VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS Pablo Richter
Introducción
La validación de un método analítico tiene como objetivo establecer por medio de estudios científicos, que un método tiene las características de desempeño que son adecuadas para cumplir los requerimientos de las aplicaciones analíticas pretendidas. Una vez validada una metodología analítica, el laboratorio de ensayo deberá fijar los intervalos de aceptabilidad para el control de calidad de cada una de las propiedades analíticas del método. Una metodología, aún cuando tenga el carácter de método estándar u oficial, debería ser validada antes de ser utilizada en forma rutinaria.
Introducción
Las propiedades analíticas que necesariamente deberán ser documentadas en un proceso de validación, son la siguientes:
Precisión al nivel de replicabilidad y repetibilidad
Exactitud
Incertidumbre
Intervalo de linealidad
Límite de detección del método
Límite de cuantificación del método
Campo de Aplicación
El presente documento corresponde a una guía técnica que define los términos y los procedimientos relativos a la validación de un método de análisis. En todas las actividades de laboratorio es esencial uniformar las definiciones y los métodos de cálculo para los diferentes términos. En este documento se establecen las definiciones relativas a propiedades de métodos analíticos que se utilizarán en los laboratorios de rutina del país.
Definiciones CURVA DE CALIBRACIÓN: Representación gráfica bidimensional, que muestra la variación de la señal analítica con la concentración del analito. Esta última se obtiene al graficar el valor obtenido de la señal analítica (valor absoluto, altura, área, etc.) versus las concentraciones de los estándares respectivos. SENSIBILIDAD: Propiedad analítica que se define como la capacidad de un método para discriminar entre concentraciones (cantidades) semejantes de analito. La sensibilidad de un método analítico corresponde a la pendiente de la curva de calibración. Algunas veces se expresa informando la razón entre el valor de señal obtenida a una concentración dada de estándar.
Definiciones LIMITE DE DETECCIÓN: Existen distintas formas de definir los límites de detección de un método de acuerdo a criterios estadísticos, basados en el cuociente entre la magnitud de la señal de la medida y el ruido de fondo producido por el instrumento o por el blanco analítico.
a) Límite de Detección IUPAC: Concentración de analito que origina una señal que puede diferenciarse estadísticamente de un blanco analítico.
Límites de detección y cuantificación ¿Cuál es la menor concentración que podemos detectar o cuantificar con este método de análisis?
S= Señal
Razón señal ruido S/n
LD => S/n = 3 n = ruido
LC => S/n = 10
b)
Límite de Detección Instrumental (LDI): Corresponde a la concentración mínima de un compuesto analizado que, sin la presencia de la matriz, un instrumento puede detectar con una fiabilidad definida y que es estadísticamente diferente de la respuesta correspondiente al ruido de fondo obtenido por el instrumento.
c)
Límite de Detección del Método (LDM): Corresponde a la concentración mínima de un compuesto que puede ser detectada en una matriz real, la cual es tratada siguiendo todas las etapas del método completo, incluyendo separaciones y pretratamientos. Esta mínima concentración produce una señal detectable con una fiabilidad definida, estadísticamente diferente a la señal producto del blanco obtenido en las mismas condiciones.
Definiciones LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN DEL MÉTODO (LCM): Corresponde a la concentración mínima de un analito que puede ser cuantificada en una matriz real, la cual es tratada siguiendo todas las etapas del método empleado, incluyendo separaciones y pretratamientos. Esta mínima concentración produce una señal cuantificable con una nivel de confianza definido. INTERVALO DE LINEALIDAD O DE DETERMINACIÓN: Corresponde al intervalo de concentración más fiable de medida para la determinación analítica del analito. Este intervalo esta comprendido entre la concentración correspondiente al del LCM y la concentración máxima que entrega el límite de linealidad.
