SNI 2332.3:2015 2332.3:2015
Cara Cara uji uji m ikro ikrobi bi olog ologii - Bagi Bagia a n 3: Penen Penentu tuan an Ang Ang ka Lem Lempe peng ng Tota Totall (ALT (ALT)) pa da prod produ u k peri perik k anan anan
1
Ruang Ruang lingku lingku p
Metode penentuan penentuan angka lempeng lempeng total ini digunakan digunakan untuk untuk menentukan menentukan jumlah total total mikroorgani mikroorganisma sma aerob dan anaerob pada produk perikanan. perikanan.
2
Istilah dan definisi
2.1 angka angka lempe lempe ng t otal otal aerob jumlah mikroorganisma mikroorganisma hidup yang membutuhkan oksigen yang terdapat dalam suatu produk produk yang yang diuji diuji 2.2 angka angka lempe lempe ng t otal otal anaerob jumlah organisme yang dapat hidup tanpa oksigen 2.3 inkubasi pengkondisian pengkondisian mikroo mikroorganis rganisma ma untuk tumbuh dan dan berkembang berkembang biak sesuai dengan dengan suhu suhu dan waktu yang diperlukan 2.4 kondisi anaerob kondisi tanpa oksigen 2.5 koloni sel mikroba mikroba yang yang tumbuh tumbuh pada media media agar dan dapat dapat dilihat dilihat secara secara visual visual 2.6 media agar media padat yang digunakan digunakan untuk pertumbuhan pertumbuhan mikrorganism mikrorganisme e 2.7 produk perikanan perikanan ikan termasuk termasuk biota perairan perairan lainnya lainnya yang ditangani dan/atau dan/atau diolah untuk dijadikan dijadikan produk akhir yang berupa berupa ikan segar, segar, ikan beku beku dan olahan lainnya lainnya yang digunakan digunakan untuk untuk konsumsi konsumsi manusia 2.8 mesofilik kelompok kelompok mikroorgani mikroorganisme sme yang hidup pada suhu 20 °C – 40 °C dengan suhu optimum 35 °C 2.9 termofilik kelompok kelompok mikroorgani mikroorganisme sme yang hidup pada suhu 45 °C – 65 °C dengan suhu optimum 55 °C
© BSN BSN 2015 2015
1 dari dari 12
SNI 2332.3:2015 2332.3:2015
3
Prinsip
Mikroo Mikroorga rganis nisme me ditumbu ditumbuhka hkan n dengan dengan metode metode agar tuang, tuang, diinku diinkubasi basikan kan dalam dalam kondis kondisii aerob atau anaerob pada suhu dan waktu yang sesuai hingga tumbuh dan berkembang biak dengan membentuk membentuk koloni yang dapat dapat dihitung. dihitung.
4
5
Peralatan alat penghitung penghitung koloni, koloni, anaero anaerobic bic jar ; autoclave, autoclave, blender beserta beserta jar yang yang dapat dapat disteri disterilisas lisasii atau sthomacher, sthomacher, botol pengencer pengencer 20 mL, cawan cawan petri petri 15 mm x 90 mm, inkubat inkubator or 35 °C ± 1 °C, inkubat inkubator or 45 °C ± 1 °C, pipet pipet gelas elas atau pipe pipetor tor:: 0,1 mL, 1 mL, mL, 5 mL, mL, dan dan 10 mL, timbangan dengan ketelitian 0,0001 g, waterbath sirkulasi sirkulasi suhu suhu 45 °C ± 1 °C.
Media dan pereaksi bacto agar ; fluid thioglycolate medium, medium,
gas pack pack dan anaerobic anaerobic indicator indicator strips strips, larutan butterfield’s phosphate buffered, buffered, mineral oil, oil, nutrie nutrient nt agar ; peptone water ; plate count agar ; trypti tryptic c soy agar .
6
Kondisi
Pada metode metode cawan cawan agar tuang, untuk menghindari menghindari berkurang berkurangnya nya populasi populasi bakteri bakteri akibat panas yang berlebihan berlebihan maka media media agar diletakkan diletakkan terlebi terlebih h dahulu padawaterbath yang akan dituang dituang mempunyai mempunyai suhu suhu 45 °C ± 1 °C sebelum sebelum digunakan. digunakan. Pros Proses es penua penuanga ngan n medi media a aga agarr dila dilaku kuka kan n dal dalam am wakt waktu u mak maksi simal mal 15 meni menitt sete setela lah h pengenceran awal.
