UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
INTRODUCCIÓN AL METABOLISMO SECUNDARIO COMPUESTOS DERIVADOS DEL ÁCIDO SHIKIMICO Profesor Gabriel Jaime Arango Acosta Dr. Sc. Pharm. Facultad de Química Farmacéutica
Medellín, mayo de 2010
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CONTENIDO INTRODUCCIÓN AL METABOLISMO SECUNDARIO GENERALIDADES Metabolitos primarios, Metabolitos intermediarios, Metabolitos secundarios REACCIONES ENZIMATICAS Mecanismos enzimáticos BIOSÍNTESIS Método biosintético Isótopos estables e Isótopos radioactivos FOTOSÍNTESIS Fijación del carbono Ciclo de Calvin (Plantas C3) Plantas C4, Metabolismo Ácido de las Crasulaceas, CAM COMPUESTOS DERIVADOS DEL ACIDO SHIKIMICO 16 Biosíntesis del Acido Shikimico Biosíntesis de fenilalanina y tirosina Biogénesis de los ácidos cinámicos Fenilpropanoides Compuestos C6C2C6 estilbenos Plantas que contienen compuestos fenil propanos COMPUESTOS (C6C3)2 (LIGNANOS) Lignanos propiamente dichos, Neolignanos, Lignoides, Lignanos diversos, 26 Lignanos conjugados Biogénesis de lignanos Extracción de lignanos Características espectrales de los lignanos Interés biológico de los lignanos Algunas plantas que contienen lignanos ESTRUCTURAS POLIMÉRICAS Ligninas Taninos, Principales plantas que contienen taninos CUMARINAS Biosíntesis de cumarinas Cumarinas simples Cumarinas complejas Furanocumarinas, Piranocumarinas, Cumarinas diversas Técnicas de extracción de cumarinas Métodos espectroscópicos para determinar cumarinas Principales plantas que contienen cumarinas BIBLIOGRAFIA
PAG.
2 2 3 3 4 7 8 10 13 13 14 15 16 17 18 19 19 23 24 24 25 27 27 29 29 30 30 30 30 31 32 34 34 35 36 37 38 39 39 41 42
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INTRODUCCIÓN AL METABOLISMO SECUNDARIO GENERALIDADES Farmacognosia: El término Farmacognosia fue utilizado por primera vez por el alemán Aenotheus Seydler, quien lo uso en su tesis doctoral en 1815, en, Analecta Pharmacognostica. Del Griego Pharmakon: droga y Gignosca: adquirir conocimiento de algo; por lo tanto la Farmacognosia es el estudio de las materias primas de origen biológico: vegetal, microbiano (hongos, bacterias) y animal. Estudia tanto substancias con propiedades terapéuticas como substancias tóxicas, excipientes u otras substancias de interés farmacéutico, en general, es la ciencia que estudia los aspectos botánicos, químicos, biológicos y económicos de las drogas, destinadas a la preparación de medicamentos, de aquí que muchos autores designan a la farmacognosia como “Materia médica” o “Materia Farmacéutica”[1]. La Farmacognosia es la más antigua de las ciencias médicas, el hombre primitivo tuvo que aprender a distinguir los productos que le servían de alimento y los curativos de los tóxicos. La Farmacognosia tiene como metas: • El conocimiento de las plantas utilizadas en terapéutica con miras a la obtención de
drogas en cantidades y calidades convenientes. • La prospección de nuevas plantas con fines terapéuticos, aquí colaboran: • La etnofarmacognosia (Conocimiento popular de la farmacognosia) • La química hemisintética (Síntesis de sustancias a partir de otras conocidas) • La quimiotaxonomía (Relación entre las tipos sustancias químicas encontrados en un ser vivo y su clasificación taxonómica) El término biosíntesis es sinónimo de anabolismo y se refiere a la formación de moléculas complejas a partir de moléculas sencillas, esto implica la formación de enlaces carbono-carbono y de otros tipos, a través de reacciones catalizadas por enzimas. En el esquema siguiente vemos como en condiciones extremas de temperatura y presión, se muestra la posible formación de macromoléculas complejas a partir de simples moléculas inorgánicas. Los seres vivos a partir de H2O, CO2 (por medio de la fotosíntesis) y una fuente inorgánica de nitrógeno, efectúan el proceso completo, produciendo moléculas orgánicas y luego macromoléculas, las cuales se ensamblan en estructuras superiores (organelos) que conforman la célula. La composición química de todas las células es similar, contienen agua (alrededor de 70%), y en partes mas o menos iguales, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos y lípidos. En general podemos decir que los productos naturales se han dividido en tres grupos debido a los diferentes factores que caracterizan a cada uno de ellos. •
Metabolitos primarios Son macromoléculas fundamentales para los seres vivos, de distribución general, que sirven para la producción de metabolitos secundarios, son incorporados directamente del medio o sintetizados a través de reacciones bioquímicas intracelulares.
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SINTESIS DE LAS ESTRUCTURAS CELULARES
la célula y sus organelos
la célula
estructuras membranas cromosomas supramoleculares macromoléculas moléculas orgánicas
moléculas inorgánicas
[2, 3]
proteinas lípidos aminoácidos ác. grasos
RNA proteinas
ribosomas
pared celular
DNA proteinas
celulosa
nucleótidos
monosacáridos
CO2 H2O NH3
Metabolitos intermediarios Son moléculas pequeñas que corresponden a un metabolismo central, producidos directamente de ciclos metabólicos primarios. • Metabolitos secundarios Es el producto de un metabolismo específico, originados a partir de un metabolismo intermediario, de distribución restringida, con una función metabólica específica, se encuentran almacenados en el interior de las vacuolas. •
PRIMARIO Carbohidratos Proteínas Lípidos Ácidos nucleicos
TIPOS DE METABOLISMO INTERMEDIARIO SECUNDARIO Monosacáridos Glicósidos, Azúcares modificados, Ac. Urónicos Glucosa, fructosa heparina Aminoácidos Alcaloides, taninos, fenil propanos, cumarinas Ácidos grasos Policétidos, terpenos, esteroles, triterpenos Bases Tetrapirroles, alcaloides imperfectos
REACCIONES ENZIMATICAS La formación de metabolitos primarios, intermediarios y secundarios resumida en el cuadro general del metabolismo secundario, ocurre a través de reacciones enzimáticas, las enzimas que actúan como catalizadores de superficie generalmente tienen naturaleza protéica lo que las hace muy difícil de aislar y purificar, debido a esto su clasificación se hace de acuerdo a su acción[3]: Clase Nombre (Grupo)
Actividad catalítica
1 2 3 4 5 6
Cambio de estado de oxidación, ej. -CHOH a -C=O Transferencia de un grupo, ej. Transferencia de metilos C1 Hidrolizar, ej. de ésteres o péptidos Reacciones de ruptura de enlaces, ej. liasa de carbono-nitrógeno Isomerizaciones, ej. epimerización cis-trans Reacciones de formación de enlaces, ej. enlaces C-C
Oxidorreductasas Transferasas Hidrolasas Liasas Isomerasas Ligasas
Cuadro 1: Clases de enzimas y su actividad catalítica
Las enzimas generalmente tienen un grupo protéico (cadenas de aminoácidos) y un grupo prostético no aminoacídico, el cual, de acuerdo a su naturaleza, se clasifica en:
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Cromoproteínas Co, Mg, Fe Glicoproteínas azúcares Lipoproteínas ácidos grasos Fosfoproteínas ácido fosfórico Métaloproteínas Cu, Zn Este grupo prostético se puede separar por diálisis y se le conoce como coenzima. Mecanismos enzimáticos[1, 4] Reacciones de alkilación: Son reacciones de Sustitución nucleofílica o de adición electrofílica y producen alargamiento de cadena Sustitución nucleofílica Vía S-adenosil metionina (SAM) Formación de SAM H2N H3C
N
H3C S
N
+
S
HO H2N COOH
N
O
ATP
N
OH
H2N COOH
L-Met
S-adenosilmetionina
NH2
NH2 N
N
N
N
HO
N
N CH 3 O
CH 2-S-CH2CH 2CHCO 2H + NH2
-CH3
N
N
O
CH 2-S-CH .. 2CH 2CHCO 2H NH2
HO
OH S-Adenosilmetionina
OH S-Adenosilhomocisteina
METILANTES
C-alkilación usando SAM
:CH2 C
C
: CH2 S+
S
C
C CH2
+
H2
-CH
2
C
C
H
CH3
5 Ad +
H3C
O
COOH
S
H H3C
COOH NH2
-
NH2
..
Ad + S
O
OH
a
b
a: Las posiciones ortho y para son activadas por grupos OH. b: Los grupos carbonilo aumentan la acidez y permiten la formación del anión enolato
O y N alkilación usando SAM Ad +
R
..OH H3C
COOH
S
+
R
O H
NH2
CH3
Ad S
COOH NH2
S-adenosilhomocisteina
Adición electrofílica Condensación aldólica y Claisen: Reacciones donde se forman enlaces carbono-carbono, se necesita un buen grupo saliente. O R
CH
R X
H
CH
O
O
-
R
X
-NuH
CH HC X
anión enolato estabilizado por resonancia
Nu:-
-
Mecanismo general
O
O R
R
CH
CH2
C
X
R
O
CH2 CH
R CH
O
X
H
R
-
CH
O
-
O
H
R
X
-
X
producto tipo Claisen
OH
X R
CH2
X O
R X producto tipo aldol
El producto de formación depende de la naturaleza del grupo saliente X. La coenzima A es el equivalente biológico a la condensación de Claisen.