Definiciones
PRECISIÓN: Grado de concordancia de un grupo de resultados entre sí. Dispersión de estos resultados alrededor de su media. Existen tres formas de plantear un estudio de precisión:
Replicabilidad (Repeatability, “within run precision”) Repetibilidad (Intermediate precision, “within lab reproducibility”) Reproducibilidad (Reproducibility conditions, “between lab precision”)
Niveles de Precisión
Replicabilidad: Forma de plantear el estudio de precisión. Se define como la dispersión de resultados originados por aplicaciones del mismo método a alícuotas de la misma muestra, para determinar el mismo analito, en el mismo laboratorio, por el mismo operador y con las mismas herramientas analíticas, en un corto intervalo de tiempo. Repetibilidad: Forma de plantear el estudio de precisión. Se define como la dispersión de resultados originados por aplicaciones del mismo método a alícuotas de la misma muestra, para determinar el mismo analito, en el mismo laboratorio, y al menos una de las siguientes condiciones es diferente: analista, instrumento, día. Reproducibilidad : Forma de plantear el estudio de precisión. Se define como la dispersión de resultados originados por aplicaciones del mismo método a alícuotas de la misma muestra, para determinar el mismo analito, en diferentes laboratorios, y en las siguientes condiciones: diferente analista, diferente instrumento, igual o diferente día.
Esta propiedad analítica no se determina de forma rutinaria en un procedimiento de validación. Sólo es aplicable a ejercicios de intercomparación.
Definiciones
EXACTITUD: Expresa la cercanía entre el valor que es aceptado, como un valor de referencia (material de referencia certificado) y el valor encontrado (valor promedio) obtenido al aplicar el procedimiento de análisis un cierto número de veces. La exactitud se expresa en términos de error, generalmente como error relativo (Ver más adelante SESGO).
RECUPERACIÓN: Corresponde a la diferencia (en porcentaje) entre la concentración medida de un analito en una muestra fortificada (a la que se le ha agregado una cantidad conocida de estándar) y la concentración medida en la misma muestra sin fortificar, dividido por la concentración de sustancia agregada.
Definiciones
INCERTIDUMBRE: Se puede distinguir entre los siguientes conceptos:
a)
Incertidumbre genérica: Duda acerca de la composición química de un objeto o una muestra. Es lo contrario a información.
b)
Incertidumbre específica: Intervalo de valores en que puede encontrarse un resultado, una media de los mismos y el valor considerado verdadero. SELECTIVIDAD: Capacidad de un método analítico para originar resultados que dependan de forma exclusiva del analito, para su identificación y/o cuantificación.
Error vs Incertidumbre Resultado de un análisis: 2,5 ± 0,8 mg / Kg Valor certificado: 2,9 ± 0,2 mg / Kg Error: 2,9 – 2,5 = 0,4 mg / Kg Incertidumbre: 0,8 mg / Kg
PROCEDIMIENTOS
I.
Calibración del método
1) Procedimiento para construir una Curva de calibración Preparar una batería de estándares de concentración conocida en el solvente apropiado, dentro del intervalo de concentraciones en que se estima que estarán las muestras a analizar. Posteriormente determinar la señal analítica que origina cada una de las soluciones, y
Realizar una inspección preliminar, graficando los puntos experimentales disponibles y verificando visualmente si existe alguna desviación de la linealidad y aproximadamente a partir de qué valor ésta se manifiesta.
A partir de la curva de calibración estimar la parte lineal, obtener la recta de calibración: Y = S C + Yb, donde C es la masa o la concentración de la sustancia a ser cuantificada y S e Yb la pendiente y ordenada en el origen de la recta, respectivamente. Calcular los coeficientes S, Yb y r (coeficiente de correlación) para la curva de calibración, descartando los puntos preliminarmente eliminados en la etapa anterior. Calcular también los límites inferior (LI) y superior (LS) a partir de los cuales los cuocientes (señal / masa) o (señal / concentración) indiquen que un punto está fuera del intervalo lineal LI = 0,95s y LS= 1,05s, respectivamente.
Verificar si existe algún punto preliminarmente incluido en la curva de calibración que, por comparación con los límites de corte calculados en b) debería de ser excluido (o sea, si el correspondiente cuociente (señal / masa) o (señal / concentración) es menor que LI o mayor que LS) o si algún punto inicialmente excluido debería de ser considerado para el cálculo de la curva de calibración.
Inclusión o exclusión de nuevos valores en la curva: Si el examen hecho en c) indica que todos los puntos de la curva preliminarmente incluidos (o excluidos) lo han sido correctamente, el procedimiento está terminado. En caso contrario, repetir las etapas de b) a d), incluyendo o excluyendo los puntos necesarios, hasta que ningún valor sea rechazado o considerado para el cálculo de la curva de calibración.