7
Preparasi Preparasi conto h
Dengan menerapkan menerapkan teknis aseptis, aseptis, contoh diambil diambil secara secara acak dan dipotong dipotong kecil-k kecil-kecil ecil hingga berat masing-masing contoh yang akan diuji sesuai ketentuan pada Tabel 1. Contoh beku dilelehkan pada saat akan dianalisa dan pelelehan dilakukan selama 18 jam jam pada suhu sekitar sekitar 2 °C – 5 °C atau suhu di bawah 45 °C dan tidak lebih dari 15 menit. menit.
© BSN BSN 2015 2015
2 da ri ri 1 2
SNI 2332.3:2015 2332.3:2015
Tabel Tabel 1 - Be rat conto conto h yang yang diambil diambil yang yang akan diuj diuj i Berat Berat conto conto h < 1 kg atau 1 L 1 kg atau 1 L – 4,5 kg atau 4,5 L > 4,5 kg atau 4,5 L
8
Prosedur
8.1
Berat Berat conto conto h yang yang akan diuji diuji 100 g atau 100 mL 300 g atau 300 mL 500 atau 500 mL
Persiapan Persiapan penguj ian
a) Untu Untuk k cont contoh oh denga dengan n bera beratt lebi lebih h keci kecillatau sama dengan 1 kg atau 1 L sampai dengan 4,5 kg atau atau 4,5 L timbang timbang contoh contoh padat sebanyak sebanyak 25 g atau atau contoh contoh cair sebanyak sebanyak 25 mL dari contoh yang akan akan diuji, diuji, kemudian kemudian masukkan masukkan dalam wadah atau plastik plastik steril steril dan tambahkan 225 mL LarutanButterfield’s LarutanButterfield’s Phosphate Buffered. b) Untu Untuk k cont contoh oh dengan dengan bera beratt lebi lebih h besa besarr dari dari 4,5 4,5kg atau 4,5 L timbang contoh padat sebany sebanyak ak 50 g atau atau contoh contoh cair cair sebany sebanyak ak 50 mL, kemudia kemudian n masu masukka kkan n dala dalam m wadah wadah atau plastik steril dan tambahkan 450 mL Larutan Butterfield’s Phosphate Buffered. Buffered. c) Homogen Homogenkan kan selama selama 2 menit. menit. Homogen Homogenat at ini merupak merupakan an laruta larutan n dengan dengan pengenc pengencera eran n 10-1. d) Deng Dengan an menggun menggunak akan an pipet pipet ster steril il,, ambi ambill 10 mL homo homogen genat at diat diatas as dan masuk masukka kan n ke dalam 90 mL Larutan Larutan Butterfield’s Butterfield’s Phosphate Phosphate Buffered Buffered untuk mendapatkan mendapatkan pengenceran pengenceran 10-2. -3 e) Siapka Siapkan n pengence pengenceran ran selanj selanjutny utnya a (10 ) dengan dengan menga mengambi mbill 10 mL mL contoh contoh dari dari -2 pengenceran 10 ke dalam 90 mL Larutan Butterfie Butterfield’s ld’s Phosphate Phosphate Buffered. Buffered. f) Pada setiap setiap pengencera pengenceran n dilakukan dilakukan pengocokan pengocokan minimal 25 kali. g) Selanj Selanjutny utnya a lakuka lakukan n hal yang yang sama sama untu untuk k pengenc pengencera eran n 10-4, 10-5 dst sesu sesuai ai deng dengan an kondisi contoh. 8.2 8.2.1 8.2.1
Tahapan penguj ian ALT aerob aerob
