, 34 - 37 ~asova posle davanja HCG - human

chorionic gonadotropin-a. Ciklusi su bili grupisani prema vaskularnim karakteristikama folikula. Grupu A su ~inili folikuli sa dobrim protokom krvi, grupa B su bili heterogeni folikuli sa dobrim i lo{im protokom krvi, grupu C su ~inili folikuli sa lo{im protokom krvi. Rezultati su ponovo pokazali zna~ajnu korelaciju izme|u perifolikularnog protoka krvi i trudno}a. Najve}i broj trudno}a od 57% je bio u grupi u kojoj su svi folikuli imali dobar protok krvi, dok je zna~ajno manje trudno}a bilo u grupi folikula sa pome{anim protokom krvi 32%, a 11% gde su svi folikuli imali lo{ protok krvi. Ova studija je kasnije pokazala na zna~ajnu vezu izme|u perifolikularnog protoka krvi i vi{estruke trudno}e. Zna~ajno vi{e vi{estrukih trudno}a je bio u slu~ajevima kod kojih su folikuli imali dobar protok krvi u trenutku aspiracije. Veza izme|u protoka krvi i vi{estruke trudno}e je kasnije potvr|ena podacima iz istog centra analizom trudno}a iz programa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. U svojoj studiji je Gregory prikazala slede}e rezultate:

Tabela 4-14: Perifolikularni vaskularitet i trudno}e

Perifolikularni vaskularitet

Kompletirani ciklusi

Broj klini~kih trudno}a

Broj ve{ta~kih trudno}a

Protok krvi 3- 4

51

47%

42%

Protok krvi 1-2

49

26%

0

Protok krvi nije zabeleèn

109

32%

15%

256


U ovoj seriji uzastopnih ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusa su primenjeni standardni protokoli ovarijalne stimulacije i tehnike kultivacije embriona. U pribli`no 50% ciklusa nisu zabeleène karakteristike protoka krvi. Ovi ciklusi su pokazali broj trudno}a od 32% i broj vi{estrukih trudno}a od 15%. Me|utim, u slu~ajevima u kojima su informacije o perifolikularnom protoku krvi kori{}ene za selekciju embriona za transfer, otkriveno je da je broj trudno}a bio zna~ajno ve}i kod ciklusa u kojima su embrioni poticali od folikula sa dobrim protokom krvi, i to, 47%, sa brojem vi{estrukih trudno}a koji je, tako|e, bio zna~ajno ve}i od 42%. Tamo gde su selektirani embrioni za transfer poticali od folikula sa lo{im protokom krvi, broj trudno}a je bio zna~ajno manji, 26%, dok vi{estrukih trudno}a nije bilo. Ovi podaci potvr|uju potencijal koji perifolikularni protok krvi moè da pruì kao objektivni marker za kvalitet embriona. Perifolikularni vaskularitet nije uniformno izraèn u cohort-u folikula, {to vodi ka zaklju~ku da se razvoj perifolikularnog vaskulariteta reguli{e doga|ajima u folikulu. Ovo dalje sugeri{e da merenje karakteristika protoka krvi ovarijalnih krvnih sudova, verovatno, nije prognosti~ki indikator za~e}a, jer merenje protoka ovarijalne arterije i stromalni protok ne dozvoljavaju identifikaciju folikularne heterogenosti. Pokazalo se da je perifolikularni vaskularitet povezan sa koncentracijom rastvorenog kiseonika u folikularnoj te~nosti FF follicle fluid-a i sa aneuploidno{}u oocita. Ultrazvu~nom sonografijom kolor doplerom merene su karakteristike protoka krvi folikula pre aspiracije, a potom je odre|ivan rastvoreni kiseonik u FF - follicle fluid-u. Tamo gde je bilo neophodno FF - follicle fluid je centrifugiran da bi se uklonila crvena krvna zrnca.

Sl. 4.66- FF - follicle fluid

EGF - vascular endothelial growth factor Oociti dobijeni iz folikula ~ije su karakteristike protoka krvi merene, koji se nisu oplodili, obra|eni su i pregledani radi analize pojave aneuploidnosti. Embrioni u dvo}elijskom stadijumu su, tako|e, pregledani radi pronalaènja prisustva multinukleatnih blastomera. Dobijene vrednosti koncentracija rastvorenog kiseonika u uzorcima FF- follicle fluid-a su naveli na podelu na tri grupe folikula. U prvoj grupi je rastvoreni kiseonik bio u opsegu 3 - 5,5% , u drugoj 1,5 - 2,5% , a u tre}oj je bio do 1,5%. Nije prona|ena nikakva veza izme|u koncentracija rastvorenog kiseonika i mejoti~ke zrelosti. Ovaj marker folikularne heterogenosti se pona{a na isti na~in kao i ostali folikularni markeri kompetencije oocita. Utvr|eno je da postoji veza izme|u rastvorenog kiseonika u FF- follicle fluid-u i kapaciteta embriona da se razvijaju do 6 8 }elijskog stadijuma sa korelacijom niskih koncentracija rastvorenog kiseonika i smanjenog kapaciteta za razvoj do 6-8 }elijskog stadijuma. Broja embriona sa multi nuklearnim blastomerama je opao za 9%. Ovo je dovelo do intenziviranja koncentracija vaskularnog endotelialnog faktora rasta, VEGF - vascular endothelial growth factor-a u folikulu.

257


Sl. 4.67- VEGF - vascular endothelial growth factor receptori u }elijama zeleno prebojeni

U nekim studijama nije potvr|ena veza izme|u folikularnih nivoa VEGF - vascular endothelial growth factor-a i ishoda IVF in vitro fertilisation, dok je u drugima utvr|eno da su visoki folikularni nivoi VEGF - vascular endothelial growth factor-a u direktnom odnosu sa niskim brojem trudno}a. Visoki nivoi u serumu VEGF - vascular endothelial growth factor-a mogu predvideti pojavu sindroma ovarijalne hiperstimulacije po nekim autorima. Statisti~ki zna~ajna veza izme|u koncentracija rastvorenog kiseonika i abnormalne morfologije oocita je, tako|e, povezana sa slabijom deobom. Meren je VEGF - vascular endothelial growth factor u FF follicle fluid-u u svakoj od tri grupe folikula i utvr|ena koncentracija u opsegu od 130 - 180 pM. Koncentracija VEGF - vascular

endothelial growth factor-a nije bila u vezi sa lokalizacijom folikula, veli~inom ili volumenom fluida. Kod folikula sa rastvorenim kiseonikom do 3%, koncentracije VEGF - vascular endothelial growth factor-a su bile ve}e od 270 pM. Koncentracije VEGF - vascular endothelial growth factor-a su bile promenljivije kod folikula sa manjim koncentracijama rastvorenog kiseonika i bile su stalno niske kod folikula sa oocitima izmenjene gra|e. Koncentracije VEGF - vascular endothelial growth factor-a u FF- follicle fluid-u pokazuju uzajamnu vezu sa nalazima perifolikularnog protoka krvi. Oociti koji se nisu fertilisali, dobijeni iz folikula sa niskim koncentracijama rastvorenog kiseonika, pokazivali su rasipanje hromozoma ili abnormalno svrstavanje hromozoma na deobnom vretenu. Utvr|eno je da 92% oocita koji ispoljavaju hromozomske abnormalnosti poti~u od folikula sa koncentracijom rastvorenog kiseonika do 3%. Analizirana je uloga kumulusa merenjem ekspresije VEGF - vascular endothelial growth factor-a u intervalima tokom 14 dana. Ova studija je pokazala da su }elije kumulusa, razbacane in vitro delovanjem spermatozoida, imale kapacitet da proizvedu VEGF - vascular endothelial growth factor u kulturi tokom produènog perioda, kao {to je prikazano u slede}oj tabeli.

Tabela 4-15: Koncentracije VEGF - vascular endothelial growth factor u medijumu kulture kumulusa po Gregory - u

Dan uzimanja uzorka

Koncentraceje VEGF

Uzimanje jaja{ca + 1 dan

250 - 2000 pg/ml

Uzimanje jaja{ca + 7 dana

108 - 3300 pg/ml

Uzimanje jaja{ca + 14 dana

150 - 2000 pg/ml

258


Tabla 4-16: Serijsko merenje VEGF - vascular endothelial growth factor -a u medijumu individualnih kultura kumulus kompleksa koji su u vezi sa odabranim embrionima za transfer u IVF - in vitro fertilisation programu (Georgy 2001.)

Kumulus kompleks Broj

VEGF (pg/ml) uzimanje jajašca + 1 dan

VEGF (pg/ml) uzimanje jajašca + 3 dana

VEGF (pg/ml) uzimanje jajašca + 10 dana

CC1

300

560

420

CC2

300

1520

1329

CC3

352

880

640

Otkriveno je da su se koncentracije razlikovale me|u uzorcima iz razli~itih kultura. Uzrok je bio delom zbog razlika u broju }elija prisutnih u svakoj kapljici, po{to se broj }elija menjao od jednog do drugog slu~aja. Zna~ajnija je bila promena vezana za vreme produkcije VEGF - vascular endothelial growth factor-a u }elijama kumulusa individualnih kompleksa, {to je prikazano u Tabeli br 4-16. Kada su vr{ena merenja koncentracija VEGF - vascular endothelial growth factor- a u medijumu pojedina~nih kompleksa kumulusa iz istog cohort-a, zapaène su zna~ajne razlike u aktivnosti }elija razvijenih u istoj hormonalnoj sredini. Podaci u gornjoj tabeli se odnose na komplekse kumulusa koji su u vezi sa tri embriona odabrana za transfer u jednom ciklusu, a koji su rezultirali trudno}om. Ovo pokazuje da je jedan kompleks CC2 - cumuluc complex bio povezan sa oocitom dobijenim iz folikula sa dobrim protokom krvi, stepen 3, dok su druga dva dobijena iz folikula sa lo{im protokom krvi, stepen 2. Merenja

Perifolik- Morfologija ularni embriona protok pri transferu krvi GRADE 1 GRADE 2

4 }elije C+

GRADE 3

4 }elije C+

4 }elije B/C

VEGF - vascular endothelial growth factor-a, posle jednog dana od punkcije oocita, se nisu zna~ajno razlikovala izme|u tri }elijska sistema. Me|utim, }elije CC2 - cumuluc complex-a, dobijene iz folikula sa najboljim protokom krvi, su proizvele mnogo ve}e koncentracije VEGF - vascular endothelial growth factor-a, tokom perioda od 10 dana pod identi~nim uslovima kultivisanja, u odnosu na ostale sisteme. ]elije iz CC2 cumuluc complex-a su imale kapacitet da odrè visoke koncentracije VEGF - vascular endothelial growth factor-a in vitro i do 10 dana. ]elije iz CC1 - cumuluc complex-a i CC3 - cumuluc complex-a, koje su inicijalno pokazale rast produkcije VEGF - vascular endothelial growth factor-a do 3. dana, ispoljile su pad VEGF vascular endothelial growth factor-a do 10. dana. Kapacitet }elija kumulusa da proizvdi VEGF - vascular endothelial growth factor nije prekinut pri ovulaciji. Embrioni ovih }elijskih sistema su se razvili do ~etvoro}elijskog stadijuma, do trenutka transfera na drugi dan i zapaèno je da su imali veoma sli~nu morfologiju.


Svi su pokazali minimalnu fragmentaciju, zabeleènu kao C/C+ kod jednog iz CC2 cumuluc complex-a koji je imao malu razliku u relativnoj veli~ini jedne blastomere, pa je zato zableèn kao B. Karakteristike protoka krvi i produkcija VEGF - vascular endothelial growth factor-a nisu se odrazile na stepen deobe i morfologiju embriona posle dva dana kultivacije. Ova zapaànja su potvrdila ranije izve{taje da folikularni markeri nisu u korelaciji sa stepenom fertilizacije, niti sa morfologijom embriona na drugi dan. Postoji negativna korelacija izme|u folukularnog protoka krvi i deobe embriona na tre}i dan. Pri procenjivanju dinami~kog sistema, kao {to je folikul ili embrion koji je u razvoju, zapaànja istog doga|aja napravljena u razli~itim trenucima mogu dati o~igledno kontradiktorne rezultate. Vrednosti perifolukularnog protoka krvi merene power doplerom menjaju se sa pribliàvanjem folikula ovulaciji kao i sa raspadom tekalnog sloja. Prema tome, u zavisnosti od trenutka merenja perifolikularnog protoka krvi u odnosu na ovulaciju, mogu}a je pogre{na interpretacija nalaza. Najbolji dokaz za perifolikularni vaskularitet je dobijen kada je obavljeno dopler skeniranje posle, ne vi{e od 34 ~asa od davanja HCG - human chorionic gonadotropin-a. Promene u tekalnom sloju pribliàvanjem ovulacije, naro~ito na apex-u folikula, rezultuju raskidanjem kapilarnog sistema i promenama protoka krvi. Progresivne promene folikula koji sazreva, od rane antralne do ovulatorne faze, pra}ene promenama u aktivnosti folikularnih }elija granuloze i kumulusa uti~u na sastav FF- follicle fluid-a. Promene perifolikularnog vaskulariteta se de{avaju u veoma kratkom vremenskom intervalu.

259

Postoji folikularna heterogenost u odnosu na karakteristike perifolikulrnog protoka krvi, kao i u odnosu na kapacitet }elija kumulusa, da proizvedu VEGF - vascular endothelial growth factor tokom kultivacije. Kapacitet postovulatornih }elija kumulusa da proizvedu VEGF - vascular endothelial growth factor u kulturi je u korelaciji sa perifolikularnim vaskularitetom, ali nije bio u vezi sa razlikama u kvalitetu embriona. Jedno od najzna~ajnijih zapaànja koja su proiza{la iz studija je dokaz za heterogenu ekspresiju protoka krvi izme|u susednih folikula u jednom jajniku. Ovo je jasna potvrda da je svaki folikul jedinstven biosistem koji oocitu pruà specifi~nu mikrosredinu tokom njegovog razvoja. Ovaj biosistem funkcioni{e nezavisno od spolja{njih faktora, kao {to je primena egzogenih gonadotropina. Neovaskularizacija CL - corpus luteum-a je pod kontrolom heparinskih faktora, naro~ito VEGF-vascular endothelial growth factor-a i faktora rasta fibroblasta koje proizvode }elije koje poti~u od granuloze corpus luteuma. Angiogeneza u corpus luteumu je bila predmet posebnog izu~avanja. Inhibicija bioaktivnosti VEGF- vascular endothelial growth factor-a je rezultat supresije angiogeneze CL- corpus luteum-a i osloba|anja progesterona. VEGF - vascular endothelial growth factor je }elijski endotelijalni specifi~ni mitogen za koji se zna da je medijator fetalne i tumorne angiogeneze i pokazalo se da je ekspresija VEGF - vascular endothelial growth factor-a mRNK - messenger ribonucleic acid-a u vezi sa proliferacijom krvnih sudova. VEGF - vascular endothelial growth factor nije jedini faktor za inicijaciju angiogeneze u antralnom folikulu i CL - corpus luteum-u.

260


Leptin, za koji se pokazalo da potpomaè angiogenezu in vitro je prisutan u folikularnoj te~nosti i ima angiogensku ulogu u folikulu. Perifolikularni protok krvi je u vezi sa formiranjem corpus luteuma i razvojem njegove vaskularizacije. Programi donacije oocita u kojima su recipijenti doniranih oocita ili embriona pripremljeni za transfer embriona kombinacijom egzogenog estradiola i progesterona pokazuju da corpus luteum nije neophodan za odràvanje trudno}e U ciklusima transfera zamrznutog embriona u kome se pacijenti pripremaju za transfer upotrebom pituitarne regulacije pomo}u analoga GnRH - gonadotropin releasing hormon-a i endometrijuma pripremljenog kombinacijom egzogenog estradiola i progesterona, pokazuje da funkcionalni CL -corpus luteum nije neophodan za implantaciju. Zapaànje da }elije kumulusa u in vitro uslovima proizvede VEGF - vascular endothelial growth factor tokom 14 dana, moè biti od zna~aja. Cikli~na progresija angiogeneze u jajniku ka angiogenezi u endometrijumu, na mestu implantacije je neophodna. ]elije kumulusa mogu da imaju ulogu u inicijaciji angiogenskih doga|aja u uterusu koji prate implantaciju. Opisana je subpopulacija }elija kumulusa koje blokiraju faktore rasta. Na ovaj na~in }elije kumulusa mogu da koncentri{u faktore rasta radi tempiranog osloba|anja kada to bude potrebno. Tako bi }elije kumulusa, koje poti~u od dobro vaskularizovanih folikula mogle potpomo}i implantaciju osloba|anjem ovih faktora koji iniciraju rane angiogene promene u endometrijumu.

Endometrijalni i subendometrijalni protok krvi Dobro snabdevanje endometrijuma krvlju se smatra neophodnim za implantaciju.

Uloga endometrijalnog i subendometrijalnog protoka krvi merenog pomo}u trodimenzionalnog power dopler ultrazvuka u predvi|anju trudno}e tokom IVF - in vitro fertilisation tretmana u jednom od istraìvanja, odre|ivala se merenjem na sam dan aspiracije oocita. Merena je debljina endometrijuma, endometrijalnog indeksa pulsiranja, PI pulsatility index, indeksa otpora RI - resistance index krvnih sudova uterusa, volumena endometrijuma, indeksa vaskularizacije VI - vascularization index, indeksa protoka FI - flow index i VFI - vaskularnog indeksa protoka endometrijalnih i subendometrijalnih regija. Rezultati su pokazali da su uterini RI resistance index, endometrijalni VI - vascularization index i VFI - vascularization index protoka zna~ajno niì kod grupe gravidnih èna u odnosu na grupu èna koje nisu ostale trudne. Broj transferisanih embriona i endometrijalni VI - vascularization index su bili jedina dva faktora predikcije trudno}e. Analiza krive ROC - reciever operator characteristic je otkrila da je povr{ina ispod krive bila pribli`na 0,5 za sve parametre endometrijalne receptivnosti. Pokazalo se da endometrijalni i subendometrijalni protok krvi, meren power dopler ultrazvukom, nisu dobri prediktori trudno}e.

Citokini Citokini su polipeptidi ili glikopeptidi koji prenose informacije izme|u }elija. Ishod IVF - in vitro fertilisation nije u vezi sa folikularnim koncentracijama IL - interleucin-a; IL-6, IL-8, IL-10, IL-11 ili granulocitno makrofagnog faktora stimulacije kolonija GM-CSF - granulocyte macrophage colony stimulating factor.

261


Sl. 4.68- Interleukini

Pove}ana folikularna koncentracija proinflamantornog citokina IL-13 je povezana sa uspe{nom oplodnjom oocita, deobom embriona i trudno}om.

modulatora ovarijalne funkcije kao prediktora ishoda IVF - in vitro fertilisation, potencijalni kandidat za biohemijskog prediktora je adrenalni steroidni hormon, kortizol.

Kortizol

Sl. 4.69- GM-CSF - granulocyte macrophage colony stimulating factor

Uzimaju}i u obzir razli~ite podatke koji se ti~u konvencionalnih endokrinih i parakrinih

Kortizol, ~iji je klini~ki naziv hidrokortizon, sinteti{e se u adrenalnom korteksu. Adrenalne `lezde sinteti{u dve klase steroidnih hormona, mineralokortikoide i glukokortikoide. Kortizol se sinteti{e od progesterona sekvencijalnim dodavanjem 3-hidroksilne grupe na pozicije ugljenika 17, 21 i 11, {to je prikazano na slede}oj slici. Zbog njihovih sli~nih hidrofobnih struktura, kortizol i progesteron se transportuju u serumu vezani za globularni protein, kortizol vezuju}i globulin CBG - corticosteroid binding globulin.

262


Sl. 4.70- Adrenalna sinteza kortizola

Kortizol, kao svi steroidni hormoni, vr{i svoj uticaj preko intracelularnog receptora koji deluje na transkripciju i stabilnost mRNK - messenger ribonucleic acid-a, kodirane ciljnim genima. Sli~nost molekularne strukture kortizola i progesterona se odraàva u sli~nosti njihovih receptora. Ova dva receptora se vezuju za identi~ne DNK - deoksiribonukleinska kiselina sekvence za regulisanje transkripcije ciljnih gena, pa su kortizol i progesteron sposobni da izvr{e izvestan broj zajedni~kih akcija na }elijskom i molekularnom nivou. U istraìvanjima je utvr|eno da kortizol u~estvuje u lokalnoj kontroli ovarijalne funkcije. Kod èna koje su se podvrgle asistiranom za~e}u, koncentracije folikularnog kortizola pove}avale su se sa pribliàvanjem rupture folikula. Zna~aj ovog fenomena jo{ je uvek nejasan.

Neke studije su utvrdile prisustvo ve}ih koncentracija kortizola u folikulima koji sadrè zrele oocite, dok drugi nisu prona{li nikakvu vezu izme|u ovog glukokortikoida i zrelosti oocita. îni se da koncentracije folikularnog kortizola ne predvi|aju uspe{nu oplodnju oocita.

CBG - corticosteroid binding globulin U nekim studijama je merena serumska i intrafolikularna koncentracija CBG - corticosteroid binding globulin-a i SHBG - sex hormone binding globulin-a. Nivo CBG - corticosteroid binding globulin-a je bio zna~ajno vi{i kod aspiriranih folikula u uspe{nim IVF - in vitro fertilisation ciklusima nego kod onih kod kojih nije do{lo do trudno}e. Nasuprot istovetnim koncentracijama folikularnog kortizola, pove}ane koncentracije CBG - corticosteroid binding globulin-a, smanjuju biolo{ku

263


Sl. 4.71- SHBG - sex hormone binding globulin

dostupnost kortizola, ugroàvaju}i sposobnost kortizola da u|e u ciljne }elije i interreaguje sa glukokortikoidnim receptorima. Ova situacija se komplikuje ~injenicom da CBG - corticosteroid binding globulin vezuje i kortizol i progesteron. Zbog visokih koncentracija progesterona u folikularnom fluidu, samo mali deo kortizola unutar ovarijalnog folikula ostaje zadràn od strane CBG - corticosteroid binding globulin-a, tako da umereno pove}anje koncentracije CBG - corticosteroid binding globulin-a moè imati malo ili nimalo uticaja na slobodnu bioaktivnu koncentraciju kortizola. Kao {to je ve} pomenuto, steroidni hormoni deluju vezivanjem za intracelularne receptore koji mogu da interreaguju sa DNK - deoksiribonukleinskom kiselinom i i-RNK, informacionom RNK, stimuli{u}i sintezu proteina kod ciljnih }elija. Iako struktura steroidno vezivnog domena svakog receptora postavlja izvesna ograni~enja za tipove steroida koji se mogu vezivati za receptor i aktivirati ga, ovaj sistem specifi~nosti receptora je sklon neuspehu. Na primer, in vitro mineralokortikoidni receptor nije sposoban da napravi razliku izme|u strukture fiziolo{kog mineralokortikoida aldosterona, bitnog za kontrolu

ravnoteè vode i elektrolita i glukokortikoida kortizola. U ovakvim slu~ajevima je potreban dodatni mehanizam za pove}anje specificnosti interakcije izme|u receptora i kandidatnih liganda. Ovo obi~no uzima formu jednog ili vi{e intracelularnih enzima koji modifikuju strukturu steroida i tim putem pove}avaju ili smajuju njegov afinitet ka vezivnom domenu receptora. Ako su enzimi koji {tite receptore steroida ugroèni na bilo koji na~in, postoji pove}ano vezivanje steroida ~ak i za neodgovaraju}e receptore i poja~ano dejstvo na ekspresiju ciljnih gena.

11 β HSD - β 11 - hydroxysteroid dehydrogenaze U slu~aju mineralokortikoidnih i glukokortikoidnih receptora, pristup kortizola je kontrolisan izoformama enzima 11 β HSD 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze.

Sl. 4.72- Me|ukonverzija kortizol - kortizon putem kloniranih izoformi 11 βHSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze

264


Ovi enzimi katali{u reverzibilno uklanjanje dva jona vodonika konvertuju}i aktivni steroidni kortizol sa njegovim inertnim metabolitom kortizonom kao {to je prikazano na prethodnoj slici. Po~etkom 90-ih godina enzimska oksidacija kortizola u kortizon je prvi put otkrivena kod humanih granuloza - luteinskih }elija aspiriranih iz folikula èna koje su se podvrgle IVF - in vitro fertilisation.

Sl. 4.73- β11 HSD - 11β-hydroxysteroid dehydrogenaze mRNK - messenger ribonucleic acid ovarijuma in situ hibridizacija: T - tekalne ovarijalne }elije; G - granulozne }elije

Ubrzo nakon toga pojavio se rad o potencijalno prediktivnoj vezi izme|u stepena oksidacije kortizola u kojoj posreduje β11 HSD - β11 - hydroxysteroid dehydrogenaze i ishoda IVF - in vitro fertilisation. U studijama o aktivnosti enzima 11 βHSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze su odre|ivane, in vitro kvantifikacijom, neto oksidacije 3H-kortizola u 3H kortizon tokom 4 ~asa. Dok su }elije kod 2/3 pacijenata ispoljavale umerene i visoke nivoe aktivnosti 11β HSD -11β -hydroxysteroid dehydrogenaze enzima, kod 1/3 pacijenata }elije su imale veoma niske nivoe aktivnosti 11β HSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze, ispod granice detekcije. S obzirom na to, da kod nijednog od pacijenata, sa ovarijalnom aktivno{}u 11 β HSD -11 -hydroxysteroid dehydrogenaze

koja se moè detektovati, nije kasnije do{lo do za~e}a, niski nivoi aktivnosti enzima 11 β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze su dovedeni u vezu sa procentom trudno}e od 64%. Posle objavljivanja ovih ohrabruju}ih podataka, dve nezavisne istraìva~ke grupe su ispitivale ovu potencijalno prediktivnu vezu. Iako ni jedna od ovih grupa nije na{la zna~ajnu korelaciju izme|u ovarijalne aktivnosti 11β HSD - 11β hydroxysteroid dehydrogenaze i ishoda IVF - in vitro fertilisation, prethodna studija je pokazala da su srednje vrednosti metabolizma kortizola najmanje u onim ciklusima koji su rezultovali trudno}om, a najvi{i u ciklusima sa neuspe{nom fertilizacijom. Umerene vrednosti aktivnosti enzima su bile u ciklusima u kojima nije bilo za~e}a. Razlike u metodama kori{}enim za procenu ovarijalne aktivnosti 11β HS - D11β hydroxysteroid dehydrogenaze su imale uticaj na rezultate ove korelacije. Na primer, u jednoj studiji granulozne }elije su bile zamrznute u vreme folikularne aspiracije, a aktivnost enzima je kasnije ispitivana kod odmrznutih }elija. Podaci jednog broja laboratorija ukazuju da su 11 β HSD - 11 β - hydroxysteroid dehydrogenaze enzimi osetljivi na proceduru krioprezervacije, pa je ovo moglo ugroziti merenja ovarijalnih aktivnosti 11β HSD 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze. U inicijalnim studijama ovarijalne aktivnosti 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze medijum je ~uvan pri temperaturi od 4° C tokom tri dana pre upotrebe. Posle separacije u Percoll-u granulozne }elije su kultivisane tokom tri dana u medijumu sa dodatnim serumom radi olak{avanja ponovnog formiranja luteiniziranog fenotipa pre procene aktivnosti 11 β HSD 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze, koja je ra|ena ~etvrtog dana kultivacije.


Kada je ra|ena procena ovarijalne aktivnosti 11β HSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze kod sveè izolovanih granuloznih }elija i bez prethodne kultivacije }elija radi olak{avanja luteinizacije, nije prona|ena nikakva veza izme|u aktivnosti enzima i uspeha IVF - in vitro fertilisation. Kultivacija granuloznih }elija u prisustvu seruma tokom tri dana pre procene enzima primetno smanjuje stepen oksidacije kortizola u kojoj posreduje 11β HSD - 11β hydroxysteroid dehydrogenaza. Smatra se da se pad ovarijalne aktivnosti 11 βHSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze sa prihranjivanjem ili uzgajanjem granuloznih }elija ~ini neophodnim za otkrivanje veze izme|u in vitro merenja aktivnosti 11β HSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze i ishoda IVF - in vitro fertilisation. Krajem 1990-ih godina, posle kloniranja dva odre|ena izoforma enzima 11β HSD -11β - hydroxysteroid dehydrogenaze ~oveka jedan broj molekularnih studija je doprineo debati koja se ti~e potencijalne prediktivne uloge enzima 11 β HSD -11β hydroxysteroid dehydrogenaze u IVF - in vitro fertilisation programu. Istraìvanja su utvrdila da se kod granuloznih }elija dominantni izoform enzima menja. Pre izlaganja LH - luteinizing hormone / HCG - human chorionic gonadotropin, granulozne }elije izbacuju mRNK - messenger ribonucleic acid enkodiranjem izoforma 11β HSD2 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze 2, koji je veoma sli~an 11β HSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze i koji, tako se~eni, deluje samo kao oksidazni enzim putem NAD - nikotinamide adenine dinukleiotide kao enzimskog kofaktora. Posle izlaganja HCG - human chorionic gonadotropin-u, luteiniziraju}e granulozne }elije vi{e ne izbacuju 11β HSD2 - 11β -hydroxysteroid

265

dehydrogenaze 2, ve} izbacuju gene enkodiraju}i 11β HSD1 - 11β - hydroxysteroid dehydrogenazu, relativno niske sli~nosti sa 11β HSD -11 β -hydroxysteroid dehydrogenazom. îni se da ovaj izoform deluje nadmo}no kao reduktazni enzim sa predno{}u u odnosu na NADP - nikotinamide adenine dinucleotide phosphate, kao kofaktora. Podaci iz drugih laboratorija podupiru osloba|anje 11β HSD1 - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze 1 kod luteiniziraju}ih granuloznih }elija, ali ukazuju na postojanje novog, biohemijski osobenog izoforma 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze kod granuloznih luteinskih }elija. Molekularnom zamenom izoforma enzima 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze, dok se granulozne }elije luteiniziraju u preovulatornim folikulima, moè se objasniti zapaànje potencijalne prediktivne veze izme|u oksidativne aktivnosti 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze i ishoda IVF - in vitro fertilisation. Po{to su inicijalna ispitivanja aktivnosti 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze merila neto oksidacije kortizola u kortizon, za nivoe metabolizma kortizola bi se o~ekivalo da budu najvi{i kod granuloznih }elija nezrelih folikula, osloba|aju}i oksidativni 11β HSD2 - 11β hydroxysteroid dehydrogenaze 2 izoform sa samo ograni~enim osloba|anjem 11β HSD1 - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze enzima i supresijom 11β HSD2 - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze 2. Istovremeno pove}anje redukcije kortizona, pra}eno smanjenjem u oksidaciji kortizola, koje se odrazilo kao ukupno smanjenje neto oksidacije kortizola u kortizon, pokazuje biohemijski marker folikularne zrelosti. Godine 1996. istraìva~i iz Edinburga su izvestili o produkciji transgenskih mi{eva koji nemaju 11β HSD1 - 11β - hydroxysteroid

266


dehydrogenazu. Bez obzira na odsustvo ovog enzima, ovi mi{evi su pokazali normalan fertilitet, pa su neki istraìva~i po~eli da ispituju reproduktivni zna~aj 11β HSD 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze u jajniku. Jedan od bitnih problema ciljnog brisanja gena je da jedan, ili vi{e proteina koji su povezani sa brisanjem, mogu prisvojiti ulogu produkta obrisanog gena i tako kompenzovati hroni~no odsustvo obrisanog proteina. U ovom specifi~nom primeru 11β HSD2 - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze 2 i za sada neklonirani izoformi 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze su mo`da preuzeli biohemijsku funkciju obrisanog proteina 11β HSD1 -11β hydroxysteroid dehydrogenaze 1. O~igledno da bi mi{evi sa oba obrisana klonirana izoforma 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze u~estvovali u ovom razmatranju, ali svi dosada{nji poku{aji da se proizvedu ovakve ìvotinje nisu bili uspe{ni, {to pokazuje da dvostruki nokaut moè biti embrionski smrtonosan. Drugi problem leì u pretpostavci da bi hroni~no genomsko brisanje proteina 11β HSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze u jajniku, moglo modelirati prirodne okolnosti pod kojima su ovarijalne aktivnosti 11β HSD 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze niske. Niske aktivnosti enzima merenih kod ljudskih granuloza - luteinskih }elija, odraàvaju prisustvo lokalnih enzimskih inhibitora koji uti~u na ishod IVF - in vitro fertilisation koji je nezavistan od supresije metabolizma glukokortikoida u kome posreduje 11 βHSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze. Sa dobijanjem novih podataka, ~ini se sve verovatnijim da je u inicijalnim studijama oksidacija kortizola u kortizon bila

surogatni marker drugih ovarijalnih doga|aja koji ne bi bili reprodukovani transgenskim nokautom jednog izoforma 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze. Zbog velikih razlika u reproduktivnoj biologiji izme|u glodora i primata, isklju~ivanje uloge 11β HSD1 - 11β hydroxysteroid dehydrogenaze 1 u fertilitetu mi{eva ne isklju~uje i ulogu kod ~oveka. Povratkom na istraìvanja humane IVF - in vitro fertilisation, kasnije studije su otkrile da su nivoi osloba|anja mRNK messenger ribonucleic acid enkodiraju}i 11 β HSD1 - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze1 kod granuloznih }elija u korelaciji sa verovatno}om za~e}a kod èna koje su se podvrgle IVF - in vitro fertilisation. Nivoi mRNA - messenger ribonucleic acid se ne moraju obavezno poravnati sa nivoima enkodiranog enzimskog proteina i aktivnostima enzima. Sumirani podaci podràvaju hipotezu da potencijalno prediktivna veza ovarijalne kortizol - kortizon me|ukonverzije i ishoda IVF - in vitro fertilisation, samo zapaène pod definisanim uslovima, odraàva ovarijalne doga|aje koji kontroli{u aktivnost enzima 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze, verovatno na posttranslacionom nivou. Unutar Leydig-ovih }elija testisa, enzim 11β HSD1 - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze 1 obavlja klju~nu ulogu u prevenciji inhibicije biosinteze testosterona pomo}u glukokortikoida. Kao {to je spomenuto u ovom poglavlju, }elije testisa sekretuju sli~an izoform 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenazi, srodan biohemijskoj aktivnosti zapaènoj kod granuloza luteinskih }elija. Metabolizam kortizola, u kome posreduje 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze je dokazan kod spermatozoida i drugih }elijskih komponenti semene tecnosti.


Kod oksidativne aktivnosti 11β HSD 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze u spermi sa niskim brojem spermatozoida i visokim procentom morfolo{ki abnormalnih formi otkriveno je da su deset puta ve}e nego kod onih uzoraka sa ve}im brojem spermatozoida i dobrom morfologijom. Niska neto konverzija kortizola u kortizon u gonadalnim }elijama, bilo u germinativnim ili somatskim }elijama, moè indicirati bolji ishod IVF - in vitro fertilisation. U drugim studijama o ovarijalnim aktivnostima 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze in vitro, poku{ano je da se proceni aktivnost in vivo merenjem koncentracija kortizola i kortizona u folikularnoj te~nosti. In vivo ovarijalna aktivnost 11β HSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze trebalo bi da se odraàva folikularnim odnosom kortizol - kortizon. Pretpostavljaju}i da je kortizol nadmo}ni enzim supstrat, a da je kortizon glavni enzim produkt, visok odnos kortizol - kortizon bi pokazivao nisku ovarijalnu aktivnost 11β HSD 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze, dok nizak odnos kortizol - kortizon bi trebao da odraàva velike brzine oksidacija kortizola ovarijalnim enzimom 11β HSD - 11β hydroxysteroid dehydrogenaze. Neke studije su pokazale da su folikularni odnosi kortizol - kortozon zna~ajno ve}i kod folikularne aspiracije u uspe{nim ciklusima IVF - in vitro fertilisation, nego kod onih uzoraka folikularne te~nosti dobijenih iz ciklusa bez trudno}e, srednji odnosi 9,7, naspram 6,9. U proceni ishoda IVF - in vitro fertilisation, folikularni odnos kortizol - kortizon ve}i od 7 je dobijen u grupi èna sa trudno}ama od skoro 50%, a ovarijalni odnos manji od 7,7 u grupi èna sa trudno}ama od samo 7,6%. Ovi podaci podupiru potencijalno prediktivnu, inverznu korelaciju izme|u

267

metabolizma kortizola u kome posreduje 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze i verovatno}e za~e}a putem IVF in vitro fertilisation. Do danas su sve sprovedene studije koristile uzorke dobijene iz ciklusa IVF stimulisanih gonadotropinom. Kako se pokazalo da LH - luteinizing hormone i HCG - human chorionic gonadotropin pove}avaju ekspresiju 11β HSD1 - 11β hydroxysteroid dehydrogenaze 1, na odnos kortizol - kortizon su uticali dati lekovi. Sli~ni podaci su nedavno dobijeni u studijama o folikularnom odnosu kortizol kortizon kod èna koje su se podvrgle prirodnom ciklusu IVF - in vitro fertilisation. Navedeni odnosi su bili ve}i kod onih IVF - in vitro fertilisation ciklusa koji su rezultovali trudno}om, a najniì kod onih kod kojih nije uspela fertilizacija oocita. Folikuli sa odnosima kortizol - kortizon ve}im od srednje vrednosti od 5,9 su dovedeni u vezu sa brojem trudno}a od 58%, nasuprot samo 13% trudno}a kod onih folikula sa manjim odnosima kortizol - kortizon. Nasuprot gore navedenim studijama, u drugim studijama nije prona|ena zna~ajna veza izme|u folikularnih odnosa kortizol kortizon i ishoda IVF - in vitro fertilisation. Ovaj nalaz stvara mogu}nosti da na vezu izme|u in vivo indeksa aktivnosti 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze i ishoda IVF - in vitro fertilisation, mogu uticati male razlike u klini~kom tretmanu, ili protokolima {to je slu~aj kod direktnih merenja ovarijalnih aktivnosti 11β HSD 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze in vitro. [to se ti~e pitanja vezanih za prediktivnu vrednost folikularnih odnosa kortizol - kortizon i ishoda IVF - in vitro fertilisation, gornja grani~na vrednost folikularnog odnosa kortizol - kortizon za sve uzorke, bez obzira na ishod IVF - in vitro fertilisation

268


je iznosila 11,2. Upadljivo je da je kod onih uzoraka u odnosima kortizol - kortizon ve}im od 11,2 bilo trudno}a, dok su kod svih uzoraka folikularne te~nosti sa odnosima kortizol - kortizon manjim od 11,2 bili neuspe{ni poku{aji. Ovi podaci daju zna~ajnu podr{ku hipotezi prema kojoj ovarijalna kortizol kortizon me|ukonverzija, posredovana u folikulu putem jednog ili vi{e izoforma 11 βHSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze, moè predvideti ishod IVF - in vitro fertilisation, samo pod definisanim okolnostima. Na kraju se postavlja pitanje za{to na direktna merenja ovarijalne aktivnosti 11 βH SD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze in vitro mogu uticati: • kultivacija granuloznih }elija u medijumu dopunjenim serumom tokom tri dana pre ispitivanja enzima, • ~uvanje aspirisanih }elija do 3 dana na temperaturi od 4° C u folikularnoj te~nosti ili medijumu pre izolacije i kultivacije }elija.

Poznato je da granulozne luteinske }elije sinteti{u i lu~e parakrine inhibitore metabolizma kortizola. Kandidat za lokalnu inhibiciju ovarijalne aktivnosti 11 βHSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze bi bio progesteron koji je glavni produkt lu~enja luteiniziraju}ih granuloznih }elija i koji je provereni inhibitor kloniranih izoforma 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze, naro~ito 11β HSD2 - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze 2. Po{to se sinteza ovog steroida progresivno pove}ava dok se granulozne }elije luteiniziraju tokom 3 dana u medijumu sa serumom, serum-supplemented medium, rastu}a produkcija progesterona se moè pripisati smanjenju brzine metabolizma kortizola utvr|enog kod granuloznih }elija tokom prva tri dana kultivacije.

Ova hipoteza je proverena suprimiranjem bazalne sekrecije progesterona iz kultivisanih granuloznih }elija pomo}u citohromnog P450 enzimskog inhibitora aminoglutethimida. S jedne strane blokiranje sinteze progesterona podiè ovarijalnu aktivnost 11β HSD - 11 β - hydroxysteroid dehydrogenaze potvr|uju}i da progesteron deluje kao lokalni inhibitor kortizol - kortizon me|ukonverzije kod kultivisanih granuloznih luteinskih }elija. S druge strane, ~ak i granulozne }elije kontinuirano inkubirane sa aminoglutethimidom izazivaju progresivan pad nivoa aktivnosti 11β HSD -11β - hydroxysteroid dehydrogenaze s obzirom na pove}anje ekspresije proteina 11β HSD 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze, {to pokazuje da te }elije sigurno proizvode jo{ neki enzimski inhibitor, osim progesterona. Granuloza luteinske }elije proizvode parakrine inhibitore aktivnosti 11β HSD 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze za vreme kultivacije. Trenutno se ispituje da li su ovi modulatori enzima prisutni u folikularnoj te~nosti u kojoj su granuloza luteinske }elije ~uvane tokom tri dane pre separacije. Da bi obogatili bilo koji inhibitor enzima prisutan u folikularnoj te~nosti, usvojen je metod da se rastvore endogeni inhibitori 11β HSD - 11 β - hydroxysteroid dehydrogenaze iz urina. Uzorci folikularne te~nosti su stavljeni u C18 Seppak homatografske kertridè, iz kojih se jedinjenja rastu}e hidrofobnosti, jedno za drugim, ispiraju rastvorom sa rastu}om koncentracijom metanola. Svaki deo se potom testira da bi se videlo da li ima sposobnost da moduli{e bilo NADP+ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ili NADP- - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisnu oksidaciju kortizola pomo}u homogenata iz bubrega


pacova kao izvora oba klonirana izoforma 11β HSD - 11 β - hydroxysteroid dehydrogenaze.

Sl. 4.74 - NADP - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

Upotrebom ovakvog pristupa, potvr|eno je da uzorci humane folikularne te~nosti sadrè hidrofobne molekule ispirane koncentracijama metanola u opsegu od 50 do 90% vol. koje su u stanju da zna~ajno inhibiraju NADP+ - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisnu aktivnost 11β HSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze, ali ne NADP+ - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisnu oksidaciju kortizola u roku od jednog ~asa. Jedinjenja ispirana 80% metanolom postiù maksimalnu inhibiciju enzima, suprimiraju}i NADP+ - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisnu aktivnost 11β HSD11β - hydroxysteroid dehydrogenaze i do 88% u odnosu na kontrolu aktivnosti enzima, mereno samo u prisustvu odgovaraju}e koncentracije metanola. Ova tehnika je, tako|e, otkrila da folikularna te~nost sadrì hidrofilna jedinjenja, ispirana 0% i 10% metanolom, koja mogu stimulisati i NADP+ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisne i NAD+ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

269

zavisne aktivnosti 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze ~ak do 2,7 puta u roku od 1 ~asa. Kako je otkriveno da folikularna te~nost sadrì endogene stimulanse i inhibitore aktivnosti 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze, teku}a istraìvanja se okre}u pitanju da li nivoi ovih jedinjenja odre|uju folikularni odnos kortizol - kortizon, ili sluè kao novi biohemijski prediktor ishoda IVF - in vitro fertilisation. Odnos kortizol - kortizon u folikularnoj te~nosti, za koji se pretpostavlja da je inverzno proporcionalan oksidativnoj aktivnosti ovarijalnih enzima 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze je najve}i kada folikul sadrì maksimalne koli~ine hidrofobnih 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze inhibitora, minimalne koli~ine hidrofilnih 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze stimulansa. Obrnuto, ovaj odnos je najmanji kod onih folikula koje sadrè zanemarljive nivoe hidrofobnih 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze inhibitora ili visoke nivoe hidrofilnih 11β HSD - 11β hydroxysteroid dehydrogenaze stimulansa, tako da se folikularni odnosi kortizol - kortizon mogu utvrditi nivoima 11β HSD 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze modulatora prisutnih u folikularnoj te~nosti. Zato se postavlja pitanje, da li mogu nivoi 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze modulatora u pojedina~nim uzorcima folikularne te~nosti predvideti ishod IVF - in vitro fertilisation. Nezavisno od ishoda IVF - in vitro fertilisation, sastavni delovi folikularne te~nosti ispirani su sa 80% metanolom. Oni su inhibirali NADP+ - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisnu oksidaciju kortizola srednjom vredno{}u od 61%

270


tokom jednog ~asa, a hidrofilna jedinjenja ispirana 0% metanolom su stimulisala srednje pove}anje NADP+ - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate zavisne 11β HSD - 11β hydroxysteroid dehydrogenaze aktivnosti od 56%. Ciklusi karakterisani niìm nivoima folikularnih 11β HSD -11β - hydroxysteroid dehydrogenaze inhibitora su povezani sa brojem trudno}a od 17%, u pore|enju sa brojem trudno}a od 46% kod onih ciklusa sa folikularnim nivoima ovarijalnih 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze inhibitora iznad prose~nog nivoa nezavisnog od ishoda. Osim toga, folikuli sa visokim nivoima hidrofilnih 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze stimulansa su povezani sa brojem trudno}a od samo 10%, dok je broj trudno}a bio 59% kod ciklusa u kojima su nivoi ovarijalnih 11β HSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze stimulansa bili ispod proseka. Iz ovoga proizlazi da se rezultat u programu IVF - in vitro fertilisation stimulisanom gonadotropinom, moè predvideti visokim nivoima hidrofobnih ovarijalnih inhibitora 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze, ili niskim nivoima hidrofilnih ovarijalnih stimulansa aktivnosti ovog enzima. Novi podaci dozvoljavaju da se razvije upotrebljiva hipoteza, predstavljena na donjoj slici, koja moè objasniti za{to direktna i indirektna merenja ovarijalne aktivnosti 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze mogu, pod definisanim okolnostima, predvideti ishod IVF - in vitro fertilisation . Ovaj model moè re{iti pitanja koja se postavljaju u biohemijskom sistemu od strane nekih negativnih studija sumiranih u ovom poglavlju.

Sl. 4.75- Funkcionalna hipoteza dualne regulacije aktivnosti: 11β HSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze i razvojna sudbina oocita u funkciji parakrinih ovarijalnh modulatora enzima: ODS - ovarijalni dehidrogenazni stimulus; ODI - ovarijalni dehidrogenazni inhibitor; (+) - pozitivno dejstvo koje pove}ava razvojni potencijal oocita i neto oksidaciju kortizola u kortizon (-) - negativno dejstvo koje smeta razvojnom potencijalu oocita ili inhibira neto oksidaciju kortizola u kortizon

Da se povezani razvojni potencijal oocita i ovarijalne aktivnosti 11β HSD - 11β hydroxysteroid dehydrogenaze moè kontrolisati, ili nezavisno jednim jedinjenjem, ili grupom biohemijskih jedinjenja, podràno je razmatranjem slu~aja gliciretinske kiseline i njenog hemisuksinatnog estrakarbenoksolona. Utvr|eno je da su ovi molekuli inhibitori 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze i dobijaju se od likorisa, liquorice koji tako|e uti~u na sazrevanje oocita raskidanjem gap spojeva izme|u oocita i okolnih kumulusnih }elija. Nema dokaza koji bi naveli na sumnju da je sposobnost gliciretinske kiseline i karbenoksolona da zatvore gap spojeve na bilo koji na~in povezano sa njihovim dejstvom inhibitora 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze. Osobina funkcionalnog modela, kod kojeg bi ovarijalna aktivnost 11β HSD 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze sluìla kao surogat biohemijskog markera drugih


komponenti zrelog folikula, moglo bi da objasni za{to ciljano brisanje gena koji enkodiraju klonirane izoforme 11 βHSD 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze, ne}e pove}ati broj trudno}a. Ako su u pitanju nivoi modulatora enzima u jajniku, umesto nivoa ekspresije 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze koji utvr|uje ili odraàva razvojnu kompetenciju oocita, smanjivanjem ovarijalnih aktivnosti 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze putem transgenskog pristupa, ne bi stvaralo biohemijsku okolinu potrebnu u folikulu radi optimalnog razvoja oocita. Trenutni model, tako|e, pruà obja{njenje za{to je ~uvanje granuloznih }elija u folikularnoj te~nosti u mediju sa serumom, bilo neophodno za direktna in vitro merenja ovarijalne aktivnosti 11β HSD - 11β hydroxysteroid dehydrogenaze, radi korelacije za verovatno}om za~e}a. Klju~ za ovu prediktivnu vezu leì u stepenu do kog ispitivanje aktivnosti 11β HSD - 11β hydroxysteroid dehydrogenaze u granuloznim }eljama odraàva nivoe ovarijalnih modulatora enzima, sekretovanih u folikulu razvojem oocita i granuloznih }elija. U ovom slu~aju, veza izme|u aktivnosti enzima i ishoda IVF - in vitro fertilisation, moè biti oja~ana ~uvanjem }elija u folikularnoj te~nosti i kultivacijom granuloznih }elija, tako da one mogu nastaviti da proizvode autokrine i parakrine modulatore enzima, pre procene metabolizma kortizola. Prisustvo modulatora ovarijalnog metabolizma steroida u folikularnoj te~nosti, kod IVF - in vitro fertilisation pacijenata, nije bez presedana. Poznato je da folikularna

271

te~nost sadrì jedinjenje koje moè da inhibira konverziju androgena u estrogene putem aromataze. Povi{eni nivoi ovog jedinjenja, ili vi{e njih, predvi|aju smanjenu verovatno}u za~e}a putem IVF - in vitro fertilisation. Folikularna te~nost, tako|e, sadrì jedinjenja koja mogu poja~ati ili inhibirati sintezu progesterona pomo}u enzima 3 - hidroksisteroid 3β HSD - 3β - hydroxysteroid dehydrogenaze. Inhibicija 3β HSD - 3β - hydroxysteroid dehydrogenaze, od strane folikularne te~nosti je posredovana pomo}u folikularnog regulatornog peptida FRP follicle regulatory peptide i to nivoima koji su bili dovedeni u vezu sa uspe{nom oplodnjom oocita i deobom u in vitro uslovima. Prema tome, ona jedinjenja koja se trenutno ispituju, u kontekstu veze 11β HSD - 11β - hydroxysteroid dehydrogenaze i IVF in vitro fertilisation, zapravo pripadaju familiji biohemijskih prediktora koje mogu modulisati aktivnosti jednog ili vi{e enzima metabolizma steroida. Ako se ovo dokaè, smanjena ovarijalna aktivnost 11β HSD - 11β -hydroxysteroid dehydrogenaze moè jednostavno sluìti kao odraz folikularnih nivoa modulatora enzima koji uti~u na fertilitet stvaraju}i obrasce metabolizma steroida koji se razlikuju od oksidacije glukokortikoida. Perspektive daljeg razvoja biohemijskog prediktora kao farmaceutskog agensa ishoda IVF - in vitro fertilisation su od posebnog zna~aja da bi se pruìo jedan pouzdan prediktor koji se moè upotrebiti za selekciju oocita i embriona i utvr|ivanje ishoda odre|enog IVF - in vitro fertilisation ciklusa.

272


8. KRIOPREZERVACIJA SPERMATOZOIDA Krioprezervacija je rutinska procedura kod ve}ine programa ART - assisted reproductive technology. Godine 1938. je prvi put bila primenjena ova metoda kod humanog semena. Promene sperme u postupku krioprezervacije su slede}e: pogor{anje pokretljivosti, smanjenje sposobnosti za normalan rast i razvoj, i promena na molekularnim i }elijskim nivoima koje mogu pogor{ati potencijal za oplodnju.

Indikacije za krioprezervaciju spermatozoida Spermatozoidi se dobijaju iz ejakulata, epididimisa ili testisa.

Kod IUI - intra uterina insemination, ili konvencionalne IVF - in vitro fertilisation je obi~no dovoljan uzorak koji sadrì koncentraciju pokretnih spermatozoida ve}u od 5 miliona, sa preko 4 % normalne morfologije. Kada je u uzorku broj pokretnih spermatozoida manji od 5 miliona i kada je broj normalno formiranih spermatozoida manji od 4%, primenjuje se ICSI - ntra citoplasmatic sperm injection tehnika oplodnje. U slede}oj tabeli je dat prikaz indikacija za krioprezervaciju semena.

Tabela 4-17: Indikacija za krioprezervaciju spermatozoida

O~uvanje plodnosti Ljudski spermatozoidi iz ejakulata za upotrebu IUI/IVF/ICSI • pre hemoterapije i radioterapije, ili orhidektomije • pre vazektomije Testikularno tkivo pre hemoterapije i zra~ne terapije Donorski uzorci spermatozoida Konzervacija za budu}i tretman Spermatozoidi iz ejakulata za budu}u upotrebu IUI/IVF • psihološki razlozi tokom IVF/ICSI tretmana • fizi~ko odsustvo tokom IUI/IVF/ICSI tretmana • rezervna krioprezervacija Epididimalni ili testikularni spermatozoidi, spermatidi ili testikularno tkivo • dijagnosti~ko prikupljanje epididimalnih ili testikularnih spermatozoida • višak epididimalnih ili testikularnih spermatozoida tokom ICSI ciklusa


Kriofizika krioprezervacije spermatozoida Da bi }elije preìvele krioprezervaciju, krioza{titni agensi moraju biti prisutni prilikom hla|enja i tokom etapa zagrevanja. Krioza{titne supstance niske molekularne teìne {tite }elije tako {to spre~avaju formiranje kristala leda u citoplazmi. Kontrolisana brzina hla|enja dozvoljava te~nosti iz citoplazme da iza|e iz }elije i da se zamrzne spolja. Ovo rezultuje postepenom dehidratacijom citoplazme koja ne ugroàva o~uvanje sposobnosti za kasniji normalan rast i razvoj. Utvr|eno je da se spermatozoidi mogu skupiti za 75% svoje normalne veli~ine i pove}ati na 110% izoosmotskog }elijskog volumena, bez gubitka funkcionalnog integriteta.

Sl. 4.76 - Krioprezervirani spermatozoidi

Tokom ovih osmotskih procesa koncentracija krioza{titnih agenasa unutar citoplazme se jako pove}ava i ako se ne obrati pa`nja tokom procesa krioprezervacije, ovi agensi mogu dosti}i toksi~ne nivoe. Optimalna brzina hla|enja i zagrevanja se posebno odre|uje za svaki tip }elije da bi se izbegla potencijalna fizi~ka o{te}enja i toksi~nost. Brzine hla|enja i zagrevanja su povezane sa volumenom }elije, njenom povr{inom, permeabilno{}u, energijom aktivacije

273

{irenja te~nosti, kao i vrstom i koncentracijom upotrebljenih krioprotektanata.