O
O
O H
O SCoA
-
CH2
C SCoA
ACoS
OH O
O H
H2O SCoA
HO
OH O SCoA
6
Reacciones de condensación Vía fosfo enol pirúvico O CH2
C O
C CO2H
C CH2 C COOH
OP
OH
Vía Isopentenil pirofosfato (IPP) o dimetil alil pirofosfato (DMAPP) :Enz
H
C OPP
C O
O
OPP
OH
O
O
-CH
O
X
X
O
+
O
O P
O
-O
P
O PP
OP
-O
Reacciones de Carboxilación y descarboxilación O NH
HN
O
O
S
CO2 ATP (CH2)4CO 2H
HO
C N
NH (CH2)4CO2H
S
biotina OH O
O
C C OH
HO
C N
C C CO2H
NH
S
O
NH
N + S
(CH2)4CO2H
(CH2)4CO2H
O HN
O
NH O
Biotina
(CH2)4-C-NH-Enz
S
O 2C N
-
O NH O
S
O 2CCH2CSCoA Malonil CoA
HCO3 /ATP
O -
-
H3C-C-SCoA Acetil CoA
(CH2)4-C-NH-Enz
CARBOXILASA
Eliminación: La eliminación depende de las características del grupo saliente
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H
Nu-
B
+ NuH +B
En sistemas biológicos el grupo saliente más común es el fosfato. -
Nu
H
R1
C CR2 O
R2
O
R1
-
P
C
R2
C
R2
OH
= + NuH + PO 3
R2
O
Epoxidación O. O
O2 C
C
H
H
C H
O
H2
C H
C
C
H
H
+
H2O
Oxoredución: R-CH3
R-CH2OH
R-CHO
R-COOH
NICOTIN AMIDA DINUCLEOTIDO FOSFATO H O CNH2
H
OH OH
N O
O
O
CH2O P O P OCH2 O
-
O
CNH2
O
N
NADPH
N HO
OH OH
N
-
O
+ N
NH2
N
O
OH H-
O
O
CH2O P O P OCH2 O
-
O
NH2
N
O
N
-
N
+ NADP
N HO
OH
MODO DE ACTUAR H+ X H-
R
+ NADPH+H
NADP+
H X R
BIOSÍNTESIS[2- 5] Todos los compuestos orgánicos están constituidos por carbono e hidrógeno a menudo contienen oxígeno y nitrógeno y menos frecuentemente azufre, fósforo y halógenos. La formación de los productos naturales en plantas superiores, algas y algunas bacterias fotosintéticas; tiene como origen la fotosíntesis, la energía solar es utilizada por células que contienen clorofila la cual se encuentra en los cloroplastos. Los productos inmediatos de la absorción de energía lumínica son ATP y el reductor NADPH, compuestos que más tarde se utilizan en el proceso de fijación del carbono con la
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formación de enlaces carbono-carbono y la reducción del CO2 para formar los carbohidratos (CH2O)n. FOTOSÍNTESIS
CARBOHIDRATOS
CO 2 + H 2O COOH
Glucólisis
Ciclo de las pentosas
Ácido
Eritrosa 4P HO
OH OH
Fosfoenol
Acido Shikímico
pirúvico
Aminoácidos aromáticos y
TANINOS Acido cinámico
alifáticos
CH3COCOOH
CUMARINAS LIGNANOS
Ac. pirúvico
ALCALOIDES Ciclo CH3CO.SCoA AcetilCoA
FLAVONOIDES
de
ANTRAQUINONAS POLIACETATOS
Krebs
H3C
MalonilCoA CH3
OH O Ac. mevalonico
AC. GRASOS
H3C CH2OPP
HO
TETRACICLINAS
H3C isopentenilpirofosfato dimetilalilpirofosfato
Terpenoides Carotenoides Alcaloides esteroidales
Cuadro general del metabolismo segundario
Prácticamente toda la vida en la tierra depende de la fotosíntesis pues todos los organismos que no son fotosintéticos necesitan consumir moléculas orgánicas previamente formadas para vivir, además, la fotosíntesis es la única fuente natural de oxígeno en el planeta Los animales y otros organismos como las bacterias de la putrefacción, obtienen su energía degradando moléculas orgánicas que han sido formadas por otros seres vivos, por lo que podemos afirmar que todos los organismos dependen de la energía solar. Método biosintético[1, 2, 3, 4] Consiste en el estudio de las técnicas y procesos de formación de sustancias en los organismos vivos. Para entender bien el método biosintético, es necesario conocer la definición de algunos términos: Biosíntesis: Formación de una sustancia en o por un organismo vivo (comprobado experimentalmente). Biogénesis: Son las hipótesis de la formación de una sustancia en un organismo. Estas hipótesis deben estar de acuerdo a las reglas y leyes de la bioquímica y la química orgánica. Las consideraciones biogenéticas pueden facilitar en mucho la determinación de la estructura de un producto desconocido, pero también puede conducirnos a conclusiones
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erróneas. Es por esto, que las teorías deberían solo servir para confirmar o rechazar una estructura propuesta de una sustancia o producto natural. Los estudios biosintéticos pueden dividirse en dos grupos - Estudio de secuencias biosintéticas o Análisis secuencial - Estudio de mecanismos biosintéticos Primero se realiza el análisis secuencial y luego se determina su mecanismo. Análisis secuencial Pretende establecer los pasos individuales de una secuencia biogenetíca El análisis secuencial, se basa en la aparición de productos relacionados entre si en diferentes etapas de la formación de compuestos, sin embargo, hay que tener en cuenta: • El mismo precursor puede metabolizarse de varias maneras diferentes A
v1 B
v2 v4
C
v3
P
D
• La diversidad de tejidos del órgano productor de los metabolitos: animales, vegetales superiores y microorganismos; originan sistemas enzimáticos diversos que operan de forma diferente. Si las velocidades de reacción son muy diferentes, se pueden perder la pista de algunas de las sustancias de interés. v1 >>> v2 El producto B va a ser mas abundante pues la velocidad v1 es mucho mayor que v2, debido a esto, se puede pensar erróneamente que el producto es B y no P. La detección se basa en buscar "moléculas claves" que originen los diferentes metabolitos en condiciones biológicamente posibles (pH∼7, medio acuoso, presión normal y temperatura ambiente). Cuando se emprende un estudio biosintético hay que tener en cuenta que las conclusiones obtenidas pueden ser erróneas si no se detecta bien la "molécula clave"; en Conium maculatum el máximo contenido de γ-coniceina es alcanzado una semana antes que la coniina, debido a que la velocidad de formación es muy grande toda la coniina pasa rápidamente a γ-coniceina; cuando se llega a una determinada cantidad de γconiceina, se inhibe la formación de esta y aumenta la de la coniina, siendo esta precursor de la otra. N
CH3
N
H
CH3
γ Coniceína
Coniína
Esta detección se dificulta igualmente cuando un intermediario es fácilmente ínter convertible con otro metabolito que esta fuera del camino directo: A
B
D
C
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D no es un intermediario en el camino que conduce de A a C, sin embargo si se suministra D marcado se obtendrá C marcado, demostrar que D no pertenece al camino directo implica demostrar que las siguientes expresiones no son ciertas: A
B
A
D D
A
D B
C C
C
B
Un método de demostrar esto, es aislar y purificar las enzimas de cada una de los procesos. El problema puede complicarse si la interconversión entre B y D no es un proceso enzimático, como por ejemplo un hidroxiácido y la lactona. En estos casos, es imprescindible efectuar un estudio cinético cuidadoso de las reacciones enzimáticas. Un ejemplo real es la biosíntesis de ciertas lactonas esteroidales como la hellebrigenina[1] O H3C
HO
O
O
OH
OH
Hα HO
Ac. mevalónico
O
O
H
3
pregnelonona O
OH
HO OH
hellebrigenina
O
progesterona
Esta biosíntesis de la hellebrigenina se pudo demostrar fácilmente pues la interconversión de pregnelonona a progesterona es lenta comparada con los otros pasos y al utilizar pregnelonona marcada en el protón 3α, se demostró que un porcentaje de la marcación era retenido en el producto final, indicando que la progesterona no era un intermediario, si así lo fuera, la marca se hubiera perdido totalmente, pues al formarse la progesterona, se pierde ese protón. Isótopos estables e Isótopos radioactivos Se denominan isótopos a los átomos del mismo elemento que contienen el mismo número de protones pero diferente número de neutrones, y que por lo tanto tienen diferentes números de masa. Los tres isótopos del hidrógeno 1H, 2H (deuterio) y 3H (tritio), contienen cero, uno y dos neutrones. No obstante, algunos isótopos con demasiados neutrones son inestables y tienden a degradarse para formar un isótopo más estable, se convierte en otro elemento; esos isótopos se denominan radioisótopos, ya que emiten radiaciones de alta energía al desintegrarse. La cantidad de 146C en la atmósfera terrestre se mantiene constante en el tiempo y pasa a formar parte del ciclo de la alimentación, según
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CO2 (gas) plantas, fotosíntesis <=> 14C (carbohidratos, alimentos especies vivas)
Como resultado del equilibrio anterior, todos los seres vivos contienen la misma fracción de C-14 e igual a la que existe en la atmósfera. Al momento de la muerte del organismo de la especie considerada, ya no regenerá este equilibrio y solo se produce la desactivación radiactiva del C-14 que existía en el momento de extinguirse su vida. Esto nos permite calcular las edades de materiales de la corteza terrestre, basándose en la existencia de 14C radioisótopo, el cual se va desintegrando por bombardeo de neutrones provenientes de la estratosfera, produciendo así átomos de N como se muestra en la ecuación siguiente: t½ = 5730 años Así pues, al medir la cantidad de radiactividad en una muestra de origen orgánico con un contador de partículas Geiger se puede calcula la cantidad de 14C que aún queda en el material. Así puede ser datado el momento de la muerte del organismo correspondiente. Se ha logrado determinar con bastante exactitud que la radiación de C-14 en la atmósfera corresponde a la medición de 13,6 desintegraciones β por cada minuto, para 1 gramo de Carbono presente. Esto es así porque, en tanto existe vida, la proporción 146C / 12 6C , permanece constante de modo que solo consideramos el C total para las mediciones normalizadas. Así, Intensidad de radiación 14C en equilibrio = 13.6 desintegraciones β minuto/gramo C El método de datación por radiocarbono es la técnica más fiable para conocer la edad de muestras orgánicas de menos de 60.000 años. Está basado en la ley de decaimiento exponencial de los isótopos radiactivos. El tiempo de datación de la especie, se calcula fácilmente considerando que 13,6 es la radiación inicial a t = 0 y que es proporcional al contenido de 146C al momento de muerte del organismo y si llamamos I la intensidad de la radiación actual de una muestra de ese organismo en la era actual, la edad desde su muerte está dada por t = (1,90·104 años) log(13.6/I) ELEMENTOS RADIOACTIVOS UTILIZADOS EN INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS Isótopo 3
