Translatedcopyof030.63.2016.2.3.PDF

Acta Microbiologica et Immunologica Immunologica Hungarica, 63 (2), pp 171-184 (2016) DOI:. 10,1556 / 030.63.2016.2.3 030.63.2016.2.3

LABORATORIUM IDENTIFIKASI BAKTERI ANAEROBIK ISOLASI ON Clostridium difficile SELEKTIF MEDIUM CRISTINA RODRIGUEZ 1 *, NATHALIE WARSZAWSKI 1, NICOLAS KORSAK 1, BERNARD TAMINIAU 1, JOHAN VAN BROECK 2, MICHEL DELMÉE 2 dan GEORGES DAUBE 1 Departemen Ilmu 1Food, FARAH, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Liège, Liège, Belgia 2Belgian Pusat Referensi untuk Clostridium difficile (NRC), Kutub de microbiologiemédicale, UniversitéCatholique de Louvain, Brussels, Belgia (diterima: 31 Agustus 2015; diterima: 14 April 2016) Meskipun meningkat katnya minat dalam bakteri, metodologi untuk Clostridium difficile pemulihan belum diba dibakuk kukan an.. Cycl Cyclos oser erin inee-ce cefo foxi xititin n fruk frukto tosa sa taur tauroc ocho hola late te (CCF (CCFT) T) seca secara ra hist histor oris is medi media a yang yang pali paling ng seri sering ng digu diguna naka kan n untu untukk C. diff diffic icilile e isol isolas asii dari dari manu manusi sia, a, hewa hewan, n, ling lingku kung ngan an,, dan dan sampe sampell maka makana nan, n, dan dan iden identitififika kasi si pres presum umtitiff bias biasan anya ya dida didasar sarka kan n pada pada morf morfol olog ogii kolo koloni ni.. Namu Namun, n, CCFT CCFT tida tidakk bena benar-b r-ben enar ar sele selekt ktifif.. Pene Penelilititian an ini ini menj menjel elas aska kan n pemu pemuliliha han n spes spesie iess 24 bakt bakter erii yang yang term termas asuk uk 10 gene genera ra yang yang berb berbed eda a sela selain in C. diff diffic icilile, e, hadi hadirr dala dalam m ling lingku kung ngan an dan dan maka makana nan n dari dari pemb pemben entu tuka kan n pens pensiu iun n yang yang tida tidakk diha dihamb mbat at dala dalam m C. medi media a sele selekt ktifif diff diffic icilile. e. Temu Temuan an ini ini memb member erik ikan an wawa wawasa san n untuk studi lingkungan dan makanan lebih lanjut serta untuk isolasi C. difficile pada CCFT dilengkapi. Kata kunci: cycloserine-cefoxitin menengah fruktosa taurocholate, sefotaksim,identifikasi bakteri, 16S ribosom urutan DNA analisis

Pendahuluan

perubah perubahanB anBany anyak ak peneli penelitia tian n telah telah melapo melaporka rkan n dalam dalam epidem epidemiol iologi ogi Clostr Clostridi idium um diffic difficile ile dan kehadirannya dalam makanan, hewan, dan lingkungan [1, 2]. Minat jenis C. difficile sampel terus berkembang dan kemungk ngkinan penularan zoonosis dan makanan dari ari bakteri masih menj menjad adii fokus okus utam utama a bebe bebera rapa pa lapo lapora ran n pene peneliliti tian an [3] [3]. Namun amun,, pros prosed edur ur isol isolas asii untu untukk tujua ujuan n pene peneliliti tian an belu belum m diba dibakkukan ukan.. Dala Dalam m bebe bebera rapa pa tahun ahun tera terakkhir, hir, seju sejum mlah lah besa besarr pene peneliliti tian an tela telah h difokuskan pada * Penulis Sesuai; E-mail: [email protected] 1217-8950 / $ 20,00 © 2016 Akadémiai Kiad o, Budapest

172 RODRIGUEZ ET AL.

perbaikan media dan budaya metode diferensial [4-6], termasuk kejutan etanol, pengayaan sampel dalam kaldu selektif, atau penggunaan agars pra-dibuat kromogenik dan lainnya. Namun, agars pra-dibuat mahal dan dengan demikian tidak terjangkau bagi banyak kelompok penelitian. Selain itu, mereka digunakan untuk pemulihan klinis C. difficile dari sampel feses dan bukan untuk semi-kuantifikasi spora yang layak [7]. Sejak pertama kali diusulkan oleh George et al. [8], cycloserine- cefoxitin fruktosa (CCF) telah media yang paling umum digunakan untuk C. difficile isolasi dari sampel manusia, hewan, lingkungan, dan makanan. Penambahan taurocholate, desoxycholate atau kolat juga telah ditunjukkan untuk menginduksi perkecambahan spora C. difficile ketika mereka digabungkan dalam CCF [6, 9]. Tions modifikasi-lain untuk meningkatkan Media ini telah diusulkan; Delmée et al. [10] termasuk sefotaksim bukan cefoxitin, yang meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas medium. Beberapa penelitian telah difokuskan pada identifikasi spesies bakteri lainnya tumbuh di CCF. George et al. [8] melaporkan pertumbuhan Lactobacillus spp., Ragi tak dikenal dan tak dikenal anaerob batang Gram-negatif pada CCF. Hanya satu studi lebih lanjut [11] dijelaskan koloni Clostridium lainnya tumbuh di cycloserine-cefoxitin fruktosa taurocholate (CCFT), termasuk sporogenes Clostridium, Clostridium cadaveris, Clostridium perfringens, Clostridium mentans bifer-, dan Clostridium septicum. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi oleh 16S komparatif analisis urutan DNA ribosom spektrum bakteri dikultur pada CCFT, menggunakan permukaan dan makanan sampel. Pertumbuhan isolat juga diuji di media CCFT dimodifikasi (dengan sefotaksim) dan strain yang lebih ditandai untuk kerentanan terhadap dua agen selektif, sefotaksim dan cycloserine. Bahan dan Metode