Permeabilni agensi, kao glicerol, se koriste, radi dehidratacije citoplazme }elije. Nepermeabilni agensi, kao {to je saharoza, dodaju se da pove}aju osmolaritet radi spre~avanja o{te}enja nekontrolisanim }elijskim oticanjem tokom procesa dehidratacije. Proteini, amino kiseline i drugi permeabilni molekuli mogu stabilizovati organele, ali se obi~no uklanjaju tokom procesa krioprezervacije. Sertifikovani krioprezervacioni rastvori, koji su na raspolaganju, nude stabilan izvor krioprotektivnih sredstava, pa treba izbegavati laboratorijski pripremljene rastvore, poput onih koji sadrè ùmance. Uspe{na krioprezervacija spermatozoida zavisi od optimalnih brzina hla|enja. Sporo hla|enje je kada se temperatura spusta brzinom manjom od 100° C/min, dok je kod brzog hlad|nja brzina 400° C/min. Stepen preìvljavanja spermatozoida je oko 90%. Indukovanje nukleacije leda, koje se obavlja pri krioprezervaciji embriona, tako|e pobolj{ava ishod i kod spermatozoida . Ranije primenjivanu krioprezervaciju u pari te~nog azota treba izbe}i i zameniti automatizovanom, sporom krioprezervacijom u opsegu od 2° C /min do 7° C / min, kada se uradi indukcija nukleacije leda. Na temperaturi od minus 30° C sledi uranjanje u te~ni azot. Metoda brzog zamrzavanja humanih materijala, pa i sperme, se naziva vitrifikacija. Pokazuje najbolje rezultate sa swim-up pripremljenim spermatozoidima bez krioprotektanata. U pore|enju sa konvencionalnim zamrzavanjem sa krioprotektantima, vitrifikacija spermatozoida bez krioprotektanata pokazuje bolje o~uvanje motiliteta i fertilnosti. U slede}em poglavlju }e biti vi{e re~i o vitrifikaciji.

274


O{te}enja usled zamrzavanja Smrt }elije usled intracelularnog formiranja kristala leda i o{te}enja usled pove}anog osmolariteta krioprotektanta tokom hla|enja, su glavni problemi kod krioprezervacije }elija i spematozoida. Neke studije su pokazale smanjenje motiliteta normalnih uzoraka spermatozoida od 25 - 75 %, nakon krioprezervacije. Kod oligoasteno-teratozoospermije procenat motiliteta moè biti i ve}i. Epididimalni i testikularni spermatozoidi su podlo`niji o{te}enjima od ejakuliranih spermatozoida. Sposobnost spermatozoida da preìve krioprezervaciju je specifi~na kod svakog pacijenta i ~ini se da procene fluidnosti membrane, anizotropije, imaju prediktivnu vrednost u odnosu na ishod. O~igledno je da }e vi{i stepen o{te}enja biti u korelaciji sa smanjenjem fertilnosti. Za primenu u klini~koj ART - assisted reproductive technology preporu~uje se da se uzorci spermatozoida pripremaju swim-up ili gradijent centifugalnom metodom.

Krioprezervacija testikularnih spermatozoida Metoda kultivacije zamrznutih testikularnih spermatozoida, ili spermatida je tek nedavno razvijena i razlikuje se od onih koje se koriste kod ejakuliranih spermatozoida. Spermatozoidi se dobijaju u malom broju, sa veoma slabom pokretljivo{}u i u razli~itim etapama sazrevanja. Postoji nekoliko tehnika kultivacije specifi~nih za testikularne spermatozoide da bi se pobolj{ao motilitet u in vitro uslovima, nakon odle|ivanja. Izlaganjem pentoksifilinu stimuli{e se metabolizam mitohondrija, a na taj na~in i pokretljivost spermatozoida. Spermatozoidi za koje se pretpostavlja da se mogu koristiti za fertilizaciju, se mogu identifikovati primenom osmoti~kog {oka u hipoosmotskom rastvoru.

Krioprezervacija testikularnog materijala trebala bi da elimini{e potrebu za ponavljanjem hirur{kih biopsija. Testikularni spermatozoidi mogu biti krioprezervirani za vi{e poku{aja ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, ali prvo moraju da se o~iste od testikularnog tkiva i ostataka. Krioprezervaciju spermatozoida u suspenziji treba izbegavati, jer produkti lize, posle otapanja, mogu biti toksi~ni. Iako je broj klini~kih studija sa krioprotektiranim testikularnim spermatozoidima ograni~en, potvr|eno je da su rezultati slabiji u pore|enju sa rezultatima ciklusa ICSI - intra citoplasmatic sperm injection u kojima su kori{}eni sveì uzorci testikularnih spermatozoida. Trudno}e sa krioprotektiranim testikularnim spermatozoidima, uklju~uju}i i one koji su sazreli in vitro nakon krioprezervacije, su registrovane.

Bezbedna krioprezervacija spermatozoida ûvanje zamrznutih spermatozoida moè biti potrebno tokom duèg perioda, pa prema tome, dokumentovanje i metode pripreme moraju biti pa`ljivo kontrolisani. Pre krioprezervacije bi svi pacijenti trebali biti pregledani na prisustvo zaraznih bolesti kao {to su hepatitis A, B, i C i AIDS, a trebalo bi obaviti i op{ti medicinski pregled, radi isklju~enja virusnih bolesti, jer postoji mogu}nost prenosa virusa u te~nom azotu. Preporu~uje se karantinski period, kada je to mogu}e, od 6 meseci posle koga sledi drugi pregled na prisustvo virusa, a pre nego {to se uzorak deponuje. Vaàn je izbor paljeta u kojima }e se zale|ivati sperma. Paljete od PVC polyvinyl chloride se ne mogu koristiti, ako su bile sterilisane prozra~ivanjem, jer u tom slu~aju postaju toksi~ne. Staklene paljete, PETG - polyethylene terephtalate glycol i PVC - polyvinyl chloride se mogu polomiti, ili eksplodirati pri hla|enju ili zagrevanju

275


i procuriti u tankove sa te~nim azotom. Jonomerske paljete od smole su najprakti~nije, jer ostaju savitljive i mogu se topiti na vrhu radi osiguravanja protiv curenja. Sistem obeleàvanja radi identifikacije paljeta bi trebao biti otporan na niske temperature i lociran unutar cev~ice, po{to uobi~ajeni na~in obeleàvanja nije trajan. Mesto skladi{tenja uzorka bi trebalo biti nadgledano periodi~no, uz kontrolu nivoa te~nog azota.

Pokretljivost i sposobnost normalnog rasta i razvoja krioprotektirane sperme Pokretljivost je dobar parametar kvaliteta kod spermatozoida dobijenih ejakulacijom. Ovi spermatozoidi bi uvek trebali da imaju prednost. Iako se uspe{na oplodnja i razvoj embriona mogu desiti i sa nepokretnim ejakuliranim spermatozoidima, dobijeni rezultati su slabiji. Isto zapaànje vaì i za nepokretne epididimalne spermatozoide. Suprotno tome, u dosada{njim istraìvanjima je utvr|eno da nepokretni testikularni spermatozoidi imaju isti potencijal za oplodnju kao i pokretni. Ukoliko se motilitet ne popravlja posle produène kultivacije, predlaè se HOS - hypoosmotic swelling test u cilju identifikacije spermatozoida sa neo{te}enim membranama.

HOS - hipoosmotic swelling test je razvijen kao metoda za procenjivanje funkcionalnog integriteta membrane humanog spermatozoida. Spermatozoid se inkubira u hipoosmotskom medijumu. Kod spermatozoida koji imaju funkcionalnu membranu pro{iruje se citoplazmatski prostor, dok se vlakna repa uvijaju. Ove promene se vide uz pomo} svetlosnog mikroskopa. Spermatozoidi sa inaktivnom }elijskom membranom ne uve}avaju cistplazmatski prostor i njihov rep ostaje nepromenjen. Spermatozoidi koji pokazuju pozitivan hipoosmotski swelling test su vitalni.

Kori{}enjem testa mogu}e je identifikovati vitalne spermatozoide i u najteìm slu~ajevima asthenozoospermije i selektirati ih za kori{}enje u programu vantelesne oplodnje ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom. Izlaganje pentoksifilinu, tako|e, moè inicirati i pobolj{ati pokretljivost. Me|utim, ova tehnika je sloèna i sa ograni~enim pozitivnim ishodom.

Morfologija sperme Morfologija spermatozoida je va`na, ali nije apsolutni parametar za odabir zdravog spermatozoida. Neke abnormalnosti glave, repa i srednjeg dela se mogu povezati sa genetskim poreme}ajem spermatozoida, pa prema tome igraju va`nu ulogu u selekciji spermatozoida pre ICSI - intra citoplasmatic sperm injection oplodnje. Postoji jasna korelacija morfologije spermatozoida sa njegovim genetskim sadràjem. Oko 26% spermatozoida sa amorfnim, okruglim i izduènim glavama imaju strukturne hromozomske anomalije. Ve}ina spermatozoida sa velikim glavama su diploidni. Spermatozoidi sa okruglim glavama imaju promenljiv nedostatak u komponentama odgovornim za aktiviranje oocita nakon oplodnje. Tako|e, postoji korelacija promenjene morfologije spermatozoida sa labavo raspore|enim hromatinom. S druge strane je dokazano postojanje aneuploidnosti polnog hromozoma kod morfolo{ki normalnih spermatozoida kod pacijenata koji su bili u programu ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Utvr|eno je prisustvo aneuploidnosti od 2 - 5% za X, Y ili hromozom 18, kod morfolo{ki normalnih spermatozoida. Ovi rezultati pokazuju da normalna morfologija nije apsolutni indikator za odabir genetski normalnih spermatozoida.

276


Prema tome, negativan rezultat kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection pacijenata moè delimi~no biti rezultat odabira aneuploidnih spermatozoida.

Sazrevanje Nezrele }elije spermatozoida dobijene iz suspenzija testikularnih }elija se koriste za metodu ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, kao {to je ve} re~eno. Njihova kompetencija je odre|ena stadijumom razvoja u kojoj se nalaze. Kada se za oplodnju koriste okrugli spermatidi i spermatociti, procenat oplo|enih oocita je 20%, a procenat trudno}a manji od 4%. Razvoj do stadijuma blastociste se odvija mnogo sporije kod embriona dobijenih od okruglih testikularnih spermatida. Ukupan kvalitet ovih blastocisti je lo{iji i nije prime}en spontani hatching in vitro.

Fertilizacija spermatidama je tako|e dovedena u korelaciju sa ~estim pojavljivanjem velikih malformacija u ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusima. U ovom trenutku nema jasnih parametara za identifikaciju normalnih spermatida i njihovu selekciju. Kod nezrelih testikularnih spermatozoida morfolo{ke osobine, kao {to je zadràvanje citoplazme, indiciraju nezrelost i ve}i rizik za dizomiju. Za uspe{nost IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection neophodne su detaljne analize sperme i odgovaraju}e metode krioprezervacije radi dobijanja kompetentnih spermatozoida u dovoljnom broju. Po{to je krajnji cilj svih metoda asistirane reproduktivne tehnike zdravo potomstvo, neophodna je stroga procedura u ovoj fazi rada.

Tabela 4-18: Smernice za izbor spermatozoida

Pokretljivost Nepokretni spermatozoidi: -- Potpuno nepokretni: HOS test ili tretman sa PVP radi provere • pozitivan kod testikularnih spermatozoida: dobar ishod • pozitivan kod ejakuliranih ili epididimalnih spermatozoida: loš ishod --Prvobitno nepokretni spermatozoidi koji su stekli pokretnost posle kultivacije :dobar ishod Morfologija - Normalna morfologija: 2-5% aneuploidnosti kod X,Y i 18 - Amorfna glava: 26% ima strukturne hromozomske anomalije - Okrugla glava: 26% strukturnih hromozomskih anomalija, ve}ini nedostaju faktori aktivacije oocita - Izduèna glava: 26% strukturnih hromozomskih anomalija - Velika glava: 90% je diploidno Zrelost: - Okrugao spermatid: broj oplodnji < 20%, usporeno formiranje balstociste, broj trudno}a < 4% - Izduèni spermatid: normalan broj oplodnji i trudno}a, veliki broj anomalija kod potomaka - Nezreli testikularni spermatozoid: normalan broj oplodnji i trudno}a - Nezreli ejakulirani spermtatozoid sa zadràvanjem citoplazme: rizik za aneuploidnost, dizomiju i nezrelost hromatina


277

9. KONVENCIONALNA KRIOPREZERVACIJA OOCITA, EMBRIONA I OVARIJALNOG TKIVA Uvo|enjem metode krioprezervacije u IVF - in vitro fertilisation postupak pove}ane su {anse za ostvarivanje trudno}e iz svakog pojedina~nog postupka. U Australiji, Alan Trounson i Linda Mohr prvi objavljuju uspe{nu trudno}u nakon transfera krioprezervisanog embriona kod ljudi 1983. godine. Krioprezervacija podrazumeva rashla|ivanje ìvih }elija u cilju stavljanja ìvotnih procesa u poziciju stand by. Najkriti~niji momenat za }elije u toku procesa zamrzavanja i odmrzavanja je tzv. intermedijarna temperaturna zona od -15 do -60 stepeni Celzijusa. U toku konvencionalne krioprezervacije, jo{ poznate i kao slow freezing ili equilibrium freezing, ekvilibrijum se postiè sa relativno niskim koncentracijama krioprotektanata oko 1,5 M, a dehidratacija se odigrava u toku sporog procesa hla|enja od 0,3 do 2 stepena Celzijusa/min. Ukoliko je rashla|ivanje dovoljno sporo, voda se uklanja iz }elija delovanjem krioprotektanta, ~ime se izbegava letalna intracelularna kristalizacija. Mogu se koristiti i permeabilni i nepermeabilni krioprotektanti. Biolo{ki materjal se deponuje na temperaturi od -196 stepeni Celzijusa u te~nom azotu.

U toku procesa odmrzavanja moè da do|e do stvaranja intracelularnih kristala leda, {to se izbegava brzim zagrevanjem. Najva`niji limitiraju}i faktor pri sporom rashla|ivanju je brzina kojom voda i krioprotektantni prolaze }elijsku membranu. Ovo zavisi od gra|e }elijske membrane, temperaturno zavisne permeabilnosti }elijske membrane za vodu i krioprotektante kao i povr{insko / zapreminskog odnosa.

Osmotske promene izazvane dehidratacijom imaju za posledicu pove}anje unutra{nje koncentracije soli koja negativno uti~e na vitalne procese u }eliji. Pad temperature u toku krioprezervacije ima direktan efekat na biohemiju }elije. Na svakih 10 stepeni smanjenja temperature, registruje se 50% smanjenja biohemijske aktivnosti }elije. Na nivou }elije, ovaj temperaturni fenomen primarno deluje na }elijski metabolizam i proteine u citoplazmi, koja je okruèna plazma membranom i sastavljena od bioaktivnih proteina izme|u lipidnih slojeva. Tako odre|ene enzimske reakcije za koje je na temperaturi od 27 stepeni potrebna 1 sec, na temperaturi te~nog azota od - 196 stepeni traju 2 miliona godina. Protokoli krioprezervacije sastoje se u laganom eliminisanju frizibilne vode.

278


Va`no je ista}i da odre|ena koli~ina vode ostaje vezana za molekularne strukture i da se ne elimini{e u toku procesa dehidratacije. Isto tako, smanjenjem temperature ekstracelularni rastvor trpi fizi~ke i hemijske promene, a osmolarnost raste. Pove}anje koncentracije ekstracelularne soli rezultira daljim osmotskim izvla~enjem vode iz }elije, {to ima za posledicu pasivnu dehidrataciju. Ekscesivna i nekontrolisana redukcija }elijskog volumena moè da dovede do ireverzibilnog o{te}enja }elijskog citoskeleta. Drugi vaàn problem u vezi sa krioprezervacijom je formiranje kristala leda. Imaju}i u vidu da jedan deo vode ostaje u }eliji, postoji opasnost da }e smanjenjem temperature i formiranjem kristala leda oni o{tetiti prvenstveno plasma membranu i druge membranozne elemente. Nije definitivno odre|eno koliko dugo humani oocit, odnosno embrion, moè da bude zamrznut. Preìvljavanje nakon krioprezervacije je zavisno od kvaliteta promena u toku procesa zamrzavanja, odnosno odmrzavanja, dok je sam period deponovanja od sekundarnog zna~aja. Najduì period ~uvanja humanog embriona, objavljen u literaturi, koji je rezultirao ro|enjem zdrave bebe nakon transfera odmrznutog embriona iznosio je 12 godina.

Konvencionalno zamrzavanje humanih oocita Iako su objavljeni rezultati uspe{nog zamrzavanja oocita, sveukupni rezultati pokazuju ograni~enu primenu krioprezervacije oocita u klini~koj praksi. Oocit u drugoj metafazi pokazuje posebnu osetljivost na niske temperature. Ovo moè da bude posledica poreme}aja na nivou deobnog vretena ili mitohondrijalnih membrana, ili promena na nivou zone pelucide.

Problem u vezi sa o{te}enjem deobnog vretena moè se zaobi}i pode{avanjem intervala izme|u odmrzavanja oocita i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection postupka, ~ime se omogu}ava citoskeletu oocita da se remodelira i obnovi deobno vreteno. Pove}ana osteljivost oocita moè se objasniti smanjenom permeabilno{}u citoplazmatske membrane, kao pove}anom osetljivo{}u na osmotske promene. Zamrzavanje oocita u GV - germinal vesicle stadijumu gde je DNK - deoksiribonukleinska kiselina okruèna nuklearnom mebranom, otkriva nove probleme u smislu IVM - in vitro maturation. Tucker je 1998. godine objavio prvu trudno}u iz krioprezervisanih GV - germinal vesicle faze oocita. Bilo je krioprezervisano ukupno 29 oocita, ali je samo tri oocita u GV- germinal vesicle fazi preìvelo. Nakon 30 ~asova kultivacije, dva oocita su sazrela i bili su oplo|eni ICSI - intra citoplasmatic sperm injection tehnikom. ICSI - intra citoplasmatic sperm injection koja se koristi u postupku fertilizacije oocita nakon odmrzavanja, premo{}uje problem o~vr{}avanja zone nakon procesa krioprezervacije. I pored opisanih trudno}a, procenat uspe{ne fertilizacije i formiranja blastociste je samo oko 5,6%, a procenat trudno}e je manji od 10%. Ipak, sve bolji rezultati ukazuju da zamrzavanje oocita moè da bude alternativna metoda zamrzavanju embriona, posebno ako se imaju u vidu slu~ajevi oocit donor programa, oboljenja pra}ena gubitkom ovarijalnog tkiva, ili u slu~ajevima kada je nemogu}e zamrznuti embrione.

Krioprezervacija nezrelih oocita Prikupljanje nezrelih oocita skra}uje fazu rasta oocita i proliferativnu fazu

279


endometrijalnog razvoja, potencijalno izazivaju}i te{ko}e u endometrijalnoj receptivnosti u istom ciklusu. Oociti iz GV - germinal vesicle stimulisanih IVF - in vitro fertilisation ciklusa mogu preìveti krioprezervaciju i nastaviti mejozu do ostvarivanja

punog nuklearnog sazrevanja, zadràvaju}i smanjeni kapacitet za oplodnju i razvoj. U tabeli je dat pregled rezultata nekih autora u programima asistirane reproduktivne tehnologije gde su kori{}eni krioprotektirani nezreli oociti.

Tabela 4-19: Rezultati studija krioprezervacije nezlelih oocita u programima asistirane reprodukcije

Studije

Metoda

Chen, 1986

IVF

Broj oocita 40

Trudno}e Broj ìvoro|ene dece 1

Van Unmet al., 1987

IVF

28

1

Al-Hasanietal., 1987

IVF

182

2

Siebzehnrubl et al 1989

IVF

38

1

Tucker et al, 1996

ICSI

81

3

0

Porcuetal., 1997

ICSI

12

1

1

Tucker et al, 1998

ICSI

13

1

1

Borini et al. 1998

ICSI

129

3

Porcuetal, 1998

ICSI

709

9

6

Young et al, 1998

ICSI

9

1

3

Polak de Fried et al, 1998

ICSI

10

1

1

Donaldson et al, 2000

ICSI

18

2

Porcu et al, 2000

ICSI

1840

19

Winslow et al..2001

ICSI

324

Chen et al, 2002

ICSI

8

Porcu et al, 2002

ICSI

124

Yang et al, 2002

ICSI

158

11

14

Quintans et al, 2002

ICSI

109

5

2

Fosas et al, 2003

ICSI

88

5

Boldtetal, 2003

ICSI

90

5

12 16

1 3

280


Zamrzavanje embriona

Prva podrazumeva zamrzavanje u stadijumu 2 PN sa odre|enim prednostima, jer je }elija u interfazi mitoti~ke deobe i nema anuklearnih fragmenata koji negativno uti~u na proces krioprezervacije. U ovom slu~aju je teè izabrati embrione za tzv. fresh embrio transfer, {to ima za posledicu neoptimalan embriotransfer.

Zamrzavanje embriona je danas rutinska metoda u programu vantelesne oplodnje. Postupkom ovarijalne stimulacije omogu}ava se dobijanje velikog broja oocita koji mogu da se oplode. Da bi se smanjio broj multiplih trudno}a, praksa je u ve}ini zemalja da je broj transferiranih embriona limitiran. Prekobrojni embrioni mogu biti zamrznuti i transferirani u nekom od slede}ih ciklusa, ~ime se pove}ava ukupan procenat ostvarenih trudno}a iz jednom stimulisanog ciklusa. Istovremeno se umanjuje broj stimulisanih ciklusa sa smanjenjem posledica ovarijalne stimulacije. Zamrzavanje doniranih embriona omogu}ava izbegavanje sinhronizacije ciklusa izme|u donora i recipienta u programima donacija. Embrioni se ~uvaju dok god se ne elimini{e rizik od eventualne transmisije virusom izazvanih oboljenja. Postoje dve osnovne tehnike zamrzavanja humanih embriona.

Blastocistu je mogu}e zamrznuti isto kao i dvo ili osmo}eliske embrione. Prednosti ovog izbora su da je embriotransfer optimiziran i da se biopotencijal embriona predvi|enih za zamrzavanje moè pratiti. Najbolja selekcija se vr{i ukoliko zamrzavamo embrione u stadijumu blastociste. Blastocista moè da izgubi ne{to trofoektodermnih }elija bez gubitka vitalnosti. Postoji i bolja sinhronizacija izme|u embriona i razvoja endometrijuma. Dosada{nja ispitivanja ne pokazuju razlike izme|u dece ro|ene nakon fresh ET embryo transfer i ET - embryo transfer-a krioprezerviranih embriona.

Embryo – slow cooling

Blastocista - slow cooling

Sl. 4-77- Embryo - slow cooling

Sl. 4.78- Blastocita - slow cooling

Krioprezervacija blastociste


Konvencionalna krioprezervacija humanog ovarijalnog tkiva Jedna od novijih metoda krioprezervacije u okviru programa IVF - in vitro fertilisation je i krioprezervacija ovarijalnog tkiva. Primordijalni folikuli iz ovarijalnog tkiva sadrè oocit manjeg volumena koji je otporniji na proces zamrzavanja i odmrzavanja. Mala veli~ina primordijalnog folikula, odsustvo zone pelucide i mali broj support }elija i njihov nizak metaboli~ki status, arest u prvoj profazi mejoze, mala koli~ina osetljivih lipida i odsustvo kortikalnih granula, ~ini primordijalni folikul manje osetljivim na o{te}enja izazvana smanjenjem temperature. Relativno jednostavna metoda zamrzavanja pojedina~nih }elija u slu~ajevima zamrzavanja tkiva postaje umnogome problemati~nija. Dva osnovna razloga ograni~avaju primenu ovarijalne stimulacije i krioprezervacije oocita i embriona u smislu ~uvanja fertilnosti: - stimulacija ovarijuma zahteva vreme, {to ~esto odlaè onkogenu terapiju, a moè eventualno i da stimuli{e hormon zavisne tumore, -stimulacija ovarijuma nije mogu}a u periodu pre puberteta. Stoga krioprezervacija moè da bude alternativa o~uvanju fertiliteta. Protokoli koji se koriste za krioprezervaciju ovarijalnog tkiva baziraju se na onim za zrele oocite. Me|utim, sada se javlja problem heterogenosti celularne strukture ovarijalnog tkiva, sa razli~itim stepenom difuzije krioprotektanta kroz tkivo. Optimalan protokol tek treba da se ustanovi, ali za sada se koristi metoda slow cooling i rapid thawing.

281

Prilikom dobijanja ovarijalnog tkiva, pregledom se mogu dobiti nezreli oociti koji tako|e mogu da se zamrznu pre ili posle IVM - in vitro maturation procedure. Ovarijalno tkivo moè da bude auto i ksenotransplantirano. Sve do 1990. godine posve}ivano je malo pa`nje ovoj metodi prvenstveno zbog malog procenta preìvljavanja osnovne bolesti, a potom i zbog neadekvatne reproduktivne tehnike neophodne za kori{}enje ove tehnologije. Ovo se menja uvo|enjem novih krioprotektanata kao i modifikovanog protokola zamrzavanja. Mnoge studije izve{tavaju o upotrebi 1,5 M DMSO - dimethyl sulfoxide sa slow freezing protokolom 0,3 do 0,5 stepena/min i transferom u te~ni azot izme|u -55 i -140 stepeni Celzijusa. Pokazano je da tkivo jajnika moè da se transportuje na ledu u toku 4 sata bez signifikatnog gubitka folikula. Isto tako, sugerisano je da se ovarijalna krioprezervacija za transplantaciju vr{i samo kod èna mla|ih od 40 godina. Prednost ortotopi~ne autotransplantacije je mogu}nost spontanog za~e}a. Posebno treba ista}i ograni~eno vreme preìvljavanja transplantiranog ovarijalnog tkiva. Godine 2001. opisana je prva ortotopi~na autotransplantacija ovarijalnog tkiva kod pacijentkinje sa Hodgkin-ovom bolesti. U periodu od 7 meseci registrovana je folikularna maturacija, porast nivoa estradiola kao i menstruacija. Medjutim, nakon dva meseca do{lo je do pojave ovarijalne insuficijencije. Schmidt je translpantirao prethodno zamrznuto ovarijalno tkivo ispod korteksa preostalog nefunkcionalnog ovarijuma. U periodu od 7 meseci do{lo je do pove}anja nivoa estradiola kao i pojave menstruacije. Nakon ovarijalne stimulacije dobijeni su

282


oociti, ali nije do~lo do fertilizacije nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. U slede}em ciklusu poku{ano je sa inseminacijom, ali bez rezultata. Nedavno, 2004. godine publikovan je rad o prvom ro|enu bebe nakon krioprezervacije/odmrzavanja i ortotopi~ne autotransplantacije. Pacijentkinja je zatrudnela spontano bez ovarijalne stimulacije. Slede}i korak u razvijanju ove metode predstavljala bi krioprezervacija/autotransplantacija celog ovarijuma zajedno sa vaskularnom petljom. Prve heterotopi~ne autotransplantacije su izvedene transplantovanjem ovarijalnog tkiva subkutano na ruci, ispod seroze

uterusa i subkutano ispod abdominalnog zida. Bilo je potrebno 3 - 4 meseca da bi transplantovano tkivo uspostavilo hormonsku aktivnost. Nakon ovarijalne stimulacije dobijeni oociti nisu se fertlisali. Ograni~avaju}i faktor i u ovom slu~aju je vremenski ograni~ena funkcija transplantata. Opisane su transplantacije tkiva jajnika u abdominalni zid. Nakon transfera ~etvoro}elijskog embriona nije do{lo do trudno}e. Sa ovakvim rezultatima izgleda da je uspeh ove tehnike samo pitanje vremena. Ksenotransplantacija humanog ovarijalnog tkiva je pogodan model za nalaènje odgovora za mnoga nau~na pitanja.

283


10. VITRIFIKACIJA OOCITA, EMBRIONA I OVARIJALNOG TKIVA Vitrifikaciju moèmo definisati kao solidifikaciju rastvora na niskim temperaturama, pomo}u ekstremnog porasta viskoziteta u toku hla|enja. Viskozitet uzorka raste dok molekuli ne postanu imobilni te uzorak nije vi{e te~an ve} dobija karakteristike ~vrstog. Tako je vitrifikacija rezultat velike brzine rashla|ivanja udruène sa visokom koncentracijom krioprotektanta. Voda se zamenjuje krioprotektantom. Postignuta brzina hla|enja kre}e se izme|u 15000 i 30000 stepena /min, a voda se direktno transformi{e iz te~ne faze u tzv. staklastu, vitrificiranu fazu. Na ovaj na~in ne dolazi do formiranja kristala leda koji je jedan od glavnih uzroka o{te}enja }elije ili tkiva. Treba napomenti da se u procesu krioprezervacije koriste termini zamrzavanje i odmrzavanje, koji se u slu~aju metode vitrifikacije zamenjuju terminima vitrifikacija i zagrevanje. U slu~aju vitrifikacije osnovni problem leì u visokim koncentracijama krioprotektanta koji je neophodan za odvijanje ovog procesa. Ne mogu se zaobi}i biolo{ka ograni~enja u odnosu na koncentraciju krioprotektanata koja moè da bude tolerisana od strane }elije. Stoga je osnovni cilj bilo kog protokola vitrifikacije pove}anje brzine

smanjenja temperature uz istovremeno kori{}enje najniìh mogu}ih koncentracija krioprotektanata. Puferovana medijumska baza koja se koristi za vitrifikaciju je ili fosfatni pufer rastvor ili Hepes pufer medijum za kulturu.

Krioprotektanti Krioprotektanti su neophodni za krioprezervaciju }elija. Toksi~nost ovih agenasa je odlu~uju}i limitiraju}i faktor u kriobiologiji. Stoga, glavni cilj bilo kog protokola vitrifikacije mora da bude supresija toksi~nosti bez gubitka efikasnosti krioprotektivnog agenta. Postoje dva osnovna tipa krioprorektanata: permeabilni i nepermeabilni krioprotektanti. Naj~e{}e kori{}eni krioprotektanti su DMSO - dimethyl sulfoxide, glicerol i 1,2-propanediol. Naj~e{}i i najprihva}eniji krioprotektant za vitrifikaciju su acetamid i EG - ethylene glycol. Pokazalo se da ima zna~ajan toksi~ni efekat kao i veliku brzinu difuzije sa brzom ekvilibracijom unutar }elija kroz zonu pellucidu i }elijsku membranu. Uobi~ajena praksa u cilju redukovanja toksi~nosti, ali ne i efikasnosti krioprotektanta je da se }elija prvo izloì niìm koncentracijama, a potom vi{im koncentracija krioprotektanata. Oni su obi~no viskozni, rastvorljivi u

284


vodi i koriste se u visokim koncentracijama. Stepen penetracije zavisi od temperature i razlikova}e se zavisno od specifi~ne hemijske strukture i tipa }elije.

Disaharidi Dodavanje {e}era: saharoze, fruktoze, glukoze, sorbitola, trehaloze ili rafimoze, krioprotektantu EG-ethylene glycol, baznom rastvoru za vitrifikaciju, menjaju se karakteristike ovog rastvora. Aditivi sa velikom molekularnom teìnom, kao {to su disaharidi, saharoza ili trehaloza, ne penetriraju }elijsku membranu, ali zna~ajno redukuju koli~inu neophodnog krioprotektanta kao i njegovu toksi~nost. Dodavanje nepermeabilne komponente soluciji za vitrifikaciju i inkubaciju }elije u ovom rastvoru, pre vitrifikacije, pomaè da se povu~e vi{e vode iz }elije i tako smanjuje vreme eksponiranja }elija toksi~nom efektu krioprotektanta. Nepermeabilna saharoza tako|e deluje i kao osmotski pufer u smislu redukovanja osmotskog soka.

Makromolekuli ]elije prirodno sadrè visoke koncentracije proteina koji su od pomo}i u procesu vitrifikacije. Vi{e koncentracije krioprotektanata su potrebnije za ekstracelularnu nego za intracelularnu vitrifikaciju. Dodavanje polimera visoke molekularne teìne kao {to je PVP - polyvinylpyrolidone, PEG - polyethylene glycol ili fricoli je dovoljno za vitrifikaciju ekstracelularnog dela sa koncentracijom krioprotektanta koji je dovoljan za intracelularnu vitrifikaciju. Pokazano je da u odre|enim uslovima polimeri mogu da redukuju Cv za 7% u proseku do 24% u kombinaciji sa pove}anim hidrostatskim pritiskom. [ta vi{e, polimeri mogu da stvore viskozni matriks za inkapsulaciju oocita/embriona i

spre~e kristalizaciju u toku rashla|ivanja, odnosno zagrevanja.

Intracelularni lipidi Nedavno su objavljeni rezultati o novoj metodi koja se sastoji u polarizaciji i uklanjanju citoplazmatskih lipida iz oocita i embriona pre vitrifikacije, ~ime se izbegava negativni efekat uzrokovan hla|enjem intracelularnih lipida. Bez obzira na prve objavljene rezultate, ne moè se a ne uzeti u obzir uloga intracelularnih lipida kao izvora energije za oocite, odnosno, kao gradivni materijal za }elijske membrane, mitohondrije i endoplazmatski retikulum. U obilju istraìvanja koja se bave efektima rashla|ivanja, negativan kriouticaj je obja{njen i efektima na elemente citoskeleta. Negativni efekat rashla|ivanja se tako|e obja{njava depolimerizacijom mikrotubula i mikrofilamenata kod humanih oocita. Zamrzavanje i odmrzavanje oocita indukuje promene u fizi~ko-hemijskim svojstvima intracelularnih lipida. Poznato je da su oociti u drugoj metafazi rezistentniji na o{te}enja izazvana zamrzavanjem od oocita u GV germinal vesicle stadijumu. To je verovatno uslovljeno razlikama u svojstvima citoskeletnih elemenata. Jedan od va`nih elemenata je razlika u konfiguraciji mikrotubula i mikrofilamenata u toku maturacije oocita. Elementi citoskeleta GV - germinal vesicle oocita su rigidni i pravi, dok su mikrofilamenti i mikrotubuli kod oocita u drugoj fazi mejoze fleksibilni i talasasti. Imaju}i u vidu hipotezu da je interakcija izme|u lipidne faze }elije i elemenata citoskeleta kompleksna, menjanje strukture lipida moè da uzrokuje deformaciju i prekid elemenata citoskeleta. U slu~ajevima rigidnog citoskeleta GV - germinal vesicle oocita o{te}enja su trajna.

285


Faktori koji uti~u na efikasnost procesa vitrifikacije su slede}i: - tip i koncentracija krioprotektanta, jer su gotovo svi krioprotektanti toksi~ni, - medijum koji se koristi kao bazni medijum, - temperatura vitrifikacionog rastvora, - vreme za koje su }elije/tkivo izloène finalnoj koncentraciji krioprotektanta pre potapanja u te~ni azot, - volumen rastvora krioprotektanta koji okruùje }elije/tkivo, - tehni~ka obu~enost embriologa, - kvalitet i stepen razvoja }elija/tkiva, - direktni kontakt te~nog azota i vitrifikacionog rastvora koji sadrì biolo{ki materijal moè biti izvor kontaminacije. Protokoli vitrifikacije su jednostavni, brzi, i relativno jeftini, imaju}i u vidu da nije potrebna skupa oprema.

Sistem nosa~a Treba naglasiti da postoji posebni sistem nosa~a za vitrifikacione rastvore, i to: • Open

pulled straws Flexipet-denuding pipette • Cryoloop •

Njihov zadatak je da smanje zapreminu vitrifikacionog rastvora da bi se brzina rashla|ivanja zadràla na {to je mogu}e vi{em nivou i da uzorak koji se vitrifikuje bude okruèn te~no{}u, a ne gasom. Vitrifikacija se ne koristi rutinski u ve}ini IVF - in vitro fertilisation laboratorija. Jo{ uvek postoji mnogo razlika i varijabila u vitrifikacionim protokolima, pa su i rezultati u skladu sa tim. Ova metoda je jo{ uvek u povoju, a poslednjih godina dobija na zna~aju i njen pravi zamah se moè o~ekivati u slede}ih nekoliko godina.

Na kraju da rezimiramo podatke o krioprezervaciji humanih materijala. Prednosti vitrifikacije u odnosu na krioprezervaciju bi bile slede}e: - direktni kontakt izme|u humanog materijala i te~nog azota, - nema kristalizacije, - kori{}enje visokih koncentracija krioprotektanta koje omogu}avaju kratko izlaganje, - brza procedura vitrifikacije i zagrevanja, - mali volumen vitrifikacionog rastvora, - cooling rates od 15000 - 30000 stepeni/min, - minimiziranje osmotskog o{te}enja, - redukovano vreme krio procedure na 2 - 10 min., - jednostavan protokol, - nepotrebna skupa oprema.

Vitrifikacija huumanih oocita Kao {to je ve} re~eno, oociti su posebno osetljivi na formiranje kristala leda, o{te}enje lipidnih kapljica, ili citoskeletona. Osetljivost oocita raste sa njegovim sazrevanjem. I u slu~ajevima vitrifikacije oocita, dobijeni rezultati nisu zadovoljavaju}i. Osmotske promene vezane za vitrifikaciju i visoke koncentracije krioprotektanta mogu da budu toksi~ne za }eliju. Ipak, procenat preìvljavanja nakon vitrifikacije pokazuje sve bolje rezultate, posebno, upotrebom i uvo|enjem razli~itih koncentracija i vrsta krioprotektanata. Procenat preìvljavanja je izme|u 70% do 96 %. Kao i u slu~aju klasi~ne krioprezervacije, ova procedura je od posebnog zna~aja u slu~ajevima mladih èna obolelih od karcinoma. Njihovi oociti mogu da budu deponovani pre terapija koje o{te}uju tkivo jajnika, kao {to su radijacija, hemoterapija i hirurgija.

286


Tabela 4-20: Prikaz rezultata vitrifikacije humanih oocita

Studije

Metoda

Broj oocita

Trudno}e

Broj ìvoro|ene dece

Kuleshova et al., 1999

ICSI

17

1

1

Yoon et al., 2000

ICSI

90

3

2

Katayama et al., 2003

ICSI

46

2

Yoon et al.,2003

ICSI

474

7

Vitrifikacija embriona Embryo - vitrifikacija

Vitrifikacija u stadijumu pronukleusa ima prednosti u smislu izbegavanja zna~ajnih hromozomskih promena. Post -thaw procenat preìvljavanja kre}e se preko 60%, sa procentom trudno}a po transferu od 17% - 30%. Uspe{no preìvljavanje zigota nakon fertilizacije obja{njava se time {to procesi u toku i nakon fertilizacije, kao {to je kortikalna reakcija i sledstvena zona hardening omogu}uju ooplazmatskoj membrani bolju toleranciju niskih temperatura i osmotskih promena. Od kvaliteta embriona uveliko zavisi procenat preìvljavanja. Embrion sa adekvatnim brojem blastomera zavisno od dana kultivacije, ne sadrì multinuklearne blastomere, a stepen fragmentacije je ispod 15%. Implantacioni potencijal je direktno proporcionalan broju intaktnih blastomera. Procenat preìvljavanja je preko 60% (1193%), sa procentom trudno}a od 20%.

Vitrifikacija blastociste Glavna karakteristika blastociste je te~no{}u ispunjena {upljina poznata kao blastocela. Smanjenje uspeha vitrifikacije prime}en je u slu~ajevima pove}ane blastocele. Razlog ovome treba traìti u nedovoljnom

Sl. 4.79- Embryo - vitrifikacija

prelasku krioprotektanta u blastocelu, pri ~emu rezidualna voda pove}ava mogu}nost stvaranja kristala leda u toku hla|enja, smanjuju}i preìvljavanje nakon zagrevanja. Procenat preìvljavanja nakon krioprezervacije raste u slu~ajevima prethodne redukcije {upljine blastociste. Pore|enjem rezultata preìvljavanja blastociste kod rezus majmuna nakon slow cooling krioprezervacije i vitrifikacije pokazalo se da je post thaw survival rate 36% sa 5% hatching-a posle konvencionalnog zamrzavanja, odnosno 85% sa 71% hatching-a nakon vitrifikacije. Vitrifikacijom humane blastociste kori{}enjem cryoloop-a kao nosa~a, procenat preìvljavanja se kretao izme|u 72 i

287


90%, procenat klini~kih trudno}a od 3748%, a implantacija od 22 - 29%. Kultivacija embriona do stadijuma blastociste zna~ajna je iz jo{ jednog razloga. Poznat je negativan uticaj ICSI - intra citoplasmatic sperm injection na rezultat krioprezervacije. Izgleda da nekompletno zatvaranje oocitne citoplazmatske membrane i zone pelucide moè da dovede do defekta koji perzistiraju i u vreme krioprezervacije. Stoga krioprezervacija u fazi morule, ili blastociste obezbe|uje duè vreme za reparaciju.

Vitrifikacija ovarijalnog tkiva Kompleksnost ovarijalnog tkiva ~ini vitrifikaciju sloènom. U nekim studijama objavljenje su analize }elijskog nukleusa i dobijeni rezultati koji su bili komparabilni sa onim nakon konvencionalne krioprezervacije.

Za sada, konvencionalna krioprezervacija tkiva jajnika je metoda izbora zbog nesumnjivo ve}eg iskustva koje prati ovu metodu. Vitrifikacija kao i u ostalim slu~ajevima u budu}nosti moè da postane alterntaivna metoda u ovoj oblasti. Teoretska mogu}nost retransplantacije tumorskih }elija ostaje problem koji jo{ nije re{en. Odluka izme|u rizika i onoga {to se dobija mora da se donosi individualno. Poznato je da je rizik za pacijente sa Hodgkin-ovom bolesti mali, ali umeren kod pacijenata sa karcinomom dojke, odnosno vrlo visok u slu~ajevima leukemije. Vitrifikacija kao metod krioprezervacije ima prednosti, a najva`nija je odsustvo formirannja kristala leda kroz pove}anje brzine hla|enja. Da rezimiramo u donjoj tabeli razlike metoda krioprezervacije i vitrifikacije.

Tabela 4-21: Pore|enje procedura vitrifikacije i slow cooling

Dostupnost i regulacija

Vitrifikacija

Slow cooling

Moè da se posmatra

Da

Ne

Moè da se analizira

Da

Ne

Interakcija sa oocitom ili embrionom

Da

Ne

Kontrola penetracije rastvora

Da

Ne

Kontrola stepena dehidratacije

Da

Ne

Odràvanje fiziološke temperature u toku procesa ekvilibracije Vreme van inkubatora

Da

Ne

- 10 min

- 3h

Ne

Da

Niska

Visoka

O{te}enje zone pelucide

Ne

Mogu}a

Pojava kristala leda

Ne

Mogu}a

Prolongirani temperaturni šok Interferenca sa oocitom ili embrionom

288


11. PROCES STARENJA I ASISTIRANA REPRODUKTIVNA TEHNOLOGIJA U novije vreme usled stalnog pove}anja prose~ne starosti pacijenata u programima asistirane reprodukcije, posebno mesto zauzimaju postupci i stimulacija kod pacijenata preko ~etrdesete godine. Demografski podaci pokazuju da se u svim zemljama Zapadne Evrope i Sjedinjenim Ameri~kim Dràvama prose~na starost trudnih èna i dalje pove}ava. U Holandiji je prose~na starost èna sa prvom trudno}om porasla sa 24,6 godina u 1970-oj godini, na 29,1 u 1999-oj godini. Mnogi parovi jo{ uvek nisu svesni ~injenice da je poznije materinstvo glavni faktor ènske neplodnosti, jer ni najbolji medicinski tretmani ne mogu odloìti menopauzu i neplodnost koji su u vezi sa fiziolo{kim iscrpljivanjem ovarijuma. U takvim slu~ajevima je donacija oocita jedina opcija koja je trenutno na raspolaganju. Zbog porasta broja reproduktivno starijih èna koje èle da ra|aju u kasnim tridesetim, ili tokom ~etrdesetih godina starosti, ukoliko je mogu}e sa njihovim oocitima, veliki je izazov u asistiranoj reprodukciji procena plodnosti pojedinih parova, sa odre|ivanjem kompetentnosti oocita iz heterogene populacije oocita dobijene od reproduktivno starije ène. Podaci dobijeni analizama dosada{njih

rezultata IVF - in vitro fertilisation ukazuju na direktnu korelaciju izme|u starosti ène i verovatno}e za~e}a. Najnoviji podaci objavljeni u Velikoj Britaniji pokazuju da ène starije od 40 godina imaju oko 10 % {ansi da za~nu uz pomo} IVF- in vitro fertilisation. Starenje jajnika pra}eno je promenama u funkciji granuloze i kvalitetu oocita i embriona. Studije su otkrile smanjenje steroidogene aktivnosti granuloznih }elija kod èna starijih od 40 godina kao i korelaciju izme|u lo{eg ovarijalnog odgovora i pove}anog indeksa pulsiranja PI - pulsatility index-a i indeksa otpora RI-resistence index-a, kao potvrdu lo{ijeg protoka krvi. Angiogeneza se usporava sa starenjem u folikulogenezi i moè biti faktor aneuploidnosti. Folikularna hipoksija {tetno uti~e na formiranje deobnog vretena i segregaciju hromozoma oocita. Slabija vaskularnost i niske koncentracije kiseonika u folikularnoj te~nosti obja{njavaju inicijaciju aneuploidnosti vezanu za povi{enu starost. Uterina receptivnost kod perimenopauzalnih èna i mogu}nost implantacije nema ve}eg zna~aja, {to je dokazano sli~nim brojem implantacija i trudno}a mla|ih i starijih pacijenta, koje su se podvrgle IVF - in vitro fertilisation sa doniranim jajnim }elijama.

289


Ve}ina uticaja koji poti~u od starenja u odnosu na uterus, mogu biti prevazi|eni optimalnim doziranjem hormona. Za sada nema efikasnog tretmana efekata poznog materinstva kod smanjenog broja oocita, njihovog kvaliteta i kompetentnosti. Starost ima uticaj na kvalitet oocita kao i na plodnost tokom reproduktivnog ìvota ène i danas je o~igledno da umanjena plodnost, koja je povezana sa staro{}u, po~inje ve} u kasnim dvadesetim godinama, ali je najdramati~nija posle ~etrdesete godine kada vi{e od 50% parova ima te{ko}e u ostvarivanju trudno}e. Pad fertilnosti po~inje u periodu reproduktivnog ìvota mnogo pre pojave neregularnosti menstrualnog ciklusa i ovulatorne disfunkcije, dok jo{ uvek u jajniku postoji dovoljan broj primordijalnih folikula. Period plodnosti tokom perimenopauze je pra}en pove}anom brzinom atrezijom folikula u jajniku, {to nagove{tava korelaciju izme|u kriti~no male veli~ine grupe folikula, pove}ane folikularne atrezije i prate}im smanjenjem kvaliteta oocita. Populacije oocita dobijene od jednog pacijenta se mogu zna~ajno razlikovati u razvojnoj kompetentnosti. Kao {to je ve} re~eno, aneuploidnost oocita je jedan od glavnih faktora koji doprinose subplodnosti starijih èna, pre i postimplantacionom neuspehu, spontanom abortusu i za~e}u trizomi~nog deteta, naro~ito kod èna starijih od 40 godina. Ovo je podràno podacima iz programa donacije oocita koji pokazuju da se rizik od spontanog abortusa pove}ava sa staro{}u donora. Smatra se da je 15 - 20% embriona kod ovih èna hromozomno neuravnoteèno sa posledicom visokog stepena gubitka fetusa. Broj aneuploidnosti izra~unat iz incidencije trizomije 21 se pove}ava eksponencijalno kod èna koje imaju vi{e

od 35 godina starosti, sa dramati~no pove}anim rizikom nerazdvajanja hromozoma oocita u mejozi kod èna starijih od 40 godina. Pored hromozomske neravnoteè mogu postojati i dodatni faktori koji doprinose nièm razvojnom potencijalu starijih oocita, po{to je frekventnost spontanih abortusa, sa ili bez hromozomske neravnoteè, ve}a kod starijih èna. Mogu}i etiolo{ki faktori, koji bi mogli biti u vezi sa pove}anim poreme}ajima hromozomske segregacije pri oogenezi i smanjenom kompetentno{}u oocita, su kratko pomenuti u ovom poglavlju kao i neke trenutne i budu}e opcije za predvi|anje, prevenciju i tretmane subplodnosti koja se dovodi u vezu sa staro{}u.

Sl. 4.80- Gen

Prema konceptu uticaja starosti na oogenezu, umesto na spermatogenezu, analiza odvajanja i distribucije polimorfnih markera u hromozomima kod trizomija je pokazala da je ve}ina dodatnih hromozoma materinskog mejotskog porekla. Oko 90% trizomija 13, 15, 21 i 22 poseduje dodatni materinski hromozom i oko 80% svih slu~ajeva rezultuje iz gre{ke u segregaciji ~itavih hromozoma, nerazdvajanja homologih hromozoma u mejozi I.

290


Sl. 4.81- Trizomija 13 - Patauov sindrom

Sl. 4.83- Trizomija 18 - Edwardsov sindrom

Sl. 4.82- Trizomija 16

Sl. 4.84- 47 XXX

Trizomija 16 je isklju~ivo materinskog porekla sa gre{kom u prvoj mejozi kod 100% svih klini~ki poznatih slu~ajeva. Trizomija 18, tako|e, uglavnom poti~e od majke, ali se naj~e{}e dovodi u vezu sa neuspehom pravilnog hromatidnog odvajanja u drugoj mejozi. Jedini izuzetak je dodatni X hromozom kod 47 XXX i 47 XXY slu~ajeva, koji poti~e od oca u 50% slu~ajeva. Na slici br. 4.85 je prikaz kariotipa kod Klinefelter-ovog sindroma.

Sl. 4.85- 47 XXY Klinefelter syndrom

291


Sl. 4.86- Trizomija 21 male

Sl. 4.87- Trizomija 21 female

Ovo nagove{tava da postoji hromozom specifi~ni mehanizam koji uti~e na pravilno odvajanje, segregaciju specifi~nih homologa ili sestrinskih hromatida u ènskoj mejozi. Broj nerazdvajanja hromozoma kod trizomi~nih trudno}a odraàva razlike u osetljivosti pojedina~nih hromozoma na nondisjunkciju, ali zavisi i od relativnih {ansi za preìvljavanje hromozomno neuravnoteènog embriona. Podaci o trizomiji iz trudno}a i hromozomnih studija doniranih oocita iz asistirane reprodukcije, pokazuju da je nondisjunkcija trizomije 16 jedan od naj~e{}ih poreme}aja. Ona se pove}ava skoro linearno, tokom kasnijeg materinstva, dok su trizomija 21 i trizomije drugih malih akrocentri~nih hromozoma niske tokom ranog reproduktivnog doba i pove}avaju se eksponencijalno od 35. godine ìvota. Rizik od vi{estrukih trizomija se pove}ava i prevazilazi broj trizomija 21 kod èna starijih od 40 godina. Veliki hromozomi iz grupa A i B se retko upli}u u genezu trizomije. Razlozi za razli~ite osetljivosti pojedina~nih hromozoma dop-

rinose heterogenosti u razvojnoj kompetentnosti izme|u kohorta oocita mla|ih i starijih pacijenata, ali tako|e i individualno kod pojedina~nih pacijenata. Hromozomna analiza neoplo|enih oocita iz stimulisanih ciklusa nije utvrdila pove}anje aneuploidnosti vezanih za starost. Me|utim, konvencionalna analiza kariotipa je te{ka kod ljudskih oocita, jer metode koje koriste in situ hibridizaciju su svojstveno sklone gre{kama. Nedavne studije koje su koristile biopsiju polarnog tela ili donirane oocite i spektralno odre|ivanje kariotipa, koje identifikuje sve hromozome, podràvaju koncept koji tvrdi da postoji veza izme|u starosti i pove}ane osetljivosti na nondisjunkciju tokom oogeneze. Veliki broj aneuploidnosti, mozai~nost, ili haoti~no hromozomsko uvo|enje perimplantacionih embriona nagove{tava da primarne, kao i sekundarne, nondisjunkcije doprinose smanjenoj razvojnoj kompetentnosti starih oocita i embriona. U skladu sa tim matemati~ko modeliranje bazirano na retrospektivnim i prospektivnim eksperimentalnim zapaànjima apoptoze kod preimplantacionih embriona, predvi|a da je ve}ina embriona

292


Sl. 4.88 - Down-ov sindrom

ve} razvojno programirana u jedno}elijskoj etapi. Na primer, aneuploidnost, manjak faktora koji reguli{u zigotsku ekspresiju gena tokom, ili nakon kompakcije, ili druge unutra{nje smetnje, umesto uslova uzgajanja, mogu uticati na sudbinu preimplantacionog embriona i postimplantacioni opstanak. Visoka ta~nost odvajanja hromozoma generalno zavisi od rekombinacije izme|u dvaju roditeljskih homologa koji poti~u od oca i majke. Rane etape uparivanja i rekombinacije se odvijaju u embrionalnom jajniku pri progresiji oocita kroz profazu prve mejoze. Univalentni hromozomi nisu fizi~ki zaka~eni, pa prema tome poseduju veliki rizik za nasumi~nu orijentaciju i segregaciju tokom prve mejoze. Transgenski ìvotinjski modeli pokazuju da neuspeh istiskivanja produkata gena potrebnih za upravljanje, rekombinaciju i popravku DNK deoksiribonukleinske kiseline, moè rezultovati sterilitetom usled mejotskog zastoja i smrti }elije zametka tokom profaze prve mejoze, ili kao posledica velikog broja aneuploidnosti, naro~ito kod oocita. Povratni mehanizmi, check points koji vode ka mejotskom zastoju u prvoj profazi, kada

postoje smetnje u upravljaju ili rekombinaciji, se ~ine prili~no dopustivim u oogenezi. Kao posledica mutirane mu{ke jedinke ìvotinjskih modela su sterilne i ne proizvode spermu, dok novi oociti sa univalentima i gre{kama u segregaciji hromozoma preìvljavaju do ovulacije kod ènskih jedinki sa istim genetskim defektom. Ovaj deformizam doprinosi polno specifi~noj susceptibilnosti na mejotske gre{ke vi|ena kod ~oveka kao i starosno smanjenje kompetentnosti oocita. @ivotinjski modeli otkrivaju da ~ak i fine zabune u rekombinaciji i genetskoj razmeni u profazi prve oogeneze, unutar jajnika embriona uti~u na ta~nost odvajanja hromozoma tokom oogeneze. Mejotsko poreklo, prva ili druga mejoza, o~insko ili maj~insko poreklo, duìna rekombinacione mape i relativni brojevi i pozicija genetskih razmena, su retrospektivno analizirani kod trizomija radi testiranja na mogu}e korelacije izme|u poreme}ene rekombinacije u ranim etapama mejoze i aneuploidnosti kod oplo|enih oocita starijih pacijenata. Rekombinaciona mapa je potom analizirana. Trizomija 21 koja poti~e od materinske


prve mejotske gre{ke, uglavnom sadrì ahiasmati~ne hromozome, bez obzira na starost majke. Hromozomi 21 koji imaju umanjenu rekombinaciju u blizini centromera, kratku rekombinacionu mapu u proksimalnim delovima hromozoma, imaju visok rizik za nondisjunkciju u prvoj mejozi, iako distalna chiazma moè jo{ uvek biti prisutna. Hromozomi 21 sa vi{kom rekombinacije u blizini centromera se ~ine predodre|enim za gre{ke u odvajanju hromatida u drugoj anafazi, a ne u prvoj anafazi, kao {to bi se moglo o~ekivati . Po{to su se chiazmate ve} raspale u prvoj mejozi, gre{ke u segregaciji hromatida hromozoma 21 sa vi{kom proksimalne rekombinacije su posledica smetnje u prvoj mejozi. Smanjena rekombinacija u proksimalnim regijama dodatnog hromozoma u trizomiji 16, ali normalna, ili ~ak pove}ana rekombinacija u distalnim delovima hromozoma, predodre|uje pogre{no odvajanje ovog hromozoma u prvoj mejozi. Suprotno ovome, trizomija 15 i uniparentalna materinska dizomija 15, dve kopije hromozoma 15 od majke i nulisomija za o~ev hromozom, ~esto sadrè hromozome sa ukupno smanjenom rekombinacionom mapom i odgovaraju}e tome, smanjenim razmerama.