H C 24 Na 42 K 35 S 32 P 131 I 14
Tiempo de vida media 12-43 años 5730 años 14.9 horas 12.4 horas 87.4 días 14.3 días 8.04 días
Energía de radiación Beta Gama 0.186 nula 0.156 nula 1.39 1.38 3.5 1.5 0.167 -1.709 nula 0.247-0.806 0.08
Observaciones toxicidad 3
3 H. He + e14 C N + eSubgrupo inferior Subgrupo inferior Subgrupo inferior Subgrupo inferior Subgrupo inferior 14
ELEMENTOS NO RADIACTIVOS Elemento 2 H 13 C
Abundancia natural % 0.015 1.0
Espin 1 ½
Detección Masas, IR, Masas, RMN
baja media
media
12 15
N
0.36
½
Masas, RMN
Formación del Alcaloide Shimanina a partir del Ácido O-Succinilbenzoido en la Orquidea Dendrobium pierardii[6] O
O COOH
CHO
2H
COOH Ac. o-succinil benzoico
COOH
O
NH3 N-Met
COOH B. Schiff
N O
+ N
CH3
CH3 COOH
Shimanina O 4
5
5 3 7
N
2
6
8
O 9
NHCH3
3 13
4
CH3 10
12
11
13 9
10
8 117
O 12
2
6
200
TMS
0
100
5
* N O
CH3
10 9
O 12 200
3
8 117
13 6
4
TMS
2 100
0
Este ejemplo, nos muestra la posibilidad de estudiar el método biosintético de una sustancia por resonancia magnética nuclear de 13C, el primer espectro de la shimanina, nos muestra claramente todas las señales de 13C; si partimos de ácido o-succinil benzoico marcado en el carbono carboxílico de la cadena, se nos formará la shimanina con marcación (5-13C) como se muestra en la figura, por lo tanto, veremos en el espectro 13 C RMN (inferior) un aumento (comparado con las otras señales) en la intensidad de la señal de ese carbono. Efectividad del precursor[1] En plantas superiores se aceptan incorporaciones del 0.1% como efectivas En microorganismos aproximadamente del 5%. El Grado de Incorporación GI esta dado por la siguiente ecuación: GI = (A2 M2 / A1 M1) x 100 M1 y M2 : [ ] Molares. A1 y A2: Actividades específicas molares del precursor y del producto (Medidas por el método de centelleo)
Cuando en la formación de una sustancia existen compuestos simétricos, se formarán isómeros marcados, como es el caso de la nicotina, la cual mostrará marcación en diferentes átomos disminuyendo así el grado de incorporación
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O H2N
*
OH NH2
* NH 2
H2N
O * H
H2N
O *
NH2
H
O OH *
* N CH3
N nicotina
+
N H3C
*
+
*
N H3C
Como detectar posibles precursores Hay que determinar el lugar y la etapa de formación Ej. La Brugmancia sanguinea sintetiza la escopolamina en la etapa de prefloración y no en la de fructificación, además, los ésteres, se forman en las raíces y son transportados a las partes aéreas donde pueden ser hidrolizados. Cuando se presume la naturaleza del precursor, este se puede introducir artificialmente en el medio biológico y seguir su destino. Para seguir el destino existen dos métodos 1. Marcado isotópicamente - Isótopos radioactivos - Isótopos estables 2. Método biológico, usando mutantes o inhibidores enzimáticos específicos. Suministro El suministro del metabolito depende del estado físico del sustrato Si es un gas (18O2, o CO2 marcado con 14C o 13C) se hace crecer el material en atmósfera del gas. Si es líquido o sólido se aplica en solución (estas deben ser solubles en medio fisiológico) y se pueden aplicar por: Riego (cultivos hidropónicos) Por adsorción en tallos cortados Por inyección de la solución en el sitio biosintético Por infiltración a presión reducida FOTOSÍNTESIS[3-5] El proceso fotosintético tiene lugar únicamente en las células que contienen clorofila y solo en ciertos organelos como los comatóforos (pequeños corpúsculos coloreados que se encuentran en el interior de las células, como los cloroplastos y cromoplastos). Según la fuente de Energía que utilizan, las células se clasifican en: • Fototróficas: Obtienen la energía directamente de la luz: células vegetales • Quimiotróficas: Obtienen la energía de la oxidación de los alimentos: células animales y células vegetales en oscuridad Fijaciòn del carbono[3-5] La fijación del carbono es la incorporación fotosintética del CO2 atmosférico a compuestos orgánicos, mientras que la carboxilación es la adición de una unidad de CO2 a un compuesto orgánico. Ciclo de Calvin (Plantas C3) El conocimiento sobre la fijación del carbono, se debe en gran parte a Melvin Calvin en 1946, incubó una micro alga verde Chlorella pyrenoidosa en presencia de luz y le burbujeó 14CO2, la incubación se llevaba a cabo en diferentes periodos de tiempo desde 3 segundos a sesenta segundos, suspendiendo la incubación con vapores de alcohol; se
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extraían los compuestos radioactivos y se cromatografiaban en papel, revelándose luego con una placa fotográfica que marcaba las sustancias radioactivas. A los tres segundos solo dio una sola mancha correspondiente a 3-fosfoglicerato, pero a los treinta segundos dio varias manchas según el sigiente cuadro. SECUENCIA GLOBAL:
C5 CO2
+
C
C6
SISTEMA CARBOXIDISMUTASA
H2O
3 FOSFO GLICERALDEHIDO
2 MOLÉCULAS AC. 3 FOSFOGLICÉRICO
RIBULOSA 1, 5 DI P RIBULOSA 5 P
2 X C3
DIHIDRO ACETONA P RIBOSA 5 P FRUCTOSA 1, 6 DI P SEDUHEPTULOSA 7 P
XILOSA 5 P
ERITOSA 4 P
SEDUHEPTULOSA 1, 7 DI P
FRUCTOSA 6 P
Ciclo del carbono en la fotosíntesis plantas C3 (ciclo de Calvin)
En 30 segundos Triosas
Pentosas:
Heptulosas:
Dihidroacetona P Gliceraldehido 3P Ac. 3-P glicerato Ribosa 5P Ribulosa 5P Xilosa 5P Ribulosa 1,5 di P Seduheptulosa 7P Seduheptulosa 1,7 di P
Tetrosas:
Eritrosa 4P
Hexosas:
Fructosa 6P Glucosa 6P Fructosa 1,6 di P
Toda la fijación fotosintética del carbono tiene lugar a través de la carboxilación de la ribulosa-1,5difosfato (C5), dando un compuesto C6, (esta reacción es catalizada por la enzima Ribulosa-1,5-difosfato carboxilaza conocida como rubisco), luego se hidroliza para producir dos moléculas de fosfoglicerato (C3). En las llamadas plantas C3, la anatomía de las hojas presenta las células del mesófilo distribuidas al azar en todo el tejido de la hoja y son los sitios primarios de fijación del CO2. fig. 1.
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Fig. 1 Anatomía de las hojas C3 (a) y C4 (b)[3]
Plantas C4[3, 5] Algunas plantas que crecen en regiones semi-áridas con elevada intensidad lumínica, poseen un sistema adicional de fijación de carbono; aunque es menos eficaz en la utilización de energia, si lo es para la utilización de CO2, reduciendo la fotorespiración y pérdida de agua, estas plantas son conocidas como plantas C4 donde el fosfoenol piruvato es el aceptor inicial del CO2; produciendo un compuesto C4, el oxaloacetato; luego estas reacciones se invierten en otra parte de la planta para dar CO2 que se recombina con de la ribulosa-1,5 difosfato. Las células de las plantas C4, a diferencia de las plantas C3, poseen una anatomía característica; las células del mesófilo, se encuentras organizadas en torno a las células de la vaina del haz, siendo estas, mas prominentes que sus equivalentes en las hojas C3; esta estructura se conoce como “anatomía de Kranz” o guirnalda. fig. 1. En ambos casos intervienen células del mesófilo con cloroplastos en la fijación del CO2. Sin embargo, en las hojas C4 la fijación de CO2 por el rubisco, tiene lugar en las células de la vaina del haz, mientras que en las células del mesófilo C4, se especializan en la incorporación inicial del CO2 en el ácido dicarboxílico oxaloacetato, el cual pasa al cloroplasto para reducirse a malato por medio de NADP-malato deshidrogenasa. El transporte de malato entre la célula del mesófilo y la célula de la vaina del haz, origina a la vez el transporte de CO2 entre ambas células. Fig. 2.
Fig. 2: Via C4 de fijación de CO2[3]
Metabolismo Acido de las Crasulaceas CAM[3, 4, 5]
16
Otro grupo de plantas se conocen como plantas CAM el término significa la sigla en inglés de Metabolismo Ácido de las Crasulaceas, se denomina asi por que fue inicialmente en la familia de las Crasulaceas donde se observó un incremento de ácido málico en horas de oscuridad. Otras grandes familias como Liliaceas, Cactaceas y Euphorbiaceas poseen especies con una bioquímica similar. Al igual que en las plantas C4, se trata de una adaptación del ciclo fotosintético en vegetales en situación de sequia, pues también capturan CO2 para producir inicialmente oxaloacetato, pero lo hacen de manera distinta que las plantas C4, pues el mecanismo es temporal (fase oscura y fase lumínica) como se muestra en la figura 3.
Fig. 3 Metabolismo Ácido de las Crasulaceae (CAM)[3]
En la oscuridad el CO2 es fijado al fosfoenolpiruvato produciendo el oxaloacetato, este se oxida para dar malato, el cual se fija en la vacuola. En la luz el malato pasa la membrana entrar en los cloroplastos y descarboxilarse para ser fijado por las enzimas del ciclo de Calvin o reducirse a oxaloacetato. En general los tipos de fijación del dióxido de carbono CO2 son: Tipo de fijación C3 C4 CAM
Aceptor de CO2 Ribulosa 1,5 di P Fosfoenolpiruvato Fosfoenolpiruvato
Producto de fijación Fosfoglicerato Oxaloacetato Oxaloacetato
Ejemplos de plantas Espinaca, trigo, tabaco Maíz, caña de azúcar, sorgo Piña, papaya, cactus
COMPUESTOS DERIVADOS DEL ACIDO SHIKIMICO El ácido shikímico se aisló inicialmente en 1885 de la planta asiática "SHIKIMI-NOKI" Illicium sp. (Fam. Illiciaceae) y es reconocido como el compuesto punto de partida para un vasto número de sustancias naturales. Su existencia como un discreto constituyente vegetal, ha sido observado en años recientes, pero no hay duda de que es el metabolito universal de las plantas superiores y de muchas clases de organismos no mamíferos.