Penelitian ini dilakukan selama 4 bulan, dari bulan Maret sampai Juni 2013, dan termasuk 188 sampel makanan dan 246 sampel permukaan [12]. Makanan sampel yang terdiri dari bahan-bahan mentah dan / atau dimasak, menurut menu sehari-hari. Setiap Jumat pagi, sampel dari minggu diangkut ke laboratorium untuk analisis langsung. Tanggal persiapan makanan, tanggal analisis, kuantitas, dan bahan-bahan untuk setiap sampel dicatat. Sampel dari permukaan diambil pada dua kesempatan yang berbeda dengan interval 65 hari di antara mereka. Berbagai daerah (total luas sekitar 100 cm2) yang diusap sebelum atau setelah pembersihan rutin, termasuk kamar penduduk dan area umum lainnya [12]. Budaya dilakukan pada CCFT seperti yang dijelaskan sebelumnya [12] dalam sebuah workstation anaerobik (LedTechno, Heusden-Zolder, Belgia) pada 37 ° C. Koloni Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016

BAKTERI TUMBUH PADA C. DIFFICILE MEDIUM 173

lainnya dibandingkan dengan morfologi karakteristik C. difficile kemudian disubkultur pada Columbia agar piring dengan darah 5% kuda (BIOMERIEUX, Marcy- l'Étoile, France ). Jumlah DNA dipanen dari koloni tunggal dan diekstraksi seperti yang dijelaskan sebelumnya [13]. Identifikasi molekul bakteri dengan 16S analisis urutan DNA ribosom dilakukan menggunakan primer dan kondisi yang dijelaskan oleh Simpson et al. [14]. Sequencing dan pemurnian produk dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [15]. Berikut sequencing, urutan konsensus dibuat menggunakan program Geneious (http://www.geneious.com). Genus dan spesies dari setiap urutan konsensus yang disimpulkan dari perbandingan dengan non-redundant basis data nukleotida (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) menggunakan alat pencarian keselarasan lokal dasar. Identitas 99% digunakan sebagai ambang batas untuk identifikasi spesies [16]. Semua strain terisolasi disubkultur pada dimodifikasi-CCFT agar menyertakan agen selektif Cycloserine (400 mg / mL) dan cefotaxime (3,6 mg / mL). Setelah tion incuba- selama 48 jam dalam suasana anaerob pada suhu 37 ° C, piring diperiksa untuk memverifikasi pertumbuhan bakteri dalam media dimodifikasi. Selain itu, semua isolat diuji untuk kerentanan terhadap cycloserine dan cefotaxime antimikroba. Tes dilakukan dengan difusi cakram kertas sesuai dengan French Society of Microbiology (FSM) (www.sfm-microbiologie.org) pedoman. Untuk sefotaksim, tes dilakukan dengan 30-ug standar disc (Becton-Dickinson, Erembodegem, Belgia). Untuk cycloserine, seperti cakram standar komersial tidak tersedia, tes disesuaikan dengan protokol seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Mith et al. [17] dengan konsentrasi akhir 120 ug cycloserine di disk. Piring diinkubasi selama 48 jam dalam workstation anaerobik. Aktivitas antibakteri dievaluasi dengan mengukur diameter zona hambat dalam milimeter menggunakan Top Craft kaliper digital (Globaltronics GmbH & Co KG, Jerman). Sarana kemudian dihitung dari hasil tiga penentuan. Seluruh tes dilakukan dalam rangkap dua. Bacteroides fragilis ATCL 25.285 diuji sebagai kontrol kualitas. Hasil danDiskusi

shockEtanol tidak digunakan dalam program studi ini, juga bukan pilihan alkohol mikroorganisme yang dilakukan; oleh karena itu kita dapat menggambarkan lebih luas spesies yang mampu tumbuh di media ini. Di sisi lain, untuk kedua sampel makanan dan permukaan, tidak ada koloni tumbuh diamati pada lebih dari setengah dari piring dianalisis. Untuk sampel permukaan, temuan ini dapat menunjukkan bahwa panti jompo memiliki program yang baik bersih-diterapkan untuk mengontrol tidak hanya penyebaran C. difficile, tetapi juga bakteri lain. Untuk sampel makanan, besar kemungkinan memasak menghilangkan beban mikroba dari makanan mentah dan ada juga kebersihan yang baik Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016


