Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat p engukur intensitas ca haya yang ditrans misikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Kelebihan spektrofotometer dibandingka dibandingka n fotometer fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih lebih dapat terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma, grating ataupun celah optis. Pada fotometer filter, sinar dengan panjang gelombang yang diinginkan diperoleh dengan berbagai filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada fotometer filter, tidak mungkin diperol eh panjang gelomban g yang benar-benar benar-benar monokromatis, melainkan suatu trayek panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada spektrofotometer, panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blangko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan blangko ataupun pembanding. Suatu grafik yang menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi (panjang gelombang) sinar merupak an spektrum absorpsi. Transisi yang diboleh kan untuk suatu molekul dengan struktur kimia yang berbeda adalah tidak sama sehingga spektra absorpsinya juga berbeda. Dengan demikian, spektra dapat digunakan sebagai bahan informasi yang bermanfaat u ntuk analisis ku alitatif. Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada panjang gelombang tertentu sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi, sehingga spektra absorpsi j uga dapat dig unakan untuk analisis kuantitatif. kuantitatif. Semua molekul dap at mengabsorpsi radiasi daerah UV-Vis UV-Vis karena mereka mengandung elektron, baik sekutu maupun menyendiri, yang dapat dieksitasikan ke tingkat energi yang lebih tinggi (Underwood, 2002).
Hukum Lambert ± Beer Hukum Lambert ± Beer digunakan untuk radiasi monokromatik, dimana absorbansi sebanding dengan tebal medium (b (b) dan konsentrasi (c (c) senyawa yang mengabsorbsi. Hal ini dapat dinyatakan dengan persamaan sebagai berikut : A = a.b.c ««««««««««««««««««..(2.1) Dimana a adalah faktor kesebandingan yang disebut absorptivitas. Besarnya dan ukuran dari a tergantung pada satuan untuk b untuk b dan c. Untuk larutan dari senyawa yang mengabsorpsi,
b sering diberikan dalam centimeter dan c dalam gram per Liter. Maka absorptivitas -1
-1
dalam satuan L.g .cm (Skoog, DA, 1996). Ketika persamaan (2.1) dinyatakan dalam mol per liter dan tebal medium dalam centimeter, absorptivitas disebut molar absorptivitas dan diberi simbol khusus yaitu?. Jadi, ketika b adalah centimeter dan c dalam mol per Liter maka persamaannya adalah sebagai berikut : A = ?.b.c«««««««««««««««««««««««.(2.2) -1
-1
Dimana ? dalam satuan L.mol .cm (Skoog, DA, 1996).
K eterbatasan Hukum Lambert ± Beer
Beberapa pengecualian ditemukan untuk menyamaratakan absorbansi sebagai garis lurus. Di sisi lain, penyimpangan dari perbandingan langsung diantara absorbansi dan konsentrasi ketika b adalah konstan seringkali ditemukan. Beberapa penyimpangan ini adalah dasar dan menunjukkan keterbatasan yang nyata dari hukum ini (Skoog, DA, 1996).
Instrumentasi untuk Spektrofotometri
Spektrofotometer adalah suatu instrumen untuk mengukur
transmitan / absorbans
suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang, pengukuran terhadap sederetan sampel pada suatu panjang gelombang tunggal. Komponen utama dari spektrofotometer dapat dilihat pa da gambar sebagai berikut :
Terlihat bahwa inti dari pekerjaan dengan spektrofotometer UV-Vis adalah SINAR. dimana sinar berasal dari dua lampu yang berbeda, yaitu lampu wolfram untuk sinar Visible (sinar tampak = 38 ± 780nm) dan lampu deuterium untuk sinar Ultra Violet (180-380nm) pada video lampu yang besar. Kedua yang diperlukan ad alah pembaur caha ya yang kerennya disebut monokromator yang di video memberikan sinar pelangi, karena dari sana lah kemudian kita bisa memilih panjang gelombang yang diinginka/diperlukan. Pada video yang diperlihatkan sinar tampak
atau untuk spektro visible, tapi untuk UV pun kerjanya sama, hanya saja tidak akan terlihat oleh mata kita. Ketiga adalah tempat sampel atau kuvet, divideo ada dua karena alat yang dipakai tipe double beam, disanalah kita menyimpan sample dan yang satu lagi untuk blanko. yang keempat adalah detektor atau pembaca cahaya yang diteruskan oleh sampel, disini terjadi pengubahan data sinar menjadi angka yang akan ditampilkan pada reader. komponen lain yang nampak p enting adalah cermin-cermin dan tentunya slit (celah kecil) untuk membuat sinar terfokus dan tidak membaur tentunya, jadi satu hal penting dalam pekerjaan dengan spektrofotometer Uv-Vis adalah harus dihindari adanya cahaya yang masuk ke dalam alat, biasanya pada saat menutup tenpat kuvet, karena bila ada cahaya lain otomatis jumlah cahaya yang diuku r menjadi bertambah. Instrumen
Spektrofotometer
Pada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer, yaitu single-beam dan double-beam. gambar S ingle-beam instr ument dan Double-beam instr ument Single-beam instrument
S ingle-beam instr ument dapat digunakan untuk kuantitatif dengan mengukur absorbansi pada panjang gelombang tunggal. S ingle-beam instr ument mempunyai beberapa keuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan mengurangi biaya yang ada merupakan keuntungan yang nyata. Beberapa instrumen menghasilkan singlebeam instr ument untuk pengukuran sinar ultra violet dan sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah 190 sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000 nm (Skoog, DA, 1996). Double-beam
instrument
Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang 190 sampai 750 nm. Double-beam instr ument dimana mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan cermin yang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati larutan blangko dan sinar kedua secara serentak melewati sampel, mencocokkan fotodetektor yang keluar menjelaskan perbandingan yang ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh alat pembaca (Skoog, DA, 1996). Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri UV-Vis
Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri UV-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri visibel karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang berwarna. Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus diperhatikan : P embent ukan
molekul yang dapat men yer ap sinar UV -V is
Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah tersebut. Cara yang diguna kan adalah dengan merubah menja di senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu : 1. Reaksinya selektif dan sensitif. 2. Reaksinya cepat, kuantitatif, dan reprodusibel. 3. Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama. 4. Waktu operasional Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan. P emilihan
panjang gel ombang
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang maksimal, yaitu : 1. Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar. 2. Disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum
lambert-beer akan terpenuhi.
3. Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang maksimal. K euntungan
Spektrofotometer
Keuntungan dari spektrofotometer adalah : 1. Penggunaannya luas, dapat digunakan untuk senyawa anorganik, organik dan biokimia yang diabsorpsi di daerah ultra lembayung atau daerah tampak. 2. Sensitivitasnya tinggi, batas deteksi untuk mengabsorpsi pada jarak 10 -5
sampai 10
M. Jarak ini dapat diperpanjang menjadi 10
-6
sampai 10
-7
-4
M
dengan prosedur modifikasi yang pasti. 3. Selektivitasnya sedang sampai tinggi, jika panjang gelombang dapat ditemukan dimana analit mengabsorpsi sendiri, persiapan pemisahan menjadi tidak perlu. 4. Ketelitiannya baik, kesalahan relatif pada konsentrasi yang ditemui dengan tipe spektrofotometer UV-Vis ada pada jarak dari 1% sampai 5%. Kesalahan tersebut dapat diperkecil hingga beberapa puluh persen dengan perlakuan yang khusus. 5. Mudah, spektrofotometer mengukur dengan mudah dan kinerjanya cepat dengan instrumen modern, daerah pembacaannya otomatis (Skoog, DA, 1996).