17 HO O
HO
O
H H
OH OH
OH H
OH
HO HO
Podemos afirmar que el ácido shikímico es el precursor de la mayoría de constituyentes vegetales que contienen anillos aromáticos; dando un patrón de oxigenación en el anillo aromático claro, que permite reconocer los compuestos derivados de este; así, en compuestos aromáticos derivados del ácido shikímico, las posiciones oxigenadas son de tipo catecol (orto) o pirogalol (diorto), y en el caso de los fenoles monooxigenados son generalmente p-hidroxi-compuestos. En compuestos derivados de la ruta del AcetatoMalonato los grupos oxigenados están en disposición meta entre sí, o sea que los polifenoles son derivados tipo resorcinol. Del ácido shikímico se obtiene por hemisíntesis el oseltamivir, un medicamento antiviral selectivo contra el virus de la influenza. Lo produce la casa Roche bajo la marca Tamiflu®. El oseltamivir es una prodroga, que se transforma en un compuesto activo en el organismo disminuyendo los síntomas de pacientes con la gripe adquirida recientemente y reduce la incidencia de los síntomas propios de una gripe confirmada, como las infecciones bacterianas: bronquitis, sinusitis y neumonía. Después de su administración oral el oseltamivir inhibe la replicación del virus A y B de la gripe, y la patogenicidad in vivo en modelos animales de infección de gripe con exposiciones a antivirales es similar a la alcanzada en humanos con 75 mg dos veces al día. La actividad antiviral de oseltamivir se ha confirmado en los estudios de provocación experimental en voluntarios sanos.
BIOSÍNESIS DEL ÁCIDO SHIKÍMICO[4, 7, 8] La formación del ácido shikímico ocurre a partir de precursores de 3 y 4 átomos de carbono como son el ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y la eritrosa 4-fosfato (E4P) por una condensación de tipo aldólica, produciendo un compuesto C7 a través de una serie de etapas que se resumen en la Figura 4.
18
H O H
COOH P
O
-Pi
H
HO
E4P
COOH
CH2
O
P
PEP
O P
O
HO COOH
O
-Pi
HO
OH
HO
OH
OH
OH OH -2H
COOH
COOH
HO COOH
+2H HO
OH
-H2O O
O
OH
OH
OH OH
OH
Acido shikímico
Figura 4. Biosíntesis del ácido shikímico a partir de fosfo enol pirúvico y eritrosa 4- fosfato.
Biosíntesis de fenilalanina y tirosina (Aminoácidos aromáticos). Los aminoácidos fenilalanina y tirosina, se sintetizan por reacciones posteriores del ácido shikímico con PEP, seguida de las transformaciones que se muestran en el esquema de la figura 6, vía del ácido corísmico como intermediario del ácido prefénico para luego formar el fenilpirúvico. En microorganismos y plantas, estos aminoácidos, se forman separadamente a partir del ácido prefénico, ver Fig. 5. Los ácidos prefénico, fenilpirúvico y el p-hidroxifenilpirúvico son los precursores de fenilalanina y tirosina, estos aminoácidos son los constituyentes universales de proteínas y es punto de partida de la secuencia biosintética que lleva a los llamados compuestos C6C3 H COOH
+
CH2
COOH
COOH
COOH
H PO
ATP HO
OH
H
-HOP CH2
.. OH
PO
H
COOH
PO
COOH
O OP
OH
OH
PO
OH
O
COOH
OH
Ac. shikímico -HOP O H
COOH
COOH O
COOH
O
tranaminación
CH2
-CO 2
NH2 R
O
R=H: fenil alanina R=OH: tirosina
OH
Ac. prefénico
COOH
OH CH3 Ac. corísmico
Figura 5. Biosíntesis de fenilalanina y tirosina
En el caso de los animales, se produce la hidroxilación directa de la fenil alanina a tirosina y luego a dihidroxifenil alanina (L-DOPA), precursor de las catecolaminas como el neurotrasmisor noradrenalina y la hormona adrenalina, como se muestra en la figura 6.
19
O2
NH2
COOH
HO COOH O2
COOH
HO L-DOPA
L-Tyr
L-Phe
Catecolaminas
NH2
NH2 HO
O
COOH
O
HO [O]
Melanina
COOH
COOH HO
HO
N
O
N H
H 2N
DOPAquinona
DOPAcromo
Figura 6: Formación de la melanina
[4]
Biogénesis de los ácidos cinámicos La ruta principal para la producción de los ácidos cinámico a partir de fenilalanina o tirosina, se reveló cuando se encontró que los tejidos vegetales contienen sistemas enzimáticos capaces de catalizar la remoción de amoníaco de estos aminoácidos: COOH R
NH2
COOH
-NH3 (PAL ó TAL)
R
R = H, Acido cinámico R = OH, Acido p-cumárico
R = H, Fenilalanina R = OH, Tirosina
En los mecanismos PAL (fenilalanina-amonioliasa) o el TAL (tirosina-amonioliasa) las enzimas actúan sobre los grupos salientes en posición trans, como una eliminación de tipo Hoffmann Fig. 7. -
HR
COO
HS
+
H3N
Figura 7: Eliminación de tipo Hoffmann.
Las evidencias experimentales muestran al parecer que la enzima (PAL) se encuentra ampliamente distribuida en los vegetales, mientras que la (TAL) se encuentra principalmente en ciertas gramíneas. Estas enzimas son esteroespecíficas ya que son capaces de desaminar los L-aminoácidos pero no los D-aminoácidos. Los ácidos cinámicos producidos por acción de los aminoliasas, constituyen el punto de partida para una cantidad enorme de procesos metabólicos secundarios. Fenilpropanoides C6C3, C6C2 Y C6C1. Compuestos C6C3 (Ácidos cinámicos) La importancia fundamental de la secuencia de reacciones ácido shikímico → ácido prefénico → fenilalanina (o tirosina) → ácidos cinámicos, y la amplia distribución natural de los ácidos cinámicos y sus productos de biodegradación, lleva a la conclusión de que muchos compuestos naturales que contienen cadenas laterales de 3 átomos de carbono ligados a núcleos fenólicos, son productos de reducciones biológicas de los ácidos cinámicos; la naturaleza ofrece muchos ejemplos de casi todos los niveles de oxidación de la cadena lateral de estos compuestos. Figura 8.
20
Una característica estructural general, en este tipo de sustancias es la presencia frecuente de funciones oxigenadas en posiciones 4, 3 y 4, 4 y 5 y 3, 4 y 5, que son las mismas posiciones oxigenadas presentes en el ácido Shikímico. R 1
3 RO
5
OR
4 OR
COOH
HO
COOH
COOH
[O]
NH2
*
NH2
HO
-NH3
NH2
HO
-NH3
COOH
-NH3
HO
COOH
COOH
[O]
HO
HO
ácido cinámico
p-cumárico (Gramineae)
cafeico C1
CH3O
COOH
COOH CH3O
CH3O C1
HO
COOH
[O]
HO
HO OCH3
OH
ferúlico -2H
sinápico (Angioespermas)
O
COOH metilencafeico
O
* Ocurre en microorganismos y en animales NO ocurre en plantas Figura 8. Formación de fenil propanos a partir de fenil alanina y tirosina
Es interesante anotar que en ciertos casos los isómeros alil y propenil se encuentran juntos en algunas plantas. Por ejemplo, el safrol y el isosafrol se encuentran en Cananga odorata (Fam. Annonaceae), y la miristicina junto con la isomiristicina en Myristica fragrans (Fam. Myristicaceae). CH3 CH2X HO HO
-X
H-
propenil fenol CH2
CH2X HO HO
alil fenol
Es muy probable que ambos isómeros sean biosintetizados de manera independiente, es decir que es improbable un proceso de isomerización del uno para generar el otro. Los siguientes son los núcleos principales de los fenil propanos, se puede observar que las sustituciones oxigenadas del anillo son en para o en meta de la cadena
21 R
R
OH
OH
R
R
OH
OCH3 OCH3
guayacil
OH
OH OCH3
O
O
Eugenol
COOH
OCH3
O
O
H3CO
CH2
CH2
Safrol- Miristicina
OCH3 OCH3 trimetilgalil
siringil
3,4-metilendioxil
CH2
CH2
OCH3 CH3O OH
O
veratril
R
O CH3O
OCH3
OH
4-hidroxifenil catequil
R
R
Anetol
OH
Ac. clorogénico
Entre los derivados de los ácidos cinámicos, se encuentra el cloranfenicol (cloromicetina), agente bacteriostático de amplio espectro, inicialmente aislado de cultivos de Streptomyces venezuelae, se sintetiza a partir de la tirosina por medio de una aminación produciendo la p-aminofenilalanina (L-PAPA), que luego de una serie de reacciones produce el cloranfenicol. Actualmente es sintetizado en forma de ésteres (succinato y palmitato); activo frente a bacterias gram-positivas y gram-negativas, incluyendo anaerobios, clamidias y ricketsias. Exhibe actividad bactericida frente a Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Neisseria meningitidis. Por sus efectos secundarios, actualmente no se considera antibiótico de primera elección. Su biogénesis se muestra en la figura siguiente: COOH
COOH
COOH NH2
NH2
CH2OH HO
HO
NHCOCHCl2
NHCOCHCl2
hidroxilación N-acilación
OH
Tirosina
NO2
NH2
NH2
cloranfenicol
p-aminofenilalanina L-PAPA
Compuestos C6C2 Una clase de compuestos C6C2 que provienen de compuestos C6C3 por un proceso de descarboxilación, estos compuestos son derivados tipo estireno, fenil etanoide y acetofenona, O CH2
Estireno
CH3
CH3
fenil etanolide
acetofenona
Compuestos C6C1 A partir de los ácidos cinámicos las plantas pueden generar compuestos aromáticos C6C1, formando inicialmente el éster de la coenzima A del ácido cinámico, el cual puede sufrir degradación de la cadena lateral, mediante un proceso enzimático similar a la β oxidación de los ácidos grasos. El esquema de este proceso es e1 descrito en la Figura 9.