prosedur penanganan makanan. Selanjutnya, koloni berbudaya diamati dalam jumlah rendah, yang memfasilitasi identifikasi morfologi yang berbeda meskipun tidak memiliki digunakan langkah etanol shock. Dari sampel makanan, total 59 strain diisolasi dan diidentifikasi dengan analisis sekuensing 16S rDNA. Hasil penelitian menunjukkan total 7 genera bakteri com- prizing 20 spesies yang berbeda. Bakteri yang paling sering diisolasi milik genera Lactobacillus, Clostridium, dan Enterococcus. Dalam ini, spesies dominan diidentifikasi sebagai Lactobacillus rhamnosus (n = 6), Enterococcus faecium (n = 5), dan Enterococcus faecalis (n = 5) (Tabel I). C. sporogenes (n = 12) adalah klostridia yang paling umum terisolasi. Dalam perjanjian dengan hasil penelitian ini, Limbago et al. [8] melaporkan total 13 isolat diidentifikasi sebagai C. sporogenes diperoleh dari daging sapi dan tanah kalkun setelah kultur pada medium selektif C. difficile. Untuk permukaan lingkungan, total delapan spesies bakteri yang berbeda telah diidentifikasi. Sebagian besar spesies sebelumnya telah diamati sebagai mampu bertahan selama berbulan-bulan pada permukaan [18]. E. faecalis (n = 26) dan Eggerthella lenta (n = 14) adalah bakteri yang paling sering terisolasi dari daerah sampel. Mengenai genus Clostridium, hanya satu isolat (Clostridium tertium) diperoleh. Spesies lain diidentifikasi adalah E. faecium (n = 2), Staphylococcus haemolyticus (n = 2), Staphylococcus capitis (n = 1), Pediococcus pentosaceus (n = 2), dan Finegoldia magna (n = 2) (Tabel II). Dalam penelitian ini, semua strain yang dijelaskan diisolasi dari makanan dan permukaan sampel mampu tumbuh di CCFT dalam kondisi budaya yang sama ditetapkan untuk C. difficile pemulihan. Konsentrasi diperkirakan dalam agar peneliti-siap D

-cycloserine adalah 400 ug / mL dan 3,6 mg / mL untuk cefoxitin (dengan rata-rata 20 mL CCFT per piring). Dalam dimodifikasi-CCFAT, yang termasuk sefotaksim dan cycloserine agen selektif dalam konsentrasi yang sama, semua strain terisolasi juga bisa tumbuh, kecuali hanya regangan diidentifikasi sebagai viridescens Weisella. Sebelumnya melaporkan data menggambarkan C. difficile penghambatan minimal konsentrasi- trasi ≥1,024 ug / mL untuk D

-cycloserine di 16 strain yang berbeda dari C. difficile [8]. Namun, dalam pedoman manajemen antibiotik yang tersedia, tidak ada breakpoint disk atau konsentrasi kritis untuk obat ini. Sehubungan dengan sefotaksim, menurut FSM, sensitivitas dan zona tahan diameter diusulkan adalah ≥21 mm dan <15 mm, dan konsentrasi kritis untuk kerentanan dan ketahanan yang ≤4 mg / L dan> 32 mg / L untuk anaerob yang ketat. Namun, harus diperhitungkan bahwa nilai-nilai tersebut hanya breakpoints terapi. Untuk sebagian besar strain terisolasi, zona diamati inhibisi lebih rendah atau sama dengan ukuran zona C. difficile penghambatan. Hasil yang diperoleh dari

D

tes-cycloserine difusi cakram (120 ug / disc) menunjukkan bahwa untuk semua Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016

BAKTERI TUMBUH PADA C. DIFFICILE MEDIUM 175 Tabel I. 16S rDNA identifikasi sequencing bakteri tumbuh di CCFAT yang menengah diisolasi dari sampel makanan setelah pengayaan CCFT terisolasi bakteri total jumlah isolat Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016 Contoh weeksa

jumlah isolat /weekb sampelterdiri dari satu atau lebih bahan baku sampel terdiri dari bahan-bahan dimasak hanya Genus Clostridium perfringens baratii 1 29 / 03 1 0 1 Clostridium butyricum 2 10/05 2c 1 1 Clostridium orbiscindens 1 24/05 1 0 1 Clostridium sporogenes 12 22/03 4c 1 3 26/04 2 0 2 03/05 2/ 05 1 1 0 07/06 1 0 1 28/06 1 0 1 Clostridium subterminale 4 22/03 1 0 1 4/5 2c 0 2 4/12 1 0 1 Genus Enterococcus Enterococcus casseliflavus 3 07/06 1 1 0 14 / 06 1 0 1 28/06 1 1 0 Enterococcus durans 3 29/03 2 1 1 31/05 1 0 1 Enteroc occus faecalis 5 29/03 1 0 1 10/05 2c 1 1 20/06 1 0 1 28/06 1 1 0 Enterococcus faecium 5 24/05 1 0 1 14/06 1 0 1 20/06 1 1 0 28 / 06 2 0 2 Enterococcus gallinarum 1 14/06 1 0 1 Genus Lactobacillus Lactobacillus sakei 3 29/03 1 0 1 4/12 1 1 0 28/06 1 0 1 Lactobacillus salivarius 1 28/03 1 1 0 Lactobacillus rhamnosus 6 29 / 03 1 0 1 4/5 1 0 1 4/12 1 0 1 19/04 1 0 1 10/05 1 0 1 24/05 1 0 1 Lactobacillus casei 2 19/04 1 1 0 31/05 1 1 0 Lactobacillus graminis 1 17/05 1 1 0

176 RODRIGUEZ ET AL. Tabel I. (cont.) Terisolasi bakteri Total Sampel Jumlahdari jumlah weeksa isolat / isolat weekb Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016

Sampel terdiri dari satu atau lebih bahan baku Sampel terdiri dari bahan-bahan dimasak hanya Genus Paenibacillus Paenibacillus Lautus 1 24/05 1 0 1 Genus Pediococcus Pediococcus pentosaceaus 5 03/05 1 0 1 10/05 1 1Pediococcus acidilactici 1 10/05 1 1 0 Genus Propionobacterium Propionobacterium acnes 1 22/03 1 0 1 Genus Weisella Weisella viridescens 1 14/06 1 0 1

tanggal tersebut mengacu pada Jumat yang sampel dari minggu melanjutkan dikumpulkan dan diangkut ke laboratorium untuk analisis langsung. b Jumlah spesies bakteri yang berbeda diperoleh dari sampel makanan di setiap minggu sampling. c Dua isolat dari makanan disiapkan pada hari y ang sama tetapi dalam layanan yang berbeda.

