RHODOSPORIDIUM TORULOIDES – TORULOIDES – UTILIDAD UTILIDAD MICROBIOLÓGICA PRODUCCIÓN DE ACEITE MICROBIANO POR LEVADURAS EN REACTORES DE COLUMNA DE BURBURJEO Fuente: http://159.90.80.55/tesis/000172770.pdf La búsqueda de fuentes alternativas para la producción de energías que puedan sustituir los combustibles fósiles, y así reducir las consecuencias negativas que la utilización de éstos tiene sobre el medio ambiente, ha estimulado investigaciones con el objetivo de obtener combustibles renovables como el biodiesel. El biodiesel es un combustible biodegradable, no tóxico y poco contaminante, que es producido a partir de aceites vegetales y grasas animales mediante el proceso de transesterificación (Silva et al., 2012). La transesterificación es una reacción reversible de una grasa o aceite con un alcohol para formar ésteres y glicerol: usualmente se utiliza un catalizador para mejorar la velocidad de reacción y el rendimiento (Rivaldi, 2008). Sin embargo, el alto costo del aceite vegetal que alcanza entre el 60% y 80% del costo de producción del combustible, la necesidad de grandes extensiones de tierras agrícolas durante largos períodos de cultivo, la dependencia a las condiciones climáticas, la ubicación geográfica, la fertilidad y variedad de los suelos necesarios, tornan desfavorable el uso de aceites vegetales como materia prima para la producción de biodiesel. Por otra parte, debido a los bajos rendimientos de lípidos producidos por semillas y plantas oleaginosas, la producción de biocombustibles por esta vía genera una gran competencia con la industria de los alimentos. Una alternativa para esta problemática son los aceites microbianos, como los producidos por microalgas, hongos y levaduras. La producción lipídica a partir levaduras constituye una fuente interesante de materia prima renovable para la producción de biocombustibles, ya que la velocidad de crecimiento de las levaduras es mayor cuando se compara con la de las microalgas, y a su vez esta síntesis es independiente de los cambios climáticos o estacionales, al contrario de los cultivos vegetales. Los aceites extraídos de estos microorganismos son conocidos como SCO ( por por sus siglas en inglés para single cell oil) y el estudio de los mismos comenzó en la primera mitad del siglo XX. La utilización industrial se inició en Alemania durante la primera Guerra Mundial, siendo repetida durante la segunda Guerra Mundial. Al final de la década de 1950 otros países, como Estados Unidos y el Reino Unido, mostraron interés por la posibilidad de utilizar aceite microbiano en aplicaciones comerciales. Finalmente, después de la segunda Guerra Mundial, la producción de aceite microbiano continuó atrayendo la atención de los i nvestigadores. Se debe destacar que los aceites vegetales puros y sus derivados fueron utilizados en motores de combustión interna, como situación de emergencia por la crisis de abastecimiento mundial del petróleo y sus derivados debido a las guerras. Los aceites microbianos producidos a partir de levaduras pueden ser empleados en diferentes aplicaciones. Además de su uso como materia prima para biodiesel, sirven como surfactantes naturales, nutracéuticos y se pueden utilizar en la industria de alimentos y de cosméticos. Por otra parte, para la producción de lípidos son necesarias condiciones adecuadas de cultivo tales como la disponibilidad de nutrientes en el medio de cultivo, asociada con la limitación de un determinado nutriente, generalmente cantidades limitadas de nitrógeno. El perfil lipídico para las levaduras varía de especie a especie y éstas pueden llegar a almacenar hasta un 70% de su biomasa en lípidos. Las fuentes de carbono más utilizadas son la glucosa y el glicerol. Este último es el principal subproducto de la producción de biodiesel y representa a una alternativa
promisora como fuente de carbono en los procesos fermentativos, por su gran disponibilidad y su bajo valor económico. Otro aspecto a considerar cuando se trabaja con procesos fermentativos se refiere a la capacidad para cultivar elevadas cantidades de microrganismos en poco espacio. Esto es posible con el uso de recipientes conocidos como biorreactores o fermentadores. El reactor de columna de burbujeo es uno de ellos, el cual presenta ventajas significativas como bajos costos de operación en comparación con los demás reactores, poca manutención por no poseer partes móviles, elevada durabilidad de sus componentes, además de proporcionar excelente transferencia de masa y calor. Dentro de este contexto, el presente trabajo tuvo como objetivo general estudiar la producción de aceites microbianos por levaduras en reactores de columnas de burbujeo. Para ello se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Seleccionar, entre cinco cepas diferentes de levadura, la que presenta la mejor combinación entre productividad, rendimiento, y consumo de sustrato. 2. Evaluar el efecto del caudal de aire en un reactor de columna de burbujeo sobre la productividad, rendimiento y consumo de sustrato de la cepa de levadura seleccionada. 