EJEMPLO – Curva calibrado
Los siguientes datos son las áreas máximas relativas en cromatogramas de disoluciones patrón de metil vinil cetona (MVK): Determine la recta por el método de los mínimos cuadrados Una muestra dio una señal para MVK con un área relativa de 10,3. Calcule la concentración de MVK en la muestra. Dos evaluaciones adicionales de la muestra dieron como resultado las siguientes áreas; 10,8 y 10,1. Calcule la precisión de esta determinación.
Conc. MVK, mM
Área relativa
0,5
3,02
1,5
9,00
2,5
15,03
3,5
21,42
4,5
27,03
5,5
32,97
6,5
39,00
7,5
44,20
8,5
47,00
9,5
50,20
I.
Calibración del método
2) Adición de estándares Cuando en el proceso de calibración del método, se determine que hay interferencia de la matriz, utilizar el método de la adición estándar de acuerdo a los siguientes procedimientos alternativos. a)
Con muestra sintética: Utilizar una mezcla preparada en el laboratorio de todos los componentes de la matriz de la muestra sin el principio activo a determinar, luego enriquecer con estándar a diferentes niveles de concentración. Para preparar las soluciones, en este caso se mantiene constante la cantidad de muestra sintética y se agregan cantidades variables del estándar. (curva en presencia de matriz)
Ácido oxolínico
Curva de Calibración de Estándar de ácido Oxolínico
Curva de Calibración de ácido Oxolínico en matriz
Curva Calibración Ác. Oxolínico en Matriz
Curva Oxolínico y = 42084x - 9036,7 R2 = 0,9997
10000000
5000000 4000000 Área
Área
15000000
5000000
y = 19162x + 4564,4 R2 = 0,9982
3000000 2000000 1000000
0 0,00
100,00 200,00 300,00 400,00 Conc: (ng/ml)
0 0,00
50,00 100,00 150,00 200,00 Conc. (ng/g)
I.
Calibración del método
2) Adición de estándares b)
Con muestra: Cuando no es posible contar con una muestra sintética (o matriz blanco), trabajar directamente con una muestra real. Determinar por duplicado la señal promedio del analito en la muestra, con el método a validar; una vez conocida la señal promedio, proceder a enriquecer las muestras con estándar a diferentes niveles de concentración. Para preparar las soluciones, en este caso se mantiene constante la cantidad de muestra tomada y se agregan cantidades variables del estándar. La ICH (International Conference Harmonization), recomienda preparar muestras independientes por triplicado a cada nivel de concentración.
EJEMPLO – Adición estándar
En una muestra de agua de mar se determina cobre por voltamperometría de redisolución anódica (ASV). Una alícuota de 5 ml de muestra es diluida en un matraz de 10 ml con agua destilada. Enseguida en tres matraces de aforo de 10 ml se agrega una alícuta de 5 ml de muestra y respectivamente se agrega un volumen de 1, 2 y 3 ml de solución estándar del analito de 10 µg/l. Las señales respectivamente obtenidas son: 4,11 µA; 6,15 µA; 7,99 µA y 10,05 µA. Determinar la concentración de cobre en la muestra. Cu, µg/l
Señal, µA
0
4,1
1
6,15
2
7,99
3
10,05
ejemplo adicion estándar.xls
I.
Calibración del método
3) Uso de estándar interno Siempre que sea posible, particularmente en cromatografía, debe emplearse un estándar interno (explicar diferencia con estándar subrrogate), puesto que esto minimiza los errores debidos a la adsorción en superficies, a la pérdida durante la extracción, a las pérdidas durante la evaporación del solvente, o durante los procedimientos de derivatización, y la irreproducibilidad debida a las técnicas de transferencia y de inyección.
Los estándares internos deben ser, idealmente, un homólogo del analito. Si esto no es posible, se elegirá un compuesto que posea propiedades físicoquímicas similares a las del analito. Las propiedades cromatográficas del estándar interno deben ser tales que eluya muy cerca del analito pero aún así, completamente resuelto de cualquier otra sustancia presente.