isolat yang termasuk dalam genus Clostridium, Pediococcus, Propionibacterium, Staphylococcus, dan Paenibacillus, tidak ada zona penghambatan hadir di piring. Untuk genus Lactobacillus, tidak ada zona penghambatan diamati untuk setiap isolat kecuali Lactobacillus graminis dan Lactobacillus salivarius, yang zona 22,7 mm dan 28,3 mm yang masing-masing terdeteksi. Mengenai genus Enterococcus, semua spesies yang dipelajari ditampilkan diameter penghambatan antara 13 mm dan 16 mm kecuali Enterococcus gallinarum, yang memiliki diameter maksimum 22 mm. E. lenta menunjukkan diameter 29,6 mm, sedangkan F. magna memiliki diameter 26 mm. Untuk sefotaksim (30 ug / disc), hasilnya lebih heterogen. Isolat milik genus Lactobacillus, termasuk L. rhamnosus dan L. graminis menunjukkan perlawanan penuh untuk cefotaxime (tidak ada zona inhibisi), sementara dua spesies lain dari genus ini, sakei Lactobacillus dan Lactobacillus casei, memiliki diameter 19 mm dan 20,5 mm, masing-masing . Mengenai genus Clostridium, sebagian besar spesies menunjukkan zona hambat ≥10 mm dan ≤32 mm (Clostridium orbiscidens 31,3 mm; C. sporogenes 20,6 mm; Clostrodium baratii 15,6 mm, dan Clostridium butyricum 11,8 mm). Hanya tiga spesies, C. tertium, Clostridium subterminale, dan C. difficile disajikan resistensi penuh terhadap obat tersebut. Sebagian besar isolat yang termasuk dalam genus Enterococcus menunjukkanresistance

BAKTERITUMBUH PADA C. DIFFICILE MEDIUM 177 Tabel II. Bakteri yang berbeda dari lingkungan rumah jompo terisolasi di CCFT Sampling daerah Jumlah sampel Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016 Terisolasi Jumlah bakteri

isolat Informasi spesifik mengenai wilayah isolat Dapur Eksternal dapur gagang pintu 4 - - gagang pintu internal Kitchen 4 - - Lemari es menangani 2 - - Penutup makanan hangat (bain marie) 2 Eggerthella lenta 1

Kitchen talenan untuk daging 2 - - dapur talenan untuk sayuran 2 Eggerthella lenta 1 mesinSlicer 2 Pediococcus pentosaceus

1 Oven menangani 2 - - Sentuh kontrol kran dapur 4 Eggerthella lenta gerobak pengiriman 1 Meal (untuk kamar dan kantin) 14 Enterococcus faecalis 1 Carts untuk

Baki kantin (untuk kamar dan kantin) 8 Enterococcus faecalis 1 Baki untuk kantin Kitchen dinding 2 Kitchen lantai 2 staf kamar mandi dandapur

ruang ganti gagang pintuEksternal 9 Eggerthella lenta 1 internal gagang pintu 9 Clostridium tertium 1 Toiletinternal yang gagang pintuToilet duduk 4 Eggerthella lenta flu 2a Cistern tombol sh 2 Kertas handuk dispenser 2 Eggerthella lenta 1 kontrol Shower 2 Sink keran 2 Sabun dispenser 2 Handuk bar 2 Kenop kontrol (radiator) 2 Kamar Mandi dinding lantai 2 Kamar Mandi 2 Eggerthella lenta 1 Cahaya saklar 2 Eggerthella lenta1 kamarWarga eksternal gagang pintu 8 Eggerthella gagang pintu lenta 1 kamar E internal 8 Enterococcus faecium 1 Room F Enterococcus faecalis 1 Room D Bedside 8 Finegoldia magna 1 Room D Enterococcus faecalis 1 Room F Eggerthella lenta 1 Room E B 8 Finegoldia magna 1 Room D Enterococcus faecalis 2 Room G / B

178 RODRIGUEZ ET AL. Tabel II. (cont.)

Jumlah daerah Sampling Nomorbakteri Terisolasi sampel isolat Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016

Informasi spesifik mengenai wilayah isolat kursi valid 1 Enterococcus dinding faecalis 1 Room D Room 8 Enterococcus faecalis 1 Room F Room lantai 8 Enterococcus faecalis 4 Room D / E / F / B kamar mandi pribadi gagang pintu eksternal 8 Enterococcus faecalis 2 kamar D / 0 Staphylococcus haemolyticus

1 kamar E internal gagang pintu 8 Staphylococcus haemolyticus

1 ruang D Sink kran 8 Enterococcus faecalis 1 Room A Staphylococcus capitis 1 kamar E Eggerthella lenta 1 ruang E Cistern tombol siram 8 Enterococcus faecalis 2 Room D / C sikat Toilet menangani 8 Toilet kursi 8 Enterococcus faecalis 1 Room D dukungan Toilet bar 6 Eggerthella lenta 1 Room F Towel 8 Enterococcus faecalis 4 Room D / G / 0 / A Chamber pot 1 Enterococcus faecalis 1 Room D Bathroom wall 8 Eggerthella lenta 1 Room E Mandi lantai 8 Enterococcus faecalis 1 kamar E umum daerah Couch 2 meja kopi 2 kontrol Elevator pa nels 12 Enterococcus faecalis 2a Pediococcus pentosaceus

1 Staircase pagar 4 Enterococcus faecium 1 Balai dinding 2 Balai lantai 2 Enterococcus faecalis 1 Catatan: Sampling sebelum pembersihan: kamar 0, C, E, F; sampel setelah pembersihan: kamar A, B, D, G; kamar dengan warga dinyatakan positif C. difficile pada saat pengambilan sampel: D, E. Satuisolat dari setiap hari sampling.