22 HO COSCoA
COOH
COSCoA
[O]
Ac. Shikímico R
CoASH
H
R
R
H 2O [O]
O OH
O
O
HSCoA H O 2
CH 3 SCoA HSCoA
COSCoA
SCoA
R
R
R
Figura 9. Biogénesis de compuestos C6C1
E1 derivado del ácido benzoico así originado, puede descarboxilarse para generar compuestos C6, o sufrir una o varias etapas de reducción para generar derivados tipo benzaldehído, alcohol bencílico y compuestos derivados del tolueno. COOH
CHO
2H R
CH2OH
2H
CH3
2H
R
R
Derivados benzaldehído
Derivados tipo alcohol bencílico
R
-CO2 Compuestos C6 (bencenoides)
Derivados tipo tolueno
Compuestos C6 Son pocos los compuestos C6, que han sido aislados en la naturaleza, los más comunes son la arbutina (el β-D-glucopiranósido de la hidroquinona) y su éter metílico. La arbutina es derivada de la ruta del ácido shikímico→fenilalanina; esto se comprobó por experimentos en los cuales se administró fenilalanina, ácido cinámico, tirosina y ácido shikímico marcados con 14C, a hojas de Pera, Pyrus communis (familia Rosaceae), demostrando que la arbutina era originada a partir de estos precursores ya que efectivamente se aisló arbutina radiactiva. Estos resultados y la posterior demostración experimental de la formación de arbutina a partir de fenilalanina marcada en Grenvillea robusta (Fam. Proteaceae) confirmaron este hallazgo. Esta biogénesis se esquematiza en la Figura 10. O
Acido shikímico
OH R
R
CO2 Si R=OH
OGlucosil
Glicosilación
HO
OH
HO
Arbutina
Figura 10. Biogénesis de arbutina
Ejemplos de compuestos C6C1 y C6.
[O] HO
23
COOH
HO
COOH
CH3O
HO
HO
COOH
HO
Acido p-hidroxibenzoico
COOH
COOH
OH
OCH3
OCH3
Acido vanílico
Acido siríngico
HO
COOH
HO
Acido salicílico
COOH
HO
HO OH
HO
Acido gálico
Acido protocatechuico
OH
OH
OH
Acido gentísico
Antiarol
OH CHO
CHO
H3C O
O OH
O
OCH3
Vainillina Alcohol anísico piperonal
COMPUESTOS C6C2C6 (ESTILBENOS) [4, 5, 11] Los eltilbenos son compuestos naturales de frecuente aparición en diferentes familias de plantas como Cyperaceae, Dipterocarpaceae, Gnetaceae y Vitaceae, pueden encontrarse libres o como glicósidos. Pertenecen al grupo de los polifenóles no flavonóidicos, su esqueleto estructural comprende dos anillos bencénicos unidos por un puente etileno (C6-C2-C6) donde el resveratrol (3, 5, 4’-trihidroxiestilbenceno), con gran actividad antioxidante; es de anotar que el resveratrol proviene de dos vías metabólicas diferentes, vía acetato (el primer anillo) y vía ácido shikímico el segundo anillo. H3CO OH H3CO HO
H3CO
HO
OH
OCH 3
Resveratrol
Combrestastatina A-4
El resveratrol de Vitus vinifera (Vitaceae) y otros estilbenos como la combrestastatina A-4, del sauce africano Rhus lancea (Anacardiaceae) mediante inhibiciones enzimáticas, se ha demostrado que actúan como compuestos quimiopreventivos del cancer, capaces de prevenir, inhibir o reversar procesos de carcinogénesis. La biosíntesis de los estilbenos se produce por el alargamiento de cadena de un cinamil CoA (via shikímico) con tres unidades de malonil CoA (via acetaro). OH
OH OH
HO
O 3xmalonilCoA
-CO2
O
CoAS
SCoA cond. aldolica O
O -
O
4 hidroxicinamil CoA
OH
resveratrol
-
Biogénesis de estilbenos[4]
24
Plantas que contienen compuestos fenil propanos[5, 11, 12] Las hojas secas de Gayuba, Arctostaphylos uva-ursi, Fam. Ericaceae. La gayuba es un pequeño arbusto perenne de montaña, localizado en centro y norte de Europa y en Norteamérica. El extracto acuoso de las hojas secas de Gayuba, es tradicionalmente utilizado para el tratamiento de infecciones en las vías urinarias (Farmacopea Francesa 10a edición). La gayuba es diurética y astringente, durante la excreción ejerce una acción antiséptica sobre las vías urinarias, en forma tópica se usa para quitar manchas de la piel. La droga contiene flavonoides, ácido ursúlico (triterpeno pentacíclico), 10% de taninos gálicos y entre 5 y 10% de arbutosido y metil arbutosido. Vainilla, Vainilla planifolia, Fam. Orchidaceae. La vainilla esta constituida por los frutos inmaduros, curados y desarrollados de la orquidea Vainilla planifolia, cultivada en de Méjico y algunas islas oceánicas. La vainilla verde contiene heterósidos principalmente glucovanillina y alcohol glucovanillico. Durante el curado, estos compuestos sufren oxidación e hidrólisis, los principales constituyentes son vainillina, anisaldehido y piperonal. Fruto de anís, Pinpinella anisum, Fam. Unbelliferae/Apiaceae. Esta es una planta herbácea originaria de Egipto y del Medio Oriente y cultivada en casi todas las regiones del planeta. La droga comprende los frutos maduros y secos, son de color gris verdoso y olor aromático agradable, empleados en forma natural como infusiones es carminativo, estomacal, antiespasmódico expectorante, germicida y aromatizante. Los frutos contienen entre 2 a 3% de aceite esencial, este es incoloro cuyo principal componente es el anetol (hasta un 90%), estragol, anisaldehído. Uva roja, Vitus vinifera, Fam. Vitaceae Los frutos de esta planta, la uva oscura de pulpa roja es comestible y materia prima para la fabricación de vino y otras bebidas alcohólicas. La coloración es debido a una importante concentración de compuestos de tipo antocianinas, concentración que varia en función del tiempo de maduración. Sus principales compuestos activos se encuentran en las semillas y en la “piel” de la uva. Entre éstos se destacan los flavonoides, polifenoles (entre ellos el resveratrol), antocianinas, proantocianidinas, COMPUESTOS (C6C3)2 (LIGNANOS)[1, 4, 6- 8, 10] Los lignanos son una clase de compuestos derivados de fenilpropanos ampliamente distribuidos en la naturaleza, formados por dimerización oxidativa de unidades C6C3. Dentro de esta clase de compuestos, se pueden distinguir varios grupos: Los lignanos propiamente dichos: son dímeros oxigenados de fenilpropanos sencillos con puente β-β' en la cadena lateral. β
β'
25
De estos dímeros se han aislado mas de 500 compuestos en aproximadamente 60 familias, del orden Magnoliales y Piperales, se han encontrado principalmente en Myristicaceae, Magnoliaceae, Piperaceae y Aristolacaceae. En raíces y rizomas de especies de Podophyllum Berberidaceae, y de otras especies, se extraen las tetralinas como podofilotoxina[9], un anticancerígeno; en raíces de Artemisia absinthium (Asteraceae), se han extraído furofuranos de tipo sesamina, usado como sinergista de piretros, el ácido nor-dihidroguairético y sus derivados, presentan una importante actividad antioxidante. O
OH
O
O
O O
O O O CH3O
OCH3
O O
OCH3
sesamina
podofilotoxina
Los lignanos propiamente dichos, dependiendo de las cadenas laterales, se pueden dividir en cinco grupos de estructuras fundamentales: Diaril butanos cuando las cadenas laterales no son sustituidas como el caso del ácido guairético. α
H3CO
α'
HO
β
CH3
β'
CH3
OCH3 OH
Ácido guaiarético
Butirolactonas, una de las cadenas es un ácido carboxílico y la otra un alcohol que al deshidratarse forman una lactona, pueden ser saturadas o insaturadas. O O O O
O H3 CO O HO
OCH3
O
OH
O
5-metoxi-isoyateina
chaerofilina
Furanos y Furanoides CH3
H3C
O O
O O
Galbacina
Furofuranos o Difuranos
O
OCH3
HO O H3CO
furoguayacina
OH
26
OCH3 OCH3
O
OCH3 O O O
Aschantina
Ariltetrahidronaftalenos (Tetralinas) O
CH3
O
CH3
OH
Atenuol
Neolignanos: son compuestos cuyas uniones son diferente a β-β' COOH
HO
OCH 3 O
H3C
HO
O
H3CO
O
CH2
HO OH
OCH 3
OH
Äcido rosmarínico
Eusiderina CH2
OCH3
H3CO O
H3CO H2C
H3C
H3CO
O
O CH3 CH2
O-metil magnolol
kadsurenona
Lignoides o los Oligómeros de lignanos, con este término se designa al resultado de la condensación de tres a cinco unidades de fenilpropanos. Lignanos diversos O O
H 3C O H 3C O H3C O
CH3
CH3
H 3C O
Schisandrina B
Lignanos conjugados Dentro de esta clase de sustancias existen los lignanos conjugados con otros compuestos fenólicos como los flavolignanos: condensación entre un lignano y un flavonoide, constituyentes de Sylibum marianum (Asteraceae) o cardo mariano.