a) Pipet Pipet 1 mL dari dari setiap pengenc pengencera eran n diatas danmasukk masukkan an ke dalam dalam cawan cawan petri steril steril.. Lakukan Lakukan secara duplo untuk setiap setiap pengenceran. pengenceran. b) Tambahk Tambahkan an 12 mL - 15 mL PCA ke dalam dalam masingmasing-mas masing ing cawan cawan yang yang sudah sudah berisi berisi contoh. Supaya contoh dan media PCA tercampur tercampur sempurna, sempurna, lakukan lakukan pemutara pemutaran n cawan cawan ke depan-ke belakang dan ke kiri-ke kanan. c) Inkuba Inkubasi si cawa cawan-c n-cawa awan n terse tersebut but dalam dalam posisi posisi terbal terbalik. ik. Masukk Masukkan an ke ke dalam dalam inkuba inkubator tor pada suhu suhu 35 °C °C ± 1 °C untuk untuk bakter bakterii mesofi mesofilik lik atau atau pada suhu suhu 45 °C °C ± 1 °C untuk untuk bakteri bakteri termofi termofilik lik selama 48 jam jam ± 2 jam. 8.2.1 8.2.1
ALT anaero anaerob b
a) Tuang Tuang 6 mL - 7 mL media media (PCA/N (PCA/NA/T A/TSA) SA) ke dalam dalam cawan cawan petri petri steri steril, l, sebark sebarkan an dengan dengan cepat dan ratakan. ratakan. b) Pada Pada saat saat medi media a agar agar tela telah h mem membe beku ku,, pipe pipett seca secara ra as aseptik eptik 1 mL cont contoh oh yang yang tela telah h homogen dari masing-masing pengenceran pada bagian tengah tengah cawan petri. Lakukan secara duplo. c) Tuan Tuangk gkan an 15 mL mL Thioglycolate agar ke dalam dalam cawa cawan n pet petri ri.. Camp Campur ur denga dengan n bai baik k dan dan putar dengan hati-hati. hati-hati. © BSN BSN 2015 2015
3 dari dari 12
SNI 2332.3:2015 2332.3:2015
d) Inku Inkuba basi si caw cawanan-ca cawa wan n ters terseb ebut ut dalam dalam posi posisi si tid tidak ak terb terbal alik ik dala dalam m anaer anaerobi obic c jar dan masukk masukkan an kedala kedalam m inkubat inkubator or pada pada suhu 35 °C ± 1 °C untuk untuk bakter bakterii mesofi mesofilik lik atau atau 45 °C ± 1 °C untu untuk k bakter bakterii termof termofili ilik k selama selama 48 48 jam ± 2 jam.
9 9.1
Pembacaa Pembacaa n dan perhitung perhitung an koloni pada cawan petri petri Cawan Cawan yang mengand ung juml juml ah 25 kol oni – 250 kol oni dan dan bebas spreader
Catat pengenceran pengenceran yang yang digunakan digunakan dan hitung hitung jumlah total total koloni. koloni. Perhitungan Perhitungan ALT ALT sebagai berikut: Catat pengenceran pengenceran yang yang digunakan digunakan dan hitung hitung jumlah total total koloni. koloni. Perhitungan Perhitungan ALT ALT sebagai berikut:
Keterangan: N jumlah koloni koloni produk, produk, dinyatak dinyatakan an dalam koloni per mL atau atau koloni per g; C jumlah koloni pada semua cawan yang dihitung; n1 jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung; n2 jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung; d pengenceran pertama yang dihitung.