Sl. 4.89- Trizomija 15

293

Hromozomi 15, bez ili sa jednom chiazmom, su izloèni riziku nondisjunkcije kod mladih èna. [anse da se hromozomi sa dve ili vi{e chiazmate nepravilno odvoje jedan od drugog tokom prve mejoze oogeneze se pove}avaju sa pove}anjem starosti majke. Ovi podaci podràvaju zapaànje da hromozomi sa odre|enom hromozomnom istorijom i {ablonom rekombinacije, koji poti~e od genetskih razmena u profazi prve mejoze u jajniku embriona, imaju naro~ito visoke {anse da ne uspeju da se pravilno transformi{u tokom poslednjih etapa oogeneze pre oplodnje kod starije ène. Globalno niski stepeni rekombinacije su dodatni faktor rizika u trizomiji 21, iako nivoi razmene mogu jo{ uvek biti unutar normalnog opsega. Po{to nema dokaza za generalno smanjenje broja, ili pozicije razmene na hromozomima sa staro{}u, ovo nagove{tava da nema proizvodne linije koja bi prouzrokovala da oociti sa nesavr{enom rekombinacijom ostanu u jajniku sve do poznog materinskog doba. Umesto toga, predloèn je dvostruki model two-hit model koji pretpostavlja da su hromozomi sa osetljivom konfiguracijom prisutni u oocitima u svim starosnim dobima majke. Takvi hromozomi se odvajaju sa velikom ta~no{}u u citoplazmi mladog oocita, ali ne uspevaju da se pravilno odvoje unutar ooplazme starije ène. Smanjena kompetentnost oocita da odvoje hromozome u mejozi nije bazirana na opstanku specifi~ne grupe oocita sa predodre|enim {ablonom devijantne rekombinacije. Transfer citoplazme u oocite kori{}en za IVF - in vitro fertilisation, nije imao nepovoljan uticaj na potomstvo, ali je jo{ uvek kontroverzan. Transfer citoplazme sa mitohondrijama je kori{}en za spre~avanje apoptoze kod oocita i smatra se da moè da

294


pomogne razvojnoj kompetentnosti. Uzimaju}i u obzir posledice heteroplazmije mitohondrijske DNK - deoksiribonukleinske kiseline i smetnje transkripcije na razvoj i jo{ uvek nepoznatih posledica starenja po sklop hromozoma, potrebno je jo{ istraìvanja pre nego {to se nuklearni, ili citoplazmati~ni transfer moè razmatrati u rutinskoj klini~koj primeni.

u profazi, oociti ne sadrè parove centriolarnih MTOC - microtubule organizing center-a, ve} imaju vi{estruke acentriolarne MTOC - microtubule organizing center.

Sl. 4.91- MTOC - microtubule organizing center

Sl. 4.90- Hromozomi

Od posebnog je zna~aja regulacija niti deobnog vretena i aktivnosti kinaze pri starenju oocita. Osim od rekombinacije, odvajanje hromozoma zavisi i od prisustva funkcionalnih citoplazmati~nih niti deobnog vretena i spaciotemporalne kontrole odvajanja hromozoma u prvoj i drugoj mejozi. Formiranje citoplazmati~nih niti deobnog vretena zahteva polimerizaciju tubulina, kao aktivnost pokretnih mikrotubularnih proteina iz familije dineina i kinezina i zavisno od ciklusa }elijske aktivnosti kinaze, fosfataze i odgovaraju}e jonske homeostaze. Za razliku od ve}ine mitotski deljivih somatskih }elija i spermatocita, koji poseduju dva polarna mikrotubularna organizaciona centra, MTOC - microtubule organizing center, parove centriola koje u~estvuju u formiranju bipolarnih niti deobnog vretena

Hromozomi regrutuju ove MTOC microtubule organizing center nakon GVBD - germinal vesicle breakdown radi uspostavljanja cilindri~nih anastralnih niti deobnog vretena.

Sl. 4.92- GVBD - germinal vesicle breakdow

Vi{estruki MTOC - microtubule organizing center se sastavlja na ravnim, plo~astim polovima niti deobnog vretena. Mikrotubule kod citoplazmati~nih niti deobnog vretena oocita su veoma dinami~ne sa brzom kinetikom depolimerizacije i repolimerizacije. In vitro studije koje su koristile M - fazu ooplazme àbe xenopus, ili ooplazmati~ne fragmente mi{a koji su


sadràli faktor unapre|enja sazrevanja, MPF - maturation promoting factor i mitogenske proteinske kinaze, MAP - mitogen activated protein kinaze, su pokazale da ooplazma ki~menjaka sadrì sve komponente za formiranje bipolarne niti deobnog vretena, ~ak i u odsustvu MTOC - microtubule organizing center-a, pa i u odsustvu hromozoma. Pokreta~ki proteini i visoko energetski supstrati kao ATP - adenosine triphosphate i GTP - guanosine triphosphate su neophodni za polimerizaciju i za sortiranje, uvezivanje i organizovanje vlakana niti deobnog vretena.

295

a koja pripadaju mikrotubulskim pokreta~kim proteinima iz familije sli~ne kinazi, ne uti~u na formiranje niti deobnog vretena, poravnavanje hromozoma i odvajanje u somatskim }elijama.

Sl. 4.95- Lokalizacija kinezin HSET (crven) proteina u metafazi, hromozomi su plave boje

Sl. 4.93- ATP - adenosine triphosphate

Sl. 4.94- GTP - guanosine triphosphate

Antitela koja se protive pokreta~kom proteinu HSET - kinesin related protein-u,

Lokalna dostupnost visoko energetskih supstrata za aktivnost mejoti~ke kinaze i pokreta~kih proteina je tako|e od va`nosti, jer poreme}aji u broju mitohondrija, njihovoj aktivnosti, raspodeli i membranskom potencijalu mogu imati veliki uticaj na regulaciju odvajanja hromozoma. Ekspresija MOS - serine / threonine protein kinaze i MAP - mitogen activated protein kinaze su potrebni za odràvanje odgovaraju}e dinamike i morfologije niti deobnog vretena kao i za formiranje polarnog tela kod oocita. Integritet niti deobnog vretena u drugoj mejozi zahteva izbacivanje MISS - meiotic spindle stability protein -a (AMH - anti Mullerian hormone), interakcije MAP - mitogen activated protein kinaze i stabilizacije niti deobnog vretena, MAP - mitogen activated protein kinase interacting and spindle stabilizing protein-a. Ovo nagove{tava da oociti mogu biti jedinstveno osetljivi na ugroèno funkcionisanje, ili ekspresiju takvih regulatornih molekula i genskih produkata koji su

296


potrebni za formiranje i stabilnost anastralnih niti deobnog vretena. Smanjene kompetentnosti oocita pokazuje se i neuspehom kongresije. Poja~ana polarizaciona mikroskopija, polscope, o ~emu }e detaljno biti re~i kasnije, pruà na~in za neinvazivnu analizu morfologije niti deobnog vretena kod ìvih oocita pomo}u svojih birefrigentnih osobina, baziranih na prisustvu ure|enih parakristalnih snopova mikrotubula. Oociti koji ne sadrè birefrigentne niti deobnog vretena, usled odsustva niti deobnog vretena ili neure|enih vlakana niti deobnog vretena, imaju niì razvojni potencijal u odnosu na one sa vidljivom strukturom. Polscop se moè upotrebiti za procenu razvojne kompetentnosti ljudskih oocita kod èna koje se pribliàvaju perimenopauzi i za izbor najboljih oocita iz kohorta oocita dobijenih od starijeg pacijenta. Pored karakteristi~nih poreme}aja koji se mogu videti sa polscopom, imuno tubulinska analiza ljudskih oocita koji poti~u od starijih èna je tako|e otkrila ~est neuspeh hromozoma da se okupe u procesu poravnavanja hromozoma na ekvatoru. Poravnavanje hromozoma se ne moè videti kod ìvih oocita. Smetnje u poravnavanju hromozoma i odvajanju povezane su sa iscrpljivanjem folikularnog pool-a, a ne sa hronolo{kom staro{}u ène. Saglasno ovom konceptu, neuspeh kongresije i aneuploidnosti su uobi~ajeni kod oocita sa poreme}enom folikulogenezom i rastom. Smatra se da su ugroèna folikulogeneza i poreme}ene veze izme|u kompetentnosti nukleusa, citoplazme i aberacija niti deobnog vretena, posledica neporavnatih hromozoma i gre{aka u odvajanju hromozoma u oocitima. Poreme}eni }elijski ciklus i trenutak odvajanja hromozoma u genezi aneuploidnosti su od posebnog zna~aja.

Zapaànja vezana za ure|enje hromozoma neoplo|enih ili doniranih in vivo ili in vitro sazrelih oocita i analiza kinetike sazrevanja starih oocita, nagove{tavaju da postoji korelacija izme|u devijantne mejotske progresije i smanjene razvojne kompetentnosti. Stariji oociti ~esto poseduju jedan hromatid ili parove hromatida u drugoj metafazi zbog preranog odvajanja sestrinskih hromatida u prvoj anafazi, ili preuranjenog gubitka kohezije centromera pre druge anafaze. Neuravnoteèna ili uravnoteèna pred-deoba predstavlja visok rizik za gre{ke u drugoj mejozi i aneuploidnosti, pa se smatra da je preuranjen gubitak kohezije hromozoma glavni mehanizam koji je odgovoran za starosne gre{ke u odvajanju hromozoma. Studije koje su koristile fluorescentnu in situ hibridizaciju, FISH - fluorescence in situ hybridization metodu sa hromozom specifi~nim sondama kod analize prvog i drugog polarnog tela, ili kod hromozomne analize neoplo|enih ili doniranih ljudskih oocita, potvr|uju ideju o dva mehanizma nepravilnog odvajanja, ali tako|e pokazuju da nondisjunkcija ~itavog hromozoma zna~ajno doprinosi aneuploidnosti kod ~oveka. Ispravno odvajanje hromozoma u prvoj mejozi zahteva da sestrinske hromatide rekombinovanih homolognih roditeljskih hromozoma ostanu zaka~ene jedna za drugu, ili du` ose hromozoma, naro~ito distalno u odnosu na hiazmate, sve do prve anafaze. Rastvaranje hiazmate u prvoj anafazi zavisi od gubitka kohezije me|u sestrinskim hromatidama distalno od mesta razmene, osim kod centromera. Tokom normalne mejoze, kohezija me|u centromerama sestrinskih hromatida se gubi u drugoj anafazi, {to je sli~no mejozi. Kompleks visoko o~uvanih kohezionih proteina, koji se mogu na}i kod somatskih i mejotskih }elija, posreduju u spajanju me|u hromozomima.

297


Sl. 4.96 - APC - anaphase promoting complex

Proteoliza drugih proteina, koji zapo~inju anafazu, zavisi od aktivnosti APC -anaphase promoting complex-a, kompleksa unapre|enja anafaze, ubikvitinske ligaze koja, tako|e, inicira degradaciju ciklina B, {to dovodi do inaktivacije MPF maturation promoting factor-a.

APC - anaphase promoting complex se reguli{e i blokira kaskadom doga|aja pokrenutih neporavnatim hromozomima, koji nisu pod tenzijom spoja, niti deobnog vretena sa suprotnim polovima. Kontrola u prolaznim ta~kama, checkpoint control, bitna je za redukciono odvajanje hromozoma

Sl. 4.97- MPF - maturation promoting factor

298


u prvoj anafazi. Odlaganje prve anafaze polaznim ta~kama niti deobnog vretena se ispoljava kasnije tokom sazrevanja oocita i zavisi od stabilnosti spoja vlakna niti deobnog vretena sa hromozomima. Po{to oociti mogu napredovati do prve anafaze, bez obzira na prisustvo univalenata i neuspeha kongresije, mogu}e je da imaju relativno propusnu prolaznu ta~ku, naro~ito pod uslovima kada oociti ne uspeju da steknu punu mejotsku i razvojnu kompetentnost u ovarijumu starije ène. Ovo predstavlja rizik za gre{ke u odvajanju hromozoma, po{to su prolazne ta~ke, koje deluju kao ~uvari, permisivne. Predaja, stabilnost, izbacivanje i ekspresija produkata gena, kao {to su hrec 8 human rec8 gen, ili proteini, koji su ume{ani u monopolarnu orijentaciju centromera sestrinskih hromatida kod homologa u prvoj mejozi, na primer monopolina, nisu utvr|eni sve do danas. Ne zna se da li produèn zastoj u razvoju oocita u diktatnoj etapi moè na kraju dovesti do gubitka kohezije, inicirati preventivno odvajanje hromozoma i na taj na~in,

u odsustvu kontrole prolaznih ta~aka, doprineti visokim {ansama za nasumi~no odvajanje hromozoma kod starih oocita. Prevremena separacija homologa je otkrivena kod oocita, koju su ostvarili nakon ovulacije, ili su oociti zadràvani u prvoj mejozi izlaganjem specifi~nim hemikalijama. Oociti starijih èna sazrevaju sporije in vitro. Naro~ito kratki hromozomi iz grupe E i G prolaze kroz pred-deobu kod humanih oocita. U ovom trenutku je potrebno jo{ informacija o statusu hromozoma kod humanih oocita u prvoj metafazi radi utvr|ivanja da li stariji oociti nose funkcionalne univalente. Pre poku{aja sa zamenom citoplazme kod starijih oocita sa citoplazmom mladih donora, va`no je znati da li su originalno hiazmati~ni, prerano odvojeni univalenti prisutni i da li predstavljaju rizik za gre{ke u segregaciji, koje se ne mogu kompenzovati donacijom komponenata citoplazme. Za razliku od drugih tipova }elija, oociti sisara ispoljavaju mejotski zastoj u drugoj metafazi. U zastoju posreduje aktivnost citostati~kog faktora CSF - cytostatic factor.

Sl. 4.98- CSF - cytostatic factor


CSF - cytostatic factor zastoj zavisi od aktivnosti MOS - serine /threonine protein kinaze i MAP- mitogen activated protein kinaze. Ribozomna p 90 RSK - ribosomal S6 kinase, proteinska kinaza aktivira kinazu Bub1 prolazne ta~ke niti deobnog vretena sa inhibicijom APC - anaphase promoting complex-a koja je potrebna za metafaznu i anafaznu tranziciju.

Sl. 4.99- APC - anaphase promoting complex

Druge putanje koje u~estvuju u metafaznom zastoju verovatno obuhvataju inaktivaciju APC - anaphase promoting complex-a pomo}u proteina MAD 2 - mitotic arrest deficiency 2 protein-a, koji je zadràn u kinetohorama centromera pogre{no poravnatih hromozoma u mitozi i koji je prisutan kod poravnatih hromozoma u oocitima sisara, koji su u zastoju druge metafaze. Stariji oociti sadrè manje Mad 2 mitotic arrest deficiency 2 protein mRNK messenger ribonucleic acid u pore|enju sa onima kod mladih èna. E mi1 je jo{ jedna komponenta koja inhibira APC - anaphase promoting complex kod oocita. Deregulacija ovog i drugih genetskih produkata za regulisanje }elijskog ciklusa, moè doprineti gubitku kontrole, putem prolaznih ta~aka, checkpoint control i prevremenog otka~injanja i nasumi~ne segregacije starijih hromozoma, {to rezultuje smanjenom

299

kompetentno{}u za normalan razvoj nakon oplodnje. Funkcija mitohondrija, snabdevanje kiseonikom i disgeneza niti deobnog vretena su dalji elementi za razmatranje. Mitohondrije su naro~ito oboga}ene u blizini niti deobnog vretena oocita. Sedativ diazepam se vezuje za periferni benzodiazepanski receptor mitohondrije, mPBR mitochondrial peripheral benzodiazepine receptor, koji je uklju~en u funkcionalnu strukturu odre|enu kao tranziciona pora permeabilnosti koja kontroli{e potencijal membrane i apoptozu. Diazepam podsti~e smetnje u udruìvanju mitohondrije sa nitima deobnog vretena kod oocita i uzrokuje mejotsko zadràvanje ili zastoj. Ovaj tretman ometa okupljanje, kongresiju hromozoma i uzrokuje aneuploidnost. Starenje Leydigovih }elija kod mu{kog pola je u vezi sa smanjenim izbacivanjem, ekspresijom mPBR - mitochondrial peripheral benzodiazepine receptor-a, koji doprinosi smanjenom kori{}enju holesterola i zamenama u steroidogenezi. Izbacivanje mPBR - mitochondrial peripheral benzodiazepine receptor-a jo{ uvek nije analizirano kod starih jajnika. Trenutno postoji polemika o u~e{}u mutacija ili brisanja mitohondrijske DNK deoksiribonukleinske kiseline i o ulozi reaktivnih tipova kiseonika ROS - reactive oxygen species, lipidnoj peroksidaciji i {teti na mitohondrijima pri smrti }elije, ili starosnoj smanjenoj kompetentnosti sazrevanja i razvoja oocita. Efikasnost mitohondrijske respiracije je kod oocita i preimplantacionih embriona u bliskoj korelaciji sa programiranom brzinom razvoja embriona, a u obrnutoj vezi sa staro{}u majke. Proces je kompleksan, jer brojevi mitohondrija variraju unutar kohorta pojedina~nih oocita

300


kod razli~itih pacijenata, ali tako|e i kod istog pojedinca. Mitohondrije sa visokom aktivno{}u i membranskim potencijalom zauzimaju odre|ena mesta unutar ooplazme i njihova raspodela tokom rane deobe moè uticati na razvojnu kompetentnost. Generalno se ~ini da kohorti ljudskih oocita sa uporedivo visokim nivoom ATP - adenosine triphosphate imaju bolji razvojni potencijal u pore|enju sa onima sa niskim sadràjem ATP - adenosine triphosphate. Smanjena vaskularizacija i snabdevanje kiseonikom su odgovorni za starosne smetnje pri formiranju niti deobnog vretena i za hromozomnu segregaciju kod oocita, pre mitohondrijske disfunkcije i smanjene produkcije ATP - adenosine triphosphate. Naro~ito somatski odeljak u folikulu zavisi od dovoljnog dovoda kiseonika za oksidativnu fosforizaciju i tereoizogenezu. Smanjenje u ravnoteì kiseonika tokom kultivisanja preantralnog folikula ozbiljno uti~e na opstanak folikula, rast oocita i sazrevanje. Smanjenje snabdevanja kiseonikom okoline oocita gajenih in vitro u kulturi preantralnog folikula, nakon obnavljanja sazrevanja podstaknutog gonadotropinom, zna~ajno smanjuje napredak ka drugoj metafazi. Ovo, tako|e, ometa kongresiju, okupljanje hromozoma na metafaznoj plo~i. Sli~no je zapaènje kod spontano ovuliranih oocita koji su sazreli in vivo kod èna sa iscrpljenim folikulima. Nasuprot situaciji unutar folikula, izolovani oocit druge metafaze i preimplantacioni embrioni su veoma osetljivi na povi{eni kiseonik i oksidativni stres, tako da kultura sa 5% CO2 u vazduhu moè izazvati mitoti~ku nondisjunkciju. Blago izlaganje peroksidu zna~ajno smanjuje razvojnu kompetentnost embriona.

S obzirom da rast oocita i folikulogeneza mogu trpeti zbog manjeg snabdevanja kiseonikom, naro~ito kod pacijenata sa iscrpljenim folikulima, selekcija najvaskularnijih folikula je naro~ito va`na u optimizaciji tretmana asistirane reprodukcije. Dodatne studije su potrebne radi procene prediktivne vrednosti niskih, ili visokih koncentracija komponenti u folikularnom fluidu koje mogu biti u vezi sa kompetentno{}u oocita, kao {to su VEGF - vaskular endothelial growth factor, faktori rasta sli~ni insulinu, inhibini, aktivini ili angiogenin. Uloga mutacija na mitohondrijama pri funkcionisanju somatske }elije, apoptoze i izmenjenog odziva i steroidogeneze kod folikula koji miruju u ovarijumu tokom duèg perioda, nije bila analizirana, ali doprinosi pove}anom broju smrti granuloznih }elija i na taj na~in indirekto smanjuje kompetentnost oocita. ]elije koje prethode oocitima, primordijalne }elije zametka i oogonije, sadrè relativno mali broj mtDNK - mitochondrial DNK, i ovo moè pomo}i u za{titi oocita od mitohondrijskih insuficijencija, budu}i da nema dokaza za selekciju protiv visokih nivoa patogenih ta~kastih mutacija mtDNA mitochondrial DNK u oogenezi, u ranom razvoju embriona, ili u razvoju fetusa.

Sl. 4.100- mt DNK - mitochondrial DNK


Sticanje kompetentnosti, regulacija ekspresije i aneuploidnosti kod starih oocita su od posebnog zna~aja. Oociti sti~u visoku kompetentnost razvoja i sazrevanja tokom prepubertalnog i postpubertalnog ìvota i tokom folikulogeneze i rasta oocita. Rast oocita je period kada parakrine i autokrine interakcije unutar folikula sprovode ekspresiju na transkripcionom i translacionom nivou, {to snabdeva oocite sa svim faktorima neophodnim za podupiranje rane embriogeneze, sve dok ne po~ne zigotska aktivacija gena. Imprinting tokom rasta oocita je vaàn za sticanje kompetentnosti po{to kontroli{e razvoj i ekspresiju gena iz imprintiranih lokacija. Niska razvojna kompetentnost oocita, sazrelih in vitro do druge metafaze je povezana sa odsustvom specifi~nih proteina u oocitu. Neadekvatno uparivanje izme|u oocita i granuloznih }elija, kod starijih jajnika, moè izazvati poreme}aje u ekspresiji oocita. Prate}e granulozne }elije igraju aktivnu ulogu u modulisanju kondenzacije hromatina i u transkripcionoj aktivnosti oocita, {to je potrebno za visoku razvojnu kompetentnost. Produèna inaktivacija transkripcije u GV - germinal vesicle fazi, pre obnavljanja sazrevanja, ometa visoku preciznost segregacije hromozoma kod oocita. Sticanje kompetentnosti sazrevanja zavisi od ekspresije i raspodele genskih produkata koji kontroli{u }elijski ciklus. Kontinuirana sinteza ciklina B je potrebna za sazrevanje i zastoj u drugoj metafazi. Zbog toga interakcije izme|u somatskih i }elija zametka, pogor{ane staro{}u, mogu ozbiljno uticati na sudbinu oocita. Permisivne prolazne ta~ke kontrole bi pove}ale uticaj manjih smetnji, na primer u slu~ajevima kada je kohezija hromozoma prerano izgubljena. Otkriveno je

301

da sterol aktivacije mejoze iz folikularnog fluida, FF-MAS - follicular fluid meiosis activating sterol koji proizvode folikularne }elije, smanjuje pred-deobu sestrinskih hromatida kod oocita sazrelih do druge metafaze bez kumulusa, a pod suboptimalnim uslovima uzgajanja. Retardacija starenja citoplazme supstancama kao {to je FF-MAS - follicular fluid meiosis activating sterol i optimiranje uslova kultivacije se moè smatrati kao nov pristup u zadràvanju visoke razvojne kompetentnosti oocita. Kao i kod drugih metoda, neophodno je dalje istraìvanje radi kriti~ke analize metabolizma i procene uticaja ugljenih hidrata, amino kiselina, faktora rasta i supstanci sli~nih hormonima, kao {to je FF-MAS - follicular fluid meiosis activating sterol, koje se nalaze u medijumu kulture, na sazrevanje oocita i razvojnu kompetentnost. Neke posledice starenja, kao uravnoteèna pred-deoba, se mogu prevazi}i kultivisanjem in vitro humanih oocita pod odgovaraju}im uslovima. Na sli~an na~in bi se mogli spre~iti i {tetni uticaji mikro sredine na folikulogenezu i kompetentnost oocita u kulturi folikula. Iscrpljivanje folikula, a ne hronolo{ko starenje uti~e na smanjenje broja oocita i njihovu kompetentnost, kao i sklonost ka nondisjunkciji. Veruje se da unilateralna ovariektomija smanjuje uspeh kod IVF - in vitro fertilisation. Neke statistike su pokazale da smanjenje veli~ine pool-a hirur{kim putem, moè pove}ati rizik za~e}a deteta sa trizomijom 21. @ene sa trizomi~nim spontanim abortusom su dostigle menopauzu ranije od onih èna sa hromozomno normalnim poro|ajem ili abortusom. Pacijenti iz razli~itih starosnih grupa sa sli~no visokim bazalnim serumom FSH follicle stimulating hormona i visokim

302


koncentracijama estradiola, koji proizvode samo tri ili manje oocita nakon rutinske FSH - follicle stimulating hormone stimulacije, imaju veoma lo{ ishod IVF - in vitro fertilisation tretmana. Oociti i embrioni, od pacijenata sa lo{im odzivom, imaju pove}an broj aneuploidnosti. Smanjenja folikularne rezerve se obi~no dovodi u vezu sa odre|enim izmenama gonadotropina i faktora rasta u serumu i folikularnom fluidu. Nivoi FSH - follicle stimulating hormona se pove}avaju u serumu tokom tre}eg dana menstrualnog ciklusa usled parakrine funkcije folikula. U nekim radovima je utvr|eno da povi{eni FSH - follicle stimulating hormone, kada se dovede u vezu sa iscrpljenim jajnikom, moè biti faktor rizika za nastanak Daunov-og sindroma, dok samo povi{eni FSH - follicle stimulating hormone ima nisku prediktivnu vrednost za aneuploidnost i sniènu kompetentnost. Snièni inhibin B u folikularnoj te~nosti je posluìo kao dodatni efikasni marker folikularnog razvoja i bio je koristan u predvi|anju broja oocita i kvaliteta embriona. Nivoi bazalnog E2 (<75-80 pg/ml) su bili prediktivni u pogledu kompetentnosti oocita u IVF - in vitro fertilisation. Broj antralnih folikula u ranoj folikularnoj fazi je imao prediktivnu vrednost, naro~ito u kombinaciji sa povi{enim FSH follicle stimulating hormone. @ene sa redovnim normalnim ovulatornim ciklusom, sa prethodno lo{im odgovorom na ovarijalnu hiperstimulaciju kod IVF - in vitro fertilisation, su ~esto ispoljavale karakteristike folikularne faze koja indicira starenje jajnika. Hormonska stimulacija ne moè kompenzovati gubitak folikularne rezerve, pa se slab ishod ciklusa sa inicijalno lo{im odgovorom na kontrolisanu ovarijalnu

hiperstimulaciju ne moè spre~iti udvostru~avanjem ili pove}avanjem HMG - human menopausal gonadotrophin doze posle 5 dana od stimulacije. Iz svega navedenog jasno je da multivarijantna analiza ovarijalne rezerve moè pomo}i u predvi|anju ukupnog broja oocita, njihove kompetentnosti i ishoda IVF - in vitro fertilisation. Pregled ovarijalne rezerve i epidemiolo{ke studije plodnosti pokazuju da se finalna etapa reproduktivnog starenja, ozna~ena menopauzom, u mnogome razlikuje me|u ènama. Osim uticaja sredine, specifi~nih promena ili hemoterapije, koji mogu izazvati preuranjenu ovarijalnu hipofunkciju, POF - premature ovarian failure, ~ini se da je starost, pri prirodnoj menopauzi, uglavnom odre|ena interakcijom vi{e gena, na primer onih koji uti~u na veli~inu osnovne populacije folikula kao i na stepen atrezije. Dokazana je pozitivna korelacija izme|u menopauza majki i }erki. Uporedne studije, tako|e, nagove{tavaju snaàn genetski faktor u odre|ivanju starosti pri kojoj dolazi do menopauze. Posledica ovoga je da je èna sa porodi~nom istorijom rane menopauze i sama izloèna riziku ranog prestanka reprodukcije. Osim utvr|ivanja ovarijalne rezerve, identifikacija genetskih determinanti veli~ine pool-a i faktora koji uti~u na folikul i opstanak oocita i njegov razvoj, kao i rizik od nondisjunkcije i smanjene kompetentnosti oocita, bi}e od velikog interesa u budu}nosti. Do danas je identifikovano tek nekoliko gena koji uti~u na opstanak oocita i aneuploidnosti, broj primordijalnih folikula i njihovrazvoj, i opstanak i starost pri kojoj nastupa menopauza. Iscrpljivanje ovarijalnih folikula se kod fetusa obavlja putem svojstvenih mehanizama


apoptoze u oocitima, a kasnije tokom ìvota odrasle jedinke opstanak rastu}ih folikula moè biti primarno odre|en apoptozom granulosa }elija. Za poreme}aje u uparivanju i rekombinaciji, tokom rane oogeneze unutar ovarijuma embriona, se zna da izazivaju mejotski zastoj, ozbiljno iscrpljivanje veli~ine pool-a i aneuploidnost kod nekoliko preostalih oocita sa niskom razvojnom kompetentno{}u. Kod ìvotinjskih modela, homozigotne mutacije gena, koji su u rekombinaciji, ~esto rezultuju sterilitetom, bez obzira na opstanak nekih }elija zametka. Moè se o~ekivati da aleli sa blaìm fenotipom postoje i da mogu doprineti POF - premature ovarian failure i ranom riziku aneuploidnih oocita sa ugroènim razvojnim potencijalom. Primarno se numeri~ke ili strukturalne hromozomne aberacije, kao one kod Tarnerovog sindroma ili gonadalne mozai~nosti hromozomnih abnormalnosti, povezuju sa sterilitetom ili subplodno{}u, koji su rezultat preranog iscrpljivanja veli~ine pool-a, iako folikuli mogu preìveti do odraslog doba. Za smanjenje broja ovarijalnih folikula, bilo zbog X mutacija koje uti~u na atreziju oocita ili restrikcije po~etne veli~ine pool-a tokom razvoja, veruje se da je uzrok za visok rizik od ponovljenog spontanog abortusa koji je u vezi sa hromozomnom neravnoteòm kod nekih pacijenata sa neslu~ajnom iskrivljenom X inaktivacijom. Tako|e se o~ekuje da mutacija gena, koje podsti~u ili {tite od folikularne apoptoze, moduli{u trajanje reproduktivnog ìvotnog veka, ovarijalno iscrpljivanje i kompetentnost oocita. Genetska baza mehanizama popisa, putem koga se vi{ak primordijalnih folikula pri ro|enju detektuje i uklanja iz jajnika do deoba, ili koji {titi od atrezije je jo{ uvek nepoznata.

303

Oksid azota se pojavio kao za{tita folikula od atrezije, putem podsticanja proteina toplotnog {oka, HSP70 - heat shock protein i potiskivanjem apoptoze podstaknute bax genom.

Sl. 4.101- HSP 70 - heat shock protein 70

Kratkoro~ni tretman pacijenta sa L-arojininom u stimulisanim ciklusima radi podsticanja oksida azota i podizanja folikularnog vaskulariteta je nepovoljno uticao na kvalitet embriona i broj trudno}a. Ostali faktori koji se dovode u vezu sa indukcijom apoptoze oocita uklju~uju GnRHgonadotropin releasing hormon agoniste, povla~enje estrogena, androgene, interleukin-6, vezuju}i protein faktora rasta sli~an insulinu i faktor nekroze tumora. Faktori koji smanjuju ovarijalnu apoptozu su gonadotropini, LH - luteinizing hormone i FSH - follicle stimulating hormone, hormon rasta, faktor-1 rasta, nalik insulinu, interleukin -1, epidermalni i osnovni faktor rasta fibroblasta. Nedavni izve{taji dalje podvla~e va`nost hormonalne homeostaze i ekspresiju funkcionalnog faktora rasta i faktora opstanka potrebnih za plodnost i kompetentnost oocita. Pored faktora inhibitora leukemije, LIF - leukemia inhibitory factor, postoje dokazi da insulin, preko insulinskih receptora, pomaè u koordinaciji tranzicije

304


primordijalnog u primarni folikul na nivou oocita, {to dovodi dijabetis u vezu sa plodno{}u i mo`da kompetentno{}u oocita. Status FSH - follicle stimulating hormona je va`na determinanta u starenju jajnika po{to haploinsuficijencija podsti~e ubrzano reproduktivno starenje. Mutacije FSH receptora i mutacije FOXL2 - forkhead transcription factore gene, genskog mapinga na X hromozomu su u~estvovale u ranoj menopauzi. îni se da AMH - anti-Mullerian hormone, spre~ava rast primarnog folikula, pa prema tome moè biti kandidat za produènje reproduktivnog ìvotnog veka. Koncentracije AMH - anti-Mullerian hormone-a su smanjene kod starijih èna i mogu posluìti kao novi marker ovarijalnog starenja i smanjene kompetentnosti. Smanjenje ekspresije AMH - anti-Mullerian hormone-a moè doprineti brzom iscrpljivanju pool-a folikula kod premenopauzalnih èna. Ostali geni sa produktima koji su ume{ani u starenje ili POF - premature ovarian failure, kada se dereguli{u, tako|e mogu imati vezu sa smanjenom kompetentno{}u oocita kao rezultat iscrpljenog pool-a folikula, ili devijantne }elijske signalizacije izme|u oocita i somatske }elije. Tehnologija otcepljenja gena, gene chip tehnology je nedavno dovela do otkri}a pentraksina PTX3 - pentraxin related gene, novog faktora podstaknutog pomo}u GDF9 - growth differentiation factor 9 u granuloza }elijama preovulatornih folikula. Manjak PTX3 - pentraxin related gene izaziva subfertilnost usled defekta u integritetu kompleksa kumulusnih }elija i oocita. Agresivna hemoterapija moè izazvati POF - premature ovarian failure dok je gra|a hromozoma i kompetentnost preìvelih ovularnih oocita, koji poti~u od delimi~no iscrpljenog pool-a folikula èna tretiranih

agonisti~nim analognim hormonom koji osloba|a gonadotropin, za sada nepoznata. Zna~aj ishrane, na~in ìvota i delovanje sredine na kompetentnost oocita, sa odmi~u}im maj~inskim godinama, tek treba analizirati. Oralni kontraceptivi visokih doza polako, ali zna~ajno smanjuju starost pri kojoj po~inje menopauza. Ovo moè biti razlog aditivnog uticaja kontracepcije i pu{enja na rizik od trisomije 21 zajedno sa drugom mejotskom nondisjunkcijom kod oocita. Testovi odre|ivanja folikularne rezerve kao i analiza porodi~ne istorije, predodre|enosti polimorfizmima, mutacija ili na~ina ìvota i faktora okoline }e u budu}nosti postati korisni za predvi|anje kompetentnosti oocita kod èna koje se pribliàvaju premenopauzi, ili kod mla|ih pacijenata koji su doìveli prerani prestanak funkcije jajnika koji je u vezi sa preuranjenim iscrpljenjem pool-a folikula. Kompetentnost, morfologija i sklop hromozoma su od posebnog zna~aja. Pronuklearni skoring i biopsijski pregled polarnog tela na aneuploidnost su metode koje se mogu primeniti za izbor kompetentnih oocita, kod èna koje se pribliàvaju menopauzi. Aneuploidnost kao najva`niji etiolo{ki faktor u smanjenoj kompetentnosti ne podsti~e uskla|enu devijantnu morfolo{ku osobinu kod starijeg oocita, ili kod njegovog embriona koji }e se iskoristiti u proceni kompetentnosti. Dok se ~ini da monozomija autozoma uti~e na opstanak i razvoj preimplantacionog embriona, trizomija se ne moè prepoznati dismorfologijom i vi{e od jedne tre}ine svih trizomi~nih embriona moè sti}i do stadijuma blastociste. Odsustvo prolaznih ta~aka, checkpoint koje detektuju hromozomske aberacije i osetljivost preimplantacionog embriona na mitoti~ku nondisjunkciju,


pod suboptimalnim uslovima uzgajanja moè doprineti mozai~nosti i smanjenoj razvojnoj kompetentnosti starih oplo|enih oocita nakon IVF - in vitro fertilisation. Velika mozai~nost je detektovana u blastocisti dobijenoj od aneuploidnog embriona i u blastocisti sa normalnom morfologijom. Prema tome, produèno kultivisanje se ne ~ini korisnim pri selekciji embriona koji nisu hromozomno devijantni. Blastomere jednakih veli~ina mogu biti jedini morfolo{ki parametar za koji se zna da je povezan sa normalnom konstitucijom hromozoma. Identifikacija gena, koji moduli{u doba menopauze, }e doprineti predvi|anju starosnih rizika za smanjenu kompetentnost oocita, kao i savetovanje pacijenata o izgledima uspeha IVF - in vitro fertilisation. Na }elijskom nivou je smanjena kompetentnost starih oocita primarno bazirana na gre{kama u segregaciji hromozoma u oogenezi. Nondisjunkcija, odnosno gre{ke u segregaciji ~itavih hromozoma, kao i prevremen gubitak kohezije me|u sestrinskim hromatidima u prvoj mejozi i pre druge anafaze doprinose aneuploidnosti, i to pre svega, susceptibilnih hromozomnih konfiguracija. îni se da su susceptibilni hromozomi prisutni u oocitima kod svih starosnih doba, ali ne uspevaju da se obrade na odgovaraju}i na~in u staroj ooplazmi. Dok mehanizmi prolaznih ta~aka, checkpoint, koji detektuju nedostatke uparivanja u prvoj profazi i nezaka~ene, ili neporavnate hromozome u metafazi, {tite od gre{aka u segregaciji hromozoma u spermatogenezi. Prolazne ta~ke su prili~no permisivne kod oogeneze sisara. Poreme}aji u formiranju niti deobnog vretena, nedovoljna ekspresija komponenti za kontrolu putem prolaznih ta~aka i neodgovaraju}e

305

snabdevanje visoko energetskim supstratima za pokreta~ke proteine i za aktivnost mejotskih kinaza, na primer usled ugroène mitohondrijske funkcije i raspodele, moè biti naro~ito kriti~na kod starih oocita. Neuspesi okupljanja hromozoma, poravnavanje hromozoma na ekvatoru niti deobnog vretena su karakteristi~ni za stare oocite kao i one dobijene iz ugroène folikulogeneze. Biopsija polarnog tela, ili preimplantaciona genetska dijagnoza PGD - preimplantation genetic diagnosis oocita i embriona je pove}ala broj implantacija kod starijih pacijenata. Lokalizacija i morfologija pronukleusa i obeleàvanje embriona moè biti korisno za selekciju, dok se o rizicima i koristima produène kultivacije embriona, jo{ uvek raspravlja. Trenutno su metode za pobolj{anje kompetentnosti starih oocita i pobolj{anje njihovog rasta kao i za sticanje kompetentnosti sazrevanja i razvoja, jo{ uvek u ranoj fazi. Rizici koji su povezani sa metodama kao {to je transfer citoplazme, nuklearna razmena i in vitro sazrevanje za pobolj{anje interakcija oocit-somatska }elija i sinhronizma u procesu sazrevanja citoplazme i jedra, moraju biti dalje ispitani pre nego {to po~nu da se koriste u rutinskoj praksi. Molekularnim testiranjem i transgenskom metodologijom }e se dobiti nove informacije. Tehnologija otcepljivanja, ciljanog rascepljivanja gena, omogu}i}e dobijanje novih markera i metoda za predvi|anje i, ~ak, pobolj{anje kompetentnosti oocita kod ljudi sve do poodmaklog reproduktivnog doba. Otkrivanje uslova koji odlaù iscrpljivanje primordijalnog pool-a folikula omogu}i}e o~uvanje plodnosti i kompetentnost oocita u odmaklom maj~inskom dobu.

306


Trenutno nema dokaza da hiperstimulacija pove}ava aneuploidnost oocita ili da izaziva gubitak kompetentnosti oocita. U skladu sa tim, iskustva sa ponovljenom hiperstimulacijom kod doniranja oocita od mladih èna nagove{tava da nema nepovoljnog uticaja na kompetentnost oocita. Posledice uzastopne i ponovljene hiperstimulacije, radi pobolj{anja {ansi za prirodno za~e}e, i u tretmanu ciklusa asistirane reprodukcije, jo{ uvek treba ispitati u vezi sa njihovim potencijalnim sinergi~nim dejstvom. Oociti starijih pacijentkinja imaju niù razvojnu kompetentnost, jer poti~u od ugroènih folikula koji nisu odgovaraju}e odgovorili na stimulaciju. Vlakna deobnog vretena ovakvih oocita brzo degeneri{u. Zamrzavanje i odmrzavanje imaju dodatne {tetne uticaje na organizaciju mejoti~kog vlakna deobnog vretena oocita krioprezerviranih tokom obe, GV - germinal vesicle i M2 faze. Brzina apoptoze nezrelih oocita kultivisanih u in vitro uslovima je bila zna~ajno ve}a kod oocita dobijenih od starijih èna, koje su imale 41 do 50 godina starosti, u odnosu na ène starosti 21 - 40 godina, {to nagove{tava da folikularna sredina pre nastavljanja sazrevanja moè uticati na kompetentnost ljudskih oocita.

Usavr{avanjem medijuma za kultivaciju oocita, smanji}e se starosni uticaji i dobiti euploidne oocite sa vi{im razvojnim potencijalom. Pobolj{anjem metodologije krioprezervacije, identifikovanjem gena i produkata gena, koji su markeri visoke kompetentnosti, ili pobolj{anjem folikulogeneze i sazrevanja oocita in vivo i in vitro, smanji}e se uticaji starenja na kompetentnost oocita. Genetska analiza alela i polimorfizama, koji moduli{u doba nastupanja menopauze, pomo}i }e u savetovanju i pruànju najbolje prognoze i tretmana starijim pacijentima u asistiranoj reprodukciji. Nakon svih ovih godina pokazalo se da stimulacija ovulacije nije potpuno kontrolisana. Jedan od naj~e{}ih rizika je pojava hiperstimulacionog sindroma. Pretpostavlja se da lokalni ovarijalni renin, angiotenzin sistem i vaskularni endometrijalni growth factor imaju glavnu ulogu u patogenezi ovog sindroma deluju}i na angiogenezu i permeabilnost kapilara. Treba pomenuti i mogu}nost primene IVF - in vitro fertilisation u prirodnom ciklusu, nestimulisanom sa, ili bez davanja HCG - human chorionic gonadotropin-a. Procenat uspeha IVF - in vitro fertilisation u nestimulisanom ciklusu se kre}e oko 7% po ciklusu, odnosno 16 % po embrio transferu.

307


12. PROCENA OVARIJALNE REZERVE Procenu ovarijalne rezerve je potrebno uraditi kod pacijentkinja pre po~etka stimulacije radi utvr|ivanja mogu}nosti dobijanja jajnih }elija, kao i odre|ivanja individualne doze gonadotropina za svakog pojedina~nog pacijenta. Premenopauzalni ovarijum uvek sadrì cohorts rastu}ih folikula koji potencijalno mogu biti stimulisani do zrelosti. Tretman sa suprafiziolo{kim dozama FSH - follicle stimulating hormone-a stimuli{e razvoj antralnih folikula, spre~avaju}i njihovu atreziju koja bi se ina~e desila. Zato je od izuzetne va`nosti procena veli~ine pool-a rastu}ih folikula. Kao slab odgovor, poor response, smatra se dobijanje manje od 4 oocita nakon punkcije folikula, prekidanje stimulacije usled prisustva manje od tri folikula, ili odsustvo ovarijalnog odgovora nakon ovarijalne hiperstimulacije. Uzimaju}i u obzir donje granice procenta fertilizacije od 50 60%, minimum 4 oocita je neophodno za transfer najmanje dva embriona. Pacijenti sa high response su slu~ajevi sa vi{e od 20 oocita, ili slu~ajevi kada se stimulacija ciklusa prekida zbog preteranog odgovora jajnika, sa vi{e od 30 folikula u oba jajnika i vrednosti estradiola ve}im od 15ooo pmol/l. Starije ène, gojazne ène, ène pu{a~i, imaju slabiji odgovor na stimulativnu terapiju.

Razli~iti hormonski parametri, kao {to su bazalne koncentracije serumskog FSH - follicle stimulating hormone-a u ranoj folikularnoj fazi, kao i koncentracije FSH - follicle stimulating hormona nakon provokativnih testova, na primer clomifen citrat test, mogu biti od koristi u otkrivanju eventualnih poor responders-a. Danas se u praksi procena potencijalnog ovarijalnog odgovora moè odrediti na osnovu: - starosne dobi, - body mass index-a, - broja antralnih folikula, - volumena oba jajnika, - koncentracije serumskog FSH - follicle stimulating hormone-a, - nivoa inhibina B, - ovarijalnog stromalnog protoka, i - anti - Mullerian hormona.

Starosna dob pacijenta je va`na za ovarijalnu funkciju, jer ona opada sa godinama. To je biolo{ka, a ne hronolo{ka funkcija. Fertilitet opada zbog smanjenja broja primordijalnih folikula. Vi{e od 250.000 primordijalnih folikula je prisutno u vreme menarhe, dok samo nekoliko stotina ostaje na kraju reproduktivnog zivota. Opadanje broja je, tako|e, registrovano i kod antralnih folikula ve}ih od 1 mm. Broj antralnih folikula veli~ine do 2 mm opada za pribli`no 60 % izme|u 22 i 42. godine ìvota.

308


Brzina smanjenja broja folikula ubrzano raste nakon 37. godine ìvota, prethode}i menopauzi za 10 -12 godina.

Body mass index je vaàn, jer je utvr|eno da gojazni pacijenti zahtevaju zna~ajno ve}e doze gonadotropina i duì protokol stimulacije. Zato se savetuje redukcija telesne teìne pre procesa stimulacije. Ovaj problem je detaljno opisan u poglavlju - Poreme}aji ishrane i sterilitet. Broj antralnih folikula je u direktnoj koordinaciji sa ovarijalnim odgovorom. Ve}i broj antralnih folikula rezultira}e ve}im brojem oocita dobijenim nakon punkcije. Procenjivanje broja antralnih folikula radi se u ranoj folikularnoj fazi pre po~etka IVF - in vitro fertilisation tretmana brojanjem folikula manjih od 10mm, u oba dijametra, u oba ovarijuma. Zna~ajno vi{e ciklusa se prekida kao neuspe{ni, kod pacijenata gde je broj antralnih folikula ispod 6, dok je za o~ekivati hiperstimulacioni sindrom, ukoliko njihov broj prelazi 9. Broj

antralnih folikula je smanjen i kod pacijenata sa endometriozom. U mnogim istraìvanjima je dokazano da smanjen broj antralnih folikula pre po~etka stimulacije nema nikakvog zna~aja za procenat trudno}a i da su rezultati isti kao i kod pacijenata sa ve}im brojem antralnih folikula.

Volumen oba jajnika se meri transvaginalnom sondom u ranoj folikularnoj fazi drugog dana menstrualnog ciklusa. 3 D, odnosno 4 D sonografijom, merenje i procena volumena su precizniji. 2 D sonografijom mere se duìna, {irina i dubina jajnika u sagitalnom i koronarnom preseku, a ovarijalni volumen se dobija po formuli za volumen elipsoida, pi/6 x duìna x {irina x visina. Zapremina jajnika je proporcionalna broju antralnih folikula pre stimulacije: - pre puberteta oko 8 ml - posle puberteta oko 18 ml - posle menopause oko 8 ml.

Tabela 4-22: Zapremina jajnika kao funkcija starosne dobi

starost starost starost starost starost starost starost

0 - 10 godina; 11 - 20 godina; 21 - 30 godina; 31 - 40 godina; 41 - 50 godina; 51 - 60 godina; 61 - 70 godina;

srednja srednja srednja srednja srednja srednja srednja

1,7 7,8 10,2 9,5 9,0 6,2 6,0

ml ml ml ml ml ml ml

(0,2 (1,7 (2,6 (2,6 (2,1 (1,6 (1,0

-

4,9 18,5 23 20,7 20,9 14,2 15

ml) ml) ml) ml) ml) ml) ml)


Koncentracija FSH - follicle stimulating hormone u ranoj folikularnoj fazi varira od ciklusa do ciklusa od 10 - 25 IU/l. Istraìvanja su pokazala da bazalna vrednost manja ili jednaka 9,5 IU/l predstavlja gornju grani~nu vrednost normalne ovarijalne rezerve. Koncentracija FSH - follicle stimulating hormone-a u ranoj folikularnoj fazi, tre}i dan menstrualnog ciklusa je obrnuto proporcionalna veli~ini folikularne populacije. Porast koncentracije FSH - follicle stimulating hormone-a nakon testa sa klomifen citratom pokazao se od zna~aja za identifikaciju poor responders-a koji ne bi bili identifikovani odre|ivanjem samo koncentracije FSH - follicle stimulating hormone-a. Kako je FSH - follicle stimulating hormon indirektan marker ovarijalne funkcije, direktni produkti granuloznih }elija mogli bi da bolje reflektuju ovarijalni sekretorni kapacitet kao i broj folikula. Inhibin je heterodimeri~ni glikoprotein produkovan od strane granuloznih }elija i sastoji se od alfa i beta subjedinica. Postoje dve molekularne forme beta subjedinice, beta A i beta B, koje u kombinaciji sa alfa subjedinicom formiraju inhibin A i inhibin B. Inhibin B ima najve}u koncentraciju u ranoj folikularnoj fazi, a inhibin A u lutealnoj. Inhibin B se, uglavnom, sekretuje od strane malih antralnih folikula i jedan je od najranijih markera opadanja broja folikula kao znaka reproduktivnog starenja, {to ne mora da bude pra}eno pove}anjem koncentracije FSH - follicle stimulating hormona merenog tre}eg dana menstrualnog ciklusa. Inhibin A sekretuje dominantan folikul. Nakon injekcije rFSH - rekombinantni folikul stimulirajuci hormon-a dolazi do

309

naglog porasta sekrecije inhibina B, {to je u skladu sa postavkom da su granulozne }elije malih folikula najsenzitivnije na rast FSH follicle stimulating hormona kada su endogene koncentracije niske. Vrednosti koncentracije inhibina manje od 45 pg/ml merene u serumu tre}eg dana menstrualnog ciklusa, predstavljaju grani~nu vrednost za procenu funkcionalne rezerve jajnika.

Ovarijalni stromalni protok se meri color Doppler-om. Dobijaju se informacije koje se ti~u vaskularizacije i protoka krvi ovarijuma. U ovarijumu su arterije tanke i vijugave {to oteàva merenje, a meri se protok pojedina~ne arterije subjektivno izabrane. Trodimenzionalna power Doppler sonografija omogu}ava mapiranje i kvantificiranje power Doppler signala unutar celokupnog prostora od interesa, omogu}avaju}i bolju detekciju vaskularizacije i protoka krvi kroz organ. Merenjem je obuhva}en: index vaskularizacije, flow index i vaskularni flow index. Index vaskularizacije meri odnos color voxel-a u definisanom volumenu u odnosu na sve voxele u odre|enom volumenu, reprezentuju}i krvne sudove u tkivu, {to je izraèno u procentima. Flow index, srednja vrednost color voxel-a, predstavlja prose~an intenzitet protoka /raspon 0 -100/. Vaskularni flow index je srednja color vrednost u svim vokselima u odre|enom prostoru i karakteristika je i vaskularizacije i protoka, opseg 0 -100. Srednja siva vrednost u sivom vokselu pokazuje srednju ehogenost ili prosvetljenost odre|enog volumena, opseg 0 -100.

310


Tabela 4-23: Prikaz 3D ultrasonografskog merenja ovarijuma nakon pituitarne down regulacije i gonadotropne stimulacije

Niska ovarijalna rezerva

Normalna ovarijalna rezerva

6,1 4,4 42,0 2,1 51,2

7,5 6,4 44,2 3,0 48,8

15,1 5,7 44,1 2,7 42,4

31,9 8,8 48,7 4,3 41,8

Nakon pituitarne supresije Zapremina cm3 VI FI VFI MG

Nakon ovarijalne stimulacije Zapremina cm3 VI FI VFI MG VI = vaskularni index FI = flow index VFI = vaskularni flow index MG = srednja siva vrednost

Uo~eno je pove}anje ovarijalnog vaskularnog indexa, flow indexa i vaskularnog flow indexa nakon gonadotropne stimulacije kod pacijenata sa normalnom ovarijalnom rezervom. Takve promene se ne registruju kod pacijenata sa malom ovarijalnom rezervom. Pokazalo se da ovarijumi sa malim brojem antralnih folikula nisu sposobni da pove}aju protok krvi nakon gonadotropne stimulacije, ili ukoliko do toga dolazi, razlika nije dovoljno velika da se detektuje opisanim metodama.

AMH - anti - Mullerian hormon pripada grupi transforming growth factora beta. Doplerska merenja pokazuju pove}an protok krvi kroz stromu jajnika sa pove}anjem serumske koncentracije endotelijalnog growth factora.Vaskularni endotelijalni growth factor je endotelijalni }elijski mito-

gen sa jakim angiogeni~kim svojstvima, ~iji rast se ne registruje kod ovarijuma sa malim brojem antralnih folikula. Anti Mullerian hormon je detektovan u granuloznim }elijama primarnih folikula sve do antralnog stadijuma kada folikuli postaju FSH - follicle stimulating hormon zavisni. Budu}i da se AMH - anti-Mullerian hormon produkuje samo od strane rastu}ih folikula, serumski nivo moè da se koristi kao marker ovarijalne rezerve, reprezentuju}i kvantitativno i kvalitativno ovarijalni folikularni pool. Nivo AMH -anti-Mullerian hormona opada sa godinama ène. Ve}i nivo serumskog AMH - antiMullerian hormona kod PCO - polycystic ovarian pacijenata obja{njava se time da njihovi ovarijumi sadrè dva puta vi{e preantralnih, primarnih i sekundarnih folikula kao i antralnih folikula.