EJEMPLO – Estándar Interno Los siguientes datos de calibración han sido obtenidos en una determinación de benzopireno (BP) por GC-MS. Como estándar interno se utilizó pireno (C13). Construya la curva de calibrado correspondiente. Area relativa
Conc. BP, ppm
Area BP
Area estándar interno
0,1
1100
8600
0,13
0,5
5200
8000
0,65
1,0
18000
12800
1,41
5,0
59000
9100
6,48
10,0
95000
7300
13,01
II.
Procedimiento para determinar la sensibilidad Una vez establecida la curva de calibración de acuerdo al procedimiento anterior, determinar la pendiente de la curva (S), lo cual define la sensibilidad del método.
Curva Oxolínico y = 42084x - 9036,7 R2 = 0,9997
10000000
5000000 4000000
Área
Área
15000000
Curva Calibración Ác. Oxolínico en Matriz
5000000
y = 19162x + 4564,4 R2 = 0,9982
3000000 2000000 1000000
0 0,00
100,00 200,00 300,00 400,00 Conc: (ng/ml)
0 0,00
50,00 100,00 150,00 200,00 Conc. (ng/g)
III.
Procedimiento para determinar el límite de detección IUPAC
Medir la respuesta de al menos 10 blancos analíticos independientes, de los que se deduce la media YB y la desviación estándar σB. De acuerdo a la IUPAC, el límite de detección es: YLD = YB + 3 σB
A una señal YLD le corresponde una concentración CLD, lo que se consigue por extrapolación gráfica en la curva de calibrado.
YLD
Curva de Calibrado
CLD
El límite de detección debe expresarse en unidades de concentración
EJEMPLO – LD
Para estudiar la sensibilidad de un método de determinación de quínina en agua tónica se han realizado dos series de experimentos. En la primera, se realizan 11 medidas repetidas del blanco (agua tónica en ausencia de quinina suministrada por el fabricante) y se obtiene los siguientes datos de intensidad de fluorescencia: 0,70; 0,74; 0,72; 0,71; 0,73; 0,71; 0,73; 0,74; 0,70; 0,69 y 0,75. En otra serie de experimentos, al agua tónica sin quinina, se le añaden cantidades crecientes de quinina para preparar 7 muestras artificiales, obteniéndose los siguientes resultados:
Quinina, ug/L
1,0
2,0
3,0
4,0
6,0
8,0
10,0
Intensidad de Fluorescencia
2,51
4,60
6,52
8,60
12,71
16,68
20,81
Determinar la sensibilidad y límite de detección del método
ejemplo Limite deteccion quinina.xls
IV.
Procedimiento para la determinación del Límite de Detección Instrumental (LDI) Agregar una alícuota de solución estándar de analito en “agua pura” o en el solvente adecuado, de manera de obtener una concentración correspondiente a 2-10 veces el LDI estimado (obtener el límite estimado alternativamente de valores reportados en literatura, catálogo del equipo, razón señal / ruido, etc.). Someter esta solución a medición (n replicas independientes de la solución) en el sistema instrumental. Se determina la señal analítica Yb y su desviación estándar (σB) de acuerdo a la siguiente expresión: σB = ( (Xi- promedio)2/n-1)1/2
La expresión para calcular el límite de detección instrumental es la siguiente: YLD = 3 σB n ≥10 Después utilizando la curva de calibrado se obtiene la concentración en el límite de detección.
V.
Procedimiento para la determinación del Límite de Detección del Método (LDM) Determinar el límite de detección del método en una muestra real, según el siguiente procedimiento
1) Si la concentración del compuesto analizado se sitúa entre 2 y 10 veces la concentración del límite de detección estimado, pasar a la etapa siguiente. Si por el contrario la concentración es demasiado elevada, cambiar de muestra. Si la concentración es demasiado baja, ajustar mediante la adición de un estándar la concentración del compuesto de interés, para situarla entre 2 y 10 veces el límite de detección estimado. 2) Separar a lo menos 10 alícuotas de la muestra utilizada para evaluar el LDM y realizar todas las etapas implicadas en el método analítico.
V.
3)
Procedimiento para la determinación del Límite de Detección del Método (LDM) A partir de los resultados obtenidos, calcular la media y la desviación estándar (σB) de las replicas: La expresión para calcular el límite de detección del método es la misma anterior.