CONTOH: Pengenceran Jumlah koloni
9.2
1:100 232 dan 244
1:1000 33dan 33dan 28
Cawan Cawan dengan jumlah jumlah koloni lebih besar dari 250 koloni
Bila jumlah jumlah koloni per per cawan lebih lebih besar dari 250 koloni koloni pada seluruh seluruh pengenceran pengenceran maka laporkan laporkan hasilnya hasilnya sebagai terlalu terlalu banyak banyak untuk dihitung dihitung (TBUD), (TBUD), tetapi jika salah satu pengenceran mempunyai jumlah koloni mendekati 250 koloni laporkan sebagai perkiraan ALT. CONTOH: Pengenceran Jumlah koloni Perkiraan ALT koloni per mL atau per g
© BSN BSN 2015 2015
: : :
1 : 100 100 1 :1000 :1000 TBUD 640 640.000
4 da ri ri 1 2
SNI 2332.3:2015 2332.3:2015
9.3
Spreader
Koloni spreader dibedakan menjadi 3 tipe: a) Rantai koloni, koloni, antara koloni saling menyambung menyambung yang disebabkan disebabkan karena bakteri bakteri yang saling mengelompok. b) Spreader berasal berasal dari dari lapisan lapisan air antara agar dan dasar dasar cawan. c) Spreader berasal berasal dari lapisan lapisan air pada sisi/pinggi sisi/pinggirr cawan atau pada pada permukaan agar. agar. Jika cawan ditumbuhispreader ditumbuhi spreader lebih besar dari 25% maka laporkan laporkan sebagaispreader spreader : • Spreader tipe 1, jika hanya ada 1 rantai maka nyatakan nyatakan sebagai 1 koloni. • Jika Jika 1 atau atau lebih lebih rant rantai ai terlihat terlihat berasa berasall dari dari sumber sumber yang yang berbeda berbeda,, lapork laporkan an masingmasingmasing sumber sumber sebagai sebagai 1 koloni. koloni. • Spreader tipe 2 dan 3 umumnya berasal dari koloni yang berbeda dan laporkan masing-masing sebagai 1 koloni. d) Jumlahkan spreader dan koloni koloni untuk menghitung menghitung “ Angk Angka a Le mpeng mpeng T otal otal”” . 9.4
Jumlah koloni semua cawan kurang dari 25 koloni atau cawan tanpa kolon i.
Bila pada kedua pengenceran yang digunakan diperoleh koloni kurang dari 25 koloni, catat koloni yang ada, tetapi nyatakan perhitungan sebagai kurang dari 25 koloni dan dikalikan dengan 1/d, dimana d adalah adalah faktor pengenceran pengenceran pertama pertama yang digunakan digunakan dan dilaporkan dilaporkan sebagai perkiraan ALT. CONTOH: Pengenceran Jumlah koloni
:
1:100 18 dan 0
1:1000 2 dan 0
Perk Perkir iraa aan n ALT ALT kolo koloni ni per per mL atau atau kolo koloni ni per per g
:
< 2.50 2.500 0
< 2.50 2.500 0
10 • •
•
:
Pelaporan Untuk Untuk menghas menghasilk ilkan an perh perhitu itunga ngan n yang yang akurat akurat dan telit teliti, i, maka maka laporka laporkan n hasiln hasilnya ya dengan dengan dua angka (digit) pertama sebagai hasil pembulatan. Bulatkan Bulatkan keatas dengan cara menaikkan menaikkan angka kedua menjadi angka yang lebih tinggi bila bila angka angka ketiga ketiga adalah adalah 6, 7, 8 atau 9 dan gunak gunakan an angka angka 0 untuk masingmasing-mas masing ing angka pada pada digit berikutnya. berikutnya. Bulatk Bulatkan an ke ke bawah bawah bila bila angka angka ketig ketiga a adalah a h 1, 2, 3 atau atau 4. Bila Bila angka angka ketig ketiga a 5, bulatka bulatkan n keatas bila angka kedua ganjil dan bulatkan kebawah bila angka kedua genap. CONTOH: Hasil Hasil perhitungan perhitungan 12.700 12.400 15.500 14.500
•
ALT 13.000 12.000 16.000 14.000
Beri Beri tanda tanda bint bintang ang (*) (*) untuk untuk cawan cawan yang yang kura kurang ng dari dari 25 kolon koloni. i. CONTOH: Pengenceran
:
1:100
1:1000
Jumlah koloni
:
18 dan 0
2 d an 0
Perk Perkir iraa aan n ALT ALT kolo koloniper niper ml atau atau kolo koloniper niper g
:
< 2.50 2.500* 0*
< 2.50 2.500* 0*
© BSN BSN 2015 2015
5 dari dari 12
SNI 2332.3:2015 2332.3:2015
•