311


13. POF - PREMATURE OVARIAN FAILURE Prerani gubitak ovarijalne funkcije podrazumeva gubitak normalne funkcije jajnika pre 40. godine. On se dijagnostikuje kod oko 1% èna. Prerani gubitak funkcije jajnika se ~esto izjedna~ava sa preranom menopauzom, ali ova dva stanja nisu u potpunosti identi~na. Kod èna sa preranom menopauzom postoji gubitak menstruacije, dok ène sa preranim gubitkom normalne funkcije jajnika mogu imati sporadi~ne menstruacije godinama, pa ~ak i ostati u drugom stanju. Naj~e{}i znak prematurnog gubitka funkcije jajnika je iregularna menstruacija ili amenoreja. Neke ène prvi izostanak menstruacije zapaàju posle trudno}e, ili prestanka uzimanja kontraceptivnih pilula. Drugi znakovi poreme}aja funkcije jajnika podse}aju na one kao kod èna u menopauzi, a koji su tipi~ni znaci deficijencije estrogena. Prerani poreme}aj funkcije jajnika nastaje kada je u ovarijumu preostalo svega nekoliko folikula sposobnih da odgovore na hormonsku stimulaciju, follicle depletion, odnosno, kada folikuli ne odgovaraju adekvatno na stimulaciju, follicle dysfunction. Naj~e{}i uzroci preranog gubitka funkcije jajnika su: - hromozomski defekti - toksini, hemioterapija, radioterapija, hemijski otrovi, pesticidi, virusi - autoimuni.

êsto je vrlo te{ko ozna~iti ta~an uzrok preranog gubitka ovarijalne funkcije, pa u ve}ini slu~ajeva ostaje nepoznat. Jedan od uzroka ovarijalne disfunkcije je i autoimuno oboljenje, koje se smatra uzro~nikom pojave ovog sindroma u oko 30% slu~ajeva. Vrlo je mogu}e da je ovaj proces iniciran izlaganju virusnoj infekciji. Autoimuni poreme}aj funkcije jajnika se klini~ki moè podeliti u dve kategorije: •

povezano sa drugim autoimunim oboljenjima: - endokrina, adrenalna, tireoidna, insulin zavistan diabetes, miastenia gravis - neendokrina, hroni~na kandidijaza, idiopatska trombocitopeni~na purpura, sistematski lupus eritematosis, reumatoidni artritis • izolovani autoimuni poreme}aj funkcije jajnika: - autoimuni oophoritis - autoimuna antitela na steroid produkuju}e }elije i enzime gonadotropin /FSH/LH/ receptore zonu pelucidu.

Nedavno je identifikovano nekoliko faktora rasta i }elijskih povr{inskih molekula kao kriti~ne substance za rast oocita, te su i ove substance kandidati za target antigen koji uzrokuje prerani gubitak ovarijalne funkcije POF - premature ovarian failure.

312


Sl. 4.102 - POF - premature ovarian failure; Histoloski snimak ovarijalnog tkiva imuniziranog sa ZP2 peptidom: A - normalan nalaz; B - imunoreaktivno promenjeno tkivo bez rasta folikula sa fibroziranim intersticijumom

313


14. DONACIJA GAMETA I EMBRIONA Doniranje gameta i embriona je jedino re{enje za bra~ne parove sa nedostatkom ènskih ili mu{kih gameta. Tako|e se primenjuje u slu~ajevima te{kih naslednih bolesti, radi izbegavanja preno{enja genetskih aberacija na potomke. Doniranje gameta i embriona je emotivno i socijalno zna~ajno za svaki bra~ni par, jer dovodi u pitanje genetsko poreklo porodice koja je centralni deo ve}ine dru{tava. Prava i obaveze koje se povezuju sa genetskom vezom su pitanje od javnog interesa i o kome treba da odlu~i dru{tvo, obi~no putem zakonodavstva. Pored toga, u svakom trenutku je va`no uzeti u obzir dobrobit budu}eg deteta.

Posebni eti~ki aspekti Anonimnost U ovom programu ne postoji pojedina~no re{enje problema anonimnosti, jer su razli~ita prava izloèna riziku, i to: • pravo autonomije i privatnosti bra~nog para; • pravo na privatnost donora; • pravo deteta da zna svoje poreklo.

Ova prava ne mogu uvek biti istovremeno ispo{tovana. Prema tome, predloèn je dvostruki kolosek kao re{enje kojim se postiè najbolja ravnoteà svih interesa,

uzimaju}i u obzir specifi~an kontekst anonimnosti donora. U ovu proceduru donor moè da u|e u program kao donor koji se moè identifikovati, ili kao anoniman donor, a primaoci se mogu opredeliti za donora koji se moè identifikovati ili za anonimnog donora. Predloèni sistem uokviruje izbor o anonimnosti ili mogu}nosti identifikacije donora kao i odluku da li donaciju dràti u tajnosti unutar prava roditeljske anonimnosti koja se ti~e organizovanja njihove porodice. Razumljivo je da ovaj sistem ne}e re{iti sve probleme. Verovatno je da }e postojati nedostatak donora koji }e èleti da se odreknu anonimnosti. Pored toga, deca koja su upoznata sa svojim donorskim poreklom ne}e imati pristup informacijama o svom biolo{kom roditelju. Poznati donor, on ili ona, je identifikovan kod primaoca u trenutku za~e}a ili tretmana. U slu~aju donora koji se moè identifikovati, identitet donora se saop{tava detetu kada dostigne zrelost. U principu ne bi trebalo biti pla}anja za doniranje biolo{kog materijala. Svojstvena vrednost poklona, kao na~ina pokazivanja solidarnosti, je ve}a od pozitivnih korisnih posledica pla}anja i dobijanja ve}e koli~ine materijala. Ovo ne isklju~uje razumnu kompenzaciju za trud donora. Ova kompenzacija

314


ne treba da bude visoka, jer bi odvratila velikodu{ne nepla}ene donore i privuklo ljude koji u suprotnom ne bi donirali, ili ih podstaklo da prikriju informacije koje mogu biti relevantne po bezbednost donacije. Postoji veliki broj zemalja u kojima je predloèno pragmati~no re{enje pla}anja biolo{kog materijala, {to mi smatramo da nije eti~ki.

Regrutovanje i pregled donora Pregled je neophodan da bi se za{titio primalac i budu}e dete. Psiholo{ka procena op{tih sposobnosti i intelektualnog kapaciteta donorskih kandidata je tako|e neophodna. Poznati genetski rizici koji su povezani sa godinama impliciraju da donori sperme treba da budu mla|i od 50 godina, a donori oocita mla|i od 35 godina. Za poznatu donaciju je prihvatljiva vi{a granica, ako primaoci pristanu na povi{eni genetski rizik. U ovim slu~ajevima primaocima treba da bude obavezno ponu|ena mogu}nost prenatalne dijagnostike, ako do|e do trudno}e. Regrutovanje donora se najbolje obavlja od strane nezavisnog i neprofitabilnog tela ~ija je du`nost da podsti~e doniranje na nacionalnom nivou na osnovu principa solidarnosti i isklju~ivanja finansijskih podsticaja. Trebale bi biti zabeleène minimalne informacije o donoru koje se ti~u izgleda, obrazovanja, profesije, dru{tvenog porekla i motiva za doniranje.

Procena i pregled primalaca Implikaciono savetovanje je obavezno u vreme procene i ono mora da se fokusira na interes i dobrobit budu}eg deteta.

Medicinske indikacije Doniranje gameta se indicira kada ne postoji mogu}nost trudno}e bez ove

metode, kada ostali tretmani nisu uspeli, ili ako postoji rizik od prenosa ozbiljne genetske bolesti.

Psiho-socijalne indikacije Postoji vi{e javnih debata o prihvatljivosti upotrebe doniranja gameta u okolnostima kada je neplodnost izazvana ili obja{njena psiho-socijalnim faktorima, kao {to je to slucaj kod ènskih homoseksualnih parova, slobodnih èna i postmenopauzalnih èna. Ne postoji konsenzus o psiho-socijalnim indikacijama za doniranje gameta i embriona. Razli~ita dru{tva odraàvaju svoje stavove po ovom pitanju ure|enjem prava nacionalnim zakonodavstvom.

Bezbednost Detaljan pregled donora gameta se mora primeniti da bi se izbeglo preno{enje bolesti na recipijenta i dete. Pregled obuhvata kompletno ispitivanje na genetske bolesti, mogu}e infekcije i op{te zdravstveno stanje. Doniranje gameta mora da se praktikuje u centrima koji prolaze kroz proces akreditacije i redovne kontrole. U okviru toga potrebno je postojanje eti~ke komisije radi davanja odobrenja pre po~etka tretmana.

Informisani pristanak Proces pruànja informacija, uz savetovanje koje se ti~e implikacija doniranja ili primanja gameta, je neophodan da bi se donoru ili primaocu omogu}ilo da daju svoj informisani pristanak. Ovaj proces zahteva vreme i mogu}nost nastavljene interakcije. Posebna pa`nja treba da se obrati ~injenici da doniranje ili primanje gameta ima dugoro~ne implikacije koje mogu da uti~u na kasniji ìvot.

315


15. SUROGAT MAJKA Strahovi o uticaju surogatstva na dobrobit tako ro|ene dece i porodica se ~ine neosnovanim, sude}i prema nalazima prvog sistemati~nog mega ispitivanja surogat porodica koje je predstavljeno na Godi{njoj konferenciji "Evropskog dru{tva za humanu reprodukciju i embriologiju". Analize su pokazale da surogat majke pokazuju vi{e topline prema njihovim bebama i emotivnije su nego {to je to slu~aj kod porodica u kojima je dete za~eto prirodnim putem. I majka i otac su posedovali bolje ve{tine roditeljstva u odnosu na kontrolnu gdupu, a same bebe ne pokazuju razlike u temperamentu i pona{anju u pore|enju sa ostalim bebama. Nisu registrovani problemi pri preuzimanju bebe. Prva faza studije je posmatrala porodice u kojima je dete bilo staro izme|u 9 i 12 meseci. U pra}enoj grupi pacijenata, 40 % slu~ajeva se odnosilo na surogat roditeljstvo, a kod 60 % pacijenata je bila donirana jajna }elija. Oko 66% surogat majki nije bilo poznato genetskom ocu i majci pre dogovora o surogatstvu, dok je preostala tre}ina surogat majki bila u rodbinskim vezama, ili prijateljica majke. Od ro|enja deteta je ve}ina porodica odràvala kontakt sa surogat majkama, a

njih 70% se sa njom vi|alo jednom u dva meseca. Oko 90% majki je izjavilo da jo{ uvek ima veoma dobar odnos sa surogat majkom i nijedna majka nije opisala sukob ili neprijateljstvo izme|u roditelja i surogat majke. Zabrinutost o stavu prave majke prema vezi surogat majke sa detetom se ~ini neosnovanom, jer je 90% majki izjavilo da ne ose}a strepnju u ovom pogledu. Kada su istraìva~i posmatrali pet razli~itih aspekata roditeljstva, otkrili su da su kod ~etiri aspekta (toplina, emotivna povezanost i maj~inski i o~inski kvaliteti) surogat porodice i porodice sa donorskim jajnim }elijama imale bolje ocene od porodica u kojima je dete za~eto prirodnim putem. Za peti aspekt, osetljivost maj~inog odziva prema detetu, nije bilo zna~ajne razlike me|u razli~itim tipovima porodica. Nije bilo razlika u pogledu temperamenta deteta, su|eno prema nervoznom pona{anju, prilagodljivosti prema novim situacijama, op{toj aktivnosti i predvidljivosti reakcije. Postojala je zna~ajna razlika izme|u surogat porodica i porodica sa donorskim jajnim }elijama u odnosu na ~uvanje anonimnosti postupka. Sve surogat majke su rekle svojim prijateljima i porodicama o surogatsvu, dok 12% porodica kod kojih je donirana jajna }elija nije nikome reklo o

316


doniranju, 41% porodica nije obavestilo ni sopstvene roditelje, a 26% porodica nije obavestilo prijatelje. Sve surogat majke su nameravale da svojoj deci ispri~aju o njihovom za~e}u, ali je samo 57% majki sa doniranim jajnim }elijama bilo spremno da kasnije obavesti dete o na~inu za~e}a. Kada analiziramo trenutno stanje zakonodavne regulative po pojedinim zemljama, surogat roditeljstvo je nelegalno u Austriji, Nema~koj, [vedskoj i Norve-

{koj. U Finskoj, Gr~koj i Irskoj se surogatstvo odvija bez pravnih propisa. U Australiji je dozvoljeno, ali ne u komercijalne svrhe. Francuska, Danska i Holandija zabranjuju pla}anje surogat majkama, dok je u Velikoj Britaniji i Izraelu dozvoljeno pla}anje samo razumnih tro{kova. U SAD se zakoni razlikuju od jedne do druge dràve, pa je u Arizoni, Nju Dèrsiju i Mi~igenu potpuno zabranjeno, u Floridi dozvoljeno uz odre|ene uslove, a u ostalim dràvama dozvoljeno.


317

16. KOMPLIKACIJE PROGRAMA ASISTIRANE REPRODUKTIVNE TEHNOLOGIJE Torzija adnex - a Adneksalna torzija je relativno retka, ali ozbiljna komplikacija stimulacije jajnika. Glavni uzrok pojave torzije adneksa je prisustvo ovarijalne ciste, stoga je incidenca ove komplikacije ve}a kod pacijenata sa OHSS - ovarian hyperstimultion syndrome-om.

vra}a u uterusnu {upljinu, simuliraju}i fiziolo{ki put fertilisanog oocita. Ukoliko je tuba disfunkcionalna transport je poreme}en, {to moè da dovede do pojave ektopi~ne trudno}e.

Komplikacije transvaginalne procedure Komplikacije koje se javljaju kao posledica vaginalne punkcije su eventualna pojava pelvi~ne infekcije, ruptura endometrijalnih cisti, retko povreda visceralnih organa, kao i intravaskularne povrede koje mogu biti potencijalno ozbiljne.

Ektopi~na trudno}a U istorijatu in vitro fertilizacije prva trudno}a do koje je do{lo nakon IVF - in vitro fertilisation bila je ektopi~na. Steptoe i Edwards su je opisali 1976. godine. Incidenca pojave ektopi~ne trudno}e nakon embriotransfera varira od 2 do 11%. Incidenca iz multicentri~nih studija kre}e se do 5%. O~igledno je da u toku embriotransfera embrion moè da dospe u Falopijevu tubu. Ukoliko je tuba normalna, embiron se

Sl. 4.103- Laparoskopski nalaz tubarnog graviditeta

Jedan od faktora za pojavu ektopi~ne trudno}e je sama tehnika embriotransfera. Postoje dokazi koji ukazuju da stimulacija ovulacije pra}ena visokim nivoima estrogena uti~e na tubarni embrio transfer. Tako|e je pove}ana i incidenca kombinovane intrauterine i ekstrauterine trudno}e u programu IVF - in vitro fertilisation.

318


17. OHSS - OVARIAN HYPERSTIMULATION SYNDROME Prvi slu~ajevi OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma su opisani 1943. godine kada su i prvi put sintetizovani i upotrebljeni u medicinskoj praksi preparati gonadotropina. In vitro fertilizacija je elektivna metoda, te su klini~ke komplikacije izazvane ovim postupkom uvek jatrogene. Ovarijalni hiperstimulacioni sindrom je retka komplikacija ovarijalne stimulacije koja se javlja u toku lutelane faze, ili u toku rane trudno}e nastale nakon stimulacije ovarijuma. Kod OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma dolazi do cisti~nog uve}anja jajnika i prelaza te~nosti iz intravaskularnog u perivaskularni prostor zbog pove}ane kapilarne permeabilnosti i ovarijalne neoangiogeneze. Pojava sindroma je direktno zavisna od primene HCG - human chorionic gonadotropina. Frekventnost je razli~ita, blagi oblici ovarijalne hiperstimulacije se javljaju u oko 8 - 23% od svih stimulisanih ciklusa, umereni oblici 1 - 7% , i te{ki oblici 0,5% stimulisanih ciklusa .

Fiziopatologija Fiziopatologija OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma se sve bolje razume. Nedoumica je ravnoteà izme|u proangio-

genih i antiangiogenih faktora prisutnih u folikularnoj te~nosti. Proangiogena uloga VEGF - vascular endothelial growth factor-a je van svake sumnje najva`niji medijator sindroma. Visoke koncentracije VEGF vascular endothelial growth factor-a su prona|ene u folikularnoj te~nosti, ~ine}i medijatorsku ulogu ovarijalnog VEGF vascular endothelial growth factor-a u razvoju OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma veoma mogu}om. Pokazalo se da su koncentracije VEGF-vascular endothelial growth factor-a u ascitu, serumu i plazmi kod OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma pacijenata povi{ene. mRNK - messenger ribonucleic acid ekspresija VEGF - vascular endothelial growth factor-a humanih luteiniziranih granuloza }elija je vremenski zavisna od HCG - human chorionic gonadotropina, {to dodatno isti~e ulogu VEGF - vascular endothelial growth factor-a u razvoju OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma. Postoje dva VEGF - vascular endothelial growth factor receptora, VEGFR-1 - vascular endothelial growth factor i VEGFR-2 - vascular endothelial growth factor. Oba su stvorena od strane endotelijalnih }elija, od kojih jedan postoji u rastvorljivom obliku s- seruma, sVEGFR -1 vascular endothelial growth factor i deluje

319


kao negativni modulator bioaktivnosti VEGF - vascular endothelial growth factor. Vi{ak bioaktivnog proangiogenog VEGF - vascular endothelial growth factor-a pove}ava rizik pojave OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma. Vi{ak antiangiogenog sVEGFR-1 -vascular endothelial growth factor-a i ostalih antiangiogenih faktora umanjuje reakciju jajnika i rizik za pojavu OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma, a ispoljava se smanjenim stepenom trudno}a. Apsolutne serumske koncentracije nemaju vrednost u pojedina~noj proceni rizika, jer postoje individualne varijacije vezivanja VEGF - vascular endothelial growth factor-a sa njegovim receptorima. Kod eksperimentalnih ìvotinja je dokaz koncepta prikazan tako {to je VEGF2- vascular endothelial growth factor inhibitorom (SU5416) blokirao HCG - human chorionic gonadotropin zavisnu produkciju VEGF - vascular endothelial growth factor. Tako|e je pokazano da izazivanje ovulacije pomo}u LH - luteinizing hormona umesto HCG - human chorionic gonadotropin-om, rezultuje niòm produkcijom VEGF - vascular endothelial growth factor-a. Ovo sluì kao teorijska osnova za izazvanu ovulaciju koja koristi rLH - rekombinantni luteinizing hormon u klini~koj praksi. Fiziopatolo{ka kaskada OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma se sastoji od neoangiogeneze i pove}ane kapilarne permeabilnosti pove}anih ovarijalnih i ostalih endotelijalnih povr{ina, pomeranjem te~nosti iz intravaskularnog prostora u ekstravaskularni prostor abdomena, pleure, perikarda, pojavom hemokoncentracije, smanjenjem renalne funkcije sa oligurijom/anurijom, hiperviskozno{}u krvi, modifikacijom faktora koagulacije i tromboembolijskih rizika. Hemokoncentracija vodi pove}anju hematokrita, koncentracije

trombocita i leukocita, kreatinina, ureje i enzima jetre u plazmi, sa pojavom hiperkalijemije i acidoze. Koncentracija albumina u serumu se smanjuje kao rezultat ekstravazacije fluida i pojave ascita. Proces je samoograni~avaju}i, jer se uticaj HCG - human chorionic gonadotropin-a smanjuje, osim u slu~aju trudno}e kada po~inje da se osloba|a fetalni HCG human chorionic gonadotropin.

Faktori rizika Faktore rizika smo podelili na primarne i sekundarne. Primarni faktori rizika su prisutni pre po~etka davanja lekova, a sekundarni se pojavljuju sa po~etkom stimulacije.

Primarni faktori rizika su: • Postojanje sindroma policisti~nih jajnika PCOS - polycystic ovarian syndrome; • Pacijenti samo sa nekim od karakteristika PCOS - polycystic ovarian syndroma; ve}i broj folikula kod oba jajnika u stanju mirovanja pre stimulacije, 10 folikula veli~ine 4 - 10 mm u svakom jajniku, odnos LH - luteinizing hormone / FSH - follicle stimulating hormone ve}i od dva; • Hiperandrogenizam; • Prethodna pojava OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma u anamnezi; • Mladi pacijenti, stoga {to su ovarijumi mla|ih osoba osetljiviji na gonadotropine, jer poseduju ve}i broj gonadotropnih receptora, ili ve}i broj folikula koji je sposoban da odgovori na gonadotropine; • Mr{ave ène, manje dokazano; • Predispozicija ka alergijama, manje dokazano.

Sekundarni faktori rizika su: • Visoke vrednosti serum estradiola, >3000 - 4000 pg /mL, nema jasne grani~ne

320


vrednosti, relativno lo{a mo} predikcije najvi{e 73%. Sam estradiol nije medijator po{to je OHSS - ovarian hyperstimulation syndrom, tako|e, mogu} i sa niskim vrednostima serumskog estradiola, kod stimulacija sa rFSH - rekombinantni folikul stimuliraju}i hormon-om. Brzina porasta estradiola je glavni faktor rizika i od ve}eg je zna~aja od maksimalnog nivoa, pozitivna prediktivna vrednost 77%: • Broj folikula u svakom jajniku ve}i od 20 - 25. Nema jasne grani~ne vrednosti; • Merenja apsolutnih koncentracija serumskog vaskularnog endotelijalnog faktora rasta VEGF - vascular endothelial growth factor-a nisu upotrebljiva za pojedina~no predvi|anje.

Klasifikacija Podela na razli~ite stepene oblika OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a je na osnovu vremena kada se javlja i na osnovu teìne klini~ke slike.

Rani oblik je izazvan davanjem HCG human chorionic gonadotropina i hiperreakcijom ovarijuma koji su u fazi gonadotropinske stimulacije. Kasni oblik se javlja kao reakcija na sekreciju placentarnog HCG - human chorionic gonadotropina. Najnovija definicija se jo{ uvek oslanja na osnovnu etiologiju, ali pravi jasnu razliku izme|u ranog oblika, nekoliko dana nakon injekcije HCG human chorionic gonadotropina i kasnog oblika, naj~e{}e oko 10. dana od davanja HCG - human chorionic gonadotropina. Slu~ajevi sa ranim oblikom na koji se nadovezuje trudno}a su naro~ito rizi~ni i dugotrajni. Blagi oblik OHSS- ovarian hyperstimulation syndrome-a Blagi OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome ne zahteva specifi~an tretman.

Pacijente treba umiriti i ve}ina njih }e se potpuno oporaviti u roku od sedam dana. Observacija pacijenata je obavezna u cilju detekcije slu~ajeva koji mogu napredovati do umerenog ili te{kog OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Ako su u ovoj fazi hiperstimulacije jajnici uve}ani, pacijenti treba da izbegavaju naporne aktivnosti zbog rizika torzije ovarijuma. Stepen abdominalnih bolova moè zahtevati upotrebu analgetika.

Umeren oblik OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a Osnova tretmana je mirovanje i adekvatno uzimanje te~nosti uz kontrolisanje balansa pra}enjem koli~ine unete te~nosti i izba~enog urina. Kontrola se radi na svakih 2 - 3 dana, imaju}i na umu da ukoliko do|e do trudno}e stanje moè da se pogor{a i pre|e u te{ki oblik OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a.

Te{ki oblik OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a Te{ki oblik OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a se mora smatrati i tretirati kao potencijalno fatalna komplikacija koja zahteva hitnu terapiju i kontinuiranu observaciju. Klini~ki pregled se obavlja radi detekcije prisustva sekundarnih komplikacija. Hematokrit je vredan parametar za procenu ozbiljnosti OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a, jer je hospitalizacija neophodna za vrednosti ve}e od 45%. U ovoj fazi su potrebna i druga ispitivanja: Dnevna: • Diureza, abdominalni obim i telesna teìna, • Nivo leukocita, (povi{eni nivo je znak tromboembolizma), koncentracija hemoglobina i svih elektrolita,

321


• Koncentracija

kreatinina i uree,

• C-reaktivni protein, za isklju~enje infekcije, • Vrednosti koagulacije u slu~aju uklju~enja terapeutske antikoagulacije.

Nedeljna, u skladu sa klini~kom evolucijom: • Testovi jetre i bubrega,

• Hemokoncentracija, hematokrit >45%, • Leukocitoza >15 000/mm3, • Osloba|anje kreatinina <50 mL u min-

utu; serumski kreatinin >1.2 mg /dL, • Povi{eni enzimi jetre, • Hiperkoagulacija, • Hipoproteinemija i hipoalbuminemija <30 g/L.

• Ro-radiografija thorax-a radi kontrole pleuralnog izliva, • Elektrokardiogram i eventualno sr~ana ultrasonografija.

Klini~ka slika Naj~e{}i simptomi i znaci su: • Distenzija donjeg abdomena, • Progresivno pove}anje abdominalnog obima merenog u nivou umbilikusa, • Jajnici uve}ani preko 12 cm, • Mu~nina i povra}anje koji spre~avaju uzimanje hrane i te~nosti, • Oteàno disanje i respiratorni problemi usled povi{ene dijafragme i hidrotoraksa, • Diareja, • Brzo pove}anje teìne. Ozbiljniji znaci i simptomi su: • Ascites, • Hipotenzija, • Pleuralni izliv, ~e{}i na desnoj strani, • Perikardijalni izliv, • Razvijen oblik sindroma respiratornih

smetnji, • Oligurija i anurija, • Vi{estruki otkaz organa, • Smrt (1/500 000 ciklusa). Biolo{ki nalazi su: • Poreme}aj elektrolita; hiponatremija <136 mEq /L, hiperkalemija >5.0 mEq /L • Hipovolemija,

Sl. 4.104- Ascites kod OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma

Dodatne komplikacije su:

Torzija ovarijuma koja izaziva iznenadni i ekstremni abdominalni bol i mu~ninu. Pojavljuje se u 1/5000 stimulacionih ciklusa, ali je ~e{}a ako su prisutni trudno}a i OHSS - ovarian hyperstimulation syndrom; Ovarijalno krvarenje usled rupture jajnika ili intraovarijalnog krvarenja izazvanog pritiskom ili bimanualnim pregledom. Pra}eno je znacima akutnog krvarenja sa hipotenzijom, mu~ninom, iznenadnim padom hematokrita. Tromboembolizam - opisane su venska u 65.7% i arterijska lokalizacija, naj~e{}e na venama vrata, ruke ili glave u 60% slu~ajeva. Tromboza se tako|e javlja u arterijama i venama donjeg dela tela. Pulmonalna embolija se javlja kod 4 - 12% slu~ajeva.

322


Embolija je opisana kod humeralnih, subklavikularnih i internih vena vrata, kod vena cava-e, kao i kod subklavikularnih, ulnarnih, kod karotidnih, vi{e interne, cerebralnih medijalnih i koronarnih arterija.

Sl. 4.105- Pleuralni izliv kod OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome

Tromboembolijske komplikacije su krajnje retke u slu~aju OHSS -ovarian hyperstimultion syndrome-a, ali mogu imati fatalni ishod uprkos odgovaraju}em tretmanu.

Terapija Terapija ima za osnovni cilj dopunjavanje arterijalnog volumena, mobilizaciju te~nosti iz van}elijskog prostora, odràvanje cirkulatorne hemodinamike i spre~avanje hemokoncentracije. Dopuna volumena po~inje intravenskim kristaloidnim rastvorima, normalnim slanim rastvorima brzinom od 125 - 150 ml/h. Ekspanderi plazme, koloidi, se mogu koristiti, ako je to neophodno. Me|utim, ako se sami ekspanderi plazme transportuju do peritonealne {upljine, njihova upotreba moè biti kontraproduktivna. Albumin se naj~e{}e koristi, 200 ml 25% rastvora albumina tokom 4h kao i dekstran, manitol i sveè smrznuta plazma. Nedavno je uticaj rastvora 6% hidroksietil skroba HAES - hydroxyethyl starch,

upore|en sa uticajem albumina kod pacijenata sa te{kim oblikom OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma. Rezultati su bili u korist HAES - hydroxyethyl starch rastvora zbog bolje diureze, manjeg broja procedura punkcije i skra}enja bolni~kih dana. U drugoj komparativnoj studiji upore|ene su primene 10% HAES - hydroxyethyl starch rastvora i hemacela. Nije prona|ena klini~ka prednost HAES - hydroxyethyl starch rastvora u odnosu na hemacel. HAES - hydroxyethyl starch rastvor ima prednost {to je nebiolo{kog porekla i ve}e molekularne teìne, 200 -1000 kDa, naspram 69 kDa kod albumina. Ishrana bogata proteinima se primenjuje sa istom svrhom. Ukoliko do|e do oligurije neophodna je stimulacija diureze. Dopamin moè pomo}i u ponovnom uspostavljanju renalne perfuzije. Pokazalo se da intravensko davanje dopamina od 0.18 mg/kg na svaki sat vremena {iri renalne sudove i pove}ava renalni protok krvi bez uticaja na krvni pritisak i otkucaje srca. Diuretici su kontraindikovani kada pacijenti ispolje hemokoncentraciju, hipotenziju ili hiponatremiju. Njihova upotreba bi trebala da bude ograni~ena na slu~ajeve u kojima se hemodilucija pove}ava, dok oligurija i dalje ostaje. Intravensko davanje 20% albumina zajedno sa frusemidom od 20 mg na svakih 6h se pokazalo uspe{nim kod pacijenata rezistentnih na ostale terapeutske mere. Merenje centralnog venskog pritiska se preporu~uje kada je balans fluida te{ko odràvati, kao i u slu~aju upotrebe dopamina. Pacijent moè napustiti bolnicu kada se hemokoncentracija smanji i kada se diureza pove}a uz nepostojanje dodatnih komplikacija. Antibiotici se savetuju u odre|enim postupcima.


Hipoglobulinemija je mogu}a kod slu~ajeva te{kog OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a i moè podsta}i relativnu imunodepresiju. Infekcije su prili~no ~esto posledica jatrogenih pojava kao {to je urinarna kateterizacija, venska kateterizacija, pleuralna punkcija, paracenteza i hirur{ke procedure. Preoperativna antibiotska profilaksa se preporu~uje zbog toga. Nej~e{}e bakterije koje su dijagnostikovane su pseudomonas, proteus, klebsiella i enterobacter. Neki predlaù primenu imunoglobulina po{to se koriste i kod drugih patologija koje se dovode u vezu sa hipoglobulinemijom, kao {to je nefroti~ki sindrom ili neke enteropatije. Ova mera tek treba da se proceni. Predlagano je da se indometacin moè koristiti kao inhibitor sinteze prostaglandina koji moè imati ulogu u etiologiji sindroma. Istraìvanja su pokazala da indometacin moè da spre~i prelaz te~nosti u intercelularni prostor, sa pojavom ascitesa i pleuralnog izliva. U drugim studijama na eksperimentalnim ìvotinjama utvr|eno je da formiranje ascita nije efikasno potisnuto indometacinom. U klini~koj praksi, neki autori upotrebom indometacina nisu prona{li klini~ko pobolj{anje, ili inhibiciju formiranja ascita kod pacijenata sa te{kim OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-om. Osim toga, postoji teratogeni rizik primene indometacina u prvih nekoliko nedelja rane gestacije. Kona~no, oligurija i renalni otkaz su pripisani upotrebi indometacina u slu~ajevima OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma, ~ak i u odsustvu hipovolemije. Renalna perfuzija se moè odràvati na osnovu kompenzacijske vasodilatacije posredovane prostaglandinom kada je renalna aktivnost poja~ana, a kada indometacin moè inhibirati ovaj mehanizam.

323

Preventivni tretman heparinom se savetuje kod svih slu~ajeva povi{enog rizika od tromboembolije. Kod slu~ajeva te{kog oblika OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a slede}e situacije predstavljaju povi{eni rizik od tromboembolije: hiperestrogenemija, imobilizacija, kompresija pelvi~nih sudova od strane uve}anih jajnika ili ascitesa i trudni~ke koagulacione anomalije. Neki istraìva~i savetuju primenu heparina kod svih hospitalizovanih pacijentima zbog OHSS-ovarian hyperstimulation syndrome-a, dok drugi ograni~avaju njegovu upotrebu na pacijente sa hemokoncentracijom. Prevencija pomo}u mobilizacije i antitromboznih ~arapa se pokazala nedovoljnom, po{to se tromboza moè javiti na svim lokalizacijama, pa se ~ini da je etiologija sistemske prirode. Profilaksa heparinom ostaje diskutabilna iz nekoliko razloga. Prvo, nema ve}ih studija koje dokazuju njegovu efikasnost u spre~avanju tromboembolijskih komplikacija tokom te{kih oblika OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Osim toga, do{lo je do tromboembolija kod slu~ajeva gde je ve} primenjen tretman heparinom. Tako|e, treba ista}i pojavu dodatnih faktora rizika kao {to su otpornost na aktivni protein C, mutacija zbog Lejden faktora V ili Kronova bolest. Trenutak po~etka primene preventivnih mera je tako|e tema brojnih debata. Prijavljene su kasne tromboze i do 20 nedelja nakon transfera embriona, ali samo u slu~ajevima gde je do{lo do trudno}e. Ova zapaànja idu u korist preventivnog davanja heparinske terapije do 4. nedelje, pa ~ak, i tokom ~itavog prvog tromese~ja trudno}e. U drugim istraìvanjima se pokazalo ispitivanjem faktora koagulacije da prve promene nastaju ve} posle dva dana od davanja HCG - human chorionic gonadotropin i da

324


su ove promene maksimalne 8 dana kasnije, {to sugeri{e potrebu za profilaksom, ~ak i pre pojave simptoma OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a.Ovo je naro~ito va`no kod pacijenata sa poznatim prethodnim trombofilnim faktorima. Pored detaljne anamneze, potrebno je ispitati aktivnost AT III, procenu proteina C i S, ispitivanje faktora V, II i MTHFR - 5, 10 methylenetetrahydrofolate reductase gena kod pacijenata sa li~nom i porodi~nom istorijom tromboembolijskih epizoda, ili prethodnim OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Ovaj tip provere zahteva precizna ispitivanja. Kod ovih pacijenata nije dovoljno nadgledati protrombinsko vreme PT - prothrombin time i aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme APTT - activated partial thromboplastin time, radi detekcije hiperkoagulabilnosti. Potrebno je pra}enje D-dimera, AT III, trombin-AT III kompleksa, fibrinopeptida A i B, alfa2 plazmin inhibitora i plazmin-alfa2 antiplazmin kompleksa.

Punkcija ascitesa Abdominalna punkcija je naj~e{}a intervencija kod te{kih slu~ajeva OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Nakon punkcije dolazi do zna~ajnog pobolj{anja sa smanjenjem vrednosti kreatinina u krvi i pove}anjem diureze, uz gubitak teìne. Smanjuje se hematokrit i krvna osmolarnost. U velikoj studiji ura|enoj u Izraelu, punkcija ascitesa je ura|ena abdominalnim ili vaginalnim putem kod 82% OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-a. Indikacije su bile pogor{anje respiratorne funkcije u 74% slu~aja, oligurija u 11% , hemodinami~ka nestabilnost kod 2% i kombinacija ovih faktora u 13% slu~ajeva.

Rezultati ura|ene drenaè su bili pobolj{anje dispneje kod 95% slu~ajeva i pove}anje diureze kod 73% slu~ajeva. Abdominalni pristup ima prednost zbog bolje pristupnosti i optimalnog komfora pacijenta. Edemi trbu{nog zida mogu da u~ine ovaj pristup nemogu}im. Tada se pristupa vaginalnoj punkciji sa aplikacijom posebnih vaginalnih katetera. Zbog rizika od povreda hipervaskularizovanih i uve}anih ovarijalnih cisti ili creva i ostalih komplikacija, kao {to je postparacentezni bilateralni vulvarni edem, obavezna je ultrazvu~na kontrola u toku procedure. U slu~aju ultrasonografskih nalaza dèpova ascitesa ve}ih od 5 cm obavezna je transvaginalna ili abdominalna punkcija. Kod hipoalbuminemije indikovano je davanje 250 ml 25% albumina tokom 3- 4 ~asa nakon punkcije. Postoje nekoliko mehanizama zbog kojih uklanjanje ascitesa pove}ava diurezu i smanjuje hemokoncentraciju: 1. Smanjenje intra abdominalnog pritiska moè ublaìti kompresiju vene cave, olak{avaju}i venski protok i sr~ani rad sa pove}anjem urinarne perfuzije, 2. Dekompresija uretera, tako|e pove}ava diurezu, 3. Uklanjanje dela medijatora odgovornog za proces OHSS-ovarian hyperstimulation syndroma prisutnog u peritonealnoj te~nosti. U jednoj studiji je analizirana diureza nakon drenaè ascitesa sa pretpostavkom da punkcija ima direktan uticaj na produkciju urina. Me|utim, naglo smanjenje intra abdominalnog pritiska uzrokovano brzom i totalnom punkcijom olak{ava prelazak te~nosti iz intravaskularnog dela u peritonealnu {upljinu i brzu ponovnu akumulaciju ascitesa i smanjenje efektivnog

325


intravaskularnog volumena. Uklanjanje velikih volumena te~nosti dalje iscrpljuje proteine izgubljene iz intravaskularnog prostora. Ovo ~esto vodi niskoj intravaskularnoj koncentraciji proteina i neravnoteì elektrolita, naro~ito kada se punkcija ponavlja. Niska intravaskularna koncentracija proteina izaziva dalju akumulaciju te~nosti u abdominalnoj, pa ~ak i u pleuralnoj {upljini. Zato se predlaè obavezno intravensko davanje makromolekula, albumina, HAES - hydroxyethyl starch rastvora uz kontrolu hemodinami~kih parametara. Zbog tih razloga su neki autori predlagali upotrebu autoreinfuzije aspirisane te~nosti. Autoinfuzija je obavljena upotrebom kompletne te~nosti. Punkcija se obavlja vaginalno pod strogo sterilnim uslovima. Dobijena te~nost se ~uva na 4°C da bi se uradila bakteriolo{ka kultura uzorka i reinfuzija nakon 48 ~asova. Da bi se izbegla infuzija nekoncentrisanih, zna~i velikih volumena te~nosti i kontaminacija bakterijama i }elijama, druga grupa autora je koristila ultrafiltraciju sa dva filtera: celulozno acetatskim vlaknastim filterom koji uklanja }elije i bakterije i poliakrilonitrilnim vlaknastim ultrafilterom koji koncentri{e protein pre reinfuzije. Dobijena koncentracija proteina nakon filtracije je dvostruko pove}ana, a koncentracija albumina 2 - 5 puta. Te~nost se reinfuzira intravenski brzinom od 300500 ml na svakih 6 ~asova. U nekim radovima je opisano peritoneovensko premo{}avanje, koje se koristi kod ciroze jetre. Da bi se postiglo peritoneovensko premo{}avanje abdominalni kateter je spojen sa antekubitalnim venskim kateterom preko peristalti~ne pumpe sa mikrofilterom pre~nika 10µm, brzinom od 100 - 200 ml/h. Kontrolna grupa je tretirana intravenskim davanjem albumina

37.5g dnevno. U grupi pacijenata kojima je ura|eno peritoneovensko premo{}avanje, pokazali su se bolji rezultati u pore|enju sa pacijentima koji su primali albumin, skra}enjem boravka u bolnici, pobolj{anjem hematokrita, diureze, krvnog pritiska i serumske koncentracije proteina. Autori su pretpostavili da recirkulacija ascita koji sadrè potencijalne OHSS - ovarian hyperstimultion syndroma medijatore moè olak{ati degradaciju ovih medijatora u jetri, plu}ima ili bubrezima, dok su prethodno bili zarobljeni u peritonealnoj {upljini. Nakon peritoneovenskog premo{}avanja, koncentracije medijatora kao {to su renin, angiotensin I i II i VEGF - vascular endothelial growth factor su se smanjili u serumu kod pacijenata sa te{kim OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-om. Potrebno je naglasiti da se peritoneovenskim premo{}avanjem izbegava naglo smanjenje abdominalnog pritiska uzrokovanog paracentezom. Peritoneovensko premo{}avanje i autoinfuzija nisu postali klasi~ni pristupi tretmanu OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a zbog komplikovane primene i straha od sepse.

Pleuralna punkcija i tretman pulmonalnih komplikacija Procena dispnoi~nih pacijenata sa te{kim OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-om uklju~uje fizi~ki pregled, radiografiju grudnog ko{a i arterijalnu gasnu analizu krvi. Va`no je precizno proceniti pulmonalne i ventilacione smetnje i rezultuju}u hipoksiju i primeniti odgovaraju}i tretman. To je naro{ito va`no, jer je dokazano da maj~inska hipoksija u ranim fazama trudno}e moè da izazove poba~aj.

326


Kiseoni~ka dopuna i rano uklanjanje te~nosti iz slobodnog prostora smanjuje rizik od hipoksije. Torakocenteza nije neophodna kod svih slu~ajeva. U slu~ajevima gde je ura|ena do{lo je do pobolj{anja klini~kog statusa. Potreba za ponovljenom torakocentezom je retka, ~ak i kod slu~ajeva reakumuliranog izliva. Predloèno je postavljanje grudne drena`ne cevi za bilateralnu drenaù. Definitivno pobolj{anje klini~ke slike je prime}eno nakon upotrebe ove procedure. Istovremena drenaà ascitesa je kori{}ena bez potrebe za ascitnom punkcijom. Sindrom akutnih respiratornih smetnji ARDS - acute respiratory distress syndrome je prime}en nakon preoptere}enja usled davanja velikih koli~ina te~nosti, preko 5000 ml dnevno, {to nagla{ava potrebu odràvanja stroge ravnoteè ulaza i izlaza te~nosti. ARDS - acute respiratory distress syndrome se generalno povla~i nakon 3 - 6 dana uz ograni~enje unosa te~nosti, kontrolisanu diurezu i upotrebu dopamina.

Hirur{ki pristup OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-u Hirur{ki pristup koji je preporu~ivan u po~etku treba izbe}i, osim ako se sumnja na krvarenje usled folikularne rupture, ili torzije jajnika. Operacija treba da bude minimalno invazivna uz pa`ljivu hemostazu da bi se o~uvao funkcionalni deo jajnika koliko je god to mogu}e. Jedna od preporu~enih operativnih tehnika je aspiracija folikularnih cisti uz verovanje da eliminisanje njihovog sadràja moè smanjiti ovarijalnu aktivnost OHSS-ovarian hyperstimulation syndrome-a medijatora, mada bi ovo trebalo biti uravnoteèno sa rizikom izazivanja krvarenja jajnika {to moè dovesti do ovariektomije i neplodnosti.

Vaskularne hirur{ke procedure su nekada neophodne za tretman tromboza koje su otporne na terapiju lekovima, ili koje se dovode u vezu sa visokim rizikom od embolije. Postoje izve{taji o posterolateralnoj torakotomiji, subklavijalnoj arteriotomiji i tromboarteriektomiji u skladu sa Fogartijevom tehnikom. Kliping inferior vena cave u cilju spre~avanja masivne pulmonalne embolije je tako|e primenjen. Amputacija usled gangrene, uprkos arterijskoj embolektomiji je, tako|e, opisana. Mezenteri~ka resekcija, nakon masivnog infarkta mezenteri~ne arterije je, tako|e, bila neophodna. Slu~aj perforacije duodenalnog ulcerusa pripisan helicobacter pylori u vezi sa intenzivnim stresom povezanim sa te{kim oblikom OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a je, tako|e, objavljen. Prekid trudno}e je obavljen u nekim ekstremnim slu~ajevima sa arterijskim opstrukcijama radi pobolj{anja klini~ke slike sa neurolo{kim, hematolo{kim i vaskularnim smetnjama.

Preventivni tretman Preventivni tretman zauzima sve va`nije mesto u mnogobrojnim radovima o OHSS - ovarian hyperstimultion syndromu. Velika prepreka prou~avanju ove ozbiljne komplikacije je njena relativno mala frekventnost pojavljivanja. Do danas su samo dve studije prikupile veliki broj slu~ajeva, od kojih je jedna Abramov-aiz 1998. godine, gde su prou~ene i analizirane pulmonalne komplikacije kod 209 te{kih oblika OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a,i druga, Delvigne-ova iz 1993. godine, gde su prou~ene klini~ke osobine i prediktivni faktori kod 128 pacijenata.


Patofiziologija i kontrola OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a ostaju nesigurne. Tretman akutne faze se samo oslanja na empirijski i simptomatski pristup. Adekvatnije metode bi zahtevale bolje razumevanje osnovnih patofiziolo{kih mehanizama za unapre|enje etiolo{kog terapeutskog pristupa. Ovo moè dovesti do razvoja preventivnih strategija pre pojave znakova te{kog oblika OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a sli~no prevenciji eklampsije kod rizi~nih pacijenata tokom trudno}e. Neki autori sugeriraju izostavljanje primena HCG - human chorionic gonadotropina u slu~ajevima ozbiljnog rizika od OHSS-ovarian hyperstimulation syndrome-a. U slu~ajevima indukcije ovulacije kada se ne koriste GnRH - gonadotropin releasing hormon agonisti, postoji mogu}nost pojave spontanog LH - luteinizing hormone peak-a i spontanog za~e}a sa potenciranjem razvoja OHSS - ovarian hyperstimulation syndroma, posebno ako se ima u vidu da se ovulacija odigrava i 11 dana nakon prestanka gonadotropin terapije. U IVF - in vitro fertilisation poznato je da je cilj programa, po definiciji, pove}anje broja oocita. S druge strane, jedina sigurna metoda u spre~avanju razvijanja OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-a je ne davanje HCG - human chorionic gonadotropina, kao i odustajanje od ciklusa. Sve ostale procedure, uglavnom, smanjuju rizik ili ozbiljnost OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a pre nego {to potpuno spre~avaju razvijanje ovog sindroma.

Coasting - tehnika je opisana po~etkom 1990. godine i vrlo brzo nakon toga primenjena u slu~ajevima IVF - in vitro fertilisation ciklusa. Bazirana je na pretpostavci da nivo estradiola koji je dostignut u vremenu

327

primene HCG - human chorionic gonadotropin-a ima zna~ajnu ulogu u predvi|anju razvijanja OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Kada je kod rizi~nog pacijenta visok nivo estradiola prestaje se sa davanjem egzogenih gonadotropina, a nastavlja se sa primenom GnRh- gonadotropin releasing hormon agonista. Primena HCG human chorionic gonadotropin-a se odlaè dok se nivo serumskog estradiola ne spusti u sigurnu zonu, ukazuju}i na taj na~in na atreziju granuloznih }elija. Ispitivanja su pokazala da je coasting metoda efektivna i da smanjuje rizik od OHSS-ovarian hyperstimulation syndrome-a, iako potpuno ne elimini{e mogu}nost pojave ovog sindroma. Metoda je povezana sa smanjenjem broja dobijenih oocita, posebno ukoliko je coasting - period produèn 24 h do 72 h. S druge strane, kvalitet oocita nakon coastinga - metode je smanjen isto kao i receptivnost endometrijuma nakon pada nivoa estradiola. Od kako je 1991. godine dokazano da aspiracija folikula indukuje intrafolikularno krvarenje koje ima negativan uticaj na formiranje corpus luteuma, javila se ideja da pra`njenjem folikularnog sadràja moè da se uti~e na folikularnu maturaciju i modifikovanje intraovarijalnih mehanizama odgovornih za pojavu OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Ovi podaci su kontradiktorni.

EUFA - early unilateral folicular aspiration, unilateralna punkcija folikula se primenjuje 10 - 12 h nakon primene HCG human chorionic gonadotropin-a, nakon ~ega sledi punkcija drugog jajnika 35 - 36 h nakon primene HCG - human chorionic gonadotropina. Ovom metodom nije u potpunosti eliminisan rizik od pojave te{kog oblika OHSS

328


- ovarian hyperstimulation syndrome-a. Invazivna priroda ove metode, dve punkcije uz eventualnu primenu anestezije, ~ini da ova metoda nije ~e{}e primenjivana u odnosu na coasting - metodu. Modifikacija metoda za izazivanje ovulacije podrazumeva redukciju doze HCG human chorionic gonadotropina, ili izazivanje ovulacije primenom rLH - rekombinantni luteiniziraju}i hormona, ili endogeno indukovanim LH - luteinizing hormone talasom. Iako su rezultati pokazali da primena glikokortikoida ne smanjuje rizik od OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a novija istraìvanja koja ukazuju na eventualnu inflamatornu etiopatologiju OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-a ponovo aktuelizuju eventualnu upotrebu glikokortikoida u slu~ajevima OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-a.

Progesteron Pretpostavljeni su razli~iti mehanizmi delovanja profilakti~ke primene progesterona u visokim dozama u spre~avanju pojave OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a: - op{ti antiestrogeni efekat progesterona posredovan down regulacijom estrogenih receptora, na primer na vaskularnom endotelu, - direktna inhibicija sekrecije ovarijalnih hormona, kao {to je prorenin, - antagonisti~kim efektom u odnosu na aldosteron.

Krioprezervacija embriona Umesto prekidanja ciklusa mogu}e je uraditi punkciju na regularan na~in, ali nakon fertilizacije zamrznuti sve embrione, ~ime se rizik od ranog OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a potpuno ne izbegava, ali je

rizik od sekundarne egzarcerbacije ranog OHSS-ovarian hyperstimulation syndrome-a, kao i od kasnog OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a zna~ajno smanjen. Elektrokauterizacija ili laser vaporizacija jednog ili oba ovarijuma se retko primenjuje imaju}i u vidu invazivni karakter ove metode i mogu}e propratne efekte, kao {to su formiranje adhezija i gubitak ovarijalnog tkiva. Ova metoda ima eventualnog opravdanja samo u odre|enim slu~ajevima OHSS ovarian hyperstimulation syndrome-a, kod pacijenata sa PCOS - polycystic ovarian syndrome-om i savetuje se samo kao poslednje sredstvo.

LTMD - long term moderate dosis je terapija za indukciju ovulacije pacijenata kod kojih su prekinuti prethodni ciklusi stimulacije zbog polifolikularne reakcije nalazom preko 10 folikula po ovarijumu sa pre~nikom od 10 - 12 mm i visokim rizikom nastanka OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome-a. Tretirani su kao pacijenti sa hipersenzitivnim ovarijumima na gonadotropine. Da bi se kod ovih pacijentkinja postigla selekcija od maksimalno tri dominantna folikula, u slede}em ciklusu le~enja inicijalna FSH - follicle stimulating hormone doza je bila odgovaraju}e redukovana na 37,5 - 75 IJ i zadràna toliko, dok se nije pokazala selekcija folikula. Dalje je terapija nastavljena sa pove}anom dozom do postizanja jednog preovulacionog folikula. LTMD - long term moderate dosis FSH - follicle stimulating hormone terapija predstavlja sigurnu i korisnu stimulacionu terapiju za le~enje pacijentkinja sa hipersenzitivnim jajnicima sa u dve tre}ine slu~aja izbegavanjem polifolikularne reakcije.

329


18. HIDROSALPINKS I ASISTIRANA HUMANA TEHNOLOGIJA Hidrosalpinks predstavlja blokiranu, dilatiranu, te~no{}u ispunjenu tubu, uglavnom prouzrokovano prethodnom tubarnom infekcijom. Nagomilavanje te~nosti obi~no se de{ava na abdominalnom kraju, najbliè jajniku. Pelvi~ne infekcije koje dovode do hidrosalpinksa naj~e{}e su izazvane seksualno prenosivim oboljenjima, kao {to su chlamydia trachomatis i neisseiriae gonorrhoea.

Sl. 4.106- Histopatolo{ki nalaz epitela kod hidrosalpinksa, normalan epitel pokazuje strelica, limfociti (bele okrugle }elije) u submukozi

Dijagnoza hidrosalpinksa postavlja se uz pomo} histerosalpingograma, procedure pri kojoj se vizualizuje uterusna {upljina i Falopijeve tube.

Sl. 4.107- Histerosalpingogram - obostrani hydrosalpinx

330


Hidrosalpinks se, tako|e, moè dijagnostikovati i uz pomoc laparoskopije i ultrazvuka.

Sl. 4.108- Laparoskopski nalaz hidrosalpinksa

Mnogi pacijenti sa hidrosalpinksom imaju hroni~ni ili povremeni bol, dok su drugi asiptomatski. Pacijenti sa hidrosalpinksom mogu imatu rekurentne akutne tubarne infekcije koje uzrokuju groznicu i bol.

U blaìm slu~ajevima, fertilitet moè da bude uspostavljen hirur{kim otvaranjem tube. Ukoliko je tubarni epitel te{ko o{te}en, IVF - in vitro fertilisation koja premo{tava tube je metoda izbora. Iako se smatra da je IVF -in vitro fertilisation najbolji tretman za hidrosalpinks, prisustvo hidrosalpinksa smanjuje uspe{nost IVF - in vitro fertilisation. Te~nost hidrosalpinksa smanjuje procenat implantacije embriona i pove}ava rizik od abortusa. Zbog ovih razloga, preporu~uje se, ili uklanjanje izmenjene tube, ili laparoskopska koagulacija istmi~nog dela tube pre po~etka IVF - in vitro fertilisation tretmana. Dosada{nja ispitivanja su pokazala da IVF - in vitro fertilisation pacijenti sa hidrosalpinksom imaju upola manje {anse da ostanu u drugom stanju u odnosu na pacijnte bez hidrosalpinksa i da operativni tretman pre IVF - in vitro fertilisation tretmana pove}ava uspe}nost IVF - in vitro fertilisation tretmana.

331


19. ELEKTIVNA REDUKCIJA FETUSA Postoji nekoliko opcija u slu~ajevima rane dijagnoze multiplih trudno}a nakon programa asistirane reproduktivne tehnologije. Pre dono{enja odluke o eventualnoj elektivnoj redukciji fetusa u dogovoru sa bra~nim parom, neophodno je sa~ekati do desete nedelje trudno}e. Razlog za to je ~injenica da kod 10 - 30% multiplih trudno}a, jedan ili vi{e fetusa spontano biva absorbovan, to je tzv. vanished fetus. Ovo se obi~no doga|a pre desete nedelje trudno}e, s tim da procenat raste sa starosnom dobi ène. Multifetalna redukcija je tehnika pri kojoj se smanjuje broj fetusa. Procedura se sprovodi u slu~ajevima kada imamo tri ili vi{e fetusa. Broj fetusa se redukuje na dva ili jedan.

Redukcija fetusa se radi izme|u 10 i 12. nedelje gestacije, ali u izuzetnim slu~ajevima moè i do 24. nedelje. Procedura se izvodi pod kontrolom ultrazvuka, injiciranjem KCl u srce fetusa, {to ima za posledicu smrt fetusa. Fetus koji je eliminisan biva absorbovan, dok ostali nastavljaju da rastu. Sigurno je da elektivna redukcija fetusa otvara brojna eti~ka i medicinska pitanja. Multifetalna redukcija ne izjedna~ava rizike obstetri~kih komplikacija sa onima koje sre}emo kod normalnih trudno}a. Prerani poro|aji sre}u se u 75% slu~ajeva nakon fetalne redukcije, dok se poba~aj preostalih fetusa javlja u oko 10% slu~ajeva. Infekcija nakon intervencije je retka.