VI.
Procedimiento para la determinación del límite de detección de un método analítico, a través de la construcción de una curva de calibración
1)
Construir curva de calibración, sobre matriz de muestra, en un intervalo de concentraciones cercano al cero (lo más bajo que pueda ser detectado) (n ≥ 4) .
2)
A partir de la curva, determinar: a) b)
Ordenada en el origen de la línea de regresión: YB Desviación estándar de la regresión (se obtiene con cualquier programa estadístico): σy/x σy/x
(yi n
2 yˆ i)
2
Donde: yi: Valor observado del punto en la ordenada ŷi: Valor teórico del punto obtenido por la predicción del modelo de regresión n: Número de puntos de la curva de calibración (n ≥ 4) c)
Pendiente de la curva de calibración: S
VI.
Procedimiento para la determinación del límite de detección de un método analítico, a través de la construcción de una curva de calibración
3) Calcular Límite de detección: Señal del Límite de detección: yLD = yB + 3 sy/x Concentración del Límite de detección se calcula haciendo uso de la ecuación de la curva de calibración.
VII.
Procedimiento para la determinación del Límite de Cuantificación del Método (LCM)
El límite de cuantificación del método se determina siguiendo el mismo procedimiento que el usado para el LDM pero finalmente en la expresiones respectivas el factor 3 se sustituye por 10.
VIII.
Ej: Procedimiento para la determinación del límite de cuantificación de un método analítico, a través de la construcción de una curva de calibración
El límite de cuantificación del método, a través de una curva de calibración, se determina siguiendo el mismo procedimiento que el usado para el LDM, pero finalmente la expresión que debe considerarse es: Señal del Límite de cuantificación:
yLCM = yB + 10 sy/x Concentración del límite de cuantificación a través de la curva de calibración
IX.
Procedimiento para calcular replicabilidad (Precisión)
la
Dentro del intervalo de 2 a 10 veces el límite de cuantificación del método, separar 10 alícuotas de una muestra y aplicarles el método completo, respetando las siguientes condiciones: mismo analista, mismo instrumento y mismo día. Para realizar los cálculos que requiere el método e informar los resultados, utilizar las unidades apropiadas y el número de cifras significativas necesarias.
La replicabilidad se expresa como la desviación estándar relativa o coeficiente de variación (CV).
X.
Procedimiento para calcular repetibilidad (Precisión)
la
Dentro del intervalo de 2 a 10 veces el límite de cuantificación del método, separar 10 alícuotas de una muestra y aplicarles el método completo, cambiando al menos una de las siguientes condiciones: el analista, el instrumento o el día. Para realizar los cálculos que requiere el método e informar los resultados, utilizar las unidades apropiadas y el número de cifras significativas necesarias.
Los resultados se expresan como desviación estándar relativa o coeficiente de variación (CV).
XI.
Procedimiento para determinar la exactitud
Dentro del intervalo de determinación, aplicar el método analítico completo “n” veces (n = 3-10 replicas) a una muestra en la cual el parámetro a medir esté certificado por un organismo reconocido (material de referencia certificado).
Para determinar el error relativo del método (E, %), aplique la siguiente ecuación: E(%)
(Vo Vc) 100 Vc
Vc = Valor certificado; Vo = media de los valores obtenidos aplicado el método.
Además, puede ser necesario hacer el cálculo estadístico para la equivalencia con el material de referencia, utilizando el test de varianzas homogéneas
XI.
Procedimiento para determinar la exactitud
Si no existe o no está disponible el material de referencia, la determinación de la exactitud puede llevarse a cabo de acuerdo a una de las siguientes posibilidades, y en siguiente orden de prioridad: 1)
Comparación del método en la misma muestra, con un método absoluto
2)
Comparar el método con un método independiente, ya sea éste de referencia o validado previamente.
3)
Recuperación en una matriz real con 2 niveles de concentración distintos. Los niveles de concentración deben estar, en un caso entre 2 y 10 veces el LCM y en el otro, entre 20 y 30 veces el LCM.