27 OH O
HO
OCH3
O O
=R
OH OH
OH
O
Silibina R
OH
O OH
O
R
O
HO H 3C O
OCH3
Silicristina
HO
OH
Silidianina
Constituyentes de Silimarina
BIOGÉNESIS DE LIGNANOS La biogénesis de los lignanos se basa en el acoplamiento oxidativo de fenoles, este acoplamiento por dimerización de los precursores C6C3 puede explicarse de forma bielectrónica o por radicales libres. El acoplamiento bi-electrónico se explica según el esquema siguiente[8]: Luego del acoplamiento oxidativo de fenoles, actuan NADPH +H+ y aromatizar los anillos, según el esquema de la formación del ácido guaiarético por radicales libres (ver adelante). R
H
+ HO
R
R
-O
R
R
R
Ac. guayarético
O-
O
O-
O
E1 acoplamiento mediante radicales libres, mostrado en el esquema siguiente, permite determinar las posiciones activas del anillo las cuales son en para y en meta a la cadena lateral[4]: R'
X
X= CH3, CH2OH, COOH R,R'=H, OH, OCH3
HO R
.
-H
R'
X
.O
O R I
X
R'
. R II
.
R'
X
R'
.
O
O R III
R IV
X
28
En la estructura IV, el radical libre se encuentra en la posición β de la cadena; por lo tanto, cuando se unen dos estructuras del tipo IV se forma un lignano, cuando se unen dos estructuras diferentes a IV-IV se forma un neolignano. X
H3C
X
CH3 H
R'
O R''
R'
H3CO
O
O
OCH3
O H+
R''
H3CO OCH3 NADPH+H+
H3CO
HO
OCH3
OH
O
OH
H+
Ac. guayarético
Formación del ácido guaiarético
IV
+
IV
OCH3
OCH3
H3CO
H3CO O O
O H
H+
OH
O
-OH
H+
O
H3CO
OCH3
OH
galgravina
HO
Biogénesis de la galgravina -OH HO
OH
HO . .
OH
O
O
OCH3
H3CO
O
O
O OH-
HO
O O
H3CO
O
OH
OH
O
HO
HO
OH
O
-H2 O
OCH3
H3CO
OCH3
H3C O
O
OH
O
O HO
H-H2 CO O
H3CO
OCH3 OCH3
O
O
O O
+
OH
OH O
O
O CH3 H
O
O
O CH3
H3C O O CH3
O
2SAM
H3CO
OCH3 OH
Podofilotoxina
Biosíntesis de la podofilotoxina. EXTRACCIÓN DE LIGNANOS Los lignanos se pueden aislar por extracciones con metanol seguidas por particiones con solventes de diferentes polaridades. Los lignanos que poseen grupos fenólicos, se pueden separar por precipitación; a las soluciones alcohólicas se les adiciona KOH acuoso concentrado, estos se precipitan como sales de potasio o con acetato de plomo, precipitan como sales de plomo, en este último caso, los fenoles se liberan por la adición de H2S a la suspención alcohólica. Una vez obtenido el extracto, se monitorea por cromatografía en capa fina (ccf) y las manchas se observan en UV a 254 nm o con vapores de yodo.
29
CARACTERÍSTICAS ESPECTRALES DE LIGNANOS Una característica importante de los lignanos, es que todos producen rotación específica de la luz polarizada, o sea tienen un valor de α]D. Los espectros UV carecen de detalles particulares exceptuando aquellas conjugaciones con los anillos aromáticos, generalmente tienen dos máximos de absorción de similar intensidad uno entre 230 – 240 nm y el otro entre 280 y 290nm.Las insaturaciones conjugadas con los anillos aromáticos originas desplazamientos de las señales. El espectro de masa muestra los diferentes fragmentos para la asarinina un bifuránico y para el dimetoxi galgravina un tetrahidrofurano. O O O
H2C
HO CH Ar
O
O O
O
m/e= 203
m/e=354
CH 2-CH2
Ar
+
Ar-CH=CHCH2
m/e=161
m/e= 179 H 3C H 3C
CH 3
H 3C
OCH 3 OCH 3 H
O
O
OCH 3
H 3CO OCH 3
OCH 3
H 3CO OCH 3
Señales de 1H RMN de lignanos tipo tetrahidrofuránico y arilnaftalinlactona[13] 7.69 1.08 H3C 3.9 1H3CO
7.04
7.32
1.05 CH3 1.78
5.10
O
1.78 4.43
3.83 O CH3
6.55
7.0 6.93
6.60
O
6.55
3.83 OCH3 O CH3 3.83
5.93
OH
O
H
O HO 5.60
O
8.36
H
5.94 6.77-6.94m
O O
H 6.06 H
6.03
INTERÉS BIOLÓGICO DE LOS LIGNANOS[11] Gran número de lignanos y neolignanos poseen diferentes usos terapéuticos, en especial como inhibidores enzimáticos y antihipertensivos como los derivados del pinoresinol, potencializadores de la acción de piretros, como el aceite de sésamo, hepatoprotector como la schisandrina B aislado de los frutos de Schisandra chinensis Fam. Magnoliaceae, etc. pero solo los derivados hemisintéticos de la podofilotoxina, con propiedades citostáticas y antimitóticas, y los flavolignanos del cardo mariano, con propiedades antioxidantes y hepatoprotectoras, se encuentran con formulaciones farmacéuticas y son explotadas terapéuticamente.
30
ALGUNAS PLANTAS QUE CONTIENEN LIGNANOS[5, 9-11] Podofilo, resina de podofilo, Podophyllum peltatum, Fam Berberidaceae La droga esta constituido por las raíces y el rizoma desecado, es una planta herbácea, perenne, común en lugares húmedos del oriente de Canadá y Estados Unidos. Los principios activos del podofilo entre 8 y 12%, son podofilotoxina y α y β peltatina, los cuales se obtienen precipitando el extracto alcohólico de resina en agua. La resina de podofilo es citotóxica y se usa localmente en el tratamiento de verrugas. Hyptis verticillata, Fam. Lamiaceae [9, 10, 13]. Las partes aéreas de este arbusto de 1 a 2 metros de altura, son usadas por los indígenas centroamericanos, como antibacteriano y antiinflamatorio, antihelmíntico y antifúngico. Contienen triterpenos, esteroides y los lignanos podofilotoxina, β peltatina y ácido rosmarínico. Cardo mariano, Silybum marianum, Fam. Asteraceae[4, 11, 12] Hierba bianual que alcanza hasta los 2 m de altura, con hojas alternas, grandes, y el margen muy espinoso, limbo verde oscuro, brillante, con manchas blancas irregulares. Las semillas de Cardo Mariano, desde épocas antiguas, han sido utilizadas en el tratamiento de los trastornos hepáticos. La semilla está compuesta por: principios amargos, aceite esencial, resina, tiramina, hitamina y flavonas. El componente más importante y que justifica su acción es la silimarina que es un componente lignoflavonoide muy amargo y con marcada acción hepato-desintoxicante y regenerador hepático, por lo que resulta particularmente útil en el tratamiento de trastornos hepáticos, tanto lesionales como funcionales, tóxicos (tetracloruro de carbono, tioacetamida, paracetamol, etc.), infecciones virales (hepatitis tipo A, B, etc.). ESTRUCTURAS POLIMÉRICAS A partir de derivados del ácido shikímico, se forman tres tipos de polímeros ver Fig 11: Las ligninas, los taninos y los derivados de la tirosina, pasando por dopa amina y que genera la melanina responsable de la pigmentación de la piel. Ligninas son polímeros de unidades C6-C3 con peso molecular alto ∼8000 correspondiente a ≈40 unidades y constituye entre un 22 a un 34% de la madera, contienen tres tipos de residuos aromáticos el Guaiacil o coniferil, el siringil o sinapil y el p-cumaril. Se detecta la lignina con el test de floroglusinol en HCl dando un color rojo o también con el test de Maüle, que se puede determinar la clase de material vegetal, se trata el material con KmnO4 seguido de HCl y luego amoniaco, dando un color púrpura para las Gynnospermas y un color marrón para las Angiospermas dependiendo de cual sea el residuo. Los polímeros de las Gymnospermas contienen solo residuos de alcohol coniferilico, las Angioespermas dicotiledoneas contienen los residuos coniferil alcohol y sinapil alcohol, mientras que las Angioespermas monocotiledoneas contienen los tres residuos coniferil alcohol, sinapil alcohol y pcumaril alcohol[4].
31
Gymnospermas OCH3 OH
Angiosperma (Dicotiledoneas)
Angiosperma (Monocotiledoneas)
CH3O
OCH3 OH
CH3O
OCH3 OH
OCH3
OCH3
OH
OH
p-hidroxifenil p-cumaril
siringil sinapil
OH guaiasil coniferil
Taninos[1, 5, 11, 14] son sustancias de origen vegetal y de estructura polifenólica, peso molecular entre 500 y 3000; son amorfas, de sabor astringente, solubles en agua, en alcohol y en acetona en forma de soluciones coloidales, pero su solubilidad depende del grado de polimerización, son insolubles en solventes apolares;, por su capacidad de precipitar proteínas, se usan para curtir la piel. Se encuentran repartidos en la mayoría de las especies vegetales, especialmente en familias como: Coniferae, Ericaceae, Labiadas, Leguminosae, Myrtaceae, Poligonaceae, Rosaceae Rubiaceae, Fagaceae, fabaceae, etc. Desde el punto de vista farmacológico, presentan acciones derivadas de su capacidad de formar complejos y precipitar metales, alcaloides y proteínas: •
Astringentes y antidiarreicos, se unen y precipitan las proteínas presentes en las secreciones.
•
Antimicrobianos y antifúngicos.
•
Antídotos para el envenenamiento con alcaloides y metales pesados. Su toxicidad en general es baja y deriva de la posible intolerancia gástrica y estreñimiento que pueden causar.
Se localizan en vacuolas, combinados con alcaloides y proteínas y desempeñan una función defensiva frente a insectos: agallas, maduración de los frutos. Se pueden encontrar en todos los órganos de la planta: Corteza: roble (Quersus colombiana), castaño (Sterculia apetala), eucalipto (Eucalyptus globulus), granada (Punica granatum), canela (Cinnamomum zeilanicum), quina (Cinchona sp.) Madera: mangle (Rhysophora mangle), acacia (Delonix regia). Hoja: hamamelis (Hamamelis virginiana), té (Thea sinensis), guayaba (Psidium guajava), almendro (Terminalia catappa). Flores: rosa roja (Rosa canina). Granos o semillas: café (Coffea sp.), kola (Cola nitida). Tejidos patológicos y órganos viejos: agallas de alepo (corteza de roble resultado de la descomposición debido a la ovoposición de las avispas.
