Cuestionario de Enzimas 1) ¿Qué es una enzima? ¿Cuál es su función? 2) ¿Qué significa que una enzima es un catalizador biológico? 3) ¿Cuál es la estructura química de las enzimas? ¿Qué es el sitio activo de una enzima? ¿Por qué tres aminoácidos que forman parte del sitio activo pueden estar alejados en la estructura primaria? 4) Explique a qué se denomina apoenzima, holoenzima, coenzima, cofactor y grupo prostético. 5) Explique y ejemplifique qué son las isoenzimas. 6) ¿De qué depende la especificidad de las enzimas? 7) Para la reacción de A → B se aplica el siguiente diagrama. Calcule: ) l o m 400 / l a c (
Estado Esta do activ activado ado
sin enzima
G 300 con enzima
200 Sustrato 100 Producto
Grado Grado de avanc avance e de la reacc reacción ión
a) El ∆G para la reacción de A → B, indicando si se producirá espontáneamente esta reacción en el sentido en el que está escrita. b) La energía de activación a ctivación (Ea) en presencia presenci a y ausencia de enzima indicando qué curva corresponde a cada caso. Cinética Enzimática. 8) ¿Cómo se hace para determinar la concentración de una determinada enzima en una muestra de extracto tisular o de algún líquido biológico’ 9) Defina actividad de una enzima. ¿Cómo se determina?¿Qué son las Unidades Internacionales (UI)? 10) ¿Qué información brinda la actividad total y la actividad específica? 11) ¿Cuáles son los factores que modifican la actividad enzimática? 12) Explique cuál es la influencia de las variaciones de temperatura sobre las velocidades de reacción enzimática. a) Dibuje un gráfico de la velocidad de reacción en función de la temperatura explicando qué pasa a baja temperatura y alta temperatura.
b) ¿Qué es la temperatura óptima? 13) Discuta cómo afectan los cambios de pH a la actividad enzimática a) ¿Cuál es el mecanismo por el cual los cambios de pH afectan a la actividad enzimática? 14) En el siguiente gráfico, se muestran los pH óptimos de tres enzimas importantes ¿Qué puede decir al respecto?
15) En el estudio de una enzima se midió la concentración del compuesto producido a los largo del tiempo. Se obtuvo el siguiente gráfico:
Proponga un diseño experimental para la obtención de este gráfico Indique: a) ¿Qué parámetros se miden y cómo? b) ¿Qué parámetros se mantienen constantes durante la determinación? c) ¿Cómo se obtiene la velocidad de la reacción a un tiempo dado? d) Compare la velocidad de la reacción a t1 y t2. e) ¿Qué significado tiene la meseta que se observa en el gráfico?
f) Grafique los resultados obtenidos cuando se realiza la misma experiencia i) con diferente [Enzima] ii) con diferente [S] inicial g) Realice un gráfico que muestre cómo varía la velocidad de reacción en función del tiempo. h) ¿Qué otras determinaciones necesita realizar para poder determinar los parámetros cinéticos de la enzima? 16) a) Explique qué información proporciona el 100 siguiente gráfico. b) ¿Cómo procedería ) experimentalmente para o V ( construir dicho gráfico. 75 s e l c) ¿A qué se denomina una a i c enzima Michaeliana. i n i d) ¿Cuáles son los s 50 e d parámetros cinéticos de una a d i enzima Michaeliana? c o l e) Señale en el grafico Km y e v 25 Vmáx. f) Dibujar en el mismo gráfico la curva que se 0 obtiene con una 0 concentración mayor de enzima. En este caso ¿cómo se modifica el Km y la Vmáx?.
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
concentracion de sustrato
Actividad enzimatica: Recuerde.