3. Determinar el coeficiente de transferencia oxígeno (KLa) en las condiciones de mayor productividad, establecida durante los estudios, para realizar la ampliación de escala del reactor. FUNDAMENTOS TEÓRICOS 1.1 Microrganismos oleaginosos Todas las células vivas están constituidas por un cierto contenido de lípidos, pero no todos los microrganismos pueden ser considerados como fuente de aceites y grasas. Dentro de los microrganismos oleaginosos se incluyen algunas especies de microalgas, hongos, bacterias y levaduras, capaces de producir y acumular por lo menos 20% de su peso seco en lípidos, generalmente en forma de triglicéridos TGC (Subramaniam et al., 2010). Por otro lado, bajo condiciones adecuadas de cultivo los rendimientos de algunos microrganismos (naturales o modificados genéticamente) pueden alcanzar valores de entre 40 y 70% o más de lípidos en composición celular en base seca (Faife et al., 2012). El aceite microbiano, también conocido como SCO (por sus siglas en inglés para single cell oil), es aquel obtenido por microrganismos; su estructura es similar a la de los aceites vegetales y animales (Cohen y Ratledge, 2005). Los microrganismos pueden ser microorganismos procariotoas, que no presentan membrana alrededor del núcleo como las bacterias, o eucariotas (Severo, 2014), que poseen un núcleo definido separado del citoplasma. Las algas, hongos y levaduras constituyen este grupo. En comparación con los aceites de origen vegetal, los microrganismos presentan ventajas potenciales como fuentes de lípidos por su gran velocidad de generación, gran variedad de materias primas y de bajo costo utilizadas como sustrato, requieren menores áreas de producción para la misma cantidad de lípidos y controles más simples para la producción, son independientes de los cambios climáticos o estacionales y son aptos para la fermentación a gran escala (Faife et al., 2012). 1.2 Aplicaciones del aceite microbiano Las aplicaciones del aceite microbiano dependen de su perfil de ácidos grasos, el cual está relacionado con las condiciones de cultivo empleadas y el tipo de microrganismo (Severo, 2014).
Se ha demostrado que el consumo de ácidos grasos insaturados trae beneficios para la salud. Los aceites microbianos constituyen una fuente alternativa para la obtención de ácidos grasos monoinsaturaos (MUFAs) y polinsaturados (PUFAs), los cuales disminuyen el riesgo de enfermedades cardiovasculares, ya que una dieta rica en MUFAs (por ejemplo, ácido oleico) conduce a la reducción de glucosa en la sangre y de la presión arterial, y su vez aumenta los niveles de colesterol HDL (Da Rosa, 2014) (Silva, 2012). Por otro lado, aunque muchos microrganismos son capaces de producir SCO, existe un gran interés por algunas especies de hongos filamentosos que tienen la capacidad de producir lípidos esenciales como los ácidos araquidónicos (ARA), Omega-6 (GLA), ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA). Éstos lípidos tienen aplicaciones importantes como fuente nutricional y suplementos alimenticios para gestantes, recién nacidos y prematuros (Severo, 2014). Por otro lado, las bacterias son capaces de producir otros materiales como reserva energética, como lo son los alcanoatos (Da Rosa, 2014) y muchos géneros de bacterias que participan en la síntesis de ácidos grasos pueden aumentar su acumulación modificando su composición con técnicas de ingeniería biológica, genética y metabólica (Alvarez y Steinbechel, 2002) (Ellingsen et al., 2007) (Kalscheuer et al., 2006). Por lo tanto, la acumulación de TGC queda limitado solo para las levaduras, hongos filamentosos y algunas algas. Otra aplicación del SCO es la fabricación de combustibles, como el biodiesel, el cual puede ser utilizado en los motores diesel sin ninguna alteración. Los aceites microbianos pueden ser una fuente lipídica para este fin por estar compuestos principalmente por triglicéridos (TGC). 1.3 Lípidos producidos por levaduras Dentro de las levaduras más prometedoras para la producción de lípidos se encuentran los siguientes géneros: Candida, Lipomyces, Rhodospiridium, Rhodotorula, Saccharomyces, Torulopsis y Trichosporon (Aquarone et al., 2001) (Ageitos et al., 2011). Aunque estas especies son consideradas oleaginosas, también pueden ser subdivididas en altas productoras de lípidos y bajas productoras de lípidos. Las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Candida utilis sólo acumulan hasta 10% de su biomasa celular en lípidos mientras que géneros como Rhodotorula y Lipomyces son capaces de acumular hasta un 70% (Rattray, 1989). Los lípidos producidos por levaduras están constituidos principalmente por ácidos grasos monoinsaturados y polinsaturados, tales como ácido palmítico ( C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1), linoleico (C18:2), linolénico (C18:3) y mirístico (C14:0), los cuales son empleados como materia prima para la producción de biodiesel (El-Fadaly, El-Ahmady, & Marwan, 2009) (Papanikolaou & Aggelis, 2011). En la Tabla 1.1 se muestra la composición lipídica de algunas levaduras oleaginosas.
