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CLINICA DE ENFERMED ENFERMEDADES ADES INFECCIOSAS HOSPITAL ROOSEVELT

REVISTA DE MICROBIOLOGIA VOLUMEN NO. 1 ENERO - MARZO 2016

Revista No. 1 Enero Enero - Marzo Marzo 2016 Clinica Clinica de Enfermedades Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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CLINICA DE ENFERMED ENFERMEDADES ADES INFECCIOSAS HOSPITAL ROOSEVELT

REVISTA DE MICROBIOLOGIA MI CROBIOLOGIA VOLUMEN VOLUMEN NO. 1 ENERO - MARZO 2016


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EDITOR DE LA REVISTA Licda Maria Remey Gordillo Coordinadora General Area de Microbiologia y Hospital Roosevelt Dr. Carlos Mejía Villatoro Jefe de la Clínica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

CONTRIBUCIONES Autores: Licda Maria Remey Gordillo Licda. Julia Mirelia Cali Arriaga Licda. Jackelyn Paola Tol Urizar Licda. Alejandra Castillo Licda. Veronica Itzep Licda. Rosa Alvarez Licda. Diana Baldizòn Licda. Margarita Boloix Sr. Héctor Catú Licda. Lis Jerez Licda. Ana Lucía Lemus

DIAGRAMACIÓN Y DISEÑO Mellross Elswith Salazar Alvarez

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Editorial La Microbiología Clínica tiene como objetivo principal establecer el agente causal de las infecciones que afectan al hombre. El Diagnóstico debe ser certero y oportuno, capaz de dirigir un tratamiento adecuado que conlleve a la recuperación del paciente. El logro del diagnóstico se basa en la estandarización adecuada de los procedimientos y el conocimiento y uso adecuado de diferentes tecnologías dirigidas al tipo de microorganismo sospechoso. En respuesta a las diversas necesidades se tomó la iniciativa de actualizar a los profesionales de diversas áreas de la salud, mediante la información de temas básicos a través de un Diplomado de Microbiología Clínica en el cual se incluyeron temas de resistencia antimicrobiana, biología molecular, diagnóstico y tratamiento de hongos sistémicos y tuberculosis con la participación de conferencistas expertos en los temas.

Entre las actividades que se realizaron en el Diplomado se tuvieron: 1. Conferencias teóricas donde se presentaron y discutieron temas en aspectos generales y especícos sobre diagnóstico, procedimientos estándar, tratamiento de infecciones causadas por microorganismos bacterianos. 2. Investigación sobre un tema especíco sobre resistencia antimicrobiana. 3. Elaboración y presentación de un manual de procedimientos estándar acorde a las necesidades, capacidades y disponibilidad de recursos para el diagnóstico bacteriano microbiológico. El Diplomado se desarrolló en el Hospital Roosevelt con el apoyo del Programa de Postgrado y Maestría de la Unidad de Enfermedades Infecciosas que funciona en Hospital Roosevelt desde el año 2004 y que es avalado por las autoridades docentes y administrativas del hospital Roosevelt y de la Facultad de Medicina de la Universidad Francisco Marroquín. Tuvo una duración de 6 meses.

Los principales objetivos especícos que se deseaba alcanzar fueron: 1. Asistir y fortalecer los conocimientos de los laboratoristas y médicos de instituciones clínicas públicas y privadas sobre los principios y la práctica del diagnóstico de microorganismos bacterianos, pruebas y tratamiento antimicrobiano. 2. Conocer y aplicar los reportes de susceptibilidad correctos para guiar el tratamiento del paciente, logrando que los laboratorios radicados en distintos hospitales y a nivel comunitario sigan con exactitud los mismos procedimientos de pruebas y de control de calidad. 3. Conocer y aplicar el manejo de bases de datos que permitan tener información que pueda ser utilizada por especialistas en enfermedades infecciosas, epidemiólogos y otros funcionarios responsables de la salud para establecer patrones de resistencia a agentes antimicrobianos, promoviendo el tratamiento óptimo e implementando medidas para limitar la difusión de organismos resistentes en los hospitales y la comunidad. Al Diplomado se inscribieron un total de 67 personas, 42 profesionales, de los cuales 4 eran Médicos y 38 Químicos Biólogos, 20 eran estudiantes con pensum cerrado de la carrera de Química Biológica y 4 técnicos de laboratorio clínico. Se retiraron 9 personas, quedando 58. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Dentro de la población de profesionales Químicos Biólogos se tuvo la participación de profesionales que provenían de Quetzaltenango, Sololá, Chimaltenango, Antigua Guatemala, Amatitlán, Mazatenango. El 21% de toda la población estaba trabajando en hospitales en la iniciativa privada. De los 67 inscritos, completaron el diplomado 58 personas, 52 aprobaron el diplomado lo que representó un 90% del total de asistentes, 6 no aprobaron, 10.3% y 9 se retiraron. El puntaje más alto fue de 89 puntos y el más bajo de 61 puntos, con una media de 76 puntos. Únicamente 7 profesionales obtuvieron puntajes por encima de los 80 puntos. El porcentaje de asistencia fue del 86% en los 10 módulos. El porcentaje de puntualidad fue del 48%. El módulo que presentó mayor dicultad fue el de Resistencia Antimicrobiana, lo que se reejó en los puntajes obtenidos durante el segundo examen parcial que evaluó este módulo, únicamente el 50% de la población aprobó. Debido a la dicultad se tomó la decisión para el II Diplo mado ampliar el módulo y reforzar los temas sobre resistencia. En general se puede concluir con los resultados obtenidos que los temas tratados fueron correctamente orientados y asimilados por los participantes. Y la elaboración de manuales contribuyó a una mejor estandarización microbiológica en los lugares de trabajo de donde provenían los profesionales que elaboraron los trabajos. Los profesionales participantes completaron la asistencia a X módulos con diferentes temas microbiológicos y desarrollaron trabajos de investigación. La siguiente edición presenta los traba jos más importantes referentes a la información que proveen. Son el reejo del esfuerzo de sus realizadores para proporcionar información estandarizada de procedimientos diarios que son básicos en el trabajo diario en Microbiología. Representan un importante aporte en los temas desarrollados y son herramientas fundamentales para los laboratorios que trabajan Microbiología. Licda. Maria Remei Gordillo Dr. Carlos Mejia Villatoro


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Manual de tinciones en Microbiologia Clinica Introducción Generalidades

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Normas de seguridad en el laboratorio

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Preparación, jación y coloración de frotes

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Tinciones en Microbiología Clínica Tinciones simples Tinción de Azul de Metileno de Loeer Tinción de Azul de Lactofenol Tinción Naranja de Acridina Tinción de Negro de Clorazol KOH con Tinta Azul Parker

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Tinciones diferenciales Tinción de Gram Tinción de Wright Tinción de Giemsa Tinción de Ziehl-Neelsen Tinción de Kinyoun Tinción de Ziehl-Neelsen Modicado Tinción selectiva de esporas Wirtz-Conklin Tinción de Ácido Peryódico de Schi (PAS)

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Tinciones especiales

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Tinta China Tinción de Auramina-Rodamina Tinción Blanco de Calcouor Tinción de Gomori-Grocott Referencias

Manual de Microbiologia Introducción Generalidades Normas Mínimas de Seguridad en el Laboratorio de Microbiología Organización de Área de Trabajo Generalidades de la Estructura Bacteriana Bacterias Gram positivo Bacterias Gram negativo Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Tinciones Básicas Tinción de Gram Principio Procedimiento de la Tinción de Gram Tinción Ziehl Neelsen Principio Procedimiento de Tinción de Ziehl Neelsen Tinción de Kinyoun Principio Procedimiento de Tinción Kinyoun Tinción Kinyoun Modicado Principio Procedimiento de Tinción Kinyoun Modicado Observación en Fresco Principio Procedimiento de Observación en Fresco Toma de Muestra y Procedimientos Orocultivo Propósito e importancia Recolección de la muestra y transporte Procedimiento Aislamiento Primario Identicación Streptococcus pyogenes Procedimiento Cultivo de Garganta Especial Propósito Recolección de Muestra y Transporte Toma de muestra para Corynebacterium diphteriae Toma de Muestra para Neisseria meningitidis y Bordetella pertussis Aislamiento primario Corynebacterium diphteriae Neisseria meningitidis Bordetella pertussis Identicación de principales Microorganismos Corynebacterium diphtheriae Neisseria Meningitidis Bordetella pertussis Hemocultivo y Mielocultivo Propósito Recolección de la muestra y transporte Toma de muestra


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Aislamiento primario Procedimiento de incubación Identicación de principales microorganismos Líquido cefalorraquídeo y otros líquidos estériles Propósito Recolección de Muestra y Transporte Aislamiento Primario del Líquido Cefalorraquídeo u otros Líquidos Estériles Identicación de principales microorganismos Coprocultivo Propósito e Importancia Salmonella sp Shigella Vibrio Cholerae Recolección de Muestra y Transporte Aislamiento Primario Procedimiento para aislar Salmonella sp, Shigella sp Procedimiento para aislamiento de Vibrio cholerae Identicación de principales Microorganismo Pruebas Bioquímicas Identicación de Salmonella sp Identicación de Shigella sp Identicación de Vibrio cholerae Urocultivo Propósito e importancia Recolección de la Muestra y Transporte Asilamiento primario Identicación de principales microorganismo Escherichia coli Klebsiela pneumoniae Klebsiella oxytoca Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Secreciones Varias Secreciones de heridas y abscesos Propósito e importancia Recolección de la muestra y transporte Toma de muestra de Herida Toma de muestra de Absceso Toma de muestra en quemaduras Toma de muestra de ojo Toma de muestra de Oído Aislamiento primario


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Identicación de principales microorganismos Esquema de identicación de Cocos Gram positivo Identicación de Gram negativo Fermentadores Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae Identicación de Gram Negativo no Fermentador Pseudomonas aeroginosa Secreción Vaginal Propósito Recolección de la muestra y transporte Aislamiento Primario Identicación de principales microorganismo Identicación presuntiva de N. gonorrhoeae Identicación de Gardnerella vaginalis Identicación de Streptococcus agalactiae Identicación de Candida albicans Esputo de cultivo bacteriano Propósito Recolección de la muestra y transporte Aislamiento primario Realización del frote del Esputo Criterio de Murria Identicación de Principales Microorganismo Identicación de Streptococcus pneumoniae Identicación de Haemophilus inuenzae Anexos Prueba de Catalasa Prueba de Coagulasa Prueba de Manitol Sal Prueba de DNasa Prueba de Novobiocina Prueba de Bacitracina A Prueba de PRY (pirrolidonilarilamidasa) Prueba de CAMP Prueba de Hidrólisis de Hipurato Bilis Esculina Crecimiento de NaCl 6.5% Prueba de Sensibilidad a Optoquina Solubilidad en Bilis Prueba de Satelitismo Factor de Crecimiento XV Bibliografía


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Manual de Procedimientos Tamizaje, Aislamiento, Identicacion y Sensibilidad de Micobacterias Introducción Generalidades Propósito e importancia Tuberculosis pulmonar y tuberculosis extrapulmonar Niveles de laboratorio Nivel i Nivel ii Nivel iii Toma de muestra y procedimientos por tipo de muestra Muestras de orina Propósito e importancia Toma de muestra Chorro medio u orina al vuelo Sondas permanentes Punción o aspirado suprapúbico Catéter Procesamiento de la muestra Requerimientos e instrucciones especiales de muestra de orina Preparación de la muestra previo a la elaboración de frotes Muestras de sangre y médula ósea Medio de cultivo para aislamiento de micobacterias de muestras de sangre y médula ósea Toma de muestra de sangre y médula ósea Precauciones para el uso de los frascos Tratamiento de la muestra en el laboratorio Preparación de la muestra previo a la elaboración de frotes Muestras de líquido cefalorraquídeo, lavados y otros líquidos corporales Propósito e importancia Toma de muestra para líquido cefalorraquídeo Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra Preparación de la muestra para la elaboración de frotes Muestras de heces Propósito e importancia Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la Muestra de heces Preparación de la muestra de heces para la elaboración de frotes Muestras de biopsias y secreciones varias Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra Preparación de la muestra para la elaboración de frotes muestras de esputo toma de muestra.


-60-60-60-60-61-61-61-61-61-62-62-62-62-62-62-62-62-62-63-63-63-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-65-65-65-66-66-66-67-67-67-67-67-67-67-68-68-68-68-68-68-68-68-68-68-69-68-69-69-69-69-69-70-70-70-70-70-70-70-71-71-71-

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Procedimiento para obtención de la muestra. Procesamiento de la muestra de esputo Preparación y observación directa de una muestra Preparación de un extendido Procedimientos de tinción alcohol-ácido resistencia Coloración de ziehl-neelsen: Coloración de kinyoun: Interpretación e informe de baciloscopías Pruebas de tamizaje Prueba de lam Genexpert Cultivo de micobacterias en lowenstein jensen Muestras Métodos para decontaminación de muestras. Método de n-acetil-l-cisteína-hidróxido de sodio (nalc-naoh) Método del hidróxido de sodio Método del ácido oxálico Método mycoprep bbl (método comercial) Inoculación de tubo bactec mgit 960 (indicador de crecimiento de micobacterias). Métodos de identicación Test de ácido nicotínico para tb bbl taxo (niacina) Tiras bbl taxo para prueba de nitritos Detección de antígeno mpt64 Identicación de especies comunes de micobacterias (genotype mycobac terium cm) Identicación de especies adicionales (genotype mycobacterium as) Identicación del complejo mycobacterium tuberculosis (genotype mtbc) Sensibilidad antibiótica Introducción Métodos de determinación de sensibilidad antifímica Método de las proporciones de canetii Método de pcr: identicación del complejo mycobacterium tuberculosis (genotype® mtbdrplus) Método de sensibilidad antifímica por bactec mgit 960 sire kit Bibliograa

Normas de Publicación


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MANUAL DE TINCIONES EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA Julia Mirelia Cali Arriaga Jackelyn Paola Tol Urizar

I.

INTRODUCCIÓN

El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de Microbiología, con el n de conocer todas las técnicas de tinciones que sirven de base en las identicaciones bacterianas, a la vez se hace mención de las normas de bioseguridad útiles para mantener la seguridad dentro del laboratorio y de quienes laboran en el, así como también el procedimiento de elaboración de frotes y jación de los mismos. Además está elaborado de tal manera que sea apli cable al funcionamiento actual de los diferentes procedimientos del Laboratorio en Microbiología

II.

GENERALIDADES

A. Normas mínimas de seguridad en el laboratorio de microbiología 1. Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal n. 2. Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer completamente cerrada. 3. Limpiar y desinfectar las supercies de trabajo, antes de comenzar y al nalizar el trabajo. 4. Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas, antes de salir del laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes. 5. Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las áreas de laboratorio. 6. Evitar llevar al laboratorio, accesorios que podrían ser fuente de contaminación (por ejemplo joyas). 7. Recoger el cabello largo. Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar sólo lo indispensable. 8. No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse cosméticos ni ponerse o quitarse lentes de contacto en ningún área del laboratorio. .

9. Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades o hacer uso de ellos. Si usted tiene alguna duda, diríjase al supervisor o encargado del área. 10. Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales, exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo. 11. Tener cuidado cuando manipule el mechero. Nunca debe dejar éste desatendido. 12. Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de manera ordenada a su respectivo lugar una vez nalizada la actividad. Reporte cualquier daño de los mismos al supervisor. 13. Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal n. 14. No usar ningún reactivo que no esté debidamente identicado, vericar las etiquetas de los mismos y estar seguro de cómo emplearlo. 15. No devolver sustancias a sus envases originales. 16. Emplear pipeteador o bomba de vacio al medir líquidos. Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. 17. Realizar solamente aquellas actividades programadas y asignadas, no llevar a cabo experimentos actividades no autorizadas. 18. Reportar inmediatamente cualquier accidente al supervisor o encargado del área (de rrame de material contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.


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19. Reducir al mínimo la formación de aerosoles durante la realización de cualquier trabajo. 20. Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar la inoculación accidental y la generación de aerosoles durante su manipulación y desecho. 21. Emplear técnicas asépticas para el manejo de cultivos de microorganismos (OMS, 2005) .

B. Preparación, jación y coloración de frotes Debido al pequeño tamaño de la mayoría de microorganismos, se requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campo oscuro para hacer la descripción morfológica de éstos. El microscopio de uso más común es del de campo claro, en el que la observación de células cicas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso de una gran cantidad de luz (Aquiahuatl, Pérez, 2004). La observación de frotes teñidos es más recomendable. El frote se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una supercie transparente, en la cual se jan y tiñen los microorganismos. De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son: simples, diferenciales y especiales (Aquiahuatl, Pérez, 2004). Los frotes de cultivos líquidos se deberían jar con alcohol para evitar residuos del medio, que al quemarse darán interferencias en las observaciones y los de colonias de medios sólidos se jan generalmente con calor. Después de la jación, los frote son teñidos con diferentes colorantes sintéticos derivados de anilina en su mayoría (Aquiahuatl, Pérez, 2004). Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos cargados conocidos como cromóforos. Por ejemplo:

Si el cromóforo es un ión positivo el colorante es de tipo básico, pero si la carga es negativa será de tipo ácido. La mayoría de las bacterias son teñidas por colorantes básicos, que permeas la pared celular y se adhieren por enlaces iónicos débiles a moléculas con cargas negativas de la célula bacteriana. La tinción de las bacterias con azul de metileno, es un ejemplo de tinción simple que facilita la observación de forma, tamaño y arreglo de las células (Aquiahuatl, Pérez, 2004).

1. Preparación de frote: a. Muestras sólidas Tomar la muestra con un hisopo, de preferencia que el material no sea algodón, puede ser dacrón o alginato de calcio. Rodar el hisopo con la muestra sobre una lámina portaobjetos limpia de manera que se obtenga una preparación homogénea (mismo grueso aproximado en toda la lámina) de ésta forma los colorantes penetran de manera adecuada en las estructuras presentes en la muestra. Dejar secar al aire o secar aplicando calor suave debajo de la lámina portaobjetos sin quemar la muestra (Gordillo, 2005).

b. Muestras líquidas Tomar una pequeña porción del líquido ya sea con pipeta pasteur estéril, asa en argolla ameada, asa estéril descartable. Colocar en la lámina, NO restregar la muestra. Dejar secar al aire o secar aplicando calor suave debajo de la lámina portaobjetos sin quemar la muestra (Gordillo, 2005).

1) Fijación del frote Fijar los frotes de cultivos líquidos con dos gotas de metanos o etanol absoluto y dejar secar al aire (hacer esto en zonas alejadas del mechero).


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Los frotes de cultivos sólidos, completamente secos se jarán con calor. Para esto se debe pasar la lámina rápidamente 2 – 3 veces en el interior de la parte amarilla de la ama del mechero, evitando el sobrecalentamiento. Dejar enfriar a hasta alcanzar temperatura ambiente (Aquiahuatl, Pérez, 2004).

Figura 1. Preparación y jación de frotes bacterianos a partir de cultivos sólidos y líquidos .

Este es un colorante catiónico y se combina fuertemente con los componentes celulares cargados negativamente, con los ácidos nucléicos y los polisacáridos ácidos (Kone man, Allen, Janda, Procop, Schreckenberger, Woods, 2008).

b. Materiales y Reactivos • Azul de metileno • Alcohol etílico 95% • Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol • Pinzas • Portaobjetos • Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra biológica • Microscopio • Aceite de inmersión • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro c. Procedimiento • Extender la muestra en un portaobjetos limpio y jar la muestra. • Cubrir la extensión con azul de metileno de Loeer durante 1-2 minutos • Retirar exceso de colorante y lavar con abundante agua desmineralizada. • Dejar secar a temperatura ambiente. d. Resultados

III. TINCIONES EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA A. Tinciones simples Son aquellas en donde se utiliza un solo colorante, es simple y fácil su realización. 1. Tinción de Azul de Metileno de Loefer a. Principio Es una tinción simple utilizada para una gran variedad de microorganismos, sin embargo su uso es especíco para detectar bacterias en frotes de líquido cefalorraquídeo en casos de sospecha de meningitis bacteriana.

Figura 2. Células epiteliales núcleos teñidos de azul oscuro y citoplasma azul pálido, bacterias pequeñas azules apenas visibles (100X).


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d. Resultados 2. Tinción de Azul de Lactofenol a. Principio La tinción de Azul de lactofenol se emplea para observar hongos. Es una tinción simple (un sólo colorante) y como tal está basada en la anidad del colorante por componentes de las células, en este caso por las estructuras fúngicas.El azul de lactofenol tiene tres características que lo hacen especial para observar dichas estructuras en los hongos del tipo moho obtenidos en los cultivos por aislamiento. Figura 3. Estructuras fúngicas de coloración azul. El fenol destruye la ora acompañante (algunas veces en los cultivos, juntos a los hongos pueden crecer colonias de bacterias). El ácido láctico conserva las estructuras fúngicas al crear, por decirlo de algún modo, una película que las protege provocado por un cambio de gradiente osmótico entre el interior y el exterior de dicha estructura. El azul de algodón tiene la capacidad de adherirse a las hifas y conidios de los hongos microscópicos (García, Beltran, Guzmán, León, Arredondo y Fonseca. 2001).

b. Materiales y Reactivos • Solución de azul de lactofenol • Cultivo a evaluar • Asas • Portaobjetos • Cubreobjetos • Microscopio • Aceite de inmersión • Mechero • Agua salina siológica

3. Tinción Naranja de Acridina a. Principio El uorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleído ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la uorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. A pH neutro las bacterias, hongos y material celular se tiñen de naran ja rojizo, pero a pH ácido las bacterias y los hongos mantienen su color naranja rojizo, pero el material de fondo se tiñe de amarillo verdoso. Se utiliza para la detección de hongos y bacterias en muestras clínicas principalmente (Flores, Albarado, Thomas, Lobo. 2008). b. Materiales y Reactivos • Solución de naranja de acridina 0.7% (naranja de acridina doble sal, buer de aceta tos pH:4,0) •I ncinerador, mechero Bunsen o de alcohol • Pinzas • Portaobjetos • Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra biológica • Microscopio de epiuorescencia • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro

c. Procedimiento • Colocar una gota de agua salina siológica sobre el portaobjetos. • Con el asa picar el cultivo y expandir por encima de la gota de agua salina siológica, hasta que no se seque. • Después seca la muestra, tomar una gota de azul de lactofenol y se añade sobre la muestra. c. Procedimiento • Se cubre la muestra con el cubreobjetos • Se cubrir la lámina • Observar en el microscopio. naranja de acridina • Procurar que no queden burbujas de aire • Lavar con agua de en la preparación, ya que sino lo que se ob• Dejar secar al aire servara mayoritariamente serán las burbuobservación jas.

con la solución de por dos minutos. chorro abundante. para su posterior


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aproximadamente por dos minutos. • Observar al microscopio en los objetivos de 10X y 40X.

d. Resultados Las láminas deben enfocarse utilizando un microscopio de epiuorescencia, utilizando ltro d. Resultados La coloración observada es negro con diferente azul o amarillo estándar. intensidad según el grosor de la quitina.

Figura 4. Tinción de ascosporas.

4. Tinción de Negro de Clorazol a. Principio El colorante negro de clorazol permite visualizar rápida y con claridad las estructuras fúngicas, uniéndose a la quitina, sin embargo, debe tenerse especial cuidado ya que el reactivo se degrada con la luz. Es ideal para coloraciones en fresco y es necesario apoyarse en el hidróxido de potasio (KOH) para la eliminación de la queratina presente en la muestra (Arreaza, 2008). b. Materiales y Reactivos • Negro de clorazol • Dimetil sulfoxido (DMSO) • KOH 40% • Portaobjetos • Cubreobjetos • Bisturí • Muestra biológica • Microscopio • Goteros • Agua desmineralzada

Figura 5. Examen directo con negro de clorazol se observa parénquima y estructuras fúngicas de menos tamaño e intensidad (40X).

5. KOH con Tinta Azul Parker a. Principio La búsqueda de estructuras fúngicas utilizando hidróxido de potasio como aclarante de la queratina es un método sencillo, pero este método clásico ha sido mejorado con el uso de tinta azul Parker lo cual colorea el fondo de la tinción con la estructura fúngica y las contrasta para facilitar su visualización (Pérez, Weiss, Villanueva, s.f.). b. Materiales y Reactivos • KOH/Tinta Parker relación 1.1 • Portaobjetos • Cubreobjetos • Bisturí • Muestra biológica • Microscopio • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro

c. Procedimiento • Tomar una porción pequeña de la muestra c Procedimiento (si es necesario triturar con un bisturí las es• Tomar una porción pequeña de la muestra camas) y colocar en un portaobjetos. (si es necesario triturar con un bisturí las es• Agregar una gota de la solución de negro de camas) y colocar en un portaobjetos. clorazol. • Agregar una gota de KOH 20% preparado • Colocar el material con una lámina cubre con tinta azul Parker. objetos y dejar incorporarse en la muestra Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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d. Resultados

Figura 6. Examen directo de piel con KOH 20% y tinta azul Parker, hifas segmentadas y ramicadas dicotómicamente

B. Tinciones diferenciales Son aquellas donde se utilizan dos o más colorantes y en contaste permite la diferenciación del microorganismo o la visualización de la estructura deseada.

1. Tinción de Gram a. Principio De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (gram positivo y gram negativo), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias gram positivo tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias gram negativo tienen una capa de peptidoglicano más na y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las bacterias gram negativo, mientras que en las bacterias gram positivo el colorante queda retenido y permanecerán azules. Las gram negativo se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse, de color rosado al microscopio (López-Jácome y otros, 2014). b. Materiales y Reactivos • Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol • Asa de Siembra en argolla • Pinzas

• Portaobjetos • Cultivos bacterianos de 24 horas • Palillos • Microscopio • Aceite de inmersión • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua destilada • Solución de cristal Violeta • Lugol • Safranina • Etanol 95% • Cronómetro

c. Procedimiento • Cubrir el frote con Cristal Violeta durante 3 min. • Retirar el colorante mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el portaobjetos, para no desprender la muestra. • Cubrir ahora con Lugol durante 1 min., realizar otro lavado suave. Todas las células se teñirán de violeta. • Agregar unas gotas de etanol 95%, deslizándolo por el portaobjetos, hasta que las gotas que salen no tengan casi color. Las células gram- pierden el colorante violeta y quedarán incoloras. Las gram + seguirían violeta. • Añadir una el colorante safranina (colorante de contraste) por 2 min. • Lavar el colorante con agua. Este colorante sólo entrará en las bacterias gram –, que quedarán rojas. Las gram + seguirán violetas. • Secar las preparaciones sobre papel de l tro. • Observarlas al microscopio utilizando el ob jetivo de inmersión d. Resultados

Figura 7. Se observa cocos gram negativo de color rojo por la safranina y bacilos gram positivo de color morado por el cristal violeta.


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bulos sanguíneos. El colorante deberá cubrir completamente el portaobjetos, pero no debe derramarse por los bordes. Deberá agregarse una cantidad adicional si éste se comienza a evaporar. • Agregar directamente al colorante un volumen igual de amortiguador de Wright, para evitar la coloración débil. Esperar la formación de brillo metálico. Puede usarse de igual manera agua desmineralizada. Dejar actuar de 10-15 minutos. • Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensión presente un aspecto rosado al examinarlo a simple vista. • Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante. • Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersión

2. Tinción de Wright a. Principio Esta tinción tiene diversos usos en microbiología; en la parasitología, se le emplea en la búsqueda de hematozoarios como Plasmodium spp. El reactivo de Wright está compuesto por eosina y azul de metileno, cuando éste se oxida se conoce como azur B a una concentración de 0.8 g/L empleando como solvente alcohol metí lico. La eosina es un colorante ácido que tiene anidad por componentes alcalinos. La eosina Y es la más utilizada en procedimientos rutinarios. Es un compuesto ácido cuya propiedad está basada en su polaridad negativa, lo que le permite enlazarse con constituyentes celulares de carga positiva; por esta razón, colorea componentes citoplasmáticos y se les conoce como acidólos. La tonalidad resultante de la tinción con eosina es rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo d. Resultados • Los eritrocitos se observarán de color naintenso en el caso de los eritrocitos. El típico coranja o rosado. lor de los núcleos celulares, mayoritariamente • El citoplasma de los monocitos presentarán morado, se basa en la interacción molecular enuna tonalidad azul grisácea con gránulo rojitre eosina y un complejo azul de metileno-DNA. zos bastante nos y sus vacuolas caracterís La intensidad de la coloración depende del conticas. El citoplasma de los linfocitos presentatenido de azur B y de la relación con la eosina rá varias tonalidades azules. amarilla (Ortega, Garibaldi. 2009) • Los núcleos de los linfocitos y neutrólos aparecerán de color púrpura oscuro. Los núb. Materiales y Reactivos cleos de los monocitos de color púrpura algo • Alcohol 96% más claros (lila). • Alcohol Metílico • Los gránulos de los eosinólos son de color • Portaobjetos rojo-anaranjado intenso. Los gránulos de los • Wright-Giemsa Stain, Modied basólos púrpura azulado muy oscuro. Los • Cubetas para tinción gránulos de los neutrólos se aprecian de co• Pizetas con agua desmineralizada lor lila, bastante nos. • Toalla de papel • Las plaquetas toman coloración violeta o • Guantes púrpura. • Microscopio • Libreta • Contador celular • Cronómetro c. Procedimiento • Colocar el frote secado al aire sobre una rejilla o cubeta de tinción con el frote hacia arriba • Cubrir completamente el portaobjetos con el colorante de Wright gota a gota. • Dejarlo que permanezca en el frote aproxi madamente de 5-8 minutos, para jar los gló-

Figura 8. Frote periférico con parásitos intracelulares, teñidos de color violeta


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3. Tinción de Giemsa

eliminar cualquier resto de colorante. • Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersión.

a. Principio d. Resultados • Los núcleos celulares se tornan violeta inEs la segunda coloración en uso, luego de la tenso. tinción de Wright, y en importancia de las mez• Es frecuente encontrar en el método de clas de Romanowsky. Es quizás la mejor moGiemsa que la granulación eosinóla no dicación de este tipo de coloraciones para presenta la tonalidad rojo-anaranjada cadescubrir parásitos en la sangre, como en el racterística sino que presenta una tonalidad caso de malaria (Plasmodium spp.) y tripanopardo rojizo. Esta dicultad puede prevenir somiasis (Trypanosoma cruzi). El colorante de se añadiendo una gota de fucsina fenicada Giemsa también da excelentes resultados para por cada 10ml de alcohol metílico utilizado. la tinción rutinaria de frotes sanguíneos. Cuan• Las granulaciones neutrólas (lila) y los do se va a teñir con este colorante, debe jarse hematíes (rojo pálido) se tiñen mal; sin primero la muestra con metanol absoluto por un embargo, esta coloración permite diferentiempo mínimo de tres minutos (cuando la preciar algunas formas de metamielocitos que paración no incluye metanol). El colorante en pueden ser confundidos con los monocitos, solución nunca se utiliza de manera directa, por pues el protoplasma de los monocitos quelo que se debe diluir con la solución amortiguada de color azulado y el de los metamielocidora en una proporción de 1:10 ó 1:20 y el tiemtos de color rosa. po de coloración podrá ser de 10 ó 20 minutos, • El citoplasma de los linfocitos presenta respectivamente (Ortega, Garibaldi. 2009). una tonalidad azul denida y sus núcleos violetas de intensidad variable. b. Materiales y Reactivos • Los gránulos basólos y las plaquetas se • Colorante de Giemsa (constituido por una tiñen de color azul, no obstante éstas últimezcla de azul de metileno, eosina y varios mas presentan corpúsculos violetas interazures en dilución acuosa). nos. • Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol • Pinzas • Portaobjetos • Muestra biológica • Microscopio • Aceite de inmersión • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro c. Procedimiento • Sumergir el frote verticalmente en una solución de Giemsa preparada temporalmente a partir de 1 volumen de la solución colorante más 9 volúmenes de solución tampón (pBs, pH 6.8) o bien en agua desmineralizada. • Esperar durante 10-20 minutos. • Lavar el frote con abundante agua, directamente del chorro. • Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol para

Figura 9. Frote periférico con células sanguíneas de color violeta y eritrocitos de color rosado a rojo.