332


20. UÊSTALOST HROMOZOMSKIH ABERACIJA KOD NA[IH PACIJENATA U PERIODU OD 2000 - 2005. GODINE Citogeneti~ki nalaz zauzima veoma va`nu ulogu u asistiranoj reprodukciji, kako zbog otkrivanja eventualnog uzroka steriliteta ili infertiliteta kod le~enih parova, tako i zbog kasnijeg dijagnostikovanja kariotipa ploda kod onih parova koji su u{li u program. Iako u na{oj zemlji nije ura|ena populaciona studija koja bi registrovala ljude sa nenormalnom hromozomskom konstitucijom, podaci iz strane literature govore da je u~estalost individua sa razli~itim numeri~kim aberacijama hromozoma oko 0,85%, a u~estalost ljudi sa strukturnim aberacijama hromozoma oko 0.1%.

Sl. 4.109- Kariotip ~oveka

U Specijalnoj bolnici u Beogradu analizirani su kariotipovi iz limfocita periferne krvi tehnikom G-traka kod pacijenata le~enih od steriliteta u periodu od 5 godina. Od ukupnog broja, u 3% slu~ajeva registrovani su razli~iti poreme}aji u broju ili strukturi hromozoma. Svi pacijenti kod kojih je ura|ena citogeneti~ka analiza mogli su se svrstati u tri kategorije:

Prvu grupu sa~injavale bi osobe kod kojih je nenormalna hromozomska konstitucija direktno povezana sa sterilitetom i specifi~nim izgledom. Nju sa~injavaju individue sa aneuploidijom polnih hromozoma, osobe sa nedostatkom ili vi{kom X ili Y hromozoma. U drugu grupu pacijenata spadaju osobe normalnog fenotipa sa takozvanim balansiranim kariotipom, tj. kariotipa kod koga je ukupna koli~ina naslednog materijala ostala o~uvana, iako je do{lo do preraspodele gena unutar jednog, ili razmene gena izme|u dva hromozoma. Ovi pacijenti skoro po pravilu imaju smanjen reproduktivni potencijal i u zavisnosti od tipa aberacije, sa razli~itim stepenom rizika, mogu o~ekivati nenormalno potomstvo.

333


Tre}u grupu pacijenata predstavljale bi osobe sa normalnim kariotipom. Ne treba isklju~iti mogu}nost da se i unutar ove najmnogobrojnije grupe pacijenata ipak na|u osobe ~iji je sterilitet naslednog porekla, izazvan razli~itim tipovima genskih mutacija. Poznato je da mu{ki sterilitet moè nastati kao posledica recesivne mutacije na X - hromozomu, odsustva spermatogeneze izazvanog nedostatkom peptida hipotalamusa odgovornog za sekreciju gonadotropina, Kallmann-ov sindrom, ili recesivnom mutacijom na autozomima koja uzrokuje nepokretljivost spermatozoida, Kartagener-ov sindrom. U na{em uzorku aberantnih kariotipova preovla|uju oni kod kojih se registruje neka od strukturnih aberacija hromozoma: delecija, inverzija ili translokacija.

Tu spadaju poliploidije, aneuploidije svih autozoma sa izuzetkom trizomija: hromozoma 13, Patau-ov sindrom, hromozoma 18, Edwards-ov sindrom i hromozoma 21, Down-ov sindrom. Od pobrojanih vijabilnih trizomija jedino je kod èna sa Down-ovim sindromom o~uvan reproduktivni potencijal. Iz tih razloga, jedine o~ekivane numeri~ke aberacije hromozoma bile bi aneuploidije polnih hromozoma. Registrovane su: - Monozomija X-hromozoma kod ène, kariotip 45, X, Turner-ov sindrom, - Dizomija X-hromozoma kod mu{karca, kariotip 47, XXY Klinefelter-ov sindrom, - Dizomija Y-hromozoma kod mu{karca, kariotip 47, XYY. Od svih prethodno pobrojanih aneuploidija polnih hromozoma naju~estaliji su mu{karci sa Klinefelter-ovim sindromom, dok se najre|e sre}u ène sa Turner-ovim sindromom.

Sl. 4.110 - Zastupljenost numeri~kih i strukturnih aberacija hromozoma kod pacijenata sa aberantnim kariotipom

Ovi podaci ne{to se razlikuju od podataka objavljenih u literaturi, gde se numeri~ke aberacije smatraju u~estalijim od strukturnih aberacija hromozoma, kako u op{toj populaciji tako i kod pacijenata le~enih od steriliteta.

Kariotipovi sa numeri~kim aberacijama hromozoma Od svih tipova numeri~kih aberacija najve}i broj je inkompatibilan sa ìvotom.

Sl. 4.111- Distribucija pacijenata sa numeri~kim i strukturnim aberacijama hromozoma

@ene sa Turner-ovim sindromom su veoma niskog rasta, u proseku oko 145 cm, sterilne su sa slabo razvijenim sekundarnim seksualnim karakteristikama, kratkog i zadebljalog vrata.

334


Sl. 4.112- Turner-ov sindrom, kariotip 45, X

Sl. 4.113- Klinefelter-ov sindrom, kariotip 47,XXY

Ovaj sindrom ne nastaje isklju~ivo kao posledica nedostatka X - hromozoma, ve} tako|e i kao rezultat strukturnih aberacija jednog od X - hromozoma, prisustva izohromozoma Xq ili Xp, kariotip 46, X isoXq, ili 46, XisoXp, ili delecije kratkog kraka Xhromozoma, 46, X Xp. Neki pacijenti sa Turner-ovim sindromom kod kojih se registruje mozai~ni kariotip, 45, X/46, XX, mogu biti fertilni, po{to se kod njih umesto primitivnih seksualnih traka mogu na}i funkcionalni jajnici. Na osnovu u~estalosti Turner-ovog sindroma u populaciji od 1 : 2500, mogla bi se o~ekivati njegova ve}a u~estalost i u na{em uzorku. Ovaj sindrom se, uglavnom, dijagnostikuje pre reproduktivnog perioda, pa se samim tim i mali broj èna sa Turner-ovim sindromom prijavljuje za program asistirane reprodukcije.

Mu{karci sa Klinefelter-ovim sindromom, kariotip 47, XXY, su evnuhoidnog izgleda, sterilni, sa izraènim, hipogonadizmom i izduènim ekstremitetima. Njihov izgled direktno je povezan sa smanjenom produkcijom testosterona. Na 1000 de~aka rodi se jedan sa dizomijom X - hromozoma. Iako se u citogeneti~koj praksi u 15% slu~ajeva Klinefelter-ov sindrom moè na}i u mozai~noj formi: kariotip, 46, XY/47, XXY, kod koje postojanje }elijskih linija sa normalnim kariotipom moè da bude razlog za fertilnost ovih mu{karaca, u na{em uzorku oni nisu registrovani. Ekstremni oblici Klinefelter-ovog sindroma sa polizomijom X - hromozoma: kariotipovi 48, XXXY i 49, XXXXY, ina~e veoma retki, ni u na{em uzorku nisu bili prisutni.

335


Sl. 4.114- Kariotip Klinefelte r - ov sindrom

Dizomija Y - hromozoma kod mu{karaca, kariotip 47, XYY, uz trizomiju X-hromozoma kod èna, kariotip 47, XXX, predstavlja redak primer aneuploidije u kome je reproduktivni potencijal pacijenata o~uvan. Mu{karac sa dizomijom Y- hromozoma ne razlikuje se bitno od mu{karaca sa normalnim kariotipom 46, XY. U njihove specifi~nosti bi se mogle ubrojati ne{to vi{i rast od proseka i agresivno pona{anje. Treba ipak ista}i da se problemi sa infertilitetom javljaju ne{to ~e{}e nego u populaciji mu{karaca sa normalnim kariotipom.

Po podacima iz literature u~estalost strukturnih aberacija hromozoma manja je u odnosu na u~estalost numeri~kih aberacija hromozoma, kako u op{toj populaciji, tako i u grupi pacijenata le~enih od steriliteta, i kre}e se oko 0,1%. Balansirane translokacije se navode kao naju~estaliji tip od svih strukturnih aberacija. Na{i podaci razlikuju se od citiranih, s obzirom da je na|ena ve}a u~estalost pacijenata sa strukturnim aberacijama hromozoma od pacijenata sa numeri~kim aberacijama hromozoma. U na{em uzorku dominantni tip strukturnih aberacija su inverzije, koje ~ine 63% svih registrovanih strukturnih aberacija. Pored inverzija na|eni su pacijenti sa razli~itim tipovima heterologih i Robertsson-ovih translokacija kao pacijenti sa delecijom Y- hromozoma.

Kariotipovi sa strukturnim aberacijama hromozoma Promene u strukturi hromozoma mogu obuhvatiti jedan hromozom, tzv. intrahromozomske preraspodele gena i u njih spadaju: delecije, gubitak gena, inverzije, promena redosleda gena na hromozomu i izohromozomi, dupliranje gena sa jednog kraka hromozoma uz istovremeni gubitak gena sa drugog kraka hromozoma. Promene koje obuhvataju dva i vi{e hromozoma su tzv. interhromozomske preraspodele gena, u koje spadaju translokacije razmena gena izme|u dva hromozoma i duplikacije dupliranje gena na hromozomu.

Sl. 4.115- Zastupljenost pacijenata sa strukturnim aberacijama hromozoma

Inverzije Inverzije nastaju kao rezultat dvostrukog prekida na hromozomu pri ~emu se prekinuti fragment zarotira za 180o pre nego {to }e se hromozom ponovo sastaviti. Prilikom rotacije prekinutog fragmenta izmeni se linearni raspored gena na hromozomu.

336


Sl. 4.116- Pericen tri~na inverzija

Ukoliko se jedan prekid desi iznad, a drugi ispod centromere, tako da invertovani fragment obuhvata centromeru, inverzija se naziva pericentri~na. U slu~aju pericentri~ne inverzije menja se morfologija hromozoma. Ukoliko se dvostruki prekid desi na jednom od krakova hromozoma, inverzija je paracentri~na i ne dolazi do promene morfologije hromozoma. Inverzije, skoro po pravilu, ne pokazuju {tetne posledice za nosioca. Moè do}i do pozicionog efekta, {to podrazumeva izmenjenu ekspresiju gena. Pove}ana aktivnost nekih protoonkogena moè prouzrokovati transformaciju normalne }elije u malignu, dok smanjena aktivnost gena dovodi do nedostatka odre|enog proteina }eliji, {to se tako|e manifestuje kao poreme}aj. Iako je u literaturi opisan veoma velik broj pojedina~nih primera u kojima je kod nosioca razli~itih tipova inverzija bio ispoljen neki poreme}aj ili oboljenje, smatra se da je prisustvo invertovanog hromozoma uglavnom bilo rezultat slu~ajnosti, a ne razlog za ispoljavanje oboljenja. Osnovni problem za nosioca invertovanog hromozoma sastoji se u naru{enom procesu gametogeneze. Taj problem je izraèniji kod mu{karaca nego kod èna.

Nezavisno od tipa hromozoma, oligospermija ili azospermija prisutni su skoro po pravilu kod nosioca pericentri~nih inverzija. [to je invertovani fragment na hromozomu ve}i posledice na spermatogenezu su teè. Razlog za poreme}aj gametogeneze leì u ~injenici da je oteàno sparivanje invertovanog hromozoma i njegovog homologog para u mejozi. Ne retko, kada je invertovani fragment veoma velik, sinapti~ki kompleks se, ~ak, i ne formira asinapsis, pa se kao posledica toga stvaraju aneuploidni gameti, gameti sa vi{kom ili nedostatkom hromozoma.

Sl. 4.117- Inverziona petlja

U slu~ajevima gde se sinapti~ki kompleks formira, sinapsiranje izme|u normalnog i invertovanog hromozoma se odvija tako {to invertovani hromozom pravi petlju da bi se identi~ni genski lokusi normalnog i invertovanog hromozoma sparili. U retkim slu~ajevima kada se rekombinacija ili crossing-over desi u regionu inverzione petlje stvori}e se nebalansirani hromozomi sa duplikacijom i delecijom. Gameti koji budu sadràvali nebalansirane hromozome, nebalansirani gameti, prilikom sparivanja sa normalnim gametima da}e potomstvo sa poreme}ajem. U na{em uzorku registrovane su inverzije tri razli~ita hromozoma:


- Inverzija hromozoma 9 u 25 slu~ajeva - Inverzija hromozoma 1 u jednom slu~aju - Inverzija hromozoma 19 u jednom slu~aju. Sve inverzije u zavisnosti od veli~ine invertovanog fragmenta pokazuju razli~it stepen negativnih posledica na reprodukciju. Kod mu{karaca je {tetni efekt lak{e uo~ljiv s obzirom na ~injenicu da se u ve}ini slu~ajeva, bez obzira na tip inverzije, javlja oligospermija. Najzna~ajnija i naj~e{}e na|ena inverzija je inverzija hromozoma 9, koja pored oligospermije u odre|enom broju slu~ajeva dovodi i do azospermije.

337

akrocentri~ne hromozome, hromozomi D grupe 13, 14, i 15 i hromozomi G grupe 21 i 22. Kao rezultat razmene gena izme|u dva akrocentri~na hromozoma nastaje jedan hromozom sa skoro celokupnom koli~inom gena dva hromozoma i jedan hromozom sa zanemarljivo malom koli~inom gena koji se gubi, tzv. minutni hromozom.

Translokacije Translokacije predstavljaju razmenu segmenata izme|u dva hromozoma. One mogu biti recipro~ne, kada svaki hromozom daje i dobija odre|eni segment, ili nerecipro~ne, kada segment jednog hromozoma prelazi na drugi hromozom.

Sl. 4.118- Reciprocna translokacija izme|u hromozoma X i 21

Nerecipro~ne translokacije jo{ se nazivaju i insrecije. Poseban vid recipro~nih translokacija su Robertsson-ove translokacije ili hromozomske fuzije. One su karakteristi~ne za

Sl. 4.119- Mehanizam nastanka Robertsson -ove translokacije

Na taj na~in svaki nosilac Robertssonove translokacije sadrì u somatskim }elijama 45 umesto 46 hromozoma. Uprkos ~injenici da nedostaje jedan ceo hromozom, zbog postojanja translociranog hromozoma koji sadrì skoro kompletnu koli~inu gena dva hromozoma, kariotip nosioca Robertsson-ove translokacije ozna~ava se kao balansiran. Nosioce translokacija, uglavnom, karakteri{e normalan fenotip. Kao i u slu~aju inverzija i kod nosioca translokacija moè da se ispolji pozicioni efekt. Njihova gametogeneza je specifi~na, jer se svaki translocirani hromozom sparuje sa homologim regionima dva hromozoma istovremeno, pa se u pahitenu prve mejoti~ke deobe umesto bivalenata formira kvadrivalent, kod obi~nih heterologih translokacija, ili trivalent kod Robertssonovih translokacija.

338


Sl. 4.120- Gametogeneza kod nosioca Robertsson -ove translokacije

Razdvajanje trivalenta ili kvadrivalenta moè se odigrati na tri na~ina. U dva slu~aja na kraju mejoze dobijaju se gameti sa nebalansiranim kariotipom, gameti koji imaju duplirane gene jednog hromozoma translokacione dizomije i istovremeno nedostatak gena drugog hromozoma. Ovakav tip razdvajanja naziva se susedni, a rezultat dva tipa susednog razdvajanja je formiranje ~etiri tipa razli~itih gameta sa nebalansiranim kariotipom. U jednom slu~aju razdvajanje moè da bude tako da u jednu }eliju odu translocirani hromozomi, ili samo jedan translocirani u slu~aju Robertsson-ovih translokacija, a da u drugu }eliju odu dva normalna hromozoma. Ovakvo razdvajanje kvadrivalenta ili trivalenta naziva se naizmeni~no ili alternativno i rezultira}e nastankom normalnih gameta i gameta sa balansiranim kariotipom na kraju mejoze.

Iz svega izloènog moè se zaklju~iti da svaki nosilac translokacije formira {est tipova razli~itih gameta, pri ~emu samo u jednom slu~aju nastaje gamet sa normalnim kariotipom i u jednom slu~aju gamet sa balansiranim kariotipom. Pod pretpostavkom da je verovatno}a nastanka svih tipova gameta podjednaka, procenjuje se da svaki nosioc translokacije nosi rizik od 2/3 ili 66% za dobijanje nenormalnog potomstva. Verovatno}a da se dobije normalan potomak iznosi svega 1/6. U na{em uzorku od ukupnog broja translokacija preovladavali su pacijenti sa Robertsson-ovim translokacijama. Od Robertsson-ovih translokacija su na|ene: - Translokacija hromozoma 14 i 21, kariotip 45, XX t (14/21) - Translokacija hromozoma 13 i 14, kariotip 45, XY t (13/14).


339

U slu~aju braka normalnog mu{karca i ène sa translokacijom 14 i 21 rizik po potomstvo je prikazan na slede}oj slici.

Sl. 4.121- Kariotip ène sa translokacijom hromozoma 14 i 21

Robertsson-ove translokacije u kojima u~estvuje hromozom 21 predstavljaju posebnu nepovoljnost za nosioce, po{to kod njih postoji pove}an rizik za dobijanje deteta sa Down-ovim sindromom, teoretska verovatno}a 16%. Zbog toga se svim trudnicama koje poseduju ovu anomaliju preporu~uje prenatalna dijagnostika. Kod èna nosioca translokacije registruje se pove}an broj spontanih poba~aja. Do njih dolazi po{to jajnu }eliju sa nebalansiranim kariotipom oplodi normalan spermatozoid. Embrion koji tom prilikom nastaje uglavnom je inkompatibilan sa ìvotom.

Sl. 4.122- Kariotip nosioca translokacije hromozoma 13 i 14

Sl. 4.123- Mu{karci i ène sa translokacijom 14 i 21

Mu{karce nosioce Robertsson-ove translokacije, pored rizika za dobijanje nenormalnog potomstva, ~esto prati oligospermija, {to kod njih dodatno komplikuje planiranje porodice. Od heterologih translokacija na|eni su pacijenti kod kojih je do{lo do razmene izme|u hromozoma 7 i 15, kao i izme|u hromozoma 2 i 9.

Sl. 4.124- Translokacija hromozoma 7 i 15

340


Sl. 4.125- Translokacija hromozoma 2 i 9

Delecije Delecije predstavljaju gubitak gena sa hromozoma. One mogu biti terminalne, kada jednostruki prekid dovodi do gubitka hromozomskih krajeva, ili intersticijalne, kada dvostruki prekid unutar hromozoma izazove gubitak prekinutog fragmenta. Sve delecije su veoma {tetne za nosioca, ali stepen {tetnosti varira u zavisnosti od veli~ine izgubljenog fragmenta, kao i od hromozoma na kome je do gubitka do{lo. Delecije se nazivaju i parcijalne monozomije, po{to je odre|en broj gena zbog gubitka homologog para prisutan u jednoj dozi. êsto delecije imaju letalan efekat. U najpoznatije primere delecija u humanoj genetici mogu se navesti: delecija kratkog kraka hromozoma 5, 5p-, sindrom ma~jeg pla~a, delecija dugog kraka hromozoma 13, 13q-, Praeder-Vili-ov sindrom. Neki oblici

Sl. 4.126- Delecije - parcijalne monozomije

tumora kao {to je retinoblastom mogu nastati kao rezultat delecije na dugom kraku hromozoma 13. Od svih delecija najmanje su {tetne delecije na Y - hromozomu. U odnosu na svoju veli~inu ovaj hromozom sadrì relativno malo gena, oko 50. Najbitniji je gen koji kontroli{e transformaciju Milerovih kanala u Volfove, tj diferencijaciju testisa. Gubitak ovog gena, gena za TDF - testis determining factor, moè izazvati sindrom reverzije pola. Pored ovog, za proces spermatogeneze su bitna tri genska lokusa koja kontroli{u sintezu takozvanih faktora azospermije, geni AZF - azoospermia factors a, b, i c . Gubitak nekog od njih uslovi}e oligospermiju, dok gubitak sva tri izaziva azospermiju. Neki podaci govore da je zastupljenost delecija Y - hromozoma prisutno kod 20% pacijenata sa oligospermijom ili azospermijom.

341


21. STATISTI^KI PREGLED REZULTATA ASISTIRANE REPRODUKTIVNE TEHNOLOGIJE U EVROPSKIM ZEMLJAMA Da bi se stekao utisak o primenljivosti metoda asistirane reprodukcije u svakodnevnoj klini~koj praksi u svetu sa svim statisti~kim podacima, uzet je jedno-

godi{nji ESHRE - european society for human reproduction and embryology izve{taj ART - assisted reproductive technology u Evropi za 2000. godinu.

Tabela 4-24: Broj tretmana

Zemlje

Belgija

Broj IVF klinika u zemlji Broj Izveštaji klinika klinika 27 25

êška Republika

16

7

Danska Finska Francuska Nema~ka Gr~ka Ma|arska Island Irska Italija Holandija

16 18 93

16 17 88 103 8 7 1 3 75 13

46 8 1 5 115 13

Tretmani IVF

ICSI

FER

OD

Ali

3316

5667

2340

500

11823

1459

706

376

64

2605

158 290 143 0 244 18 23 0 806 0

9682 7489 56754 63005 5888 2157 364 1570 19835 15062

5278 3004 1242 2651 1672 2876 23347 23228 10036 35285 16991 10729 2310 3075 259 772 1355 12 153 103 85 782 527 261 6876 9419 2734 9563 4162 1336

342


Norve{ka

8

8

2624

1405

311

0

4340

Poljska

15

12

1065

1812

816

35

3728

Portugal

16

11

896

1063

120

0

2079

Slovenija

3

3

957

1046

371

0

2374

Rusija [panija [vedska [vajcarska

30 182 15 17

21 36 15 17

4155 3974 4048 954

1440 6645 3749 2010

316 2323 1408 1680

452 6363 1577 14519 0 9205 0 4644

Velika Britanija Ukrajina

75 10

75 8

15694 10645 802 252

6160 8

2135 34634 85 1147

>729

569

126961 99976 45800 6530 279267

Ukupno

Tabela prikazuje broj svih stimulisanih ciklusa zabeleènih u svakoj zemlji, broj klinika u zemlji i broj klinika koje su slale izve{taj za registraciju. Ciklusi su podeljeni na IVF - in vitro fertilisation, ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, FER - frozen

embryo replacement i OD - ovum donation. U Belgiji, Islandu i Sloveniji je prikazan broj aspiracija, jer broj iniciranih ciklusa nije bio na raspolaganju. Ukupno je 569 klinika iz 22 zemlje prijavilo 279 267 ciklusa.

Tabela 4-25: Broj prijavljenih ciklusa, poro|aja i beba u odnosu na populaciju i nacionalni broj ìvo-ro|ene dece. Ciklusi uklju~uju IVF, ICSI, FER i OD.

Zemlje

Broj Populacija Cik/mi ART ART Nacionalni ART ciklusa br 1 poro|aji bebe br.poro|aja bebe%

Danska 9682 Finska 7489 Francuska 56754 Island 364 Holandija 15062 Norve{ka 4340 [vedska 9205 [vajcarska 4644 Velika Britanija 34634

5.25 5.18 59.08 0.28 15.93 4.47 8.87 7.21 59.76

1830 1446 961 1300 946 971 1038 644 580

Ukupno

166.07

856

1421744

2457 1184 8357 102 NA 860 1854 783 5553

2457 1293 10334 166 NA 1223 2253 809 7677

67081 56742 744791 4315

3,7% 2,3% 1,4% 3,8%

59234 90441 78458 679029

2,1% 2,5% 1,0% 1,1%

343


Zemlje kod kojih su kompletno sve klinike koje rade slale izve{taje nacionalnom registru date su u slede}oj tabeli. Tabela prikazuje podatke devet zemalja iz kojih su sve klinike slale izve{taje za Registar: Danska, Finska, Francuska, Island, Holandija, Norve{ka, [vedska, [vajcarska i Velika Britanija. Na taj na~in se broj ciklusa odnosi na ukupnu populaciju u zemlji. Osim toga, broj beba ro|enih nakon ART - assisted reproductive technology je izraèn kao pro-

cenat ukupnog broja poro|aja u zemlji. Ukupno je ura|eno 142.174 ciklusa u populaciji od 116 miliona, {to daje srednju vrednost od 856 ciklusa po milionu stanovnika. Broj beba ro|enih nakon ART - assisted reproductive technology se kre}e od 1% do 3.8%. Slede}a tabela prikazuje raspodelu veli~ine 569 klinika koje su slale izve{taje. Veli~ina klinike ili odeljenja je bazirana na svim ciklusima koji su obavljeni tokom godine.

Tabela 4-26: Veli~ina klinike koje su slale izve{taje registru

Broj IVF klinika Veli~ina klinika u zemlji Broj Izve{taj <100 100 -199 200-499 500-1000 >1000 Zemlje klinika klinika ciklusa ciklusa ciklusa ciklusa ciklusa Belgija 27 25 2 6 10 5 2 êška Republika 16 7 1 1 13 2 0 Danska 16 16 1 1 4 9 1 Finska 18 17 2 1 9 3 2 Francuska 93 88 5 6 28 36 13 Nema~ka 103 16 11 29 25 22 Gr~ka 46 8 0 3 3 1 1 Ma|arska 8 7 2 1 3 1 0 Island 1 1 0 0 1 0 0 Irska 5 3 0 1 1 1 0 Italija 115 75 25 24 12 12 2 Holandija 13 13 0 1 0 6 6 Norve{ka 8 8 0 0 5 3 0 Poljska 15 12 4 3 3 2 0 Portugalija 16 11 3 4 3 1 0 Slovenija 3 3 0 0 1 1 1 Rusija 30 21 5 8 5 3 0 [panija 182 36 4 9 14 6 3 [vedska 15 15 2 0 3 7 3 [vajcarska 17 17 4 6 4 2 1 Velika Britanija 75 75 7 17 20 24 7 Ukrajina 10 8 4 2 2 0 0 >729 569 87 105 163 150 64 Ukupno

344


Tabela 4-27: Procentualna starost èna tretiranih sa IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection

Zemlje Belgija ê{ka Republika Danska Finska Francuska Nema~ka Gr~ka Ma|arska Island Irska Italija Holandija Norve{ka Poljska Portugalija Rusija Slovenija [panija [vedska [vajcarska Velika Britanija Ukrajina Ukupno, opseg

< 29 Godina

30 - 34 Godina

35 - 39 Godina

> 40 Godina

23% 49% 22% 19% 20% 18% 9% 28% 23% 5% 13% NA NA 13% 18% 25% 14% 14% 14% 13% 9% 37%

37% 30% 40% 32% 39% 38% 37% 37% 29% 34% 34%

26% 17% 32% 29% 33% 33% 39% 25% 39% 46% 46%

13% 4% 7% 20% 13% 11% 15% 11% 9% 15% 15%

35% 43% 29% 25% 37% 36% 35% 36% 33%

27% 33% 29% 50% 37% 36% 36% 38% 22%

15% 6% 16% 11% 11% 13% 16% 14% 7%

5-49%

25-43%

17-50%

4-20%

Tabela prikazuje procentualnu starost tretiranih èna u raznim zemljama. U razli~itim zemljama opseg starosti èna do

29 godina je od 5 % - 49%, 30 - 34. godine 25% - 43%, 35 - 39. godine 17% - 50%, i preko 40 godina 4% - 20%.

345


Tabela 4-28: Broj transferisanih embriona nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection

Zemlje Belgija

2 embriona 3 embriona 4embriona Ukupno 1embrion % % % % transfera 7754 1003 12.9% 3996 51.5% 2229 28.7% 526 6.8%

ê{ka Republika Danska Finska Francuska Nema~ka Gr~ka Ma|arska Island Irska Italija Poljska Portugalija Rusija Slovenija [panija [vedska [vajcarska Velika Britanija Ukrajina

1783 7053 3756 36406 40928 4713 1853 235 1144 13150 2563 1625 5005 1600 8857 6586 2537 22783 970

198 990 1015 5055 4689 432 141 22 81 1745 431 176 529 327 340 829 340 1825 89

11.1% 14.0% 27.0% 13.9% 11.5% 9.2% 7.6% 9.4% 7.1% 13.3% 16.8% 10.8% 10.6% 20.4% 27.0% 12.6% 13.4% 8.0% 9.2%

Ukupno

171301 20747 12.1% 79917 46.7% 57082 33.3% 11715 6.8%

Tabela prikazuje broj transferisanih embriona nakon kombinovane IVF-in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Ukupan broj transfera jednog embriona je bio 20 756 (12.1%), dva embriona 79 917 (46.7 %), tri embriona 57 082 (33.3%) i ~etiri ili vi{e embriona 11 715 (6.8%). Kao {to se iz tabele vidi, postoje zapaène razlike me|u dràvama u broju tran-

513 5477 2525 16677 18154 786 355 164 462 4396 1458 569 974 1042 1956 5507 1467 13261 178

28.8% 77.7% 67.2% 45.8% 44.4% 16.7% 19.2% 69.8% 40.4% 33.4% 56.9% 35.0% 19.5% 65.1% 22.1% 83.6% 57.8% 58.2% 18.4%

734 586 226 11144 18085 1496 885 49 578 5016 535 783 1657 231 3933 249 687 7697 282

41.2% 8.3% 6.0% 30.6% 44.2% 31.7% 47.8% 20.9% 50.5% 38.1% 20.9% 48.2% 33.1% 14.4% 44.4% 3,8% 27.1% 33.8% 29.1%

338 0 5 1747 0 1999 472 0 23 1993 139 97 1774 0 2138 0 43 0 421

19.0% 0.0% 0.1% 4.8% 0.0% 42.2% 25.5% 0.0% 2.0% 15.2% 5.4% 6.0% 35.4% 0.0% 24.1% 0.0% 1.7% 0.0% 43.4%

sferiranih embriona. Opseg transfera tri embriona je od 3.8 - 50.5%, a opseg transfera ~etiri ili vi{e embriona je od 0 - 43.4%. Podaci o eSET - elective single embryo transfer-u, izabranom jedno-embrionskom transferu su bili dostupni iz 4 zemlje sa ukupno 2295 transfera (Belgija 564, Francuska 1444, Slovenija 6 i [vedska 281).

346


Tabela 4-29: Trudno}e i poro|aji nakon IVF - in vitro fertilisation

Inicirani Aspir- Tran- Trudn- Poro|o}e aji po ciklusi racije sferi ciklusu Belgija 3316 2944 2708 775 619 23.4% ê{ka Republika 1459 1395 1166 357 232 24.5% Danska 5278 4999 4418 1395 1097 26.4% Finska 2651 2546 2242 671 530 25.3% Francuska 23347 20513 17433 4654 3508 19.9% Nema~ka 35285 30353 25327 6827 4489 19.3% Gr~ka 2310 2138 1929 645 487 27.9% Ma|arska 772 699 630 183 137 23.7% Island 153 153 138 63 53 41.2% Irska 782 725 682 166 135 21.2% Italija 6876 6061 5235 1421 1106 20.7% Holandija 9563 8426 7294 2374 24.8% Norve{ka 2624 2463 2229 654 549 24.9% Poljska 1065 1022 898 183 139 17.2% Portugalija 896 807 725 178 125 19.9% Rusija 4155 3793 3615 1100 607 26.5% Slovenija 975 902 789 256 199 26.8% [panija 3974 3406 3032 982 601 24.7% [vedska 4048 3699 3392 1146 889 28.3% [vajcarska 954 871 769 176 140 18.4% Velika Britanija 15694 14015 12794 3489 2725 22.2% Ukrajina 802 778 736 181 128 22.6% Ukupno 126961 112708 98181 27876 22.0% Zemlje

Tabela prikazuje broj trudno}a i poro|aja u odnosu na broj iniciranih ciklusa, aspiracija i transfera za IVF - in vitro fertilisation Nakon IVF - in vitro fertilisation, 27 876 trudno}a rezultovalo iz 98 181 transfera embriona. Prema tome je srednji klini~ki

Trudno}e

po

po

aspiraciji transferu

26.3% 25.6% 27.9% 26.4% 22.7% 22.5% 30.2% 26.2% 41.2% 22.9% 23.4% 28.2% 26.6% 17.9% 22.1% 29.0% 28.4% 28.8% 31.0% 20.2% 24.9% 23.3% 24.7%

28.6% 30.6% 31.6% 29.9% 26.7% 27.0% 33.4% 29.0% 45.7% 24.3% 27.1% 32.5% 29.3% 20.4% 24.6% 30.4% 32.4% 32.4% 33.8% 22.9% 27.3% 24.6% 28.4%

broj trudno}a po transferu embriona bio 28.4% sa opsegom od 20.4 do 47.70%. Broj poro|aja po transferu embriona nakon IVF - in vitro fertilisation nije sumiran zbog nekompletnog pra}enja trudno}e u mnogim zemljama.

347


Tabela 4-30: Trudno}e i poro|aji nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm

Aspir- Tran- Trudn- Poro|Ciklus Zemlje o}e aji po i racije sferi ciklusu Belgija 5667 5318 5046 1443 1172 25.5% ê{ka Republika 706 694 617 146 101 20.7% Danska 3004 2884 2635 846 685 28.2% Finska 1672 1638 1514 417 323 24.9% Francuska 23228 20921 18973 5419 3913 23.3% Nema~ka 16991 16441 15601 4176 2804 24.6% Gr~ka 3075 2947 2784 928 672 30.2% Ma|arska 1355 1328 1223 351 242 25.9% Island 103 103 97 43 35 41.7% Irska 527 479 462 113 90 21.4% Italija 9419 8672 7915 2084 1735 22.1% Holandija 4162 3840 3579 1266 NA 30.4% Norve{ka 1405 1333 1226 327 275 23.3% Poljska 1812 1762 1665 537 418 29.6% Portugalija 1063 966 900 217 155 20.4% Rusija 1440 1398 1390 394 224 27.4% Slovenija 1046 995 811 255 203 24.4% [panija 6645 6233 5833 2002 1253 30.1% [vedska 3749 3513 3194 988 771 26.4% [vajcarska 2010 1947 1768 455 336 22.6% Velika Britanija 10645 10637 9989 2673 2141 25.1% Ukrajina 252 247 234 48 33 19.0% Ukupno 99976 94296 87456 25128 25.1% Nakon ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, 25128 trudno}a je rezultovalo iz 87 456 transfera embriona. Srednji klini~ki broj trudno}a po transferu embriona je bio 28.7% sa

Trudno}e

po

po

aspiraciji transferu

27.1% 21.0% 29.3% 25.5% 25.9% 25.4% 31.5% 26.4% 41.7% 23.6% 24.0% 33.0% 24.5% 30.5% 22.5% 28.2% 25.6% 32.1% 28.1% 23.4% 25.1% 19.4% 26.6%

28.6% 23.7% 33.1% 27.5% 28.6% 26.8% 33.3% 28.7% 44.3% 24.5% 26.3% 35.4% 26.7% 32.3% 24.1% 28.3% 31.4% 34.3% 30.9% 25.7% 26.8% 20.5% 28.7%

opsegom od 20.5 do 44.3%. Broj poro|aja po transferu embriona nakon ICSI intra citoplasmatic sperm injection nije sumiran zbog nekompletnog pra}enja trudno}a u mnogim zemljama

348


Tabela 4-31: Trudno}e i poro|aji nakon FER - frozen embryo replacement

Zemlje Belgija ê{ka Republika Danska Finska Francuska Nema~ka Gr~ka Ma|arska Island Irska Italija Holandija Norve{ka Poljska Portugalija Rusija Slovenija [panija [vedska [vajcarska Velika Britanija Ukrajina Ukupno

Poro|aji po Trudno}e po Otapa- Tran- Trud- Poro|nje sferi no}e aji otapanju transferu otapanju transferu 2340 507 1242 2876 10036 10729 259 12 85 261 2734 311 816 120 316 371 2323 1408 1680 6160 8

1879 464 970 2488 8753 9546 247 8 83 219 2368 1337 225 697 107 279 340 1872 1208 1487 5569 8 40154

263 45 163 448 1284 1541 76 3 21 43 462 270 43 94 19 50 51 366 259 246 914 2 6663

Tabela pokazuje da je nakon FER frozen embryo replacement 6 663 trudno}e rezultovalo iz 40155 transfera. Srednji klini~ki broj trudno}a po transferu embriona nakon FER - frozen embryo replace-

207 20 135 331 936 937 51 0 14 34 350 NA 36 75 7 33 38 245 194 184 697 1

11.2% 8.9% 13.1% 15.6% 12.8% 14.4% 29.3% 25.0% 24.7% 16.5% 16.9% 13.8% 11.5% 15.8% 15.8% 13.7% 15.8% 18.4% 14.6% 14.8% 25.0%

14.0% 9.7% 16.8% 18.0% 14.7% 16.1% 30.8% 37.5% 25.3% 19.6% 19.5% 20.2% 19.1% 13.5% 17.8% 17.9% 15.0% 19.6% 21.4% 16.5% 16.4% 25.0% 16.6%

8.8% 3.9% 10.9% 11.5% 9.3% 8.7% 19.7% 0.0% 16.5% 13.0% 12.8%

11.0% 4.3% 13.9% 13.3% 10.7% 9.8% 20.6% 0.0% 16.9% 15.5% 14.8%

11.6% 9.2% 5.8% 10.4% 10.2% 10.5% 13.8% 11.0% 11.3% 12.5%

16.0% 10.8% 6.5% 11.8% 11.2% 13.1% 16.1% 12.4% 12.5% 12.5%

ment je bio 16.6%. Broj poro|aja po transferu embriona nakon FER - frozen embryo replacement nije sumiran zbog nekompletnog pra}enja trudno}a u mnogim zemljama.

349


Tabela 4-32: Trudno}e i poro|aji nakon donacije

Zemlje

Trudno}e Trudno}e Poro|aji Dona- Ukupni Ukupno Poro|- po Poropo po cije transferi trudno}a aji donaciji transferu donaciji |aji

Belgija 500 ê{ka Republika 78 Danska 158 Finska NA Francuska 143 Nema~ka 0 Gr~ka 244 Ma|arska 18 Island 23 Irska 0 Italija 806 Holandija NA Norve{ka 0 Poljska 35 Portugalija 0 Rusija 452 Slovenija 0 [panija 1577 [vedska 0 [vajcarska 0 Velika Britanija 2135 Ukrajina 85 Ukupno

359 50 132 290 214 0 223 16 20 0 722 NA 0 35 0 383 0 1416 0 0 1982 83 5925

86 7 47 91 41

70 1 26 61 NA

17.2% 24.0% 14.0% 9.0% 14.0% 1.3% 2.0% 19.7% 35.6% 16.5% 19.7% 31.4% 21.0% 28.7% 19.2%

71 6 9

33 NA 8

29.1% 31.8% 13.5% 14.8% 33.3% 37.5% 39.1% 45.0% 34.8% 40.0%

214

161

26.6% 29.6% 20.0% 22.3%

11

31.4% 31.4% 31.4% 31.1%

137

11 0 89

662

357

42.0% 46.8% 22.6% 25.2%

549 20 1951

403 15

25.7% 27.7% 18.9% 20.3% 23.5% 241% 17.6% 18.1% 32.9%

Tabela pokazuje da je nakon OD 1951 klini~ka trudno}a rezultovala iz 5925 trans-

30.3% 35.8% 19.7% 23.2%

fera, {to je broj trudno}a po transferu od 32.9% sa opsegom od 14 do 46.8%.

350


Tabela 4-33: Udeli poro|aja jedne bebe, blizanaca, trojki

Zemlje

Gubitak u Ukupno Klini~ki Dokum entovan ,,follow poro|aja gubitak -up’’

207

263

ê{ka Republika

20

45

14

1

16 80.0% 4 20.2% 0 0.0%

Danska

135

163

27

1

107 79.3% 28 20.7% 0 0.0%

Finska

331

448

111

6

291 87.9% 38 11.5% 2 0.6%

Francuska

936

1284

291

57

775 82.8% 125 13.4% 5 0.5%

Nema~ka

937

1541

483

121 790 84.3% 137 14.6% 9 1.0%

Gr~ka

51

74

11

12

37 72.5% 14 27.5% 0 0.0%

Ma|arska

0

2

1

1

0

Island

14

21

7

0

11 78.6% 3 21.4% 0 0.0%

Irska

34

43

8

Italija

350

462

83

29

313 89.4% 34 9.7%

Holandija

NA

270

84

NA

NA

Norve{ka

36

43

7

0

26 72.2% 10 27.8% 0 0.0%

Poljska

75

94

19

0

67 89.3% 8 10.7% 1 1.3%

Portugalija

7

19

4

8

7 100.0% 0

Rusija

33

53

11

4

29 87.9% 4 12.1% 0 0.0%

Slovenija

38

51

4

8

38 100.0% 0

[panija

245

366

92

29

129 80.0% 46 18.8% 3 1.2%

[vedska

194

259

65

0

169 87.1% 25 12.9% 0

[vajcarska

184

246

55

8

157 85.3% 26 14.1%

Velika Britanija

697

914

75

142

1

2

1

0

Ukupno

6663

Tabela prikazuje poro|aje nakon IVF i ICSI, i to poro|aj jedne bebe, blizanaca, trojki i ~etvorki. Poro|aji jedne bebe, blizanaca, trojki i ~etvorki nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection.

NA

NA

Blizanci% Trojke %

Belgija

Ukrajina

56

Jedna beba %

NA

NA

25 73.5% 7 20.6% 2 5.9% NA

3 0.9% NA

0.0% 0.0%

0 0.0% 0 0.0% 0.0%

1 0.5%

577 82.8% 108 15.5% 11 1.6% 1 100.0% 0

0.0%

0

0.0

3632 84.7% 617 14.4% 37 0.9% Moè se videti da je raspodela poro|aja slede}a: jedna beba 25 336 (73.6%), blizanci 8396 (24.4%), trojki 674 (2%) i ~etvorki 13 (0.04%). Poro|aji jedne bebe, blizanaca, trojki i ~etvorki nakon FER - frozen embryo replacement.

351


Tabela prikazuje poro|aje nakon FER frozen embryo replacement u odnosu na poro|aj jedne bebe, blizanaca, trojki i ~etvorki. Moè se videti da je raspodela poro|aja slede}a: jedna beba 3632 (84.7%), blizanci 617 (14.4%), trojke 37 (0.9%) i ~etvorki 2 (0.05%).

Tabela prikazuje udeo novoro|en~adi koja su ro|ena kao jedna beba, blizanci, trojke i ~etvorke nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI intra citoplasmatic sperm injection tretmana.

Tabela 4-34: Procenat novoro|en~adi ro|enih kao jedna beba, blizanci, trojke, ~etvorke

Zemlje

Ukupno beba

Belgija

Jedna beba

Blizanci

Trojke

êtvorke

NA

NA

NA

NA

ê{ka Republika

444

52.3%

41.0%

6.8%

0.0%

Danska

2260

57.9%

41.6%

0.5%

0.0%

Finska

1150

59.8%

39.7%

0.5%

0.0%

Francuska

9302

60.4%

37.1%

2.4%

0.1%

Nema~ka

9324

58.3%

36,0%

5.6%

0.1%

Gr~ka

1548

51.1%

44.8%

4.1%

0.0%

Ma|arska

526

47.9%

40.7%

11.4%

0.0%

Island

121

46.3%

51.2%

2.5%

0.0%

Irska

297

54.2%

37.7%

8.1%

0.0%

Italija

3630

59.6%

31.5%

8.0%

1.9%

NA

NA

NA

NA

Holandija Norve{ka

1177

51.1%

47.9%

1.0%

0.0

Poljska

899

46.8%

28.3%

2.7%

0.0%

Portugalija

375

52.8%

35.2%

12.0%

0.0%

Rusija

1239

50.2%

42.3%

7.5%

0.0%

Slovenija

500

61.4%

36.8%

1.8%

0.0%

[panija

2529

49.6%

41.6%

8.7%

0.2%

[vedska

2034

63.5%

35.6%

0.9%

0.0%

[vajcarska

597

61.0%

34.5%

4.5%

0.0%

Velika Britanija

6334

55.1%

39.7%

5.2%

0.0%

Ukrajina

264

37.1%

56.1%

6.8%

0.0%

Ukupno

44587

56.7%

38.7%

4.5%

0.1%

352


Tabela 4-365 Komplikacije i elektivna redukcija fetusa

Ukupno komplikacija Zemlje OHSS pri pribavlj- Krvarenje Infekcija anju oocita Belgija 139 17 8 9 ê{ka Republika 25 7 4 2 Danska NA NA Na NA Finska NA NA Na NA Nema~ka 336 377 278 0 Gr~ka 36 1 2 2 Ma|arska 23 1 0 1 Island 2 1 0 1 Irska 11 1 2 1 Italija 255 51 41 10 Holandija NA NA Na NA Norve{ka 31 9 3 1 Poljska 54 6 6 0 Portugalija 11 0 0 0 Rusija 158 32 29 3 Slovenija 21 2 2 0 [panija 75 24 S 5 [vedska NA NA Na NA [vajcarska 17 1 0 1 Velika Britanija 376 120 6 0 Ukrajina 16 2 2 0 Ukupno 1586 652 388 36 Tabela predstavlja incidenciju OHSS ovarian hyperstimultion syndrome-a koja je zabeleèna u registrima 17 zemlje. Vidi se da je bilo 1586 slu~ajeva ovog sindroma. Broj IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusa u ovih 17 zemalja je bio 146 342, {to odgo-

Smrt majke

Fetalna redukcija

0 0 NA NA 0 0 0 0

27 14 NA NA 0 73 16 0 0 28 NA 0 0 0 0 0 0 NA 1 82 15 256

0 NA 0 0 0 0 0 0 NA 0 0 0

vara incidenci od 1.1% od svih stimulisanih ciklusa. Iz istih zemalja je zabeleèno 652 komplikacije pri aspiraciji oocita. Ova tabela, tako|e, daje podatke o zabeleènim elektivnim fetalnim redukcijama. Ukupno je zabeleèno 256 slu~ajeva.


Radi sistematizacije bolje kontrole programa asistirane reprodukcije ESHRE european society for human reproduction and embryology uvodi parametre visokog kvaliteta. Jedan od parametara visokog kvaliteta definisan je kao broj poro|aja po transferisanom embrionu, {to zna~i koliko se implantira embriona za jednu trudno}u. Nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI intra citoplasmatic sperm injection, 20 zemalja je transferisalo 398 952 embriona i ovo je rezultovalo 35 928 poro|aja. Broj transferisanih embriona za svaki poro|aj je prema tome 11,1. Broj poro|aja po transferisanom embrionu je bio 0.09%, {to zna~i da je na 11,1 embrion bila jedna trudno}a. Analiziraju}i ove podatke, va`no je napomenuti da je jedan broj trudno}a izgubljen u pra}enju, pa ovi podaci ostaju samo procena. Drugi parametar visokog kvaliteta je broj ro|enja jedne bebe po transferu. Nakon IVF - in vitro fertilisation i nakon 167 097 transfera, broj ro|enja jedne bebe po transferu je bio 15.2%. Uzimaju}i u obzir ovaj broj va`no je imati na umu da se jedan broj trudno}a gubi u pra}enju, pa ta~an broj poro|aja ostaje nepoznat. PGD - preimplantation genetic diagnosis je zabeleèna u sedam zemalja: Belgiji, Danskoj, Gr~koj, Ma|arskoj, Italiji, Portugalu i Rusiji. Ukupno 543 ciklusa, 533 aspiracija i 362 transfera je rezultovalo sa 106 trudno}a i 78 poro|aja. Ovo daje klini~ki broj trudno}a od 19.5% po ciklusu, 19.39% po aspiraciji i 29.2% po transferu. Navedeni izve{taj je ~etvrti uzastopni evropski izve{taj o IVF - in vitro fertilisation podacima i pokriva cikluse tretmana iz godine 1997., 1998., 1999. i 2000. Broj zemalja koje su izve{tavale je nepromenjen od 1999. godine i okuplja 22

353

zemlje koje pokrivaju celu Zapadnu Evropu sa izuzetkom Austrije i Luksemburga koji nema IVF - in vitro fertilisation centre. Devet zemalja u~esnica ve} ima kompletne izve{taje u svom sistemu: Danska, Finska, Francuska, Island, Holandija, Norve{ka, [vedska, [vajcarska i Velika Britanija. Broj prijavljenih ciklusa nastavlja da raste. Godine 2000. je 569 klinika prijavilo 279 267 ciklusa, {to je pove}anje od 8% u odnosu na 1999. godinu. Od 1997. godine do 1998. je pove}anje iznosilo 14% , a od 1998. godine do 1999. godine je 11%. Ukupno, ovo zna~i pove}anje sa 203 893 ciklusa u 1997.godini na 279 267 u 2000. godini i ekvivalentno je u porastu od 37% tokom perioda od ~etiri godine. Ovo zapaèno pove}anje je delimi~no posledica boljeg izve{tavanja, ali je i posledica pro{irenja aktivnosti u nekim zemljama. Poslednji svetski izve{taj o IVF - in vitro fertilisation podacima iz 1998. godine je zabeleìo 388 000 procedura {irom sveta i procenjuje sa da ovaj broj predstavlja 80% od ukupnih aktivnosti. U Sjedinjenim Dràvama je zabeleèno 88 077 ciklusa od 1999. godine. Ovo zna~i da pribli`no 60% zabeleènih IVF - in vitro fertilisation aktivnosti poti~e iz Evrope. U samoj Evropi, najve}i broj poku{aja dolazi iz Nema~ke sa 63 000 ciklusa, Francuske sa 57 000 ciklusa i Velike Britanije sa 34 000 ciklusa. U Italiji je prijavljeno blizu 200 000 ciklusa u 2000. godini. [panija ima podatke od samo 36, od pribli`no 180 klinika, iako su uglavnom ve}e klinike prijavile 14 500 ciklusa u [paniji, veoma je verovatno da se samo mali deo ART - assisted reproductive technology aktivnosti iz [panije evidentira.

354


Odnos standardnih IVF - in vitro fertilisation procedura i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection procedura je ostao isti u 2000. godini u pore|enju sa prethodne dve godine, 56% standardnih IVF - in vitro fertilisation u odnosu na 44% ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. U nekim zemljama je ICSI - intra citoplasmatic sperm injection metoda rasprostranjenija od IVF in vitro fertilisation, u Belgiji, Gr~koj, Ma|arskoj, Italiji, Poljskoj, Portugalu, Sloveniji, [paniji i [vajcarskoj. Broj prijavljenih FER - frozen embryo replacement i OD - ovum donation ciklusa je tako|e u porastu u 2000. godini, u odnosu na 1999. godinu. Dostupnost usluga je jo{ uvek najve}a u Danskoj sa 1830 ciklusa na milion stanovnika. Ovaj broj je, tako|e, visok u Skandinaviji, i u Holandiji i Francuskoj. Prose~an broj ciklusa na milion stanovnika u onim zemljama sa kompletnim izve{tavanjem je iznosio 856. Udeo ART - assisted reproductive technology dece u ukupnom broju ro|ene dece je bio najve}i u Skandinaviji i kretao se od 2.1 do 3.8%. Broj transferisanih embriona u IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection ciklusima se zna~ajno rezlikovao me|u zemljama. Prose~an broj transfera jednog embriona je ostao na oko 12%, dok je udeo transfera dva embriona pove}an sa 39.2% 1999. godine na 46.7% 2000. godine. Udeo transfera tri embriona je smanjen sa 39.6% 1999., na 33.3% u 2000. godini. Broj transfera ~etiri embriona je tako|e smanjen sa 9.3% na 6.8%. Danska, Finska i [vedska su prijavile mali udeo transfera tri embriona. Po prvi put su podaci iz 2000. godine uklju~ivali i broj eSET - elective single embryo transfer-a. Dostupni su bili podaci iz

samo 4 zemlje koje su prijavile 2295 eSET - elective single embryo transfer-a. eSET elective single embryo transfer se pojavio tokom poslednjih godina i broj poro|aja jedne bebe nije promenjen u 2000. godini, kada se uporedi sa prethodnim godinama. Va`no je primetiti da je ukupna pojava vi{estrukih poro|aja nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection od 26.9% u 2000. godini bila sli~na sa brojem iz 1997. godine. Me|utim, bilo je promena u broju poro|aja trojki koji je smanjen sa 3.6% u 1997. godini na 2.3% u 1998. i 1999. godini, i na 2% u 2000. godini. Postoje velike razlike u brojevima ro|enja trojki me|u raznim zemljama. Ovo je prvi izve{taj o ukupnom broju fetalne redukcije u Evropi. Ukupno je prijavljeno 256 procedura, ali podaci od jednog broja zemalja nisu dostupni, pa je zato mogu}e da je obavljen ve}i broj ovih procedura. Ukupan broj trudno}a za IVF - in vitro fertilisation, ICSI - intra citoplasmatic sperm injection i FER - frozen embryo replacement nastavlja da polako raste. Kod IVF - in vitro fertilisation je sada prose~an broj trudno}a po transferu 28.4% u pore|enju sa 27.7% u 1999. godini. Kod ICSI - intra citoplasmatic sperm injection je 28.7% u pore|enju sa 27.9% u 1999. godini. Kod FER - frozen embryo replacement je 16.6% dok je 1999. godine bio 15.37%. Jo{ jedan na~in za izve{tavanje o uspe{nosti bi bilo zasebno izve{tavanje o broju poro|aja jedne bebe. Trenutno ukupan broj ovih poro|aja iznosi 15.2% po transferu nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Alternativni na~in prikazivanja uspe{nosti unutar jednog parametra visokog kvaliteta je bio broj poro|aja po transferisanom embrionu od 0.09% {to je ekvi-


valentno sa upotrebom 11 embriona da bi se ostvario jedan poro|aj nakon IVF - in vitro fertilisation i ICSI - intra citoplasmatic sperm injection. Ukupno je prijavljeno 543 PGD preimplantation genetic diagnosis ciklusa, dok ih je 1999. godine bilo 131, {to nagove{tava {irenje ove aktivnosti u slede}im godinama. Rezultati tehnika asistirane reprodukcije, za parove i za dru{tvo, moraju biti nadgledani i pra}eni u svojoj efikasnosti, bezbednosti, kvalitetu, dostupnosti i ceni. Sada{nji izve{taj uklju~uje i podatke o efikasnosti i dostupnosti kao i o jednom veoma va`nom aspektu bezbednosti tj. vi{estrukim trudno}ama. ESHRE - european society for human reproduction and embryology i EIM - european IVF - monitoring programme sada planiraju da pro{ire svoje aktivnosti nadgledanja tehnika asistirane reprodukcije,

355

uklju~uju}i podatke o bezbednosti, kvalitetu i ceni. Sada{nji, ~etvrti godi{nji ESHRE european society for human reproduction and embryology Izve{taj ART - assisted reproductive technology u Evropi u 2000. godini pokazuje nastavak {irenja izve{tavanja u pogledu centara koji u~estvuju i broju prijavljenih ciklusa. Trendovi postaju vidljivi. Postoji trend ka ve}oj efikasnosti. Poro|aji trojki se re|e pojavljuje nego u prethodnim godinama, ali je broj vi{estrukih trudno}a sa 26.4% sli~an sa prethodnim procentima. U Srbiji je 2006. godine formirana asocijacija centara koji se bave ART - assisted reproductive technology, pa se o~ekuje da se sa 2007. godinom uvede i statisti~ko pra}enje programa sa evidentiranjem godi{njih podataka kod ESHRE - european society for human reproduction and embryology.