En un estudio realizado por (Kuntzler et al., 2013) para determinar el contenido de lípidos presentes en la biomasa de las levaduras cultivadas en frascos agitados a 30 °C y 180 rpm en un medio utilizando glicerol bruto como substrato, se encontraron que las levaduras R. mucilaginosa y L. lipofer se destacaron como productoras de lípidos, con acumulaciones de 55,06% y 57,75% de la masa celular seca total, respectivamente. Los resultados obtenidos en este estudio, en términos del contenido de lípidos, biomasa y rendimiento, se muestran en la Tabla 1.2.
1.4 Producción de lípidos El rendimiento de la síntesis lipídica depende de la presencia de nutrientes en el medio de cultivo para atender la demanda nutricional del microrganismo. La composición nutricional es un parámetro importante para la producción de lípidos, ya que una vez que existe un desequilibrio entre los componentes nutricionales, o sea, cuando la célula agota un nutriente clave, usualmente el nitrógeno, la asimilación de la fuente de carbono en exceso es destinada para la producción de grasa en forma de triglicéridos. De esta forma, el factor principal que determina la acumulación de lípidos en microrganismos es la relación C/N (Severo, 2014).
Otros parámetros que afectan la producción de aceite microbiano se discuten en las secciones 1.4.1 a la 1.4.5. 1.4.1 Fuente de carbono El tipo de fuente de carbono puede afectar la producción de lípidos. Muchos compuestos, especialmente los azúcares, pueden causar represión catabólica de varias enzimas y disminuir la velocidad de crecimiento de algunos microrganismos (Martins, 2003). Para fines económicos, es necesario encontrar fuentes de carbono diferentes de la glucosa para obtener un aceite con mayor competitividad económica. Según la literatura, algunas fuentes de carbono posibles son la xilosa, el almidón, la arabinosa, la manosa y residuos orgánicos industriales como el glicerol. (Faife et al., 2012) (Da Rosa, 2014). Siendo el glicerol un subproducto de la síntesis de biodiesel y considerando que el aumento en la producción de biodiesel el cual conlleva a un aumento de glicerol, que no es absorbido en su totalidad por la demanda, hace de éste una fuente de carbono interesante que merece ser investigada (Da Rosa, 2014). Cabe destacar que los productos del hidrólisis de celulosa también constituyen a una fuente económica de carbono. Sin embargo, algunos hidrolizados contienen ácido acético, ácido fórmico, y furfural, entre otros compuestos que son tóxicos e inhiben el crecimiento de las levaduras. Por ello dichos hidrolizados necesitan tratamientos previos para ser utilizados como fuentes de carbono, lo que incrementa su costo (Faife et al., 2012). 1.4.2 Fuente de nitrógeno Como ya se ha mencionado, la acumulación de lípidos en microrganismos está asociada a la limitación de algún nutriente, siendo utilizada en la mayoría de los casos la limitación de nitrógeno en el medio de cultivo. Dicha limitación impide que nuevas células sean generadas mientras que el exceso de carbono asimilado por el microrganismo es convertido en lípidos, generalmente en forma de TGC (Rossi et al ., 2011). Zhang et al., (2011) estudiaron la capacidad de la levadura Cryptococcus curvatus para sintetizar lípidos utilizando la glucosa como única fuente de carbono, variando la tasa de carbono a nitrógeno (C/N). Observaron que el uso de nitrógeno orgánico (extracto de levadura y peptona) e inorgánico (NH4Cl) tienen diferentes efectos sobre el crecimiento celular y la acumulación de lípidos. El nitrógeno orgánico mejora tanto el crecimiento celular como la acumulación de lípidos mientras que el nitrógeno inorgánico es más beneficioso para la acumulación de lípidos. Wu et al., (2011) demostraron que la limitación de sulfuro en el medio de cultivo fue efectiva para la acumulación de lípidos (58,3%) de la levadura R. toruloides Y4 en presencia de una fuente de nitrógeno en exceso y utilizando glucosa como sustrato, en un tiempo de fermentación de 122,5 h. Esto podría ser una estrategia valiosa para producir lípidos microbianos utilizando materias primas relativamente baratas y con sustratos ricos en nitrógeno como el hidrolizado de quitina. Sitepu et al., (2014) observaron que el agotamiento de nitrógeno promueve una mayor acumulación de lípidos en levaduras oleaginosas, obteniendo un mayor contenido de lípidos en 35 especies de las 37 levaduras evaluadas.