Actividad enzimática: Unidad Internacional
UI = moles/ min
Katal
Katal = mol/ seg
Actividad Específica
AE = UI/ mg proteínas
17) 20 ul de una homogenato de tejido hepático (250 µg de proteínas) catalizan la formación de 56,7 µmoles de glu-6P en 15 minutos de incubación en las condiciones óptimas para la determinación de la actividad de glucoquinasa. a)¿Cuántas UI de enzimas habrá en dicha preparación? b)¿Cuántas por ml de homogenato?. c)¿Cuál será la actividad específica de dicha preparación? d)¿Cómo esperaría que fuera esta último valor con respecto al de la enzima pura? e)¿Cuál es el valor de actividad enzimática expresado en Katales?
18) La hidrólisis de pirofosfato a fosfato constituye una fuerza impulsora importante en muchas reacciones químicas (por ejemplo: síntesis de ADN). La Vmáx de una pirofosfatasa purificada de E.coli es de 2800 UI/mg de proteina. ¿Cuántos moles de sustrato son hidrolizados por segundo por mg de proteina cuándo la concentración del sustrato es mucho mayor que el Km? 19 Un extracto formado por 94 g de proteínas totales contiene una enzima (no purificada) que cataliza la transformación de 480 µmoles de sustrato en producto en 30 segundos. Luego de varios pasos de purificación se obtuvieron 27 mg de proteínas totales, capaces de transformar 220 µmoles de sustrato en 30 segundos. a) calcule la actividad (en unidades internacionales) y la actividad específica de las preparaciones antes y después de la purificaron. b) ¿Cómo varían la actividad y la actividad específica en el proceso de purificación? Justifique.
20) En un experimento en el estudio de una enzima se obtuvieron los siguientes resultados. Calcule la velocidad inicial Vo.
21) La hidrólisis de la sacarosa, catalizada por la sacarasa.
Sacarosa + H2O
→
Tiene el siguiente curso. a) Calcule las velocidades de la reacción.
Glucosa + Fructosa
Tiempo (segundos) 0 20 40 60 90 130 180 360
[producto] (mM) 0,050 0,195 0,342 0,488 0,659 0,770 0,871 0,991
Velocidades (mM/segundos)
1,0
0,8 M m ) o 0,6 t c u d o r P ( 0,4
0,2
0,0 0
100
200
300
400
t (segundos)
b) Utilizando el grafico de aparición de producto en función del tiempo que se muestra a continuación, i) Calcule la velocidad inicial (Vo). ii) Realice el gráfico velocidad vs tiempo.
22) Midiendo la velocidad inicial de una reacción en presencia de diferentes concentraciones de sustrato, se obtuvieron los siguientes datos: Indique en qué condiciones se realizó la determinación. ¿Qué significado tiene la meseta que se observa en el gráfico?
[Sustrato] (M) -6 2,5 10 -6 4 10 -5 1 10 -5 2 10 -5 4 10 -4 1 10 -3 2 10 -2 1 10
Vo ( M/min) 28 40 70 95 112 128 139 140
23) La hexoquinasa cataliza la fosforilación de la glucosa y la fructosa utilizando ATP. Siendo el Km para la glucosa 0,13 mM, mientras que para la fructosa es 1,3 mM. Indicar por cuál de ambos sustratos la enzima tiene mayor afinidad. Considere que ambas Vmáx son muy similares para ambos sustratos.
24) Se tienen dos enzimas que catalizan la misma reacción
A
→
B
La enzima 1 tiene un Km para el compuesto A de 10 mM. El Km de la enzima 2 para el compuesto A es de 0,1 mM. Compare la velocidad de ambas enzimas cuando la [A] = 1 mM, con respecto a la Vmáx de cada una de las enzimas.
25) Una cantidad constante de una solución de [Sustrato] Vo una enzima fue adicionada a una serie de tubos ( M) ( M/min) conteniendo diferentes concentraciones de 0,1 0,27 sustrato [S]. La velocidad inicial (Vo) de la 2 5 reacción fue obtenida por la medida de la 10 22 pendiente inicial de la curva de formación de 20 40 producto. Los datos se representan en la 40 67 siguiente tabla. 60 80 Considere que la enzima tiene un 100 100 comportamiento michaeliano. 200 120 a) Sin graficar, estime un valor aproximado para 1000 150 ambos parámetros cinéticos, Km y Vmáx. 2000 155 b) Usando los parámetros cinéticos del inciso a), 3000 163 calcular la velocidad inicial cuando la concentración de sustrato es 15 µM. c) Utilizando los datos de la tabla, realice el grafico de Michaelis-Menten. Calcule según el gráfico los valores de Km y Vmáx. d) Realice la representación gráfica de las dobles reciprocas o Lineweaver-Burk. Calcule según este grafico los valores de Km y Vmáx.