Jika Jika selu seluru ruh h caw cawan an beri berisi si spreader atau cawan terkontaminasi oleh sesuatu yang tidak diketahui, diketahui, maka laporkan laporkan hasil sebagai sebagai ’Kegagalan ’Kegagalan dalam pengujian pengujian
Contoh perhitungan: 1. Cawan dengan jumlah koloni 25 koloni – 250 koloni koloni Perhitungan Angka Lempeng Total sebagai berikut: ∑C N=
[(1 x n1 ) + ( 0,1 x n2 ) ] x ( d )
Keterangan:
N
adalah jumlah koloni produk, produk, dinyatakan dinyatakan dalam dalam koloni per mL atau atau koloni koloni per g; adalah jumlah koloni pada semua cawan yang dihitung; adalah jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung; adalah jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung; adalah pengenceran pertama yang digunakan
ΣC n1 n2 d
CONTOH:
N
Pengenceran
:
1:1000
1:1000
Jumlah koloni
:
3 3 d an 2 8
3 3 d an 2 8
= (232 + 244 + 33 + 28) -2 [(1x2) + (0,1x2)]10 = 537 / 0,022 0,022 = 24.409 = 24.000
2. Selur Seluruh uh cawa cawan n beris berisii spreader dan atau kegagalan kegagalan dalam pengujian. pengujian. Laporkan Laporkan hasil sebagai “Spreader “Spreader ” (SPR) (SPR) atau kegag kegagalan alan dala dalam m penguji pengujian an 3. Seluruh Seluruh cawan cawan berisi berisi lebih lebih dari dari 100 koloni/cm koloni/cm2. Perkiraan Perkiraan jumlah ALT adalah lebih besar dari (>) 100 dikalik dikalikan an pengencer pengenceran an terting tertinggi gi dan dan kalikan kalikan dengan luas cawan. Contoh dibawah berdasarkan pada penghitungan rata-rata 110/cm2 CONTOH: pengenceran
:
1:100
1:1000 1:1000
Jumla h koloni
:
TBUD TBUD
7.15 0a 6.490 c
a b c
Perkiraan Perkiraan ALT koloni /mL atau kolo kolo ni/g ni/gb > 6.500. 6.500.000 000 > 5.900. 5.900.000 000
berdasarkan berdasarkan luas area 65 cm2 perkiraan jumlah ALT berdasarkan berdasarkan luas luas area 59 cm2
CATATAN Untuk perhitungan perhitungan koloni koloni yang menggunaka menggunakan n metode metode cawan cawan agar sebar/ spread plate, plate, jumlah koloni koloni yang dihitung dikalikan dikalikan dengan 10 dari pengenceran pengenceran yang digunakan.
11
Keamanan dan keselamatan kerja
© BSN BSN 2015 2015
6 da ri ri 1 2
SNI 2332.3:2015 2332.3:2015
Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan pengujian maka perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut: a) b) c) d) e) f)
cuci cuci tangan tangan sebelum sebelum dan sesudah sesudah mela melakuk kukan an pengu pengujia jian; n; gunakan gunakan jas jas labora laborator toriu ium m selama selama melak melakukan ukan penguji pengujian; an; lakuka lakukan n setiap setiap tahapan tahapan penguji pengujian an secara secara asepti aseptis; s; bersihkan bersihkan meja kerja sebelum sebelum dan sesudah sesudah melakukan melakukan pengujian; pengujian; bersihkan bersihkan segera contoh yang tercece tercecerr dan mengandung mengandung bakteri bakteri dengan menggunakan menggunakan bahan desinfektan; media media yang sudah sudah digunakan digunakan diste disteril rilka kan n terlebih terlebih dahulu dahulu sebelu sebelum m dibuang dibuang..
© BSN BSN 2015 2015
7 dari dari 12
SNI 2332.3:2015 2332.3:2015
Lampiran A (normatif) Pembuatan media
A.1
Plate Count Agar Tryptone Yeast extract extract Dextrose Agar Aquades
5 22.5 1 15 1
g g g g g
Panaskan Panaskan seluruh bahan bahan tersebut tersebut hingga mendidih.S mendidih.Steril terilisasi isasi selama selama 15 menit pada suhu 121 °C. Media tersedia secara komersial.
A.2
Peptone water Peptone water Aq Aquades
25,5 1
g L
Laru Larutk tkan an baha bahan n dalam dalam 1 liter liter aquad aquades es.. Masu Masukk kkan an dala dalam m wada wadah h sesuai sesuai vol volum ume e yang yang diinginkan. diinginkan. Sterilisasi Sterilisasi dalam autoclave autoclave pada pada suhu suhu 121 121 °C, °C, selama 15 menit. menit. pH akhir akhir 7,0 ± 0,2.