4. Tinción de Ziehl-Neelsen a. Principio La tinción de Ziehl-Neelsen (Z-N) fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de maniesto la presencia de los bacilos causan tes de la tuberculosis en muestras clínicas de pacientes. Esta técnica es capaz de diferenciar los bacilos Acido Alcohol Resistentes ( BAAR).


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La técnica de Z-N fuerza la penetración de la fucsina básica en la pared celular mediante la acción combinada del fenol y el calor, que aumentan la uidez de la capa de ácidos micóli cos: el calor “derrite” el componente ceroso y el fenol actúa a modo de disolvente, permitiendo el paso del colorante básico que se une a los ácidos micólicos con carga negativa. Cuando cesa la aplicación de calor y/o se elimina el exceso de fenol mediante un lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero las moléculas de fucsina quedan atrapadas en su espesor. Con la coloración de Z-N se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul (López y otros, 2014).

b. Materiales y Reactivos • Azul de metileno • Alcohol ácido • Fucsina • Mechero • Portaobjetos • Cubetas para tinción • Pizetas con agua destilada • Toalla de papel • Guantes • Microscopio • Libreta • Cronómetro c. Procedimiento 1) Coloración • Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela, a una distancia de aproximadamente 5 cm entre una y otra, una sobre un soporte dentro del lavabo/pileta de coloración. • Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para las tinciones a realizar en la jornada. Si el número de baciloscopia a colorear es pequeño, se puede ltrar la fucsina directamente cuando se la deposita sobre el extendido a través de un pequeño embudo con papel de ltro. • Colocar sobre el soporte las láminas jadas conservando el orden numérico con el extendido hacia arriba y manteniendo una separación de al menos 1cm entre ellas. • Cubrir totalmente la supercie del extendi-

do con fucsina básica fenicada recién ltrada. Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el embudo los extendidos. • Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. No calentar con mechero. • En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado. • En el término de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisión de vapores; esto es suciente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se je a sus lípidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal. • Con una pinza, levantar cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo más cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presión, con un frasco o un grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la supercie eliminando totalmente la solución de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado también la parte posterior. • Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y así evitar diluir los reactivos que se utilizarán a continuación.

2) Decoloración • Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar aproximadamente 3 minutos. • Enjuagar con abundante agua a baja presión. • Vericar que el extendido se ha decolorado (las partes más gruesas del extendido a lo sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cúmulos rojos o coloración rosada intensa, volver a cubrir con solución decolorante, dejarla actuar entre uno y tres minutos y enjuagar nuevamente. • Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos 3) Coloración de fondo • Cubrir todo el extendido con solución de azul de metileno. • Dejar actuar durante un minuto.


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croscopio, un manchado diapositivas Kinyoun mostrará bacilos como organismos rojos y no ácido-rápido como el azul. Se basa en el comportamiento ácido-resistente de la cubierta de algunos parásitos como Isospora y Cryptosporidium, los cuales se tiñen de rojo y destacan sobre un fondo verde o azul, dependiendo del colorante de contraste usado (Ortigoza Gutierrez, y Cruz Aguilar, s.f.).

• Enjuagar las láminas en ambas caras con agua a baja presión y limpiar parte inferior con un algodón si ha quedado coloreada. • Observar si las láminas conservan la numeración clara y visible. Si no es así volver a numerarlas. •Dejar secar las láminas a temperatura ambiente, apoyándolas en posición vertical en un soporte sobre un papel absorbente. No b. Materiales y Reactivos • Fucsina fenicada apoyar papel absorbente sobre el extendido.. • Verde de malaquita o Azul de metileno • Alcohol metílico d. Resultados • Alcohol etílico • Alcohol ácido • Aceite de inmersión • Portaobjetos • Puente de tinción • Microscopio

c Procedimiento • Realizar un frote de la muestra. • Dejar secar perfectamente. • Cubrir las gotas con unas gotas de alcohol metílico y dejar que seque. • Cubrir la preparación con fucsina fenicada durante 5 mins. • Lavar con alcohol ácido durante 3 min. Figura 10. Se observa las bacterias alcohol ácido re• Enjuagar con agua corriente sistentes (BAAR) de color rojo fucsia y el resto de mi• Coloración de contraste, agregar verde de croorganismos y demás componentes del campo de malaquita o azul de metileno dejar actuar ducolor azul. rante 1 min. • Lavar con agua corriente y dejar secar. 5. Tinción de Kinyoun • Observar con objetivo de inmersión. a. Principio El Kinyoun manc ha es un método para teñir mi-

croorganismos resistentes a los ácidos, especícamente Mycobacterium y Nocardia. El procedimiento para la coloración de Kinyoun es similar a la tinción de Ziehl-Neelsen, pero no implica el calentamiento de las diapositivas siendo stained.1 El método de tinción de Kinyoun utiliza carbolfucsina como una mancha principal, seguido de decoloración con una solución de ácido-alcohol y azul de metileno como contrateñir. Kinyoun carbolfuschsin tiene una mayor concentración de fenol y fucsina básica y no requiere de calefacción con el n de man char properly.1 Cuando se observa bajo un mi-

d. Resultados

Figura 11. Se observan los BAAR de color rojo, las demás estructuras se tiñen del color del colorante de contraste en este caso verde de malaquita.


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6. Tinción de Ziehl-Neelsen Modicado

• Cubrir la lámina con colorante azul de metileno por 30 segundos. • Lavar el exceso de colorante con abundante agua del chorro. • Dejar secar a temperatura ambiente y observar al microscopio.

a. Principio Esta tinción es útil para visualizar quistes de protozoos intestinales que tienen la propiedad de ser ácido-alcohol resistente (AAR). Cryptos- d. Resultados poridium, Cyclospora e Isospora suelen producir diarrea persistente, sobre todo en pacientes inmunocomprometidos o con infección por el VIH. La técnica de Ziehl-Neelsen modicado fuerza la penetración de la fucsina fenicada en la pared celular mediante la acción combinada del fenol y el calor, que aumentan la uidez de la capa de ácidos micólicos. Con el lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero el colorante fucsina queda dentro del parásito y este se destaca en contraste al fondo azul (EHAS, 2012).

b. Materiales y Reactivos • Carbol fucsina (fucsina fenicada) • Azul de metileno • Alcohol-Ácido • Mechero • Portaobjetos • Cubetas para tinción • Pizetas con agua destilada • Toalla de papel • Guantes • Microscopio • Libreta • Cronómetro

Figura 12. Se observa Quistes de Cryptosporidium (AAR) de color rojo fucsia con contraste azul en el fondo.

7. Tinción selectiva de esporas WirtzConklin

a. Principio La producción de endosporas bacterianas es una forma de resistencia de algunos géneros de bacterias gram positivas, debido a la ubicación intracelular las esporas no se tiñen convencionalmente. Por esta razón se utiliza la tinción de Wirtz-Conklin , en donde los microorganismos son teñidos en caliente con el colorante verde de malaquita y que el calor aumenta la permeabilidad de la membrana bacteriana y de la espora, posterior a esto se realiza una decoloración a través del lavado con abundante agua y los c. Procedimiento extremos de la bacteria son teñidos posterior• En una lámina portaobjetos hacer un exten- mente con el colorante de contraste safranina dido delgado de la muestra de heces, dejar (Vázquez, Martín, Siloniz, Serrano, 2010). secar a temperatura ambiente y jar la muestra con calor pasando dos o tres veces por b. Materiales y Reactivos mechero. • Verde de malaquita • Cubrir la lámina con colorante carbol fucsina • Safranina y aplicar calor hasta la emisión de vapores • Etanol 95% y mantener por 5 minutos, evitando la ebulli•Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol ción del colorante. •Pinzas • Lavar el exceso con agua del chorro. • Portaobjetos • Decolorar con alcohol-ácido durante 20-30 • Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra segundos. biológica • Lavar con abundante agua del chorro. • Microscopio Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Aceite de inmersión • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro •

tinción es un método químico muy utilizado en histología y permite la detección de hongos en muestras de tejidos (Pontón, Llovo, 2007).

b. Materiales y Reactivos • Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol • Pinzas • Portaobjetos • Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra biológica • Microscopio • Aceite de inmersión • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro • Ácido periódico • Reactivo de Schi

c. Procedimiento • Fijar la muestra en una lámina portaobjetos. • Cubrir la lámina con colorante verde de malaquita y aplicar calor hasta la emisión de vapores y mantener por 5 minutos. • Lavar el exceso con agua del chorro. • Cubrir con la lámina con colorante safranina por 1 minuto. • Lavar el exceso de colorante con abundante agua del chorro. • Dejar secar a temperatura ambiente y ob c. Procedimiento servar al microscopio. • Cubrir el material jado en la lámina con d. Resultados acido peryodico al 0,5% durante 5 minutos. • Lavar con agua destilada. • Agregar el reactivo de Schi. 20 minutos. • Lavar con agua del chorro. • Dejar secar al aire para su posterior obser vación d. Resultados

Figura 13. Tinción de esporas en Bacillus subtilis, la echa indica la espora teñida en verde. Microscopia de campo claro 100X.

8. Tinción de Ácido Peryódico de Schiff (PAS) a. Principio Se realiza un tratamiento al material con ácido periyódico 0,5%, el cual oxida los 1,2-glicoles formándose grupos aldehídos en los glucanos y mananos de las paredes celulares de hongos, con el reactivo de Schi (preparación de fucsina básica y metabisulto de sodio) los aldehídos reaccionan dando un color rojo luminoso. Esta

Figura 14. Se observa dentro del tejido, la presencia de levaduras de Candida spp.

C. Tinciones Especiales Se basan en el hecho que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes.


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1. Tinta China a. Principio

• Portaobjetos • Cubreobjetos • Pipeta

Fue desarrollada originalmente para micros- c. Procedimiento copia de luz con el n de rodear y delinear las • En una lámina portaobjetos colocar una bacterias no teñidas u otros materiales biológigota de la tinta china. cos. Utilizamos diferentes métodos para evaluar • Esterilizar el asa y tomar una muestra de estructuras individuales, tan pequeñas como las cultivo del hongo o en el caso de la muestra vesículas sinápticas e incluso de gran tamaño, de LCR colocar con una pipeta una gota socomo los microorganismos unicelulares. Este bre la tinta. método es muy útil, aunque está limitado por la • Con el cubreobjetos mezclar la tinta con la presencia de un fondo oscuro que no permitirá muestra la correcta identicación de forma nítida y deta • Colocar el cubreobjetos sobre la preparallada de los componentes de dichas estructuras. ción • Observar la placa en el microscopio a 40x En microbiología, la tinción de Tinta China proy 10x porciona un resultado presuntivo de la presencia de Cryptococcus neoformans, microorga- d. Resultados nismo causante de meningitis en pacientes con inmunosupresión, siendo la técnica más utilizada para poner de maniesto su cápsula. Este hongo presenta dos formas durante su ciclo vital: una forma asexual y una forma sexual; en la primera se presenta como levaduras encapsuladas que se reproducen por gemación y puede ser visualizada por medio de la tinta china. El principio es simple, ya que sólo se requiere depositar una gota de la muestra clínica sobre un portaobjetos, posteriormente se coloca el coloFigura 15. Se observa levaduras capsuladas de C. rante y se observa al microscopio sin necesidad neoformans 40X. de jación, algunas estructuras difundirán el colorante y otras no, lo que permitirá un contraste Tinción de Auramina-Rodamina de las estructuras observadas. Se han utilizado 2. diferentes colorantes: uno de ellos es la menPrincipio cionada tinta china, la cual tiñe el fondo de la a. muestra de un color oscuro y la cápsula del C. Los ácidos micólicos de las paredes celulares neoformans permanece sin teñir. La principal de las micobacterias poseen anidad para los dicultad con la tinción negativa es que los mi- uorocromos auramina y rodamina. Estos colo croorganismos tienden a contraerse durante el rantes se jan a las bacterias, que aparecen de periodo de secado; para evitarlo, se ha optado color amarillo o naranja brillante contra un fondo por usar la tinción negativa húmeda, en la cual verdoso. El permanganato de potasio, empleado los organismos se suspenden en una película como contraste, evita la uorescencia inespecíde tinta china o mancha oscura y el contorno de ca. Todos los microorganismos ácido-alcohol la cápsula puede ser observado sin el peligro de resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes. Un aspecto contracción (López-Jácome y otros, 2014). importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frote pueden ser reteñidos con b. Materiales y Reactivos la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun direc• Asa tamente sobre la tinción con el uorocromo, si • Tinta China se elimina antes el aceite de inmersión. • Mechero Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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De esta forma, los resultados positivos pueden ser conrmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica (García, Beltran, Guzmán, León, Arredondo y Fonseca. 2001).

b. Materiales y Reactivos • Microscopio de ourescencia • Fluorocromos: auromina, rodamina • Solución decolorante • Permanganato de potasio (contraste) • Glicerol • Fenol • Agua desmineralizada • Portaobjetos • Cubreobjetos • Mechero c. Procedimiento • Fijar el frote al calor, en un mechero • Teñir el frote 15 minutos con los uorocromos auramina-rodamina • Aclarar con agua. • Coloración de contraste con permanganato de potasio durante 3 minutos • Aclarar con agua destilada • Lavar con agua y dejar secar al ambiente d. Resultados

Figura 16. Las bacterias alcohol ácido resistentes se observan en el microscopio de ourescencia (luz ultravioleta) como bacterias de color amarillo anaranjado sobre un fondo oscuro.

3. Tinción Blanco de Calcouor a. Principio Es un método de tinción uorescente para la detección de hongos incluyendo Pneumocystis

carinii. Maeda & Ishida en 1967, describieron que este blanqueador de algodón uorescente, podía teñir hongos al exponerlo a la luz UV. Hageage y Harrington lo utilizaron para la tinción de tejidos jados en parana, logrando identicar hifas y esporas. La tinción se basa en la capacidad del blanco de calcoúor para unirse a los ß 1-3, ß 1-4 polisacáridos (celulosa y quitina) de la pared fúngica, y en que el compuesto exhibe uorescencia cuando se expone a luz ultravio leta, permitiendo delinear claramente elementos fúngicos. Al igual que en un examen directo se observarán hifas anchas, no septadas, con ramicaciones en ángulo recto. Se puede utilizar en tejidos frescos y/o congelados, jados en parana y en cultivos puros. Este método no sirve para teñir bacterias. Otros elementos como por ejemplo bras vegetales (algodón) que pudieran teñirse, deben diferenciarse cuidadosamente por la morfología. Para realizar esta tinción, el tejido debe ser tratado con KOH al 10% e igual proporción de solución de calcoúor al 0,05%. Para examinar el extendido se requiere un microscopio de uorescencia. Las estructuras fúngicas se observarán verde claro o azul, dependiendo del ltro UV que se utilice (Ortigoza Gutierrez y Cruz Aguilar, s.f.).

b. Materiales y Reactivos • Fenol • Ácido láctico y azul de algodón • Fucsina acida • Rojo allura • Azul brillante • Colorante vegetal • Ácido acético • Glicerina • Agua desmineralizada c. Procedimiento • El tejido a evaluar debe ser tratado con KOH al 10% e igual proporción de solución de calcoúor al 0,05%. • Para examinar el extendido se requiere un microscopio de uorescencia. • Colocar en un portaobjetos la muestra • Agregar una gota de KOH dimetil sulfóxido y una gota de calcouor • Mezclar, colocar el cubreobjetos • Después de hacer ocurrido la claricación, observar con el microscopio de ourescencia (verde brillante o blanco azulado).


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d. Resultados Las bras elásticas y colágeno se observan con uorescencia amarillo verdosa, estas se pueden confundir con hongos y levaduras, se diferencian en la uorescencia.

Figura 17. Se observarán hifas anchas, no septadas, con ramicaciones en ángulo recto con uorescencia blanca.

4. Tinción de Gomori-Grocott

c. Procedimiento • Cubrir la muestra jada en el portaobjetos con la solución de ácido crómico al 10% durante 10 minutos. • Lavar con abundante agua desmineralizada. • Cubrir con la solución de metabisulfato sódico 1% durante 1 minuto. • Lavar con abundante agua desmineralizada. • Introducir la lámina en un recipiente con la solución de metenamina-nitrato de plata, dicha solución debió ser previamente calentada en baño de maría a 800C por 6 minutos, Una vez introducida la lámina se debe mantener las condiciones durante 5 minutos más hasta observar el cambio de color en solución de marrón a negro. • Lavar con abundante agua desmineralizada. • Cubrir el portaobjetos con la solución de cloruro de oro 1% de 2 a 5 segundos y lavar con agua desmineralizada. • Cubrir el portaobjetos con la solución verde brillante 0.2% en ácido acético glacial durante 1 minuto. • Lavar con abundante agua desmineralizada y dejar secar a temperatura ambiente.

a. Principio Es una coloración especial para hongos, la coloración está basada en la presencia de ácido crómico, los grupos hidroxilo de los polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos y estos a su vez reducen el d. Resultados complejo nitrato-plata metenamina produciendo la coloración café o negra. Utiliza un buer (bisulto de sodio) y también un colorante de contraste (cloruro de oro) y uno de fondo (verde brillante) (Pontón, Llovo, 2007). b. Materiales y Reactivos • Ácido crómico • Bisulto de sodio • Metenamina.-nitrato de plata • Cloruro de oro • Verde brillante • Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol • Pinzas • Portaobjetos • Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra biológica • Microscopio • Aceite de inmersión • Soporte de Tinciones • Goteros • Agua desmineralizada • Cronómetro

Figura 18. Se observa levaduras de C. neoformans 100X

IV. Referencias A. Aquiahuatl., M. Pérez., M. (2004) Manual de prácticas de laboratorio de microbiología general. Departamento de Biotecnología. Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa, México. pp. 20-24.


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MANUAL DE MICROBIOLOGIA Alejandra Castillo Veronica Itzep

1 Introducción Las enfermedades infecciosas constituyen un problema de salud pública cada vez en aumento generando costos altos para su tratamiento, esto se ha debido al uso indiscriminado de antibióticos generando la desimanación de bacterias multiresistente en el ámbito hospitalario o comunitario, dicultando el adecuado tratamiento. Los pacientes hospitalizados como no hospitalizados presentan una variedad de sintomatologías, poniendo en evidencia el tipo de enfermedad pero en otros casos diculta al médico poder diagnosticar, por lo recurren al laboratorio de microbiología para poder obtener diagnósticos certeros y poder tratar al paciente efectivamente. El objetivo del presente manual es poder utilizarlo como una guía de procesos facilitando el diagnostico de algunas enfermedades infecciosas frecuentes, describiendo los procedimientos de aislamiento como las técnicas presuntivas y conrmatorias de identicación.

2 Generalidades 2.1 Normas Mínimas de Seguridad en el Laboratorio de Microbiología La bioseguridad se reere a los procesos de manejo de los agentes infecciosos para evitar o proteger al personal de laboratorio, al medio ambiente y a paciente de un riego biológico. El manejo de microorganismos dentro del laboratorio debe realizarse con mucha precaución para evitar infecciones accidentales. Debe tenerse en cuenta las siguientes indicaciones para el manejo de muestras microbiológicas: - Acceso limitado al área de trabajo, - Lavar las manos, antes y después del manejar material infeccioso con jabón germicida o con alcohol a 70% en caso de manejo de microorganismos gram positivo. - No comer, ni beber alimentos dentro del área de trabajo. No fumar. - Utilizar descartador para objetos punzocortan-

tes. - El personal de laboratorio debe utilizar equipo de protección apropiados (lentes, mascarilla) para evitar en lo posible aerosoles o salpicaduras de las muestras. Las muestra que se deben centrifugar debe ser tapadas previamente, al destapar algún tubo usar gasas para evitar los aerosoles. - Desinfectar las mesas de trabajo antes y después del manejo de material infeccioso, con alcohol al 70% o hipoclorito de sodio. - Recipientes adecuados para desechos de materiales como placas, tubos, muestras clínicas. El personal de laboratorio debe utilizar equipo de protección como, bata, lentes, mascarillas y guantes. Al momento de toma de muestras se debe tener en cuenta las siguientes instrucciones: - Vericar que el área de trabajo esté limpia - Contar con todo los materiales adecuados para la toma de muestras como, medios de transporte, hisopos, lancetas, portaobjetos, jeringas, solución salina, alcohol al 70%, torniquetes, gasas, frascos estériles, bajalengua, etc. - Identicar al paciente, vericar si esta con tratamiento de antibiótico, revisar el área de toma de muestra o qué tipo de prueba solicitan el médico. Apuntando las anotaciones. - Previo a la toma de muestra vericar y preparar el material adecuado para la toma de muestra. - Rotular los materiales a utilizar - Lavarse las manos antes del proceso y usar guantes limpios - Realizar la toma de muestra según el procedimiento adecuado.

2.2 Organización de Área de Trabajo El mobiliario debe ser fuerte y resistente. Los espacios entre mesas, cabinas y equipo han de ser de fácil acceso para la limpieza. - Contar con una campana microbiológica tipo I o II.


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- Contar con asa calibrada de 0.001, asa en ar-

Membrana Citoplásmica: localizada por debajo de la pared celular, que está formada por una bicapa de fosfolípido integral y proteínas periféricas empotradas. La membrana citoplásmica cumple la función de barrera osmótica, tienen permeabilidad selectiva y permite el ingreso de nutrientes y la salida de desechos por mecanismos de transporte activo y pasivo. Citoplasma: en el citoplasma bacteriano se puede dividir en tres partes, región citoplásmica de apariencia granular conteniendo RNA, región nuclear o cromatinica que contiene DNA y la parte liquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. El ARN combinada con proteínas forma una masa densa y compacta llamadas ribosomas.

golla y asa en punta. Para Micología asa en L, pinzas. - La supercie de las mesas de trabajo han de ser impermeables al agua y resistente al calor moderado, solventes orgánicos, ácidos, álcalis y otros productos químicos. - La silla que se usen deben estar cubiertas por material que no sea de tela y que se puede limpiar fácilmente. - La iluminación será adecuada para todas las actividades. Evitar reejos y brillos molestos. - Contar con mechero de Alcohol o Bunsen con gas propano, que la llama sea azul. - Contar con un microscopio binocular, aceite de inmersión, laminillas, cubreobjetos, palillos. 2.3.1 Bacterias Gram positivo - Contar con colorantes para Gram, Zn, KOH, Giemsa. La envoltura de la bacteria comprende de membrana citoplasmática y una pared celular com2.3 Generalidades de la Estructura puesta por una gruesa capa de peptidoglicano Bacteriana de 20 a 80 nm, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmátiLas diferentes estructuras bacterianas se pue- ca mediante moléculas de ácido lipoteicoico. La den dividir en elementos obligatorios para poder capa de peptidoglicano conere gran resisten sobrevivir como pared celular, membrana celu- cia a estas bacterias y responsable de retener lar, ribosomas y material genético y elementos el cristal violeta durante la tinción de Gram. El facultativos son los que están presentes en al- ácido teicoico de la pared que está en la supergunas celular y pueden seguir viviendo si pier- cie y se une solo a la capa de peptidoglicano, den alguna capacidad siológica o patológica este ácido es el responsable del determinante como pilis o mbrias, cápsula y esporas. antigénico del organismo. (g. 1) Pared Celular: está ubicada por fuera de la membrana plasmática, es una estructura vital para las bacterias que la poseen. Su función es proteger a la bacteria de presión osmótica entre el medio interno de la bacteria y del exterior, barrera contra sustancias toxicas químicas y biológicas y le proporciona rigidez a las bacterias. Está constituida por aminoácidos, aminoazúcares, azúcares y grasas. Todas las bacterias contienen en la pared celular peptidoglicano, que consiste en cadena lineal de dos azúcares alternados, N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico que se halla ligado un tetrapéptido. La pared celular permite clasicar las bacterias en Gram positivo que son capaces de retener el colorante cristal violeta luego de la decoloración con alcohol cetona y Gram negativo que pierden el colorante cristal violeta después de la decoloración. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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2.3.2 Bacterias Gram negativo La envoltura de la bacteria está compuesta por una membrana citoplasmática, una pared celular delgada de 2 a 7 nm de peptidoglicano y una membrana externa. Entre la membrana citoplasmática y la membrana externa se localiza el espacio periplásmico, relleno de una sustancia denominada periplásma la cual contiene enzimas para la nutrición, enzimas inactivadora de antibióticos y proteínas de transporte. La membrana externa contiene diversas proteínas: porinas, lipopolisacáridos (LPS) y fosfolípidos. El lipopolisacárido forma tres regiones: polisacárido O (antígeno O), polisacárida central (KDO) y el lipido A (endotoxina). (g. 2)

2.4 Tinciones Básicas 2.4.1 Tinción de Gram 2.4.1.1 Principio Es el método de tinción diferencial más utilizado en bacteriología, siendo esencial para la clasicación y diferenciación de microorganismos, la cual divide las bacterias en dos grupos, las Gram positivas y las Gram negativas. La reacción de la tinción de Gram está basada en la diferencia en la composición química de la pared celular bacteriana. La tinción consta de 4 reactivos químicos, el primero es el colorante primario cristal violeta, su

función dar color a todas las células. El segundo reactivo el lugol, actuando como mordiente, haciendo que el cristal violeta se je con mayor intensidad a la pared celular de la bacteria. El tercer reactivo el decolorante Alcohol-acetona, donde los organismos Gram positivo no se decoloran y los Gram negativo si lo hacen. Y el cuarto reactivo el colorante de contraste Safranina, poniendo de maniesto las bacterias Gram negativas.

2.4.1.2 Procedimiento de la Tinción de Gram a. Preparación del Frote - Tomar la muestra con un hisopo de dacron o alginato de calcio. - Rodar el hisopo sobre un portaobjeto - En caso de muestras liquidas tomar una porción con un asa en argolla ameada y fría, colocarlo en un portaobjeto. - Dejar secar al aire o acelerar el secado acercando el portaobjeto al mechero, pero con precaución porque el calor puede degradar o deformarse las bacterias. b. Preparación de la tinción - En una bandeja con dos varillas colocar el frote en forma horizontal - Colocar el Cristal Violeta suciente cantidad, dejar actuar durante 1 minuto - Lavar suavemente con agua - Colocar el mordiente Yodo, dejar actuar por 1 minuto - Lavar suavemente con agua - Decolorar con Alcohol-Acetona, agregando gota o gota hasta que salga casi claro o ligeramente azul - Lavar con agua - Agregar safranina como contraste, dejar actuar por 1 minuto - Lavar con agua - Dejar secar la muestra - Examinar al microscopio con objetivo 100X de inmersión de aceite. Gram Positivo se tiñen de morado y Gram negativo de rosado. (g. 3)


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2.4.2 Tinción Ziehl Neelsen 2.4.2.1 Principio Es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada para identicar microorganismos patógenos como M. tuberculosis o el género Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros. El fundamento de la tinción se basa en resistir a la decoloración con alcohol-acido después de la tinción con colorantes básicos. Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga que les conere la propiedad de resistir la decoloración. La técnica consiste en la penetración de carbón fucsina en la pared celular mediante el calor como mordiente, luego de cesar la aplicación de calor la pared celular cerosa recupera su consistencia quedando atrapado el colorante. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo observándolo como bastoncitos delgados, ligeramente curvos. (g. 4)

- Cubrir el frote con el reactivo Carbón fucsina, - Por debajo del frote calentar con suavidad hasta la aparición de vapores durante 1 minuto - Dejar el colorante durante 4-5 minutos, sin calentar - Lavar el frote con agua de chorro y eliminar el exceso de agua - Decolorar el frote con alcohol-ácido - Lavar el frote con agua de chorro y eliminar el exceso de agua - Cubrir el frote con el reactivo azul de metileno durante 1 minuto - Lavar el frote con agua de chorro, dejar secar al aire - Observar el frote con microscopio con objetivo 100X en busca de BAAR

2.4.2.2 Procedimiento de Tinción de Ziehl Neelsen a. Preparación del frote - Con un palillo o un asa ameada y fría tomar muestra y colocarla en un portaobjeto limpio - Dejar secar a ambiente - Fijar al calor la muestra, con cuidado b Preparación de coloración - En una bandeja con varillas colocar el frote en posición horizontal Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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2.4.4.2 Procedimiento de Tinción Kinyoun Modicado 2.4.3 Tinción de Kinyoun 2.4.3.1 Principio La tinción es similar a la tinción de Ziehl Neelsen, siendo una coloración en frio, utilizando un reactivo especial que además de fucsina agrega una concentración alta de fenol. El fenol disuelve los lípidos de la pared celular permitiendo que el colorante primario entre entré, evitando el calentamiento. (g. 5 )

2.4.3.2 Procedimiento de Tinción Kinyoun - En una bandeja con dos varillas, colocar la laminilla en posición horizontal - Cubrir la laminilla con carbón fuscina-fenicada durante 5 minutos - Lavar con agua de chorro - Decolorar con alcohol-acido - Lavar con agua de chorro - Cubrir con el colorante de contraste por 1 minuto - Lavar con agua de chorro, secar al aire

2.4.4 Tinción Kinyoun Modicado 2.4.4.1 Principio

- Flamear el frote para jarlo - Colocar el frote en posición horizontal en una bandeja con varillas - Cubrir el frote con fucsina-fenicada durante 5 minutos - Lavar con agua de chorro - Decolorar con un ácido débil ácido sulfúrico, durante aproximadamente 3 minutos - Lavar con agua de chorro - Cubrir el frote con el colorante de contraste Azul de Metileno durante 3 minutos - Lavar con agua de chorro, dejar secar

2.4.5 Observación en Fresco 2.4.5.1 Principio Son todas aquellas formas o métodos de observación, mediante los cuales los objetos a investigarse no sufren cambios o alteraciones en cuando a su forma, estructura o composición química. Es útil para observar especies que se dañarían al teñirla o jarlas, como espirilos, así como observar movilidad, fenómeno de multiplicación o esporulación. (g. 6)

3 Toma de Muestra y Procedimientos

Parecida a la coloración de Kinyoun o en frio, haciendo la jación con alcohol metílico para 3.1 Orocultivo preservar las estructuras celulares y utilizando 3.1.1 Propósito e importancia ácido sulfúrico al 2% en agua destilada remplaEsta prueba se realiza para detectar infecciones zando al alcohol-acido. en la garganta causada por Estreptococos del grupo A causando amigdalitis o faringitis.