26) Aunque existen métodos gráficos para la determinación precisa de los parámetros cinéticos, Km y Vmáx, ambos valores se pueden estimar en algunos casos particulares mediante la observación de datos como los registrados en la siguiente tabla. [Sustrato] Vo a) Estime el valor de Km y Vmáx (mM) (mM/min) -6 b) Calcule la velocidad inicial de la reacción cuando 2,5 10 28 -5 -6 [S] = 3. 10 mM. 4 10 40 -5 c) Utilizando los datos de la tabla, realice el grafico 1 10 70 -5 de Michaelis-Menten. Calcule según el gráfico los 2 10 95 -5 valores de Km y Vmáx. 4 10 112 -4 d) Realice la representación grafica de las dobles 1 10 128 -3 reciprocas o Lineweaver-Burk. Calcule según este 2 10 139 -2 grafico los valores de Km y Vmáx. 1 10 141 Inhibición enzimática 1) La biosíntesis de purinas y pirimidinas utilizadas en la síntesis de ADN necesita acido fólico. El Metotrexate es un análogo estructural del acido fólico utilizado en el tratamiento de algunos canceres. Se fija con 1000 veces más afinidad que el sustrato a la enzima dihidrofolato reductasa. Esta enzima es importante para el mantenimiento de los niveles del acido fólico.
a) Grafique Vo en función de [S] en presencia y ausencia del inhibidor. b) ¿Por qué este fármaco se utiliza para el tratamiento del cáncer? c) ¿Por qué el fármaco tiene efectos secundarios que afectan al tubo digestivo y al sistema hematopoyético?
2) El metabolismo del etanol se produce fundamentalmente en el hígado en dos pasos: en principio el etanol se oxida a acetaldehído por la enzima etanol deshidrogenasa (EDH) que consume NAD +. El acetaldehído es medianamente toxico, dado que normalmente es oxidado por la aldehído deshidrogenasa (ADH) a acetato. El Metanol también es sustrato de la etanol deshidrogenasa, pero el producto formado que se acumula es muy toxico. EDH + + Etanol + NAD Acetaldehido + NADH + H →
ADH Acetaldehido + NAD+
→
Acetato + NADH + H+
Caso A. A un hombre de 43 años se le prescribió disulfiran pero se le advirtió que no consumiera alcohol durante el tratamiento. El disulfiran inhibe en forma irreversible a la enzima aldehído deshidrogenasa y no presenta toxicidad en ausencia de alcohol. El paciente bebió una gran cantidad de etanol en una fiesta y tuvo que ser trasladado al hospital, donde murió esa misma noche. ¿Por qué el fármaco resulto tóxico para este paciente?