A.3 Fluid thiog lycol ate medium Fluid thioglycolate medium Aq Aquades
30 1
g L
Larutk Larutkan an bahan bahan dalam 1 liter aquades aquades.. Dengan Dengan cara cara dipanask dipanaskan an sampai sampai mendidi mendidih h atau dalam dalam alat alat steam steam yang yang lain, lain, tuang tuang ke dala dalam m tabung tabung ster sterili ilisas sasii dalam dalam autocl autoclave ave pada pada suhu suhu 121 °C, °C, selama 15 menit. menit. pH akhir akhir 7,1 ±0,2. ±0,2.
A.4 Fluid Fluid thio thiog g lycol lycol ate agar Fluid thioglycolate medium Bacto agar
25,5 15
g g
Larutkan Fluid thioglycolate mediumdal medium dalam am 1 L aquades aquades,, tambahk tambahkan an 15 gBacto agar . Aduk Aduk sampai sampai tercam tercampur pur sempur sempurna. na. Steril Sterilisa isasi si dalam dalam autocl autoclave ave pada pada suhu 121 °C, °C, selama selama 15 menit.
© BSN BSN 2015 2015
8 da ri ri 1 2
SNI 2332.3:2015 2332.3:2015
Lampiran B (normatif) Pembuatan pereaksi
Larutan Butterfield’ Butterfield’s s phosphate phosphate buffered buffered Larutan stok: KH2PO4 Aq A qudes
34 500
g mL
Atur Atur pH 7.2 dengan dengan 1 N NaOH. NaOH. Tepatk Tepatkan an volume volume larut larutan an terseb tersebut ut hingga hingga 1 liter liter dengan dengan penamba penambahan han aquade aquades. s. Steril Sterilisa isasi si selam selama a 15 menit menit pada suhu 121 °C. °C. Simpan Simpan dalam dalam refrigerator. Larutan kerja: Pipet 10 mL larutan larutan stok stok dan tepatkan tepatkan hingga hingga 1 L dengan penambah penambahan an aquades. aquades. Sterilisas Sterilisasii selama 15 15 menit pada suhu 121 121 °C.
© BSN BSN 2015 2015
9 dari dari 12
SNI 2332.3:2015 2332.3:2015
Lampiran C (informatif) Skema penentuan Angka Lempeng Total (ALT)
Gambar Gambar C.1 - Skema Skema penentu penentu an Angk Angk a Lempen Lempeng g Total Total (AL T)
© BSN BSN 2015 2015
10dari12
SNI 2332.3:2015 2332.3:2015
Lampiran D (informatif) Skema penentuan Angka Lempeng Total anaerob (ALT anaerob)
Gambar Gambar D.1 - Skema Skema penentu penentu an Ang Ang ka Lempe Lempeng ng Tot Tot al anaerob anaerob (ALT anaerob anaerob))
© BSN BSN 2015 2015
11 dari dari 12
SNI 2332.3:2015 2332.3:2015
Bibliografi
Food and Drug Administration Bacteriological Analitycal Manual.8 th edition, edition, 2001.Ch 2001.Chapte apterr 3. AOAC International. http://www.fda.gov/food/foodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063346 http://www.fda.gov/food/foodScienceResearch/Lab oratoryMethods/ucm063346.htm .htm tanggal unduh 6/13/2014. Compe Compend ndiu ium m of Meth Method ods s for for The The Microbi Microbiol olog ogic ical al Exami Examinat natio ion n of Food Foods s (Ame (Ameri rica can n Public Public Health Health Associat Association ion Washingto Washington, n, D.C. 1984. Marvin Marvin L. Speck, Editor). Editor). Data verifika verifikasi si metoda pengujian pengujian Angka Lempeng Lempeng Total (ALT) (ALT) aerob dan anaerob. anaerob. Laboratoriu Laboratorium m mikrobiologi mikrobiologi UPT BPMPHP BPMPHP DKI Jakarta, Jakarta, 2014.
© BSN BSN 2015 2015
12dari12