356


22. PROFILAKSA INFEKCIJA U PROCEDURI ASISTIRANE REPRODUKTIVNE TEHNOLOGIJE In vitro oplo|enje sa transferom embriona i srodne metode asistirane reprodukcije ART - assisted reproductive technology za pacijentkinju i za trudno}u koja je rezultat le~enja, nose iste rizike preno{enja uzro~nika bolesti kao i kod per vias naturales koncepcije. Kod reproduktivno medicinskih intervencija posebnu odgovornost za zdravlje ène koja se le~i preuzimaju lekari koji u~estvuju u tome, a isto tako i za dete koje se rodi zahvaljuju}i le~enju. Postoje mnogi potencijalni rizici od infekcije. Klice mogu da poti~u iz donjeg genitalnog trakta pacijentkinje, odnosno iz ejakulata supruga, ili mogu da budu preneti preko medijuma sa kulturom, ili medicinskom manipulacijom u toku postupka le~enja. U toku rada fiziolo{ko prisustvo bakterija donjeg ènskog genitalnog trakta sa potencijalno patogenim klicama stvara mogu}nost da se klice pri dobijanju jajne }elije prenesu intraperitonealno, odnosno da se naj~e{}e prilikom AIH - artificial insemination by husband ili ET - embryo transfer stvore uslovi za medicinsko preno{enje klica.

Ne preporu~uje se pripremna dezinfekcija vagine i grli}a uobi~ajenim dezinfekcionim sredstvima, po{to ista mogu da deluju toksi~no i na embrione. Redukcija klica putem detaljnog ispiranja vagine i ~i{}enja grli}a sterilnim rastvorom kuhinjske soli redukuje rizik od infekcije u istom obimu, ali ne redukuje procenat trudno}a. Pri punkciji folikula i ET - embryo transfer-a koriste se instrumenti za jednokratnu upotrebu. Sva ostala aparatura koja je u neposrednom kontaktu sa pacijentkinjom ili njenim telesnim te~nostima, kao {to su ultrazvu~ne sonde i pomo}ni instrumenti pri punkciji, {tite se mehani~kim barijerama. Infekcija moè u pojedina~nim slu~ajevima da nastane i zbog akcidentnih povreda creva ili punkcija hroni~no inficiranog hidro, ili piosalpingsa. Zato se preduzima opse`na priprema pacijenta za program. Infekcije u maloj karlici kao komplikacije vantelesnog oplo|enja su sveukupno opisane u mnogobrojnim radovima i smatra se da se javljaju jako retko, na oko 1 : 5000 pacijenata. Istraìvanja su pokazala da je posle dobijanja jajne }elije skoro svaka ~etvrta igla za punkciju na vrhu kontaminira bak-


terijama, a u svakom tre}em punktatu folikula mogu da se dokaù bakterije koje tako mogu da budu unete u medijum sa kulturom. Zbog toga je neophodno dodavanje penicilina i streptomicina u medijume sa kulturom. Profilakti~ko davanje antibiotika pacijentkinji, naprotiv ne pobolj{ava rezultate intervencije i stoga se ne preporu~uje. Ejakulat nikada nije apsolutno sterilan. Priprema spermatozoida u laboratoriji putem swim-up tehnike, ili metodom gradijentne selekcije centrifugiranjem, dovodi do efikasne fizi~ke redukcije broja klica. I ovde se kao pouzdana metoda dokazalo dodavanje penicilina. Uz pomo} senzitivnih metoda ispitivanja klica i pored toga mogu da se dokaù u 90 do 99% svih analiza sperme. Identifikuju se, uglavnom, normalna flora distalnog mokra}nog kanala kao i bakterije ko`ne i perinealne flore. Profilakti~ko davanje antibiotika pacijentima isto kao i kod èna, ne pobolj{ava uspeh ART- assisted reproductive technology i stoga se ne preporu~uje. U embrionalnoj laboratoriji trebalo bi da se u potpunosti radi sa materijalom za jednokratnu upotrebu. Pridràvanje preporuka o higijeni za rad u sterilnim laboratorijama se podrazumeva. Posebnu pa`nju kao potencijalni izvor infekcije, zasluùje medijum u kome se nalazi kultura. Ukoliko se ne koriste industrijski proizvedeni medijumi, koji podleù kontroli kvaliteta od strane proizvo|a~a, prilikom obrade treba da se po{tuju preporuke American Fertility Society koje podrazumevaju strogu kontrolu kvaliteta kori{}ene vode radi spre~avanja pirogenih, endotoksi~nih i bakterijskih kontaminacija, kao i sterilne uslove spravljanja sirovina sa prevashodnom primenom materijala za jednokratnu upotrebu.

357

Dok su na raspolaganju rekombinantni serumski suplementi, potrebno je da se po mogu}nosti koriste humane albuminske preparacije iz karantinskog spender pools - a, testirane na HIV - human immunodeficiency virus, HBV - hepatitis B virus, HCV hepatitis C virus, HCMV- human cytomegalo virus i na treponemu pallidum. Do kontaminacije moè da do|e i tokom kriokonzervacije i skladi{tenja gameta, odnosno krioprotektiranih jajnih }elija. Te~ni azot moè kroz pukotine da prodre u pajete i do|e u kontakt sa infektivnim materijalom. Kriokonzerviran materijal u reproduktivnoj medicini nije ni pribli`no tako visoko optere}en virusima kao krv i ki~mena mo`dina. Pojedina~ne preparacije i kulture, odnosno obrade spermatozoida dovode do fizi~ke redukcije klica. I pored toga, treba da se koriste samo posude za zamrznuti materijal, koje mogu pouzdano da se zatvore, koje ne mogu da postanu porozne i ~ija mehani~ka stabilnost se ne menja prepakivanjem. Osim toga, posuda za skladi{tenje treba da redovno prazne i ~iste. Za{tita osoblja u laboratoriji pri radu sa potencijalnim infektivnim telesnim te~nostima se sprovodi u skladu sa propisima o za{titi od nezgoda no{enjem rukavica, mantila i za{titnih nao~ara zbog opasnosti od prskanja, izbegavanjem o{trih ili {picastih instrumenata, njihovim pravilnim odlaganjem, odricanjem od usnih pipeta kod pojedina~nih manipulacija i manipulacija sa embrionom, redovnom dezinfekcijom radnih povr{ina sa odgovaraju}im sredstvima, kao i opreme laboratorijskih prostorija sa lavaboima za pranje ruku i aparata za ispiranje o~iju za neodlo`nu dekontaminaciju. Podrazumeva se, da tim koji radi u laboratoriji treba da bude vakcinisan protiv hepatitisa B.

358


Tabela 4-37: Mere za smanjenje rizika od infekcija kod asistirane reprodukcije

Ppripremno saniranje hidro-i piosalpinksa Ispiranje vagine i tupferovanje grli}a sterilnim izotonim rastvorom kuhinjske soli pre intervencije Koriš}enje instrumenata za jednokratnu upotrebu pri punkciji folikula, preparaciji spermatozoida, kulture embriona i pri prenosu embriona Sterilizacija toplotom i po potrebi ~iš}enje ultrazvukom potrebnog pribora koji se koristi više puta Dopunjavanje medijuma sa kulturom penicilinom i streptomicinom Kontrola kvaliteta medijuma sa kulturom (klice, endotoksini, pirogeni) Kao suplement serumu koristiti samo albuminske preparacije iz testiranih na HIV, HBV, HCV, CMV, treponemu pallidum, karantinski uskladištenih spender pools-a, u slu~aju potrebe koristiti sopstveni serum pacijentkinje Ispiranje jajne }elije i kumulusa medijumom sa kulturom Poštovanje detaljnih propisa o higijeni za dobijanje spermatozoida Obrada spermatozoida Koriš}enje stabilnih posuda za zamrzavanje Redovno pra`njenje i ~iš}enje posuda za skladištenje kriokonzervanta Prevencija vakcinacijom za osoblje laboratorije i higijenske mere zaštite

359


23. KLINI^KA IVF LABORATORIJA Uspe{na asistirana reprodukcija uklju~uje pa`ljivu koordinaciju medicinskog i nau~nog pristupa svakom paru, koji se podvrgava tretmanu, uz blisku saradnju doktora, sestara i savetnika. Samo pa`nja prema detaljima u svakom koraku tretmana moè optimizirati njegove {anse za ro|enje zdrave bebe. Odgovaraju}i izbor pacijenata, stimulacija jajnika i kontrolisana procedura bi trebalo da pruè IVF - laboratoriji dobre gamete sposobne da daju zdrave embrione. Laboratorija za IVF - in vitro fertilisation je odgovorna za osiguranje stabilne, netoksi~ne sredine bez patogena uz optimalne parametre za oplodnju oocita i razvoj embriona. Prvi deo ove knjige otkriva sloènost ~inilaca koji u~estvuju u postupku uspe{ne oplodnje i razvoja embriona zajedno sa sistemima kontrole koji su razja{njeni na molekularnom nivou. Podrazumeva se da in vitro oplodnja mora uklju~ivati sisteme jednake, ako ne i ve}e sloènosti od prirodnih. Za klini~kog biologa je osnovno da po{tuje uslove koji su izuzetno osetljivi na, ~ak, i prividno male promene okruènja gameta i embriona, naro~ito temperature, pH vrednosti i brojnih drugih faktora koji potencijalno uti~u na }elije na molekularnom nivou. U sada{njem vremenu brze evolucije tehnologije, uspeh novih inovacija se moè

meriti samo pore|enjem sa standardom efikasnih i reproduktibilnih utvr|enih procedura. ESHRE - European society for human reproduction and embryology je ulagala velike napore radi unapre|enja poznavanja tehnika, procedura i strategija i osiguravanja upotrebe najkvalitetnije prakse u reproduktivnoj medicini. Potreba za razvojem smernica je bila logi~na posledica koja je prvi put izraèna 1990. godine kada je Focus on Reproduction objavio prve smernice za rad u laboratoriji. Pet godina kasnije se pro{iruju uputstva sa nekoliko novih tehnika u Human Reproduction. Oba dokumenta su se pokazala va`nim za primenu u svakodnevnom radu.

Izgradnja laboratorije: oprema i prostorije Prioritet u IVF - laboratoriji mora biti dat minimizaciji potencijalnog rizika od infekcije, ili kontaminacije iz bilo kog izvora, pa zbog toga prostor sa kulturom tkiva mora da ima najvi{e standarde sterilne tehnike, gde svi podovi, povr{ine i komponente moraju biti laki za svakodnevno ~i{}enje. Idealno bi bilo da se jedan deo prostora odredi kao podru~je sa ograni~enim pristupom zajedno sa prostorijama za presvla~enje u ~istu operativnu ode}u i obu}u pre ulaska.

360


Odabir osoblja i njihova kontrola Laboratorijom upravlja iskusan embriolog sa odgovaraju}im kvalifikacijama u skladu sa nacionalnim zakonima. Mora postojati odgovaraju}i broj osoblja sa potrebnim iskustvom za rad u laboratoriji. Novo osoblje se podvrgava uvodnom programu. Neophodno je kontinuirana edukacija osoblja. Pojedina~na odgovornost svakog ~lana osoblja i linija odgovornosti su dati u pisanoj proceduri.

Pravila i procedure Sve laboratorijske procedure moraju da uklju~uju pruànje jedinstvene identifikacije pacijenta uz zadràvanje poverljivosti prema pacijentu. Laboratorijski rezultati treba da se saop{tavaju u skladu sa pisanom procedurom. Rezultati treba da budu provereni, datirani i treba da uklju~uju jedinstven identitet pacijenta. Bilo kakva interpretacija rezultata treba da bude precizna, iscrpna i klini~ki relevantna. Mora postojati zapis svih reagenasa, kalibracije i materijala za kontrolu kvaliteta. Mora postojati pisani, potpisani i datirani protokol za svaku proceduru, pisani prenos rezultata i redovno odràvanje opreme. Sve procedure treba da se nalaze u priru~niku u laboratoriji, koji je na raspolaganju. Potrebno je odràvati dnevnik rada u cilju redovnog procenjivanja rezultata.

Bezbednost u laboratoriji Nacrt laboratorije Embriolo{ka laboratorija bi trebalo da ima odgovaraju}i prostor radi odràvanje dobre laboratorijske prakse i to:

• Konstrukcija laboratorije treba da osigura asepti~no i optimalno rukovanje gametima i embrionima tokom svih faza tretmana; • Lokacija prostora za kultivaciju i opremu, kao {to su inkubatori, centrifuge i kriooprema treba da bude logi~ki planirana unutar svakog radnog prostora; • Odvojeni kancelarijski prostor treba da bude obezbe|en za administrativni rad, kao {to je arhiviranje i uno{enje podataka; • Op{ti prostor gde se obavlja pranje opreme, sterilizacija, itd., treba da bude odvojen od embriolo{ke laboratorije. Ako se koriste fiksativi, ove analize treba da budu obavljene u zasebnoj prostoriji sa fume-hood. Prilikom pu{tanja laboratorije u rad, treba uzeti u obzir najnovija dostignu}a u proizvodnji opreme i izgradnji pomo}nih prostorija. Visina radnog stola, podesive stolice, visina mikroskopa, efikasna upotreba prostora i povr{ine, odgovaraju}a klimatizacija i koli~ina dnevne svetlosti, doprinose radnom okruènju koje minimizuje ometanje i zamor. Pa`nja se tako|e mora obratiti lokalnim zdravstvenim i bezbednosnim zahtevima.

Laboratorijska oprema •

Laboratorijska oprema koja se koristi treba da bude adekvatna za laboratorijski rad i jednostavna za ~i{}enje i dezinfekciju; • Kriti~na oprema, uklju~uju}i inkubatore i opremu za ~uvanje zamrznutih embriona, treba da bude pod odgovaraju}im alarmima i nadgledana; • Sve embriolo{ke laboratorije mora da imaju automatski pomo}ni generator za napajanje u slu~aju nestanka elektri~ne energije; • Preporu~uje se minimalno dva inkubatora. Cilindri sa gasom treba da budu

361


sme{teni napolju ili u zasebnoj prostoriji sa automatskim pomo}nim sistemom; • Inkubatore treba redovno ~istiti i sterilizovati. Tankovi sa azotom mora da se ~iste bar jednom godi{nje.

Infektivni agensi Sve tehnologije asistirane reprodukcije uklju~uju rukovanje biolo{kim materijalom i predstavljaju potencijalnu opasnost od preno{enja bolesti na osoblje. Izvori infekcije u ovom sistemu su jedinjenja i folikularna te~nost. Svaka jedinica treba da utvrdi procedure i pravila za bezbednost osoblja uzimaju}i u obzir propise. Prema tome: • Preporu~uje se vakcinacija osoblja protiv hepatitisa B, ili ostalih virusnih bolesti; • Pregled pacijenata i donora gameta na HIV - human immunodeficiency virus, hepatitis B/C i ostale prenosive bolesti pre tretmana ili krioprezervacije gameta. Iako je prijem pacijenata u tretman IVF - in vitro fertilisation regulisan od strane lekara, laboratorijsko osoblje mora da bude informisano o rizicima rukovanja potencijalno inficiranim biolo{kim materijalom. Slede}e preporuke treba razmotriti: •

Ako je jedan ili ako su oba partnera HIV - human immunodeficiency virus pozitivni, IVF - in vitro fertilisation i transfer embriona ne treba poku{avati, osim, ako eti~ki komitet da dozvolu. Za seronegativnu ènu se preporu~uje donorska sperma ukoliko je njen partner seropozitivan po{to virus HIV -1 - human immunodeficiency virus moè biti prisutan u citoplazmi sprematozoida. Prema tome, postoji mogu}nost da virus u|e u oocit tokom oplodnje bilo konvencionalnom IVF - in vitro fertilisation ili intracitoplazmati~nom injekcijom sperme;

• Ako je mu{ki partner inficiran virusom hepatitisa B, seronegativna èna mora biti vakcinisana pre IVF - in vitro fertilisation. • Ako je èna inficirana virusom hepatitisa B, IVF - in vitro fertilisation je izvodljiva, ali par mora biti upozoren o neophodnosti specifi~ne vakcinacije bebe na ro|enju. Nedavno je predloèno da upotreba ICSI - intra citoplasmatic sperm injection kod pacijenata koji su pozitivni na hepatitis B moè pove}ati rizik uno{enja virusa u oocit, zbog prijanjanja virusa uz membranu spermatozoida; • Ako je jedan partner inficiran virusom hepatitisa C, IVF - in vitro fertilisation se moè obaviti nakon konsultovanja; • U slu~aju seropozitivnosti na sifilis, mora biti obavljen odgovaraju}i tretman pre primene IVF - in vitro fertilisation.

Za{titne mere Svrha za{titnih mera je osiguravanje asepti~kih uslova za gamete i embrione. Procedure su sledece: • Upotreba laboratorijske ode}e; • Upotreba netoksi~nih rukavica i maski; • Upotreba za{tite za o~i i lice prilikom rukovanja kriogenskim materijalima; • Upotreba radnih stolova sa vertikalnim laminarnim protokom; • Upotreba mehani~kih pipeta; • Upotreba fume-hood u slu~aju fiksativa; • Dezinfekcija i sterilizacija potencijalno inficirane opreme; • Upotreba materijala za jednokratnu upotrebu. Nakon upotrebe mora odmah da bude odba~en u odgovaraju}e kontejnere za otpad. Potencijalno infektivni materijali se moraju ukloniti na na~in koji }e za{tititi laboratorijske radnike, sanitarno i osoblje koje radi na odràvanju, od izlaganja infektivnim materijalima tokom njihovog rada; • Iglama i ostalim o{trim predmetima

362


treba rukovati uz ekstremnu pa`nju i odbaciti u specijalne kontejnere. Ukoliko je mogu}e, iz laboratorije treba ukloniti sve staklene predmete. U suprotnom, Pasterove pipete i polomljene staklene predmete treba odbaciti u specijalne kontejnere. Unakrsna kontaminacija infektivnim materijalom sa jednog pacijenta na drugog jo{ uvek moè da se desi tokom procedure krioprezervacije kada se pajete sa spermom ili embrionima pune spermom ili embrionima, zape~a}uju i prebacuju u te~ni azot bez spoljne dezinfekcije. Materijal koji je deponovan u rezervoarima za krioprezervaciju mora biti ~uvan na na~in koji izbegava kontakt faze te~nog azota sa biolo{kim supstancama. Sigurnosne pajete su zami{ljene da ispune ovaj zahtev. Uzorak za koji se zna da je kontaminiran treba da bude ~uvan u takvim visoko bezbednim pajetama.

Kvalitet ambijentalnog vazduha Va`nost ambijentalnog vazduha i mogu}e posledice hemijske vazdu{ne kontaminacije su ispitani od strane Koena. Dok je ve}ina organizama i vrsta do odre|enog nivoa za{ti}ena od opasnosti iz njihovog okruènja putem njihovog imunog, digestivnog i epitelijalnog sistema, oociti i embrioni in vitro nemaju takvu za{titu i njihovi aktivni i pasivni apsorpcioni mehanizmi su, uglavnom, indiskriminativni. Laboratorije za in vitro oplodnju koje su postavljene u zgradama unutar zaga|enih podru~ja ili blizu industrijskih lokacija mogu biti podlo`ne ozbiljnoj hemijskoj kontaminaciji vazduha koja se moè odraziti neodgovaraju}im brojem trudno}a. Inkubatori dobijaju svoj ambijentalni vazduh direktno iz laboratorijske prostorije; CO2 se dovodi iz gasnih boca koje mogu biti kontaminirane organskim jedinjenjima ili metalnim konta-

minantima. Prostorije pod pritiskom koje koriste HEPA - high efficiency particulate air filtraciju su napravljene u brojnim IVF in vitro fertilisation laboratorijama sa standardima koji se primenjuju za farmaceutske ~iste sobe. Me|utim, HEPA - high efficiency particulate air filtracija ne moè efikasno da zadrì gasne organske i neorganske molekule male molekularne teìne. êtiri naj~e{}a vazdu{na zaga|iva~a su: 1. U urbanim i gustim prigradskim podru~jima isparljiva organska jedinjenja koja stvara industrija, raznolike procedure ~i{}enja, isparenja iz izduvnih cevi vozila i sistema za grejanje. Instrumenti kao {to su mikroskopi, televizijski monitori ili name{taj, kao rezultat proizvodnje, tako|e mogu stvarati isparljiva organska jedinjenja. 2. Mali neorganski molekuli kao {to su N2O, SO2, CO. 3. Supstance dobijene od gra|evinskih materijala, npr. aldehidi iz podnih lepkova, substituisani benzeni, fenol i n-dekan oslobo|en iz vinilnih podnih plo~ica. Otkriveno je da su podni lepkovi naro~ito agresivni. Sveè ofarbane povr{ine ~esto predstavljaju opasnost, po{to veliki broj farbi sadrì supstance koje su veoma toksi~ne u IVF - in vitro fertilisation laboratoriji. 4. Ostala zaga|iva~ka jedinjenja su pesticidi i aerosoli koji sadrè butan ili izobutan kao podlogu. Te~nosti kao {to su podni voskovi sadrè te{ke metale koji imaju drasti~an uticaj na implantacioni potencijal embriona. Koen je sproveo detaljnu studiju hemijske kontaminacije vazduha u svim podru~jima njegove IVF - in vitro fertilisation laboratorije koja je otkrila dinami~ke interaktivne procese izme|u sistema koji rade sa vazduhom, prostora, alata, materijala za

363


jednokratnu upotrebu i ostalih predmeta. Prona|eni su anestetski gasovi, rashladne te~nosti, agensi za ~i{}enje, ugljovodonici i aromati~na jedinjenja, a neki su se akumulirali, naro~ito u inkubatorima. Koen nagove{tava da mo`da postoji interakcija izme|u ~vrstih faza rastvorljivih u vodi i rastvorljivih u lipidima, kao {to su one u inkubatorima. Dok se neki kontaminanti mogu apsorbovati u medijumima kulture, ovo se moè neutralisati obezbe|ivanjem ve}eg odvoda kao {to je ovlaìva~ u inkubatoru. Mineralno ulje moè delovati kao odvod za ostale komponente. Nefiltriran spoljni vazduh moè biti ~istiji od laboratorijskog vazduha filtriranog pomo}u HEPA - high efficiency particulate air, zbog akumulacije isparljivih organskih jedinjenja dobijenih iz susednih prostorija, ili specifi~nih laboratorijskih proizvoda. Proizvo|a~i kompresovanog vazduha i inkubatora nemaju obzira prema specifi~nim potrebama in vitro oplodnje za ~istim vazduhom. Standardi za zalihe kompresovanog vazduha su zasnovani na kriterijumima koji nisu dizajnirani za uzgajane i neza{ti}ene }elije. Testiranje novog inkubatora je otkrilo koncentracije isparljivih organskih jedinjenja koje su 100 puta ve}e od onih koje su dobijene iz testiranja kori{}enih inkubatora istog proizvo|a~a. Dozvoljavanje emisije gasova iz novih laboratorijskih proizvoda je od presudne va`nosti. U svetlu ~injenice da se ~ini nemogu}im spre~iti zaga|enje laboratorije iz okruènja pomo}u trenutnih tehnologija obrade vazduha, primarna pa`nja treba da se usmeri prema osmi{ljavanju prostora za laboratoriju i susednih podru~ja. Da bi prevazi{li ovaj problem potencijalnih opasnosti u ambijentalnom prostoru, posebno su razvijene jedinice aktivne filtracije sa filterima sa aktivnim ugljenikom i oksidacionim

materijalom za IVF - in vitro fertilisation laboratorije. One se mogu postaviti unutar inkubatora, ili u samom laboratorijskom prostoru.

Nacrt laboratorijskog prostora Posebna pa`nja se mora obratiti na raspored opreme u laboratoriji. Lokacija opreme, kao {to su inkubatori i centrifuge, treba biti lokalno planirana radi efikasnosti i bezbednosti unutar svakog radnog prostora. Upotreba mobilnih laboratorijskih komponenti dozvoljava fleksibilnost u zadovoljavanju promenljivih zahteva. Osnovna neophodna oprema potrebna za rutinsku IVF - in vitro fertilisation uklju~uje: 1. Disekcione, inverzione i svetlosne mikroskope, 2. Inkubatore sa regulacijom temperature i koncentracije CO2, 3. Centrifuge za pripremu sperme, 4. Zagrejane povr{ine za manipulisanje kulturama, 5. Friìder/zamrziva~, Sistem video kamera se tako|e preporu~uje za obuku, procenu i arhivu. Rutinski rasporedi ~i{}enja, odràvanja i servisiranja moraju biti utvr|eni za svaki deo opreme, a arhiva ~ek-lista se mora voditi za dnevne, nedeljne, mese~ne i godi{nje rasporede ~i{}enja i odràvanja za svu opremu koja se koristi, zajedno sa proverama popune zaliha i njihovog datuma isteka roka upotrebe.

Inkubatori Uspe{no su kori{}ena dva tipa gasne faze: 5% CO2 u vazduhu i me{avina tri gasa, i to, 5% CO2, 5% O2 i 90% N2. Atmosfera sa 5% CO2 je potrebna za odràvanje odgovaraju}e pH vrednosti u bikarbonatnim sistemima medijuma kulture da bi

364


fiziolo{ka pH vrednost bila ispod 7.5. Ova ravnoteà zavisi od sastava kori{}enih medijuma i na nju uti~u temperatura i atmosferski pritisak. Neki uslovi zahtevaju 6% CO2 u vazduhu da bi se odràvala odgovaraju}a pH vrednost. Pa`ljivo kalibrisani i precizno kontrolisani CO2 inkubatori su od kriti~nog zna~aja za uspe{nu in vitro oplodnju. Izbor izme|u humidifikovanog i nehumidifikovanog inkubatora zavisi od tipa kori{}enog tkivnog sistema kulture. Dok je vla`nost potrebna za standardnu ~etvorodelnu otvorenu kulturu, upotreba uravnoteène humidifikovane dopune mineralnih ulja dozvoljava upotrebu inkubatora bez vlage. Suvi inkubatori sa sobom nose manji rizik od gljivi~ne kontaminacije i lak{i su za ~i{}enje. Inkubator se mora redovno nadgledati, a o~itavanja sa displeja proveravati i kalibrisati prema nezavisnim bele{kama temperature. pH vrednosti treba da se nadgledaju sondama koje su postavljene u standardni test sistem kulture. Unutra{nje zidove i vrata treba jednom nedeljno prati sterilnom vodom i preporu~uje se godi{nja inspekcija i generalno servisiranje od strane dobavlja~a. Ponovljeno otvaranje i zatvaranje inkubatora uti~e na stabilnost okruènja kulture tkiva. Upotreba malog stonog mini inkubatora tokom prikupljanja oocita i manipulacije pomaè u minimizaciji ometanja skladi{nog inkubatora. Savremeni mini inkubatori za IVF - in vitro fertilisation kulturu su predstavljeni nedavno i projektovani su da prevazi|u probleme postojanosti i stabilnosti pH vrednosti i temperature koji se susre}u kod tradicionalnih sistema sa velikim inkubatorima.

Kvalitet vode Pouzdan izvor ultra~iste vode je kriti~an faktor u laboratoriji, naro~ito ako se medi-

jumi pripremaju na licu mesta. Vajmer je obavio potpunu analizu ne~isto}a koje se mogu na}i u vodi. Voda kao univerzalni rastvara~ pruà medijum za ve}inu biolo{kih i hemijskih reakcija i podlo`nija je kontaminaciji od bilo kog drugog rastvara~a. Povr{inska i podzemna voda je kontaminirana {irokim opsegom supstanci, uklju~uju}i |ubriva, pesticide, herbicide, deterdènte, industrijske otpadne vode i otpadne rastvara~e uz sezonska kolebanja temperature i padavina koja uti~u na nivoe kontaminacije. Postoje ~etiri kategorije kontaminanata: neorganski, rastvorene katjonske i anjonske vrste, organski, ~esti~ni i mikroorganizmi kao {to su bakterije, alge, bu| i gljivice. Hlor, hloramini, polijonski supstrati, ozon i fluor se mogu dodati vodi tokom procesa tretmana i moraju se ukloniti iz vode radi pripremanja medijuma kulture }elija. U pro~i{}avanju vode je od presudne va`nosti analiza izvora dolazne vode zbog utvr|ivanja potrebnih koraka filtracije, a protokoli za obradu vode treba da budu prilago|eni regionalnim zahtevima. Sistemi obrade vode uklju~uju ~esti~nu filtraciju, filtraciju aktivnim ugljenikom, inverznu osmozu i elektro-dejonizaciju. Ultraljubi~asti oksidacioni sistem nakon koga sledi Milli-Q PF Plus pro~i{}avanje pre finalne filtracije kroz filter od 0.22 µm za uklanjanje bilo kakvih ~estica i spre~avanje reverzne bakterijske kontaminacije iz okruènja. Osoblje IVF - in vitro fertilisation laboratorije treba da bude upoznato sa varijacijama njihovog izvora vode kao i sa sposobnostima njihovog sistema za pro~i{}avanje vode i treba da razvije protokole za postojano osiguravanje visokokvalitetnih zaliha ultra~iste vode. Vajmer je preporu~io slede}i raspored za odràvanje vode za sistem koji je koristio

365


za pro~i{}avanje vode za pripremu medijuma: • Mese~na zamena ugljenih i dubinskih filtera, • Nadgledanje hlora na svakih 21 dan, • Hlorska sanitizacija sistema inverzne osmoze i elektrodejonizacije dva puta mese~no, • Ve`ba sanitizacije sistema inverzne osmoze i elektrodejonizacije dva puta mese~no, • Zamena predtretmanskog pakovanja inverzne osmoze na svaka tri meseca, • UV recirkulacija skladi{nog rezervoara, • Sanitizacija skladi{nog rezervoara sa NaOH ~etiri puta godi{nje, • Sanitizacija Milli-Q PF Plus sa NaOH dva puta mese~no, • Zamena smolastog pakovanja za pro~i{}avanje ~etiri puta godi{nje, • Zamena 0.22 µm finalnog filtera svakog meseca, • Nadgledanje silicijuma i ukupnog organskog ugljenika u finalnom proizvodu svakodnevno.

Zalihe Osnovni spisak zaliha je opisan na kraju ovog poglavlja; ta~no potrebna kombinacija }e zavisiti od sistema kulture i kori{}enih tehnika manipulacije. Zalihe za jednokratnu upotrebu se koriste kad god je to mogu}e i mora se garantovati stepen netoksi~nosti kulture, naro~ito posuda kulture, igala, sistema za prikupljanje i katetera za aspiraciju oocita i transfer embriona. Visokokvalitetne staklene pipete za jednokratnu upotrebu su potrebne za manipulisanje gametima i embrionima; one moraju biti potopljene i isprane sterilnom vodom i sterilisane suvom toplotom pre upotrebe. Prilikom pripreme za rukovanje

gametima ili embrionima, svaku pipetu treba pregledati i isprati sterilnim medijumom da bi se osiguralo da je ~ista i da na njoj nema ostataka.

Dnevna rutina ~i{}enja Ukoliko je tokom rada prosut materijal, o~isti se suvim ubrusom i ne treba se koristiti deterdènt i alkohol dok se rukuje oocitima ili embrionima. Ako je potrebno koristiti bilo deterdènt ili alkohol, treba dozvoliti da pro|e 20 minuta da bi zaostali tragovi isparili pre uklanjanja oocita ili embriona iz inkubatora. Na kraju svakog dana treba: • Sav otpad iz procedura staviti u dvostruke vre}e, zape~atiti ih toplotom i odloìti na odgovaraju}e mesto; • Ukloniti sve drà~e pipeta radi pranja i sterilizacije pre ponovne upotrebe; • Ponovo zape~atiti i ponovo sterilizovati kanistere sa pipetama; • O~istiti flow hood, radne stolove i svu opremu pranjem sa rastvorom destilovane vode i 7 X laboratorijskim deterdèntom posle ~ega sledi brisanje sa 70% metilisanim alkoholom; • Pripremiti svako radno mesto ~istim vre}ama za sme}e, drà~ima pipeta i Pasterovim pipetama za slede}i radni dan.

Proceduure pranja Ako laboratorija ima sistem za pripremu ultra~iste vode, posebna pa`nja se mora obratiti instrukcijama za odràvanje i hemijsko ~i{}enje. îsto}a vode je od najve}eg zna~aja za procedure pranja, a sistem se treba periodi~no proveravati na prisustvo organske kontaminacije i endotoksina.

Pipete 1. Nove pipete preko no}i potopiti u ~istu Analar ili Milli-Q vodu proveravaju}i da su potpuno pokrivene;

366


2. Ocediti pipete i isprati ~istom vodom; 3. Ponovo ocediti i osu{iti pri temperaturi od 100°C u trajanju od 1-2 ~asa; 4. Postaviti ih u ~ist kanister sa vrhovima napred i sterilisati suvom toplotom u trajanju od 3 ~asa pri temperaturi od 180°C. 5. Nakon hla|enja, zapisati datum i koristiti u roku od jednog meseca od sterilizacije.

Predmeti za vi{ekratnu upotrebu, rukovanje sa rukavicama bez praha non-powered ispranim u pro~i{}enoj vodi 1. Potopiti u destilovanu vodu koja sadrì 3-5% 7 X; 2. Male predmete staviti u ultrazvu~nu kadu za ~i{}enje u trajanju od 5-10 minuta; 3. Osam puta isprati destilovanom vodom pa zatim dva puta u Analar ili MilliQ vodi; 4. Osu{iti, zape~atiti u aluminijumsku foliju, ili dvostruko upakovati u autoklavne vre}e; 5. Sterilizovati u autoklavu ili suvom toplotom na temperaturi od 180°C u trajanju od tri ~asa; 6. Zabeleìti datum sterilizacije i odloìti na ~istom mestu na kome nema pra{ine.

Tkivni medijumi kulture Veliki broj nau~nih istraìvanja i analiza je primenjen na razvoj medijuma koji }e uspe{no podupreti rast i razvoj embriona. Brojne kontrolisane studije su pokazale zadovoljavaju}u oplodnju i deobu na nizu jednostavnih i sloènih medijuma. Metaboli~ki i nutricionalni zahtevi embriona su sloèni i etapno specifi~ni. Razumevanje metaboli~kih promena embriona i njihovih zahteva za supstratom i hranljivim supstancama je dovelo do

velikog napretka proizvodnje medijuma. Kontrola kvaliteta je veoma va`na u pripremi medijuma, uklju~uju}i i izvor svih sastojaka, naro~ito vode, koji moraju da budu bez endotoksina, sa niskim sadràjem jona i garantovano bez organskih molekula i mikroorganizama. Svaka serija pripremljenih medijuma kulture se mora proveriti na osmolarnost 285 ± 2 mOsm /kg i pH vrednost 7.35-7.45 i moraju se pre upotrebe podvrgnuti procedurama kontrole kvaliteta pomo}u testa preìvljavanja spermatozoida ili mi{jih embriona. Medijumi kulture mogu brzo da se promene za vreme skladi{tenja, pa se posebna pa`nja mora obratiti na uslove skladi{tenja i preporu~eni datum isteka roka upotrebe koji je dao proizvo|a~. Komercijalno pripremljeni i unapred testirani visokokvalitetni medijumi kulture se danas mogu kupiti od velikog broja snabdeva~a iz celog sveta, pa priprema medijuma za rutinsku upotrebu u laboratoriji nije neophodna, jer ova ve`ba moè biti skupa kada se uzmu u obzir vreme i kontrola kvaliteta. Za sada nema ~vrstih nau~nih dokaza da je neki od ovih medijuma superiorniji u odnosu na druge u rutinskoj IVF - in vitro fertilisation, pa izbor treba da zavisi od okolnosti kao {to su kontrola kvaliteta i primenjene procedure testiranja tokom proizvodnje, cena i, naro~ito, garantovana efikasnost dostave u pogledu roka trajanja. Nakon isporuke se medijum moè podeliti na jednake male zapremine tako da se svaka moè koristiti za pripremu i kultivaciju gameta jednog pacijenta, uklju~uju}i i pripremu spermatozoida. Medijumi koji sadrè HEPES - (4-(2hydroxyethyl)-piperazineethanesulfonic acid), koji odràva stabilnu pH vrednost u bikarbonatnom sistemu, se mogu koristiti


za pripremu spermatozoida i prikupljanje i pranje oocita. Me|utim, poznato je da HEPES - (4-(2-hydroxyethyl)-piperazineethanesulfonic acid) menja aktivnost jonskog kanala u plazma membrani pa moè biti embriotoksi~an. Zbog toga se gameti kasnije moraju isprati u medijumu kulture, koji ne sadrì HEPES - (4-(2hydroxyethyl)-piperazineethanesulfonic acid), pre inseminacije. Medijumi koji su posebno osmi{ljeni za pranje spermatozoida su, tako|e, komercijalno dostupni. Tokom 1990-ih godina je veliki broj istraìvanja doveo do razja{njenja metaboli~ke biohemije i molekularnih mehanizama koji u~estvuju u sazrevanju gameta, aktivaciji, oplodnji, genomskoj aktivaciji, deobi, kompakciji i formiranju blastociste. Zahtevi za hranljivim materijama razlikuju se tokom svih ovih razli~itih etapa. Neodgovaraju}i uslovi kulture izlaù embrione }elijskom stresu koji rezultuje usporenom deobom, zaustavljanjem deobe, pogor{anom proizvodnjom energije, neadekvatnom aktivacijom genoma i transkripcijom gena. Nakon formiranja blastociste sledi eksponencijalno pove}anje sinteze proteina, uz neosintezu glikoproteina, histona i novih povr{inskih antigena. Iako specifi~ne potrebe embriona tokom njihovog preimplantacionog razvoja nisu potpuno definisane, etapno-specifi~ni i hemijski definisani medijumi su dostupni za upotrebu u IVF - in vitro fertilisation sistemima. Oni imitiraju prirodnu in vivo situaciju prate}i zna~ajne promene fiziologije i metabolizma embriona koje se de{avaju tokom predimplantacionog perioda.

Serum U po~etku se koristio filtriran maj~inski serum koji je dodavan u IVF - in vitro fertilisation medijume kulture. Maj~inski

367

serum se rutinski tretirao toplotom da bi se deaktivirali potencijalno {tetni sastojci, ali je ova procedura mogla da stvori embriotoksi~na jedinjenja. Albumin iz seruma je proteinski sastavni deo okruènja embriona, on vezuje lipide i moè da pomogne u vezivanju i stabilizaciji faktora rasta. Vaàn je u odràvanju kvaliteta embriona i spre~avanju embriona i gameta da se zalepe za staklene ili plasti~ne povr{ine olak{avaju}i tako njihovu manipulaciju. Preparati albumina mogu biti veoma promenljivog kvaliteta i nedavna razmatranja o prenosu patogenih agenasa, kao {to su hepatitis i HIV - human immunodeficiency virusi i Krojcfeld-Jakobova bolest krvnim produktima, veoma su oteàla pronalaènje pouzdanih izvora humanog serum albumina. Danas je ve}ina laboratorija po~ela da koristi komercijalne gotove preparate. Rekombinantna tehnologija se sada sve vi{e primenjuje na komercijalnu proizvodnju izvesnog broja fiziolo{kih proteina, a rekombinantni ljudski serum albumin mo`da }e biti dostupan u budu}nosti. Predstavljeni su medijumi bez seruma koji koriste zamene kao {to je PVA polivinil alkohol i hialuronat. Polivinilalkohol je sinteti~ki polimer i on je, iako se pokazalo da pomaè IVF - in vitro fertilisation kulturu, ne-fiziolo{ko jedinjenje, pa bilo koji dugoro~ni uticaji ili posledice mogu ostati neotkriveni duè vreme. Hialuronat je glikosaminoglikan prona|en u povi{enim nivoima u materici u vreme implantacije i ljudski embrion ekspresuje njegov receptor tokom ~itavog predimplantacionog razvoja. Za njega se tako|e zna da formira antivirusni i antiimunogeni sloj oko embriona radi pove}anja angiogeneze i olak{avanja brze difuzije transferskog medijuma u viskozno

368


te~no okruènje materice. Tako|e je mogu}e da je uklju~en u inicijalne faze spajanja blastociste sa endometrijumom. Hialuronat nema proteinske poddelove, pa se moè sintetizovati i izolovati u ~istom obliku. Preliminarna ispitivanja pokazuju da njegovo prisustvo, ne samo da zamenjuje albumin u kulturi, ve} zna~ajno pove}ava broj implantacija.

Faktori rasta Faktori rasta igraju klju~nu ulogu u rastu i diferencijaciji od faze prelaska morule u blastocistu. Definisanje njihovih uloga i potencijala za pobolj{anje in vitro predimplantacionog razvoja je komplikovano dodatnim ~iniocima kao {to je genska ekspresija. Blastocista sisara ekspresuje ligande i receptore za nekoliko faktora rasta i veliki broj njih moè me|usobno da reaguje oteàvaju}i interpretiranje uticaja pojedinih faktora koji su dodati medijumu. Insulin, LIF - leukemia inhibitory factor, EGF - epidermal growth factor, TGFα - transforming growth factor, TGFβ - transforming growth factor, PDGF - platelet derived growth factor, HB-EGF - heparin binding epidermal growth factor su prou~eni u IVF - in vitro fertilisation kulturi Uzgajanje embriona u grupama, umesto pojedina~no, pobolj{ava njihovu implantaciju. Mogu}e je da autokrini i parakrini uticaji trofi~nih faktora postoje me|u embrionima. Me|utim, prime}eni efekti kultivacije su zavisni od sastava medijuma kulture i fizi~kim uslova u toku kultivacije, naro~ito odnosa embrion/zapremina medijuma.

Folikularno ispiranje Danas se ne koristi rutinski ispiranje folikula u toku punkcije.

Ako je broj folikula mali, ili je procedura te{ka iz tehni~kih razloga, folikuli se mogu ispirati fiziolo{kim rastvorom. Balansirani rastvori soli, kao {to je Erlov rastvor EBSS - Earle's balanced salt solution, se mogu koristiti za folikularno ispiranje, uz dodavanje heparina sa koncentracijom od dve jedinice po ml. Za ispiranje se tako|e mogu koristiti i HEPES - (4-(2-hydroxyethyl)-piperazineethanesulfonic acid) medijumi. Temperatura i pH vrednost medijuma za ispiranje se moraju pa`ljivo kontrolisati, a oociti dobijeni iz medijuma za ispiranje se kasnije moraju oprati u medijumu kulture pre transfera u njihovu finalnu kulturu.

Procedure kontrole kvaliteta Laboratorije za IVF - in vitro fertilisation treba da imaju sistem kontrole kvaliteta, nadgledanjem svih procedura i komponenti laboratorije. Uz pra}enje rezultata obavezna je i sistematska provera i ispitivanje laboratorijskog materijala, zaliha, opreme i instrumenata. Sistem koji nadgleda pojedina~ni u~inak ~lanova tima, sa redovnim ocenjivanjem je od pomo}i u odràvanju optimalnog standarda rezultata. Kona~ni test kontrole kvaliteta je broj trudno}a. Teku}e beleènje rezultata oplodnje, deobe i razvoja embriona pruà najbolje kratkoro~ne dokaze dobre kontrole kvaliteta. Dnevne bele{ke u vidu laboratorijskog dnevnika su va`ne jer sumiraju detalje o pacijentima i ishodu laboratorijskih procedura: starost, uzrok neplodnosti, protokol stimulacije, broj prikupljenih oocita, analiza sperme, detalji o pripremi sperme, vreme inseminacije, oplodnja, deoba, transfer embriona i krioprezervacija. Tako|e je va`no beleìti detalje o serijama medijuma i ulja radi kasnijih referenci

369


zajedno sa uvo|enjem bilo kog novog metoda ili upotrebljenog materijala. Obavljen je jedan broj biolo{kih ispitivanja, radi detekcije toksi~nosti i suboptimalnih uslova kulture, kao {to je preìvljavanje humanih spermatozoida, linije somatskih }elija i kulture mi{jih embriona iz jedno}elijske ili dvo}elijske faze. Validnost ispitivanja mi{jih embriona je dovedena u pitanje kao pouzdano ispitivanje za ekstrapolaciju u klini~koj IVF - in vitro fertilisation. Ona pretpostavlja da su zahtevi za humane i mi{je embrione isti, a poznato je da ova pretpostavka nije ta~na. Mi{ji embrion ne moè da reguli{e svoju endogenu metaboli~ku rezervu pre kasne dvo}elijske etape, sto ne vaì za humane embrione. Mi{ji embrioni }e se razvijati iz dvo}elijske etape u velikom broju medijuma kulture, bez diskriminacije. Nijedan trenutno dostupan sistem ne moè da garantuje detekciju niskih nivoa toksi~nosti, ali moè pomo}i u identifikaciji specifi~nih problema. Nove serije medijuma, ulja, materijala ili zaliha kori{}enih u sistemu kulture, ako nisu ranije testirani, treba da budu testirani pre upotrebe. U rutinskoj IVF - in vitro fertilisation kulturi je o~ekivan broj oplodnje >70%, a stepen deoba >95%. Stepen deoba je vaàn po{to arest u fazi dva pronukleusa ukazuje na ozbiljan problem. Minimalno 65% inseminiranih oocita treba da rezultuje embrionima u deobi drugog dana. Fizi~kohemijska ograni~enja testiranja kulture medijuma su, tako|e, veoma va`na. Osmolarnost mora da bude unutar granica 275-305 mOsm sa ukupnom varijacijom ne ve}om od 30 mOsm. Vrednost pH mora da bude unutar granica 7.2-7.5 sa maksimalnom varijacijom od 0.4 jedinice pH. Ve}e varijacije bilo kog parametra ukazuju na

lo{u tehnologiju i neadekvatnu kontrolu tokom proizvodnje {to vodi ka lo{oj reproduktibilnosti. Plasti~ne posude kulture tkiva su povremeno bile promenljivog kvaliteta, pa ispiranje posuda medijumom pre upotrebe moè biti korisna predostro`nost. Studije su pokazale da ulje moè da stupi u interakciju sa razli~itim plasti~nim posudama {to uti~e na razvoj embriona. Kvalitet plastike koja se koristi za kulturu tkiva moè se promeniti i takve promene u proizvodnji {priceva, filtera i posuda ponekada mogu da budu embriotoksi~ne. Ako je osmolarnost kulture niska, veli~ina embriona se pove}ava u odnosu na zapreminu citoplazme, a citoplazmi~ni blebovi se formiraju u cilju kompenzacije i dostizanja adekvatnog odnosa nukleus citoplazma za ulazak u mitozu. Embrion gubi, ne samo citoplazmu, ve} i mRNK messenger ribonucleic acid i proteine koji su neophodni za dalji razvoj.

Predloèna korisna rutinska procedura kontrole kvaliteta uklju~uje: Test preìvljavanja spermatozoida Odabrati normalan uzorak ispranih pripremljenih spermatozoida i proceniti brojnost, pokretljivost i progresivnost. Podeliti odabrani uzorak na ~etiri jedaka dela: dodati materijal za testiranje u dva dela i istu koli~inu kontrolnog materijala koji se trenutno koristi u druga dva dela. Inkubirati jedan kontrolni i jedan probni uzorak na 37°C i po jedan od svakog na sobnoj temperaturi. Proceniti svaki uzorak po brojnosti, pokretljivosti i progresivnosti nakon 24 do 48 ~asova. Probni i kontrolni uzorci treba da pokazuju jednako preìvljavanje. Ako postoji bilo kakva sumnja, test treba ponoviti.

370


Kultura prekobrojnih oocita Prekobrojni oociti od pacijenata kod kojih je prikupljen veliki broj oocita se mogu koristiti za testiranje novog materijala kulture. Uzgajati bar 6 oocita u kontrolnom medijumu i najvi{e 4 u probnom medijumu.

Kultura multipronuklernog embriona Oociti koji pokazuju abnormalnu oplodnju prvog dana nakon inseminacije se mogu koristiti za testiranje novih serija materijala. Posmatra se i procenjuje svaki embrion. Razvoj embriona do faze blastociste se smatra dokazom adekvatnih uslova kulture.

Sistemi kulture tkiva Posude koje su uspe{no kori{}ene za in vitro oplodnju uklju~uju epruvete, ~etvorodelne posude za kulturu i Petrijeve posude koje sadrè mikrokapi medijuma kulture ispod sloja parafinskog ili mineralnog ulja. Bez obzira na to koji je sistem upotrebljen, on mora da bude sposoban da strogo odràva fiksirane stabilne parametre temperature, pH vrednosti i osmolarnosti. Humani oociti su izuzetno osetljivi na kratkotrajno hla|enje in vitro i umerena sniènja temperature mogu da izazovu nepovratni poreme}aj mejotskog deobnog vretena uz mogu}e rasturanje hromozoma. Analize embriona dobijenih putem IVF - in vitro fertilisation su pokazale da je veliki broj njih hromozomno abnormalan i mogu}e je da je rasturanje hromozoma izazvano temperaturom, doprinelo ve}em broju preklini~kih i spontanih abortusa koji slede IVF - in vitro fertilisation i intrafalopijski transfer gameta. Prema tome, va`no je kontrolisati kolebanje temperature od trenutka aspiracije folikula i tokom svih manipulacija oocitima i embrionima

pomo}u zagrejanih mikroskopskih etapa i grejnih blokova ili platformi. Dopuna uravnoteènog ulja kao dela tkivnog sistema kulture donosi specifi~ne prednosti: 1. Ulje se pona{a kao fizi~ka barijera i odvaja kapljice medijuma od atmosfere i vazdu{nih ~estica i patogena; 2. Ulje spre~ava isparavanje i odlaè difuziju gasa ~ime odràva stabilnim pH vrednost, temperaturu i osmolarnost medijuma tokom manipulisanja gametima, {tite}i embrione od zna~ajnih kolebanja njihove mikrosredine; 3. Ulje spre~ava isparavanje: ovlaèno i unapred uravnoteèno ulje dozvoljava upotrebu inkubatora bez ovlaìva~a koji su lak{i za ~i{}enje i odràvanje. Bilo je sugestija da bi ulje moglo da pobolj{a razvoj embriona tako {to }e iz medijuma ukloniti toksine rastvorljive u lipidima. Ulje ima i neka negativna svojstva . Ono spre~ava slobodnu difuziju metaboli~kih nusprodukata kao {to je amonijak, a akumuliranje amonijaka u medijumu kulture je toksi~no po embrion. Upotreba ulja tako|e, uti~e na koncentrisanje kiseonika u medijumu uz rezultuju}e uticaje na osetljivu ravnoteù metabolizma embriona.

Priprema ulja Mineralno, parafinsko ili silikonsko ulje treba da pri isporuci bude sterilno i da ne zahteva sterilizaciju ili filtraciju. Visoka temperatura sterilizacije moè da bude {tetna po samo ulje, a procedura moè da oslobodi potencijalne toksine iz kontejnera. Provo i Her su izvestili da izlaganje mineralnog ulja direktnoj sun~evoj svetlosti u trajanju od 4 ~asa rezultuje izuzetnom embriotoksi~no{}u, pa preporu~uju da se ulje {titi od svetlosti i tretira kao fotoreaktivno jedinjenje.


Osnovna oprema potrebna za IVF laboratorijuu Embriologija CO2 bioinkubator CO2 rezervni bioinkubator Disekcioni mikroskop Laboratorijski mikroskop Inverzioni mikroskop sa sistemom za mikromanipulaciju

371

Grejne povr{ine za mikroskop i podru~ja za manipulaciju Grejni blok za epruvete Laminarija Sistem za krioprezervaciju Friìder Centrifuga Medijumi za kulturu Aspiracioni set Kateteri za transfer Potro{ni materijal za jednokratnu upotrebu

372


24. POLSCOPE - SPINDLE VIEW IMAGING SYSTEM Spindle ViewTM PolscopeTM Imaging system nam danas omogu}ava da neinvazivno posmatramo u in vitro uslovima mejoti~ko vreteno u ìvim oocitima.

Sl. 4.127- Polscope

Prednosti Spindle ViewTM PolscopeTM Imaging systema pominjanom u poglavlju o PGD - preimplantation genetic diagnosis, su slede}e: - visok kontrast slike, - direktan prikaz na kompjuterskom monitoru, - digitalna obrada i pregled slika, - posedovanje step by step software. Sistem ~ini integrisani set mikroskopskih dodataka koji se sastoji od jedinstvene kristalne te~nosti polarizovane tehnologijom svetlosnog kontrasta, elektronske kontrole, polarizacionih algoritama, video

kamere i softvera koji nam daje jasno svetlo i visoko kontrasno vi|enje mejoti~kog vretena. Kori{}enjem Spindle ViewTM PolscopeTM Imaging systema dobijamo izvanrednu rezoluciju, osvetljenost i visok kontrast slika mejoti~kog vretena, nezavisno od orijentacije polarizatora ili uzorka. Obra|ene slike mejoti~kog vretena se pokazuju visokim belim kontrastom na zatamnjenoj podlozi kompjuterskog monitora. CRI step by step softver program omogu}ava brzu obradu slika. Od velikog zna~aja je mogu}nost rada u in vitro uslovima sa }elijom koja nije podvrgnuta fiksaciji, bojenjima ili drugim tehnikama koje bi dovele do njenog razaranja. Vi|enje uzorka kroz okular je isto kao i na kompjuterskom monitoru. Vretena su vidljiva kroz okulare zbog menjanja polarizacionih stanja kristalne te~nosti polarizacionog kompenzatora. Svetlost sa mikroskopa, prolaze}i kroz cirkularni polarizator sa jednako ure|enim zracima svetlosti, produàva kroz zeleni filter koji isklju~uje sve druge svetlosti izvan opsega 546 ± 5 ηm talasne duìne. Kad ova svetlost nai|e na birefringentne strukture, kao {to je deobno vreteno, ona se prelama i prolazi kroz kristalnu te~nost ispod. Kristalna te~nost menja okvir ~itanja ovog pomeranja svetlosti pod razli~itim

373


uglovima {aljuci sve informacije u ra~unar koji ih prera|uje u slike, upotrebom algoritama. Daljom obradom dobijaju se slike birefringentnih delova uzorka i svih polarizacionih uglova koji su proizvedeni pomeranjem informacija prikupljenih u kristalnoj te~nosti. Mnoge materije u biomedicini su providne. Pojavljuju se homogeno i bezstrukturno kada su povratno osvetljene belom svetlo{}u. Kada se smeste izme|u dva polarizatora strukture postaju vidljive. Ako je uzorak kroz koji prolazi svetlost opti~ki anizotropan on menja poloàj polarizovane svetlosti. Opti~ka svojstva koja produkuju ovaj efekat nazvana su birefrigence. Anizotropne celularne strukture kao {to su tubulin, aktin, kolagen, miozin, su birefrigentne. Birefrigence pruà jedinstvenu mogu}nost da se izmeri i analizira strukturni red uzorka, bez tretiranja egzogenim bojama, fluorescentnim markiranjima, bojenjem ili pribegavanja destruktivnom i skupom elektronskom mikroskopu. Birefringence se javlja kod molekularnog reda, kada prose~na molekularna orijentacija nije anizotropne }elijske stukture, ve} na odgovaraju}i na~in ure|ena. Anizotropne strukture sadrè dve opti~ke ose sa indeksom prelamanja du` jedne ose, razli~itog od

indeksa prelamanja druge ose. Polarizovana svetlost paralelna sa jednom osom kre}e se razli~itom brzinom kroz uzorak za razliku od polarizovane svetlosti paralelne sa ortogonalnom osom. Ako su ove dve svetlosne komponente u fazi kada ulaze u uzorak one }e u uzorku iza}i iz faze. Merenje promene faze moè biti upotrebljeno za determinaciju birefrigence koji moè da se koristi za analizu i merenje molekularnog reda uzorka. Kvantitativno birefrigence prikazivanje se odnosi na merenje 2-D reda ta~aka, koji je u ovom slu~aju izvr{en pomo}u kristalne te~nosti univerzalnog kompenzatora i drugih elemenata Polscope sistema. Ova tehnika je zasnovana na merenju birefringence zaostatka koji je uzrokovan svojstvima uzorka. Zaostatak je proizvod birefrigence uzorka, koji dovodi u vezu ovaj zaostatak sa veli~inom i orjentacijom molekularnog reda. Birefrigence orjentacija se odnosi na opti~ku osu u uzorku koja ima ve}i indeks prelamanja. Ova osa je nazvana spora osa. Birefrigence orijentacija je u koleraciji sa molekularnom orijentacijom, koja tipi~no menja ta~ku po ta~ku u uzorku. Upotreba Polscope olak{ava analizu uzoraka, automatizaciju procesa merenja i obezbe|uje visoku osetljivost i visoku prostornu rezoluciju.

