I.
INTRODUCCION:
El género Streptococcus es un grupo formado por diversos cocos grampositivos que normalmente se disponen en parejas o en cadenas. La mayoría de las especies son anaerobios facultativos, y algunos crecen únicamente en una atmósfera enriquecida con dióxid dióxidoo de carbono carbono (crecim (crecimien iento to capnofí capnofíli lico). co). Sus exigen exigencia ciass nutric nutricion ionale aless son complejas, y su aislamiento requiere el uso de medios enriquecidos con sangre o suero. Son capaces de fermentar hidratos de carbono, proceso que produce ácido láctico, y son catalasa-negativos, a diferencia de las especies del género Staphylococcus. La especie más importante de los estreptococos del grupo A es S. pyogene pyogenes. s. S. pyogenes origina diversas enfermedades supurativas y no supurativas. Aunque este
microorganismo constituye la causa más frecuente de faringitis bacteriana, la fama de estos microorganismos se debe a las llamativas enfermedades potencialmente mortales provocadas por estas bacterias necrosantes. (1) Las cepas de S. pyogenes son cocos esféricos de diámetro comprendido entre 1 y 2 mm que forman cadenas cortas en las muestras clínicas y cadenas de mayor longitud cuando crecen en medios de cultivo. Su crecimiento es óptimo en el medio de agar sangre enriquecido, pero se inhibe cuando contiene una concentración elevada de glucosa. (1) Los enterococos («cocos entéricos») se clasificaron previamente como estreptococos del grupo D debido a que poseen el antígeno de la pared celular del grupo D, un ácido teicoico con glicerol que se asocia a la membrana citoplásmica. (2) A pesar de este dato, se observó que estos microorganis microorganismos mos diferían diferían de los restantes estreptococos estreptococos del grupo grupo D (cono (conoci cidos dos como como estr estrept eptoc ococo ocoss del grupo grupo D no ente enteroc rocóc ócíc ícos os [p. [p. ej., ej., Streptococcus bovis]). Los grupos enterocócícos y no enterocócícos se diferenciaron
inicialmente por sus propiedades fisiológicas y a través del análisis de ácidos nucleicos. En el año 1984, los enterococos se clasificaron en el nuevo género Enterococcus, el cual consta actualmente de 29 especies. Las especies que se aíslan con una mayor frecuencia y que son clínicamente clínicamente las más importantes importantes son Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium. (1)
Los enterococos son cocos grampositivos que típicamente se disponen en parejas o en cadenas cortas. A menudo, la morfología microscópica de estos microorganismos no se puede distinguir de la de Streptococcus pneumoniae. (2) Son anaerobios facultativos y su temperatura óptima de crecimiento es de 35°C, aunque la mayor parte de las cepas pueden crecer en un intervalo de temperatura comprendido entre 10 °C y 45 °C. Los enterococos son exigentes desde el punto de vista nutricional, ya que requieren vitaminas B, bases de ácidos nucleicos y una fuente de carbono como la glucosa. Los enterococos son microorganismos comensales que no fabrican ninguna toxina potente ni otro factor de virulencia definido. En consecuencia, por lo general se considera que estas bacterias poseen una limitada capacidad patógena, aunque las enfermedades potencialmente mortales, en especial en sujetos hospitalizados, se han convertido en un grave problema. (1) Neisseria gonorrhoeae es un agente etiológico de gonococia, enfermedad de
transmisión sexual. Es un diplococo gram negativo, oxidasa positivo. Requiere medios muy nutritivos para el crecimiento, como agar chocolate. Igualmente para su cultivo requiere una atmósfera con 5% de CO2. Las Neisseriaceae constituyen una familia de bacterias Gram-negativas con algunas características similares a las pseudomonas. Las neisserias son pequeños cocos Gramnegativos que usualmente se presentan en pares enfrentados de forma arriñonada. La mayor parte de ellos son comensales que viven en las membranas mucosas de los mamíferos. En humanos son residentes usuales del tracto respiratorio superior y de la garganta, siendo Neisseria gonorrhoeae una de las especies patógenas para el hombre.
II.
OBJETIVO:
Preparar los medios de cultivo, reactivos y material de laboratorio que se utilizan en la identificación de los géneros Streptococcus, así como saber identificar el agente causal de las patologías más frecuentes por medio de técnicas especiales, bioquímicas y serológicas.
III.
MATERIAL Y PROCEDIMIENTO: 1. Materiales: Material biológico:
S. pyogenes.
Enterococos (agua de albañal).
S. pneumonie (lámina montada).
Neisseria gonorrhoeae.
Material de vidrio:
Placas Petri.
Tubos de ensayo.
Balones.