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Taninos hidrolizables: galotaninos y elagitaninos, que pueden ser hidrolizados por ácidos o enzimas, son formados por varias moléculas de ácidos fenólicos derivados del shikímico unidos por enlaces éster a un núcleo central de glucosa. Taninos condensados o proantocianinas o también llamados catecol taninos, son moléculas más resistentes a la ruptura y cuyas unidades son derivados flavonóidicos, estos taninos se estudiaran mas adelante. En este capítulo solo hablaremos de los taninos hidrolizables. Galotaninos Los galotaninos son aquellos en los cuales son unidades comprenden ya sea el ácido gálico o el ácido digálico. Algunos ejemplos ruibarbo, clavero, pétalos de rosa roja, hojas de gayuba, agallas de China, hamamelis, castaño y arce Elágitaninos son aquellos cuyas unidades contienen el ácido elágico o el ácido hexahidro difénico. Algunos ejemplos Eucalipto, castaño, corteza de roble. HO
HO
O
O
COOH
HO
HO
C
OH
COOH
O HO
OH
C
COOH O
OH HO
ácido gálico
HO
O
O HO HO
HO
C
ácido digálico
HO
OH OH
HOOC OH OH
ácido elágico
ácido hexahidroxidifénico
Estos taninos pueden ser hidrolizados por enzimas cono la tanasa, secretada por Aspergillus sp. y Penicillum sp., hidrolizando la glucosa y liberando los ácidos que los conforman. Las soluciones acuosas de los taninos precipitan con sales de metales pesados Cu, Fe, Hg, Pb, Zn. Con sales férricas los taninos hidrolizables producen una coloración azul oscura y los taninos condensados una coloración verdosa. PRINCIPALES PLANTAS QUE CONTIENEN TANINOS[5, 11, 15, 16] Agallas de Roble (alepo) Quercus infectoria, Fam. Fagaceae Son excrecencias o verrugas formadas sobre las ramas jóvenes del roble, como resultado de la ovodeposición de la avispa de agalla (Adleria gallaetinctoriae), al desarrollarse la larva, induce a la proliferación celular de los tejidos del huésped, formándose una masa globosa, dura y densa de coloración variable, donde se acumulan ésteres galotánicos de glucosa en gran proporción (50-70%). Hamamelis Hamamelis virginiana, Fam. Hamamelidaceae. Es un arbusto de 2 a 5 m de altura, ampliamente distribuido al norte de América, la droga esta constituida por las hojas secas, utilizadas por sus propiedades astringentes y vasocontrictoras. Las hojas de hamamelis contienen ~10% de galitaninos y elagitaninos, proantocianinas y principios amargos.
33
HO
CO2H NH2
HO
CO2H
CO2H
HO
tirosina
HO
ác.caféico
OH OH ác.gálico
O
MeO
CH2OH
CO2H N
O
HO coniferol
H
melanina
taninos
lignina
CH2OH HO
O
MeO
O OR OR
CO2H
R OH
N
O
H
O
O
O
HOH2C
C
CO2H
OH
CH2OH
N
O
H
O
O
HO
O
CO2H
C
OH n
OH
N
O
MeO
HOH2C
R
O
O
HO
H
C
O
HOH2C
O
HO
HO MeO
HO MeO
galotaninos
Fig. 11: Diferentes estructuras poliméricas derivadas de fenilpropanos.
Almendro tropical Terminalia catappa, Familia Combretaceae Árbol exótico ampliamente distribuida en zonas tropicales y subtropicales es considerado como la mayor fuente de taninos del trópico, de altura considerable de hasta 25 metros y cañón recto, cuyas ramas o brazos casi horizontales, saliendo de un mismo punto en todas direcciones, asemeja un quitasol sin curvatura; por cuya agradable y peregrina apariencia se destina para alamedas y jardines; la madera es blanca, cáscara lisa, roja por dentro; hojas grandes, nerviosas, ovoides, algo angostadas por sus extremos y rematando en punta, verdes o moraduzcas, verdes amarillosas por debajo y ásperas; flores pequeñas, inodoras, de un verde blancuzco y en espigas; el fruto se asemeja a la almendra común. Las hojas han sido empleadas en la medicina tradicional en Taiwan, La India, Filipinas, Malasia e Indonesia, para el tratamiento de la dermatitis y la hepatitis[16]. Los compuestos presentes en las hojas de la Terminalia catappa son fundamentalmente taninos hidrolizables como: punicalagina, punicalina Fig. 12, ácido chebulágico y geranina. OH
OH
HO
HO O
O
HO
OH
HO
OH
O
O OH
OH
O
OH O
O O
HO OH
HO
OH
OH
HO
O
O
O O
OH
HO
O
OH
O
O
HO HO
O
O O
HO
HO CH3
OH
OH HO
HO OH
HO
OH OH
O
OH
Fig. 12. Estructuras químicas de punicalina y punicalagina.
34
CUMARINAS[4, 5,9, 10, 17, 18] Las cumarinas su nombre viene de “Coumarou” nombre común de la haba tonca (Dipteryx odorata Willd., Coumarouna odorata Aubl. Fam. Leguminosae/Fabaceae), son metabolitos típicos de plantas superiores y algunos pocos microorganismos, su núcleo es benzo 2 pirona o benzo α pirona. En general son lactonas insaturadas y comprenden otra clase de compuestos C6C3, prácticamente todas las cumarinas, a excepción de la cumarina propiamente dicha, poseen un sustituyente oxigenado en posición 7, ya sea hidroxilado como sucede en la umbeliferona, o combinado (metilo, azúcares, etc.). Se han aislado unas 1000 cumarinas naturales en unas 150 especies distribuidas en aproximadamente 30 familias, principalmente en Umbeliferae/Apiaceae, Rutaceae, Leguminosae/Fabaceae, Papilionaceae, Rubiaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Solanaceae, Gramineae, etc. En forma libre o como glicósidos. La propiedad física mas importante de estos compuestos es la fluorescencia generada con la luz ultravioleta (365 nm), propiedad ampliamente usada para su detección. Estos compuestos presentan un amplio rango de actividad biológica, podemos citar: la acción anticoagulante y antibacterial del dicumarol, la acción antibiótica de la novobiocina, la hepatoxicidad y carcinogenicidad de ciertas aflatoxinas, la acción estrogénica del cumestrol, la acción fotosensibilizadora de ciertas furanocumarinas, etc., se destaca además, el uso de cumarinas como saborizantes y en perfumería[17, 18]. Las cumarinas se clasifican en: Cumarinas simples Cumarinas complejas Estas a su vez, se clasifican en Furanocumarinas y Piranocumarinas, las cuales, dependiendo de la posición del anillo furano o pirano, se subclasifican en lineales y angulares. Cumarinas diversas Biosíntesis de cumarinas La biogénesis de las cumarinas simples presentes en Gramíneas y algunas plantas superiores, se derivan biogenéticamente del ácido shikímico, vía ácido cinámico, la especificidad del proceso consiste en la hidroxilación del carbono 2, produciendo un rompimiento (β-oxidación) de la cadena lateral, como ocurre en plantas del género Salix, o una isomerización de la cadena y posterior lactonización, generando la umbeliferona, se explica según el esquema siguiente[4, 11], COOH
HO
COOH
COOH
[O]
Glu HO
OH
COOH HO
OGlu
HO
ß-oxidación
COOH
HO
OH
Ácido salicílico
-Glu HO
OGlu
-Glu
COOH
OGlu
HO
O
O
umbeliferona
En general la formación de cumarinas en plantas superiores, ocurre en forma radicalaria, por acción de enzimas del tipo peroxidasa, como se muestra en la figura 13.
35
BIOSINTESIS DE COUMARINAS O
O
OH
OH
HO
HO
H2O2 H
H
O
O
PEROXIDASA OH
OH O
O
OH
OH
H2O
OH OH
O O
HO
HO
O
O
OH OH
HO
H
O
HO
O
HO
O
H
O
O
O
Figura 13 Biosíntesis de las cumarinas
Las cumarinas simples pueden tener sustituciones oxigenadas en las posiciones 6, 7 y 8 del núcleo bencénico, como se muestra en la siguiente tabla. 5
4
6
3 2
7 8
R6 H H H OH H OCH3 OCH3
R7 H OH OCH3 OH OH OH OH
R8 H H H H OCH3 H OH
O 1
NOMBRE Cumarina Umbeliferona Herniarina Esculetina Hidrangetina Escopoletina Fraxetina
O
ORIGEN PRINCIPAL Haba tonca Leguminosae / Fabaceae, Solanaceae, Thymeliaceae Compuesta Lavandula sp, Ruta graveolens Castaño de indias Rosaceae Hydrangea macrophylla (Hortensia) Tabaco, Bella dona Solanaceae Apocinaceae (Echites ursuta), Oleaceae
Cumarinas complejas Además de las cumarinas simples citadas anteriormente, también se originan a partir del ácido shikímico las llamadas cumarinas piránicas y furánicas, estas a la vez se dividen en lineales y angulares dependiendo de la posición donde se condensa el isopentenil pirofosfato para luego ciclarse y formar el heterociclo. Furanocumarinas. En 1934 se aisló el primero de estos compuestos, el bergapteno (psoroleno metoxilado en posición 5) de Citrus bergamia y posteriormente la xantotoxina (8 metoxi psoroleno); en 1940 se identificaron estos compuestos como los
36
responsables de producir fotodermatitis, estos compuestos son altamente fluorescentes bajo luz UV y aun en la región visible.