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El área faríngea puede estar colonizada por varias bacterias como Staphylococcus, Streptococcus, micococos, Moraxella catarrhalis, Corinebacterias, Haemophilus spp, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Veillonela, Peptostreptococcus, Actinomyces, levadura, etc., pero el microorganismo más frecuente que causa faringitis es el Streptococcus pyogenes

Carnero al 5% en un extremo de la caja realizando el inoculo. g. Enviarlo inmediatamente al laboratorio 3.1.3 Aislamiento Primario a. Proceder a realizar el estriado en Agar Sangre Carnero al 5%, realizando dos cortadas de aproximadamente 1 cm para aumentar la identicación de la beta hemolisis. Entre cada estriada y cortada no amear el asa. (g. 8)

3.1.2 Recolección de la muestra y transporte Previo a la toma de muestra el paciente no debe estar tomando antibióticos, no haber realizado gargarismo con algún antiséptico y no es necesario que el paciente se presente en ayuno. En algunos casos el procedimiento puede causar nauseas o vómitos.

3.1.2.1 Procedimiento a. Que el paciente este sentado, pedirle que trague saliva dos veces b. Indicarle al paciente que vea hacia arriba, abra la boca y diga aahh c. Con ayuda de un bajalengua presionar la lengua hacia abajo y con una linterna observar el área afectada, en busca de áreas inamada, con pus o ulceras blanquecinas.(g. 7) d. Con un hisopo estéril de dacrón proceder a la toma de muestra, con el mayor cuidado de no tocar paredes de la boca ni la lengua.

b. Incubar por 18 a 24 hrs a 35-36 °C introducirlo en una jarra con veladora con el objetivo de crear un ambiente de C02 c.Buscar colonias de pequeñas de 1 a 1.5 mm de diámetro rodeada de un halo de hemolisis completa sospechosas con beta-hemolisis sospechosas de S. pyogenes

3.1.4 Identicación Streptococcus pyogenes Es el principal microorganismo patógeno humano que produce infección local o sistémica y trastornos inmunitarios postestreptocócicos. Puede causar Faringitis, Erisipe, Celulitis, Gangrena estreptocócica, Fiebre puerperal, Piodermia estreptocócica, Síndrome de Choque Toxico, ebre reumática y glomerulonefritis. La prueba de catalasa es negativa, susceptible al Taxo A (bacitracina 0.04 U) formando un halo de inhibición, resistente al Taxo SXT, la identicación de pirrolidonilarilamidasa (PYR) y la detección del Antígeno A de Lanceeld. (g. 9)

e. Introducir el hisopo en el medio de transporte Todd Hewitt, llevarlo a la brevedad posible al laboratorio. f. En caso de realizar la inoculación directa realizar la inoculación en medio de Agar Sangre de

3.1.4.1 Procedimiento a. Después de la incubación de 16 a 24 horas del asilamiento primario, proceder a buscar colonias sospechosas de beta hemolisis.


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b. Trasladar una o varias colonias a un agar sangre carnero al 5% en el centro y proceder a realizar un estriado en forma de tapete c. Con una pinza ameada y fría colocar un disco de Taxo A (bacitracina 0.04 U)en el centro d. Incubar por 16 a 24 horas en ambiente de CO2 e. Examinar la caja para observación de un halo de inhibición alrededor del Taxo A. La presencia del halo indica que se aislo S. pyogenes (g. 10) f. Proceder a realizar la prueba de susceptibilidad y pruebas serologías de aglutinación para conrmación del grupo

3.2 Cultivo de Garganta Especial 3.2.1 Propósito La presencia de las bacterias especiales por cultivo se realiza mediante solicitud e investigación justicada. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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• Corynebacterium diphtheriae: conocido como bacilo Klebs-Löer, causante de la difteria, es investigada por sintomatología que presenta el paciente, siendo: formación de pseudo-membranas (pellejos) de color gris en la garganta, que sangran mucho al desprenderse, ebre y el paciente se encuentra severamente intoxicado, afectando las amígdalas, garganta, nariz, miocardio, bras nerviosas o piel. Bacterias Gram Positiva, catalasa positiva, inmóvil, no espurulados, bacilos rectos o ligeramente curvados 2-6 um de largo y 0.5 um de diámetro, a menudo con en forma de V lo que se conoce como forma de letras chinas. • Neisseria Meningitidis: Causante de severa y contagiosa meningitis, y se investiga principalmente el Líquido Cefalorraquídeo, la presencia la bacteria se realiza en cultivo de garganta en personal que han estado en contacto con el paciente, siendo médicos, enfermeras, técnicos de laboratorio, siendo importante identicar y erradicar la bacterias con tratamiento para evitar la desimanación. • Bordetella pertussis: Causante de la tos ferina, también conocida con tos convulsa o coqueluche. Se caracteriza por inamación traqueobronquial y accesos típicos de tos violenta y espasmódica con sensación a asxia. Cocobacilo Gram Negativo pequeño mide alrededor de 0,3-0,5 μm de ancho y entre 1,0 y 1,5 μm de largo, aerobios, posee capsulas, presenta lamentos similares a pilis.

3.2.2 Recolección de Muestra y Transporte 3.2.2.1 Toma de muestra para Corynebacterium diphteriae a. Con buena iluminación examinar la garganta, bajar la lengua con ayuda de un bajalengua, buscar aéreas necróticas o grisáceas (pseudomembrana) Fig. 11 b. Con un hisopo alginato de calcio estéril frotar rmemente las lesiones, retirar el hisopo con cuidado de no tocar las paredes ni la lengua de la boca. Tomar por lo menos 3 muestras con hisopo c. Un hisopo realizar un frote gram d. Inocular en los medios de cultivo.

3.2.2.2 Toma de Muestra para Neisseria meningitidis y Bordetella pertussis El cultivo de garganta/nasofaríngeo para el ais lamiento de N. meningitidis, debe obtenerse de personal que han tenido contacto directo con algún paciente que se ha detectado la presencia de la bacteria en LCR, se obtiene mayor porcentaje de aislamiento en toma de muestra nasofaríngea que de garganta. Figura No. 12 a. Colocar al paciente con la cabeza inmovilizada b. Con el pulgar de la mano, levantar suavemente la punta de la nariz c. Introducir un hisopo de alginato de calcio en unos de los oricios nasales d. Mover el hisopo hacia atrás y hacia arriba a lo largo del tabique nasal, hasta llegar a la parte posterior de la faringe. e. Retirar el hisopo con cuidado f. Inocular el hisopo en medio de transporte o directamente en el medio de cultivo. g. Con otro hisopo tomar muestra y realizar un frote gram


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3.2.3 Aislamiento primario 3.2.3.1 Corynebacterium diphteriae a. Inocular el hisopo en un medio inclinado de Loeer (suero animal más caldo glucosado coa gulado) el medio es de color crema pálido. b. El segundo hisopo inocular en agar Chocolate-Telurito de Potasio c. Proceder a estriar los medios de cultivo d. Incubar ambos medios aerobicamente por 36°C por 18 a 24 horas e. Un tercer hisopo inocular en agar Sangre Carnero al 5% para investigar Streptococcus pyogenes, incubar en ambiente CO2 f. Teñir el frote Gram y buscar características de la bacteria

das en Agar Chocolate-Telurito para realizar las pruebas de Catalasa y Nitritos Catalasa: Positivo Nitritos: Positivo Reporte: Si la morfología del crecimiento en medio Loeer es típica informar, Se aisló un bacilo gram-positivo, de morfología compatible con Corynebacterium diphtheriae. Si la morfología microscópica de crecimiento en medio Loeer es típica y hay colonias negras en Agar Chocolate-Telurito reportar: Se aisló Corynebacterium diphtheriae. Identicación preliminar, pendiente de demostrar la producción de toxina en vitro o in vivo

3.2.3.2 Neisseria meningitidis a. Inocular un hisopo en medio de de Thayer Martin b. Estriar el inoculo e incubar a 36°C en ambiente CO2 por 18-24 horas c. Teñir el frote Gram 3.2.3.3 Bordetella pertussis a. Inocular un hisopo en medio de agar Bordet-Gengou o Agar Regan-Lowe b. Estriar el inoculo e incubar a 36° por 4-5 días 3.2.4.2 Neisseria Meningitidis c. Teñir el frote gram a. Después de la incubación observar colonias en Agar Chocolate pequeñas, grises, brillantes y 3.2.4 Identicación de principales Mi- ligeramente mucosas croorganismos b. Realizar un frote Gram con cuidado, observar 3.2.4.1 Corynebacterium diphtheriae diplococos Gram-negativo en forma de granos a. Después de la incubación del medio Loeer de café, agrupados en pareja con dos a ocho horas, preparar dos frotes uno c. Realizar un subcultivo para obtener un cultivo para gram y otro para Azul de metileno, con cui- puro en agar Chocolate sin inhibidores de colodado de remover lo menos posible nias características y morfología microscópicas b. Tinción de Gram: bacilos gran-positivo pleo- de la bacteria para las pruebas de identicación mórcos y en forma de maza, agrupadas en for - como Oxidasa, utilización de azucares y pruema de letras chinas o en formas de V o Y. bas serológicas. c. Tinción de Azul de Metileno: utilizar Azul de Metileno de la coloración de Ziehl Neelsen ob- Prueba de Oxidasa servar el mismo patrón que el gram, solo que la a. Tomar una porción de la colonia a estudio, con coloración es discontinua en forma de bandas un palillo de madera o un asa plástica, frotar soazules por los corpúsculos metacromáticos de bre un disco con reactivo de oxidasa. polimetafosfato. b. La reacción positiva se da en 10 segundos, d. En agar Chocolate-Telurito se observan colo- con una coloración morado oscuro a negro indinias de color negro intenso. cando prueba positiva. e. Sulcultivar en Agar Sangre de Carnero al 5% colonias características de C. diphtheriae creciRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Utilización de Azucares Método Agar Cistina Tripticasa ACT a. Se utiliza un juego de 4 tubos con agar ACT con distintas azucares (glucosa, maltosa, lactosa y sacarosa) b. Tomar una pequeña cantidad con un asa en punta del crecimiento de un cultivo de N. meningitidis, de un cultivo puro de 24 horas en agar Sangre y Chocolate c. Inocular pinchando varias veces los 10 mm superiores del medio. Y repetir el proceso con los otros tubos usando un asa ameada y fría. d. Cerrar los tubos e incubarlos a 35°C por lo menos 72 horas hasta 5 días antes de descartarlos como negativo e. Si se genera una turbidez visible y un color amarillo en la porción superior del medio, es indicativo de crecimiento y producción de acido, intepretando como positiva la prueba. N. meningitidis, oxida glucosa y la maltosa, pero no la lactosa ni la sacarosa. (Tabla No. 1)

Tabla No. 1 Utilización de Azucares

Colonias de B. pertussis Figura No. 14 3.3 3.3.1

Hemocultivo y Mielocultivo Propósito

El hemocultivo sirve para detectar las bacterias que se están reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. El mielocultivo es el cultivo de médula ósea y sirve para detectar bacterias en esta muestra, especialmente Salmonella typhi. El aparato circulatorio, es un sitio naturalmente estéril, por lo tanto, la presencia de microorganismo o sus productos constituyen un problema para todos los órganos y sistemas que son irrigados por el mismo. La detección e identicación de los diversos microbianos, es de vital importancia desde el punto de vista clínico para instaurar una terapia antimicrobiana adecuada y desde el punto de vista epidemiológico.


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3.3 Hemocultivo y Mielocultivo 3.3.1 Propósito

f. Dispensar el volumen de sangre obtenido rápida y suavemente en el medio de cultivo líquido con anticoagulante g. Limpiar con alcohol al 70% para remover el yodo el cual puede causar irritación en algunos pacientes. Las botellas de hemocultivo inoculadas deben ser enviadas inmediatamente al laboratorio evitando una agitación vigorosa, sin refrigerar. Si no es posible llevarlas de inmediato, conservarlas a temperatura ambiente por un corto período de tiempo sin alterar la viabilidad de las bacterias. Por un periodo mayor deben conservarse en incubadora a 35°C. En sepsis: se recomienda tomar dos muestras de lugares distintos en un lapso de media hora. En endocarditis, obtener tres muestras de diferentes lugares en un lapso de 1 a 2 horas.

El hemocultivo sirve para detectar las bacterias que se están reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. El mielocultivo es el cultivo de médula ósea y sirve para detectar bacterias en esta muestra, especialmente Salmonella typhi. El aparato circulatorio, es un sitio naturalmente estéril, por lo tanto, la presencia de microorganismo o sus productos constituyen un problema para todos los órganos y sistemas que son irrigados por el mismo. La detección e identi cación de los diversos microbianos, es de vital importancia desde el punto de vista clínico para instaurar una terapia antimicrobiana adecuada 3.3.3 Aislamiento primario y desde el punto de vista epidemiológico. 3.3.3.1 Procedimiento de incubación 3.3.2 Recolección de la muestra y a. Al obtener la muestra en el frasco de hemocultivo, incubar el frasco a 35-36°C hasta por 7 días transporte b. Examinar visualmente y con luz transmitida El momento ideal para obtención de la muestra los frascos de hemocultivo después de 12 y 24 es justo antes del pico más alto de ebre, sin horas de incubación. esperar el pico máximo de temperatura, ya que c. Observar si presenta turbidez o lisis de gloen este momento hay mayor destrucción del bulos rojos indicando crecimiento bacteriano, microorganismo. Antes de recibir terapia antimi- entonces realizar una coloración Gram y un subcrobiana, si está recibiendo ya terapia antimi- cultivo., si no presenta cambios seguir incubancrobina tomar muestra en el momento de baja do por 7 días. concentración del antibiótico.

3.3.2.1 Toma de muestra a. Seleccionar el sitio de punción, b. Preparar el sitio, lavar con agua y jabón. Limpiar con alcohol etílico a 70%. Si el paciente no es alérgico al yodo, lavar en forma concéntrica con tintura de yodo por 30 segundos c. Desinfectar las tapas de la botella del hemocultivo con alcohol o yodo. d. Proceder a la venopunción con jeringa, extraer el volumen de sangre necesario para obtener una dilución en una proporción de 1:5 o 1:10 Volumen de muestra:

neonatos 0.5 ml Niños 1-5 ml Adultos 10 ml e. Retirar la ligadura y la jeringa al terminar de obtener la sangre, colocar una torunda de algodón

Subcultivo a. Los subcultivos deben realizarse en cabina o cerca de un mechero de bunsen b. Realizar los subcultivos ciegos dentro de las 12 a 24 horas de incubación


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c.Antes de realizar el subcultivo, desinfectar la supercie de la tapa del frasco con alcohol al 70% d. Con una jeringa estéril, extraer a través del tapón de la muestras e. Inocular una gota de muestra del hemocultivo en un extremo de la supercie de las placas de Agar Sangre, Agar MacConkey, Agar Chocolate y Agar Manitol sal. f. También colocar una gota sobe un portaobjeto para la tinción de Gram g. Proceder a realizar la dispersión para obtener colonias aislada h. Incubar las placas de Agar sangre carnero 5% y Agar Chocolate a 35-36°C por 24 horas en ambiente de CO2; las placas de MacConkey y Manitol Sal incuabar en ambiente aerobiosis. i. Observar el gram si se observa morfología bacteriana informar al medico j. Si no hay crecimiento a las 24 horas, seguir incubando hasta por 48 horas. k. Si no hubiera desarrollo bacteriano, repetir el procedimiento de sulbcultivo al 5to y 7 mo dia. l. Streptococcus pneumoniae tiene tendencia a autolisis, deben ser subcultivado a las 12-17 horas de incubación, repetir a las 48 horas y 7mo día de incubación sin presentar cambio de coloración o turbidez.(Tabla No. 2)

Tabla No. 2 Alteración del hemocultivo y posible bacteria

3.3.4 Identicación de principales microorganismos Staphylococcus coagulasa negativo, corinebacterias y especies de bacillus son contaminantes frecuetnes y a menudo se aíslan en solo una de tres muestras o el paciente no presenta síntomas. Algunas bacterias frecuente en hemocultivos positivos son: Salmonella typhi Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Pseudomonas aeruginosa Haemophilus inuenzae

3.4 Líquido cefalorraquídeo y otros líquidos estériles 3.4.1 Propósito Demostrar mediante el cultivo de Líquido Cefalorraquídeo (LCR) u otro tipo de líquido el diagnos tico microbiológico de una infección. Las infecciones del SNC puede ser causada por bacterias, virus, hongos o parásitos que se hallan en el medio ambiente o que forman parte de la ora normal de la supercies corporales; los agentes causales son introducidos previamente en los tejidos periféricos del hospedero y se dirigen al SNC a través del torrente sanguíneo o ocasionado por traumatismos craneoencefálicos.


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Las bacterias que tiene mayor importancia en el líquido cefalorraquídeo son: Bacterias Gram Negativo Neisseria meningitidis Haemophilus inuenzae Escherichia coli y otras enterobacterias Pseudomonas aeruginosa Bacterias Gram Positivo Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Lysteria monocytogenes Entre otros microorganismos esta Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Cryptococcus neoformans. Los síntomas de irritación de las meninges son ebre, dolor de cabeza, vómitos, rigidez, dolor de nuca, reejos aumentados y petequias en la piel.

3.4.2 Recolección de Muestra y Transporte Las muestras de líquido LCR u otro líquido corporal estéril deben ser tomadas por un profesional capacitado, antes de iniciar tratamientos con antibióticos, colectadas en recipientes estériles por lo menos tres frascos para citológico (recuento de glóbulos rojos, recuento de glóbulos blancos, formula diferencial), químico (glucosa, proteína entre otros) y microbiológico. Deben ser transportadas inmediatamente al laboratorio y ser procesadas inmediatamente no después de 30 minutos de recolectada. Rotular la muestra adecuadamente y tipo de muestra. Si el médico sospecha de bacilos alcohol acido resistente BAAR o de hongos debe noticarlo para evaluar.


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Los líquidos o uidos corporales estériles son: - Líquido cefalorraquídeo - Líquido ventricular (cisternal o craneal) - Líquido abdominal (peritonel, de diálisis o bilis) - Líquido pleural, toracentesis y empiema ( obtenido del torax) - Líquido pericardio -Líquido sinovial La muestra de Líquido Cefalorraquídeo LCR se obtiene por punción lumbar, se sugiere por lo menos la colección de la muestra en tres tubos separados para analizar química (glucosa, proteínas entre otros), citológico (glóbulos rojos, glóbulos blancos y formula diferencial) y cultivo microbiológico de preferencia el tubo no. 2 o el más turbio para el análisis microbiológico.

Figura No. 16

3.4.3 Aislamiento Primario del Líquido Cefalorraquídeo u otros Líquidos Estériles. Primera porción a. Tomar un tubo con muestra y Centrifugar la muestra a 3,000 rpm durante 10 minutos b.Descartar el sobrenadante y con el sedimento proceder a realizar frotes para Gram y Zielh Neelsen ZN; Tinta China c.Si se observan Bacilos Alcohol Acido Resistente sembrar en Lowenstein Jensen, siguiendo el protocolo para aislamiento e identicación de micobacterias por 60 días d.Si en la coloración de Tinta China se observan

levaduras encapsuladas sembrar en agar Sabourod por 4 semanas e. Tomar una o dos gotas de líquido con una pipeta pasteur estéril o jeringa estéril e inocular los medios de cultivo sólidos, Agar Sangre Carnero 5%, Agar Chocolate, Agar Manitol Sal, Agar MacConkey. f. Incubar los medios de Agar Sangre Carnero al 5% y Agar Chocolate en ambiente de CO2 y Agar Manitol Sal y MacConkey en ambiente aerobiosis, a 36°C, revisar a las 24 horas. g. Si el laboratorio cuente con pruebas para detección de antígenos, realice estas pruebas con una pequeña cantidad del LCR o del sobrenadante del LCR. h. Si no se observa crecimiento deben ser reincubados los medios por 72 horas antes de descartados. i.Si presenta desarrollo de microorganismos sobre los medios de cultivo sólidos realizar coloración Gram, de acuerdo a lo observado proceder a montar las pruebas de identicación y antibiograma. Reportar al médico inmediatamente lo observado en la tinción de Gram, ZN o Tinta China. Segunda Porción a Proceder a realizar el examen macroscópico (color, aspecto, volumen ) y citológico del Líquido estéril b. El examen citológico de la segunda porción se analizara - Recuento de glóbulos rojos - Recuento de glóbulos blanco - Formula diferencial c Es este tubo también puede realizarse pruebas de latex para identicación de Criptococcus neoformans, H. inuenzae, N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae y del grupo B-hemolitico. Tercera Porción Proceder a realizar el examen químico con evaluación de glucosa y proteínas. d. Si en la coloración de Tinta China se observan levaduras encapsuladas sembrar en agar Sabourod por 4 semanas e.Tomar una o dos gotas de líquido con una pipeta pasteur estéril o jeringa estéril e inocular los medios de cultivo sólidos, Agar Sangre Carnero 5%, Agar Chocolate, Agar Manitol Sal, Agar MacConkey.


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Interpretación Tinción del Gram del sedimento del LCR: - Observar diplococos Gram Negativo, forma de riñon, en parejas como grano de café, compatibles con N.meningitidis. - Cocobacilos Gram Negativo pleomórcos, con escasa formas bacilares, compatible con H. inuenzae - Cocos Gram Positivo, lanceolado, ovalado, dispuestos en parejas o cadena cortas, la capsula se insinúa como un halo claro alrededor de las bacterias, compatible con S. pneumoniae. - Bacilos Gram Negativo, compatible con Enterobacterias o Pseudomonas sp. - Levaduras redondas con gemación, Gram positivo, se insinúa cápsula hacer tinta china, para vericar la presencia de C. neoformans Tinción de Ziehl Neelsen - Si se observan bacilos alcohol ácido resistente cortos, morfología compatible con M. tuberculosis o otras micobacterias. Al observar crecimiento a las 24 o 48 horas y observar crecimiento en distintos medios como guía (Tabla No. 4)

f. Incubar los medios de Agar Sangre Carnero al 5% y Agar Chocolate en ambiente de CO2 y Agar Manitol Sal y MacConkey en ambiente aerobiosis, a 36°C, revisar a las 24 horas. g.Si el laboratorio cuente con pruebas para detección de antígenos, realice estas pruebas con una pequeña cantidad del LCR o del sobrenadante del LCR. h.Si no se observa crecimiento deben ser reincubados los medios por 72 horas antes de descartados. i.Si presenta desarrollo de microorganismos sobre los medios de cultivo sólidos realizar coloración Gram, de acuerdo a lo observado proceder a montar las pruebas de identicación y antibiograma. Reportar al médico inmediatamente lo observado en la tinción de Gram, ZN o Tinta China. Segunda Porción a. Proceder a realizar el examen macroscópico (color, aspecto, volumen ) y citológico del Líquido estéril b. El examen citológico de la segunda porción Tabla No. 4 se analizara - Recuento de glóbulos rojos - Recuento de glóbulos blanco - Formula diferencial c Es este tubo también puede realizarse pruebas de latex para identicación de Criptococcus neoformans, H. inuenzae, N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae y del grupo B-hemolitico. Tercera Porción Proceder a realizar el examen químico con eva- Realizar Frote gram de las colonias para conrmar morfo luación de glucosa y proteínas. logía y proceder a identicación (tabla No. 5) 3.4.4 Identicación de principales miTabla No. 5 croorganismos


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3.5 Coprocultivo 3.5.1 Propósito e Importancia

identicar más de 40 serotipos. Los factores de virulencia son Endotoxina, que se libera tras la lisis de la bacteria, que contribuye a la irritación de la pared intestinal y la Exotoxina o Toxina Shiga que es una proteína termolábil inmunogénica, su acción afecta tanto al intestino como sistema nervioso central.

Método utilizado para identicar diferentes microorganismos causantes de enfermedades gastrointestinales, provocando diarreas, vómi- 3.5.1.3 Vibrio Cholerae tos, ebre y dolores estomacales. Los principales enteropátogenos están: Salmo- El género Vibrio agrupa a más de 30 especies, nella sp, Shigella sp y Vibrio cholerae. pero sólo 12 se consideran patógenas para el ser humano. La especie más patógena es V. 3.5.1.1 Salmonella sp cholerae, según el antígeno somático (O) se subdivide en los grupos O1, O2, O3 y O139. El El género Salmonella se incluye en la fami- Vibrio cholerae grupo O1 presenta 2 biotipos; el lia Enterobacteriaceae, integrada por bacilos Clásico, y Eltor y ambos biotipos pueden perteGram negativo anaerobios facultativos, son fer- necer a dis serotipos principales Ogawa e Inaba. mentadores de glucosa pero no lactosa, suelen Los vibrios causantes de cólera son Vibrio choser móviles por sus agelos peritricos excepto lerae grupo O1 y grupo O139, fabrican una enS. gallinarum, no esporulados, producen ácido dotoxina que es la determinante de las diarreas sulfúrico y no producen ureasa. secretoras típicas del cólera. Se distinguen tres únicas especies patógenas Son bacilos Gram negativo, con forma de coma, primarias: S. thphi, S. Cholerae-suis y S. en- aerobios y anaerobios facultativos. No esporulateritidis. Según la serotipicación de Kauman dos, tiene agelo polar. Fermenta la glucosa sin y White, estas se clasican en más de 2000 producción de gas, catalasa positivo y la mayoserotipos con base en antígenos agelares H ría es oxidasa positiva. Tiene Antígeno somático (proteicos) y antígeno somáticos O (fracción po- (O), antígeno agelar (AgH), sus factores de vi lisacárida del lipopolisacaridos bacilar). S. typhi rulencia son mucinasa y la toxina colérica. posee además un antígeno de virulencia (Vi) 3.5.2 Recolección de Muestra y Trans3.5.1.2 Shigella porte a. No estar tomando antibióticos Shigella es un bacilo Gram negativo, inmóvil, no b. Colectar la muestra de heces frescas en un formadoras de esporas e incapaces de fermen- frasco limpio y estéril de boca ancha enviarlo antar la lactosa, que puede ocasionar diarrea en tes de 1 hora al laboratorio especialmente en niños. c. Si no puede emitir muestra de heces se pueExisten varias especies diferentes y son clasi - de proceder a toma de muestra con hisopo. En cados en cuatro subgrupos niños introducir el hisopo 2.5 cm y en adultos - Serogrupo A: S. dysenteriae (12 serotipos): introducirlo 4 cm; dar 3 vueltas a la derecha y 3 causa disentería bacilar grave y complicaciones vueltas a la izquierda - Serogrupo B: S. exneri (6 serotipos): causa d. Si la muestra es tomada con hisopo introdudisentería bacilar moderada cirlo en el medio de transporte como Cary Blair, - Serogrupo C: S. boydii (23 serotipos): causa e. Enviar la muestras tomadas lo antes posible disentería bacilar moderada al laboratorio - Serogrupo D: S. sonnei (1 serotipo): causa di3.5.3Aislamiento Primario sentería bacilar leve Shigella tienen un patrón antigénico complejo, 3.5.3.1 Procedimiento para aislar Salla mayor parte de las especies comparten el an- monella sp, Shigella sp tígeno O con otras enterobacterias. El antígeno a. Procesar la muestra lo más pronto posible O (somático) es un lipopolisacárido que permite Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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b. Con un hisopo estéril o asa en argolla tomar muestras de heces donde hay presencia de moco, pus o sangre. c. Tomar un hisopo o una asada de muestra y colocarlo en caldo de selenito por 12 a 24 horas a 35-36°C (inhibiendo la ora normal y permite el desarrollo de salmonella sp y Shigella sp. d. Tomar tercer hisopo o asa con muestra e inocular los medios de cultivo selectivos como MacConkey Sorbitol y XLD o SS, realizando un inoculo de 1 cm. e. Con un asa en argolla ameada y fría proce der a estriar f. Incubar por 24 a 48 hrs a 35-36C g. Revisar la presencia de colonias sospechosas tabla no. 1, realizar identicación y antibiograma El Agar MacConkey Sorbitol utilizado para buscar Escherichia coli O 157:H7 en niños menores de 5 años. Características macroscópicas en los medios de cultivo de las bacterias más importantes (Ta3.5.3.2 Procedimiento para aislabla No. 6 y guras 17) miento de Vibrio cholerae a. Procesar la muestra lo más pronto posible o muestra Tabla No. 6 proveniente en medio de transporte de Cary Blair b.Con un hisopo estéril o asa en argolla tomar muestras de heces donde hay presencia de moco, pus o sangre. c.Tomar un hisopo o asa de muestra y colocarlo en Agua Peptonada Alcalina por 6 a 8 hr a 35-36 °C para enrique cimiento de Vibrio cholerae d.Sulcultivar en medio TCBS (tiosulfato, citrato sales bilia res y sacarosa y Agar Sangre e. Con un asa en argolla ameada y fría proceder a estriar. Incubar por 24 hrs a 35-36C f.Revisar la presencia de colonias circulares de borde entero de color amarillo (sacarosa positivo) en medio TCBS y en agar Sangre colonias hemolíticas. (Figura 18)


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- Proceder a picar una vez el medio por el centro al fondo del tubo - Sin sacar el asa recta del tubo estriar el sland del medio - Incubar a 36 C por 18 / 24 hrs - Leer la reacción

B. LIA Agar Lisina Hierro Mide la capacidad del microorganismo para descarboxilar un aminoácido (lisina o arginina) para forma una amina con la consiguiente alcalinidad, poniéndose de maniesto por el viraje del indicador púrpura de bromocresol. El medio es de color púrpura intenso pH 6. Procedimiento - Con un asa recta no ameada del proceso del TSI, - Desenrosque el tubo y amee la boca del tubo - Proceder a picar el medio tres veces hasta el fondo y estriar el sland - Incubar a 36C por 18 a 24 hrs - Leer la reacción 3.5.4 Identicación de principales Microorganismo

Tabla No. 6 Interpretación TSI y LIA

3.5.4.1 Pruebas Bioquímicas Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos, la cual se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azúcares, presencia de enzimas, degradación de compuestos; con el objetivo de diferenciar bacterias. Para la realización de las pruebas bioquímicas se debe tener cuidado utilizar mesclar bacterias y tomar proceder con aislamientos puros. A. TSI Agar hierro triple azúcar Determinar la capacidad de la bacteria para degradar los azucares y la formación de gas y Acido Sulfhidrico. Color es rojo ladrillo anaranjado pH 7.4. . La fermentación aeróbica se produce en el sland del tubo y la anaeróbica en el fondo del tubo. Procedimiento - Con un asa recta picar una colonia sospechosa que este aislada - Desenrosque el tubo y amee la boca del tubo Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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2. Descarboxilación de Ornitina, capacidad del organismo de descarboxilar un aminoácido para formar una amina, por consiguiente la C.Citrato La utilización de citrato como única fuente de alcalinización carbono es una prueba útil en la identicación 3. Producción de Indol El triptófano es un amide enterobacterias, se detecta mediante el noácido que puede ser oxidado por ciertas baccrecimiento y alcalinización del medio a pH 7.6, terias formando tres metabolitos, Indol, Escatol, el aumento de pH se visualiza con el indicador y Indolacetico. Azul de Bromotimol que vira el medio de color Procedimiento verde a azul oscuro. - Con un asa en línea ameada y fría tomar una Procedimiento colonia - Con un asa ameada y fría tomar una colonia - Desenroscar el frasco y amear la boca del aislada tubo - Desenrosque el tubo y amee la boca del - Introducir el asa en medio del agar hasta el fontubo do - Proceda a estriar el sland - Incubar por 18-24 hr a 36°C - Incubar a 36 °C por 18-24 horas - Para la prueba de Indol, agregar 5 gotas del - Interpretar reactivo de Kovacs, agitar suavemente Interpretación - Interpretar Positivo: Crecimiento y viraje azul Interpretación Negativo: Sin viraje el medio (verde) Producción de Orinitina: Positivo: color purpura Negativo: color amarillo al fondo del tubo D. UREA La tripteína y la glucosa aportan los nutrientes Producción de Indol: Positivo: anillo rojo en la para el desarrollo del microorganismo, el rojo supercie de fenol es el indicador del pH y el cloruro de Negativo: no produce color sodio mantiene el balance osmótico. Las bacMovilidad: Positivo: Los microorganismos móviterias que hidrolizan la urea por medio de la les migran de la línea de siembre hacia el medio enzima ureasa liberan amoniaco y dióxido de formando turbidez carbono, esto alcaliniza el medio virando el rojo Negativo: crecimiento bacteriano solo en la línea de fenol de amarillo al Rosado Intenso, esta de siembra. 3.5.4.2 Identicación de Salmonella sp prueba puede realizarse en medio liquido o sólido. El medio es de color amarillo. Procedimiento - De un cultivo puro tomar una colonia con una asa ameada y fría - Desenrosque el medio y amee la boca del tubo - Estriar la supercie del sland - Incubar por 18 a 24 hrs a 36C - Leer reacción

Interpretación Positivo: Rosado intenso Negativo: Sin viraje el medio (Amarillo) E. MIO (Movilidad, Indol y Orinitina) Utilizado para la identicación de enterobacterias sobre la base de: 1. Movilidad: Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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- Mezcle la suspensión y el antisuero completamente y a modo de mecedora mueva el portaob jeto repetidamente para observar aglutinación bajo luz brillante y sobre un fondo negro. Si la reacción es positiva en 30 seg a 1 min aparecerá una precipitación. - Si presenta aglutinación en el control se trata de una cepa rugosa, y no puede ser serotipi cado.