Matraces.
Probetas.
Pipetas.
Medios de Cultivo:
Agar Sangre.
Caldo Tioglicolato.
Agar Glucosa Azida.
Caldo Violeta de Etilo Azida..
Agar Chocolate
Otros:
Asas bacteriológicas.
Mechero.
Cocina eléctrica.
Encendedor.
Franela.
Marcador.
Hisopos.
2. Procedimiento:
Caldo glucosa azida:
Extracto de carne
4.8g
Peptona de caseína
15g
Glucosa
7.5g
NaCl
7.5g
Sodio azida
0.2g
Agua destilada
1000ml
pH: 7.2 ± 0.2
− Disolver, distribuir y esterilizar en autoclave (121° C por 15 minutos). ¡No recalentar! El medio de cultivo preparado es claro y amarillento. − Pequeñas cantidades de la muestra a ensayar (1ml), se incorporan en el caldo. Incubación a 37° C por 24 – 48 horas. Muestra: agua de albañal.
Caldo Violeta de Etilo Azida (EVA):
Bactotriptosa
10g
Dextrosa
5g
K 2HPO4
2.7g
KH2PO4
2.7g
NaCl Sodio azida Violeta de etilo Púrpura de bromocresol Agua destilada
5g 0.4g 0.00083g 15mg 1000ml
pH: 7.0 ± 0.1
− Disolver, distribuir y esterilizar en autoclave, el medio de cultivo preparado es claro y de color violeta
− Debido al intenso efecto inhibidor de éste cultivo, conviene sembrarlo masivamente. Incubación a 37° C hasta las 48 horas. Muestra: agua de albañal.
Caldo tioglicolato:
Caseína Extracto de levadura
15g 5g
Glucosa
5.5g
Cisteína
0.5g
NaCl
2.5g
Tioglicolato de sodio
0.5g
Rezarsurina sódica
0.001g
Agar
0.75g
Agua destilada
1000ml
pH: 7.1 ± 0.1
− Disolver, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave. Los medios de cultivos preparados son claros y de color amarillento. El medio de cultivo ya no puede utilizarse cuando esté de color rosa debido a la penetración de oxígeno, en más del tercio superior de la altura del medio y cuando dicha coloración no quede eliminada por ebullición. (una sola vez). − La muestra, el hisopado faríngeo, se siembra en profundidad en el medio de cultivo. Incubación, varios días y a temperatura óptima.
Agar sangre:
Agar Nutritivo ………………………….. 100ml Sangre desfibrinada de humano…………. 5-10% El agar nutritivo convenientemente esterilizado al autoclave se enfrió a 45º C y se agregó sangre desfibrinada, en una concentración del 5%. El agar luego se sirvió en placas Petri estériles. De una muestra obtenida por hisopado faríngeo se sembró por
estría S.pyogenes en un área estéril ayudada por el mechero. Dejamos incubar a 37º C por espacio de 24-48h. Luego de esto leímos los resultados.
Pruebas hostiles: CALDO TRIPTOSA:
Triptosa
10g
Extracto de carne
3g
NaCl
5g
Agua destilada
1000ml
pH: 7.0 ± 0.1
FASES: -
Enriquecimiento selectivo; sembrar en caldos EVA y glucosa azida ( potente inhibidor de toda la flora bacteriana Gram negativa)
-
Fases de aislamiento; en agar glucosa azida o en frasco inclinado (cultivo puro)
-
Pruebas hostiles; después de 2 días se siembran:
CALDO TRIPTOSA + BILIS DE BUEY AL 4.0 %:
En 50ml de caldo triptosa preparado agregamos bilis de buey al 40% y enseguida servimos en tubos de 13x100 en razón de 5ml por tubo llevamos a autoclave a 121º C x 15´a 15 lb de presión. Dejamos enfriar y del cultivo puro obtenido después de las identificaciones bioquímicas correspondientes sembramos enterococos en el caldo para ver su posterior resultado en este medio hostil.
CALDO TRIPTOSA A 45º C y pH 7
Servimos caldo triptosa en tubos de 13x100 en razón de 5ml por tubo llevamos a autoclave a 121º C x 15´a 15lb de presión. Dejamos enfriar y del cultivo puro obtenido después de las identificaciones bioquímicas correspondientes sembramos
enterococos en el caldo y lo sometemos a Temperatura de 60º C manteniendo un pH 7. Luego de esto dimos lectura a los resultados en este medio hostil. CALDO TRIPTOSA + NaCl 6.5%
En 50ml de caldo triptosa preparado agregamos NaCl al 6.5% y enseguida servimos en tubos de 13x100 en razón de 5ml por tubo llevamos a autoclave a 121º C x 15´a 15lb de presión. Dejamos enfriar y del cultivo puro obtenido después de las identificaciones bioquímicas correspondientes sembramos enterococos en el caldo para ver su posterior resultado en este medio hostil. CALDO TRIPTOSA A pH 9
En 50ml de caldo triptosa preparado ajustamos el pH a 9 y enseguida servimos en tubos de 13x100 en razón de 5ml por tubo llevamos a autoclave a 121º C x 15´a 15lb de presión. Dejamos enfriar y del cultivo puro obtenido después de las identificaciones bioquímicas correspondientes sembramos enterococos en el caldo para ver su posterior resultado en este medio hostil.