O
O
O
O Sposoleno
O
Angelicina
H3C HO H3C
O
O
O
O
O
Marmesina
O
Columbianetina
H3C HO CH3
Furanocumarinas
Los Psoralenos o furanocumarinas lineales[4, 8, 17], son ampliamente distribuidas en plantas y son particularmente abundantes en Umbeliferae (Apiaceae) y Rutaceae, los ejemplos mas comunes son psoraleno, bergapteno (visnagina), xantotoxina (metoxaleno) e isopimpinelina (kelina). Las plantas que contienen sporalenos, son usadas interna o externamente en “PUVAterapeutico” (tratamiento fotoquimioterapeutico donde se utiliza el Psoraleno con la luz ultravioleta A –cercana al visible-) en el tratamiento de la de psoriasis, vitiligo, y otras afecciones de la piel o para producir bronceado. R1
O
O
O
R2
Psoraleno: R1=R2=H Bergapteno: R1=OCH3, R2=H Xantotoxol: R1=H, R2=OH Xantotoxina: R1=H, R2=OCH3 Isopimpinelina: R1=R2=OCH3
El metoxaleno[4, 9, 11] o xantotoxina, un constituyente de los frutos de Ammi majus Umbeliferae (Apiaceae), (apio cimarrón) es usado para facilitar la repigmentación de la piel, en casos de vitiligo y psoriasis, administrado via oral y luego exposición a la luz UV, minimiza el riesgo de quemaduras extremas y cáncer de piel, el metoxaleno reacciona con las bases pirimídicas del DNA inhibiendo la replicación y reduciendo la rata de división celular. O NH O
N
R
H3C
O
O
CH3
HN
N
O
OCH3
O
O
O
O
O
hv
CH3
O
HN O
N
O
O CH3
R
hv
O O
CH3 HN O
N
O
O CH3
R
R
Timina de DNA xantotoxina
aducto DNA-psoroleno
diaducto DNA-psoroleno
La actividad fotosensibilizante de estos compuestos, se explica fundamentalmente por la reactividad en su estado excitado triplete (T1) (ver esquema), que se genera por efecto de la luz UV, ocasionando posibles reacciones de tipo radicalario, pueden ser reacciones
37
enlazantes con proteínas o macromoléculas (DNA o RNA) y proteínas, o reacciones de transferencia de energía al oxigeno molecular[19]. Desactivación de los estados excitados
S1
Fotorreacciones CS Fl
hν
T1
Q Q
F
Fotorreacciones S0
Fl: Fluorescencia, F: Fosforescencia, Q: Calor, CS: Cruzamiento entre sistemas, S0: Estado singlete, S1: Estado excitado, T1: Estado triplete
Las piranocumarinas tienen el núcleo pirano unido en posiciones 6-7: tipo xantiletina y 7-8: tipo sesilina. H3C H3C
O
O
O
O
O
O
H3C H3C
Xantiletina
Sesilina
La biogénesis de estas cumarinas relativamente complejas, puede proceder por una ciclización de una cumarina simple previamente prenilada[11], e1 esquema general para la biogénesis de este tipo de cumarinas es el mostrado en la figura 14:
HO
O -H
.
CH2 OPP
O
-H
.
. .
O
O
CH2
O
O
O HO-
O
O
O HO
O marmesina
NADP+ O
O
psoroleno
O
O
Figura 14: Biogénesis del psoroleno
Cumarinas diversas El dicumarol se forma por fermentación bacteriana de tréboles y pasto, se aisló de hojas descompuestas de Melilotus albus Leguminosae/Fabaceae. El dicumarol (bishidroxicumarina) antogoniza con la protombina y otras proteínas necesarias para la
38
coagulación de la sangre, presentando un problema para el ganado al consumirlo, también es utilizado comercialmente en venenos para ratas. OH
OH CH2
O
O O
O
Dicumarol
Análogos sintéticos del dicumarol son utilizados vía oral como anticoagulantes para el tratamiento de la trombosis, como es el caso de las sales de warfarina y acenocumarol (nicumalona). NO2
OH
O
OH
O
CH3
CH3 O
O
O
O
warfarina
acenocumarol (nicumalona)
Una aproximación a la biogénesis del dicumarol[4] es hidroxilando la posición 4 de la cumarina, luego capta una molécula de formaldehído y condensarse con otra molécula de cumarina hidroxilada en 4 ypor último, enolizar el grupo ceto formando el dicumarol, como se muestra en la figura 14: O -OH
HCH OH
OH
OH
OH
CH2
CH2 -H2O O
O
O
OH
OH
O
O
O
OH
O
O O
O O
O
O
O
dicumarol
O
O O
Figura 14: Biogénesis del dicumarol
Derivados de 3 fenil cumarinas del tipo cumestrol y el antibiótico novobiosina, son ejemplos de cumarinas diversas. O
OH
OH O
O
H3C O
NH2
HO
H N
OH
O H3C
HO
O
Cumestrol
O
H3C
O
O
O
CH3 CH3
O
CH3
Novobiosina
Las aflatoxinas son un grupo de sustancias relacionadas estructuralmente con las cumarinas; son micotoxinas producidas por Aspergillus flavum y A. versicolor y que han sido la causa de mortalidad animal por ingestión de alimentos enmohecidos, provocando lesiones hepáticas
39
O
O
O
O
O
OCH3
aflatoxina B
Técnicas de extracción de cumarinas La extracción de las cumarinas puede realizarse tanto sobre material seco como fresco, con solventes de polaridades diferentes, dependiendo de los tipos de estructura, algunas son ligeramente solubles en solventes apolares y a menudo pueden cristalizar directamente en ellos por enfriamiento o concentración del solvente. Métodos espectroscópicos para determinar cumarinas[17, 18] UV: Hay que diferenciar las cumarinas de las cromonas simples, estas presentan fuertes absorciones entre 240-250 nm (log ε: 3.8), mientras que las cumarinas simples absorben a 274 y 311 nm (log ε: 4.03 y 3.72) debido a los anillos bencénico y α pirona respectivamente y presentan variaciones según sus sustituyentes (ver fig 15). La mayoría de las cumarinas presentan sustituciones oxigenadas en C-7 (solo 35 de las 800 conocidas no la tienen), esta sustitución causa un efecto batocrómico en la banda de la banda de la α pirona, la posición de nuevas bandas depende de la posibilidad de conjugación del grupo hidroxilo con otros agentes cromóforos. Para el caso de las Furanocumarinas; las lineales tipo Psoroleno presentan bandas de absorción a 205-225 (log ε: 4.0), 240-255 (log ε: 4.06-4.45), 260-270 (log ε: 4.18-4.26) y 298-316nm (log ε: 3.85-4.13).
Figura 15: bandas de absorción de cumarinas simples[17]
IR: C=O 1715 - 1745 cm-1 Grupo α pirona (lactona conjugada) Psorolenos 1720 cm-1 Furano: C-O furánico : 1088-1109 y 1253-1274 cm-1 Dehidropirano 1735-1750 cm-1
40
RMN: Se muestran algunos ejemplos con las señales representativas en RMN de 1H y de 13C. 7.5-8.3
J=9.5 Hz 6.1-6.4
O
J:8Hz
124
6.88d
114.2 116.2
146.4
5.32d J.9hZ
OH
O
O
O
160.2
143.5 148.3 131.2 O
O
O
4.55d J:9Hz
HO
O
144.2
106.6 125.7 113.2
3.99s H 3C O
160.4
O
116
7.63d J:10Hz 6.24d
116.4
118 153
131
O
7.40d
143.6
128
CH3
69.8 CH317.8
119.7 1.76s
139.2
4.60d H H 4.64d J:15Hz
CH3
25.5
Murrangatina
imperatorina
SM: Se muestran algunos ejemplos típicos de fragmentación como la cumarina, la 7metoxicumarina, la capencina o metoxipreniletina y la colombianetina[17, 18] -CO O
-CO O
O
-CH 3
O
.O+
H3CO
m/e 133 ( 83%)
MeO -C 5H 8
H O OH
m/e 69 (90%)
+
MeO
+ CH2
H3C
O
O
m/e 148 ( 82%)
m/e 176 (100%)
H3C
89
90
-CO
.O+
C7H7
M-28 118 (100)
m/z: 146
H3CO
-H
C7H8
.O+
m/e 276 (1.4%)
O
HO OH
.O+
m/e 208 (100%)
O
41
-.CH3
- H2O +
O
H3C
H
OH
O
O
O
H3C
H3C
O
O
.
O
+
.
-CH 3COCH 3
O
O
O
m/e: 213
m/e: 228
m/e: 228
O
H3C
CH3
m/e: 246
.
+
H3C
H3C
O
+
O
O
.O
H-
-CO
O
O
O
-CO
O
+
O
O H 3C
m/e: 188 (100%)
m/e: 187
m/e: 159
m/e: 132
PRINCIPALES PLANTAS QUE CONTIENEN CUMARINAS[5, 11, 20, 21] Haba tonca, Dipteryx odorata Willd., Fam. Leguminosae/Fabaceae) Árbol originario de Sur América y cultivada actualmente en Venezuela, Guayana y Brasil, la droga esta constituida por las semillas desecadas que contienen entre 1 y 3% de cumarina, 25% de grasa y gran cantidad de almidón; utilizadas en perfumería y como aromatizante del tabaco y del whisky. Meliloto, Melilotus officinalis (L) Pallas, Fam. Fabaceae. El meliloto constituye una especie forrajera de hojas trifoliales y flores amarillas, ampliamente distribuida, su nombre deriva del griego méli miel, por ser una de las plantas silvestres mas visitada por colibríes y abejas, también se le conoce como trébol oloroso, debido a que luego de ser recolectada, por su desecación desarrolla un olor agradable. La droga contiene como principios mayoritarios flavonoides, saponinas triterpénicas pentacíclicas y ácidos fenólicos, todas las especien en especial las de flores amarillas contienen el o-hidroxi cinámico (melitosido), el cual se hidroliza dando lugar a la lactinización y a la cumarina. Por una inadecuada conservación de la planta, se origina a partir de esta, el dicumarol (ver figura 14), sustancia anticoagulante que han producido procesos hemorrágicos en el ganado. Frutos de apio, Apium graveolens Umbeliferae (Apiaceae). Lea droga esta constituida por frutos maduros y desecados los cuales contienen entre 23% de esencia constituida por terpenos con pequeñas cantidades de anhídrido y lactonas del ácido sedanólico y fenoles. Cumarinas, furanocumarinas, colina, tirosina, glutamina, asparagina, apiona, oleonesina. Los frutos son utilizados como digestivos, carminativos, diuréticos, tranquilizantes y anticonvulsivantes. Apio cimarrón, Ammi majus Umbeliferae (Apiaceae) Planta distribuida en Mesoamérica y el norte de Suramérica los granos del apio cimarrón, contienen furanocumarinas principalmente bergapteno, isopimpinelina y xantotoxina
BIBLIOGRAFIA
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