Existen otros parámetros que influyen en la síntesis de lípidos de las levaduras oleaginosas. La adición de sales, minerales y las condiciones de cultivo como temperatura, pH, suministro de oxígeno ejercen una influencia marcante en la acumulación de lípidos (Aquarone et al., 2001). 1.4.3 pH Dias et al., (2015) observaron que el pH óptimo para la producción de biomasa y ácidos grasos de la levadura Rhodosporidium toruloides NCYC 921 fue 4,0 mientras que la acumulación de productos (carotenoides) se llevó a cabo a un pH 5,0. En un estudio Rodrigues (2010) comparó la capacidad de producción lipídica de R. glutinis en cultivos discontinuos en biorreactores a pH 5,5 y 7,0. La productividad de lípidos y el crecimiento celular fueron superiores en los cultivos a pH 5,5 en comparación con los cultivos a pH 7,0. Estos estudios demuestran que medios de cultura con pH ácidos o ligeramente ácidos favorecen la síntesis de lípidos. El pH es un factor que influye en la síntesis enzimática, transporte e asimilación de sustratos y la formación de moléculas en el interior de las células de los microrganismos. El control y el ajuste del pH son fundamentales en procesos biotecnológicos para establecer un balance de óxido-reducción necesario para el crecimiento celular de microrganismos (Rivaldi, 2008). 1.4.4 Temperatura Sargeanta et al., (2014) demostraron que la temperatura afecta el crecimiento celular de las levaduras oleaginosas e, independientemente de los otros factores ambientales, el crecimiento a 35°C es extremadamente pobre. Su estudio concluyó que la temperatura óptima para la producción de biomasa se encuentra en el intervalo de 25 a 30°C y que, independientemente de la relación C/N, las altas temperaturas no favorecen dicha producción. Sin embargo, se obtienen valores razonables cuando la tasa de C/N es suficientemente alta (C/N >20) y la temperatura es baja. Sin embargo, Martins (2003) reporta que el intervalo óptimo de temperatura está entre 25 y 35°C para la mayoría de las levaduras, en lo que se refiere a la producción de lípidos. Lo anteriormente descrito permite mostrar la importancia del control de la temperatura tanto para la producción de biomasa como para la producción de lípidos. 1.4.5 Transporte de oxígeno En los procesos fermentativos que emplean cultivos de células aeróbicas o aeróbicas facultativas, se debe hacer un dimensionamiento para la transferencia de oxígeno ya que éste es un factor determinante para suplir las necesidades de los microrganismos para la respiración celular (Aquarone et al., 2001). Cabe destacar que, al contrario de las fuentes de carbono, el oxígeno es poco soluble en agua; de hecho, la concentración de oxígeno disuelto en condiciones de saturación es de apenas 7mg/L (7ppm), a 1atm de presión y 35°C. Por lo tanto, no solamente se necesitan grandes cantidades de nutrientes para llevar a cabo el proceso fermentativo discontinuo, sino también se debe introducir oxígeno a lo largo del proceso para proporcionar la condición aeróbica (Aquarone et al., 2001).
CONCLUSIONES Al cabo delas 120 horas de fermentación, las mayores concentraciones de biomasa fueron observadas para las levaduras Rhodotorula glutinis Y-12905 y L. starkeyi Y-27493 las cuales alcanzaron concentraciones de 17,5 g/L y 22,9g/L, respectivamente. Las cinco especies de levaduras estudiadas fueron capaces de consumir glicerol como la única fuente de carbono en el medio de fermentación. Sin embargo, no todas fueron capaces de producir lípidos a partir de glicerol. La levadura Rhodosporidium toruloides fue la que obtuvo el menor crecimiento celular y a su vez fue la única cepa incapaz de acumular lípidos bajo estas condiciones, por lo que permite concluir que simplemente, esta levadura, no es capaz de utilizar el glicerol puro como fuente de carbono.