3.5.4.3 Identicación de Shigella sp a. Reacción bioquímica

b. Tinción de Gram

Salmonella typhi c. Serológica Los cultivos de TSI sospechosa de S. typhi deben analizarse serológicamente con antisueros de Salmonella Vi y “O” del grupo D. El antígeno Vi es capsular puede enmascarar la reacción del grupo somático “O”, por lo que aislamientos de Salmonella typhi serán normalmente positivos tanto Vi como para el antisuero D. Procedimiento - En un portaobjeto límpido colocar tres pequeñas gotas de solución salina - Tomar una porción del crecimiento de la supercie de TSI y suspender cada gota de solución salina, mezclar - Añadir una pequeñas gota de antisuero O del grupo D a una suspensión y una pequeña gota del antisuero Vi a una segunda. La tercera suspensión será control Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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3.5.4.4 Identicación de Vibrio cholerae b. Tinción de Gram a. Reacción bioquímica

b. Tinción de Gram c. Serología S. dysenteriae es las mas común en desintería, los aislamientos con reacciones típicas en la pruebas bioquímicas

deben estudiarse primero con el antisuero monovalente A1, después con el antisuero polivalente B y por ultimo el antisuero polivalente D.

Procedimiento - En un portaobjeto dividirlo y en cada sección colocar una gota de solución salina - Tomar muestra de las colonias sospechosas del TSI u otro medio no selectivo - Emulsique el crecimiento en cada gota de solución salina, mezcle completamente las suspensión para hacerla moderadamente lechosa - Añadir una gota pequeña de antisuero y una se usara como control - Mezclar bien la suspensión y el antisuero para observar autoaglutinación. - Observar el portaobjeto bajo una luz brillante y sobre un fondo negro. Reacción positiva dentro de 30 seg a 1 min. - Si observar una el control que es la colonia con solución salina, se debe observar una mezcla homogénea, si hay presencia de aglutinación no sirve para serotipicado.

c. Prueba de Cuerda La prueba se utiliza para distinguir cepas de V. cholerae de Aeromonas. El desoxicolato de sodio lisas las bacterias, la solución perderá la turbidez y el ADN se desprenderá de las células causando la viscosidad. Procedimiento - En un portaobjeto colocar una gota de desoxicolato sódico al 0.5 % - Tomar una colonia a analizar previamente incubada en Agar Infusión de Corazón por 18 a 24 hrs - Interpretar Interpretación Positivo: Vibrio cholerae; otros vibrios darán positivo o positivo débil Negativo: Aeromonas


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3.6 Urocultivo 3.6.1 Propósito e importancia El urocultivo es utilizado para la identicación de microorganismos causantes de infecciones urinarias asintomáticas o sintomáticas que van precedidos de leucocitosos y bacteriuria. Bajo condiciones normales no hay bacterias en el tracto urinario. El microorganismo principales de infección urinaria son bacilos gram negativo y con mayor frecuencia es la Escherichia coli, seguido de Klebsiella sp, Enterobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa, de menor importancia están los cocos gram positivos como Enterococcus sp., Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus y hongos. Cultivos de orinas con presencia de 2 a más microorganismos es indicio de una mala limpieza por lo tanto es una contaminación. El criterio de Kass, es útil para interpretar del crecimiento del bacteriano y ser considerada una verdadera infección urinaria, siendo este criterio de igual o mayor a 100,000 UFC/ML (UFC/ml Unidad formadora de colonias por mililitro).

niños. Llevar la muestra inmediatamente al laboratorio, no pasando más de una hora después de la recolección.

Mujeres: a. Realizar la limpieza en el área genital, separando los labios mayores, con gasas estéril con jabón antiséptico limpiar y con otra gasa estéril con agua quitar el jabón b. Dejar secar c. Proceder a recolectar la muestra en un frasco estéril boca ancha, descartando la primera porción de la orina en el sanitario y luego recolectar la otra porción a medio chorro d. Trasladarla inmediatamente al laboratorio. Hombres: a. Realizar la limpieza en la punta del pene con gasa estéril con antiséptico, luego con otra gasa con agua estéril quitar el jabón. b. Dejar secar. c. Proceder a la recolección de la muestra en frasco estéril boca ancha, descartando la primera porción de la orina en el sanitario y recolectarla otra porción a medio chorro. d. Trasladar inmediatamente al laboratorio.

3.6.2 Recolección de la Muestra y 2. Punción Supra-púbica Transporte Esta por ser una técnica delicada debe ser tomada por un médico pediatra. Es la obtención de la De preferencia que el paciente no este con te- muestra por jeringa estéril. Esto solo se hace en rapia antibiótica previa a la recolección de la casos de que los cultivos aerobios dan negativos muestra, la muestra adecuada es la primera de y con sintomatología, malformación de la uretra la mañana, de no ser posible por lo menos pa- o sospecha de infección por un anaerobio. sar dos horas sin orinar para recolectar la muestra. Al momento de tener la muestra enviarla lo más antes posible al laboratorio no mayor de 2 horas. Recolectar en frasco estéril previa limpieza adecuada. Existen varios procesos de recolección de la muestra: 1. Chorro medio Niños: Realizar la limpieza en el área con agua y jabón, secar, colocar la bolsita de recolección de orina pediátrica adecuadamente (varones que el pene quede introducido en el agujero de la bolsita y mujercitas que el agujero quede en el centro donde saldrá la orina). No dejar la bolsita por más de una horas colocada en los Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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3. Sondas permanentes Este procedimiento se utiliza en aquellos enfermos con sonda permanente en los que no es posible retirar o reemplazar la sonda. Se desinfecta la parte externa de la sonda en la zona proximal con alcohol yodado y se punza la sonda con aguja y jeringa estéril. Se vuelca el contenido en forma aséptica en un frasco estéril.

Criterio de Kass

3.6.3 Asilamiento primario - Proceder a sembrar la orina con un asa calibrada; se utiliza medios de cultivo de Agar Sangre Carnero al 5% permitiendo el crecimiento de todo tipo de bacterias, Agar MacConkey permitiendo el crecimiento de bacterias Gram negativo. También puede usarse Chromocult o CLED este inhibe el swarming de Proteus sp - Con un asa calibrada de 0.001 ml ameada y fría proceder a tomar la muestra de orina previamente agitada y abierta cerca del mechero - Realizar un línea con el asa calibrada en el centro de la placa de Agar Sangre y otra línea con el asa ameada y fría en la placa de Mac Conkey de igual manera - Con un asa no calibrada realizar las estrías en forma de zigzag. - Incubar el Agar Sangre en jarra con candela ambiente de CO2 y el Agar MacConkey en aerobiosis a 35-36 °C por 18 a 24 hrs. - Interpretación, si no hay crecimiento en un cultivo por 48 horas reportar “Negativo a las 48 horas de Incubación”, si hay presencia de crecimiento contar el número de colonias presentes y multiplicar por 1000 si se usa asa calibrada de 0.001 y multiplicas por 100 si se usó asa calibrada de 0.01 ml realizar la identicación de la bacteria por medio de reacciones químicas. Tener en cuenta el criterio de Kass.

- Recuentos inferiores a 10,000 UFC/ml, con hallazgos de cultivos polimicrobianos indican que hubo una posible contaminación. - Recuentos de 10,000 a 100,000 UFC/ml, posible bacteriuria - Recuentos igual o mayor a 100,000 UFC/ml en pacientes asintomáticos tienen una probabilidad del 80% de presentar bacteriuria signicativa, probabilidad que aumenta hasta el 96% en paciente sintomático. - Muestras obtenidas por Punción Suprapúbica cualquier recuento de colonia es signicativo.

3.6.4 Identicación de principales microorganismo 3.6.4.1Escherichia coli Reacción bioquímica


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Escherichia coli (gram negativas) con la tinción de Gram.


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- Desinfectar la supercie con alcohol al 70% o yodo 3.7 Secreciones Varias 3.7.1 Secreciones de heridas y absce- - Introducir la aguja a través de la piel o la pared de absceso y aspirar aproximadamente 1 ml del sos material purulento 3.7.1.1 Propósito e importancia - Colocarlo en un frasco estéril o un medio de Está indicado para detectar la presencia de transporte y enviar inmediatamente al laboratobacterias causantes de infecciones en piel, ojo, rio oídos, quemaduras, abscesos y otros. La piel es el órgano más accesible del cuerpo que pue- 3.7.1.2.3 Toma de muestra en quemade tener mayor probabilidad de ser dañado o duras traumatizado, causando dolor, hinchazón, calor - Limpiar y retirar el tejido muerto o quemado any enrojecimiento alrededor de la herida hasta tes de la obtención de la muestra (hisopado del formar abscesos. La infección puede ser mono- exudado o una biopsia) - Llevar la muestra del tejido en frasco estéril microbianas o polimicrobianas. Los microorganismos más frecuentes S. aureus, S. epidermides, Enterococos, E. coli, Klebsiella 3.7.1.2.4 Toma de muestra de ojo sp, Enterobacter sp, P. aeruginosa, Candida al- - Realizar la toma de muestra antes de colocado analgésicos locales, colirio o antibióticos bicans. - Proceder a la toma de muestra con hisopo ro3.7.1.2 Recolección de la muestra y tando suavemente el hisopo en el ángulo interno transporte Previo a tomar la muestra del ojo e introducirlo en el medio de transporte el paciente no debe estar tomando an- - Con un hisopo estéril y húmedo con solución salina tomar la muestra y realizar los frotes gram tibiótico. - Si es para investigar Chlamydia trachomatis, verter el párpado y frotar con una torunda la su3.7.1.2.1 Toma de muestra de Herida - Realizar una buena asepsia de los bordes con percie conjuntival y teñir con coloración Giemsolución salina estéril, realizando de adentro sa. Observar inclusiones intracitoplasmaticas hacia fuera en forma concéntrica - Separa suavemente los bordes de la herida con el pulgar e índice de la mano. - Con la otra mano, con cuidado de no tocar los bordes cutáneos, introducir la punta del hisopo en la profundidad de la herida, rotando el hisopo y avanzando hacia fuera. - Obtener dos muestras o Una para cultivo, introduciendo en un medio de transporte amies, stuart. o La segunda para realizar una coloración Gram, KOH o ZN realizar inmediatamente. 3.7.1.2.5 Toma de muestra de Oído - Enviar el medio de transporte al laboratorio. - Limpiar el canal auditivo externo con un hisopo 3.7.1.2.2 Toma de muestra de Absceso impregnado con Sol. Salina estéril - Proceder a la toma de muestra con el medio La toma de muestra de absceso debe ser toma- de transporte, de atrás hacia delante y de abajo da por aspiración con jeringa. hacia arriba -Realizar un frote para coloración Gram con un - Realizar una limpieza de la supercie con so - hisopo estéril humedecido con sol. Salina estélución salina, debe realizarse de adentro hacia ril, por sospecha de hongo fuera en forma concéntrica. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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3.7.1.3 Aislamiento primario - Realizar el inoculo en los medios de cultivo; si es material purulento colocar una gota en un extremo del medio de cultivo; los medios de cultivo a usar son Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar MacConkey, Agar Manitol Sal - Flamear y enfriar un asa en argolla y proceder a estriar. A modo de obtener aislamiento de colonias. - Incubar el Agar sangre y Agar Chocolate en jara con candela a 37°C y el Agar MacConkey y Manitol sal en aerobiosis a 37°C por 24 horas - Observar crecimiento identicando bacterias patógenas. Realizar antibiograma - Realizar la jación del frote gram con el mechero y proceder a teñirlo con la coloración Gram o ZN. - Si a las 24 horas no hay crecimiento incubar por 24 horas más.

3.7.1.4 Identicación de principales microorganismos 3.7.1.4.1 Esquema de identicación de Cocos Gram positivo Tabla No. 7 Identicación de Staphylococcus aureus y coagulasa ne gativa


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Tabla No. 8 Identicación de Cocos Gram Positivo, catalasa negativo y alfa hemolisis

Tabla No. 9 Identicación de Cocos Gram Positivo, catalasa negativo y beta hemolíticos

Tabla No. 10 Identicación de Cocos Gram positivo, catalasa negativa y gamma hemolisis


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3.7.1.4.3 Identicación de Gram Nega3.7.1.4.2 Identicación de Gram negativo no Fermentador Pseudomonas aetivo Fermentadores Escherichia coli, roginosa Klebsiella pneumoniae y Enterobacter Pseudomonas aeroginosa es fácil de reconocer cloacae en medios de aislamiento primario por la morfoEn agar MacConkey visualizar la morfología de logía de la colonia que son generalmente plana, las colonias, (Tabla No. 11 Fig. 19) algo extendidas, bordes aserrados y tienen un Escherichia coli: lactosa positiva, colonias de brillo metálico, por la producción de pigmentos borde entero, color fucsia opacas de 2-3mm de difusibles si está presente porque algunas cepas diámetro. Usualmente se observa una zona opa- no lo producen y son bastante mucoides y son ca alrededor de la colonia. aislados de pacientes con brosis quística y el Klebsiella pneumoniae: colonias de borde ente- olor característico.(Tabla No. 12, gura No. 20) ro color rosado a rosado oscuro de 3-4 mm de Tabla No. 12 diámetro y aspecto mucoide. Enterobacter spp: colonias de borde entero, color rosada 2-4 mm de diámetro, no tan mucoide como Klebsiella pneumoniae.


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3.7.2 Secreción Vaginal 3.7.2.1 Propósito La mucosa genital es una región vulnerable a la infección producida tanto por microorganismos constitutivos de la microbiota habitual como por los adquiridos de forma exógena a través del contacto sexual, están normalmente colonizadas por diferentes microorganismos que incluyen estalococos coagulasa negativo, corine bacterias, estreptococos, bacterias anaerobias y con menor frecuencia levaduras. En edad reproductiva destaca la presencia de Lactobacillus acidophilus, ejerciendo un control biológico y un mecanismo de defensa para el epitelio vaginal. Las infecciones del tracto genital femenino pueden ser de origen endógeno, causadas principalmente por Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae o Candida sp.

Mujeres adultas - Colocar a la paciente en una camilla en posición ginecológica, introducir el especulo hasta visualizar el cuello - Introducir el hisopo tomar una muestra e introducirlo en un medio de transporte Stuart o Amies o Amies con carbón - Proceder a tomar dos muestras con hisopo, uno para hacer el extendido para la tinción y otro colocarlo en solución salina estéril para observación en fresco - Las muestras en medio de transporte deben ser enviada inmediatamente al laboratorio, si no es posible mantenerlo a temperatura ambiente y no exceder de 18 horas. En mujeres embarazadas, en busca de Streptococcus agalactiae (beta-hemolitico del grupo B) se recomienda la toma de muestra introduciendo el hisopo por el canal vaginal sin colocar especulo.

3.7.2.2 Recolección de la muestra y transporte Condiciones previas a la obtención de la muestra, no estar en tratamiento de antibiótico, no realizarse ducha vaginales ni relaciones sexuales 24 horas antes de la toma de muestra. Y no bañarse el día de la recolección de la misma. Tabla No. 13

En Niñas En niñas NO utilizar especulo. - Colocar a la niñas en posición ginecológica - Realizar una previa limpieza para evitar contaminación con ora colonizante - Utilizar hisopos nos estériles (Dacron) humedecido con solución salina y proceder a tomar la muestra desde los labios menores, introducirlo en medio de transporte Stuart o Amies o Amies con carbón - Utilizar otro hisopo para el extendido Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Tabla No. 14 3.7.2.3 Aislamiento Primario - Proceder a realizar el inoculo en medios de cultivo como Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar MacConkey, Thayer Martin, Manitol Sal, rotando el hisopo sobre la supercie. - Con asa en argolla ameada y fría proceder a dispersar la muestra en cuatro cuadrantes a modo de tener colonias aisladas. - Incubar las placas de Agar Sangre, Chocolate y Thayer Martin a 3536°C en medio de CO2 por 24 horas Diagrama de identicación de N. gono- Las placas de MacConkey y Manitol Sal incubar- rrhoeae la a 35-#6°C en ambiente aerobiosis por 24 horas - Concluida las 24 horas observar crecimiento de colonias sospechosas,

3.7.2.4 Identicación de principales microorganismo Examen en Fresco: Informar la presencia de células descamativas, leucocitos y bacterias, presencia o ausencia de levaduras y de trofozooitos de Trichomonas vaginalis. Gram: Identicar células clave, que son células descamativas recubiertas por cocobacilos gram variable, Lactobacilos, presencia de polimorfonucleares, levaduras. Giemsa: Observar cuerpos de inclusión sugestivas de C. trachomatis. La técnica citológica tiene baja sensibilidad, pudiendo conrmar por medio de técnicas inmunológicas o ampliación de ácidos nucleídos.

3.7.2.4.2 Identicación de Gardnerella vaginalis Es un bacilo inmóvil no encapsulado de 0.5 por 1.5 a 3 mm, anaerobio facultativo, catalasa y oxidasa negativo. El diagnostico se basa en la presencia de al menos tres de cuatro criterios clínicos por Amsel:1) Descarga na, blanca ad herente y homogénea, 2) pH superior a 4.5, 3) 3.7.2.4.1 Identicación presuntiva de Prueba de Amina Positiva y 4) Células indicadoN. gonorrhoeae ras o célula clave Tabla No. 15 y Fig. 23 Diplococos gram negativo en pareja, tétradas o Prueba de Aminas: olor característico a pescado racimo en la tinción de gram, las colonias de color al añadir 1 gota de KOH a una gota de la secrerosada a café o grisáceas y brillantes de 0.5-1.0 ción. de diámetro en medios agar Thayer Martin, oxidasa positiva. Pruebas suplementarias típicas de N. gonorrhoeae son (Tabla No. 14 gura No. 22)


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Tabla No. 15

3.7.2.4.4 Identicación de Candida albicans Se caracteriza por presentar colonias cremosas de color blanco-amarillento, lustroso poco elevado y de bordes bien denidos Figura No. 25 Tubos germinales - Suspender un inóculo de la cepa pura de candida de 24 horas de desarrollo en plasma humano fresco (plasma EDTA) - Incubar por 2 horas aproximadamente a 3536°C - Luego colocar dos gotas en un portaobjeto, cubrir con cubreobjeto, observar al microscopio con objetivo 40X - Interpretación: 3.7.2.4.3 Identicación de StreptoPositivo: visualiza una estructura elongada que coccus agalactiae se origina a partir de la levadura. Streptococcus agalactiae o Estreptococo grupo Negativo: se ven las levaduras redondas sin B de Lanceneld, es aerobio facultativo, gram elongación. positivo, diplococo que se agrupan en cadena, en agar sangre carnero al 5% crecen las colonias de color gris a blanquecino, brillantes y un poco más brillantes, produce beta hemolisis Tabla No. 16 y g. 24. Tabla No. 16


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3.8 Esputo de cultivo bacteriano 3.8.1 Propósito El esputo es un material mucoso que se segrega en los pulmones o bronquios. El cultivo de esputo está indicado para investigar infecciones respiratorias inferiores que pueden causar neumonía, bronquitis o tuberculosis. La neumonía bacteriana o infección pulmonar puede ser causada por: a. Neumonía Neumocóccica: el agente causal es el Streptococcus pneumoniae. b. Neumonía No Neumocóccica: el agente causal son Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus inuenzae, y ocasionalmente por otras enterobacterias. La muestra de esputo es muy importante para poder realizar una buena identicación por tal razón la muestra debe ser tomada adecuadamente y rechazar las muestras que estén contaminadas con saliva.

3.8.2 Recolección de la muestra y transporte Condiciones previas antes de la toma de muestra que el paciente no debe estar con terapia antibiótica, de preferencia la primera muestra de la mañana y no realizar gargarismos con antisépticos. Procedimiento - Indicar al paciente que se realice un lavado bucal con agua, no cepillar los dientes con pasta dental - Que el paciente se acuesta en la cama boca abajo, que desgarre con fuerza el esputo - Depositar la muestra en un frasco estéril de boca ancha - Enviar lo más pronto posible al laboratorio

Chocolate, Agar Manitol Sal y Agar MacConkey - Con un asa en argolla amea y fría proceder a realizar los estriados a modo de obtener colonias aisladas - Incubar el Agar Sangre y Chocolate en medio de CO2 y los medios de Manitol Sal y MacConkey en ambiente aerobios a 35-36°C - Realizar frote para tinción de Gram y Ziehl Neelsen - Proceder a vericar colonias sospechosas de patogenicidad y realizar pruebas primarias y conrmatorias, y el antibiograma Valoración de la muestras es adecuada tomando en cuenta el criterio de Murria con un frote teñido de Gram.

3.8.3.1 Realización del frote del Esputo - Colocarlo una porción de la muestra sobre un portaobjeto y con otro portaobjeto colocarlo encimas y realizar leve presión luego deslizar los portaobjetos en direcciones contrarias, a modo de obtener frotes delgados - Dejar secar, y jarlos con calor sobre el mechero pasando el portaobjeto tres veces - Realizar la tinciones solicitadas, tinción de gram y/o tinción de ziehl neelsen (ver Sec. 2.4) 3.8.3.2 Criterio de Murria Para evaluar que la muestra este correctamente tomada se debe realizar un frote gram observarlo al microscopio con objetivo seco débil (100x) evaluando las siguientes condiciones según el criterio de Murray y Washington donde son aceptables las muestras del grupo 4 y 5 Tabla No. 17: Tabla No. 17

3.8.3 Aislamiento primario - Proceder a inocular los medios de cultivo teniendo en cuenta todas las medidas de bioseguridad - Con un palillo estéril o asa ameada y fría seleccionar porciones del esputo que contenga sangre o pus - Inocular en Agar Sangre Carnero al 5%, Agar Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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3.8.4 Identicación de Principales MiMi croorganismo 3.8.4.1 Identicación de StreptococStreptococ cus pneumoniae Streptococcus pneumoniae es el agente común de las enfermedades respiratorias bajas y altas, tales como neumonía y otitis media aguda, y meningitis.

3.8.4.2 Identicación de Haemophilus inuenzae Es el agente etiológico más frecuente de enfermedades como neumonía, meningitis, otitis media y conjuntivitis. Son bacilos gram negativo, pequeños o cocobacilos, anaerobios facultativos, requieren factores de crecimiento X y V (X = hematin, V = nicotinamide adenine dinucleotide(NAD)), crecen en agar chocolate pero no en agar sangre de carnero y tienen un olor picante a indol, catalasa positivo, oxidasa positiva Figura No. 26


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una gota de plasma humano o de conejo sobre un portaobjeto 4 Anexos - Mezclar suavemente con el asa y después por 4.1 Prueba de Catalasa rotación Útil para comprobar la presencia del enzima ca- - Observar si hay aglutinación microscópica intalasa que se encuentra en la mayoría de las dicando positiva la prueba bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contiene citocromo, excepto Streptococcus Positivo hay aglutinación dentro 5 a 20 segunsp. dos Material Negativo no hay aglutinación dentro de 3-4 mi- Portaobjeto nutos - H2O2 al 30% En tubo Procedimiento - Tubo de vidrio estéril colocar 0.5 ml de una - En un portaobjeto colocar una gota de H2O2 dilución 1:4 de plasma humano o de conejo al 30% - Tomar una asada de bacterias, rotar suave- Tomar con una asa una colonia pura de 18-24 mente el tubo sin sacudir horas y extender la colonia sobre el agua oxi- - Incubar por 4-6 horas observar a cada 30 migenada suave nutos a 35°C Positivo: formación de burbujas - No sacudir el tubo t ubo en cada chequeo, inclinar el Negativo: no se observan burbujas tubo suavemente para ir observando el coagulo. - Descartar el portaobjeto en recipiente con Positivo: formación de un coágulo desinfectante Negativo: el plasma permanece líquido y no se formó el coágulo.

4.2 Prueba de Coagulasa Prueba usada especícamente para diferenciar las especies del género Estalococos.

4.3 Prueba de Manitol Sal Procedimiento - Sembrar la bacteria a estudio en un medio manitol sal -Incubar a 36°C durante 18-24 horas Positivo: Presencia de crecimiento y cambio de La coagulasa es una enzima producida por S. color amarillo del medio indica utilización del aureus, estable al calor, resistente a temperatu- manitol (S. aureus) ras arriba de 60°C por 30 minutos. Negativo: No hay cambio de color en el medio, Material permanece rosado o rojizo. (S. epidermidis ) - Plasma EDTA - Portaobjeto o tubo Procedimiento En portaobjetos - Preparar una suspensión gruesa y bien homogénea de cada microorganismo en una solución salina estéril. - Colocar una suspensión de la bacteria con Revista No. 1 Enero Enero - Marzo Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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4.4 Prueba de DNasa El Staphylococcus aureus, produce una DNAasa termoestable que hidroliza DNA. La producción de DNAsa puede determinarse incorporando ácido desoxirrubonucleico desoxirru bonucleico (DNA) en agar nutritivo Material - Agar nutritivo o agar DNAsa con azul de toluidina 0.1 gr/l - HCL 1% Procedimiento - Inocular la bacteria a estudio en mancha densa sobre el agar nutritivo - Incubar de 18 a 24 horas - Revelar con HCL 1% que precipita el DNA nativo del medio si se usa solo el agar Nutritivo Interpretación: Colonias rodeadas por una zona clara donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado es una prueba positiva. - Si se utiliza Agar DNasa, realizar una siembra espesa formando un pequeño círculo de aprox. 1 cm - Incubar a 36°C de 18-24 horas ambiente aeróbico Positivo: producción de un halo rosado alrededor de la colonia que produce DNAsa. Negativo: no hay cambio de coloración en el medio. Alrededor de la colonia permanece azul.

4.5 Prueba de Novobiocina Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la novobiocina. Procedimiento - Realizar una suspensión de la bacteria a estudio en caldo de tripticasa soya al 0.5 de MacFarland - Inocular en agar Mueller Hinton con la metodología de Kirby Bauer - Colocar el disco de novobiocina 5ug - Incubar a 37 °C por 24 horas - Un diámetro mayor o igual a 16mm de inhibición considerado como susceptible. Sensible: S. epidermides Resistente: S. saprophyticus


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4.6 Prueba de Bacitracina A Esta prueba útil para el diagnóstico presuntivo de Streptococcus beta hemolítico del grupo A de Lanceeld. Material - Agar Sangre Carnero al 5% - Disco de Bacitracina de 0.04 U

contenga PYR L-pirrolidonil-b-naftilamida - Incubar por 4 horas a 35°C - Luego agregar un colorante diazo (NN-dime ( NN-dime-til-amino-cinamaldehído) Positivo: un desarrollo de color rojo r ojo positivo (Estreptococos del grupo A y Enterococos) Negativo: no hay cambio de color o se observa un color naranja Nota: algunos estalococos pueden dar positiva la prueba.

Procedimiento - De una aislamiento puro de la colonia beta hemolítica, suspender en 1 ml de caldo tripticasa alcanzar una turbidez similar al 0.5 MacFarland - Con un hisopo realizar el inoculo en un agar sangre carnero al 5%, - Proceder a estriar en forma de tapete - Con una pinza ameada y fría colocar un ss co de Bacitracina 0.04 U (Taxo A) en el centro - Incubar por 16-24 horas en jarra con candela - Examinar y observar un halo de inhibición alrededor del disco de Taxo A. 4.8 Prueba de CAMP Prueba para identicación presuntiva de EsEs treptococos del grupo B (Streptococcus agalacagalac tiae beta hemolitico), es el único que produce una prueba de CAMP positiva. La prueba detecta una proteína extracelular estable al calor difusible producida por Estreptococos del grupo B que mejora la hemólisis de eritrocitos por el Staphylococcus aureus. Material - Cepa ATCC S. aureus ATCC 25923 - Agar Sangre de Carnero 5%

4.7 Prueba de PRY (pirrolidonilarilamidasa) Es una prueba presuntiva tanto Estreptococos del grupo A como del grupo D. Reemplaza la prueba de Bacitracina y la prueba de tolerancia a la sal para Estreptococos del grupo A y especies de Enterococo respectivamente. La enzima detectada es la pirrolidonil arilamidasa Procedimiento - Inocular la bacteria a estudio en caldo de que

Procedimiento - La cepa de S. aureus ATCC 25923 rayar una línea recta a través del centro de la placa de Agar Sangre Carnero. - Perpendicular a la raya del S. aureus realizar el inoculo de la bacteria a estudio realizando una línea recta de 2-3 cms de longitud, pero sin tocar. - Incubar la placa a 37°C durante 18 – 24 horas, en ambiente aeróbico. Positivo: aparece como hemólisis “punta de echa” entre la unión del crecimiento del S. aureus y Estreptococos del grupo B. Negativo: no se observa la formación de echa de hemólisis.