(tidak ada zona inhibisi) dengan hanya E. gallinarum ketegangan menyajikan zona penghambatan, 16,6 mm. S. capitis dan S. haemolyticus juga menunjukkan ketahanan penuh untuk cefotaxime (tidak ada zona hambat). Strain lain seperti Paenibacillus Lautus, acnes Propionobacterium, F. magna, dan E. lenta memiliki diameter 18,6 mm, 23,2 mm, 22,9 mm, dan 22,4 mm, masing-masing. Sementara P. pentosaceus memiliki diameter 16,6 mm, Pediococcus acidilactici tidak menunjukkan zona hambat di piring, menunjukkan resistensi penuh.


Sebanyak 70 dari 188 sampel yang dianalisis (70,7%) yang seluruhnya terdiri dari bahan-bahan dimasak, sementara 55 (29,3%) berisi satu atau lebih bahan baku, seperti selada, tomat, jamur, atau daging mentah. Persentase ini mungkin menjelaskan mengapa hanya 20 strain diisolasi dari makanan mentah (sebagian besar dari sayuran segar), sedangkan 40 strain diisolasi dari sampel makanan yang dimasak (semua dari mereka terdiri dari daging atau ikan sebagai bahan utama). Sampel beku sebelum analisis, yang dapat mempengaruhi kelangsungan hidup dari beberapa kelompok bakteri [19]. Mengenai sayuran segar, mereka dapat pelabuhan populasi besar dan beragam bakteri. Sebuah studi sebelumnya [20] menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam struktur komunitas bakteri tergantung pada jenis sayuran yang terlibat, dan juga perawatan yang dilakukan dalam proses produksi. Dalam konteks ini, beberapa faktor bisa berperan dalam pemulihan yang lebih rendah dari strain dari sampel makanan mentah. Metode pembersihan dan sanitasi sayuran dapat menyebabkan penurunan yang signifikan dalam total plate count [21]. Taksa dominan dalam sayuran milik kelompok aerobik, seperti Pseudomonas, Xantomonas, atau spesies lain non-Enterobacteriaceae; Oleh karena itu, mereka tidak terdeteksi di bawah kondisi budaya anaerob dari penelitian ini [20, 22]. Mengenai makanan yang dimasak, sebagian besar bakteri yang ditemukan diklasifikasikan dalam genus Clostridium, Enterococcus, dan Lactobacillus. Beberapa studi telah membahas kelangsungan hidup spora Clostridium dalam kondisi ekstrim di lingkungan. Sementara suhu beku tampaknya memiliki dampak kecil pada kelangsungan hidup sebagian besar spora, kelangsungan hidup mereka pada temperatur yang berbeda bervariasi menurut spesies. Sebagai contoh, spora layak C. sporogenes dan C. butyricum dapat bertahan hidup pada suhu 100 ° C selama berjam-jam [23, 24]. Enterococci telah menunjukkan ketahanan panas yang penting dan, tergantung pada isolat dan spesies, mereka dapat bertahan hidup pada suhu pasteurisasi [25]. Beberapa spesies Lactobacillus juga telah terbukti memiliki potensi untuk bertahan hidup pasteurisasi. Namun, perlawanan mereka tergantung pada variasi genetik antara strain, status fisiologis sel-sel dan faktor lingkungan lainnya [26, 27]. Oleh karena itu, tidak mengherankan bahwa kelompok-kelompok bakteri (khusus Clostridium dan Enterococcus) diisolasi lebih sering dari sampel yang terdiri dari ikan atau daging (bahkan jika mereka yang dimasak) sebagai kontaminasi dengan spesies feses ini akan terjadi lebih sering pada kondisi jagal dibandingkan dengan kontaminasi di lingkungan. Di sisi lain, penggunaan agen antimikroba dalam produksi ternak telah menyebabkan peningkatan resistensi Enterobaceriaceae dan keluarga bakteri lainnya, dengan produksi yang lebih tinggi dari β-laktamase, yang menghidrolisis cincin β-laktam dan menonaktifkan β-laktam [28 ]. Hasilnya prevalensi tinggi diperpanjang-spektrum β-laktamase (ESBL) -producing Enterobacteriaceae dalam produk daging. Sedangkan hubungan antara bakteri ESBL-memproduksi di mals makanan ani-, daging ritel, dan manusia telah disarankan sebelumnya [25], beberapa publikasi menggambarkan perlawanan ESBL pada bakteri dari sayuran, atau mengidentifikasi Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016