A MULTI-OMIC MAP OF THE LIPID-PRODUCING YEAST RHODOSPORIDIUM TORULOIDES Fuente: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3493640/
Algunas especies oleaginosas son excepcionalmente fuertes al convertir los carbohidratos en lípidos, como los TAG. Las especies de levadura del género anamórfico Rhodotorula a menudo se han utilizado para la transformación de recursos renovables en aceites microbianos. Rhodosporidium toruloides (anteriormente conocido como Rhodotorula glutinis o Rhodotorula gracilis), que es un hongo basidiomiceto no patógeno de color rosa, puede acumular lípidos a más del 70% de su peso de células secas. Esta levadura "roja" también es un buen productor de carotenoides y enzimas biotecnológicamente importantes, como la cefalosporina esterasa y el epóxido hidrolasa. Más importante aún, R. toruloides tiene una excelente tolerancia a los compuestos inhibidores que se encuentran en los hidrolizados de biomasa. Por lo tanto, R. toruloides es una cepa de levadura única de gran potencial biotecnológico.
ENERGY EFFICIENCY EVALUATION OF LIPID PRODUCTION BY OLEAGINOUS YEAST RHODOSPORIDIUM TORULOIDES Fuente: https://slideheaven.com/download/energy-efficiency-evaluation-of-lipid-productionby-oleaginous-yeast-rhodosporid.html?reader=1
Las condiciones de cultivo fueron: temperatura 30 °C, pH 5.6 (por control automático) usando 10.0 M de NaOH), aireación a 0.9 vvm y disuelto oxígeno a 40-50% de saturación. El cultivo fue iniciado por inocular el medio esterilizado (6300 ml) con 700 ml de 28-h-old precultivo de R. toruloides Y4. Las alícuotas eran liberado en diferentes intervalos de tiempo desde el biorreactor a determinar glucosa residual, biomasa celular, contenido de lípidos, composición elemental y calor de combustión. El cultivo era detenido cuando la concentración de glucosa se redujo a menos de 0.5 g l-1. Los lípidos microbianos se han considerado recientemente como materia prima potencial para la producción de biodiesel. Nuestro primer trabajo demostró que la levadura oleosa Rhodosporidium toruloides Y4 produjo una cantidad notable de lípidos intracelulares cuando cultivado en medios limitados en nitrógeno con glucosa como único sustrato.
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
-
Luego de la incubación de la cepa Rhosoporium Torulopsis por 48 horas en agar lactosado a 30 °C, se observan manchas blanquecinas distribuidas en las placas de Petri, este color blanquecino nos indica que la levadura no se ha desarrollado correctamente y, por lo contrario, ya se encuentra en una fase estacionaria y camino a la muerte.
-
En los tubos de ensayo, se realizó la misma incubación, pero ahora con la técnica de tubo inclinado. Se aprecian resultados similares a los obtenidos con las placas de Petri.
En la fase estacionaria: Se agotan los nutrientes, se acumulan desperdicios dañinos, procesos de división celular y muerte están en balance. Hay actividad metabólica de síntesis y energía.
VII. CONCLUSIONES:
-
Se prepararon los cultivos a partir de agar congelado y utilizando materiales de laboratorio como placas de Petri, tubos de ensayo, gradillas, mechero y asas.
-
La cepa de la levadura Rhosoporium Torulopsis pudo no haberse desarrollado correctamente por errores de manipulación en el laboratorio.
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
-
Caldera D. 2016. PRODUCCIÓN DE ACEITE MICROBIANO POR LEVADURAS EN REACTORES DE COLUMNA DE BURBURJEO. [en línea]. Obtenido desde: http://159.90.80.55/tesis/000172770.pdf
-
Wenwen Z. 2011. Energy efficiency evaluation of lipid production by oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides. [en línea]. Obtenido desde: https://slideheaven.com/download/energy-efficiency-evaluation-of-lipid-productionby-oleaginous-yeast-rhodosporid.html?reader=1
-
Zhiwei Z. 2012. A multi-omic map of the lipid-producing yeast Rhodosporidium toruloides. [en línea]. Obtenido desde: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3493640/