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Procedimiento - Una colonia aislada, sembrar en estría en la zona del pico de auta. - Incubar a 35-36°C durante 24-48 horas Interpretación La aparición de un color castaño oscuro o negro en el medio indica hidrólisis de la esculina. Si no hay cambio se considera negativa la prueba

4.9 Prueba de Hidrólisis de Hipurato Detectar la capacidad de la bacteria de hidrolizar el hipurato mediante la enzima hipuricasa. La hidrólisis de hipurato dará como resultado glicina, que reaccionara con la ninhidrina provocando un cambio de color. Material - Tubos con 0.4 ml de hipurato de sodio al 1% Procedimiento - Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipurato de sódio con el microorganismo - Incubar por dos horas 36-37°C - Agregar 0.2 de ninhidrina, si agitar Positivo: Color morado fuerte ( S. agalactiae) Negativo: no hay cambio de color (S. faecalis)

4.11 Crecimiento de NaCl 6.5% Diferenciación de Streptococcus del grupo D con respecto a Enterococos. Procedimiento - Inocular 2 ó 3 colonias del microorganismo en el medio de caldo tripticasa soya + 6.5% de NaCl - Incubar a 35°C por 24-48 horas - Observar el caldo de cultivo Positivo: turbidez (enterococos) Negativo: limpio no se observa crecimiento

4.10 Bilis Esculina Propiedad de algunos microorganismos de hidrolizar el glucósido esculina en esculetina y glucosa, la esculetina producida reacciona con un sal de hierro incorporada al medio, dando un color castaño oscuro o negro. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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4.12 Prueba de Sensibilidad a Optoquina La prueba se utiliza un disco de 6mm con 5ug de optoquina, tiene como objetivo diferenciar Streptococcus pneumoniae de las de Estreptococo viridans. Procedimiento - Inocular una colonia alfa-hemolítica con un asa estéril en una placa de Agar Sangre Carnero al 5%, extender la bacteria. - Colocar asépticamente un disco de optoquina o disco P sobre el estriado. - Incubar en ambiente de CO2 por 18-24 horas a 36°C. - Interpretar los resultados Sensible: presencia de un halo mayor a 14mm (S. pneumoniae), si se usa disco de 10 mm el halo será mayor o igual a 16mm Resistente: No hay presencia de halo de inhibición son estreptococos viridans

- Agregar 0.5 ml de solución salina al otro tubo Control - Agitar suavemente ambos tubos e incubarlos a 35°C por 3 horas Positivo: Desaparece la turbidez del tubo prueba (S. pneumoniae) Negativo: permanece turbio. En Agar - Colonias aisladas en un agar sangre de carnero, agregar una gota de deoxicolato de sodio al 2% (diluir el reactivo al 10% 1:10 con agua destilada) - Sin invertir la caja incubar a 35°C por 30 minutos Positivo: las colonias desaparecen dejando una zona de hemólisis parcial en el área donde se encontraban. (S. pneumoniae) Negativo: Las colonias son insolubles y permanecen intactas. (Estreptococos del grupo viri dans)

4.13 Solubilidad en Bilis 4.14 Prueba de Satelitismo La prueba de solubilidad en bilis es otra prueba Se conoce como satelitismo al fenomeno de para identicación de S. pneumoniae. H. inuenzae de crecer en colonias diminutas cercanas a una bacteria productora de factor V Procedimiento cuando se cultiva en agar sangre de carenro. En tubo Esto ocurre generalmente con Staphylococcus - Transferir 0.5 ml de un cultivo de 18-24 horas beta hemolítico porque produce altas cantidades de un caldo TOdd Hewitt a dos tubos limpios. de factor V (NAD). - Agregar una gota de rojo de fenol a cada uno de los tubos Procedimiento - Ajustar el pH a 7 con NaOH 0.1N -En un agar Sangre de Carnero al 5% estriar en - Agregar 0.5ml de doxicolato de sodio al 10% a toda la supercie en una sola dirección de Hae uno de los dos tubos (Prueba) mophilus. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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- Tomar una asada de un cultivo de Staphylo-

coccus aureus o beta hemolítico, realizando una estria perpendicular al sembrado. - Incubar en jarro con canderla o en CO” por 24 horas a 36°C, - Luego examinar el crecimiento de pequeñas colonias puntiformes muy cerca de la estria de estalococo.

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35. Tinción de Ziehl-Neelsen. 2011. Disponible en: http:// estudiemedicina.blogspot.com/2011/06/ziehl-neelsen. html 36. Tinciones Acido Resitentes. Disponible en: http:// www.slideshare.net/davidguevapaza/tm-tinciones 37. Tinciones. Disponible en: http://es.scribd.com/ doc/109235847/Tinciones#scribd 38. Tos ferina. Wikipedia Enciclopledia Libre. Disponible en: https://es.wikipedia.org/wiki/Tos_ferina 39. Vargas,C. Aislamiento, Identicación y Cuanticación de Vibrio Cholerae en Agua Potable, Aguas Superciales y Residuales. Disponible en: http://www.bvsde.paho.org/ eswww/fulltext/repind41/Aisla/Aisla.html 40. Velasco J., et al. Manual práctico de Bacteriología Clínica. Publicaciones Vicerrectorado académico. 2015. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/274322371/Manual-de-Bacteriologia#scribd 41. Vilchez, H.A. Manual de Prácticas de Microbiología Aplicada. Universidad Inca. Lima Perú 2010. Disponible en: http://es.slideshare.net/Prymer/gua-micro-aplicada?next_slideshow=1


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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TAMIZAJE, AISLAMIENTO, IDENTIFICACION Y SENSIBILIDAD DE MICOBACTERIAS Rosa Alvarez, Diana Baldizon Margarita Boloix, Hèctor Catú Lis Jerez, AnaLucia Lemus

1. INTRODUCCION En la última década, la tuberculosis (TB) ha resurgido como una de las mayores causas de muerte ya que anualmente se registran cerca de 3 millones; en 1995 causó más de 75,000 muertes en Latino América y el Caribe, lo cual signica que cerca de 1,100 personas enfermaron y más de 200 murieron por TB cada día. Se estima que existen 8.8 millones de nuevos casos cada año que corresponden a 52,000 muertes por semana o más de 7,000 cada día, lo que se traduce en más de 1,000 nuevos casos cada hora, cada día. Estas tasas de muerte reejan solo parcialmen te la tendencia global de la TB, ya que más del 80% de los pacientes se encuentran en la edad económicamente activa (15 – 49 años). Se estima que en el año 2000, 2 mil millones de personas se encuentran infectadas con M. tuberculosis y otras especies de Mycobacterium, 3 millones de personas mueren anualmente por complicaciones de tuberculosis en todo el mundo. Se calcula que hay 8 millones de nuevos casos cada año, el 95% de los cuales aparecen en países en vías de desarrollo. En los países industrializados, el 80 % de los casos aparecen en personas mayores de 50 años; en los países en vías de desarrollo el 80% se produce entre los 15 y los 50 años. Se estima que 3 millones de personas que padecen tuberculosis también tienen VIH/SIDA. Existen factores predisponentes en los países en vías de desarrollo como: Inmigración de personas de zonas de alta endemicidad. Condiciones socioeconómicas bajas en ciudades con alta población. Aumento de personas infectadas con VIH/SIDA. Durante las primeras décadas del siglo XX, se dio una disminución progresiva de la incidencia de la tuberculosis, y alcanzó su menor nivel a comienzos de la década de 1980. Muchos microbiólogos pensaron que la tuberculosis estaba por ser vencida, dado que la enfermedad alcanzó la línea basal de cero en muchas partes del mundo a nes de la década de los 70’s. Pero sucedió todo lo contrario. Actualmente las tasas de morbilidad y mortalidad han aumentado, con el aparecimiento de cepas resistentes de Mycobacterium a múltiples drogas y por el VIH/SIDA. Para Guatemala la Organización Mundial de la Salud (OMS) reportó una tasa de incidencia de 80 por cada 100,000 habitantes en el año 2000. La epidemia del Síndrome de Inmunodeciencia adquirida (SIDA) y el descenso de los estándares socioeconómicos, entre otros, contribuyen al resurgimiento de la enfermedad en países industrializados. Aunque en la mayoría de los países en desarrollo, la TB ha sido siempre endémica, su severidad se ha incrementado debido a la pandemia del Virus de Inmunodeciencia Humana (VIH) y a los niveles de pobreza impe rantes. La situación de la TB a nivel mundial se ha agravado con el aparecimiento de cepas multirresistentes a las drogas antituberculosas, que incrementan las tasas de mortalidad y representan un serio problema para el control de esta enfermedad, por ello la realización de una susceptibilidad antibiótica con un perl delimitado de antibióticos es de gran ayuda para poder evitar y/o disminuir la multirresistencia y poder brindar tratamientos efectivos. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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2. GENERALIDADES La TB es una enfermedad infecciosa aguda o crónica que en nuestro medio es la infección humana más importante causada por micobacterias puede afectar a cualquier tejido del organismo pero generalmente se localiza en los pulmones por la inhalación del agente causal que por lo general es Mycobacterium tuberculosis (muy rara vez M. bovis o M. africanum). El nombre de Tb deriva de la for mación de unas estructuras celulares características denominadas tuberculomas, donde los bacilos quedan encerrados. Este microorganismo, tiene forma bacilar, es aerobio estricto, de crecimiento lento, inmóvil, no poseen cápsula ni producen esporas, se tiñe con dicultad por su contenido alto de grasas en la pared celular por lo que el colorante a utilizar debe poseer fenol y/o realizarse con calor por lo que una vez teñidas con fuchsina carbólica (fenolada) no se decoloran al agregar el alcohol acidicado y de allí el término “Bacilos alcohol ácido resistentes” (BAAR). Es resistente al frío, la congelación y desecación. Es muy sensible al calor, la luz solar y ultravioleta. Se divide lentamente, por lo que su crecimiento es lento. La TB se transmite de un enfermo con tuberculosis pulmonar a otras personas por medio de pequeñas gotitas que el paciente expulsa, al toser o estornudar. El riesgo a infectarse depende de la concentración de gotitas en el aire y del período de tiempo que se respire; se reduce mediante la renovación del aire, por ventilación del exterior y por la exposición a la luz solar o rayos ultravioleta. Cada enfermo puede contagiar a 10 a 15 personas.

La TB puede ser tanto pulmonar, que es la más común y ocurre en más del 80% de los casos, como extrapulmonar. Es importante mencionar que aproximadamente un 90% de las personas que se infectan nunca desarrollan la enfermedad ya que el bacilo permanece “dormido” dentro del organismo del huésped y su presencia (infección) puede determinarse por una reacción positiva a la prueba tuberculínica ó PPD (derivado proteico puricado). Además es necesario poder determinar la presencia de la enfermedad para poder minimizar la cantidad de pacientes con cepas resistentes a los medicamentos antituberculosos y poder disminuir con ello la cantidad de enfermos bacilíferos crónicos en las comunidades.

3. PROPÓSITO E IMPORTANCIA La nalidad primordial es demostrar por medio de coloraciones, pruebas de tamizaje, cultivos especiales y pruebas de identicación la presencia de bacterias que pertenecen al género Mycobacterium, especialmente Mycobacterium tuberculosis. Aproximadamente doce especies de éste género se asocian a infección humana, pero en nuestro medio Mycobacterium tuberculosis es la especie de mayor importancia. La detección de micobacterias es una gran responsabilidad para el laboratorio de microbiología, ya que un resultado positivo de frote o cultivo implica serias consecuencias para el paciente y afecta su vida con un tratamiento especíco por varios meses, o incluso años; por lo que un resultado positivo debe informarse de inmediato al médico responsable. Se debe tener todo el cuidado de no confundir las muestras, especialmente cuando hay en grandes cantidades; se recomienda trabajarlas de cinco en cinco. Esto evitara que se den resultados falsos ya que los mismos traerían serias consecuencias para el paciente.

3.1. TUBERCULOSIS PULMONAR Y TUBERCULOSIS EXTRAPULMONAR El diagnóstico de la TB extrapulmonar depende de la probabilidad de encontrar los bacilos en los sitios de infección, los cuales se encuentran en cantidades muy pequeñas, excepto si hay caseicación o formación de cavidades,


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4.1. Nivel I las biopsias del tejido pueden rendir resultados positivos en comparación a los uidos en donde el número de los bacilos se ve disminuido por la dilución. El diagnóstico de la TB extrapulmonar es difícil a menudo por su localización en sitios del organismo de acceso complicado, además el carácter serio de esta forma de tuberculosis se debe frecuentemente a su diagnóstico tardío. Previo a la pandemia del VIH, aproximadamente el 15% de los nuevos casos de TB eran extrapulmonares. Estos casos son de difícil diagnóstico, dado que son menos comunes a los médicos y porque los sitios de infección son menos accesibles y visibles. La TB extrapulmonar más frecuente son la linfática, pleural, genitourinaria, miliar, ósea, meníngea y peritoneal. Los pacientes con TB pulmonar activa son altamente infecciosos para otros pacientes y para el personal de cuidados de salud, como ya se ha mencionado en la parte de introducción del presente trabajo. Este tipo de transmisión transmisión se se asocia a desarrollo rápido de la enfermedad en unas cuatro cuatro semanas, semanas, con mal pronóstico. De igual manera este tipo de transmisión contribuye en los casos de alta resistencia. . El aumento de casos de Tb extrapulmonar, crea la necesidad de un mejor diagnóstico y nuevas técnicas para el aislamiento y susceptibilidad micobacteriana, estableciendo como punto crítico el menor tiempo posible para el aislamiento y la información sobre la drogo resistencia de las micobacterias.

4.NIVELES DE LABORATORIO Los niveles de laboratorio en micobacteriología han sido adoptados por la Sociedad Torácica Americana (American Thoracic Society), Society), la cual ha establecido tres niveles de la siguiente manera:

Realiza lo siguiente: a. Recolección de muestras clínicas adecuadas (incluyendo esputo inducido por aerosol). b. Transporte y envío de muestras a un laboratorio de nivel superior para el aislamiento e identicación. c. Puede preparar y examinar frotes para el diagnóstico presuntivo y/o como monitoreo del progreso de los pacientes diagnosticados que están siendo tratados con medicamentos.

4.2. Nivel II Además de todas las funciones del laboratorio Nivel I, realiza lo siguiente: a. Procesa muestras para su cultivo en medios a base de huevo y medios a base de agar y huevo. b. Identicación de Mycobacterium tuberculosis c. Puede realizar estudios de susceptibilidad antimicrobiana con drogas antituberculosas primarias d. Retiene cultivos de micobacterias para test adicionales o repetición de pruebas (se recoreco miendan 6 meses de retención)

4.3. Nivel III Además de las funciones de los laboratorios I y II, realiza lo siguiente: a) Identicación de todas las especies micobacmicobac terianas de muestras clínicas b) Puede realizar estudios de susceptibilidad antimicrobiana de micobacterias c) Puede dirigir investigaciones y brindar entreentre namiento.

5. TOMA DE MUESTRA Y PROCEDIMIENTOS MIENTO S POR TIPO DE MUESTRA TOMA DE MUESTRA Actualmente se realiza la implementación de técnicas que producen resultados exactos y precisos en menor tiempo. El motivo principal es el mejoramiento de la calidad del servicio que se le presta al paciente y al sistema hospitalario.


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mal que contamina la orina a su paso, de tal manera que la orina por micción contiene un Para lograr esto es necesario que todo el per- pequeño número de bacterias. Debido a que es sonal médico y de enfermería encargado de necesario distinguir los microorganismos conla obtención y extracción de muestras conozca taminantes de los etiológicamente importantes, los procedimientos estandarizados para tales se debe de efectuar un examen cuantitativo de propósitos, a manera de evitar falsos resulta- orina para que los resultados puedan ser signidos. cativos. Para una selección y recogida correctas de material de cultivo es necesario comprender las localizaciones, variedades y papel de la microbiota normal de la región urinaria.

5.1.2. Toma de Muestra La toma de muestra de orina es muy importante, pues la veracidad de los resultados depende casi en un 100% de la forma correcta en la cual se recolectó la muestra.

Es preciso entonces, establecer la responsabilidad e importancia de la TOMA DE MUESTRA, ya que resulta ser la clave en el aislamiento de TABLA No 1. BACTERIAS COMUNES COMU NES EN cualquier microorganismo, depende de esta en VIAS GENITO-URINARIAS un 100% obtener resultados satisfactorios, en menor tiempo, lo que conduce a un tratamiento efectivo del paciente. Para obtener un buen resultado en el aislamiento de microorganismos, en especial de micobacterias, es preciso comenzar con una buena toma de muestra, tener una buena estandarización en el preparado de medios de cultivo, con los que se hará el aislamiento correcto para tener una identicación posterior. posterior. La pureza del aislamiento determinará el éxito de la sensibilidad y por consiguiente del tratamiento del paciente.

5.1. MUESTRAS DE ORINA 5.1.1. Propósito e importancia En la actualidad, el examen de micobacterias en la orina se hace cuando hay signos o síntomas de una una tuberculosis tuberculosis renal, insuciencia renal o hipertensión. Debe hacerse siempre en personas, en que se sospecha infección infección general y ya ha sido comprobado que no es de tipo bacteriano, o tengan antecedentes de tuberculosis. Washington JA. Bacteriología Médica. En Lynch MM La orina excretada por el riñón es estéril a me- Diagnóstico Clínico por el laboratorio +/- Irregular + común ++ predominante nos que el riñón este infectado. La orina de la vejiga no contaminada también es estéril. Sin embargo, la uretra contiene una microbiota norRevista No. 1 Enero Enero - Marzo Marzo 2016 Clinica Clinica de Enfermedades Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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inyectar la muestra en un tubo expulsando las burbujas de aire que pueda contener la jeringa, 5.1.2.1. Chorro medio u orina al vuelo y se lleva de inmediato al laboratorio. Este tipo de muestra constituye la única muesHombre: tra de orina aceptable para cultivos anaerobios, • Limpiar el meato urinario con agua y jabón. se indica únicamente en pacientes con bacte• Colectar la orina a la mitad de la micción en riuria anaerobia. Este tipo de infección es rara un recipiente estéril tratando de que la orina no y se sospecha su existencia cuando aparecen toque la boca del frasco. cultivos negativos de especimenes con frotes • Llevar la orina al laboratorio. positivos para tinción de Gram.

Mujer: • Limpiar la vulva con bastante agua y jabón, teniendo cuidado de quitar bien el jabón. • Secar el área. • Separando los labios, colectar la orina a la mimi tad de la micción en un recipiente estéril tratando de no topar la boca del frasco con los labios. • Llevar la orina al laboratorio.

5.1.2.4. Catéter

Niños: • En los niños pequeños para evitar al máximo la contaminación es necesario limpiar la región genital con agua y con jabón y/o con solución salina. • Colocar la bolsa estéril sobre la región. • En el momento de obtener la muestra, retirar cuidadosamente la bolsa, de manera que la orina no se escurra. • Cerrar la bolsa y llevar inmediatamente al lala boratorio.

Como se mencionó mencionó con anterioridad anterioridad la orina es es estéril, pero también puede encontrarse contaminada con alguna bacteria además de encontrarse presente la micobacteria. Por lo que toda muestra de orina debe pasar por un proceso de decontaminación.

NO es aconsejable debido al riesgo de bacteriuria asociada al procedimiento. El riesgo es del 1% en hombres y mujeres ambulatorias, y hasta el 20% en mujeres en trabajo de parto.

5.1.3. Procesamiento de la muestra

5.1.4. Requerimientos e instrucciones especiales de muestra de orina

a. Recolectar 40 ml de orina como mínimo b. No debe ser recolección por fracciones, ni ori5.1.2.2. Sondas permanentes na de 24 horas c. La primera orina de la mañana En caso de tenerse un catéter a permanencia d. Tomarla con todas las medidas asépticas secon un sistema cerrado de colección, obtener ñaladas con anterioridad la muestra: e. Utilizar un frasco estéril, de boca ancha. a. Limpiar el área del catéter o sonda con anti- f. Si se trata de un bebé se tomará en una bolsiséptico. ta pediátrica. b. Utilizando una aguja y jeringa estériles intro- g. El protocolo de evaluación es enviar cinco ducir en el área desinfectada. muestras de forma seriada c. Dejar la muestra dentro de la jeringa. NO 5.1.5. Preparación de la muestra pretrasvasar a un recipiente estéril. d. NO recolectar la muestra de la bolsa o des- vio a la elaboración de frotes conectando el catéter del tubo de recogida. r ecogida. a. Mezclar cuidadosamente la muestra a mane5.1.2.3. Punción o aspirado suprapúbi- ra de obtener una muestra representativa co b. Transferirla Transferirla a un tubo con tapón de rosca. rosca. Utilizar la mayor cantidad posible En este procedimiento se obtiene la muestra. c.Centrifugarla por 15min a 3000rpm Directamente de la vejiga. Se recolecta con aguja y jeringa estériles; se efectúa la punción; Revista No. 1 Enero Enero - Marzo Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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d. Descartar el sobrenadante con cuidado de no perder la mayor cantidad de sedimento e. Tomar con una pipeta de vidrio 1 gota del sedimento y colocarla en un portaobjetos, esperar a que se seque dentro de la campana (repetirlo por 3-5 veces) a manera de obtener un frote que contenga una cantidad representativa f. Esperar a que se seque por lo menos 10 minutos para evitar que se lave al teñir

tivo para la recuperación de micobacterias de muestras sanguíneas y MO. El medio incluye un agente lítico (saponina), SPS y otros suplementos que eliminan el paso de procesamiento, evitan la coagulación de la sangre y mejoran el crecimiento de las micobacterias. Se puede inocular directamente un volumen de 3 a 5 ml de sangre, y se incuban entre 35°C – 36°C. Las botellas contienen 29 ml de medio y un sensor interno que detecta dióxido de carbono como indicador de crecimiento microbiano. El sistema registra lecturas cada 10 minutos.

5.2. MUESTRAS DE SANGRE Y MÉDULA ÓSEA REACTIVOS En condiciones normales la sangre y la médula ósea (MO) son estériles. Debido a que la piel normal está cubierta de abundante microbiota normal es muy importante tomar la muestra en condiciones totalmente asépticas.

NOTA IMPORTANTE: Todos los especímenes deben de considerarse potencialmente infecciosos, por lo que deben de tenerse en cuenta las medidas universales para su manipulación y desecho adecuado. Observaciones importantes La recuperación de micobacterias en un hemocultivo depende de los siguientes factores: • Obtención de la muestra de sangre en condi ciones asépticas. • Cantidad de sangre cultivada y momento de la toma de muestra. • La relación entre la sangre y el caldo de cul tivo, la cual debe ser 1:10, es decir sangre al 10%. • Se debe de tomar el hemocultivo antes de iniciar un tratamiento con antibióticos

5.2.1. Medio de cultivo para aislamiento de micobacterias de muestras de sangre y Médula Ósea

a. Botellas de tapón negro BacT/Alert MB: frascos estériles y desechables, contienen 29 ml de medio y un sensor interno que detecta dióxido de carbono como indicador del crecimiento bacteriano. NO AIREAR LAS BOTELLAS. El medio contiene: • Caldo Middlebrook 7H9 (0.47% p/v) • Síntesis pancreática de caseína (0.1% p/v) • Glicerol (1.0% p/v) • SPS (0.025% p/v) • Agua puricada b. Líquido de enriquecimiento MB7BacT: El contenido total del frasco es de 5.5 ml. Se compone de: • Albúmina sérica bovina (14.5% p/v) • Cloruro Sódico (2.5% p/v) • Ácido oleico (0.174 % p/v) • Saponina (4.4% p/v) • Agua puricada c. Suplemento de antibióticos: Requiere de dos componentes los cuales se complementan:

Botellas de tapón negro para aislamiento de micobacterias tanto de sangre como de MO. Las botellas BacT/ALERT MB en combinación con el Líquido de enriquecimiento y el suplemento de antibióticos son un medio de cultivo selecRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Manejo del suplemento antibiótico ya reconstituido: • Reconstituir con 10 ml del líquido reconstituyente. • Guardar en refrigeración una vez reconstituido de 2-8ªC • Es estable 7 días después de reconstituido. • Un vial de 10 ml de antibiótico reconstituido alcanza para 20 botellas. Conservación del medio de cultivo Botellas para obtención de la muestra. Conservar los frascos en un lugar seco, fresco, en oscuridad y a temperatura ambiente. NO REFRIGERAR. Una exposición prolongada a la luz directa podría alterar el indicador uorescente. Por ningún motivo deben de airearse las botellas.

5.2.2. Toma de muestra de sangre y Médula Ósea Procedimiento para toma de muestra de sangre por venopunción. a. Tomar la botella para micobacterias. Revisar y examinar los frascos con el n de eliminar cualquier frasco que presente signos de contaminación o defectos. Identicar con los datos del paciente. b. Tomar la botella, Retirar la cápsula o tapón de protección que se encuentra en el tapón del frasco. NO DESCARTARLA, y con algodón empapado en solución yodada al 3% en alcohol (tintura) limpiar perfectamente bien el tapón perforable. Dejar secar mientras se atiende al paciente. c. Extraer las muestras de manera aséptica con el n de reducir los riesgos de contaminación. Utilizar en general una jeringa o un dispositivo de toma de muestra con cánula d. Colocar la ligadura en el brazo del paciente; palpar la vena y localizar exactamente el sitio de la punción. e. Limpiar el sitio exacto donde se localizó la vena con un algodón empapado de tintura de yodo al 3%. con movimientos en círculo, haciendo una espiral que inicia en el sitio de punción y termina en la parte de afuera. NO vuelva a palpar la vena. Dejar secar. f. Con aguja y jeringa estériles, puncionar la

vena y obtener asépticamente 3ml-5ml de sangre. g. Inyectar la sangre en la botella que contiene el caldo. Se debe de inyectar la sangre suavemente sin hacer presión en el émbolo, de manera que se evite la hemólisis que puede interferir en el momento de la interpretación de la positividad del cultivo. h. Después de obtenida la muestra, llevar los frascos al laboratorio lo más rápidamente posible. Antes de transcurridos 30 minutos. En el transcurso de este tiempo se le debe agregar tanto el suplemento antibiótico como el líquido de enriquecimiento, una vez transcurrido este tiempo, no tendrá ningún valor para la muestra el agregar ambos constituyentes. i. NO REFRIGERAR por ninguna razón. j. Colocar la identicación correspondiente en el frasco utilizando ÚNICAMENTE la zona destinada para ello. NO COLOCAR MASKING TAPE, MICROPORE, o cualquier otro tipo de tape alrededor del frasco. Procedimiento para toma de muestra de Médula Ósea. a. Las muestras de médula ósea para cultivo de micobacterias siempre deben ser obtenidas por el médico, quien puncionará el esternón o la cresta ilíaca. Procesar exactamente igual que para muestra de sangre. b. Tomar la muestra tomando todas las medidas asépticas necesarias c. De la PRIMERA FRACCIÓN obtenida inocular las cajas de petrí que contienen agar Sabouraud, Micosel y Micosel con sangre ya que ésta es la porción más rica en lo que a celularidad se reere. d. De la SEGUNDA FRACCIÓN inocular un volumen de 3 a 5 ml en las botellas para cultivo BacT/ALERT MB que en combinación con el Fluido de enriquecimiento y el suplemento de antibióticos son un medio de cultivo selectivo para la recuperación de micobacterias de muestras sanguíneas y otros líquidos e. Si va a llevarse en jeringa debe ser la mayor cantidad posible con un anticoagulante como SPS ó heparina en relación 1:1 (No utilizar EDTA) f.Transportarlas a temperatura ambiente al laboratorio durante la primera hora luego de la toma de muestra (NO REFRIGERARLAS)


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5.2.3. Precauciones para el uso de los frascos a. Los frascos de cultivo de micobacterias son para uso in vitro. b. Antes de utilizarlos los frascos deben ser observados. NO utilizar frascos que presenten signos de contaminación, Ej.: color amarillo o turbidez. No utilizar frascos que presenten algún daño. c. No pegar nada sobre la ventana de lectura, y tampoco sobre el código de barras. Utilizar UNICAMENTE la zona de identicación. d. No descartar la cápsula o tapón de protección. Colocarla en el frasco nuevamente después de haber inoculado éste. e. Antes de inocular la botella desinfectar el tapón con alcohol o solución yodada. f. Inyectar asépticamente con la aguja montada en la jeringa, el volumen necesario de sangre, teniendo cuidado de NO PRODUCIR HEMÓLISIS ya que esta interere en la lectura de los frascos. g. Los frascos inoculados deben de ser transportados al laboratorio en el menor tiempo posible. h. NO ABRIR EL FRASCO POR NINGÚN MOTIVO.

5.2.4. Tratamiento de la muestra en el laboratorio Una vez que la botella ha sido ingresada correctamente al laboratorio proseguir de la siguiente manera: a. Chequear que los datos del paciente estén completos, tanto en la papeleta de ingreso como en la botella. b. Identicar las pruebas que se le realizarán a la botella y si es el medio adecuado para ello. Botellas de tapón negro para cultivo y aislamiento de micobacterias. c. Retirar la tapa de protección y limpiar con alcohol el tapón perforable. d. Agregar 1.0 ml de líquido de enriquecimiento con una jeringa estéril en forma aséptica. e. Posterior al líquido de enriquecimiento, agregar 0.5 ml de Suplemento de antibiótico (esta solución debe de sacarse de la refrigeradora y

alcanzar la temperatura ambiente) con una jeringa estéril en forma aséptica. f.NO DEBEN DE TRANSCURRIR MAS DE 30 MINUTOS PARA AGREGAR EL LIQUIDO DE ENRIQUECIMIENTO Y EL SUPLEMENTO ANTIBIÓTICO, DESDE EL MOMENTO EN QUE FUE TOMADA LA MUESTRA. Un mayor tiempo puede alterar los resultados. g. Luego de haber tratado las botellas (líquido de enriquecimiento y suplemento antibiótico) introducir la botella en el equipo BacTAlert 3D y registrarlo, asignándole una posición. h. Registrar la posición y completar la hoja de registro con los datos correspondientes. i. Llenar la hoja de trabajo adjuntando la papeleta y colocarla en su cartapacio respectivo. j. Leer diariamente la botella durante 42 días. k. Si el equipo da alarma de positivo, sacarlo y colocar en la hoja de registro la fecha y la hora a la cual dio positivo. Hacer frote de Ziehl Neelsen y reportarlo. l. Si el cultivo es negativo, luego de 42 días de incubación, hacer un frote de ZN al caldo de la botella, si es negativo, reportarlo negativo. Anotar en la hoja de registro la fecha y la hora.