AGAR CHOCOLATE
Lleva como base agar nutritivo, al que se agrega sangre desfibrinada cuando el medio está a una temperatura de aproximadamente 80º C. El calentamiento tiene como fin la liberación de los factores X (hemina) y V (difosfo-piridínadenín nucleótido), necesarios para el desarrollo de algunos microorganismos. Está especialmente indicado para Neisseria y Haemophilus. - Se obtiene la muestra - Luego se procede a realizar una coloracion simple “Gram” - Posteriormente, se procedió a la observación microscópica. - Luego la bacteria N. gonorrhoeae se aislo en el medio de cultivo Agar chocolate para luego proceder a la lectura.
Luego la bacteria N. gonorrhoeae se aislo en el medio de cultivo Agar chocolate para luego proceder a la lectura.
IV.
RESULTADOS:
1. Caldo glucosa azida: Resultados:
-Se produce turbidez. -Color amarillo turbio. -Posible enterococo. -Presencia de un botón.
2. Caldo Violeta de Etilo Azida (EVA): Resultados:
-Se produjo acidez. -Viraje de color (de púrpura a amarillo verdoso). - Presencia de un botón. -Posible enterococo.
3. Caldo tioglicolato:
Presencia de Streptococcus
Crece en la pared del tubo formando grumos.
4. Aislamiento en agar sangre:
- Se observaron colonias β hemolíticas β - hemolítico: halo trasparente.
- Degradan la hemoglobina - Colonias pequeñas, puntiformes, grisáceas y de bordes regulares.
5. Pruebas hostiles:
-
De izquierda a derecha:
NaCl 6,5% SALES BILIARES 4.0%Presencia
pH 9
pH 7 a 45º
TTO. botónTERMICO 30º
dePresencia de dePresencia de blanco en el fondoPresencia botón blanco en botón blanco en Presencia de botón tubo, botón blanco en el cremoso en elel fondo del tubo:el fondo deldel fondo del tubo, no sedimento: fondo del tubo:crecimiento detubo: deforma esporas crecimiento deenterococos. crecimiento decrecimiento enterococos. enterococos. enterococos.
6. Neisseria gonorrhoeae
Observaciones microscópicas:
Neisseria gonorrhoeae
Aumento: 100X
Observaciones macroscópicas:
V.
COMENTARIOS:
•
Caldo glucosa azida:
Medio para el ensayo previo orientativo de enterococos y para el enriquecimiento selectivo de los mismos. La azida sódica está presente en una concentración que respeta al máximo a los enterococos e inhibe notablemente a la flora gramnegativa que las puede acompañar. La aparición de turbidez durante la incubación (crecimiento) permite sospechar la presencia de Enterococos. En éste caso para su confirmación, se resiembra en caldo EVA. Si no se presenta turbidez alguna, puede desecharse con seguridad la presencia de Enterocos. •
Caldo Violeta de Etilo Azida (EVA):
Medio para la confirmación de la presencia de Enterococos, especialmente en la investigación bacteriológica de aguas. La azida sódica inhibe toda la flora acompañante que eventualmente hubiera podido desarrollarse en el ensayo previo. Los Enterococos fermentan la glucosa que contiene éste medio, formando ácido, lo que se hace patente por el viraje hacia el amarillo que sufre el indicador de pH púrpura de bromocresol. La utilización de éste caldo ha sido prevista sobre todo en conexión con el ensayo previo mediante el caldo glucosa azida. •
Medio tioglicolato:
Medio para el cultivo y aislamiento de anaerobios estrictos y facultativos, de gérmenes microaerófilos y para ensayos de esterilidad. Las sustancias reductoras, tioglicolato y cisteína, proporcionan una anaerobiosis suficiente, incluso para anaerobios exigentes. Debido a sus grupos sulfihidrilos, se inactivan los compuestos de arsénico, mercurio y de otros metales pesados. Los medios con tioglicolato son adecuados, por lo tanto, para la investigación de materiales pesados o conservantes en cuya composición participen dichos metales pesados. La elevada viscosidad del medio de cultivo tioglicolato impide la penetración rápida de oxígeno. El eventual aumento del contenido de oxígeno
se pone de manifiesto por un viraje a rojo del indicador Redox rezarsurina sódica. •
Agar sangre:
Este medio constituye un medio enriquecido que permite el aislamiento y cultivo de microorganismo sumamente exigente. Además permite observar el tipo de degradación (hemólisis) de la hematina. •
Caldo triptosa:
Para enriquecimiento,
aislamiento,
cultivo
y
diferenciación de
los
microorganismos de esta familia se utiliza este medio; pero sobre todo para su diferenciación se utilizan las pruebas hostiles que consisten en añadir sustancias al caldo que inhiben el crecimiento de otros microorganismos siendo tolerables para los Streptococcus. •
La densidad bacteriana es menor en las zonas anteriores de la boca y la cavidad bucal (particularmente la saliva) se encuentra colonizada por bacterias que inhiben el crecimiento de S. pyogenes. Por tanto, la contaminación de una muestra bien recogida puede enmascarar o inhibir el crecimiento de S. pyogenes
•
Es importante el empleo de sangre de carnero al 5 %, porque inhibe el desarrollo de Haemophilus hemolyticus, que muchas veces se confunde con el estreptococo por presentar β-hemólisis. No debe emplearse sangre humana, porque puede contener anticuerpos y antibióticos que inhiben el desarrollo del estreptococo.
•
Algunas cepas de S. pyogenes forman una cápsula externa de ácido hialurónico que contiene moléculas repetidas de ácido glucurónico y N-acetilglucosamina. La cápsula no se diferencia a nivel antigénico del ácido hialurónico presente en los tejidos conjuntivos de mamífero, de modo que permite evitar la fagocitosis de las bacterias. Es probable que las cepas encapsuladas de esta especie originen infecciones sistémicas graves.
•
Las bacterias piógenas comprenden un amplio número de organismos en el cual depende cada una del medio de donde puedan obtener las fuentes de nutrición necesarias para cada una pueda lograr un desarrollo optimo.
•
El pus es el resultante de la batalla entre los fagocitos (neutrófilos) y las bacterias invasoras. A medida que las bacterias son ingeridas y muertas por los fagocitos los mismos eventualmente se lisan y liberan su contenido que, junto a los productos de digestión de las bacterias, constituyen el principal material del pus.
•
Por otra parte como una defensa contra los fagocitos los estreptococos y estafilococos producen toxinas que matan los neutrófilos antes de que ingieran las bacterias contribuyendo al aumento del pus.
•
La mínima cantidad de ésta forma un exudado inflamatorio purulenta causada por bacterias piógenas como Pseudomona, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus. Los cuales se aislaron y cultivaron en el laboratorio en medios generales, selectivos y diferenciales
•
El medio de cultivo para Neisseria gonorrhoeae necesita CO2 y el crecimiento es lento, por lo tanto para diagnóstico se realiza un examen directo con coloración Gram, el cual se observo al microscopio en práctica.
•
En las observaciones microscópicas, se pudo observar las diferentes formas de agrupaciones como en el caso de Neisseria gonorreae se pudo observar la característica esencial de esta bacteria, la forma de diplococo.
VI.
REFERENCIA BIBLIOGRAFICA:
1. MURRAY, PATRICK R.;ROSENTHAL, KEN S.;PFALLER, MICHAEL A. Microbiología Medica. Quinta edición. Editorial
Harcourt Brace-Elsevier.
Madrid, España. 2006. 2. PUMAROLA A.,RODRÍGUEZ TORRES A., PIEDRAHITA ANGULO G., GARCIA RODRÍGUEZ J. A. Microbiología y Parasitología Medica. Segunda Edición. Editorial Masson. Barcelona, España. 1995. 3. Madigan M. T., Martinko J.M., Parker J. BROCK MICROBIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS. Editorial Grafillos.1997. 4. JAWETZ, E., J. MELNICK Y E. ADELBERG. 2005. Microbiología Médica. 18va Ed. Editorial el Manual Moderno S.A. México. 5. ALICE LARRAINE, SMITH. 1980. Fundamentos de Microbiología. 8º va ed. Ediciones Universidad de Navarra, S.A. Pamplona España. 6. Koneman, E.W., S.D. Allen, W.M. Janda, P.C. Schreckenberger y W.C. Winn. "DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO. Texto y atlas en color". 5ª Editorial. Panamericana, 1997. 7. Raquel Granados Pérez y M a Carmen Villaverde Peris. MICROBIOLOGÍA. Editorial Paraninfo.1997.