spesies terdeteksi di mana jenis sayuran [22]. Dalam studi ini, kami memilih cefoxitin akhir (CCFT) dan cefotaxime (dimodifikasi CCFT) konsentrasi 3,6 mg / mL. Epidemiologi cut-off value (ECOFF) tersedia untuk cefoxitin berkisar antara 4 mg / mL (Staphylococcus aureus) dan 8 mg / mL (Escherichia coli, Klebsiella spp., Salmonella spp., Dan Staphylococcus spp.). Epidemiologi cut-off value tersedia untuk sefotaksim bervariasi antara ≤0.25 ug / mL (E. coli, Klebsiella spp., Dan Streptococcus spp.), 0,5 mg / mL (Citrobacter spp., Enterobacter spp., Dan Streptococcus spp.), 1 mg / mL (Yersinia enterocolitica dan Serratia spp.), 2-4 mg / mL (Staphylococcus spp.), dan 32 mg / mL (Pseudomonas aeuroginosa). Sebagian besar strain yang dipilih dalam penelitian ini mungkin sudah diperoleh resistance (setidaknya untuk cefotaxime); Oleh karena itu, tidak mengherankan bahwa dua kali lebih banyak isolat diperoleh dari makanan matang, termasuk di sebagian besar daging kasus. Seperti dalam kasus daging dan Enterobacteriaceae, beberapa makanan fermentasi baru-baru ini disarankan sebagai kendaraan potensial untuk pertukaran gen resistensi antibiotik antara bakteri asam laktat dan patogen lainnya dalam saluran testinal gastroin- [29]. Karena sebagian besar spesies Lactobacillus terisolasi dalam penelitian ini disajikan resistensi terhadap kedua obat, itu akan menarik untuk menentukan dalam perjalanan studi di masa depan apakah perlawanan dari hasil strain dari mekanisme intrinsik atau karena gen yang mengkode resistensi dipindahtangankan mungkin penentu. Sehubungan dengan sampel permukaan, spesies yang termasuk genus coccus Entero-, termasuk E. faecalis dan E. faecium, seringkali diisolasi dari swab yang berbeda (dapur, kamar warga, kamar mandi pribadi, dan area umum). Spesies ini telah umum ditemukan dalam sampel klinis [18, 30] dan mengamati bertahan antara 5 hari dan 4 bulan di lingkungan rumah sakit dan pada permukaan benda mati lainnya [31, 32]. Di rumah jompo ini, kamar warga yang dibersihkan dan didesinfeksi setiap hari menggunakan desinfektan berbasis pemutih (sodium hypochlo- ritual 10%). Otomatis dekontaminasi gas kamar warga (stabil hidrogen peroksida 6%) juga dilakukan mingguan; isolat dari dinding kamar mandi dan lantai kamar mandi yang hanya diperoleh saat pengambilan sampel dilakukan sebelum membersihkan rutin. Gagang pintu, samping tempat tidur, tombol Tadah, kursi toilet, dan pispot yang ditemukan terkontaminasi setelah membersihkan hanya dalam satu warga ruangan (D), yang mungkin menunjukkan sedikit usaha dan waktu yang dihabiskan di membersihkan ruangan ini. Tempat tidur juga ditemukan terkontaminasi setelah dibersihkan di tiga kamar yang berbeda, tetapi dalam setiap kasus, isolat diperoleh dari tempat tidur warga tergantung. Klasifikasi tergantung digunakan untuk warga yang terbatas pada tempat tidur; ini berarti bahwa pada saat pembersihan dan pada saat sampling warga yang hadir di tempat tidur, yang menghambat prosedur pembersihan dan juga nikmat kontaminasi ulang cepat dari permukaan sampel. E. faecalis diisolasi dari sandaran tangan dari satu kursi yang tidak valid. Kursi ini di ruang warga; Namun, itu tidak diperlakukan Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016


sebagai bagian dari rutinitas pembersihan. Dinding ruangan dan lantai ruang yang paling sering terkontaminasi sebelum pembersihan dilakukan. Satu-satunya lantai (ruang D) yang terkontaminasi setelah pembersihan juga dari penduduk bergantung menerima bantuan keperawatan dengan sirkulasi terus menerus dari staf perawat sumber kemungkinan kontaminasi lantai. Perlu dicatat bahwa ruangan ini (D) dihuni oleh seorang pasien didiagnosis dengan C. difficile infeksi (CDI) 9 hari sebelum studi dimulai dan positif bagi bakteri pada saat sampling. Bagi penduduk yang menderita CDI, protokol mengimplementasikan oleh fasilitas kesehatan menetapkan dekontaminasi gas otomatis ruangan setiap hari. Namun, dalam kasus khusus ini, status kesehatan kritis pasien diperlukan pemantauan terus menerus oleh perawat dan asisten medis, sehingga gerakan konstan tenaga medis di sekitar ruangan. Oleh karena itu, meskipun langkah-langkah khusus yang diambil oleh staf (gloving ganda jika memanipulasi tinja, desinfeksi konstan tangan), dekontaminasi gas otomatis tidak mungkin, setidaknya sebelum pengambilan sampel permukaan dilakukan. Aliran personil di ruangan ini juga bisa memberikan kontribusi pada fakta bahwa ini adalah ruang yang paling terkontaminasi setelah dibersihkan. Ada satu warga lainnya yang positif untuk C. difficile pada saat sampling (ruang E), namun, sedangkan bakteri terdeteksi dalam tinja mereka, CDI tidak didiagnosis dan karena itu protokol khusus disinfeksi tidak diterapkan. Selain Enterococcus, E. lenta adalah yang paling umum bakteri terisolasi. E. lenta adalah anaerob Gram-positif bakteri non-bersporulasi buruk dipelajari karena kesulitan dengan identifikasi fenotipe. Hal ini diakui sebagai ba gian dari microbiome usus manusia normal tetapi telah juga terkait dengan infeksi saluran pencernaan. Sebuah studi baru-baru diidentifikasi E. lenta di 33 pasien yang menderita patologi intra-abdominal dengan usia rata-rata 68 tahun [33]. Dalam kaitannya dengan orang tua dan usus mikrobiota, penurunan keragaman mikroba berkorelasi dengan peningkatan usia. Selanjutnya, orang yang tinggal di pendek atau jangka panjang fasilitas perumahan telah terbukti memiliki keragaman kurang biota mikro dibandingkan mereka yang tinggal di komunitas [34]. Tampaknya jangka panjang mata pelajaran perumahan memiliki proporsi yang lebih tinggi dari Bacteroidetes dalam usus mereka, sedangkan orang-orang tua di masyarakat memiliki proporsi yang lebih tinggi dari Firmicutes [35]. Pengurangan beberapa klostridia atau bifidobacteria spesies dan proliferasi bakteri oportunistik seperti E. faecalis juga dilaporkan pada pasien usia lanjut di rumah sakit [35]. Dalam penelitian ini, hanya satu isolat yang diperoleh dari gagang pintu internal staf dapur kamar mandi diidentifikasi sebagai C. tertium. Temuan ini bisa menunjukkan bahwa spesies Clostridium yang sub-dominan dalam mikrobiota feses ini warga lanjut usia, dan menjelaskan mengapa spesies lain yang hadir dalam proporsi yang lebih tinggi dan tahan terhadap agen selektif yang digunakan dalam medium yang lebih umum terisolasi. Kesimpulannya, penelitian ini berfokus pada identifikasi bakteri yang tumbuh pada media selektif (CCFT dan dimodifikasi CCFT). Ini C. difficile buatan budaya Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016