4)
Intercomparación entre metodologías validadas.
a
lo
menos
2
laboratorios
que
utilicen
XII. Procedimiento para determinar la recuperación
Analizar una muestra real y en paralelo analizar la misma muestra a la que se ha agregado una concentración dada de estándar. La concentración final debe estar dentro del rango de determinación del método. Calcular la recuperación de acuerdo a la siguiente expresión:
Recuperación (%)
(Cs C) 100 Ca
Cs = concentración de la muestra fortificada
C = concentración en la muestra no fortificada Ca= concentración agregada.
XIII. Procedimiento para el cálculo de la incertidumbre Cuantificación de los componentes de incertidumbre. • Una forma común de presentar las diferentes contribuciones a la incertidumbre de la medición total es usar los diagramas de causa y efecto. Este enfoque puede resultar muy útil cuando se estudia o cuantifica componentes de incertidumbres individuales. • Se ha demostrado, sin embargo, que en algunos casos esta metodología subestima la incertidumbre de las mediciones, dado que es difícil poder incluir todas las posibles contribuciones de incertidumbre en tal enfoque. • En este contexto, el grupo de expertos en calidad y metrología de “Nordtest (2004)” ha propuesto el modelo para el cálculo de la incertidumbre en el que la repetibilidad (P. intermedia) de las mediciones se combina con la estimación del sesgo del método. Así, usando el control de calidad existente y los datos obtenidos en la validación del método analítico, la probabilidad de incluir todas las contribuciones de incertidumbre se maximiza. Sesgo: Diferencia entre el valor medio medido a partir de una serie de resultados de ensayo y un valor de referencia aceptado (un valor certificado o nominal).
XIII. Procedimiento para el cálculo de la incertidumbre En este plano, un laboratorio puede combinar dichos componentes individuales en 2 tipos de incertidumbre: incertidumbre derivada de la repetibilidad (P. Intermedia) del método (urep) y la incertidumbre derivada del sesgo (usesgo). La manera más común de estimar los componentes del sesgo son: el uso de material de referencia certificado, participación en rondas interlaboratorios o ensayos de recuperación.
XIII. Procedimiento para el cálculo de la incertidumbre Cálculo de Incertidumbre Expandida (U). Para realizar el cálculo de U, se deben determinar previamente las dos incertidumbres estándares antes expuestas. Cálculo de incertidumbre repetibilidad del método (urep):
urep =
*t (0.95, n 1) n
Donde: = Desviación estándar al nivel de repetibilidad. t = Coeficiente de student para un 95% de nivel de confianza. n = número de datos.
XIII. Procedimiento para el cálculo de la incertidumbre Cálculo de incertidumbre derivada del sesgo (usesgo):
usesgo =
(sesgo) 2
(uCER) 2
Donde:
sesgo = el valor puede ser determinado alternativamente por medio del análisis de un material de referencia certificado, participación en rondas interlaboratorios o ensayos de recuperación . u(CER) = Incertidumbre del material de referencia certificado o del patrón de referencia (valor certificado) utilizado en el ensayo de recuperación
XIII. Procedimiento para el cálculo de la incertidumbre Finalmente la incertidumbre expandida (U) del proceso analítico, se expresa combinando ambas incertidumbres antes mencionadas, considerando un factor de recubrimiento igual a 2:
U=
2 (urep) 2 (usesgo) 2
Incertidumbre Expandida (U): Cantidad que define un intervalo alrededor del resultado de una medición que se espera que abarque una gran parte de la distribución de valores que se podrían atribuir razonablemente al mensurando, para un cierto nivel de confianza. Una Incertidumbre expandida (U) se calcula de una incertidumbre estándar combinada (u) y un factor de cobertura k usando: U = k x u.