5.2.5. Preparación de la muestra previo a la elaboración de frotes SANGRE Y MÉDULA ÓSEA a. Transferir a un tubo estéril con tapón de rosca b. Centrifugar la mayor cantidad de la muestra posible por 15min a 3000rpm c. Descartar el sobrenadante con mucho cuidado porque la mayor de la parte como su nombre lo indica es líquida d. Del sedimento tomar de 2-3 gotas para realizar el frote e. Si es Líquido Cefalorraquídeo: tomar con una pipeta de vidrio 1 gota del sedimento y colocarla en un portaobjetos, esperar a que se seque (repetirlo por 3-5 veces) f.Hacer la tinción 5.3. MUESTRAS DE LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO, LAVADOS Y OTROS LÍQUIDOS CORPORALES 5.3.1. Propósito e importancia


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El diagnóstico rápido, temprano y preciso de meningitis tiene un lugar predominante entre las urgencias médicas. Depende en alto porcentaje de mantener un elevado índice de sospecha, de obtener en forma adecuada las muestras y examinarlas a la mayor brevedad. Debido al elevado riesgo de muerte y/o daño tisular irreversible, a menos que se inicie un tratamiento inmediato, rara vez hay una segunda oportunidad de obtener una segunda muestra pretratamiento, lo que hace esencial la primera muestra para el diagnóstico etiológico especíco y óptima atención al paciente. El dato diagnóstico más urgente es la diferenciación entre la meningitis bacteriana purulenta y la meningitis granulomatosa y la meningitis viral. Las muestras que se incluyen dentro de Líquidos corporales son: • Líquido cefalorraquídeo (LCR) • Líquido ventricular • Líquido abdominal (peritoneal, de paracentesis, diálisis biliar) • Líquido pleural, toracentesis y empiema (obtenidos de tórax) • Líquido pericárdico • Líquido sinovial

5.3.2. Toma de muestra para Líquido Cefalorraquídeo La punción lumbar se lleva a cabo con técnica aséptica estricta, teniendo cuidado de no provocar compresión del bulbo por extracción rápida del líquido cuando la presión intracraneana esta notablemente elevada.

El LCR usualmente se colecta en 3 o 4 partes, de 2 a 5ml cada una, en tubos o recipientes estériles. Esto permite el examen más conveniente y de más conanza para los distintos valores que determinan la conducta a seguir por el médico. El análisis básico efectuado al LCR y al Líquido pleural y otros líquidos corporales: • Cultivo de rutina • Cultivo para tuberculosis y hongos. • Análisis químico (proteínas y glucosa) • Análisis físico y citológico (aspecto del líquido, recuento de células, fórmula diferencial). • Pruebas de látex para detección de antígeno de Cryptococcus neoformans.

5.3.3. Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra Líquidos corporales • 5-10 ml como mínimo (enviar el máximo de volumen posible) • Obtenido en condiciones asépticas • En recipiente estéril • Enviar la muestra fraccionada para otros exámenes microbiológicos Lavados • 5-10 ml como mínimo • Recipiente estéril y desechable • En ayunas (para asegurar coleccionar la muestra que ha sido tragada durante el sueño) • El Broncoscopio debe estar estéril (evitar contaminar con agua de chorro por las micobacterias saprofíticas) 5.4. MUESTRAS DE HECES 5.4.1. Propósito e importancia Demostrar por medio de cultivo, la presencia de micobacterias. Es decir, micobacterias que infectan el intestino. Esto causa diarrea, dolor abdominal, ebre y en ocasiones la muerte. Es importante que en pacientes con VIH/SIDA se realice un diagnóstico diferencial de la siguiente manera, utilizando las siguientes tinciones:


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• Recipiente estéril (frasco o caja de petri de vidrio sellado (a)) • No sumergir las muestras en solución salina, formol o formalina Secreciones • 0.5 ml como mínimo • En recipiente estéril, de preferencia en jeringas (si se va a coleccionar la muestra por medio de una punción es mejor si se cuenta con las de tipo tuberculina) • El área de toma de muestra debe estar bien limpia 5.4.2. Requerimientos e instrucciones • Si son hisopos deben transportarse en Stuart para el procesamiento de la muestra o Amies de heces 5.5.2. Preparación de la muestra para la elaboración de frotes • 1 gr. aproximadamente • En recipiente estéril, desechable y de boca ancha Biopsias de tejido • Llevar inmediatamente al laboratorio • Colocarla en una caja de petri estéril de vidrio preferentemente 5.4.3. Preparación de la muestra de • Agregarle 2 ml de caldo 7H9 Middlebrook, so heces para la elaboración de frotes lución salina o agua destilada estéril • Triturar con bisturí la biopsia en partes peque• Observar las características de la muestra y ñas a manera de formar una mezcla homogénea buscar la parte dónde se encuentre mucoso o • Transferir la solución a un tubo con estrías de sangre • Agitar por 5min aproximadamente en vortex • De esta muestra suspender 1 gramo apro - • Centrifugar la solución por 15min a 3000rpm ximadamente en 2-5ml de caldo 7H9 Middle- • Descartar el sobrenadante brook, solución salina o agua destilada estéril • Del sedimento tomar de 2-3 gotas para realizar en un tubo estéril el frote • Agitar en vórtex por 5min • Hacer la tinción • Centrifugar por 15min a 3000rpm • Descartar el sobrenadante con cuidado de no Biopsias de Hueso perder la mayor cantidad de sedimento • Colocarla en una caja de petri estéril de vidrio • Del sedimento tomar de 2-3 gotas para reali- preferentemente zar el frote • Agregarle 2 ml de caldo 7H9 Middlebrook, so • Hacer la tinción lución salina o agua destilada estéril • Si no se observan BAAR NO procesar la • Triturar con bisturí a manera de formar partícumuestra para cultivo las lo más pequeñas posibles. • Hacer por lo menos tres improntas frotando 5.5. MUESTRAS DE BIOPSIAS Y SE- una laminilla contra otra a manera de obtener CRECIONES VARIAS un frote en cada uno de los extremos y uno en el centro de la lámina portaobjetos 5.5.1. Requerimientos e instrucciones • Hacer la tinción para el procesamiento de la muestra 5.6. MUESTRAS DE ESPUTO Biopsias La muestra de esputo es de utilidad para investi•1 gr. aproximadamente gar la causa de infecciones respiratorias inferio• Obtenido en condiciones asépticas res (bronquitis, neumonía) y en la investigacion. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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cualquier muestra que no cumpla con el Valor Q establecido.

de tuberculosis. Siempre hay bacterias en una muestra de esputo, por la contaminación del material bronquial con saliva. Una muestra de 5.6.2. Procedimiento para obtención esputo es satisfactoria para estudio si contiene de la muestra. secreciones respiratorias inferiores. Esputo para infección bacteriana Muestras que consisten solo de material hialino o liquido o con abundante saliva son recha- • Obtenerse la primera muestra de la mañana, zadas por inadecuadas y no ser procesadas dado que el la más espesa y no está contami(Ver Valor Q.). En casos muy especiales puede nado con comida. estudiarse una punción transtraqueal. Aspira- • Indicar al paciente que al despertar se enjuados o lavados bronquiales son adecuados en el gue la boca con agua corriente (sin ningún tipo paciente intubado o en respirador, si se trans- de antiséptico o pasta dental). Luego acostado porta el material al laboratorio en una jeringa o en su cama, boca abajo, expectore esputo con contenedor estéril. fuerza, tosiendo, y lo deposite directamente en un recipiente estéril de boca ancha (proporcio La neumonía bacteriana, o infección del pul- nado por el laboratorio), sin mantenerlo en la món causada por bacterias puede ser de dos boca para evitar que se mezcle con saliva. tipos: • Aproximadamente 1 a 3 ml de esputo muco - Neumocóccica: Causada por Streptococcus purulento son sucientes para el gram y el cul pneumoniae tivo de rutina, así también para el cultivo de mi - No neumocóccica: Causada por Klebsiella cobacterias (BK). pneumoniae, Staphylococcus aureus, Strepto- • Llevar la muestra de inmediato al laboratorio. coccus pyogenes, Haemophilus inuenzae y • Realizar el valor Q, para establecer la calidad rara vez por otras bacterias. de la muestra y establecer si es apta para su procesamiento. Los cultivos bacterianos del esputo son un problema importante, suelen ser recolectados sin 5.6.3. Procesamiento de la muestra de cuidado, y a menudo son mas representativos Esputo de saliva que de las secreciones respiratorias Para que una muestra de esputo, sea válida inferiores, además contienen de ordinario gran para su adecuado cultivo, debe de cumplir con cantidad de bacterias propias de la cavidad oral ciertos criterios. Estos criterios determinan la y en pacientes graves hospitalizados contienen Calidad de la muestra, y su representatividad. con frecuencia bacilos gram negativo que han A continuación se encuentra la tabla para Cálcolonizado la orofaringe después de la hospita- culo de valor Q. Este método se basa en la lización. Este tipo de cultivos carece de sensibi- cuanticación de leucocitos polimorfonucleares lidad y especicidad y son, por lo tanto, difíciles y células epiteliales presentes en la muestra, de de interpretar. manera que la relación entre éstos determina el Valor de la calidad del esputo, y por consiguien5.6.1. Toma de muestra. te su aceptación o rechazo para cultivarse. La infección bacteriana de tráquea y bronquios produce abundante esputo. En el caso del diagnóstico de neumonía y tuberculosis es crucial obtener una buena muestra. El cultivo de material no satisfactorio (saliva), causa confusión al médico, ya sea porque no se detectó el verdadero patógeno, o se cultivó un patógeno incidental sin importancia como agente etiológico primario. Por esta razón el laboratorio rechaza Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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TABLA No. 2 DETERMINACIÓN DEL VALOR Q

TABLA No. 3

Resumen de Requerimientos de Muestras


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6. PREPARACIÓN Y OBSERVACIÓN DIRECTA DE UNA MUESTRA Las tinciones utilizadas para observación directa son Ziehl Neelsen, Kinyoun y Auramina-Rodamina, conocidas como tinciones de alcohol-ácido resistencia y juegan un importante papel en el diagnóstico temprano de infecciones por micobacterias. La baciloscopía ha sido adoptada por la mayoría de los países en desarrollo como el procedimiento diagnóstico de elección en los enfermos sintomáticos respiratorios por ser un método sencillo, rápido, conable y económico. Las paredes celulares de las micobacterias debido a su alto contenido de lípidos, le coneren la propiedad de ligarse al colorante de carbolfuchsina y ser decolorados con una solución de alcohol ácido, de ahí su nombre Bacilos Alcohol Ácido Resistente (BAAR). Del mismo modo, los ácidos micólicos de la pared celular de las micobacterias tienen anidad por los uorocromos auramina-rodamina, los cuales emiten uorescencia a cierta longitud de onda en el microscopio de uorescencia, permitiendo observar a las micobacterias fácilmente. Respecto a la especicidad es de 99%, ya que en la mayoría de los casos los BAAR observados en esputo corresponden a Mycobacterium tuberculosis. Pero respecto a su sensibilidad no es óptimo, ya que puede existir variación del 9-46%. Se estima que deben existir de 5,00010,000 bacilos/ml de expectoración para que puedan ser detectados al microscopio. Es por ello que se recomienda que las muestras para tinción sean de forma seriada mínimo tres), y en el caso de orina se recomienda que sean cinco. En la enfermedad extensa donde se eliminan grandes cantidades de micobacterias, existe una buena relación entre frote y cultivo y la sensibilidad es alta. Pero muchos pacientes presentan enfermedad mínima o menos avanzada donde la cantidad de micobacterias es menor y la correlación disminuye llegando a ser de un 25–40%.

La sensibilidad del frote se incrementa de acuerdo al tipo de coloración. Son más sensibles los frotes teñidos con Auramina-Rodamina, tinción uorescente que necesita de un mi croscopio uorescente. Estas técnicas aunque más sensibles resultan ser más costosas y no cualquier laboratorio cuenta con un microscopio de uorescencia. La importancia de conocer la sensibilidad y la especicidad de la baciloscopía en especíme nes de formas pulmonares y extrapulmonares de la tuberculosis, se encuentra en el hecho de que en muchas instituciones de atención médica y servicios de urgencias no cuentan con otros métodos diagnósticos de reconocida sensibilidad y especicidad como el cultivo. Si bien la complejidad del cultivo y su costo resultan ser mayores que la baciloscopía, es mejor alternativa en comparación a otras técnicas sostica das. Por lo tanto, la baciloscopía no puede ser utilizada como única opción en el diagnóstico de la tuberculosis extrapulmonar y se debe utilizar el cultivo en todos los especímenes no pulmonares. En un estudio realizado en el Hospital Universitario de la Universidad León, México, se llegó a establecer que únicamente pudieron detectarse el 30% de los casos por medio de un frote directo, y no un 70% como lo señala la literatura. Como sabemos existen muestras en las cuales la cantidad de bacilos se encuentra muy diluida y no llega a ser suciente para ser detectada mediante un frote directo de la muestra, y ni aun cuando la misma es centrifugada, por lo que no puede conarse solamente en la baciloscopía y cualquier caso que sea altamente sospechoso debe de ser cultivado y esperar el resultado de éste, para dar como negativo al paciente.

6.1. Preparación de un extendido Todas las fases de preparación del extendido deben ser sistematizadas y estandarizadas; la disposición del material debe ser siempre la misma, de manera que se pueda obtener una seguridad máxima y garantizar la calidad de la técnica. Algunas recomendaciones son las siguientes: - Cada serie de muestras a procesar no debe exceder de doce.


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- Debe utilizarse un portaobjetos (laminilla) por cada de las muestras. - Los portaobjetos deben ser nuevos de preferencia ó en buen estado y desgrasados (sumer girlos en alcohol al 95% y pasarlas por la llama del mechero) - Los colorantes deben conservarse en frascos de color ámbar por un máximo de 3 meses. Algunas muestras necesitan tratamiento previo para poder realizar los extendidos, para esto revise cada una de las secciones por tipo de muestra, en la sección Preparación de la muestra para la elaboración de frotes.

Procedimiento a. Asignar un número de identicación a la muestra y colocarlo a la laminilla con tinta indeleble b. Ordenar las muestras con numeración ascendente de forma horizontal. c. Colocar cada laminilla frente al envase correspondiente teniendo el cuidado de no dejar impresiones digitales en la parte de la lámina reservada para el extendido. d. Colocarse la bata, la mascarilla, doble par de guantes y lentes de seguridad. e. Realizar los frotes colocando la muestra utilizando un asa bacteriológica, un palillo o una pipeta sobre la laminilla dependiendo el tipo de muestra, haciendo un extendido no y circular, de aproximadamente 3 cm. de diámetro y en dos terceras partes de la laminilla (No hacer más de un frote por laminilla para evitar confusiones), luego se dejan secar dentro de la campana. Para que se sequen se necesita por lo menos esperar de 10 a 15 minutos. f. Si se trata de esputo es preferible hacer el frote con palillo de madera cortado en “L” ya que por la consistencia mucosa de la muestra tiende a adherirse mayor cantidad de muestra en él que en un asa. Se debe tener en cuenta que el lugar en dónde hay más probabilidades de encontrar bacilos está en las partículas sólidas, verdosas y sanguinolentas de la expectoración y en gran medida el resultado del examen depende de la elección de esas partículas. g. Fijar el frote por alguno de los siguientes métodos:

• Fijar el extendido pasándolo por encima del incinerador dentro de la campana (es el más seguro). • Pasar la lámina por el área azul de la llama de un mechero Bunsen tres o cuatro veces, pero evite el sobrecalentamiento. • Permita que los frotes se jen en un calentador eléctrico (65 a 70ºC) al menos por 2 horas. • Colocar las láminas en un recipiente con me tanol absoluto por un minuto (puede haber con taminación de muestras por micobacterias sueltas). NOTA: la jación por calor puede que no mate todas las micobacterias, por lo tanto las láminas deben ser manejadas cuidadosamente y descartadas en un recipiente adecuado después de su observación. h. Antes de sacar las manos de la campana quitarse un par de guantes, dejarlo dentro de ella dentro de una bolsa de descarte. i. LOS FROTES TANTO POSITIVOS COMO NEGATIVOS DEBEN GUARDARSE POR LO MENOS SEIS MESES.

6.2. Procedimientos de Tinción alcohol-ácido resistencia El diagnóstico de las micobacterias es basado en la observación de BAAR en las muestras y su cultivo in vitro, para poder observarlos es necesario realizar coloraciones como la de Ziehl-Neelsen (utiliza calor) o Kinyoun (no utiliza calor y su fuchsina es más concentrada). La característica de “alcohol-ácido resistencia” típica de las micobacterias hace que la baciloscopía tenga una importancia fundamental ya que se utiliza para seguir el curso del tratamiento y para dar de alta al paciente en el hospital, para luego poder continuar con su tratamiento ambulatorio.

6.2.1. Coloración de Ziehl-Neelsen: a) Fijar el frote con calor dentro de la campana b) Dejar enfriar c) Colocar papel ltro d) Agregar fuchsina carbónica sobre el frote, calentar cuidadosamente la lámina por debajo, ya sea con un mechero o con un algodón con alcohol hasta emitir vapores blancos (no hervir) y dejar reposar por 5 minutos.


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g) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso h) Agregar azul de metileno i) Permitir el reposo del colorante por 1-2 minutos j) Lavar con agua de chorro k) Permitir que el frote se seque al aire l) Examinar con objetivo de inmersión

6.2.2. Coloración de Kinyoun: a) Fijar el frote con calor dentro de la campana b) Agregar fucshina de Kinyoun sobre el frote y dejar reposar por 4 minutos c) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso d) Agregar alcohol-ácido y dejar reposar por 1-2 minutos e) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso f) Agregar azul de metileno g) Permitir el reposo del colorante por 1-2 minutos h) Lavar con agua de chorro i) Permitir que el frote se seque al aire j) Examinar con objetivo de inmersión

6.3. Interpretación e informe de Baciloscopías

debe repetirse el frote. • En caso de que se observen bacilos con mor fología dudosa solicitar una nueva muestra para control. • Si el frote es muy grueso es probable que se desprenda de la lámina durante la coloración por esto debe evitarse la transferencia de BAAR de una preparación a otra por medio del aceite de inmersión, lentes sucios o colorantes (por lo que debe limpiarse con papel limpialentes entre una y otra muestra) • Ocasionalmente, la buena selección de las partes anormales de la muestra para preparar el frote puede dar resultados mucho mejores que el uso de concentraciones. • Puede ocurrir que la misma muestra sea negativa por frote, pero positiva por cultivo pero no lo contrario, porque la baciloscopía es menos sensible para detectar micobacterias que el cultivo. • Un frote para diagnóstico de Tb debe exami narse de 8-10 minutos antes de darse por negativo. Si se trata de LCR debe observarse aún por más tiempo. • La liberación irregular de micobacterias de los focos endotraqueales puede dar frotes positivos y negativos en el mismo paciente. Hay varias tablas para el reporte de la cuanticación de baciloscopía. La siguiente forma de reportar ha sido estandarizada por la Asociación Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias de los Estados Unidos. con el objeto de poder comparar los resultados de distintos laboratorios y poder orientar de forma adecuada al personal médico. Tabla No. 3 Cuanticación de Baciloscopía

• Los extendidos deben examinarse total y cui dadosamente con lente de inmersión (100x) y oculares 10x y una gota de aceite de inmersión. • Se debe limpiar completamente el lente de inmersión entre una y otra muestra que se observe. • Los bacilos son aproximadamente de 1 a 10 μm de largo y aparecen como bacilos ó como bastoncitos delgados bien denidos, ligeramente curvos (pueden aparecer doblados) te ñidos de rojo brillante (se aprecian mejor con luz intensa), generalmente con gránulos más coloreados en su interior, aislados, en parejas o en pequeños grupos, destacados sobre el azul claro de la tinción de fondo. NOTA: algunas micobacterias distintas a Mycobacterium tuberculosis pueden aparecer pleomórcas que van desde bacilos largos hasta Fuente: Asociación Nacional de Tuberculosis y Enfermeformas cocoides. dades Respiratorias de Estados Unidos. • En el frote pueden aparecer artefactos alco- BAAR (Bacilos alcohol-ácido resistentes) hol-ácido resistentes, especialmente si el frote es grueso o no fue sucientemente decolorado. • En caso que se observen muy escasos BAAR Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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trocelulosa capturan este complejo inmunológico que se hace visible gracias a la presencia del marcador de oro coloidal. Un resultado positivo (una banda visible de co lor púrpura/gris) indica que el antígeno LAM de las micobacterias está presente en la muestra en el límite de detección de la prueba o por encima de él. Fuente: Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social Un resultado negativo (sin banda visible de co de Guatemala. lor purpura/gris) indica que este no está presen› (mayor) ‹ (menor) NOTA: De 1-4 BAAR en toda la lámina Repetir muestra te o que se encuentra por debajo del límite de Si la cantidad de BAAR en la nueva muestra sigue sien- detección. Con el n de garantizar la validez del do la misma el resultado es POSITIVO (+) ensayo se ha incorporado una banda de control de procedimiento en el dispositivo del ensayo. 7. PRUEBAS DE TAMIZAJE Materiales Las pruebas de tamizaje son pruebas que ayu- • Tarjetas de análisis de la prueba Alere Deter dan a dar un diagnóstico presuntivo de infec- mineTM TB LAM Ag 10 tarjetas (10 pruebas por ción por Mycobacterium tuberculosis. Se ob- tarjeta) tiene un resultado más rápido que el cultivo y • Recipientes de recolección de orina generalmente más sensible que las tinciones. • Pipetas con precisión de 60 µL Sin embargo, deben ser interpretadas correla- • Tips descartables cionando la clínica del paciente y los datos de • Temporizador la historia clínica del paciente. Obtención de la muestra 7.1. PRUEBA DE LAM Antes de recoger la muestra de orina, se recoPrincipio mienda limpiar la zona genitourinaria con una La prueba de antígeno de LAM es un análisis toalla limpia. Recoja la orina en un recipiente inmunocromatográco diseñado para la de- estándar de recolección de orina fresca. tección cualitativa del antígeno lipoarabinoma- Conservación de la muestra nano (LAM) de las micobacterias en orina hu- 1.Si se conservan a temperatura ambiente las mana. La prueba Alere DetermineTM TB LAM muestras de orina fresca pueden utilizarse a lo Ag emplea anticuerpos altamente puricados, largo de las 8 horas siguientes a la obtención. especícos del principal antígeno polisacárido 2. Si el análisis se va a realizar a lo largo de los del género Mycobacterium: lipoarabinomanano 3 días posteriores a la obtención de las muestra (LAM). de orina, estas deben almacenarse a una temperatura de entre 2 y 8 °C. Si el análisis se va a Estos anticuerpos se utilizan tanto como traza- realizar más de 3 días después, se deben condores de captura como de detección. Los an- gelar las muestras a -20 °C o menos. ticuerpos de captura se absorben en la mem- 3. Si las muestras están congeladas o refrigebrana de nitrocelulosa de las tiras reactivas. El radas, se deben poner a temperatura ambiente anticuerpo de detección se marca con un con- una hora antes de utilizarlas. jugado de partículas de oro coloidal. 4.Las muestras congeladas pueden contener agregados. Todas las muestras congeladas se Una vez que la muestra de orina se haya agre- deben centrifugar a 10,000 g durante 5 minutos gado a la sección de muestra, los anticuerpos a temperatura ambiente. La muestra a utilizar conjugados con oro coloidal se adhieren al an- se recoge con cuidado del sobrenadante. tígeno LAM y la muestra los libera de la sección 5.Evitar ciclos de congelado/descongelado repetidos. No se pueden utilizar las muestras que de conjugado. A continuación, los anticuerpos se hayan congelado y descongelado más de anti-LAM inmovilizados en la membrana de nitres veces. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Procedimiento 1. El número deseado de unidades de prueba de las 10 tarjetas de análisis pueden extraerse doblando o rasgando la perforación. NOTA: La extracción de las unidades de prueba debe iniciarse en el lateral derecho de la tarjeta de análisis con el n de conservar el número de lote que aparece en el lateral izquierdo de esta. El análisis debe iniciarse a lo largo de las 2 horas posteriores a la retirada de la cubierta protectora de aluminio de cada prueba.

2. Retire la cubierta protectora de aluminio de cada prueba. 3. Aplique 60 µL de la muestra (pipeta de pre cisión) a la sección de muestra (sección blanca marcada con el símbolo de la echa).

Inserto Prueba de LAM, Alere

7.2. GENEXPERT Principio El sistema GeneXpert integra y automatiza el procesamiento de muestras, la amplicación de ácidos nucleicos y la detección de las secuencias diana en muestras sencillas o complejas mediante ensayos de PCR y PCR de transcriptasa inversa en tiempo real. El sistema consta de un instrumento, una computadora, un lector de códigos de barras y un software precargado para la realización de pruebas con las muestras recogidas y la visualización de los resultados. Este sistema requiere el uso de cartuchos GeneXpert desechables de un solo uso para los reactivos y el proceso de PCR. Dado que los cartuchos son independientes, se elimina el riesgo de contaminación cruzada entre las muestras.

4. Espere un mínimo de 25 minutos y lea el resultado. Visualice la tira en un entorno con una iluminación interior estándar o en la sombra. No la visualice bajo la luz directa del sol. Los resultados permanecen estables hasta unos 35 minutos después de haber aplicado la muestra. Si han transcurrido más de 35 minutos no lea El Xpert MTB/RIF incluye reactivos para la delos resultaos de la muestra. tección de MTB y la resistencia a RIF, así como un control de procesamiento de la muestra Control de calidad (SPC, por sus siglas en ingles) para controlar el En la tira de reacción se debe observar una procesamiento adecuado de las bacterias diabanda control de la prueba. Si, una vez aca- na y detectar la presencia de inhibidores en la bado el ensayo, la banda de control no torna a reacción PCR. El control de comprobación de la un color purpura/gris, el resultado de la prueba sonda (PCC, por sus siglas en inglés) comprueno es válido y no se debe volver a analizar la ba la rehidratación de los reactivos, el llenado del tubo de PCR en el cartucho, la integridad de muestra. la sonda y la estabilidad del colorante. Interpretación de los resultados Los cebadores del Xpert MTB/RIF Assay amPara facilitar la lectura e interpretación de los plican una parte del gen rpoB que contiene la resultados cuando éstos se observan muy pá- región central de 81 pares de bases. Las sonlidos, se puede utilizar la Tarjeta de Escala de das son capaces de distinguir entre la secuenReferencia (incluida en el kit), la cual se sostie- cia natural conservada y las mutaciones de la región central que se asocian a la resistencia a ne a la par del resultado. rifampicina.


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3. Aparecerá una pantalla para seleccionar sesión en windows, seleccione “cepheid” e introMateriales duzca la contraseña “cphd” • Cartuchos Xpert MTB/RIF con tubos de reac- 4. Al ingresar a windows, el software de genexción integrados. pert se iniciara automáticamente, si no, presio• Sistema GeneXpert Dx equipado con el sof - ne el icono de genexpert dx software en el estware GX4.0. critorio. • Recipientes estériles y herméticos, con tapa 5. Introducir el usuario y contraseña corresponpara toma de muestra. diente para cada usuario. • Guantes desechables y protección ocular 6. Al ingresar, aparecerá un recuadro pregun• Etiquetas o rotulador permanente tando si quiere hacer algún manejo de la base • Pipetas de transferencia para el procesamien- de datos, presionar “no”. to de la muestra 7. Luego aparecerá un recuadro preguntando si quiere hacer un backup, presionar “no”. Procedimiento 8. Al terminar de ingresar los módulos del ge• Limpie adecuadamente el área de trabajo nexpert deben aparecer en el lado izquierdo (pase un algodón con cloro 10% y luego otro como “disponibles”. con etanol 70%, secar con algodón) 9. El equipo está listo para usar. • Remueva un cartucho y un vial del reactivo de muestra del kit GeneXpe rt MTB/RIF Actualización de un test (nueva versión) • Agregue 2 volúmenes de reactivo de muestra 1. Introduzca el cd que viene con el nuevo kit por una de esputo en el recipiente colector (2:1) de reactivos en el lector del cds del computador. NOTA: para este paso, se puede utilizar la muestra di- 2. Dentro del software, presione el botón “denir recta; es decir, sin haber realizado proceso de deconta- ensayo”. minación o se puede utilizar muestra ya decontaminada. En general, todas las muestras se decontaminan primero 3. Presione el botón “importar” en la parte infey únicamente las muestras de líquido cefalorraquídeo se rior de la pantalla. utilizan directas. Para ver el proceso de decontaminación 4. En la ventana que se despliega seleccionar el de muestras previo a este paso, consultar sección 8.2 y directorio del cd en la barra superior. ubicar el método de decontaminación que se esté reali- 5. Abra la carpeta de que corresponde para el zando, de preferencia el método de NALC-NaOH ya sea sistema genexpert (“nombre de la prueba” gecon reactivos preparados in house o comerciales. nexpert system). 6. En la carpeta seleccione el archivo con termi• Enrosque adecuada mente la tapa • Asegúrese que la tapa cierre adecuadamente. nación “.gxa” • Mezcle el contenedor vigorosamente 10- 20 7. Presiona “aceptar” 8. En la parte izquierda de la pantalla “denir veces. • Dejar reposar a temperatura ambiente por 15 ensayo” aparecerá la nueva versión del test actualizado listo para usarse. minutos (al minuto 10 vuelva a mezclar). • Utilizando la pipeta desechable transera, CUIDADOSAMENTE la muestra (llene la pipe- Realización del test en el GeneXpert 1. Presione el primer botón en la parte superior ta hasta la marca). • Agregue la muestra al contenedor de mues- del software “crear ensayo” 2. En la ventana que se despliega lea el código tra, despacio, evite salpicaduras. de barras del cartucho del ensayo ya preparado. • Cierre la tapa del cartucho. • Coloque el cartucho en el equipo antes de 30 3. Al leer el código de barras en la ventana aparecerá la información del ensayo a realizar. minutos 4. Coloque la identicación de la muestra en el apartado “id de muestra”. Encendido del equipo 1. Encienda el equipo presionando el switch en 5.Si desea cambiar el modulo en el que será procesada la muestra selecciónelo. la parte posterior del equipo genexpert. 6.Cuando esté listo para procesar la muestra 2. Encienda la computadora. presione el botón “iniciar”. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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7. Aparecerá el recuadro para que introduzca de nuevo su usuario y contraseña, introdúzcalos. 8. Al darle “ok” la luz del módulo seleccionado para procesar la muestra empezara a parpadear. 9. Introduzca el cartucho en el módulo y cierre la compuerta. 10. El equipo iniciara 11. a procesar su muestra. El tiempo restante dependerá del ensayo a realizar. Inserto del test MTB/RIF Cepheid Apagado del equipo

1. Después de terminar de procesar las muestras, saque los cartuchos de los módulos. 2. Cierre el software presionando en la “x” de la parte suprior derecha. 3. Aparecerá un recuadro preguntando si quiere hacer algún manejo de la base de datos, presionar “no”. 4. Luego aparecerá un recuadro preguntando si quiere hacer un backup, presionar “no”. 5. El software se cerrara. 6. Presione “inicio” en la barra de inicio de windows. 7. Presione “apagar” 8. Apague el monitor. Resultados e interpretación


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Precauciones y limitaciones • Trate todas las muestras biológicas, incluidos los cartuchos usados, como posibles agentes transmisores de infecciones. •Todas las muestras biológicas deberán tratarse con las medidas de precaución habituales • Utilice guantes protectores desechables, bata de laboratorio y protección ocular cuando manipule las muestras y los reactivos. • Lávese las manos a fondo tras manipular las muestras y los reactivos de la prueba. • Siga los procedimientos de seguridad del centro para trabajar con productos químicos y manipular muestras biológicas. • Si se va a procesar más de una muestra a la vez, abra solo un cartucho, añada la muestra tratada con el reactivo de la muestra (o una muestra liquida descontaminada) y cierre el car tucho antes de añadir la muestra tratada con el reactivo de la muestra al siguiente cartucho. • No abra la tapa del cartucho Xpert MTB/RIF salvo para añadir la muestra tratada. • No use un cartucho que se haya caído o agita do después de añadir la muestra tratada.