Media memiliki biaya yang relatif rendah tetapi menawarkan sensitivitas tinggi untuk tujuan penelitian. Data yang dilaporkan memberikan identifikasi spektrum bakteri yang tumbuh di CCFT, yang juga bisa membantu studi penyaringan lingkungan lebih lanjut di panti jompo dan lingkungan kesehatan lainnya. Referensi 1. Rodriguez-Palacios, A., Borgmann, S., Kline, TR, LeJeune, JT: Clostridium difficile dalam makanan dan hewan: Sejarah dan langkah-langkah untuk mengurangi paparan. Anim Kesehatan Res Rev 14, 11-29 (2013). 2. Vindigni, SM, Surawicz, CM: C. difficile infeksi: Mengubah epidemiologi dan manajemen paradigma. Clin transl Gastroenterol 6, E99 (2015). 3. Bauer, MP, Kuijper, EJ: Potensi sumber Clostridium difficile pada infeksi manusia. Menginfeksi Dis Clin Utara Am 29, 29-35 (2015). 4. Foster, NF, Riley, TV: Peningkatan pemulihan Clostridium difficile spora dengan penggabungan taurocholate sintetis dalam agar cycloserine-cefoxitin-fruktosa (CCFA). Patologi 44, 454-456 (2012). 5. Boseiwaga, LV, Foster, NF, Thean, SK, Squire, MM, Riley, TV, Carson, KC: Perbandingan ChromID Clostridium difficile agar cycloserine-cefoxitin-fructoseagar untuk pemulihan Clostridium difficile. Patologi 45, 495-500 (2013). 6. Tyrrell, KL, Citron, DM, Leoncio, ES, Merriam, CV, Goldsrein, EJC: Evaluasi cycloserine-cefoxitin fruktosa agar (CCFA), CCFA dengan darah kuda dan taurocholate dan lisozim untuk pemulihan dari Clostridium difficile isolat dari sampel feses . J Clin Microbiol 51, 3094-3096 (2013). 7. Lister, M., Stevenson, E., Heeg, D., Minton, NP, Kuehne, SA: Perbandingan metode berbasis budaya untuk isolasi Clostridium difficile dari tinja sampel dalam pengaturan penelitian. Anaerob 28, 226-229 (2014). 8. George, WL, Sutter, VL, Citron, D., Finegold, SM: media selektif dan diferensial untuk isolasi Clostridium difficile. J Clin Microbiol 9, 214-219 (1979). 9. Wilson, KH: Efisiensi berbagai persiapan garam empedu untuk stimulasi dari Clostridium difficile spora. J Clin Microbiol 18, 1017-1019 (1983). 10. Delmée, M., Wauters, G .: peran de Clostridium difficile dans les diarrhéessurvenant après antibiothérapy: Etude de 87 cas. [Peran Clostridium difficile diare muncul setelah pengobatan antibiotik: Sebuah studi dari 87 kasus]. Acta Clin Belg 36, 187-184 (1981). 11. Limbago, B., Thompson, AD, Greene, SA, MacCannell, D., MacGowan, CE, Jolbitado, B., Hardin, HD, Estes, SR, Weese, JS, Songer, JG, Gould, LH: Pembangunan dari metode konsensus untuk budaya Clostridium difficile dari daging dan penggunaannya dalam survei daging ritel AS. Makanan Microbiol 32, 448-451 (2012). 12. Rodriguez, C., Korsak, N., Taminiau, B., Avesani, V., Van Broeck, J., Brach, P., Delmée, M., Daube, G .: Clostridium difficile dari makanan dan permukaan sampel di sebuah panti jompo Belgia: sebuah sumber seperti kontaminasi. Anaerob 32, 87-89 (2015). 13. Rodriguez, C., Taminiau, B., Van Broeck, J., Avesani, V., Delmée, M., Daube, G .: Clostridium difficile pada hewan ternak muda dan penyembelihan hewan di Belgia. Anaerob 18, 621-625 (2012). Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016