Caso B. Una persona ingirió vino adulterado con metanol. Posteriormente debió ser hospitalizada. Como parte del tratamiento, el medico le suministró un exceso de etanol. ¿Cuál es el fundamento de este tratamiento? Caso C. Los orientales son muy sensibles a las bebidas alcohólicas. Esto se debe a que la forma mitocondrial de la enzima aldehído deshidrogenasa de bajo Km esta ausente. Estas personas solo poseen la enzima citosólica de alto Km. a) En base a esta información explique la mayor susceptibilidad al alcohol en estos individuos. b) ¿Qué son entre sí las formas mitocondrial y citosólica de la enzima aldehído deshidrogenasa? 3) La siguiente tabla indica la velocidad con que se transforma un sustrato en una reacción catalizada por una enzima, en ausencia (c) y en presencia de dos inhibidores (I1 y I2). Calcule el Km y la Vmáx en cada caso e indique de qué tipo de inhibidores se trata. [Sustrato] (mM) 1 2 5 10 20
C 2,5 4,0 6,3 7,6 9,0
Vo (mM/min) I1 1,17 2,10 4,00 5,70 7,20
I2 0,77 1,25 2,00 2,51 2,86
4) Se quiere determinaron los parámetros cinéticos de una enzima que se comporta según el modelo de Michaelis-Menten, en ausencia y en presencia de un inhibidor no competitivo. Se obtuvo el 1/Vo gráfico que se muestra más abajo. 0,03 a) Indique como se denomina dicho gráfico. b) Indique que recta corresponde a la reacción en ausencia (control) o 0,02 presencia de dos concentraciones diferentes de un inhibidor I ( I1, I2). Considere [I2] > [I1]. c) Cómo calcularía los parámetros cinéticos a partir del gráfico. ¿Qué 0,01 valor calcula para los Km y las Vmáx?. d) Represente el grafico de Michaelis-Menten (Vo en función de [S]) para los tres casos. Identifique cada uno de los gráficos. -1
1
3
2
4
1/(S)
5) Se quiere determinaron los parámetros cinéticos de otra enzima michaeliana , en ausencia y en presencia de un inhibidor. Se obtuvo el gráfico que se muestra más abajo. a) Indique de qué tipo de inhibidor se trata. b) Indique cuál recta corresponde a la reacción en ausencia (control) o presencia de dos concentraciones diferentes de un inhibidor I (I1, I2). Considere [I2] > [I1]. c) Cómo calcularía los parámetros cinéticos a partir del gráfico. ¿Qué valor calcula para los Km y las Vmáx?. d) Represente el grafico de Michaelis-Menten (Vo en función de [S]) para los tres casos. Identifique cada uno de los gráficos.
1/Vo
0,03
0,02
0,01
-1
0
1
2
3
4
5
1/(S)
6) A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar: [S] en mM
2,0 3,0 4,0 10,0 15,0
Vo (g Prod /h) Sin inhibidor 139 179 213 313 370
Vo (g Prod /h) Con inhibidor 88 121 149 257 313
a) el tipo de inhibición presente b) el valor de Km en ausencia y en presencia del inhibidor 7) A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar: a) el tipo de inhibición presente b) el valor de Km en ausencia y en presencia del inhibidor.
[S] mM 1,5 2,0 3,0 4,0 8,0 16,0
Vo (g Prod /h) Sin inhibidor 0,21 0,25 0,28 0,33 0,40 0,44
Vo (g Prod /h) Con inhibidor 0,08 0,10 0,12 013 0,16 0,18
8) La penicilina es hidrolizada y así inactivada por la enzima penicilinasa, también conocida por β-lactamasa, presente en algunas bacterias resistentes. Se midió la cantidad de penicilina hidrolizada en un minuto en [Penicilina] cantidad función a la concentración de penicilina y se hidrolizada en M obtuvieron los resultados resumidos en la siguiente en nmoles/min tabla. 1,0 11 a) ¿Sigue la penicilinasa una cinética de Michaelis3,0 25 Menten?. En caso afirmativo, 5,0 34 b) ¿Cuál es el valor del Km? 10 45 c) ¿Cuál es el valor de la Vmáx? 30 58 (Sugerencia, realice el grafico de Lineweaver-Burk) 50 61 9) Considere los siguientes datos para una reacción de hidrólisis catalizada enzima y en presencia del inhibidor I. a) Utilizando una representación de [sustrato] Vo Michaelis-Menten, determine el Km de la (M) ( M/min) ( -6 reacción en ausencia o presencia del 6 10 20,8 -5 inhibidor. 1 10 29 -5 b) Genere una representación de 2 10 45 -5 Lineweaver-Burk de los datos. Explique el 6 10 67,7 -4 significado de: i) la ordenada al 1,8 10 87 origen ii) la intersección con el eje de las abscisas iii) la pendiente c) Determine de que tipo de inhibición se trata.