8. CULTIVO DE MICOBACTERIAS EN LOWENSTEIN JENSEN

malaquita) ó en Middlebrook 7H10 (sales de fosfato y magnesio, vitaminas, cofactores, ácido oléico, albúmina, catalasa, glicerol y dextrosa) cuando es necesario enriquecer las muestras, recuperarlas o para conservación de cepas se utiliza el segundo medio de cultivo que se ha mencionado.

8.1. Muestras Las muestras para realizarles cultivo de micobacterias están clasicadas dentro de dos categorías: • De origen pulmonar (esputo, liquido y biopsia pleural, hisopados laríngeos, cepillados y lavados bronquiales). • De origen extrapulmonar (orina, heces, piel, sangre, médula ósea, tejidos blandos, aspirados suprapúbicos de vejiga, biopsias, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido pericárdico, líquido peritoneal, secreciones varias, uidos y muestras tisulares en general). De estas categorías hay dos niveles:

Los procedimientos para obtener el crecimiento in vitro de las micobacterias son especializados; deben seguirse estrictamente las instrucciones para tener éxito en su recuperación. Por lo general, las muestras para cultivo contienen muchas bacterias de las microbiotas, especialmente el esputo que siempre se contamina con microbio- Tabla No. 5 ta de la boca. Además el esputo es una muestra difícil de manipular por su mucosidad, tenacidad y adherencia. Por estas razones para su cultivo, el esputo debe digerirse para hacerlo líquido y descontaminarse; es decir darle algún tratamiento químico para destruir las bacterias contaminantes que crecen rápido, pero sin destruir a las micobacterias.

Tipos de muestras.

El cultivo se realiza en Lowenstein Jensen que es un medio muy nutritivo (Huevos enteros frescos, fécula de papa, glicerol, sales de fosfato y magnesio, L-asparagina, glicerol y verde de Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Las muestras normalmente contaminadas ya sea por microbiota normal que es arrastrada al obtenerla o por su propia naturaleza requieren el paso de digestión-decontaminación, por el contrario las muestras normalmente no contaminadas no lo requieren pero en la mayoría de los casos pueden requerir de concentración. En la tabla No.6 se encuentra la preparación según tipo de muestra previo al procedimiento de decontaminación. * Si se cuenta con triturador para biopsias proceder de la siguiente manera: - Transferir la muestra al triturador de tejido estéril usando un asa o aguja para colocarla en la pared lateral del tubo del triturador - Agregar 10 partes de NaCl 0.85%, albúmina

TABLA No. 6

bovina 0.2%, o caldo líquido para micobacterias (Ej. Middlebrook 7H9 ó Dubos) al triturador de tejido. Si la muestra es mucoide puede agregarse N-acetil-L-cisteína (NALC) - Mantener el tubo de lado e insertar el pistilo. Empujar la muestra al fondo del tubo - Detener el tubo en la mano, empujar el pistilo hacia delante y atrás en ángulo 90˚ - Triturar la muestra hasta lograr una suspensión homogénea - Remover cuidadosamente el pistilo del tubo. Utilizar un volumen pequeño de medio para en juagar la punta del pistilo dentro del recipiente de descarte - Tapar el tubo con un tapón de rosca estéril

PREPARACION DE MUESTRAS PREVIO AL PROCEDIMIENTO DECONTAMINACION


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preparación genera calor. 8.2. Métodos para decontaminación Combinar volúmenes iguales de las soluciode muestras. nes 1 y 2, autoclavear a 121˚C por 15 minutos en balones de preferencia con tapón de rosca. Las micobacterias se recuperan óptimamente NOTA: la solución puede ser guardada a tempede muestras clínicas cuando se utilizan méto- ratura ambiente, pero es preferible que se mandos para liberarlas de células y uidos corpo - tenga en refrigeración; la desventaja de tenerla rales (digestión) y para remover o reducir los preparada es que el hidróxido de sodio forma organismos competidores (decontaminación). estructuras blancas como precipitado y en éste Ningún método es ideal para todas las mues- caso ya no puede utilizarse; por lo que de pretras clínicas en todas las circunstancias. Algu- ferencia hay que prepararlo el día que va a ser nos métodos utilizan un solo reactivo tanto para utilizado. digerir como para decontaminar, mientras que otros utilizan reactivos separados para estas A continuación se presentan cantidades de didos funciones. Cualquiera que sea el método gestor y decontaminante dependiendo de la elegido, se debe estar prevenido de las limita- cantidad de solución total necesaria para trabaciones inherentes al método por lo que deberá jar un determinado número de muestras: seguir el procedimiento de digestión-decontaminación que maximice la recuperación de mi- Tabla No. 7 Cantidades para la preparación del Digestante-Decontaminante cobacterias a partir de muestras no estériles. 8.2.1. Método de N-Acetil-L-Cisteína-Hidróxido de Sodio (NALC-NaOH) Principio: La N-acetil-L-cisteína (NALC) es un agente mucolítico que a concentraciones de 0.5 a 2.0% puede digerir rápidamente aún el esputo más tenaz en sólo 2 minutos. La decontaminación • Buer de fosfatos 0.067 M (pH 6.8) se lleva a cabo por medio de una solución preparada con hidróxido de sodio y citrato de so- a. Buffer alcalino stock dio. Na2HPO4 (Fosfato disódico anhidro) 9.47 gr Agua desmineralizada 1000 ml Materiales: Indicar en la etiqueta y en el libro de trabajo b. Buffer ácido stock la fecha de inicio y expiración. Etiquetar todos KH2PO4 (fosfato monopotàsico) 9.07 gr los reactivos con fecha de preparación, receta, Agua desmineralizada 1000 ml contenido, concentración, condiciones de almacenamiento. • Agregar cada sal a balones volumétricos de 1000 mL. • Solución stock de Citrato de Sodio-NaOH • Adicionar agua desmineralizada a la marca de Solución 1 (2.9%) 1000 mL. - Citrato de sodio dihidratado 29g • Cada buer puede ser transferido a recipien- Agua desmineralizada 1000ml tes con tapón de rosca y esterilizados a 121ºC Solución 2 (4%) por 15 min, para ser mezclados después, o pue – NaOH en granallas 40g den combinarse inmediatamente y esterilizarse – Agua desmineralizada 1000ml •La solución puede ser guardada a temperatura ambiente pero es preferible que se refrigere (2Precaución el NaOH es cáustico y su 8ºC). Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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c.Solución de trabajo de buer de fosfatos (pH 6.8) • Combinar volúmenes iguales de los stocks alcalino y ácido ó 640ml del fosfato disódico con 360ml de la solución de fosfato monopotásico y chequear el pH de la solución. • Agregar pequeñas cantidades de buer alcali no para incrementar el pH o pequeñas cantidades de buer ácido para disminuirlo. • Solución NALC-NaOH-Citrato de sodio Justo antes de usar, combinar el NALC con la solución de NaOH-Citrato de sodio. La solución detrabajo puede ser utilizada por las 2 horas consecutivas de su preparación, luego debe descartarse.

Procedimiento a. Agregar un volumen de la solución de trabajo NALC-NaOH-Citrato de sodio igual al volumen de la muestra en un tubo Falcon con tapón de rosca. b. Mezclar suavemente y de forma invertida para asegurar que la solución tenga contacto con todas las supercies del interior del tubo y tapón. c. Agitar el tubo (muestra + solución de trabajo) en Vortex por 5 a 30 segundos hasta dejar la muestra licuada, se debe evitar una agitación en exceso ya que NALC es inestable en presencia de oxígeno y adquiere un color amarillo por oxidación de NALC, si esta coloración se da el NALC se inactiva. d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a temperatura ambiente por 15 minutos para que se lleve a cabo el proceso de decontaminación. e. Si fuera necesaria una decontaminación más activa, incrementar la concentración de sosa de la tabla al 5% o al 6% en lugar de aumentar el tiempo de exposición al reactivo decontaminante. f. Neutralizar la muestra añadiendo agua destilada estéril ó buer de fosfatos (pH 6.8) hasta la marca de 45-50; para detener el proceso de decontaminación. g. Mezclar de forma invertida y suave el tubo. h. Centrifugar a 3000rpm en centrífuga refrigerada durante 15 minutos.

i. De preferencia descartar el sobrenadante en un recipiente de descarte que contenga fenol al 5% y del sedimento remover una porción (ya sea una asada grande ó de preferencia 2-3 gotas con una pipeta estéril) para colocar sobre el medio sólido de cultivo. j. Inocular el sedimento de la muestra en 2 tubos de Löwenstein Jensen. k. Incubar los tubos de forma horizontal a 37°C por 2-5 días l. Seguir incubando los tubos de forma vertical en una gradilla. m. Realizar lecturas 2 veces por semana. n. Observar crecimiento de colonias con las siguientes características: color crema, rugosas, secas y bien adheridas al medio. o. Realizar frotes con Zielh Neelsen, para comprobar crecimiento de bacilos alcohol ácido resistentes. p. Si se completan 8 semanas y no hay crecimiento se dejan de incubar y se reportan como negativos para micobacterias.

8.2.2. Método del Hidróxido de Sodio Principio: El hidróxido de sodio es tanto un digestante como un decontaminante, y su efecto es muy bueno. Su actividad mucolítica más efectiva ocurre a una concentración de 4%.

Materiales: • Solución NaOH 4% - Granallas de NaOH 40g - Agua desmineralizada 1000ml -Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121˚C. Procedimiento a. Agregar un volumen de NaOH igual al volumen de la muestra en un tubo con tapón de rosca. b. Mezclar suavemente y de forma invertida el tubo. c. Agitar el tubo (muestra + NaOH) en Vortex por 30 segundos. d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a temperatura ambiente por 15 minutos para que se lleve a cabo el proceso de decontaminación. e.Diluir la muestra con agua desmineralizada para detener el proceso de decontaminación.


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f. Mezclar de forma invertida y suave el tubo. g. Centrifugar a 3000rpm por 15 minutos. h. De preferencia descartar el sobrenadante en un recipiente de descarte que contenga fenol al 5% y del sedimento remover una porción (ya sea una asada grande ó de preferencia 2-3 gotas con una pipeta estéril) para colocar sobre el medio sólido de cultivo. El NaOH debe utilizarse a la menor concentración que efectivamente digiera y decontamine efectivamente las muestras. Si ocurre contaminación excesiva con el uso de NaOH 2% hay que incrementar la concentración primero al 3% y luego a 4% antes de aumentar el tiempo de exposición.

8.2.3. Método del Ácido Oxálico Principio:

c. Agitar el tubo (muestra + ácido oxálico) en Vortex por 30 segundos. d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a temperatura ambiente por 30 minutos para que se lleve a cabo el proceso de decontaminación. e. Diluir la muestra con solución salina 0.85% estéril para detener el proceso de decontaminación. f. Mezclar de forma invertida y suave el tubo. g. Centrifugar a 3000rpm por 15 minutos. h. De preferencia descartar el sobrenadante en un recipiente de descarte. i. Agregar algunas gotas de rojo de fenol al sedimento. j. Neutralizar el sedimento con NaOH 4% hasta obtener un color rosa pálido. k. Del sedimento remover una porción (ya sea una asada grande ó de preferencia 2-3 gotas con una pipeta estéril) para colocar sobre el medio sólido de cultivo.

El ácido oxálico (ácido etanodioico) es común a muchas plantas y vegetales por lo que depende de un viraje de colores para poder decontaminar efectivamente las muestras.

Materiales: a. Reactivo de ácido oxálico al 5% • Ácido oxálico 50gr • Agua desmineralizada 1000ml • Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121˚C. b. Indicador de Rojo de fenol • Rojo de fenol 8mg • NaOH 20ml • Agua desmineralizada 000ml • Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121˚C. Disolver el rojo de fenol en NaOH al 4% en un agitador magnético, puede que se requiera de calentamiento leve. Transferir la solución a un balón volumétrico y aforar a 1000ml con agua destilada. Guardar la solución a temperatura ambiente. Procedimiento a. Agregar un volumen de ácido oxálico al 5% igual al volumen de la muestra en un tubo con tapón de rosca. b. Mezclar suavemente y de forma invertida el tubo.

8.2.4. Método MycoPrep BBL (método comercial) Principio La mayoría de las muestras enviadas para conrmación de infección por micobacterias con cultivo están contaminadas por la microbiota normal. Por esta razón deben ser tratadas con un procedimiento de digestión y descontaminación. La solución de N-acetil-L-cisteína-hidróxido sódico (NALC-NaOH) es Cuando el reactivo se diluye con la muestra en cantidades iguales provee digestión y decontaminación con una concentración NaOH al 1 %, el citrato de sodio enlaza los iones de metal pesado presentes en la muestra que pueden inactivar el NALC. El tampón fosfato ph 6.8 disminuye la actividad de la solución de NALC-NaOH y reduce la gravedad especíca de la muestra. Materiales Vericar la etiqueta y fecha de expiración.


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Materiales

si las ampollas están rotas, ausentes o bien si no contienen polvo. No utilice si hay evidencia de deterioro (e. g. el color del reactivo se vuelve amarillo). No utilice el tampón fosfato si los paquetes están desgarrados o abiertos.

Vericar la etiqueta y fecha de expiración. • Reactivo BBL MycoPrep Fórmula aproxima- RECOGIDA Y MANIPULACIÓN DE LAS da (ajustada y/o enriquecida para satisfacer MUESTRAS los criterios de rendimiento) por un litro de agua Se requiere la utilización de prácticas y proce- NaOH en granallas 20g dimientos de bioseguridad de nivel 2 y equipo e - Citrato trisódico (Na3C6H5O7.2H2O) 14.5g instalaciones para contención cuando se maniCada ampolla de vidrio sellada dentro del fras- pulen muestras clínicas sin producir aerosoles, co contiene un mínimo de 0.370 g de NALC(- como en la preparación de frotis acidorresistenC5H9NO3S) tes. Todas las actividades que generen aerosoles deben llevarse a cabo en una campana de • Tampón fosfato BBL Mycoprep Fórmula apro- ujo laminar nivel II. Se requiere utilización de ximada (ajustada y/o enriquecida para satisfa- prácticas de bioseguridad de nivel 3 y equipo e cer los criterios de rendimiento) por 500 ml de instalaciones para contención en las actividaagua puricada des de laboratorio que incluyan la propagación y manipulación de cultivos de M. tuberculosis -Fosfato disódico (Na2HPO4) 2.37g y M. bovis. Los estudios en animales también -Fosfato monopotásico (KH2PO4) 2.27g requieren la implementación de procedimientos especiales. Ph Final de 6.8 Advertencias y precaución: Para uso de diag- Procedimiento nostico in vitro. a. Prepare el tampón fosfato BBL MycoPrep El reactivo NALC-NaOH contiene alcalinos según sea necesario, vaciando el contenido de fuertes y causa quemaduras graves. Se debe un paquete en un matraz volumétrico de 500 usar guantes y protección para los ojos y la mL y rellenado con agua puricada. Transera cara. El NaOH irrita los ojos y la piel. En caso la solución tampón a un envase con tapa de de contacto con los ojos o la piel, enjuagar in- rosca y póngala en el autoclave a 121° C dumediatamente con un producto para lavado rante 15 minutos con la tapa oja. Déjela enfriar ocular o abundante agua potable durante al a temperatura ambiente y apriete la tapa. menos 15 minutos y consulte al médico. Si es ingerido, tome leche, clara de huevo o abun- b. Con cuidado para no derramarlo, aoje la dante agua y consulte al médico. Mantenga tapa de rosca del frasco de reactivo MycoPrep. fuera del alcance de los niños. Extraiga todo exceso de aire del frasco y asegure la tapa. Coloque el frasco en posición verPrecaución: Rompa la ampolla cerca del tical y apriételo hasta que se rompa la ampolla. centro una sola vez. No siga manipulando la (Nota: el frasco de 150 mL contiene dos ampoampolla ya que el frasco de plástico puede per- llas y se deben romper las dos). Agite suaveforarse y causarle heridas. mente para disolver el NALC.

Instrucciones para el almacenamien- Evite agitar en exceso. U NA VEZ ROTA LA to: En cuanto se reciba, guardar a una tempe- AMPOLLA, EL REACTIVO DEBE USARratura entre 15 y 30°C. No congelar. No abrir SE EN UN LAPSO DE 24 HORAS. hasta que vayan a utilizarse. Deterioro del producto: No utilice los reactivos Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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c. En un gabinete de seguridad biológica, utilice un tubo para centrifuga estéril libre de aerosoles de 50 mL y con tapa de rosca, añada cantidades iguales de la muestra y de la solución de NALC-NaOH activada (aproximadamente 5 mL de cada uno)

cimiento BACTEC MGIT y la mezcla antibiótica BBL MGIT PANTA está destinado para la detección y recuperación de micobacterias utilizando los sistemas BACTEC MGIT 960. Los tipos de muestras aceptables son muestras clínicas digeridas y decontaminadas (excepto orina) y uidos corporales estériles (excepto sangre).

Principio d. Tape el tubo para centrifuga y mezcle en un vortex hasta que la muestra se licúe. Si la Se tiene un compuesto uorescente en la parte muestra es muy viscosa añada más solución inferior de los tubos de 16x100 mm de fondo rede NALC-NaOH y vuelva a mezclar. dondo. El compuesto uorescente es sensible a la presencia de oxígeno disuelto en el caldo. e. Deje reposar la mezcla a temperatura am- Al inicio la gran cantidad de oxígeno disuelto biente durante 15 minutos y agite suavemente apaga las emisiones procedentes del compuesde vez en cuando. Evite tratar la muestra en to y se puede detectar muy poca uorescencia. exceso. Más tarde, los microorganismos que respiran activamente consumen el oxígeno y permiten f. Añada el tampón de fosfatos ya preparado al que se detecte la uorescencia. tubo para centrifuga hasta alcanzar los 40 mL y mezcle. Centrifugar entre 15 y 20 minutos a Los tubos que se introducen en el instrumento 3,000 gravedades. BACTEC MGIT son incubados continuamente a 37°C y este controla los tubos cada 60 minutos g. Decante con cuidado todo el uido sobrenapara detectar un aumento en la uorescencia. dante El análisis de la uorescencia, este análisis se h. Añada una pequeña cantidad de tampón de utiliza para determinar si el instrumento detecta fosfatos con un pH 6.8 (0.5 a 2 mL) y vuelva a el tubo como positivo con organismos viables. suspender el sedimento. Utilice la suspensión Cada tubo positivo contiene aproximadamente para preparar frotis y para los procedimientos 105 a 106 UFC/ml. Los frascos de cultivo que permanecen negativos durante un mínimo de micobacteriológicos. 42 días (hasta 56 días) y que no muestran in dicios de ser positivos se retiran del instrumenControl de Calidad del Usuario: • Examine los componentes del equipo de cada to como negativos y se esterilizan antes de ser lote o envío que se reciba por Deterioro del Pro- desechados. ducto. • Inocular una caja de agar sangre para bús - El suplemento de crecimiento BACTEC MGIT se añade a cada tubo MGIT para proporcionar queda de bacterias u hongos contaminantes. • Inocular los reactivos del Mycoprep (buer y substancias esenciales para el crecimiento rápisolución NaOH-citrato de sodio-NALC en tubo do de micobacterias. El ácido oleíco es usado de medio sólido y tubo de medio líquido para por las micobacterias y es muy importante en el vericar esterilidad. metabolismo micobacteriano. La albúmina actúa como agente protector al ligar ácidos grasos 8.3. Inoculación de Tubo Bactec MGIT libres que pueden ser tóxicos para las especies 960 (Indicador de crecimiento de Mi- de Mycobacterium, ayudando a su recuperacobacterias). ción. La dextrosa es una fuente de energía. El uso del tubo BBL MGIT indicador de crecimiento enriquecido con el suplemento de creRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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La catalasa destruye las peroxidasas tóxicas que pueden estar presentes en el medio. La contaminación se reduce al suplementar el caldo de base con el suplemento de crecimiento BACTEC MGIT/mezcla antibiótica BBBL MGIT PANTA antes de la inoculación con una muestra clínica.

Base de caldo Middlebrook 7H) modicado 5.9 g. Peptona de caseína 1.25 g.

El suplemento de crecimiento BACTEC MGIT contiene 15 mL de Caldo de enriquecimiento Middlebrook OADC. Fórmula aproximada por L de agua puricada: Materiales y Reactivos Albumina bovina 50.0 g Catalasa 0.03 g. El tubo indicador de crecimiento BBL MGIT Dextrosa 20.0 g contiene: 110 uL de indicador uorescente y 7 Ácido oléico 0,1 g. mL de caldo. El indicador contiene cloruro pen- Estearato de polioxietileno (POES) 1.1g. tahidratado de Tris-4, 7-difenil-1, 10-fenantrolina rutenio en una base desilicona. Los tubos MGIT 960 INGRESO O EGRESO DE TUse limpian con un chorro de CO2 al 10% y se BOS O GRADILLAS cierran con tapones de polipropileno. 1.Ingreso de los tubos o gradillas al equipo (este Formula aproximada por L de agua puricada procedimiento no es realizado por nosotros) del tubo indicador de crecimiento BBL-MGIT: A.Ingreso desde el instrumento


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Después del ingreso de los tubos, el instrumento automáticamente realizara la lectura de los tubos cada hora durante el tiempo necesario para la interpretación del procedimiento.

MANTENIMIENTO DIARIO MGIT 960 • Vericar luces internas y externas: • Correcto funcionamiento Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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• Vericar de Temperatura • Correcto funcionamiento


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• Registrar los resultados

con una amina primaria o secundaria (anilina). Kilburn y Kubica modicaron utilizando una tira 9. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN impregnada con los reactivos. El tiocianato potásico acidicado con cloramina T libera cloruro 9.1. TEST DE ÁCIDO NICOTÍNICO PARA de cianógeno, el cual reacciona con ácido niTB BBL TAXO (NIACINA) cotínico y produce un color amarillo. Si no hay ácido nicotínico no aparece ningún color. Principio Materiales Las tiras de análisis de ácido nicotínico para TB Las tiras de análisis de ácido nicotínico para contienen reactivos para la detección de la pro- TB BBL Taxo son tiras de papel absorbente imducción de ácido nicotínico por micobacterias. pregnadas con tiocianato potásico, cloramina Se utiliza el control de ácido nicotínico para TB T, ácido citríco y aminosalicilato de sodio. BBL taxo como control positivo en el análisis de ácido nicotínico. Los discos de papel control están impregnados con nicotinamida. Cuando se usan siguiendo Todas las micobacterias producen ácido nico- las instrucciones, producen una solución amatínico, o niacina, sustancia que desempeña rilla equivalente aproximadamente a 5 ug de un papel esencial en las reacciones de oxida- ácido nicotínico. ción-reducción. Debido al bloqueo de una vía Medios de cultivos. metabólica, M. tuberculosis y ciertas cepas ais- • Agua destilada o desionizada estéril o solu ladaS de M. simiae y de M. chelonae producen ción salina 0.85% estéril. las mayores cantidades de este compuesto. El • Tubos estériles de 13 x 75 mm. ácido nicotínico se acumula en los medios de • Tapones para tubo. cultivo en los que están creciendo los microor- • Pipetas de trasferencia estéril. ganismos y puede extraerse de dichos medios. • Pinzas. El ácido nicotínico producido por el microorga- • Cepas para control de Calidad nismo reacciona con el bromuro de cianógeno y Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Almacenamiento: Conservar las tiras a 2 a 8° C. La fecha de vencimiento es vigente para el producto cuando está envasado en su recipiente intacto y ha sido conservado según las instrucciones.

Preparación de la muestra • Agregar 1.5 ml de solución salina 0.85% o agua desmineralizada estéril a un cultivo de 3-4 semanas de crecimiento con al menos 50 a 100 colonias. • Frotar con un asa plástica estéril sobre el crecimiento para permitir la extracción de la niacina. No utilizar cultivos contaminados. • Inclinar los tubos de modo que la supercie del medio esté en posición horizontal y cubierta con el líquido utilizado. Permitir que permanezca en esta posición por 20 a 30 minutos. • Cuidadosamente remover aproximadamente 0.6 ml del extracto de cada muestra con una pipeta estéril y transferirlo a un tubo de 13 x 75 mm. a. Preparación de controles

jo en cada uno de los tubos (control positivo, control negativo, muestra) y taparlos inmediatamente. d. Mezclar gentilmente pero no agitar. Repetir este movimiento después de 5 a 10 min. e. Después de 15 min. pero no más de 30 min., comparar el color de los extractos f. Autoclavear y descartar los tubos después de completar la prueba.

Resultados Un resultado positivo para el test de niacina se evidencia por la aparición de color amarillo en el extracto de la muestra y en el control positivo; la ausencia de color en el control negativo. Precauciones

* Positivo: -Colocar 0.6 ml de solución salina 0.85% ó agua desmineralizada estéril en un tubo de 13 x 75 mm -Agregar uno de los discos control de niacina, tapar y agitar moderadamente 3 veces por 15 min. -Rotular como control positivo.

• Únicamente cultivos de 3 a 4 semanas de crecimiento con al menos 50 a 100 colonias deben usarse en el test de producción de niacina. Una menor cantidad de colonias puede dar resultados negativos o dudosos. • No deben utilizarse cultivos contaminados. • Deben observarse las precauciones para el manejo de Mycobacterium tuberculosis al realizar ésta prueba. *Negativo: -Colocar 0.6 ml de solución salina 0.85% ó • Los tubos tapados deben ser autoclaveados agua desmineralizada estéril en un tubo de 13 después de completar la prueba. x 75 mm Limitaciones - Rotular como control negativo. Aunque un resultado fuertemente positivo para el test de niacina en micobacterias no cromoProcedimiento génicas, es altamente indicativo de Mycobactea. Procesar el cultivo como se indica en prepa- rium tuberculosis se considera únicamente una ración de la muestra y colocar 0.6 ml del extrac- identicación preliminar de este organismo. La identicación completa y nal de Mycobacteto de cada muestra en tubos de 13 x 75 mm b. Mantener a mano los tubos control positivo y rium tuberculosis y otras micobacterias clínicamente signicativas se basa en los resultados negativo c. Utilizando pinzas ameadas, dejar caer una obtenidos en una batería de información que intira del test de niacina, con la echa hacia aba- cluye test bioquímicos, patrones de susceptibilidad antibiótica y características morfológicas. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Se considera que los medios de cultivo desarrollados en medios a base de huevo son los que producen los resultados más homogéneos, se obtienen resultados satisfactorios con agar de Middlebrook y Cohn suplementado con ácido aspártico al 0.1 %.

9.2. TIRAS BBL TAXO PARA PRUEBA DE NITRITOS Principio Se utilizan para detectar los microorganismos nitrato reductasa positivos, especialmente micobacterias en la prueba de reducción de nitrato. La capacidad que tiene la micobacteria de reducir los nitratos a nitritos es útil para diferenciarlas. Esta prueba separa las micobacerias de crecimiento lento que son nitrato positivas como ejemplo M. tuberculosis, M. kansasii y M. fortuitum de las de crecimiento rápido que son negativas o débilmente positivas como por ejemplo M. bovis, M. avium complex y M. intracellulare. La presencia de la enzima nitrato reductasa se detecta por la producción de un producto nal coloreado.

Materiales • Las tiras BBL Taxo para prueba de nitrito son tiras de papel absorbente impregnadas de nitrato sódico tamponado, ácido cítrico, yoduro potásico y almidón. • Medios de cultivos. • Agua destilada o desionizada estéril. • Tubos estériles de 20 x 110 mm con tapón de rosca. • Pipetas de trasferencia o espátula. • Pinzas. • Incubadora. • Cepas para control de Calidad

Almacenamiento Conservar las tiras de 2 a 8° C. No exponer a humedad y temperaturas elevadas. Proteger de la luz, las tiras son fotosensibles. La fecha de vencimiento es vigente para el producto cuando está envasado en su recipiente intacto y ha sido conservado según las instrucciones. Procedimiento a. Utilice un cultivo de 3 – 4 semanas hecho en medio de Lowenstein-Jensen, medio Petragnani u otro medio de huevo coagulado. b. Añada 0.5 ml de agua destilada a un tubo limpio de 20x110mm con tapón de rosca. c. Utilizando una pipeta estéril de 1 mL o una espátula, saque dos agregados de colonias del cultivo. Añada las colonias al agua destilada y disperse las colonias utilizando la pipeta o la espátula. Alternativamente, añada 1.5 ml de solución salina estéril en cada cultivo inclinado y remueva el cultivo para una suspensión espesa. Transera 0.5 ml de esta suspensión de cultivo a un tubo vacío y estéril para analizar. d. Con las pinzas esterilizadas al fuego, añada cuidadosamente una tira BBL Taxo para prueba de nitrito al tubo. Oriente la tira para poder introducir primero la parte inferior de la misma, señalada con una echa, en el tubo. Sostenga el tubo en sentido vertical. e. Cierre el tubo con el tapón e incúbelo a 35 +/2°C durante 2 horas. Agite el tubo suavemente al concluir la primera y la segunda hora de incubación. No incline el tubo f. Después de 2 horas de incubación, incline el tubo cuidadosamente de un lado a otro 6 veces para humedecer la tira entera. Inclínelos tubos a temperatura ambiente para cubrir la tira con el líquido. Deje los tubos en esta posición durante 10 min. Resultados El cambio del color de la parte superior de la tira a azul claro o azul oscuro indica la reducción de nitrato. La ausencia de un cambio de color indica una reacción negativa. Control de Calidad Especicaciones de la identidad, las tiras de papel blancas con ecas negras apuntando hacia abajo. Respuesta del cultivo: Prepare tubos con agua destilada. Inocúlelos con los organismos a analizar.