BACTERIA GROWING ON C. DIFFICILE MEDIUM 183 14. Simpson, PJ, Stanton, C., Filzgerald, GF, Ross, RP: Genomic diversity and relatedness of bifidobacteria isolated from a porcine caecum. J Bacteriol 185, 2571-2581 (2013). 15. Rodriguez, C., Taminiau, B., Avesani, V., Van Broeck, J., Delmée, M., Daube, G.: Multilocussequence typing analysis and antibiotic resistance of Clostridium difficile strains isolated from retail meat and humans in Belgium. Food Microbiol 42, 166-171 (2014). 16. Kim, M., Oh, HS, Park, SC, Chun, J.: Towards a taxonomy coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes. Int J Syst Evol Microbiol 64, 346-354 (2014). 17. Mith, H., Duré, R., Delcenserie, V., Daube, G., Clinquart, A.: Antimicrobial activities of commercial essential oils and their components against food-borne pathogens and food spoilage bacteria. Food Sci Nutr 2, 403-416 (2014). 18. D'azevedo, PA, Dias, CAG, Teixeira, LM: Genetic diversity and antimicrobial resistance of enterococal isolates from southern region of Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 48, 11-16 (2006). 19. Alexander, DC, Tittiger, F.: Bacteriological studies of meat pies and frozen prepared dinners. Can J Comp Med 35, 5-11 (1971). 20. Leff, JW, Fierer, N.: Bacterial communities associated with the surfaces of fresh fruits and vegetables. PLoS One 8, e59310 (2013). 21. Pinto, L., Ippolito, A., Baruzzi, F.: Control of spoiler Pseudomonas spp. on fresh cut vegetables by neutral electrolyzed water. Food Microbiol 50, 102-108 (2015). 22. Van Hoek, AHAM, Veenman, C., Van Overbeek, WM, Lynch, G., de Roda Husman, AM, Blaak, H.: Prevalence and characterization of ESBL- and AmpC-producing Enterobacteriaceae on retail vegetables. Int J Food Microbiol 204, 1-8 (2015). 23. Morton, RD, Scott, W., Bernard, DT, Wiley, RC: Effect of heat and pH on toxigenic Clostridium butyricum. J Food Sci 55, 1725-1727 (2006). 24. Mah, JH, Kang, DH, Tang, J.: Comparison of viability and heat resistance of Clostridium sporogenes stored at different temperatures. J Food Sci 74, M23-27 (2009). 25. McAuley, MC, Gobius, KS, Britz, ML, Craven, HM: Heat resistance of thermoduric enterococci isolated from milk. Int J Food Microbiol 154, 162-168 (2012). 26. Jordan, KN, Cogan, TM: Heat resistance of Lactobacillus spp. isolated from cheddar cheese. Lett Appl Microbiol 29, 136-140 (1999). 27. Christiansen, P., Waagner Nielsen, E., Vogensen, FK, Brogren, CH, Ardo, Y.: Heat resistance of Lactobacillus paracasei isolated from semi-hard cheese made of pasteurised milk. Int Dairy J 16, 1196-1204 (2006). 28. Kluytmans, JA, Overdevest, IT, Willemsen, I., Klytmans-van-den Bergh, MF, van der Zwaluw, K., Heck, M., Rijnsburger, M., Vandenbroucke-Gravis, CM, Savelkout, PH, Johnston, BD, Gordon, D., J ohnson, JR: Extended-spectrum β-lactamase-producing Escherichia coli from retail chicken meat and humans: Comparison of strains, plasmids, resistance genes and virulence factors. Clin Infect Dis 56, 478-487 (2013). 29. Van Reenen, CA, Dicks, LM: Horizontal gene transfer amongst probiotic lactic acid bacteria and other intestinal microbiota: What are the possibilities? A review. Arch Microbiol 193, 157-68 (2011). 30. Fisher, K., Phillips, C.: The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus. Microbiology 155, 1749-57 (2009). Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016

184 RODRIGUEZ ET AL. 31. Kramer, A, Schwebke, I, Kampf, G.: How long do nosocomial pathogens persist on inanimate surfaces? A systematic review. BMC Infect Dis 6, 130 (2006). 32. Gardinier, BJ, Tai, AY, Kotsanas, D., Francis, M., Roberts, SA, Ballard, SA, Junckerstorff, RK, Korman, TM: Eggerthella lentabacteremia: Clinical and microbio- logical characteristics. J Clin Micro 53, 626-635 (2015). 33. Claesson, MJ, Jeffery, IB, Conde, S., Power, SE, O'Connor, EM, Cusack, S., Harris, HM, Coakley, M., Lakshminarayanan, B., O'sullivan, O., Filzgerald, GF, Deane, J., O'Connor, M., Harnedy, N., O'Connor, K., O'Mahony, D., Van Sideren, D., Wallace, M., Brennan, L., Stanton, C., Marchesis, JR, Fitzgerald, AP, Shanahan, F., Hill, C., Ross, RP, O'Toole, PW: Gut microbiota composition correlates with diet and health in the elderly. Nature 9, 178-184 (2012). 34. Zapata, HJ, Quagliarello, VJ: The microbiota and microbiome in aging: Potential implications in health and age related diseased. J Am Geriatr Soc 63, 776-781 (2015). 35. Bartosch, S., Fite, A., Macfarlane, GT, McMurdo, ME: Characterization of bacterial communities in feces from healthy elderly volunteers and hospitalized elderly patients by using real-time PCR and effects of antibiotic treatment on the fecal microbiota. Appl Environ Microbiol 70, 3575-3581 (2004). Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 63, 2016

Translatedcopyof030.63.2016.2.3.PDF

Recommend Documents