Sl. 4.128- Strukturna gustina deobnog vretena

374


Azimut prikazuje strukturnu orijentaciju uzorka. Na donjoj slici moèmo videti razli~ite boje primenjene u predstavljanju uzorka. Fibrili vretena su orjentisani radijalno u unutra{njem, kao i u spolja{njem sloju zone pelucide. Moè se videti i u vektor formatu kao azimut poloèn preko znatno uveli~ane slike dela zone pelucide.

Sl. 4.131- Mejoza

Sl. 4.129- Oocit

Na slici se vidi pored tankog unutra{njeg sloja deblji radijalni i spolja{nji tangencijalni sloj.

Sl. 4.130- Metafazno vreteno jajne }elija

Metafaza je okarakterisana potpuno oformljenim deobnim vretenom i linearno raspore|enim hromozomima u ekvatorijalnom delu deobnog vretena.

Sl. 4.132- Mitoza

Zahvaljuju}i upotrebi polskopa moè se u in vitro uslovima klini~ki predvideti kvalitet i starost oocita. Istraìvanja se zasnivaju na prou~avanju uspe{nosti fertilizacije oocita u zavisnosti od morfolo{kih osobina njihovog mejoti~kog vretena druge metafaze. Pregled promena u mejoti~kom vretenu je od velikog zna~aja, jer znamo da je mejoti~ko vreteno klju~no za normalni hromozomski raspored i deljenje maj~inskih hromozoma tokom mejoze. O{te}enje mejoti~kog vretena rezultuje u reorganizaciji, ili rasutosti kroz citoplazmu i dovodi do aneuploidije posle oplo|enja. Aneuploidija je uzrok abnormalne fertilizacije sa posledicama rane smrti embriona, spontanog

375


abortusa i nastajanja naslednih bolesti. Konvencionalne metode za prikazivanje mejoti~kog vretena, imunolo{ko bojenje i elektronska mikroskopija koriste fiksaciju i tako ograni~avaju prou~avanja dinamike vretena zbog destrukcije }elije. Upotreba polskopa je dovela do velikog pomaka u preimplantacionoj dijagnostici omogu}avaju}i kompletnu analizu dinami~kih }elijskih struktura u in vitro uslovima. Posmatranjem strukture vretena ìvog oocita i utvr|ivanjem rasporeda hromozoma predstavlja vaàn deo preimplantacione dijagnostike koja je danas nezabiolazni deo

u programima asistirane reprodukcije. Polscop se tako|e koristi za procenu razvojne kompetentnosti ljudskih oocita kod èna koje se pribliàvaju perimenopauzi, za izbor najboljih oocita iz kohorta oocita dobijenih od starijeg pacijenta, o ~emu je bilo govora u delu o procesu starenja i njegovom zna~aju za metode asistirane reproduktivne tehnologije. Polscope - spindle view imaging system koristimo od 2003. godine. Zbog relativno malog broja tretiranih pacijenata statisti~ka analiza rezultata je predvi|ena u narednom periodu.

Sl. 4.133- Gustina vretena ukazuje na hromozomsku abnormalnost

376


25. STEM ]ELIJE Studije teratokarcinoma mi{eva 60-ih godina pro{log veka ustanovile su poseban tip mati~nih stem }elija nazvanih embrionalne karcinoma }elije. Ove }elije su se pokazale pluripotentnim daju}i derivate sva tri klicina lista. Rezultati pomenutih studija su podstakli dalja istraìvanja stem }elija, prete`no u pravcu prou~avanja stem }elije pluripotentnog tipa. Godine 1981. Evans, Kaufman i Martin izvode prvu embrionalnu ES - embryonic stem }elijsku liniju iz ICM - inner cell mass blastociste mi{a.

Tomson i saradnici 1995. godine uspe{no izvode prvu primatsku ES - embryonic stem }elijsku liniju. Isti tim 1998. godine izvodi prvu humanu ES - embryonic stem }elijsku liniju pri WiCell Research Institute. Do danas je izvedeno preko sto humanih ES - embryonic stem }elijskih linija. Najuop{tenija definicija stem }eliju odre|uje kao }eliju poreklom iz embriona, fetusa ili adulta koja pod odre|enim uslovima ima sposobnost samoreprodukcije tokom dugih perioda i diferenciranja u specijalizovane tipove }elija koji izgra|uju tkiva i organe. Ovakva definicija implicira dodatno definisanje vrsta stem }elija.

Tipovi stem }elija Totipotentne stem }elije imaju potencijal razvi}a u }elije celog organizma, kao i sve }elije u prvih par dana brazdanja.

Sl. 4.134- ICM - inner cell mass

U narednih 20 godina usledili su poku{aji definisanja in vitro uslova za izvo|enje prve humane ES - embryonic stem }elijske linije.

Pluripotentne stem }elije su }elije koje mogu dati derivate sva tri klicina lista mezoderma, endoderma i ektoderma. Odgovaraju po funkciji }elijama jednog dela humane blastociste od 5 do 14 dana, }elijama ICM - inner cell mass. Teoretski, pluripotentne stem }elije mogu dati svaki }elijski tip organizma i proliferisati beskona~no. Tokom razvoja stem tehnologije definisana su tri tipa pluripotentnih stem }eliskih linija:

377


- Embrionalne karcinoma EC - embryonic stem }elije. Izvode se iz gonadalnih tumora teratokarcinoma koji sadrè derivate sva tri klicina lista; - Embrionalne stem ES - embryonic stem }elije. Izvode se iz blastociste preimplantacionog embriona; - Embrionalne germinativne EG }elije. Izvode se iz primordijalnih germinativnih }elija postimplantacionog embriona. Ova tri tipa }elija nisu jednaka po svojoj sposobnosti proliferacije i diferencijacije.

Unipotentne, multipotentne stem }elije su }elije adultnog organizma sposobne da

se diferenciraju u }elije jednog ili nekoliko }elijskih tipova. Potreba za ovim sloènim izrazom dolazi usled sposobnosti nekih adultnih }elija da daju isklju~ivo jedan izvedeni }elijski tip, na primer spermatogonije koje daju spermatozoide, dok druge adultne stem }elije mogu dati nekoliko specijalizovanih derivata, primer hematopoeti~na stem }elija. Dodatno, istraìvanja su pokazala plasti~nost stem }elija i sposobnost adultne stem }elije jednog tkiva da generi{e specijalizovani }elijski tip ili tipove drugog tkiva.

Sl. 4.135- Plasti~nost adultnih stem }elija

378


Adultne stem }elije su nespecijalizovane }elije sposobne da proizvode svoje identi~ne kopije i da se diferenciraju u specijalizovane }elijske tipove tkiva iz kojih poti~u. Nalazimo ih u ko{tanoj srì, krvi, kornei i retini oka, mozgu, skeletnim mi{i}ima, pulpi zuba, jetri, koì, pankreasu i du` gastrointestinalnog trakta. Adultne stem }elije su retke, te{ke za identifikovanje i izolaciju. Novije studije pokazuju da one imaju potencijal za produkciju {ireg raspona }elijskih tipova uz ne{to ve}u efikasnost. Tehnologija kultivacije adultnih stem }elija susre}e se sa problemom njihove umanjene proliferativne sposobnosti. ]elije gube sposobnost diferencijacije i obrnuto. Su{tinski problemi su stepen reprogramiranja jedra i odràvanje stabilnog kariotipa. hESC - human embryonic stem cell Nakon izolacije }elija ICM - inner cell mass iz blastociste petog dana i njihove kultivacije u posebnim uslovima, uspe{nom proliferacijom istih, mogu se dobiti }elije specifi~nih karakteristika, koje ih defini{u kao ES - embryonic stem }elije: - zadràvaju sposobnost beskona~ne proliferacije simetri~nim deobama bez diferencijacije hESC-human embryonic stem cell, - pokazuju i odràvaju pun diploidan i normalan komplement hromozoma, kariotip, - zadràvaju razvojni potencijal formiranja izvedenih derivata sva tri klicina lista, - klonogene su, pojedina~na ES - embryonic stem }elija moè dati koloniju geneti~ki identi~nih }elija sa zadrànim karakteristikama originalne }elije. Sve ES embryonic stem }elijske linije ne pokazuju ovu osobinu, - nemaju G1 fazu }elijskog ciklusa, ve}inu ìvota provode u S fazi sinteti{u}i

DNK - deoksiribonukleinsku kiselinu, regulisane su unutra{njom signalizacijom i spoljnim faktorima, - ne pokazuju X inaktivaciju, - pokazuju ekspresiju transkripcionog faktora Oct-4 - octamer -4, klju~ni faktor za odràvanje proliferacije i nediferenciranog stanja }elija i visok nivo alkalne fosfataze - poseduju stalnu i visoku aktivnost telomeraze, enzima koji odràva duìnu telomera hromozoma. Relativno duge telomere indikacija su sposobnosti za dugi niz deoba, - odlikuju ih slede}i povr{inski }elijski markeri: SSEA-1 izostaje SSEA-3 prisutan SSEA- 4 prisutan TRA-1-60 prisutan TRA-1-81 prisutan.

Kultivacija ES - embryonic stem }elija Embrionalne stem }elije su osetljive i zahtevne u kulturi. Rast im je relativno spor PDT - population doubling time od 36 ~asova. Moraju se svakodnevno prihranjivati. Medijum za kultivaciju je DMEM Dulbecco s modified Eagle s medium sa 20% seruma FCS - fetal calt serum i dodacima, bez LIF - leukemia inhibitory factor neophodnog za mESC - mouse embryonic stem cell. U sudu za kulturu neophodan je monosloj }elija tipa fibroblasta, feeder cells koji podràva rast ES embryonic stem }elija. Pored toga {to je neophodno prisustvo feeder cells, na uspe{nost kulture uti~u i drugi, za sada nepoznati faktori. Tokom kultivacije rastu i razdeljuju se kao relativno spljo{tene i rastresite kolonije, sve do uspostavljanja besmrtne linije.

379


Sl. 4.136- ES - embryonic stem }elije sa feeder cells

Na svakih nekoliko pasaà testira se pluripotentnost ES - embryonic stem }elija, njihova sposobnost za diferencijaciju i kariotip.

Pravci istraìvanja i primena Eksperimenti sa mi{jim ES embryonic stem }elijama su dobrim delom razjasnili procese u embrionalnom, fetalnom i postnatalnom razvi}u. Tako|e su posluìli u studijama adultne homeostaze. Ekperimenti sa humanim ES - embryonic stem }elijama danas se vr{e u istraìva~kim centrima koji imaju vlastite hESC - human embryonic stem cell linije, kao i u centrima koji date }elije dobijaju za istraìvanje.

Sistem }elijske kulture za studije mehanizama diferencijacije Prvi korak u ovim studijama je izdvajanje hESC - human embryonic stem cell iz kokulture sa feeder }elijama. Sledi gajenje u suspenziji u sudu sa neadherentnom podlogom. U takvom sistemu kulture dolazi do spontane diferencijacije hESC - human embryonic stem }elija i formiranja embrioidnih tela. ]elije embrioidnih tela se potom mogu: - razbiti na suspenziju pojedina~nih }elija, zasejati u monosloju i potom izloìti

faktorima rasta u cilju dobijanja }elija odre|enog tipa, - biti ostavljene da se spontano diferenciraju unutar embrioidnih tela u cilju dobijanja ve}e koli~ine razli~itih tipova }elija u odmakloj diferencijaciji. Dodavanje nekog faktora rasta u cilju usmerene diferencijacije samo indukuje ekspresiju vi{e }elijskih markera. Rezultat nikad nije homogena }elijska populacija koja bi se sa sigurno{}u proglasila funkcionalnim }elijama èljenog tipa i bila kao takva primenjena u israìvanjima ili terapiji.

Studije diferencijacije transdukovanih ES - embryonic stem }elija ES - embryonic stem }elije se mogu transdukovati vektorima gena, gene trap vectors, kada razni tipovi molekularnih nosa~a unose strani gen u }elije doma}ina. Cilj istraìvanja je identifikovanje novih gena regulatora razvi}a i pra}enje diferencijacije }elija u kojima je dati gen aktivan. Za savremenu embriologiju je od izuzetne va`nosti izgraditi kompletnu mapu ekspresije gena tokom razvi}a sisara, naro~ito ~oveka. Humane ES - embryonic stem }elije su se pokazale kao izvanredan eksperimentalni model u studijama embriogeneze, pra}enja kako se razli~iti }elijski tipovi formiraju, odràvaju, dele, diferenciraju i migriraju.

Studije faktora nepravilne embriogeneze Jedan od prioriteta humane embriologije je definisanje teratogenih, bilo egzogenih, bilo endogenih, faktora i razumevanje uzroka nepravilne embriogeneze. ES embryonic stem }elije i u ovom slu~aju posluì}e kao in vitro sistem za studije efekata teratogenih supstanci i drugih egzogenih uzroka nepravilnog razvi}a, kao i in

380


vitro sistem za studije sa ubacivanjem reprogramiranih gena u }elije u kojima su dati geni disfunkcionalni, kao i sistem za otkrivanje novih endogenih uzroka nepravilnog razvi}a.

In vitro tehnike za tuma~enje razvojnih procesa ES - embryonic stem }elije su pogodan eksperimentalni model na kom se prou~avaju razvojni procesi u naj{irem smislu, a koji se de{avaju tokom eksperimenata sa: usmeravanjem diferencijacije }elija, gene trapping vektorima, ablacijom }elija i nekroti~ne i programirane }elijske smrti, selektovanjem }elijskih linija, markiranjem linija, karakterizacije }elijske linije u izvo|enju.

Sistem }elijske kulture za molekularno geneti~ke eksperimente Izdvajamo samo dva tipa eksperimenata kao ilustraciju primene ES - embryonic stem }elija u istraìvanjima savremene molekularne biologije: mapiranje mreè transkripcionih faktora koji reguli{u ekspresiju gena specifi~nih za neko tkivo pore|enjem mutantnih i divljih tipova ES embryonic stem }elija i analiza uticaja specifi~nih kombinacija spoljnih citokina i faktora rasta na }elijsku diferencijaciju.

Potencijalna primena ES - embryonic stem }elija u medicini Me|u brojnim potencijalnim prakti~nim primenama hESC - human embryonic stem cell, naj~e{}e se diskutuje o primeni u transplantacionim terapijama, zameni ili obnavljnju tkiva koja su o{te}ena sistemskom bole{}u ili povredom. Odgovaraju}e diferencirane i potpuno klini~ki testirane, biolo{ki sigurne po pacijenta, sa izvesno{}u opstanka u telu recipijenta, ove }elije

bi se mogle transplantirati u tretmanu slede}ih oboljenja: Parkinsonova bolest, dijabetes mellitus, o{te}enja srca, traume ki~mene mo`dine, mi{i}ne distrofije i drugih. ES - embryonic stem }elije bi mogle biti neograni~ena zaliha za humanu transplantaciju pod uslovom da se prevazi|e problem dobijanja dovoljne koli~ine ES embryonic stem }elija za detaljnu karakterizaciju istih, testiranja pre terapije i samu transplantaciju. Realni problemi u kultivaciji ES - embryonic stem }elija s kojim se od po~etka susre}u istraìva~i su relativno spor rast hESC - human embryonic stem cell, tendencija ka diferencijaciji i niska klonogena sposobnost. Opravdanost stava da su hESC - human embryonic stem cell i pored realnih problema u njihovoj kultivaciji, mogu}e re{enje za bezbednu transplantaciju, bazira se na osnovu dosada{njih potvr|enih otkri}a da se transferom jedra somatske }elije u enukleisanu jajnu }eliju dobijaju normalne ES embryonic stem }elije sa èljenim genetskim materijalom, potvr|eno na ES embryonic stem }elijama mi{a, zatim da su humane ES - embryonic stem }elije vijabilne, netransformisane, sa zadrànom sposobno{}u diferencijacije i nakon vi{e stotina pasaà. Isto tako je dokazano da su hESC - human embryonic stem cell telomeraza - pozitivne, klonabilne i kariotipski stabilne. U okviru 150 pasaà dovoljno je prostora za zamenu jedra, genetsko manipulisanje, klonalnu selekciju, testiranje kvaliteta i kreiranje banke }elija za naknadnu diferencijaciju, po standardizovanim procedurama. Ako na sve ovo potro{imo 80 pasaà, u preostalih 70 pasaà, jedna }elija da}e 10 21 }elija i sa samo 1% efikasnosti diferencijacije bi}e obezbe|ena koli~ina }elija za tretman 10 miliona pacijenata sa po 1012 }elija (≈1kg).


Preduslovi za primenu u terapijske svrhe: - nu`nost kontrolisane diferencijacije i dobijanje homogene populacije }elija, - obezbe|ivanje efikasnosti transplantiranih }elija, jer se nakon transplantacije moraju uklopiti u tkivo o{te}ene oblasti i funkcionisati dovoljno dugo odgovaraju}e diferencirane, - fizi~ka izolacija specifi~nog }elijskog tipa za transplantaciju iz sudova za kulturu u kojima je sprovo|ena njihova diferencijacija, primenom }elijskih sortera, kori{}enje selektivnih }elijskih markera za obeleàvanje èljenog ili neèljenog tipa }elije i specifi~ni uslovi kulture, kori{}enje promotera tipi~nih za jedan }elijski tip ili tkivo. Obezbe|ivanje biolo{ke sigurnosti za pacijenta podrazumeva nekoliko ispo{tovanih uslova: - hESC - human embryonic stem cell ne smeju biti tumor, - diferencijacija ovih }elija i nakon transplantacije mora biti odgovaraju}a, - pretpostavljeno prisustvo infektivnih agenasa u }elijama izvedenim na gove|em serumu mora se eliminisati kao faktor rizika. Za potrebe terapije izvodi}e se nove hESC - human embryonic stem }elijske linije bez animalnih elemanata u medijumu, medijum sa humanim serumom, problem transpozonskih skokova sa nehumanih feedera re{en je upotrebom humanih feeder }elija, - nu`nost histokompatibilnosti. S obzirom da je u transplantacionoj terapiji uslov da transplantat ne bude odba~en, mogu}e pristupe u re{enju ovog problema na hESC - human embryonic stem cell treba posebno naglasiti.

381

Imunosupresivna terapija kao klasi~an pristup u spre~avanju odbacivanja transplantata varira u ja~ini zavisno od toga koliko je stran upotrebljeni }elijski materijal. Ukoliko se oforme banke sa nekoliko osnovnih histokompatibilnih tipova hESC human embryonic stem cell koji pokrivaju celu ljudsku populaciju, imunosupresivna terapija bi bila primenjena u ne{to blaòj formi. Mogu}nost transplantacije hESC human embryonic stem cell originalnog donora, IVF - in vitro fertilisation blastocista, histolo{ki potpuno udaljenom pacijentu se danas ne smatra realnim pristupom. hESC - human embryonic stem cell potpuno histokompatibilne recipijentu mogu se obezbediti transferom jedra somatske }elije pacijenta u enukleisanu jajnu }eliju. Iniciranjem takve jajne }elije na deobu, standardnom IVF - in vitro fertilisation kultivacijom, dobija se blastocista sa genomom gotovo identi~nim pacijentu, SCNT - somatic cell nuclear transfer blastocista. Obavezni koraci u ovom procesu su: 1) Reprogramiranje nukleusa pacijentovih adultnih }elija, 2) Nukleotransfer u jajnu }eliju i izvo|enje ES - embryonic stem }elijske linije iz rezultuju}e blastociste, 3) Transgeneza u kulturi It, 4) Ubiranje transgenih }elija koje su se diferencirale u stem }elije èljenog tkiva, 5) Transfer }elija u pacijenta, autotransplantacija. Ako postoji i najmanja mogu}nost da se primenom hESC - human embryonic stem cell pomogne bolesnom ~oveku, svakako treba u~initi sve da stem tehnologija ne bude samo eksperimentalna praksa velikih svetskih instituta, ve} istinska klini~ka realnost.

382


26. ETI^KI PRISTUP PROGRAMIMA ASISTIRANE REPRODUKTIVNE TEHNOLOGIJE Osnove eti~kog pristupa, bazirane na po{tovanju autonomije pacijenta i specifi~nosti programa, su slede}e: Informisanost Detaljna informisanost pacijenata je jako zna~ajna i trebala bi biti u pisanoj formi sa podacima o na~inu izvo|enja postupka, trajanju, efikasnosti i komplikacijama. Saglasnost Mora biti potpisana saglasnost pacijenta za izvo|enje postupka. Tajnost Postupci donacija gameta i embriona moraju biti tajni, posebno kod donacija gameta, embriona, surogat roditeljstva. Bra~ni status Postupci se mogu primeniti kod bra~nih i vanbra~nih parova sa stabilnom vezom. Donacija embriona Donacije embriona su eti~ki prihvatljive, ali se moraju pravno regulisati u smislu ostvarivanja i eventualnog osporavanja maj~instva i o~instva. Donacija sperme Treba da je anonimna i ne mogu davaoci biti ro|aci i prijatelji. Donacija oocita Donacija oocita je eti~ki prihvatljiva kod slede}ih indikacija: prevremena i regularna menopauza, lo{ kvalitet oocita, vi{e

neuspe{nih IVF - in vitro fertilisation postupaka. Krioprezervacija Krioprezervacija sperme i embriona je dozvoljena. ûvanje do 10 godina, a ukoliko 5 godina nema kontakta sa pacijentima mogu se uni{titi. Zamrzavanje ovarijalnog i testikularnog tkiva dozvoljeno je kod adolescenata u slu~aju malignih obolenja.

Embrio transfer Preporuka je: - ènama do 35 godina starosti - 3 embriona - sa vi{e neuspe{nih postupaka - 3 embriona i po dogovoru - starijim od 35 godina

- 3 embriona i po dogovoru

Embriocid Dozvoljen je u dogovoru sa pacijentom. Selekcija pola Iz medicinskih razloga kod postojanja rizika za preno{enje naslednih bolesti. Surogat roditeljstvo Odobreno gestaciono surogat roditeljstvo, u kojem surogat majka nije i genetska majka. Tretman starijih èna Bez postavljanja limita godinama starosti. Jedini limit je zdravstveno stanje ène.

383


SKRA]ENICE

ACC - aminocyclopropane 1 carboxylic acid Ach - acetylcholine ACRP 30 - adiponektin-adipocyte comple ment related protein of 30kDa ADAMTS 1 - a disintegrin and metallopro teinase with 0ska kiselina, DNA- deoxyribonucleic acid Dnmt - deoxyribonucleic acid methyltransferase EBM - evidenciono bazirana medicina EBSS - Earle's balanced salt solution ECGF - epithelial cell growth factor ECM - extra-cellular matrix EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid EG - ethylene glycol EGF - epidermal growth factor EIM - european IVF- monitoring programme ELISA- enzyme linked immunosorbent assay EPO - eritropoetin ES - embryonic stem ES - embryonic stem eSET - elective single embryo transfer ESHRE - european society for human reproduction and embryology ET - embryo transfer EUFA - early unilateral folicular aspiration EUFA - early unilateral folicular aspiration FbM - filled by mass tehnika FCS - fetal calt serum FER - frozen embryo replacement FF - follicle fluid FF-MAS - folicular fluid meiosis activating sterol FGF - fibroblast growth factor FGFR - fibroblast growth factor receptor FI - flow index

FISH - fluorescence in situ hybridization FIZ3 - found inflammatory zone 3 FN - follicle number FNA - fine needle aspiration FOXL - forkhead transcription factore gene FRP - follicle regulatory peptide FSH - follicle stimulating hormone FSHR - follicle stimulating hormone receptor FSP - fallopian tube sperm perfusion G-CSF - granulocyte colony stimulating factor GDF - growth differentiation factor GIFT - gamete intrafallopian transfer GM-CSF - granulocyte macrophage colony stimulating factor GM-CSF - granulocyte macrophage colony stimulating factor GNAS - guanine nucleotide binding protein alpha stimulating GnRH antagonista - gonadotropin releasing hormon antagonista GnRH - gonadotropin releasing hormon GSH - glutathione GTP - guanosine triphosphate GV - germinal vesicle GVBD - germinal vesicle breakdown H - hystocompatibility gen HA - hyaluronic acid HAES - hydroxyethyl starch rastvor HAH - hemoaglutinacije test HB-EGF - heparin binding epidermal growth factor HBGF - heparin binding growth factor HBV - hepatitis B virus HCG - human chorionic gonadotropin HCMV - human cytomegalo virus

384


HCV - hepatitis C virus HDAC - histone deacetylase HEPA - high efficiency particulate air HEPES-(4 - (2-hydroxyethyl) - piperazinee thanesulfonic acid) hESC - human embryonic stem cell hESC - human embryonic stem cell HIG - hemolysis in gel test HIV - human immunodeficiency virus HLA - human leukocyte antigen HMG - human menopausal gonadotrophin HOS - hypoosmotic swelling test HOS - hypoosmotic swelling test HOX - homeobox gene HOXA10 - homeobox A10 gene HP U-FSH - high purity - urinarni folikul stimulirajuci hormon HPLC - high performance liquid chro matography HPV - human papilloma virus HSD - hydroxysteroid dehydrogenaze HSET - kinesin related protein HSP - hydrosalpinx HspA2 - heat shock 70kDa protein 2 HSV - herpes simplex virus IAP - intracisternal A particle ICI - intracervikalna inseminacija ICM - inner cell mass ICSI - intra citoplasmatic sperm injection IFI - intrafolikularna inseminacija Ig - immunoglobulin IGF - insulin like growth factor IGFB - insulin like growth factor binding IGT - impaired glucose tolerance IL - interleucin IMB - immunobead test IMC - inseminating motile count IPI - intraperitonalna inseminacija ITI - intratubarna inseminacija IUI - intra uterina insemination IUI - intrauterina inseminacija IVF - in vitro fertilisation IVI - intravaginalna inseminacija IVM - in vitro maturation KGF - keratinocyte growth factor LH - luteinizing hormone LHR - luteinizing hormone receptor

LIF - leukemia inhibitory factor LIF - leukocytes inhibitory factor LIT 1 - latroinsectotoxins LOS - large offspring syndrome LTMD - long term moderate dosis LUFS - luteinizing unruptured follicle MAD - mitotic arrest deficiency protein MAP - mitogen activated protein MAR - mixed antiglobulin reaction test MAS - meiosis activating sterol MBD - methyl cytosine guanine binding domain MDS - mijelodisplastièni sindrom MeCP - methyl cytosine guanine binding protein MESA - microsurgical epididymal sperm aspiration mESC - mouse embryonic stem cell MEST - PEG - mesoderm specific transcript - paternally expressed MHC - major histocompatibility complex MISS - meiotic spindle stability protein MMP - matrix metalloproteinase MMR - measles,mumps,rubella MOS - serine /threonine protein mPBR - mitochondrial peripheral benzodi azepine receptor MPF - maturation promoting factor mRNK - messenger ribonucleic acid MTHFR - 5, 10 methylenetetrahydrofolate reductase MTOC - microtubule organizing center mucus penetration test NAD - nicotinamide adenine dinucleotide NADP - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Ndn - nectin-encoding NGF - nerve growth factor NK - natural killer NPY - neuropeptida Y NRY - non recombining segment Y chromo some gene NT3 - neurotrofin OA - ovarian area OAT - oligo-astheno-teratozoo-spermia OCP - oral contraceptive pill Oct-4 - octamer -4 OD - ovum donation OHSS - ovarian hyperstimulation syndrome


OV - ovarijalni volumen PAF - platelet activating factor PB1 - polar body PBR - polar body removal PCO - polycystic ovarian PCOS - polycystic ovarian syndrome PCR - polymerase chain reaction PCT - postkoitalni test PCT - postkoitalni test PDGF - platelet derived growth factor PDT - population doubling time Peg - paternally expressed PEG - polyethylene glycol PEPCK - phosphenolpyruvate carboxykinase PESA - percutaneous sperm aspiration PETG - polyethylene terephtalate glycol PG - prostaglandins PGC - primordial germ cells PGD - preimplantation genetic diagnosis PGD-AS-preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening PGS - preimplantation genetic screening PGWB - psychological general Well-Being index PI - pulsatility index POF - premature ovarian failure POMC - pro opiomelanokortin PPAR - peroksizom proliferatorno aktivi rani receptor PR - progesteronski receptor PSA - prostate cancer screening PT - prothrombin time PTX3 - pentraxin related gene PVA - polyvinyl alcohol PVC - polyvinyl chloride PVP - polyvinyl pyrrolidone PVP - polyvinylpyrolidone PWS - Prader-Willi syndrome PZD - partial zona dissectio RBB - retinoblastoma binding gene RBMX - RNK binding motif X chromo some gene RCT - randomized controlled trial r-FSH - rekombinantni folikul stimulirajuci hormon RI - resistence index RIA - radioimmunoassay r-LH - rekombinantni luteinizirajuci hormon

385

RNK - ribonukleinska kiselina ili RNA ribonucleic acid ROC - reciever operator characteristic ROS - reactive oxygen species RPS4X - ribosomal protein S4 X chromo some gene RSK - ribosomal S6 kinase SCMPT - standardized determinations of the sperm-cervical SCNT - somatic cell nuclear transfer blastocista SCSA - sperm chromatin structural assay SHBG - sex hormone binding globulin SIFI - sperm intrafallopian insemination SN - surrounded nucleolus SNP - single nucleotide polymorphism SNP - sodium nitroprusside Snrpn - small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N SOX3 - sulfur oxidation gene SPA - sperm penetration assay SRY - sex determining region (gen) ST - syncytiotrophoblast STAT - signal transducers and activator of transcription STS - sequenced tagged sites SUZI - subzonska inseminacija TALP- termination analysis of loqic programs TAT - tray agglutination test TCM - traditional chinese medicine TDF - testis determining factor TEFNA - testicular fine needle aspiration TEM - transmission electron micrograph TESE - testicular sperm extraction TGF - transforming growth factor T-MAS - testis meiosis activating steroid TNF - tumor necrosis factor TP - thymidine phosphorylase TPO Abs - thyroid peroxidase antibodies TSH - thyroid stimulating hormone TZP - transzonal projections UCP2 - uncoupling protein UFE - uterusna fibroidna embolizacija U-FSH - urinarni folikul stimulirajuci hormon USP9 Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gene VEGF - vascular endothelial growth factor VFI - vascularisation flow index

386


VI - vascularisation index VIN - vulvarna intraepitelna neoplazija VIP - vasoactive intestinal polypeptide VOCAL - virtual organ computer-aided analysis Wnt-4 - wingless-int WT - Wilms tumors

YAC - yeast artifitial chromosome YAG - neodymium doped yttrium alumini um garnet YCS - yeast artificial chromosome ZFX - zink finger X chromosome gene Znf - zink finger gene

387

LITERATURA Abdul-Jalil, A., Child, T., Phillips, S., et al., (2001). Ongoing twin pregnancy after ICSI of PESA-retrieved spermatozoa into in-vitro matured oocytes: Case report. Hum. Reprod. 16: 1424-1426. Aboulghar, M., Mansour, R. Serour, G. et al. (1999). Elevated levels of interleukin-2, soluble interleukin-2 receptor alpha, interleukin-6, soluble interleukin-6 receptor and vascular endothelial growth factor in serum and ascitic fluid of patients with severe ovarian hyperstimulation syndrome. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 87: 81-85 Abraham IM, Han SK, Todman MG, Korach KS, Herbison AE, Estrogen receptor beta mediates rapid estrogen actions on gonadotropin-releasing hormone neurons in vivo, J Neurosci 23:5771, 2003. Acker, T., Beck, H. and Plate, K. (2001). Cell type specific expression of vascular endothelial growth factor and angiopoietin-1 and -2 suggests an important role of astrocytes in cerebral vascularization. Mech. Dev. 108: 45-57. Ackert CL, Gittens JE, O'Brien MJ, Eppig JJ, Kidder GM, Intercellular communication via connexin43 gap junctions is required for ovarian folliculogenesis in the mouse, Dev Biol 233:258, 2001. Acosta, A., Elberger, L., Borghi, M., Calamera, J. et. al. (2000). Endometrial dating and determination of the window of implantation in healthy fertile women. Fertil. Steril. 73: 788-798. Adams, R., Wilkinson, G., Weiss, C. et al., (1999). Roles of ephrinB ligands and EphB receptors in cardiovascular development: demarcation of arterial/venous domains, vascular morphogenesis, and sprouting angiogenesis. Genes and Develop.. 13: 295-306. AgcaY. and Crister J. (2002). Cryopreservation of spermatozoa in assisted reproduction. Semin. Repro. Med. 20: 15-24. Aihua, L., Dubey, S., Varney, M. and Singh, R. (2002). Interleukin-8- induced proliferation, survival and MMP production in CXCR1 and CXCR2 expressing human umbilical vein endothelial cells. Microvas. Res. 64: 476-481. Aihua, L., Dubey, S., Varney, M. and Singh, R. (2002). Interleukin-8- induced proliferation, survival and MMP production in CXCR1 and CXCR2 expressing human umbilical vein endothelial cells. Microvas. Res. 64: 476-481. Akande, V., Fleming, C.F., Hunt, L.. et al. (2002). Biological versus chronological ageing of oocytes, distinguishable by raised FSH levels in relation to the success of IVF treatment. Hum. Reprod. 17: 2003-2008. Akiyama, H., Saito, M., Qiu, G. et al. (1994). Analytical studies on hyaluronic acid synthesis by normal human epidermal keratinocytes cultured in serum-free medium. Biol. Pharm.Bull. 17: 361-364. Ali, J., Shahata, M.., Al-Natsha, S. (2000) Formulation of a protein-free medium for human assisted reproduction. Hum. Reprod, 15: 145-156. Alikani, M, Cohen J., Tomkin G. et. al., (1999). Human embryo fragmentation in vitro and its implications for pregnancy and implantation. Fertil. Steril. 71: 836-842. Alikani, M., Calderon, G. Tomkin, G. (2000). Cleavage anomalies in early human embryos and survival after prolonged culture in-vitro. Hum. Reprod. 15: 2635- 2643. Alon, R. and Feigelson, S. (2002). From rolling to arrest on blood vessels: leukocyte tap dancing on endothelial integrin ligands and chemokines at sub-second contacts. Semin. Immunol. 14:93-104. an indispensable subunit of the IL-21 receptor complex. J. Immunol. 167: 1-5. Andersen, C, Morineau, G., Fukuda, M., et al. (1999). Assessment of the follicular cortisol cortisone ratio. Hum. Reprod. 14: 1563-1568.

388

Aistirana reproduktivna tehnologija u humanoj reprodukciji

Antczak, M., (2001). Possible ramifications of the identification of ovarian follicular granulosa cells as specialized endothelial-like cells: a speculative treatise. RMB Online 2: 188-197. Antczak. M., and Van Blerkom, J. (2000). The vascular character of ovarian follicular granulosa cells: phenotypic and functional evidence for an endothelial-like cell population. Human Reprod. 15: 2306-2318. Apparao, K. Lovely, L. Gui, Y. et. al. (2002). Elevated endometrial androgen receptor expression in vomen with polycystic ovarian syndrome. Biol. Reprod. 66: 297-304. Artini, P. Monti, M., Fasciani, A. et al., (2002). Vascular endothelial cell growth factor, interleukin-6 and interleukin-2 in serum and follicular fluid of patients with ovarian hyperstimulation syndrome. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 101: 169-174. Asao, H., Okuyama, C, Kumaki, S. et al., (2001). Cutting edge: the common gamma-chain is Azghani, A., Baker, J. W., Shetty, S. et al. (2002). Pseudomonas aeruginosa elastase stimulates ERK signaling pathway and enhances IL-8 production in alveolar epithelial cells in culture. Inflamm. Res. 51: 506-510. Baggiolini, M., Balaban,B., Urman.B-, Alatas,C, et ai., (2001c). Blastocyst-stage transfer of poor-qua cleavage stage embryos results in higher implantation rates. Fertil. Steril. 75: 514-518. Baltz, J. (2001). Osmoregulation and cell volume regulation in the preimplantation embryo.Curr. Top. Dev. Biol. 52: 55-106. Barak, V., Mordel, N., Zajicek, G., et al. (1992). The correlation between interleukin 2 and soluble interleukin 2 receptors to oestradiol, progesterone, and testosterone levels in periovulatory follicles of in-vitro Fertilization. Hum. Reprod. 7: 926-929. Baranao, R., Dain, L., Palak de Fried, E. and Rumi, L. (1995). Human granulosa cells are express HLA-DR antigen and are capable of synthesizing interleukin-1. Horm. Metab. Res.27: 495-498. Barnes RB, Namnoum AB, Rosenfield RL, Layman LC, The role of LH ird FSH in ovarian androgen secretion and ovarian foilicular development: . linical studies in a patient with isolated FSH deficiency and multicystic -. aries, Hum Reprod 17:88, 2002. Barrit, J. Brenner, C, Willadsen, S. and Cohen, J. (2000). Spontaneous and artificial changes in human ooplasmic mitochondria. Hum. Reprod. 15 (Suppl. 2): 207-217. Barritt J., Brenner, C, Maker, H. and Cohen, J. (2001b) Mitochondria in human offspring derived from ooplasmic transplantation. Hum. Reprod. 16: 513-516. Barritt, J, Tomkin, G., Cohen, J. and Brenner, C. (2001a). Age-related quantification of mitochondrial DNA in human oocytes. In: Barlow DH, editor. 17th Annual Meeting the European Society of Human Reproduction and Embryology; Lausanne: Oxford University Press, p. 68, abstract 0-165. Barritt, J., Willadsen, S., Brenner, C. et al. (2001). Cytoplasmic transfer in assisted reproduction. Hum. Reprod. Update 7: 428-435. Beagley, K and Timms, P. (2000) Chlamydia trachomatis infection : Incidence, health costs and prospects for vaccine development. Journal of Reproductive Immunology 48 : 47-68. Bean, C, Hassold, T., Judis, L. et al. (2002). Fertilization in vitro increases nondisjunction during early cleavage divisions in a mouse model system. Hum. Reprod. 17: 2362-2367. Beebe, D., Wheeler, M., Zeringue, H. et. al. (2002). Microfluidic technology for assisted reproduction. Theriogenology 57: 1 Special Issue SI) 125-135. Bielanska,M.,Tan,S. and Ao,A. (2000). Significance of mosaicism in the huma-preimplantation embryo. Abstracts of the 16th Meeting of ESHRE, Bologna, June 2000-Hum Reprod 15 (Abstract Book 1): O-030. Biggers, J. and Raeowsky, C. (2002). The development of fertilized human ova to the blastocyst stage in medium KSOMAA: Is a two-step protocol necessary? Reprod. BioMed Online. 5: 133-140. Biggers, J. McGinnis, L. and Raffin, M. (2000). Amino acids and preimplantation developmc of the mouse in protein-free potassium simplex optimized medium. Biol. Reprod. 63: 281- 293. Bjarnason K, Cerin A, Lindgren R, Weber T, the Scandinavian Long Cycle Study Group, Adverse endometrial effects during long cycle hormone replacement therapy, Maturitas 32:151, 1999.

Literatura

389

Blumenfeld Z, Response of human fetal pituitary cells to activin, inhibin, hypophysiotropic and neuroregulatory factors in vitro, Early Pregnancy 5:41, 2001. Bodetti, T., Jacobson, E., Wan, C., Pospischil, A., Hafner, L., Rose, K. and Timms, P. (2003) Host range of the human pathogen Chlamydia pneumoniae expanded to include reptiles and amphibians. Veterinary Microbiology (in press) Boiso, I. (2002). Fundamentals of human embryonic growth in vitro and the selection of high quality embryos for transfer. Reprod. Bio.Med. Online 5: 328- 350. Boiso, I., Marti, M., Santalo, J. et al. (2002). A confocal microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human oocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase II stage. Hum. Reprod. 17, 1885-1891. Bravo, J. and Heath, J. (2000). Receptor recognition by gpl30 cytokines. EMBO J. T9: 2399-2411. Brockhurst, V and Timms, P (2002) Application of the ligase-assisted spacer addition (LASA) method for human genotyping using polymorphisms at the dinucleotide locus, D1S191. Biotechniques (submitted) Bruckner, K., Pasquale, E. and Klein, R. (1997). Tyrosine phosphorylation of transmembrane ligands for Eph receptors. Science 275: 1640-1643. Brunet, S. and Vernos, I. (2001). Chromosome motors on the move. From motion to spindle checkpoint activity. EMBO Rep. 2: 669-673. Buonomo, S., Clyne, R., Fuchs, J. et al. (2000). Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell 103: 387-398. Burger HG, Dudley E, Manners P, Groome N, Robertson DM, Early follicular phase serum FSH as a function of age: the roles of inhibin B, inhibinAand estradiol, Climacteric 3:17, 2000. Byskov AG, Andersen CY, Leonardsen L, Role of meiosis activating sterols, MAS, in induced oocyte maturation, Molec Cellular Endocrino 187:189,2002. Calogero, A., Burrello, N. and Ossino, A. (1998) Endothelin (ET)-l and ET-3 inhibit estrogen and cAMP production in rat granulosa cells in vitro. J. Endocrinol. 157: 209- 215. Calogero, A., Nicoletti, F., Palumbo, M. et al. (1998). Macrophage-derived cytokines in the follicular fluids of women with infertility due to immunological causes. Elevated levels of interleukin 6 and low levels of granulocyte-macrophage colongy stimulating factor. Cytokine 10: 814-818. Camenisch, T., Spicer, A. P., Brehm-Gibson, T. et al. (2000). Disruption of hyaluronan synthase2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. J. Clin. Invest. 106: 349-360. Cavilla, J., Kennedy, C, Baltsen, M, et al. (2001). The effects of meiosis activating sterol on in vitro maturation and fertilization of human oocytes from stimulated and unstimulated ovaries. Hum. Reprod. 16: 547-555. Cha, K., Han, S., Chung, H., et al. (2000). Pregnancies and deliveries after in vitro maturation culture followed by in vitro fertilization and embryo transfer without stimulation in women with polycystic ovary syndrome. Fertil. Steril. 73: 978-983 Chang, C, Wang, T., Horng, S. et al. (2002). The concentration of inhibin B in follicular fluid: relation to oocyte maturation and embryo development. Hum. Reprod. 17: 1724-1728. Chang, R., Gougeon, A. and Erickson, G. (1998). Evidence for a neutrophil-interleukin-8 system in human folliculogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 178: 650-657. Child T, Abdul-Jalil A, Gulekli B. and Tan S-L. (2001) In vitro maturation and fertilization of oocytes from unstimulated normal ovaries, polycystic ovaries and women with polycystic ovary syndrome. Fertil Steril 76: 936-942. Chou C-S, Tai C-J, MacCalman CD, Leung PCK, Dose-dependent effects of gonadotropin releasing hormone on matrix metalloproteinase (MMP)-2, and MMP-9 and tissue specific inhibitor of metalloproteinases-1 messenger ribonucleic acid levels in human decidual stromal cells in vitro, J Clin Endocrinol Metab 88:680, 2003.

390


Chow, D.. Ho, J., Pharn. T. et al. (2001). In vitro reconstruction of recognition and activation complexes between interleukin-6 and gpl30. Biochemistry 40: 7593-7603. Christensen JH, Siggaard C, Corydon TJ, deSanctis L, Kovacs L, Robertson GL, Gregersen N, Rittig S, Six novel mutations in the arginine vasopressin gene in 15 kindreds with autosomal dominant familial neurohy-pophyseal diabetes insipidus give further insight into the pathogenesis, Eur J Hum Genet 12:44, 2004. Chung, J., Park, Y., Paek. S. et al. (1999). Effect of Na-hyaluronan on stromal and endothelial healing in experimental corneal alkali wounds. Ophthalmic Res. 31: 432- 439. Cioffi, J., Van Blerkom, J., Antczak, M. et al., (1997). The expression of leptin and its receptors in pre-ovulatory human follicles. Mol. Hum. Reprod. 3: 467-472. Clyde, J., Gosden, R., Rutherford, A. et al. (2001). Demonstration of a mechanism of aneuploidy in human oocytes using Multifluor fluorescence in situ hybridization. Fertil. Steril. 76: 837-840. Cohen, T., Gluzman-Poltorak, Z., Brodzky, A. et al. (2001). Neurocndocrine cells along the digestive tract express neuropilin-2. Biochem. Biophys. Res. Commun. 284: 395-403. Cohen, T., Nahari, D., Cerem, L. et al. (1996). Interleukin 6 induces the expression of vascular endothelial growth factor. J. Biol. Chem., 271: 736-741. Cohen-Kaminsky, S. and Berrih-Aknin, S. (1988) Production of interleukin 1 (IL 1) by thymic epithelial cells (TEC). Adv. Exp. Med. Biol. 237: 299-305. Coskun, S., Uzumcu, M., Jaroudi, K. et al. (1998). Presence of leukemia inhibitory factor and interleukin-12 in human follicular fluid during follicular growth. Am. J. Reprod. Immunol. 40: 13-18. Coulthard, M, Lickliter, J., Subanesan, N. et al. (2001). Characterization of the Ephal receptor tyrosine kinase: expression in epithelial tissues. Growth Factors, 18: 303-317. Cox, G., Burger, J., Lip, V. et. al. (2002). Intracytoplasmic sperm injection may increase the risk of imprinting defects. Am. J. Hum. Genet. 71: 162-164. Cram, D., Ma, K., Bhasin, S. et. al. (2000). Y chromosome analysis of infertile men and their sons conceived through intracytoplasmic sperm injection: vertical transmission of deletions and rarity of de novo deletions. Fertil. Steril. 74: 909-915. Daly DC, Maier D, Soto-Albors C, Hysteroscopic metroplasty: six years experience, Obstet Gynecol 73:201, 1989. Damario, M., Lesnick, T.. Lessey, B. et. al. (2001). Endometrial markers of uterine receptivity utilizing the donor oocyte model. Hum. Reprod. 16: 1893-1899. Danesh J, Whincup P, Walker M, Lennon L, Thomson A, Appleby P, Daniel, T., Stein, E., Cerretti, D.. et al. (1996) ELK and LERK-2 in developing kidney and microvascular endothelial assembly. Kidney Int. Suppl. 57: S73-S81. Dantes TK, Yao Z, Sorokina K, Kotsuji F, Seger R, Amsterdam A, Down regulation of steroidogenic response to gonadotropins in human and n preovulatory granulosa cells involves mitogenactivated protein kinase acti vation and modulation of DAX-1 and steroidogenic factor-1, J Cli Endocrinol Metab 88:2288, 2003. Davy, A., Gale, N. W., Murray, E. et al. (1999) Compartmentalized signaling by GPI-anchored ephrin-A5 requires Fyn tyrosine kinase to regulate cellular adhesion. Genes Dev. 13:3125-3135. De Geyter C, De Geyter M, Huber PR, Nieschlag E, Holzgreve W, Progesterone serum levels during the follicular phase of the menstrual cycle orginate from the crosstalk between the ovaries and the adrenal cortex, Hum Reprod 17:933, 2002. De Gooyer ME, Deckers GH, Schoonen WGEJ, Verheul HAM, Kloosterboer HJ, Receptor profiling and endocrine interactions of tibolone, Steroids 68:21, 2003. De Hondt, A., Peeraer, K., Meuleman, C. et al (2005) Endometriosis and subfertility treatment: a review. Minerva Ginecologica 57(3), 257-267. De Neubourg, D., Mangelschots, K., Van Royen, E. et. al. (2002). Impact of patients' choice for single embryo transfer of a top quality embryo versus double transfer in the first IVF/ICSI cycle.

Literatura

391

Hum. Reprod. 17: 2621-2625. Deed, R., Rooney, P., Kumar, P., et al. (1997). Early-response gene signaling is induced by angiogenic oligosaccharides of hyaluronic acid in endothelial cells. Inhibition by non- angiogenic, high-molecular-weight hyaluronic acid. Internat. J. Cancer 71: 251-256. Dickson SE, Fraser HM, Inhibition of early luteal angiogenesis b\ gonadotropin-releasing hormone antagonist treatment in the primate, J Clin Endocrinol Metab 85:2339, 2000. Dorling AA, Todman MG, Korach KS, Herbison AE, Critical role for estrogen receptor alpha in negative feedback regulation-of gonadotropin-releasing hormone mRNA expression in the female mouse, Neuroendocrinology 78:204, 2003. Downs, S. (2001) A gap-junction-mediated signal, rather than an external paracrine factor, predominates during meiotic induction in isolated mouse oocytes. Zygote 9: 71-82. Duffy DM, Chaffin CL, Stouffer RL, Expression of estrogen receptor alphi and beta in the rhesus monkey corpus luteum during the menstrual cycle regulation by luteinizing hormone and progesterone, Endocrinology 141:1711,2000. Durlinger AL, Gruijters MJ, Kramer P, Karels B, Ingraham HA, Nachtigal MW, Uilenbroek JT, Grootegoed JA, Themmen AP, Anti-Miillerian hormone inhibits initiation of primordial follicle growth in the mouse ovary, Endocrinology 143:1076, 2002. Durlinger ALL, Visser JA, Themmen APN, Regulation of ovarian function: the role of antiMtillerian hormone, Reproduction 124:601, 2002. Ecochard R, Gougeon A, Side of ovulation and cycle characteristics in normally fertile women, Hum Reprod 15:752, 2000. Eichenlaub-Ritter, U. and Peschke, M. (2002). Expression in in vivo and in vitro growing anc maturing oocytes: focus on regulation of expression at the translational level. Hum. Reprod Update 8:21-41. Eisinger SH, Meldrum S, Fiscella K, le Roux HD, Guzick DS, Low-dose mifepristone for uterine leiomyomata, Obstet Gynecol 101:243, 2003. Ellis, I., Banyard, .1. and Schor, S. (1997). Differential response of fetal and adult fibroblasts to cytokincs: cell migration and hyaluronan synthesis. Development, 124: 1593-1600. Endo, T., Kitajima, Y., Nishikawa, A., et al. (2001). Cyclic changes in expression of mRNA of vascular endothelial growth factor, its receptors Fit-1 and KDR/Flk-1, and Ets-1 in human corpora lutea. Fertil. Steril 76: 762-768. Endo, T., Kitajima, Y., Nishikawa, A., et al. (2001). Cyclic changes in expression of mRNA of vascular endothelial growth factor, its receptors Fit-1 and KDR/Flk-1, and Ets-1 in human corpora lutea. Fertil. Steril 76: 762-768. Erickson GF, Shimasaki S, The role of the oocyte in folliculogenesis, Trends Endocrinol Metab 11:193, 2000. Erickson GF, Shimasaki S, The role of the oocyte in folliculogenesis Fabbri, R., Porcu. E., Marsella, T. et. al. (2001). Human oocyte cryopreservation: new perspectives regarding oocyte survival. Hum. Reprod. 16: 411-416. Fauconnier A, Chapron C, Babaki-Fard K, Dubuisson J-B, Recurrence of leiomyomata after myomectomy, Hum Reprod Update 6:595, 2000. Feng, G., Laskowski, M. B., Feldheim, D, et al. (2000). Role of ephrins in positionally selective synaptogenesis between motor neurons and muscle fibers. Neuron 25: 295-306. Filicori M, Cognigni GE, Ciampaglia W, Effects of LH on oocyte yield and developmental competence, Hum Reprod 18:1357, 2003. Filicori M, Cognigni GE, Tabarelli C, Pocognoli P, Taraborrelli S, SpettoL D, Ciampaglia W, Stimulation and growth of antral ovarian follicles by selective LH activity administration in women, J Clin Endocrinol Metab 87:1156, 2002. Filicori, M., Cognini, G., Tabrelli, C. et. al. (2002). Stimulation and growth of antral follicles by selective luteinizing hormone administration in women. J. Clin. Endocrinol. Metab. 87: 1156-1161.