EJEMPLO – Calculo incertidumbre
Determinación de BTEX Se lleva a cabo una determinación de benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos (m+p, o) en una muestra de agua. El estándar de calibración corresponde a una solución en metanol que certifica que las concentraciones de los compuestos son las nominales ± 0,5%. El sesgo del método fue determinado a través de un ensayo de recuperación, con los siguientes datos (O: valor promedio obtenido; R: valor de referencia):
Benceno µg/g
Tolueno µg/g
E-Bz µg/g
(m+p)-XIL µg/g
o-XIL µg/g
O
R
O
R
O
R
O
R
O
R
10,2
11,0
9,9
11,0
11,5
11,0
25,0
11,0
11,1
11,0
Determinación de BTEX En la validación del método analizaron separadamente 8 alícuotas de una muestra real obteniéndose las siguientes concentraciones: Nº
µg/g BEN
µg/g TOL
µg/g ET-BEN
µg/g (m+p)-XIL
µg/g o-XIL
1
43,42
48,62
32,14
44,15
14,15
2
43,41
48,44
32,17
44,64
13,07
3
43,52
48,20
31,36
44,67
13,59
4
43,60
48,27
31,14
43,68
13,06
5
43,61
48,41
31,91
44,22
12,91
6
43,57
48,56
31,80
44,67
12,96
7
42,17
47,63
31,21
45,33
13,19
8
42,29
47,70
31,25
43,03
12,80
Ejemplo incertidumbre.xls
1. Para la determinación analítica de nitrofurantoína en formas farmacéuticas se añaden cantidades crecientes de la droga de la droga en dimetilformamida (DMF). En seguida se mide la respuesta instrumental (señal analítica) de cada solución y se obtienen los siguientes datos: CONCENTRACIÓN
Respuesta
mg/l
Instrumental
0
0,01
0,5
0,058
1
0,11
2
0,225
4
0,445
6
0,67
8
0,89
10
1,08
12
1,1
15
1,12
20
1,11
(a)Determine la Sensibilidad del método. Por otra parte, al no disponer de un material de referencia certificado, se prepara una muestra artificial de tableta que contiene 750 mg de excipientes comunes (estereato de magnesio, talco, almidon, colorante, gelatina etc.) y 250 mg de nitrofurantoina pura. Una porción de 10 mg de muestra artificial se agrega en un matraz de aforo de 1 litro y se afora con DMF. A la solución resultante se le determina su respuesta instrumental dando un valor de 0,272. (b) Determine la exactitud del método (error relativo) e indique si hay interferencia por parte de los excipientes de la formulación. 10 muestras que contienen sólo la mezcla de excipientes (sin nitrofurantoína) son analizadas independientemente por el método. Las respuestas instrumental obtenidas son: 0,015; 0,010; 0,012; 0,015; 0,010; 0,012; 0,009; 0,010; 0,015; 0,008. (c) Determine el límite de detección del método. 10 porciones de una muestra real de tabletas de nitrofurantoína se analizan independientemente por el método analítico y se obtienen los siguientes resultados (mg): 250,35; 250,44; 249,36; 248,99; 250,98; 250,00; 249,98; 251,05; 250,39; 248,98. (d) Determine la precisión del método (desviación estándar relativa).
Rechazo de datos dudosos
Un dato dudoso difiere excesivamente de la media. La prueba estadística Q se utiliza para decidir si un dato debe retenerse o rechazarse. Primero se calcula un valor de Qexp y se rechaza el dato cuando el valor es mayor que el valor estadístico (Qcrit)
Qexp
xq
xn
xm ax xm in
, xq es el valor dudoso.
xn es el valor más cercanoal valor dudoso.
Valores de Qcrit Número de Datos
Qcrit a 90% de probabilidad
Qcrit a 95% de probabilidad
3
0.941
0.970
4
0.765
0.829
5
0.642
0.710
6
0.560
0.625
Ejemplo: Prueba Q
Para las mediciones replicadas que aparecen al lado, aplique la prueba Q para el valor 2.5. Use un Qcrit a 90% de confianza.
Valor (x)
x2
3.5
12.25
3.1
9.61
3.1
9.61
3.3
10.89
2.5
6.25
(x)=15.5
Qcrit Qexp Qexp
(x2)=48.61
0.642 para 5 valores y a 90% de probabilid ad. 2.5 3.1 0.60 3.5 2.5 Qcrit , se retiene el valor.