por una Voi M/min) 4,2 5,8 9 13,6 16,2
10) Se ha realizado dos experimentos con la enzima ribonucleasa. En el experimento 1 se midió el efecto del incremento dela concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción. En el experimento 2, las mezclas de reacción fueron idénticas a las del experimento 1 excepto la adición de 0,1 mg de un compuesto desconocido por tubo. Represente los datos de acuerdo don el método de Lineweaver-Burk. Determine el efecto del compuesto desconocido sobre la actividad de la enzima.
Experimento 1 [sustrato] Vo mM (mM/hora) 0,5 0,81 0,67 0,95 1 1,25 2 1,61
Experimento 2 [sustrato] Vo mM (mM/hora) 0,5 0,42 0,67 0,67 1 0,71 2 1,08
11) La enzima aspartato transcarbamilasa cataliza la primera reacción propia de la síntesis de pirimidinas. En un estudio de ésta enzima, utilizando aspartato como Aspartato V0 V0 con sustrato, en presencia de CTP 0,5 M y en (mM) sin CTP CTP 0,5 M ausencia del mismo, se obtuvieron los 1 0,45 0,2 siguientes datos: 2 0,8 0,4 a) Sin utilizar ninguna representación 3 1,7 0,7 gráfica, estime el valor de Km y Vmáx 4 2,9 1,0 b) Utilizando la ecuación de Michaelis5 3,4 1,4 Menten, calcular Vo para una [S]= 3 mM. 7 4,3 2,4 ¿Existe alguna discrepancia entre éstos 9 5,1 3,7 datos y los experimentales?. 10 5,3 4,2 Justificarlo (la realización del grafico Vo 12 5,6 4,8 vs [S] es una buena ayuda). c)
¿Qué efecto tiene el CTP sobre la
actividad enzimática?
15 16 17
5,8 5,8 5,8
5,5 5,6 5,6
12) Completar las siguientes frases: a) La región de una molécula de enzima con la cual debe interaccionar el sustrato se llama ------------------------------ b) La especie química de vida corta que se forma después de que la enzima y el sustrato interaccionen se llama ----------------------------------c) Debido a su estructura, un inhibidor -------------------------------- se une al centro activo de una enzima. d) Un inhibidor que no altera la K M de una enzima es un inhibidor de tipo ----------------e) A mayor valor de K M, --------------------- es la afinidad de una enzima por su sustrato.
Ejercicio integrador.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
O D O H
E N Z I M A T I C O
1) Capacidad de un enzima para discriminar entre sustratos o ligandos competitivos. 2) Modelo matemático que describe el comportamiento de muchas enzimas, como una dependencia hiperbólica de Vo versus [sustrato] ( 2 palabras). 3) Enzimas que tienen diferente estructura proteica y catalizan la misma reacción. 4) Zona de la enzima donde se une el sustrato para transformarse en producto (2 palabras). 5) Parámetro cinético relacionado con la afinidad de la enzima por el sustrato. 6) Parámetro cinético que depende de la cantidad de enzima presente (2 palabras). 7) Inhibición enzimática que se puede revertir aumentando la concentración de sustrato. 8) Inhibición enzimática que no se puede revertir aumentando la concentración de sustrato (2 palabras). 9) Ión inorgánico o coenzima necesaria para la actividad enzimática. 10) Molécula que modula a una enzima, por la unión no covalente, en un sitio distinto del sitio activo (2 palabras).
Problema adici onal
En el cerebro humano está presente una isoenzima de la fosfodiesterasa que degrada al AMPc y al GMPc con un Km de 20 µM y 6 µM respectivamente, pero con igual velocidad máxima. Ante un estímulo generado por neurotransmisores y péptidos natriuréticos, la concentración de estos compuestos se eleva a 10 µM. Indique cuál de los 2 compuestos será degradado más rápidamente por la enzima en esas condiciones. J ustifique.