392


Fowkes, R., Chandras, C, Chin, E., et al. (2001). Relationship between the production of prostaglandins and progesterone by luteinizing human granulosa cells. J. Endocr. 171: 455- 462. Frattarelli JL, Lauria-Costab DF, Miller BT, Bergh PA, Scott RT, Basal antral follicle number and mean ovarian diameter predict cycle cancellation and ovarian responsiveness in assisted reproductive technology cycles, Fertil Steril 74:512, 2000. Freeman, S., Yang, Q. and Allran, K. (2000). Women with a reduced ovarian complement may have an increased risk for a child with Down syndrome. Am. J. Hum. Genet. 66: 1680-1683. Gentili, M, Obermuller, N., Schleich, H. (2001). Distinct expression of endothelin receptor subtypes A and B in luteinized human granulosa cells. Horm. Metab. Res. 33: 573-576. Gianaroli, L., Plachot, M., van Kooij, R. et. al. (2000). ESHRE guidelines for good practice in 1VF laboratories. Hum. Reprod. 15: 2241-2246. Glasgow, I., Zeringue ,H., Beebe, D. et. al. (2001). Handling individual mammalian embryos using microfluidics. IEEE Trans. Biomed. Engin. 48:570-578. Gluzman-Poltorak, Z., Cohen, T., Herzog, Y. and Neufeld, G. (2000). Neuropilin-2 is a receptor for the vascular endothelial growth factor (VEGF) forms VEGF-145 and VEGF-165. J. Biol. Chem. 275: 18040-18045. Goodman RL, Gibson M, Skinner DC, Lehman MN, Neuroendocrine control of pulsatile GnRH secretion during the ovarian cycle: evidence from the ewe, Reprod Suppl 59:41, 2002. Graham H, Eternal Eve, The History of Gynaecology & Obstetrics, Doubleday & Company, Inc., Garden City, NY, 1951. Granot I, Dekel N, The ovarian gap junction protein connexin43: regulation by gonadotropins, Trends Endocrinol Metab 13:310, 2002. Greisen S, Ledet T, Ovesen P, Effects of androstenedione, insulin and luteinizing hormone on steroidogenesis in human granulosa luteal cells, Hum Reprod 16:2061, 2001. Grigorieva V, Chen-Mok M, Tarasova M, Mikhailov A, Use of a levonorgestrel-releasing intrauterine system to treat bleeding related to uterine leiomyomas, Fertil Steril 79:1194, 2003. Grimbizis GF, Camus M, Tarlatzis BC, Bontis JN, Devroey P, Clinical implications of uterine malformations and hysteroscopic treatment results, Hum Reprod Update 7:161, 2001. Hardy, K. and Spanos, S. (2002) Growth factor expression and function in the human and mouse preimplantation embryo. J. Endocrinol. 172: 221-236. Hardy, K., Spanos, S., Becker, D., lannelli, P. et al. (2001). From cell death to embryo arrest: Mathematical models of human preimplantation embryo development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1655-1660. Hardy, K.., Wright, C, Franks, S. and Winston, R. (2000). In vitro maturation of oocytes. Br. Me.d Bull. 56: 588-602. Harper, S.. Xing, C, Whittle, C, et al. (2001). Expression of neuropilin-1 by human glomerular epithelial cells in vitro and in vivo. Clin. Sci. (Lond) 101: 439-446. Harris, S., Smith, R. and Phipps, R. (2002). 15-deoxy-Delta 12, 14-PGJ2 induces IL-8 production in human T cells by a mitogen-activated protein kinase pathway. J. Immunol. 168: 1372-1379. Haslinger, B., Mandl-Weber, S., Sellmayer, A. and Sitter, T. (2001) Hyaluronan fragments induce the synthesis of MCP-1 and IL-8 in cultured human peritoneal mesothelial cells. Cell Tissue Res. 305: 79-86. Hawes, S., Sapienza, C. and Latham, K. (2002). Ooplasmic donation in humans - The potential forepigenic modifications. Hum. Reprod. 17: 850-852. Hazzard, T., Molskness. T, Chaffin, C. and Stouffer, R. (1999). Vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiopoietin regulation by gonadotropin and steroids in macaque granulosa cells during peri-ovulatory interval. Mol. Hum. Reprod. 5: 1115- 1121. Hewitt SC, Korach KS, Oestrogen receptor knockout mice: roles for oestrogen receptors alpha and beta in reproductive tissues. Reproduction 125:143, 2003. Hewitt SC, Korach KS, Oestrogen receptor knockout mice: roles for

Literatura

393

Hippenstiel, S., Soeth, S., Kellas, B., et al. (2000). Rho proteins and the p38-MAPK pathway are important mediators of LPS-induced interleukin-8 expression in human endothelial cells. Blood 95: 3044-3051. Hosokawa K, Ottander U, Wahlberg P, Ny T, Cajander S, Olofsson IJ. Dominant expression and distribution of oestrogen receptor beta over oestrogen receptor alpha in the human corpus luteum, Mol Hum Reprod 7:137,2001 Hosokawa K, Ottander U, Wahlberg P, Ny T, Cajander S, Olofsson IJ. Dominant expression and distribution of oestrogen receptor beta over oestrogen receptor alpha in the human corpus luteum, Mol Hum Reprod 7:137,2001 Hu, Y., Betzendahl, I., Cortvrindt, R. et al. (2001). Effects of low 0(2) and ageing on spindles and chromosomes in mouse oocytes from pre-antral follicle culture. Mol. Hum. Reprod. 16: 737-748. Huhtaniemi I, Jiang M, Nilsson C, Pettersson K, Mutations and polymorphisms in goandotrophin genes, Mol Cell Endocrinol 151:89, 1999. Hwang, J., Lin, Y. and Tsai, Y. (2000). In vitro maturation and fertilization of immature oocytes: A comparative study of fertilization techniques. J. Assist. Reprod. Genet. 17: 39-43. Inki P, Hurskainen R, Palo P, Ekholm E, Grenman S, Kivela A, Kujansuu E, Teperi J, Yliskoski M, Paavonen J, Comparison of ovarian cyst formation in women using the levonorgestrel-releasing intrauterine system vs. hysterectomy. Ultrasound Obstet Gynecol 20:381, 2002. Jewell, D.P. (2003) Endometriosis. In: Warrell, D.A., Cox, T.M., Firth, J.D. and Benz, E.J. (Eds.) Oxford textbook of medicine (volume 2). 4th edn. Oxford: Oxford University Press. Section 14.22 Kausche, A., Jones, G., Trounson A., et al., (2001.) Sex ratio and birth weights of infants born as a result of blastocyst transfers compared with early cleavage stage embryo transfers. Fertil. Steril. 76: 688-693. Kennedy, S., Bergqvist, A., Chapron, C. et al (2005) ESHRE guideline for the diagnosis and treatment of endometriosis. Human Reproduction 20(10), 2698-2704 Kezele, P., Nilsson, E. and Skinner, M. (2002). Insulin but not insulin-like growth factor-1promotes the primordial to primary follicle transition. Mol. Cell. Endocrinol. 192: 37-43. Khalaf, Y, Taylor, A. and Braude, P. (2000). Low serum estradiol concentrations after five days of controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization are associated with poor outcome. Fertil. Steril. 74: 63-66. Khalaf, Y., El-Toukhy, T., Taylo, A. et al. (2002). Increasing the gonadotrophin dose in the course of an in vitro fertilization cycle does not rectify an initial poor response. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 103: 146-149. Khan-Dawood FS, Oxytocin in intercellular communication in the corpus /Jteum, Seminars Reprod Endocrinol 15:395, 1998. Klein NA, Harper AJ, Houmard BS, Sluss PM, Soules MR, Is the short follicular phase in older women secondary to advanced or accelerated dominant follicle development?, J Clin Endocrinol Metab 87:5746, 2002. Koenig W, Markers of inflammation in women on different hormone replacement therapies, Ann Med 35:353, 2003. Koga, K., Osuga, Y., Tsutsumi, 0. et al. (2000). Evidence for the presence of angiogenin in human follicular fluid and the up-regulation of its production by human chorionic gonadotropin and hypoxia. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85: 3352-3355. Koh, S. W. (2002). Ciliary neurotrophic factor released by corneal endothelium surviving oxidative stess ex vivo. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43: 2887-2896. Kol, S., Ruutiainen-Altman, K., Scherzer, W., et al. (1999). The rat intraovarian intraovarian interleukin (IL)-l system: cellular localization, cyclic variation and hormonal regulation of Il-lbetaandoftype I and type II 11-1 receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 149: 115-128. Kuliev, A., Cieslak, J. lllkevitch, Y. and Verlinsky, Y. (2003). Y chromosomal abnormalities in

394


a series of 6733 human oocytes in preimplantation diagnosis for age-related aneuploidies. Reprod. BioMed. Online 6: 577-583 Loutradis, D., Drakakis, P. Kallianidis, K., et al. (2000). Biological factors in culture media affecting in vitro fertilization, preimplantation embryo development, and implantation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 900: 325-335. Macklon, N., Pieters, M, Hassan, M. et al. (2002). A prospective randomized comparison of sequential versus monoculture systems for in-vitro human blastocyst development. Hum. Reprod. 17: 2700-2705. Manna PR, Wang XJ, Stocco DM, Involvement of multiple transcription factors in Ihe regulation of steroidogenic acute regulatory protein gene expression. Steroids 68:1125, 2003. Martinez, F., Rienzi, L., lacobelli, M. et al. (2002). Caspase activity in preiniplantation human embryos is not associated with apoptosis. Hum. Reprod. 17: 1584-1590. Maston GA, Ruvolo M, Chorionic gonadotropin has a recent origin within primates and an evolutionary history of selection, Mol Biol Evol 19:320, 2002. Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q., et al. (2000). Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat. Cell Biol. 2: 318-325. May-Panloup P., Chretien M., Savagner F., et al.,(2003) Increased sperm mitochondrial DNA content in male infertility. Hum Reprod. 18: 550-556. Mayr-Wohlfart, U., Waltenberger, J., Hausser, H., et al. (2002). Vascular endothelial growth factor stimulates chemotactic migration of primary human osteoblasts. Bone 30: 472-477. McCartney CR, Gingrich MB, Hu Y, Evans WS, Marshall JC, Hypothalamic regulation of cyclic ovulation: evidence that the increase in gonadotropin-releasing hormone pulse frequency during the follicular phase reflects the gradual loss of the restraining effects of progesterone, J Clin Endocrinol Metab 87:2194, 2002. Mikkelsen, A. Andersson, A., Skakkebaek, N. and Lindenberg, S. (2001). Basal concentrations of oestradiol may predict the outcome of in-vitro maturation in regularly menstruating women. Hum. Reprod. 16: 862-867. Mikkelsen, A., Smith, S. and Lindenberg, S. (1999). In vitro maturation of human oocytes from regularly menstruating women may be successful without follicle stimulating hormone priming. Hum. Reprod. 14: 1847-1851. Mikkelsen, A., Smith, S. and Lindenberg, S. (2000). Impact of oestradiol and inhibin A. Hum. Reprod. 15: 1685-1690. Milki, A., Hinckle, M., Fisch, J. et. al. (2000). Comparison of blastocyst transfer with day 3 embryo transfer in similar patient populations. Fertil. Steril. 73:126-129. Minaretzis, D., Harris, D., Alper, M. et. al. (1998). Multivariate Analysis of Factors Predictive of Successful Live Births in In Vitro Fertilization (IVF) Suggests Strategies to Improve IVF Outcome. J. Assist. Reprod. Genet. 15: 365-371. Mora S, Diehl T, Stewart EA, Prolactin is an autocrine growth regulator for human myometrial and leiomyoma cells, J Soc Gynecol Invest 2:396, 1995. Motta PM, Makabe S, Nottola SA, The ultrastructure of human reproduction. I. The natural history of the female germ cell: origin, migration and differentiation inside the developing ovary, Hum Reprod Update 3:281, 1997. Munne, S, Magli, C, Adler, A. et. al. (1997). Treatment-related chromosome abnormalities in human embryos. Hum. Reprod. 12: 780-784. Munne, S. and Wells, D. (2002). Preimplantation genetic diagnosis. Cur. Opin. Obstet. Gynec.14: 239-244. Munne, S., Sandalinas, M., Escudero, T. et. al. (2002). Chromosome mosaicism in cleavagestage human embryos: evidence of a maternal age effect. Reprod. Biomed. Online 4:223-232. Nacharaju, V.. Muneyyirci-Delale, O. and Khan, N (1997). Presence of 11beta- hydroxysteroid

Literatura

395

dehydrogenase in human semen: evidence of correlation with semen characteristics. Steroids 62:311-314. Nagao, Y., Totsuka, Y., Atomi, Y. et. al. (1997). Heterogenous mitochondria DNA introduced by nuclear transfer influences the developmental ability of mouse embryos in vitro. Theriogenology 47: 233-239. Nagy, Z., Cecile, J., Liu, J., et al. (1996). Pregnancy and birth after intracytoplasmic sperm injection of in vitro matured germinal vesicle oocytes: case report. Fertil. Steril. 65: 1047-1050. Nasseri, A., Mukherjee, T., Grifo, J. et al. (1999) Elevated day 3 serum follicle stimulating hormone and/or estradiol may predict fetal aneuploidy. Fertil. Steril. 71: 715-718. Naviaux, R. and and McGowan, . (2000). Organismal effects of mitochondrial dysfunction. Hum. Reprod. 15 (Suppl. 2): 44-56. Nayak NR, Critchley HOD, Slayden OD, Menrad A, Chwalisz K, Baird DT, Brenner RM, Progesterone withdrawal up-regulates vascular endothe-lial growth factor receptor type 2 in the superficial zone of the human and macaque endometrium: potential relevance to menstruation, J Clin Endocrinol Metab 85:3442, 2000. Ng, E., Lan Lau, E., Yeung, W. and Ho, P. (2001). HMG is as good as recombinant human FSH in terms of oocyte and embryo quality: a prospective randomised trial. Hum. Reprod.16: 319-325. Niemann, H. and Wrenzycki, C. (2000). Alteration of expression of developmentally important genes in preimplantation bovine embryos by in vitro culture conditions: implications for subsequent development. Theriogenology 53: 21-34. Nikolettos, A., Al-Hasani, S., Felberbaum, R. et. al. (2000). Comparison of cryopreservation outcome with human pronuclear stage oocytes obtained by the GnRH antagonist, cetrorelix, and GnRH agonists. Eur. J. Obstet Gynecol. Reprod. Biol. 93: 91-95. Nilsson, E., Kezele, P. and Skinner, M. (2002) Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol. Cell. Endocrinol. 188, 65-73. Nilsson, S., Haylock, D. Johnston, H., et al. (2003). Hyaluronan is synthesized by primitive hemopoietic cells, participates in their lodgment at the endosteum following transplantation,and is involved in the regulation of their proliferation and differentiation. Blood 101: 856-862. Nilsson, S., Haylock, D. Johnston, H., et al. (2003). Hyaluronan is synthesized by primitive hemopoietic cells, participates in their lodgment at the endosteum following transplantation,and is involved in the regulation of their proliferation and differentiation. Blood 101: 856-862 Noci, I., Maggi, M., Fuzzi, B., et al. (2000). Effects of low day 3 luteinizing hormone levels on in vitro fertilization treatment outcome. Gyn. Endocr. 14: 321-326. Norwitz ER, Xu S, Jeong KH, Bedecarrats GY, Winebrenner LD, Chin WW, Kaiser UB, Activin A augments GnRH-mediated transcriptional activ-itation of the mouse GnRH receptor gene, Endocrinology 143:985, 2002. Oktay K, Newton H, Mullan J, Gosden RG, Development of human primordial follicles to antral stages in SCID/hpg mice stimulated with follicle stimulating hormone, Hum Reprod 13:1133, 1998. Oktay, K. and Yih, M. (2002). Preliminary experience with orthotopic and heterotopic transplantation of ovarian cortical strips. Semin. Repro. Med. 20: 63-74. Oktay, K. and Karlikaya, G. (2000). Ovarian function after transplantation of frozen, banked autologous tissue. N. Eng. J. Med. 342:1919. Oktay, K., Economos, K., Kan, M. et al (2002). Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. JAMA 286: 1490-1493. Olive, D.L. (2004) Optimizing gonadotropin-releasing hormone agonist therapy in women with endometriosis. Treatments in Endocrinology 3(2), 83-89. O'Loughlin, E., Pang, G., Noltorp, R., et al. (2001). Interleukin-2 modulates ion and cell proliferation in cultured human small intestinal enterocytes. Gut 49: 636-643. O'Loughlin, E., Pang, G., Noltorp, R., et al. (2001). Interleukin-2 modulates ion and cell prolif-

396


eration in cultured human small intestinal enterocytes. Gut 49: 636-643. Omodei U, Ferrazzia E, Ruggeri C, Palai N, Fallo L, Dordoni D, Peruginoa G, Endometrial thickness and histological abnormalities in women on hormonal replacement therapy: a transvaginal ultrasound/hystero-scopic study, Ultrasound Obstet Gynecol 15:317, 2000. O'Shaughnessy PJ, Fleming LM, Jackson G, Hochgeschwender U, Reed P, Baker PJ, Adrenocorticotropic hormone directly stimulates testosterone production by the fetal and neonatal mouse testis, Endocrinology 144:3279, 2003. Osterlund MK, Gustafsson J-A, Keller E, Hurd YL, Estrogen receptor B (ER6) messenger ribonucleic acid (mRNA) expression within the human forebrain: distinct distribution pattern to ERa mRNA, J Clin Endocrinol Metab 85:3840. 2000. Pall M, Friden BE, Brannstrom M, Induction of delayed follicular rupture in the human by the selective COX-2 inhibitor rofecoxib: a randomized double-blind study, Hum Reprod 16:1323, 2001. Palmert MR, Hayden DL, Mansfield MJ, Crigler JF, Jr., Crowley \V1 Jr., Chandler DW, Boepple PA, The longitudinal study of adrenal mature tion during gonadal suppression: evidence that adrenarche is a gradu^ process, J Clin Endocrinol Metab 86:4536, 2001. Palomba S, Orio F, Jr., Morelli M, Russo T, Pellicano M, Nappi C, Mastrantonio P, Lombardi G, Colao A, Zullo F, Raloxifene administration in women treated with gonadotropin-releasing hormone agonist for uterine leiomyomas: effects on bone metabolism, J Clin Endocrinol Metab 87:4476, 2002. Palomba S, Orio F, Jr., Morelli M, Russo T, Pellicano M, Zupi E, Lombardi G, Nappi C, Panici PL, Zullo F, Raloxifene administration in premenopausal women with uterine leiomyomas: a pilot study, J Clin Endocrinol Metab 87:3603, 2002. Palomba S, Russo T, Orio F, Jr., Tauchmanova L, Zupi E, Panici PLB, Nappi C, Colao A, Lombardi G, Zullo F, Effectiveness of combined GnRH analogue plus raloxifene administration in the treatment of uterine leiomyomas: a prospective, randomized, single-blind, placebo-controlled clinical trial, Hum Reprod 17:3213, 2002. PanY,Anthony M, Clarkson TB, Effect of estradiol and soy phytoestrogens on choline acetyltransferase and nerve growth factor mRNAs in the frontal cortex and hippocampus of female rats, Proc Soc Exp Biol Med 221:118, 1999. Pasquino AM, Passed F, Pucarelli I, Segni M, Municchi G, Spontaneous pubertal development in Turner's syndrome. Italian Study Group foi Turner's Syndrome, J Clin Endocrinol Metab 82:1810, 1997. Penotti M, Fabio E, Modena AB, Rinaldi M, Omodei U, Vigano P, Effect of soy-derived isoflavones on hot flushes, endometrial thickness, and the pulsatility index of the uterine and cerebral arteries, Fertil Steril 79:1112. 2003. Pernasetti F, Vasilyev VV, Rosenberg SB, Bailey JS, Huang HJ, Miller WL, Mellon PL, Cellspecific transcriptional regulation of follicle-stimulating hormone-beta by activin and gonadotropin-releasing hormone in the LbetaT2 pituitary gonadotrope cell model, Endocrinology 142:2284, 2001. Piccinni, M., Scaletti, C, Mavilia, C, et al. (2001). Production of IL-4 and leukemia inhibitory factor by T cells of the cumulus oophorus: a favorable microenvironment pre-implantation embryo development. Eur. J. Immunol. 31: 2431-2437. Pickar JH, Yeh IT, Wheeler JE, Cunnane MF, Speroff L, Endometrial effects of lower doses of conjugated equine estrogens and medroxy-progesterone acetate: two-year substudy results, Fertil Steril 80:1234, 2003. Pritts EA, Fibroids and infertility: a systematic review of the evidence, Obstet Gynecol Survey 56:483, 2001. Pron G, Bennett J, Common A, Wall J, Asch M, Sniderman K, for the Ontario Uterine Fibroid Embolization Collaborative Group, The Ontario Uterine Fibroid Embolization Trial. Part 2. Uterine

Literatura

397

fibroid reduction and symptom relief after uterine artery embolization for fibroids, Fertil Steril 79:120,2003. Raga F, Bauset C, Remohi J, Bonilla-Musoles F, Simon C, Pellicer A, Reproductive impact of congenital Mullerian anomalies, Hum Reprod 12:2277, 1997. Raga F, Casafl EM, Wen Y, Huang H-Y, Bonilla-Musoles F, Plan ML, Independent regulation of matrix metalloproteinase-9, tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1), and TIMP-3 in human endoraetrial stromal cells by gonadotropin-releasing hormone: implications in early human implantation, J Clin Endocrinol Metab 84:636, 1999. Raga F, Casan EM, Druessel JS,Wen Y, Huang HY, Nezhat C, Polan ML, Quantitative gonadotropin-releasing hormone gene expression and immunohistochemical localization in human endometrium throughout the menstrual cycle, Biol Reprod 59:661, 1998. Rossi G, Diamond MP, Myomas, reproductive function, and pregnancy, Seminars Reprod Endocrinol 10:332, 1992. Salmassi, A., Lu, S., Hedderich, J., et al. (2001). Interaction of interleukin-6 on huma-granulosa cell steroid secretion. J. Endocr. 170: 471-478. Scarman, van Daal, A., Kelly, G. and Timms, P. (2002) DNA-based diagnosis of Chlamydia pneumoniae - the significance of sample type and preparation. J Clinical Microbiology (submitted) Scarman, van Daal, A., Kelly, G. and Timms, P. (2003) DNA-based diagnosis of Chlamydia pneumoniae - the significance of sample type and preparation. (in preparation) Schairer C, Adami H-O, Hoover R, Persson I, Cause-specific mortality in women receiving hormone replacement therapy, Epidemiology 8:59, 1997. Schieve, L., Meikle, S., Ferre, C. et. al. (2002). Low and very low birth weight in infants conceived with the use of assisted reproductive technology. N. Engl. J. Med. 346: 731-737. Schipper I, de Jong FH, Fauser BC JM, Lack of correlation between maximum early follicular phase serum follicle stimulating hormone concentrations and menstrual cycle characteristics in women under the age of 35 years, Hum Reprod 13:1442, 1998. Schipper I, Hop WCJ, Fauser BCJM, The follicle-stimulating hormone (FSH) threshold/window concept examined by different interventions with exogenous FSH during the foilicular phase of the normal menstrual cycle: duration, rather than magnitude, of FSH increase affects follicle development, JClin Endocrinol Metab 83:1292, 1998. Schlaff, W.D., Carson, S.A., Luciano, A. et al (2006) Subcutaneous injection of depot medroxyprogesterone acetate compared with leuprolide acetate in the treatment of endometriosis-associated pain. Fertility and Sterility 85(2), 314-325. Schoolcraft, W. and Gardner, D. (2001). Blastocyst versus day 2 or 3 transfer. Seminars in Reprod. Med. 19: 259-268. Schwartz M. and Vissing J. (2002) Paternal inheritance of mitochondrial DNA. N. Eng. J. Med. 347:576-579. Sealfon SC, Weinstein H, Millar RP, Molecular mechanisms of ligand interaction with the gonadotropin-releasing hormone receptor, Endocr Rev 18:180, 1997. Sebastian S, Bulun SE, A highly complex organization of the regulatory region of the human CYP19 (aromatasc) gene revealed by the human genome project, J Clin Endocrinol Metab 86:4600, 2001. Seifer D., DeJesus V., and Hubbard, K. (2002). Mitochondrial deletions in luteinized granulosa cells as a function of age in women undergoing in vitro fertilization. Fertil. Steril. 78:1046-1048 Senn, A., Vozzi, C. and Chanson, A. (2000). Prospective randomised study of two cryopreservation policies avoiding embryo selection: the pronucleate stage leads to higher cumulative delivery rate than the early cleavage stage. Fertil. Steril. 74: 946-952. Shibanuma K, Tong Z-B, Vanderhoof VH, Vanevski K, Nelson LM, Investigation of KIT gene mutations in women with 46,XX spontaneous premature ovarian failure, BMC Women s Health 2:8, 2002.

398


Shiloh, H. and Dirnfeld, M. (2001). Study of zona pellucida thickness of embryos before their transfer and relation to age and follicle-stimulating hormone. Reprod. Tech. 10: 307-310. Shoubridge, E. (2000). Mitochondrial segregation in the developing embryo. Hum. Reprod. 15 (Suppl. 2): 229-234. Silvestri A, Gebara O, Vitale C, Wajngarten M, Leonardo F, Ramieres JA, Fini M, Mercucro G, Rosano GM, Increased levels of C-reactive protein after oral hormone replacement therapy may not be related to an increased inflammatory response, Circulation 107:3165, 2003. Sinclair, K., Young, L., Wilmut, I. and McEvoy, T. (2000). In-utero overgrowth in ruminants following embryo culture: lessons from mice and a warning to men. Hum. Reprod. 15 (Suppl. 5): 68-86. Smith TP, Suliman AM, Fahie-Wilson MN, McKenna TJ, Gross variability in the detection of prolactin in sera containing big big prolactin (macroprolactin) by commercial immunoassays, J Clin Endocrinol Metab 87:5410, 2002. Smith, M., Mathur, R., Keay, S., Hall, L., et al. (2000) Periovulatory human oocytes, cumulus cells, and ovarian leukocytes express type 1 but not type 2 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase RNA. Fertil. Steril. 73: 825-830. Smith, S., Mikkelsen, A. and Lindenberg, S. (2000). Development of human oocytes matured in vitro for 28 or 36 hours. Fertil. Steril. 73: 541-544. Strehler, E., Abt, M., El-Danasouri, I. et. al. (2001). Impact of recombinant follicle-stimulating hormone and human mcnopausal gonadotropins on in vitro fertilization outcome. Fertil. Steril. 75: 332-336. Su, Y.. and Eppig, J. (2002). Evidence that multifunctional calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaM KII) participates in the meiotic maturation of mouse oocytes. Mol. Reprod. Dev. 61:560-569 Suh, C, Jee, B., Choi, Y. et al. (2002). Prognostic implication of apoptosis in human luteinized granulosa cells during IVF-ET. J. Assist. Reprod. Genet 19: 209-214. Suikkari, A., Tulppala, M., Tuuri, T., et al. (2000). Luteal phase start of low-dose FSH priming of follicles results in an efficient recovery, maturation and fertilization of immature human oocytes. Hum. Reprod. 15: 747-751. Sullivan MW, Stewart-Akers A, Krasnow JS, Berga SL, Zeleznik AJ. Ovarian responses in women to recombinant follicle-stimulating hormon and luteinizing hormone (LH): a role for LH in the final stages of follicuir maturation, J Clin Endocrinol Metab 84:228, 1999. Suzuki, H., Jeong, B. and Yang, X. (2000). Dynamic changes of cumulus-oocyte cell communication during in vitro maturation of porcine oocytes. Biol. Reprod. 63: 723-739. Sykes, D., Out, H., Palmer, S. and van Loon, J. (2001). The cost-effectiveness of IVF in the UK: a comparison of three gonadotrophin treatments. Hum. Reprod. 16: 2557-2562. Takashima, S., Kitakaze, M., Asakura, M, ct al. (2002). Targeting of both mouse neuropilin-1 and neuropilin-2 genes severly impairs developmental yolk sac and embryonic angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: 3657-3662. Takeuchi, T., Gong, J., Veeck, L. et. al. (2001). Preliminary findings in germinal vesicle transplantation of immature human oocytes. Hum. Reprod. 16: 730-736. Tamura, K.., Kawaguchi, T., Hara, T., et al. (2000). Interleukin-6 decreases estrogen production and messenger ribonucleic acid expression encoding aromatase during in vitro cytodifferentiation of rat granulosa cell. Mol. Cell Endocrinol. 170:103-111. Tan, S., Child, T. and Gulekli, B. (2002). In vitro maturation and fertilization of oocytes from unstimulated ovaries: predicting the number of immature oocytes retrieved by early follicular phase ultrasonography. Am. J. Obstet. Gynecol. 186: 684-689. Tanenbaum DM, Wang Y, Williams SP, Sigler PB, Crystallographic comparison of the estrogen and progesterone receptors ligand binding domains, Proc Natl Acad Sci USA 95:5998, 1998. Tazuke SI, Giudice LC, Growth factors and cytokines in endometrium, embryonic development, and maternal.'embryonic interactions, Seminars Reprod Endocrinol 14:231, 1996.

Literatura

399

Tease, C, Hartshorne, G. and Hulten, M. (2002). Patterns of meiotic recombination in human fetal oocytes. Am. J. Hum. Genet. 70: 1469-1479. Terada ,Y., Luetjens, C, Sutovsky, P. and Schatten, G.(2000). Atypical decondensation of the sperm nucleus, delayed replication of the male genome, and sex chromosome positioning following intracytoplasmic human sperm injection (ICSI) into hamster eggs: Does ICSI itself introduce chromosomal anomalies? Fertil. Steril. 74: 454-460. Tesarik, J. (2002). Reproductive semi-cloning respecting biparental embryo origin: Embryos from syngamy between a gamete and a haploidized somatic cell. Hum. Reprod. 17: 1933-1937. Tesarik, J., Junca, A., Hazout, A. et. al. (2000). Embryos with high implantation potential after intracytoplasmic sperm injection can be recognized by a simple, non-invasive examination of pronuclear morphology. Hum. Reprod. 15: 1396-1399. Tesarik, J., Mendoza, C, Anniballo, R. and Greco, E. (2000b). In-vitro differentiation of germ cells from frozen testicular biopsy specimens. Hum. Reprod. 15: 1713-1716. The European Recombinant Human LH Study Group, Recombinant human luteinizing hormone (LH) to support recombinant human follicle-stimulating hormone (FSH)-induced follicular development in LH- and FSH-deficient anovulatory women: a dose-finding study, J Clin Endocrinol Metab 83:1507, 1998. The Women's Health Initiative Steering Committee, Effects of Thurston, L., Norgate, D., Jonas, K, et al (2002a) Endogenous ovarian modulators of ll betahydroxysteroid dehydrogenase (11betaHSD) activity correlate cortisol/cortisone ratios in human follicular fluid (hFP"). Reproduction Suppl) Abstract Series No.28: Abstract 25 Thurston, L., Norgate, D., Jonas, K.. et al. (2002b). Endogenous modulators of 11beta- hydroxysteroid dehydrogenase (11betaHSD) activity and cortisol/cortisone ratios in human follicular fluid (hFF) correlate with the outcome of in vitro fertilizsation-embryo transfer (IVF-ET). Reproduction (Suppl.) Abstract Series No.28: Abstract 26. Tiitinen, A., Halttunen, M., Harkki, P. et. al. (2001). Elective embryo transfer: the value of cryopreservation. Hum. Reprod. 16: 1140-1144 Tilford, C, Kuroda-Kawaguchi, T., Skaletsky, H., et al. (2001). A physical map of the human Y chromosome. Nature 409: 943-945. Utian WH, Shoupe D, Bachmann G, Pinkerton JV, Pickar JH, Relief of vasomotor symptoms and vaginal atrophy with lower doses of conjugated equine estrogens and medroxyprogesterone acetate, Fertil Steril 75:1065, 2001. Van Blerkom, J., Davis, P. and Alexander, S. (2000). Differential mitochondrial distribution in human pronuclear embryos leads to disproportionate inheritance between blastomeres: relationship to microtubular organization, ATP content and competence. Hum. Reprod. 15: 2621-2633. Van Blerkom, J., Davi, P., Mathwig, V. et al. (2002). Domains of high-polarized and low-polarized mitochondria may occur in mouse and human oocytes and early embryos. Hum. Reprod. 17:393-406. Van Blerkom, J., Davis, P. and Alexander, S. (2000). Differential mitochondrial inheritance between blastomeres in cleavage stage human embryos: Determination at the pronuclear stage and relationship to microtubular organization, ATP content and developmental competence. Hum. Reprod. 15: 2621-2633. Van Blerkom, J., Davis, P. and Alexander, S. (2001). A microscopic and biochemical study of fragmentation in stage-appropriate human embryos. Hum. Reprod. 16: 719-729. Van den Bosch T, Van Schoubroeck D, Ameye L, De Brabanter J, Van Huffel S, Timmerman D, Ultrasound assessment of endometrial thickness and endometrial polyps in women on hormonal replacement therapy, Am J Obstet Gynecol 188:1249, 2003. Van Golde, R., Wetzels, A., de Graaf, R., et al. (2001). Decreased fertilization rate and embryo quality after 1CSI in oligozoospermic men with microdeletions in the azoospermia factor c region

400


of the Y chromosome. Hum. Reprod 16: 289-292. van Montfrans, J., Lambalk, C, van Hooff, M. et al. (2001). Are elevated FSH concentrations in the pre-conceptional period a risk factor for Down's syndrome pregnancies? Mol. Hum. Reprod, 16: 1270-1273. van Zonneveld P, Scheffer GJ, Broekmans FJ, Blankenstein MA, de Jong FH, Looman CW, Habbema JD, te Velde ER, Do cycle disturbances explain the age-related decline of female fertility? Cycle characteristics of women aged over 40 years compared with a reference population of young women, Hum Reprod 18:495. 2003. Varila E, Wahlstrom T, Rauramo I, A 5-year follow-up study on the use of a levonorgestrel intrauterine system in women receiving hormone replacement therapy, Fertil Steril 76:969, 2001. Verlinsly, Y. and Kuliev, A. (2000). Atlas of Preimplantation Genetic Diagnosis. Parthenon, N.Y. London, pp. 174. Vidaeff, A. and Racowsky, C. (2000). Blastocyst transfer in human in vitro fertilization. A solution to the multiple pregnancy epidemic. J. Reprod. Med. 45: 529-540. Vigano, P., Fusi, P., Gaffuri, B., et al. (1998). Soluble intercellular adhesion molecule-1 in ovarian follicles: production by granulosa luteal cells and levels in the follicular fluid. Fertil. Steril. 69: 774-779. Vitt, U , Nayudu P., Rose U, and Kloosterboeeer, H. (2001). Embryonic development after follicle culture is influenced by follicle stimulating hormone isoelectric point range. Biol Reprod 65:1542-1547. Viville B, Charnock-Jones DS, Sharkey AM, Wetzka B, Smith SK, Distribution of the A and B forms of the progesterone receptor messenger ribonucleic acid and protein in uterine leiomyomata and adjacent myometrium, Hum Reprod 12:815, 1997. Wang, W., Meng, L., Hackett, R. ct. al. (2002). Rigorous thermal control during intracytoplasmic sperm injection stabilizes the meiotic spindle and improves fertilization and pregnancy rates. Fertil. Steril. 77: 1274-1277. Wang, X., Chen, H., Yin, H. et al. (2002). Fertility after intact ovary transplantation. Nature 415: 385. Welt CK, Martin KM, Taylor AE, Lambert-Messerlian GM, Crowley WF, Jr., Smith JA, Schoenfeld DA, Hall JE, Frequency modulation of follicle-stimulating hormone (FSH) during the luteal-follicular transition: evidence for FSH control of inhibin B in normal women, J Clin Endocrinol Metab 82:2645, 1997. Welt CK, McNicholl DJ, Taylor AE, Hall JE, Female reproductive aging is marked by decreased secretion of dimeric inhibin, J Clin Endocrinol Metab 84:105, 1999. Welt CK, Pagan YL, Smith PC, Rado KB, Hall JE, Control of follicle-stimulating hormone by estradiol and the inhibins: critical role of estradiol at the hypothalamus during the luteal-follicular transition, J Clin Endocrinol Metab 88:1766, 2003. White RB, Eisen JA, Kasten TL, Fernald RD, Second gene for gonadotropin-releasing hormone in humans, Proc NatlAcadSci USA 95:305, 1998. WHO (2004) Low-dose combined oral contraceptives (COCs). Medical eligibility criteria for contraceptive use. World Health Organization. http://www.who.int/ [Accessed: 20/09/2006]. Woelfer B, Salim R, Banerjee S, Elson J, Regan L, Jurkovic D, Reproductive outcomes in women with congenital uterine anomalies detected by three-dimensional ultrasound screening, Obstet Gynecol 98:1099,2001. Wu, J., Zhang, L. and Wang, X. (2001). In vitro maturation, fertilization and embryo development after ultrarapid freezing of immature human oocytes. Reprod. 121: 389-393. Wulff C, Wilson H, Largue P, Duncan WC, Armstrong DG, Fraser H Angiogenesis in the human corpus luteum: localization and change> -angiopoiedns, tie-2, and vascualr endothelial growth factor messer.p ribonucleic acid, J Clin Endocrinol Metab 85:4302, 2000. Wulff C, Wilson H, Wiegand SJ, Rudge JS, Fraser HM, Prevention thecal angiogenesis, antral

Literatura

401

follicular growth, and ovulation in the primate -treatment with vascular endothelial growth factor Trap R1R2, Endocrinolog 143:2797, 2002. Wylie C, Germ cells, Cell 96:165, 1999. Yang M, Lei ZM, Rao C, The central role of human chorionic gonadotropir in the formation of human placental syncytium, Endocrinology 144:1108 2003. Yang M, Lei ZM, Rao C, The central role of human chorionic gonadotropir in the formation of human placental syncytium, Endocrinology 144:1108 2003. Yap, C., Furness, S. and Farquhar, C. (2004) Pre and post operative medical therapy for endometriosis surgery (Cochrane review). The Cochrane Library. Issue 3. Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd. www.nelh.nhs.uk/cochrane.asp [Accessed: 13/03/2006 Young KA, Chaffin CL, Molskness TA, Stouffer RL, Controlled ovulation of the dominant follicle: a critical role for LH in the late follicular phase the menstrual cycle, Hum Reprod 18:2257, 2003. Yuan, L., Liu, J.., Hoja, M. et al. (2002). Female germ cell aneuploidy and embryo death of mice lacking the meiosis-specific protein SCP3. Science 296: 1115-1118. Yuasa, H., Takakura, N., Shimomura, T., et al. (2002). Analysis of human TIE2 function on hematopoietic stem cells in umbilical cord blood. Biochem. Biophys. Res. Commun. 298:731-737. Zacharias L, Wurtman RJ, Blindness: its relation to age of menarche. Science 144:1154, 1964. Zacharias L, Wurtman RJ, Blindness: its relation to age of menarche. Science 144:1154, 1964. Zaneveld LJD, Polakoski KL, Williams WL, Properties of a proteolytic enzyme from rabbit sperm acrosomes, Biol Reprod 6:30, 1972. Zaneveld LJD, Polakoski KL, Williams WL, Properties of a proteolytic enzyme from rabbit sperm acrosomes, Biol Reprod 6:30, 1972. Zarifian T, Olivares A, Soderlund D, Mendez JP, Ulloa-Aguirre A,Changes in the biologicakimmunological ratio of basal and GnRH-releasable FSH during the follicular, pre-ovulatory and luteal phases of the human menstrual cycle, Hum Reprod 16:1611, 2001. Zarifian T, Olivares A, Soderlund D, Mendez JP, Ulloa-Aguirre A,Changes in the biologicakimmunological ratio of basal and GnRH-releasable FSH during the follicular, pre-ovulatory and luteal phases of the human menstrual cycle, Hum Reprod 16:1611, 2001. Zawin M, McCarthy S, Scoutt LM, Comite F, High-field MRI and US evaluation of the pelvis in women with leiomyomas, Mag Reson Imaging 8:371, 1990. Zawin M, McCarthy S, Scoutt LM, Comite F, High-field MRI and US evaluation of the pelvis in women with leiomyomas, Mag Reson Imaging 8:371, 1990. Zeeman GG, Khan-Dawood FS, Davvood MY, Oxytocin and its receptor in pregnancy and parturition: current concepts and clinical implications, Obstet Gynecol 89:873, 1997. Zeeman GG, Khan-Dawood FS, Davvood MY, Oxytocin and its receptor in pregnancy and parturition: current concepts and clinical implications, Obstet Gynecol 89:873, 1997. Zeitzer JM, Daniels JE, Duffy JF, Klerman EB, Shanahan TL, Dijk DJ. Czeisler CA, Do plasma melatonin concentrations decline with age?, Am J Med 107:432, 1999. Zeitzer JM, Daniels JE, Duffy JF, Klerman EB, Shanahan TL, Dijk DJ. Czeisler CA, Do plasma melatonin concentrations decline with age?, Am J Med 107:432, 1999. Zhang J, Salamonsen LA, tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP)-l, -2, and -3 in human endometrium during the menstrual cycle, Mol Hum Reprod 3:735, 1999.

402

INDEX

A Adultne stem }elije, 377, 378 AIH - artificial insemination by husband, 356 alelomorfa, 243 Alternativne metode le~enja, 100, 173 AMH - anti-Mullerian hormone, 295, 304 Analiza ejakulata, 162 aneuploidnost, 31,32,186,188,189,190, 192,193,194,208,209,221,233,246,256, 275,276,288,289,291,292,296,299,301, 301, 302, 303,304,305,306, Angelman-ovog sindroma, 4,75, 222, 223 Anomalije kariotipa prenatalne dijagnoze, 245 APC - anaphase promoting complex, 297, 299 apoptoze oocita, 303 ARDS - acute respiratory distress syndrome, 326 Arteficijalna inseminacija, 213, 214 Asistirani hatching, 204 Asistirani hatching laserom, 204 ATP - adenosine triphosphate, 49, 50, 51, 189, 295, 300 Autoreinfuzije aspirisane te~nosti, 325 AZF - azoospermia factors, 220, 236, 237 AZFc-azoospermia factors, 237, 240, 241

B balansirane translokacije, 245, 246, 335 birefrigence, 373 Body mass index, 113, 181, 307, 308 BWS - Beckwith Wiedemann syndrome, 74, 75, 222, 223

C CBAVD - congenital bilateral absence of the vas deferens, 217, 218, 220 CBG - corticosteroid binding globulin, 250, 261, 262

Centrozoma spermatozoida, 165 CFTR – cystis fibrosis transmembrane conductance regulator gen, 220 checkpoint control, 297, 299 Citokini, 40, 87, 88, 101, 113 CK – kreatin kinaze, 189, 195 CL - corpus luteum, 42, 54, 55, 56, 79, 80, 178, 180, 211, 254, 259, 260, 327 Coasting – tehnika, 327 COS - kontrolisana stimulacija ovarijuma, 180, 181 Cryoloop, 285, 286 CSF - cytostatic factor, 298, 299 CVS - chorionic villus sampling, 208, 221

D DAZ - deleted in azoospermia homolog gen, 236, 237, 239, 240, 241, 242, 248 DAZ - deleted in azoospermia homolog genski cluster, 236 DBY - dead box Y chromosome gen, 237, 238, 242 delecija, 217, 236, 237, 242, 243, 245, 248, 333, 340 DMAP - 6-dimetilaminopurina, 38, 228 DMSO – dimethyl sulfoxide, 281, 283 Donacija gameta i embriona, 313, 314,382 Down-ov sindrom, 207, 292, 333, 339

E E mi1, 299 EBM - evidenciono bazirana medicina, 167 EBSS - Earle's balanced salt solution, 368 EDTA- ethylenediaminetetraacetic acid, 190 EG - ethylene glycol, 283, 284 EGF - epidermal growth factor, 86, 87, 88, 229, 230, 231, 253, 368 EIM - european IVF- monitoring programe, 355

403

Index

ejakulirani spermatozoidi, 217 ekspresije i raspodele genskih produkata, 301 Ekstra-peritonealna insuflacija gasa, 158 Ektopi~na trudno}a, 317 Elektivna redukcija fetusa, 331, 352 Elektrokauterizacija ili laser vaporizacija jednog ili oba ovarijuma, 328 embrionski markeri implantacije, 250 Embriotransfer, 186, 208, 210, 211, 280, 317, 345, 354, 356 equilibrium freezing, 277 eSET elective single embryo transfer, 354 Estradiol, 35, 41, 55, 57, 58, 60, 79, 83, 118, 121, 126, 183,184, 186, 207, 214 EUFA- early unilateral folicular aspiration, 327 evolucije X homologih gena Y hromozoma, 243 evolucije X i Y hromozoma, 239, 242, 244 evolucioni mehanizam degeneracije Y hromozoma, 243

F Faktori rasta, 39,40, 49, 53, 86, 87, 88, 229, 251, 300, 368 FbM - filled by mass tehnika, 181 Fertilizacija, 57, 177,178, 188, 197, 252, 254, 267, 276, 318 Fetus, 35, 69, 77, 106,107,110, 118, 119, 128,147,187,289, 300, 302, 331, 352, 376 FF - follicle fluid, 259 FF - MAS - follicular fluid meiosis activating sterol, 231, 232, 301 FI - flow index, 152, 260 FISH - fluorescence in situ hybridization, 31, 32, 33, 191, 192, 195, 207, 296 fizikalne metode le~enja, 173 Flexipet-denuding pipette, 285 Flow index, 309, 310 FNA - fine needle aspiration, 219 folikularni markeri implantacije, 250,251 follicle dysfunction, 311 FOXL2 - forkhead transcription factore gene, 304 fragmentacija, 53, 166, 198, 199, 200, 201, 259, 286 fresh embrio transfer, 280 FSH - follicle stimulating hormone, 35,37,47, 48, 51, 54, 55, 57, 58, 116,117, 121,124, 126,136,137,138,140,142,143, 144, 153,171,178,179,180,181,182,186, 205,207,214,228,228, 230, 231,251, 252,

254, 255, 301, 302, 303, 304, 307, 309, 310, 311, 319, 328

G Gasna embolija, 156, 159 GDF-9 - growth differentiation factor 9, 304 gene chip tehnology, 304 GM-CSF – granulocyte macrophage colony stimulating factor, 260 GnRH agonisti, 124, 125, 179, 180, 184, 186, 211, 303, 327 GnRH antagonisti, 100, 180, 186 Gradijentna separacija, 192, 193 GTP - guanosine triphosphate, 295 gustinski gradijent, 189, 190, 191 GVBD - germinal vesicle breakdown, 37, 38, 39, 118, 226, 228, 232, 294

H HA – hyaluronic acid, 189, 193, 194, 195 HAES - hydroxyethyl starch rastvor, 325 HB-EGF - heparin binding epidermal growth factor, 87, 368 HCG Humani horionski gonadotropin, 34, 56,87,118,127,179,180,184,186,187,211, 214,215,228,229,230,231,233,251,252, 253,255,259,265,267,306,318,319,320, 323,327,328, HEPA-high efficiency particulate air filtraciju, 362, 363 hESC - human embryonic stem cell, 378, 379, 380, 381 heterotopi~ne autotransplantacije, 282 hialuronat, 367, 368 Hidrosalpinks, 329, 330 high response, 307 Hirur{ki pristup OHSS, 326 Histerosalpingogram, 329 Histeroskopija, 161 HMG- humani menopauzalni gonadotropin, 179, 180, 214, 255, 302 HOS- hypoosmotic swelling test, 275 HPLC - high performance liquid chromatography, 181 HSET - kinesin related protein, 295 HSP70 - heat shock protein, 303 HspA2 - heat shock 70kDa protein 2, 188, 190 Humani X hromozom, 234 Humani Y hromozom, 235, 243

404


I ICSI - intra citoplasmatic sperm injection, 34,50,75,131,188,194,195,196,197,207, 209,210,213,216,217,218,219,220,221, 222,223,224,225,228,229,234,235,238, 244,246,247,249,255,256,272,274,275, 276,278,282,287,342,345,347,350,351, 352,353,354,355,361 Identifikacija oocita, 187 IGF - insulin like growth factor, 253 IL - interleucin, 260 IMC - inseminating motile count, 213 In vitro fertilizacija, 177, 188, 318 Index vaskularizacije, 309 Inhibin, 54, 138, 182, 253, 254, 300, 302, 307, 309 Integrin, 52, 82, 88, 185 Interleukini, 261 Inverziona petlja, 336 IUI - intrauterina inseminacija, 213,214,215 IVF laboratorija, 359 IVM - in vitro maturation, 226, 227, 228, 229, 230, 232, 233, 278, 281

K Kariotip ~oveka, 332, 333, 334, 335 kateteri za embrio transfer, 210 Klasifikacija blastociste, 201 Klinefelter-ov sindrom, 135, 141, 142, 209, 245, 290, 333, 334 kompetencija oocita, 186 Konvencionalna krioprezervacija oocita, 277, 278 Konvencionalna krioprezervacija humanog ovarijalnog tkiva, 277, 281 kortizol, 133, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 271 Krioprezervacija, 208, 272, 277 Krioprezervacija spermatozoida, 272 Krioprezervacija blastociste, 280 Krioprezervacija nezrelih oocita, 278 Krioprezervacija testikularnih spermatozoida, 197 Krioprotektanti, 273, 277, 283

LH -luteinizing hormone, 34,35,37,48,54, 56,57,58,79,81,82,100, 116,117,118,121, 124,126,127,136,137,138,142,143,153, 178,179,182,186,187,207,211,226,228, 230, 251, 252, 265, 267, 319, 327, 328 LIF - leukemia inhibitory factor, 185, 368, 378 Louise Joy Brown, 177, 178 LTMD - long term moderate dosis, 328 Luteal support, 178, 184, 211, 215

M MAD 2 - mitotic arrest deficiency 2 protein, 299 MAP - mitogen activated protein kinaze, 38, 295, 299 MAS - meiosis activating sterol, 231, 232 Medijastinalni emfizem, 158 Mehani~ki asistirani hatching, 204 menopauza, 27, 42, 89, 97, 179, 288, 301, 302, 304, 305, 306, 308, 311, 382 MESA - microsurgical epididymal sperm aspiration, 219, 224, 234 mikrodelecija, 237, 246, 248, 249 MISS - meiotic spindle stability protein, 295 Mitohondrija spermatozoida, 165 mitohondrije, 51, 64, 164, 200, 206, 274, 284, 293, 295, 299, 300 mitohondrijske respiracije, 299 monopolin, 298 mPBR - mitochondrial peripheral benzodiazepine receptor, 299 MPF - maturation promoting factor, 295, 297 mtDNK - mitochondrial DNK, 300 MTOC - microtubule organizing center, 294, 295

N NAD - nikotinamide adenine dinukleiotide, 265 NADP- - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, 265 nepravilne embriogeneze, 379

L

O

Laparoskopija, 99, 155, 157, 158, 171 Leptin, 51,113,114,116,117,118,119, 260

OCP - oral contraceptive pill, 182 ODI - ovarijalni dehidrogenazni inhibitor, 270

405

Index

ODS -ovarijalni dehidrogenazni stimulus, 270 OHSS - ovarian hyperstimultion syndrome, 211, 233, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328 Oncosis, 200 Open pulled straws, 285 ortotopi~ne autotransplantacije, 281, 282 Osnove eti~kog pristupa, 382 Ovarijalni stromalni protok, 309

P Parametri normalne sperme, 162 Patrick Steptoe, 14, 177 PCOS - polycystic ovarian syndrome, 94, 119, 126, 153, 228, 233, 319, 328 PCR - polymerase chain reaction, 31,207,236 PCT - postkoitalni test, 131, 132, 166 PDGF - platelet derived growth factor, 39, 40, 368 PEG -polyethylene glycol, 284 Penetrak test -cervical mucus test, 166 perifolikularni vaskularitet, 254, 255,256,259 peritoneovensko premo{}avanje, 325 Perzistencija X gena na Y genu, 244 PESA - percutaneous sperm aspiration, 219 PETG - polyethylene terephtalate glycol, 274 PGD - preimplantation genetic diagnosis, 206, 207, 208, 209, 210, 305, 353, 355, 372 PGD - AS - preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening, 209 PI - pulsatility index, 260, 288 Pinopode, 185 Pleuralna punkcija, 323, 325 Pneumotoraks, 158 POF - premature ovarian failure, 302, 303, 304, 311 Poliploidni embrion, 198 Polivinil-alkohol, 367 Polscope, 372, 373, 375 poor response, 307 primena ES - embryonic stem celija, 380 Procena ovarijalne rezerve, 307 Proces starenja, 288 Progesteron, 54,56,57,58,79,80,82,83,88, 98,118,125,126,127,180,183,184,185,186, 211,212,251,252,259,260,261,262,263, 268,271, 328 Prolaktin, 100, 128, 129, 250, 251, 253 protokola stimulacije, 178, 179, 180, 181, 183, 184, 214, 233, 308, 368

PTX3 – pentraxin related gene, 304 Punkcija ascitesa, 324 PVC - polyvinyl chloride, 274 PVP - polyvinyl pyrolidone, 196, 216, 284 PZD - partial zona dissectio, 188

R Razvojni arest embriona, 200 RBB - retinoblastoma binding gen, 241 RBM - RNK binding motif gen, 237, 241 RBMX - RNK binding motif X chromosome gen, 243 RBMY - RNK binding motif Y chromosome gen, 243 remodeliranje membrane, 189 retransplantacije tumorskih }elija, 287 rFSH - rekombinantni FSH, 186, 227, 228, 255, 309, 320 RI - resistance index, 260 Robert Edwards, 14, 177 ROC - reciever operator characteristic,123,260 ROS - reactive oxygen species, 166,196, 299 RPS4X - ribosomal protein S4 X chromosome gen, 244

S SCNT - somatic cell nuclear transfer blastocista, 381 SCSA - sperm chromatin structural assay, 166 Sertoly cell syndrom, 141, 196 SHBG - sex hormone binding globulin, 262 Sistemi obrade vode, 364 slow freezing, 277, 281 Sonohisterosalpingografija, 153, 162 SOX3 - sulfur oxidation 3 gen, 239, 241 SPA - sperm penetration assay, 166 spermatidi, 190, 195, 276, 218 spermatozoidi iz epididimisa, 217, 218 SRY - sex determining region Y chromosome gen, 239, 240, 241 Stem }elija, 25, 89, 90, 225, 376, 377, 378, 379, 380, 381 sticanje kompetentnosti, 301, 305 Stimulacija folikulogeneze, 178 subendometrijalni protok krvi, 260 Surogat majka, 315, 316, 382 susceptibilni hromozomi, 305 SUZI - subzonska inseminacija, 188 swim-up metode, 147, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 274, 357

406


T TCM - traditional chinese medicine, 173 TDF – testis determining factor, 340 TEFNA - testicular fine needle aspiration, 224, 225 TESE - testicular sperm extraction, 196, 219, 224, 225, 234 Te{ki oblik OHSS - ovarian hyperstimultion syndroma, 333 testikularni spermatozoidi, 195, 196, 197, 218, 219, 222, 272,274, 275, 276 TGF - transforming growth factor, 231, 253, 368 Torakocenteza, 326 Torzija ovarijuma, 321 transfer citoplazme, 293, 305 transfer jedra somatske }elije, 380, 381 Translokacije, 208, 220, 235, 329, 245, 246, 248, 249, 333, 335, 337, 338, 339 Transvaginalna punkcija folikula, 187 tranziciona pora permeabilnosti, 299 Trizomija 13 - Patauov sindrom, 289, 290 Trizomija 15, 289, 293 Trizomija 16, 290 Trizomija 18 - Edwardsov sindrom, 290 Tromboembolijske komplikacije, 322 Turner - ov sindrom, 243, 244, 333, 334 Tyrode rastvor, 204

U ubikvitinske ligaze, 297 uklanjanje zone pelucide pronazom, 205 ultra~iste vode, 364, 365 Ultrazvu~na folikulometrija, 181, 214

USP9 Y - ubiquitin specific protease 9 Y chromosome gen, 237, 238, 242

V vanished fetus, 331 Vaskularni flow index, 309, 310 VEGF - vascular endothelial growth factor, 40, 256, 257, 258, 259, 260, 300, 318, 319, 320, 325 Veresova kanila 156, 157, 158, 159, 160 VFI - vaskularnI indeks protoka, 152, 260 VI - vascularization index, 260 vitrifikacija, 273, 283, 285 Vitrifikacija blastociste, 286 Vitrifikacija embriona, 286 Vitrifikacija oocita, 283, 285 Vitrifikacija ovarijalnog tkiva, 287

X X - Y homologija, 241

Y YAC - yeast artifitial chromosome, 237

Z Zamrzavanje embriona, 280 Zapremina jajnika, 308 ZFX - zink finger X chromosome gen, 243, 244 Zigot, 57, 64, 66, 197, 286, zink finger Y chromosome gen, 243 ZPTV - zona pellucida thickness, 205

veštačka oplodnja

Recommend Documents