EJEMPLO – Dato dudoso
En el mundial de fútbol de Alemania 2006, al final de cada partido, llevan a un par de jugadores para hacer la prueba del doping. En la orina se determinan si hay substancias prohibidas (en este caso efedrina). Previamente el laboratorio que hizo el análisis validó su método con muestras certificadas de efedrina en orina. Esta tenía un contenido certificado de 2,05 ± 0,08 ng/ml. Al analizar esta muestra diez veces de manera independiente se obtuvieron los siguientes valores en ng/ml: 2,08; 2,14; 2,09; 2,21; 3,91; 2,01; 2,09; 1,99; 1,98; 2,05. Indique: cuál es el objeto, el analito y la muestra para el análisis. cuál es la exactitud y precisión del método que utiliza el laboratorio. Qcrit (tabla (n=10) 0,464)
ejemplo prueba Q.xls
Cartas de Control
Una vez que ha sido validada una metodología y se comienza con su aplicación en
análisis de rutina, todos los controles de calidad
relacionados con las propiedades analíticas deben ser documentadas a través de la construcción de Cartas de Control, de forma tal que el comportamiento del método en el tiempo pueda ser trazable.
EJEMPLO
carta control turbiedad.xls
GLOSARIO
Alícuota: porción bien definida (masa, volumen) de la muestra
Muestra: es la parte (alícuota) del objeto que contiene los analitos
Análisis: someter una muestra a un proceso analítico para conocer información química sobre la misma Blanco analítico: Muestra, generalmente artificial, que no contiene el analito. Teóricamente no debería originar señal, si lo hace ésta se denomina “señal blanco”. El blanco analítico es un elemento de control de calidad utilizado en la rutina analítica el que se procesa como una muestra más en un análisis Interferente: Todo compuesto, todo elemento, toda partícula o todo factor que afecte el resultado generado por un método analítico Determinación (cuantificación): proceso para conocer la cantidad /concentración de un analito (o familia) de una muestra que es analizada Detectar: Acción de un instrumento para producir una señal y transducirla en una magnitud física fácilmente medible. Proceso de medición con fines cualitativos.
Identificar: proceso analítico cualitativo que implica un reconocimiento del analito, a través de las características químicas o fisicoquímicas del mismo o de su producto de reacción Caracterizar: acción de establecer los aspectos diferenciales de un objeto o sistema, a partir de los resultados analíticos
Técnica: principio científico que se utiliza para extraer información analítica. Implica el empleo de un instrumento Método Analítico: corresponde a la Adaptación específica de una técnica analítica para un propósito de medición seleccionado. Es un conjunto de operaciones especificas para caracterizar cuali y/o cuantitativamente a un analito (o familia) en una determinada muestra. Implica el empleo de un técnica (instrumento)
Método absoluto: es aquel método de cuantificación calculable que no se basa en el empleo de estándares analíticos Procedimiento: descripción pormenorizada de una metodología analítica Material de referencia: Material o sustancia, en el cual una o más de sus propiedades están suficientemente bien establecidas, homogéneas y estables, que se emplean para calibración, asignación de valores a materiales o evaluación de métodos analíticos Material de referencia certificado: son materiales de referencia que tienen certificados uno o varios valores de sus propiedades (con sus incertidumbres específicas) obtenidos por procedimientos especiales (Ejemplo: ejercicio de intercomparación) bajo la responsabilidad de un organismo competente e independiente Ejercicio de intercomparación: conjunto de procesos de medida (método) llevados a acabo por diferentes laboratorios, bajo la coordinación de un ente competente, para analizar alícuotas de la misma muestra para determinar los mismos analitos
Referencias
J.C. Miller and J.N.Miller, Statistic for Analytical Chemistry, Ellis Horwood Limited edition, Chichester, England, 3rd edition, pag. 115-118, 1993. M. Valcarcel, Principios de Química Analítica, Springer-Verlag Ibérica, Barcelona, España, 1999. Norma IRAM 301:2000-Norma ISO/IEC 17025: 1999. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics. EURACHEM Guide. Editor: H. Holcombe, LGC, Teddington: 1998. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. Guide EURACHEM- CITAC Guide: 2000. Nordtest Report 537. 2004. Handbook for Calculation of Measurement Uncertainty in Environmental Laboratories.
Norma ISO 9000: 2000.
IUPAC, Limit of Detection, Spectrochim. Acta 33 B, 242, 1978.
Centre d'expertise en analyse environnementale du Québec. Protocole pour la validation d'une méthode d'analyse en chimie DR-12-VMC. Edition 2000-03-01
