TSI Agar Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico. Fundamento En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro. Fórmula (en gramos por litro) Extracto de carne 3.0 Pluripeptona 20.0 Cloruro de sodio 5.0 Lactosa 10.0 Sacarosa 10.0 Glucosa 1.0 Sulfato de hierro y amonio 0.2 Tiosulfato de sodio 0.2 Rojo de fenol 0.025 Agar 13.0
Instrucciones Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.
pH final: 7.3 ± 0.2 Siembra A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio. Incubación A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis. Resultados 1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico. Microorganismo
Pico/Fondo
E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC 700603 P. mirabilis ATCC 43071 S. typhimurium ATCC 14028 S. enteritidis ATCC 13076 S. flexneri ATCC 12022 P. aeruginosa ATCC 27853
Producción de gas
Producción deácido sulfhídrico -
A/A A/A
+ +
K/A
+
+
K/A
-
+
K/A
+
+
K/A K/K
-
-
A: ácido K: alcalino Características del medio Medio preparado: rojo Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC. Presentación x 100g :Código: B02-134- x 500g :Código: B02-134-06 05 LIA: Lisina Hierro Agar Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico. Fundamento En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es
el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio. Fórmula (en gramos por litro) Peptona de gelatina 5.0 Extracto de levadura 3.0 Glucosa 1.0 Lisina 10.0 Citrato de hierro y 0.5 amonio Tiosulfato de sodio 0.04 Púrpura de bromocresol 0.02 Agar 15.0
Instrucciones Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolución completa. Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la punción.
pH final: 6.7 ± 0.2 Siembra Por punción profunda con aguja de inoculación. Incubación En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 °C. Resultados 1- Decarboxilación de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. 2-Desaminación de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp.
3-Producción de ácido sulfhídrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo) Microorganismos Proteus mirabilis ATCC 43071 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Salmonella enteritidis ATCC 13076 Providencia spp. Citrobacter freundii Morganella spp.* Edwarsiella spp. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli ATCC 25922
Color en el pico de Color en la base Ennegrecimiento flauta del tubo del medio Rojo Amarillo Negativo Púrpura Púrpura Positivo Púrpura Púrpura Positivo Rojo Amarillo Negativo Púrpura Amarillo Positivo Rojo Amarillo Negativo Púrpura Púrpura Positivo Púrpura Púrpura Negativo Púrpura Púrpura Negativo
*Algunas especies de Morganella spp., pueden desaminar la lisina. Características del medio Medio preparado: color violeta. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC. Presentación x 100g :Código: B02-106- x 500g :Código: B02-106-06 05 MIO Medio. Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y producción de indol. Fundamento Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteína aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo. Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas allá de la línea de inoculación.
Crecimiento Movilidad
Indol
Ornitina decarboxilasa
La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura. El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich, indica un resultado positivo. Fórmula (en gramos por litro) Dextrosa 1.0 Extracto de levadura 3.0 Peptona 10.0 Tripteína 10.0 Clorhidrato de L-ornitina 5.0 Agar 2.0 Púrpura de bromocresol 0.02 pH final: 6.5 ± 0.2
Instrucciones Suspender 31 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullición hasta completa disolución. Distribuir en tubos y esterilizar 15 minutos a 121°C.
Siembra A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, inocular por punción profunda con ansa recta. Incubación En aerobiosis, durante 18-24 horas a 35-37 °C. Resultados 1-Movilidad: -Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra. -Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra. 2-Ornitina decarboxilasa: -Resultado positivo: color púrpura. -Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio. 3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador. -Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.
Microorganismo E. coli ATCC 25922 Bueno K. pneumoniae ATCC Bueno 700603 P. mirabilis ATCC 43071 Bueno
+ -
+ -
+ -
+
-
+
Características del medio Medio preparado: púrpura transparente a ligeramente opalescente. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC. Presentación x 100g :Código: B02-163-05
x 500g :Código: B02-163-06
Christensen Medio (Urea Agar Base). Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad ureásica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos. Fundamento En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella. Fórmula (en gramos por litro) Tripteína 1.0 Glucosa 1.0 Cloruro de sodio 5.0 Fosfato monopotásico 2.0 Rojo de fenol 0.012 Agar 15.0
pH final: 6.8 ± 0.2
Instrucciones Suspender 24 g de polvo en 950 ml de agua destilada. Dejar reposar 2 minutos. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50°C y agregar 50 ml de una solución de urea al 40% previamente esterilizada por filtración o cloroformo. Fraccionar en tubos de hemólisis y solidificar en pico de flauta con fondo profundo.
Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubación. Se rEcomienda no punzar la capa profunda para controlar el color. Incubación En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C. Resultados Microorganismo Proteus mirabilis ATCC 43071 K. pneumoniae ATCC 700603 Escherichia coli ATCC 25922 S. flexneri ATCC 12022 S. typhimurium ATCC 14028
Actividad ureásica Positiva Positiva débil Negativa Negativa Negativa
Color del medio Rojo-Rosado Rojo-Rosado Amarillo Amarillo Amarillo
Limitaciones -Bacterias que hidrolizan lentamente la urea, como ser Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, viran al color rojo-rosado de todo el medio de cultivo luego de varios días de incubación. -No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone facilmente. Características del medio Medio preparado: amarillo Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC. Presentación x 100g :Código: B02-109-05
x 500g :Código: B02-109-06
Simmons Citrato Agar Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía. Fundamento En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de
nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa. Fórmula (en gramos por litro) Citrato de sodio 2.0 Cloruro de sodio 5.0 Fosfato dipotásico 1.0 Fosfato monoamónico 1.0 Sulfato de magnesio 0.2 Azul de bromotimol 0.08 Agar 15.0
Instrucciones Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en posición inclinada.
pH final: 6.9 ± 0.2 Siembra A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar. Incubación A 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis. Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días de incubación. Resultados -Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. -Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. Microorganismo Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 S. typhimurium ATCC 14028 E. coli ATCC 25922 S. flexneri ATCC 12022
Citrato permeasa Positivo Positivo Negativo Negativo
Color del medio Azul Azul Verde Verde
Limitaciones -Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualización azul de un resultado positivo. -Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.
-Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculación antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgánica puede originar resultados falsos positivos. Características del medio Medio preparado: verde. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Medio preparado: a 2-8 ºC. Presentación x 100g :Código: B02-132-05
x 500g :Código: B02-132-06
XLD ESPECIFICACIONES El Agar XLD (por sus siglas Xilosa, Lisina, Desoxicolato) es utilizado para el aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos Gram negativos, especialmente del género Shigella y Providencia. El Agar XLD fue desarrollado por Taylor para incrementar la eficiencia en el aislamiento e identificación de patógenos entéricos, particularmente de Shigella. Los patógenos son diferenciados no sólo de los no patógenos fermentadores de lactosa, sino también de varios no patógenos no fermentadores de la lactosa o sacarosa. Este medio presenta la ventaja de facilitar el crecimiento de gérmenes exigentes ya que otros medios contienen inhibidores excesivamente tóxicos. El Agar XLD está incluido en la USP para los métodos de límite microbiano y las pruebas de “presencia-ausencia de Salmonella”. En este medio el extracto de levadura provee la fuente de nitrógeno, carbono, vitaminas y cofactores. La xilosa, lactosa y sacarosa son los carbohidratos fermentables. El tiosulfato de sodio y el citrato férrico son adicionados para ver la producción de H2S. El rojo de fenol actúa como indicador. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es adicionado como agente solidificante. Xilosa 3.5 Extracto de Levadura 3.0 L- Lisina 5.0 Rojo de Fenol 0.08 Lactosa 7.5 Desoxicolato de Sodio 2.5 Sacarosa 7.5 T iosulfato de Sodio 6.8 Cloruro de Sodio 5.0 Agar Bacteriológico 13.5 Citrato Férrico de Amonio 0.8 pH 7.4 ± 0.2
Método: Suspender 55g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Evitar el sobrecalentamiento. Enfriar a una temperatura entre 45- 50°C y vaciar en placas de Petri estériles. Procedimiento: Las muestras fecales o hisopos rectales pueden ser sembradas directamente en las placas. Las muestras pueden ser enriquecidas previamente utilizando Caldo Tetrationato o Caldo Selenito. La degradación de la xilosa, lactosa y sacarosa genera la producción de ácido cambiando el color del medio de rojo a amarillo. La producción de H2S bajo condiciones alcalinas, da colonias con el centro negro. Esta reacción es inhibida en condiciones ácidas. La descarboxilación de la lisina en ausencia de fermentación de lactosa o sacarosa, ocasiona la reversión del medio a alcalino y el color del medio regresa a rojo. Almacenamiento: 2-30°C. Caducidad: 5 años en frasco cerrado. AGAR SS: SALMONELLA SHIGELLA AGAR. Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia. Fundamento Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa, y a la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Selenito caldo (B02-120-05). Fórmula (en gramos por litro) Pluripeptona 5.0 Extracto de carne 5.0 Lactosa 10.0 Mezcla de sales biliares 8.5 Citrato de sodio 8.5 Tiosulfato de sodio 8.5 Citrato férrico 1.0 Agar 13.5 Verde brillante 0.00033 Rojo neutro 0.025 pH final: 7.0 ± 0.2
Instrucciones Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullición durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50°C y distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.
Siembra Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo. Recomendaciones, se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar E.M.B. (B02-101-05) o de agar Mac Conkey (B02-114-05). Incubación Durante24-48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis. Resultados Microorganismos Salmonella typhimurium ATCC 14028 Shigella flexneri Shigella sonnei Proteus mirabilis ATCC 43071 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Enterococcus faecalis ATCC 29212
Colonias Transparentes, centro negro Incoloras Incoloras Transparentes, centro negro Rosadas a rojas Rosadas cremosas y mucosas Incoloras, de muy escaso crecimiento
Características del medio Medio preparado: rojo naranja. Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 ºC. Presentación x 100g :Código: B02-138-05
X 500g :Código: B02-138-06