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Introduzca las tiras en los tubos con la echa apuntando hacia abajo. Incube a 35 +/- 2°C durante 2 horas. La presencia del color azul en la parte superior de la tira indica una reacción positiva.

anticuerpo-conjugado coloide dorado, se une al antígeno MPT64 en la muestra, en medio líquido. El complejo entonces continua uyendo y se une al anti- MPT64 monoclonal de ratón sobre la fase sólida en la línea de prueba, produciendo una banda de color de rojo a purpura. En ausencia del MPT64 no hay línea en la región de banda de prueba.

Materiales y Reactivos Limitaciones La prueba de reducción de nitrato es valiosa para l identicación de M. tuberculosis y otras micobacterias clínicamente signicativas. Sin embargo, esta prueba es sólo una parte de la batería bioquímica necesaria para la identicación preliminar de estos organismos. 9.3. DETECCIÓN MPT64

DE

ANTÍGENO

Principio Prueba de casete que consta de una almohadilla para la muestra, una almohadilla de conjugado dorado, una membrana de nitrocelulosa y una almohadilla absorbente. Los anti-MPT64 monoclonal de ratón están inmovilizados sobre la membrana de nitrocelulosa como material de captura (línea del test). Tiene añadidos otros anticuerpos los cuales reconocen otros epítopes del MPT64, conjugados con las partículas del coloide dorado, fueron usados para la captura del antígeno y la detección en un ensayo tipo sándwich. El dispositivo de la prueba rápida SD BIOLINE Ag MPT64 tiene una letra C (Línea control) y la letra “T” (Línea de prueba) sobre la supercie del casete. Ambas líneas, control y test no son visibles en la ventana de resultado antes de la aplicación de cualquier muestra. La “Línea Control” es usada como control del procedimiento. La línea control debe siempre aparecer si el procedimiento de prueba es realizada adecuadamente y los reactivos de prueba de la línea control están funcionando. Cuando la muestra es aplicada en el pozo de muestras, esta u ye lateralmente a través de la membrana, el

• Dispositivo de prueba individualmente empacado en una bolsa de aluminio con un desecante • Buer de extracción (para preparación de muestras a partir de cultivos sólidos). • Instrucciones de uso.

Procedimiento a. Retirar el dispositivo de prueba de su bolsa de aluminio y ubíquelo sobre una supercie plana y seca. b. Adicionar 100μl del cultivo líquido (o 100μl del cultivo solido suspendido en buer) dentro del pozo de muestra. c. Cuando la prueba comience a correr, se verá el color purpura desplazándose a través de la ventana de resultados en el centro del dispositivo de prueba. d. Interprete los resultados de prueba 15 minutos después de la aplicación de la muestra.


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Resultados

Precauciones Todos los procedimientos se deben realizar en campanas biológicamente seguras. Use tubos de ensayo con tapa para evitar infección del usuario cuando requiera de cultivos con muestras. 9.4. IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES COMUNES DE MICOBACTERIAS (GenoType Mycobacterium CM) PRINCIPIO El kit GenoType Mycobacterium CM (Common Mycobacteria) está basado en la tecnología DNA•STRIP y permite la identicación de las siguientes especies de micobacterias: M. avium ssp., M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. ulcerans, M. tuberculosis complex, y M. xenopi. El procedimiento completo se divide en tres pasos: extracción de ADN procedente de cultivo (placas de cultivo/medio líquido; los reactivos necesarios no se suministran), una amplicación múltiplex con primers marcados con biotina (la ADN polimerasa termoestable no se incluye), y una hibridación reversa.

La hibridación incluye los siguientes pasos: desnaturalización química del producto a amplicar; hibridación de amplicones de una sola cadena, marcados con biotina, a sondas unidas a membrana; lavado astringente; adición de conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una reacción de tinción mediada por AP. Una plantilla asegura la interpretación sencilla y rápida del esquema de bandas obtenido.

MATERIALES • Agua destilada (para uso en biología molecular) • Baño de agua • Baño de agua con agitación/TwinCubator • Baño de ultrasonidos • Centrífuga de mesa • Cronómetro • ADN polimerasa termoestable con tampón (recomendación: HotStarTaq DNA Polymerase de Qiagen) • Guantes desechables • Papel absorbente • Pinzas • Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μL • Plataforma de agitación/TwinCubator • Probeta graduada • Puntas de pipeta desechables con ltro • Reactivos para extracción de ADN, así como equipos necesarios • Termociclador (rango de calentamiento 3°C/ seg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión +/–0,2°C) • Termómetro calibrado • Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa 1. Preparación de muestra y controles (si aplican controles) Las muestras para extracción son a partir de colonias aisladas de cultivo sólido, suspendidas en 300 μL agua ultrapura libre de DNasa y RNasa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. Las muestras también pueden extraerse a partir de cultivos positivos en medio líquido, se traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de DNasa y RNasa.


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PROCEDIMIENTO EXTRACCIÓN DE ADN Puede usarse un crecimiento bacteriano en placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi ddlebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC, MB-Check). Este test no puede usarse para detectar micobacterias directamente de muestras de pacientes. La zona de trabajo ha de estar libre de ADN amplicado. Es crucial el calentamiento de las muestras a 95°C durante, al menos, 20 minutos con objeto de inactivar bacterias vegetativas. Se puede seguir cualquier procedimiento de extracción de ADN que produzca ADN de bacterias amplicable. El siguiente protocolo rápido normalmente produce ADN adecuado para amplicación:

– 5 μL 10x de tampón para incubación de polimerasa – no suministrado. – x μL de solución MgCl21) – no suministrado – 1-2 unidades de DNA polimerasa termoestable (consulte el manual) – no suministrado – y μL de agua para obtener un volumen de 45 μl (sin considerar el volumen de enzima) – no suministrado. – Añada 5 μL de solución de ADN (20-100 ng de ADN) para obtener un volumen nal de 50 μL (sin considerar el volumen de enzima). 1) Dependiendo del sistema enzima/tampón usado, la concentración óptima de MgCl2 puede variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta que algunos tampones para incubación ya contienen MgCl2.

La evaluación del rendimiento del ensayo Ge1a. Cuando use crecimiento bacteriano en me- noType Mycobacterium CM fue realizada utilidio sólido, recoja bacterias con un asa de ino- zando la Polimerasa HotStarTaq ADN de Qiaculación y suspéndalas en aproximadamente gen. Las cantidades necesarias por muestra 300 μL de agua (grado Biología Molecular). cuando utilice esta enzima son las siguientes: 1b. Cuando use crecimiento bacteriano procedente de medio líquido, aplique directamente – 35 μL de PNM – suministrado 1 mL. Concentre las bacterias mediante centri- – 5 μL 10x PCR Buer de la HotStarTaq (confugación 15 min en una centrífuga de sobreme- tien e 15 mM de MgCl2) – no suministrado sa en un rotor con contenedor de aerosoles y – 2 μL 25 mM de solución MgCl2 – no suminisen una cabina de seguridad de clase II a 10000 trado x g aproximadamente. Deseche el sobrenadan- – 0,2 μL (1 U) de HotStarTaq – no suministrado te y resuspenda las bacterias en 100-300 μL de – 3 μL de agua (para uso en biología molecular) agua (ver más arriba) con un vórtex. – no suministrado 2 Incube las bacterias procedentes del aparta- – 5 μL de solución de DNA (añada el ADN en do 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño una zona distinta) de agua. – La concentración nal de MgCl2 en la mezcla 3 Incube durante 15 min en un baño de ultra- de amplicación será de 2,5 mM. sonidos. 4 Centrifugue durante 5 min a máxima veloci- Determine el número de muestras a amplicar dad y utilice directamente 5 μL del sobrenadan- (número de muestras a analizar más las mues te para la PCR. En caso de que la solución de tras de control). Por ejemplo, un control de con ADN haya de almacenarse por períodos pro- taminación contiene 5 μL de agua en lugar de longados de tiempo, transera el sobrenadante solución de ADN. Prepare una mezcla que cona un tubo nuevo. tenga todos los reactivos excepto la solución de ADN y mezcle bien. No utilice vórtex. AMPLIFICACIÓN Alicuote la mezcla madre en volúmenes de 45 Prepare la mezcla de amplicación (45 μL) en μl en tubos preparados de PCR. una habitación libre de ADN. La muestra debe añadirse en un área separada. Mezcle por tubo: – 35 μL de PNM – suministrado Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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2) Perl de amplicación

Los productos para amplicación pueden alma cenarse entre +8 y –20°C. Para comprobar la reacción de amplicación, aplique directamente 5 μL de cada muestra a un gel de agarosa al 2% sin la adición de tampón de carga. Los amplicones tienen una longitud aproximada de 230 pb (Control de Género) y 200 pb (Control Universal/amplicon especie-especíco).

HIBRIDACIÓN Preparación Precaliente en baño de agua con agitación o TwinCubator a 45°C; la máxima desviación tolerada en la temperatura idónea es de +/–1°C. Precaliente las soluciones HYB y STR a 3745°C antes de usar. Los reactivos han de estar libres de precipitado (tenga en cuenta, no obstante que la solución CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. Caliente a temperatura ambiente los restantes reactivos, con la excepción del CON-C y el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 con sus tampones respectivos (CON-C con CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperatura ambiente. Para cada tira añada 10 μL de concentrado a 1 mL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso. El SUB-C diluído es estable durante 4 semanas si se almacena a temperatura ambiente y se protege de la luz.

uno de los pocillos usados. 2. Añada a la solución 20 μL de muestra amplicada, pipetee arriba y abajo para mezclar bien e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos usando pinzas e identifíquelas marcando bajo el marcador coloreado con un lápiz. Lleve siempre guantes cuando manipule tiras. 3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL de Tampón de Hibridación (HYB, verde) precalentado. Agite suavemente la bandeja hasta que la solución tenga un color homogéneo. Tenga la precaución de no derramar solución en los pocillos cercanos. 4. Ponga una tira en cada pocillo. Las tiras tienen que quedar completamente cubiertas por la solución y el lado con la sonda hacia arriba (identicable por el marcador coloreado próximo al extremo inferior). Usando pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran haberse girado durante su inmersión. Limpie cuidadosamente las pinzas después de cada uso para evitar contaminación. Ello, es también de aplicación en los pasos siguientes. 5. Ponga la bandeja en el baño de agua con agitación o en el TwinCubator durante 30 minutos a 45°C. Ajuste la frecuencia de agitación del baño de agua para que realice una mezcla completa y constante de la solución. Para obtener una adecuada transferencia de calor, la bandeja debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de su altura. 6. Aspire completamente el Tampón de Hibridación. Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío. 7. Añada 1 mL de Solución de Lavado Astringente (STR, roja) a cada tira e incube durante 15 minutos a 45°C en un baño con agitación o TwinCubator. Desde este paso, en adelante, trabaje a temperatura ambiente. Elimine completamente la Solución de Lavado Astringente. Deseche la Solución de Lavado en un contenedor y elimine todo el líquido restante volcando la bandeja y golpeándola suavemente sobre un papel absorbente. Ello es también de aplicación a todos los demás pasos de lavado.

1.Dispense 20 μL de la Solución de Desnatu ralización (DEN, azul) en una esquina de cada Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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8.Lave una vez cada tira con 1 mL de Solución de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agitado del TwinCubator (elimine el RIN después de la incubación). 9. Añada 1 mL de Conjugado diluído (ver más arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos sobre la plataforma de agitado del TwinCubator. 10. Elimine la solución y lave cada tira dos veces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto aproximadamente con 1 mL de agua destilada (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de agitación del TwinCubator (deseche la solu ción cada vez). Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua después del lavado anterior. 11. Añada 1 mL de sustrato diluído (ver más arriba) a cada tira e incube sin agitación y protegiéndolas de la luz. Dependiendo de las condiciones del test (por ej. la temperatura ambiente), el tiempo de incubación del sustrato puede variar entre 3 y 20 minutos. Tiempos prolongados de incubación del sustrato pueden conducir a una tinción incrementada del fondo y podría dicultar la interpretación de los resultados. 12. Detenga la reacción aclarando brevemente por dos veces con agua destilada. 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bandeja y séquelas entre dos capas de papel absorbente.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN Pegue las tiras y almacénelas protegidas de la luz. Con cada kit se proporciona un formulario de evaluación. Cuando se utilice este formulario de evaluación, pegue las tiras reveladas en los campos marcados, alineando las bandas CC y UC con las respectivas líneas del formulario. Anote el número de las bandas positivas en la penúltima columna y determine la especie con la ayuda de la tabla de interpretación y registre el nombre de las especies identicadas en la última columna. La plantilla suministrada también sirve como ayuda para evaluación y ha de ser alineada con las bandas UC y CC de la tira. Cada tira tiene un total de 17 zonas de reacción (ver esquema).

Control de Conjugado (CC) Debe aparecer una línea en esta zona, documentando la ecacia del conjugado unido y la reacción del sustrato. Control Universal (UC) Esta zona detecta, como es conocido, todas las micobacterias y miembros del grupo de bacterias gram-positivas con alto contenido de G+C. Si esta zona y el Control de Conjugado se tiñen como positivas, pero el restante esquema de bandas no puede ser asignado a una micobacteria especíca, se deben aplicar métodos adicionales para identicar la espe cie bacteriana correspondiente. Solamente han de considerarse aquellas bandas cuyas intensidades sean tan fuertes, o más fuertes, que la intensidad del Control Universal. Control de Género (GC) La coloración en esta zona documenta, como conocida, la presencia de un miembro del género Mycobacterium. La intensidad de esta banda varía dependiendo de la especie de Micobacteria. La banda del Control de Género puede desaparecer a pesar de la presencia de DNA micobacteriano; sin embargo, siempre que esté presente un patrón de bandeo especíco de especie, la reacción de amplicación se llevó acabo correctamente y el resultado del ensayo es válido.


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Otras bandas Cuando no aparece patrón de bandas especí- Sondas Especícas; para la evaluación ver la co de especie, un patrón que indique la pre- tabla de interpretación. sencia de una bacteria gram-positiva con alto contenido en G+C puede, en casos raros, estar No todas las bandas de una tira han de mostrar originado por una Micobacteria que no puede la misma intensidad. ser detectada por este kit. Por favor, tenga en Si fue usada una gran cantidad de amplicón, cuenta que puede identicar especias adiciona- pueden aparecer bandas adicionales. les de micobacterias con el kit GenoType MycoTABLA DE INTERPRETACIÓN bacterium AS.

PRECAUCIONES Almacene la Mezcla del Primer/Nucleótido (PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cualquier fuente potencial de DNA contaminante. Si se requiere almacenar durante más de 4 semanas, almacene a –20°C. A n de evitar congelaciones y descongelaciones repetidas, alicuote el PNM. Almacene el resto de los componentes del kit en 2-8°C. No utilice los reactivos después de su fecha de caducidad. Los especímenes de los pacientes y los cultivos realizados a partir de especímenes de pacientes deben ser considerados siempre como potencialmente infecciosos. Las muestras de

pacientes de riesgo (infectados por microorganismos patógenos incluyendo Hepatitis B y Virus de Inmunodeciencia Humana (VIH)) y los cultivos realizados a partir de esas muestras deben ser etiquetados y manejados siempre bajo las condiciones de seguridad adecuadas, de acuerdo con las guías institucionales. Observe todas las normas medioambientales y de seguridad, tanto federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada. El tratamiento y preparación de la muestra, incluyendo el paso de inactivación por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II.


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personas cualicadas, bien entrenadas en el procedimiento de utilización del ensayo y familiarizadas con métodos de biología molecular. La evaluación de este sistema de análisis fue llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polimerasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las características de rendimiento de este ensayo no han sido validadas para todas las polimerasas disponibles comercialmente, el usuario es el encargado de evaluar la aplicabilidad de otras polimerasas distintas de las arriba mencionadas.

Antes del paso de inactivación por calor las muestras deben ser centrifugadas en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir el rotor con contenedor de aerosoles solamente en la cabina de seguridad. Después de la inactivación por calor se puede utilizar un rotor standard para centrifugar las muestras fuera de la cabina de seguridad. Observe las precauciones normales para preparar la amplicación. Es esencial que todos los materiales y reactivos usados para extracción de DNA y amplicación estén libres de DNasas. 9.5. IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES ADICIONALES (GenoType MycobacteCuando manipule los reactivos del kit debe to- rium AS) mar las siguientes medidas especiales de sePRINCIPIO guridad: La Solución de Desnaturalización (DEN) contie- El kit GenoType Mycobacterium AS (Additinonal ne <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel. Species) está basado en la tecnología DNA•S El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- TRIP y permite la identicación de las siguientes metil Sulfóxido y es irritante. especies de micobacterias: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. LIMITACIONES celatum, M. smegmatis, M. genavense, M. Los miembros del M. tuberculosis complex no lentiavum, M. heckeshornense, M. szulgai/M. pueden ser diferenciados. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kan Antes de la amplicación, el DNA ha de ser ais- sasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum, y M. lado de cultivo bacteriano realizado por un mé- shimoidei. todo idóneo. Ha de tenerse la seguridad de que El procedimiento completo se divide en tres pala muestra de DNA ha sido amplicada ecien - sos: aislamiento de ADN procedente de cultivo temente durante la reacción de amplicación. (placas de cultivo/medio líquido; los reactivos El test sólo funciona dentro de los límites de las necesarios no se suministran), una amplicaregiones genómicas para las que los primers ción múltiplex con primers marcados con biotina y sondas han sido elegidos. El análisis de se- (la ADN polimerasa termoestable no se incluye), cuencias potenciales permanece reservado y una hibridación reversa. para la reanudación de investigaciones. La hibridación incluye los siguientes pasos: desLa presencia de múltiples especies de bacte- naturalización química del producto a amplicar; rias en la muestra a analizar puede dicultar la hibridación de amplicones de una sola cadena, interpretación de resultados. marcados con biotina, a sondas unidas a memComo cualquier sistema de detección basado brana; lavado astringente; adición de conjugado en la hibridación, este sistema contempla la po- de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una sibilidad de que variaciones de las secuencias reacción de tinción mediada por AP. Una plantien las regiones genómicas que fueron elegidas lla asegura la interpretación sencilla y rápida del para los primers y sondas, y la detección de re- esquema de bandas obtenido. giones para las cuales el kit no fue diseñado, pueden conducir a resultados falsos. Debido a MATERIALES la gran variabilidad existente en los genomas – Agua destilada (para uso en biología molecubacterianos es posible que ciertos sub-tipos lar) puedan no ser detectados. El test reeja los co- – Baño de agua nocimientos de Hain Lifescience. – Baño de agua con agitación/TwinCubator La utilización de este ensayo está limitada a – Baño de ultrasonidos Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Centrífuga de mesa – Cronómetro – ADN polimerasa termoestable con tampón (recomendación: HotStarTaq DNA Polymerase de Qiagen) – Guantes desechables – Papel absorbente – Pinzas – Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μl – Plataforma de agitación/TwinCubator – Probeta graduada – Puntas de pipeta desechables con ltro – Reactivos para extracción de ADN, así como equipos necesarios – Termociclador (rango de calentamiento 3°C/ seg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión +/–0,2°C) – Termómetro calibrado – Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa PREPARACIÒN DE LA MUESTRA Las muestras para extracción son a partir de colonias aisladas de cultivo sólido, suspendidas en 300 μl agua ultrapura libre de DNasa y RNasa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. Las muestras también pueden extraerse a partir de cultivos positivos en medio líquido, se traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de DNasa y RNasa. PROCEDIMIENTO EXTRACCIÓN DE ADN Puede usarse un crecimiento bacteriano en placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Middlebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC, MBCheck). Este test no puede usarse para detectar micobacterias directamente de muestras de pacientes. La zona de trabajo ha de estar libre de ADN amplicado. Es crucial el calentamiento de las muestras a 95°C durante, al menos, 20 minutos con objeto de inactivar bacterias vegetativas. Se puede seguir cualquier procedimiento de extracción de ADN que produzca ADN de bacterias amplicable. El siguiente protocolo rápido normalmente produce ADN adecuado para amplicación: 1a. Cuando use crecimiento bacteriano en medio sólido, recoja las colonias de bacterias con

un asa de inoculación y suspéndalas en aproximadamente 300 μl de agua (grado Biología Molecular). 1b. Cuando use crecimiento bacteriano procedente de medio líquido, aplique directamente 1 ml. Concentre las bacterias mediante centrifugación 15 min en una centrífuga de sobremesa en un rotor con contenedor de aerosoles y en una cabina de seguridad de clase II a 10000 x g aproximadamente. Deseche el sobrenadante y resuspenda las bacterias en 100-300 μL de agua (ver más arriba) con un vórtex. 2. Incube las bacterias procedentes del apartado 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño de agua. 3 Incube durante 15 min en un baño de ultrasonidos. 4 Centrifugue durante 5 min a máxima velocidad y utilice directamente 5 μl del sobrenadante para la PCR. En caso de que la solución de ADN haya de almacenarse por períodos prolongados de tiempo, transera el sobrenadante a un tubo nuevo.

AMPLIFICACIÓN Prepare la mezcla de amplicación (45 μL) en una habitación libre de ADN. La muestra debe añadirse en un área separada. Mezcle por tubo: –35 µL de PNM – suministrado –5 µL 10x de tampón para incubación de polimerasa – no suministrado. –x µL de solución MgCl 1) – no suministrado –1-2 unidades de DNA polimerasa termoestable (consulte el manual) – no suministrado –y µL de agua para obtener un volumen de 45 µl (sin considerar el volumen de enzima) – no suministrado. –Añada 5 µL de solución de ADN (20-100 ng de ADN) para obtener un volumen nal de 50 µL (sin considerar el volumen de enzima). 1) Dependiendo del sistema enzima/tampón usado, la concentración óptima de MgCl puede variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta que algunos tampones para incubación ya contienen MgCl . La evaluación del rendimiento del ensayo GenoType Mycobacterium AS fue realizada utilizando la Polimerasa HotStarTaq DNA de Qiagen. Las cantidades necesarias por muestra cuando utilice esta enzima son las siguientes:


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–35 µL de PNM – suministrado –5 µL 10x PCR Buer de la HotStarTaq (contiene 15 mM de MgCl2) – no suministrado –2 µL25 mM de solución MgCl2 – no suministrado –0,2 µL (1 U) de HotStarTaq – no suministrado –3 µL de agua (para uso en biología molecular) – no suministrado –5 µL de solución de DNA (añada el DNA en una zona distinta) La concentración nal de MgCL2 en la mezcla de amplicación será de 2,5 mM. Determine el número de muestras a amplicar (número de muestras a analizar más las muestras de control). Por ejemplo, un control de contaminación contiene 5 µL de agua en lugar de solución de ADN. Prepare una mezcla que contenga todos los reactivos excepto la solución de ADN y mezcle bien. No utilice vórtex. Alicuote la mezcla madre en volúmenes de 45 µL en tubos preparados de PCR. 2) Perl de amplicación *)

Los productos para amplicación pueden alma cenarse entre–20°CY 8 °C Para comprobar la reacción de amplicación, aplique directamente 5 μl de cada muestra a un gel de agarosa al 2% sin la adición de tampón de carga. Los amplicones tienen una longitud aproximada de 230 pb (Control de Género) y 200 pb (Control Universal/amplicon especie-especíco).

HIBRIDACIÓN Preparación Precaliente en baño de agua con agitación o TwinCubator a 45°C; la máxima desviación tolerada en la temperatura idónea es de +/–1°C. Precaliente las soluciones HYB y STR a 3745°C antes de usar. Los reactivos han de estar libres de precipitado (tenga en cuenta, no obstante que la solución CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. Caliente a temperatura ambiente los restantes reactivos, con la excepción del CON-C y el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 con sus tampones respectivos (CON-C con CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperatura ambiente. Para cada tira añada 10 μL de concentrado a 1 mlL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso. El SUB-C diluído es estable durante 4 semanas si se almacena a temperatura ambiente y se protege de la luz. 1. Dispense 20 μL de la Solución de Desnatu ralización (DEN, azul) en una esquina de cada uno de los pocillos usados. 2. Añada a la solución 20 μL de muestra amplicada, pipetee arriba y abajo para mezclar bien e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos usando pinzas e identifíquelas marcando bajo el marcador coloreado con un lápiz. Lleve siempre guantes cuando manipule tiras. 3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL de Tampón de Hibridación (HYB, verde) precalentado. Agite suavemente la bandeja hasta que la solución tenga un color homogéneo. Tenga la precaución de no derramar solución en los pocillos cercanos. 4. Ponga una tira en cada pocillo. Las tiras tienen que quedar completamente cubiertas por la solución y el lado con la sonda hacia arriba (identicable por el marcador coloreado próximo al extremo inferior). Usando pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran haberse girado durante su inmersión. Limpie cuidadosamente las pinzas después de cada uso para evitar contaminación. Ello, es también de aplicación en los pasos siguientes.


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crementada del fondo y podría dicultar la inter pretación de los resultados. 12. Detenga la reacción aclarando brevemente 5. Ponga la bandeja en el baño de agua con por dos veces con agua destilada. agitación o en el TwinCubator durante 30 minu- 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bandetos a 45°C. ja y séquelas entre dos capas de papel absor Ajuste la frecuencia de agitación del baño de bente. agua para que realice una mezcla completa y constante de la solución. Para obtener una RESULTADOS E INTERPRETACIÓN adecuada transferencia de calor, la bandeja Pegue las tiras y almacénelas protegidas de la debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 luz. Con cada kit se proporciona un formulario de su altura. de evaluación. Cuando se utilice este formula6. Aspire completamente el Tampón de Hibri- rio de evaluación, pegue las tiras reveladas en dación. los campos marcados, alineando las bandas Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada CC y UC con las respectivas líneas del formua una bomba de vacío. lario. Anote el número de las bandas positivas 7. Añada 1 mL de Solución de Lavado Astrin- en la penúltima columna y determine la especie gente (STR, roja) a cada tira e incube durante con la ayuda de la tabla de interpretación y re15 minutos a 45°C en un baño con agitación o gistre el nombre de las especies identicadas TwinCubator. en la última columna. La plantilla suministrada Desde este paso, en adelante, trabaje a tem- también sirve como ayuda para evaluación y ha peratura ambiente. Elimine completamente la de ser alineada con las bandas UC y CC de la Solución de Lavado Astringente. tira. Cada tira tiene un total de 17 zonas de reDeseche la Solución de Lavado en un contene- acción (ver esquema). dor y elimine todo el líquido restante volcando la bandeja y golpeándola suavemente sobre un papel absorbente. Ello es también de aplicación a todos los demás pasos de lavado. 8. Lave una vez cada tira con 1 mL de Solución de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agitado del TwinCubator (elimine el RIN después de la incubación). 9. Añada 1 mL de Conjugado diluído (ver más arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos sobre la plataforma de agitado del TwinCubator. 10. Elimine la solución y lave cada tira dos veces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto aproximadamente con 1 ml de agua destilada Control de Conjugado (CC) (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de Debe aparecer una línea en esta zona, docuagitación del TwinCubator (deseche la solución mentando la ecacia del conjugado unido y la cada vez). reacción del sustrato. Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua Control Universal (UC) después del lavado anterior. 11. Añada 1 mL de sustrato diluído (ver más Esta zona detecta, como es conocido, todas las arriba) a cada tira e incube sin agitación y pro- micobacterias y miembros del grupo de bacterias gram-positivas con alto contenido de G+C. tegiéndolas de la luz. Si esta zona y el Control de Conjugado se tiñen Dependiendo de las condiciones del test (por como positivas, pero el restante esquema de ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in- bandas no puede ser asignado a una micobaccubación del sustrato puede variar entre 3 y 20 teria especíca, se deben aplicar métodos adi minutos. Tiempos prolongados de incubación cionales para identicar la especie bacteriana del sustrato pueden conducir a una tinción in- correspondiente. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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contenido en G+C puede, en casos raros, estar originado por una Micobacteria que no puede Control de Género (GC) ser detectada por este kit. Por favor, tenga en La coloración en esta zona documenta, como cuenta que puede identicar especias adiciona conocida, la presencia de un miembro del gé- les de micobacterias con el kit GenoType Myconero Mycobacterium. La intensidad de esta bacterium AS. banda varía dependiendo de la especie de Micobacteria. Otras bandas La banda del Control de Género puede desapa- Sondas Especícas; para la evaluación ver la recer a pesar de la presencia de DNA micobac- tabla de interpretación. teriano; sin embargo, siempre que esté presente un patrón de bandeo especíco de especie, No todas las bandas de una tira han de mostrar la reacción de amplicación se llevó acabo co - la misma intensidad. rrectamente y el resultado del ensayo es válido. Si fue usada una gran cantidad de amplicón, Cuando no aparece patrón de bandas especí- pueden aparecer bandas adicionales. co de especie, un patrón que indique la pre sencia de una bacteria gram-positiva con alto TABLA DE INTERPRETACIÓN

Cuando utilice bacterias crecidas en medio lí- idéntica morfología de colonias). quido, la contaminación bacteriana puede posiblemente generar el mismo patrón de bandas. Este resultado, por tanto, es válido únicamente cuando el DNA fue aislado del crecimiento bacteriano en medio sólido (colonias individuales/ Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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2) M. nebraskense muestra el mismo patrón de bandas que M. haemophilum. 3) Si se genera este patrón de bandas con el kit GenoType Mycobacterium AS, se puede diferencia entre M. szulgai y M. intermedium utilizando GenoType Mycobacterium CM.. M szulgai mostrará bandeo en las bandas 1, 2, 3, 10 y 11, y M. Intermedium mostrará bandeo en las bandas 1, 2, 3 y 10. 4) Debido a variaciones de secuencia M. kan sasii puede producir 4 patrones diferentes de bandeo.

PRECAUCIONES Almacene la Mezcla del Primer/Nucleótido (PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cualquier fuente potencial de DNA contaminante. Si se requiere almacenar durante más de 4 semanas, almacene a –20°C. A n de evitar congelaciones y descongelaciones repetidas, alicuote el PNM. Almacene el resto de los componentes del kit en 2-8°C. No utilice los reactivos después de su fecha de caducidad. Los especímenes de los pacientes y los cultivos realizados a partir de especímenes de pacientes deben ser considerados siempre como potencialmente infecciosos. Las muestras de pacien-

tes de riesgo (infectados por microorganismos patógenos incluyendo Hepatitis B y Virus de Inmunodeciencia Humana (VIH)) y los cultivos realizados a partir de esas muestras deben ser etiquetados y manejados siempre bajo las condiciones de seguridad adecuadas, de acuerdo con las guías institucionales. Observe todas las normas medioambientales y de seguridad, tanto federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada. El tratamiento y preparación de la muestra, incluyendo el paso de inactivación por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II. Antes del paso de inactivación por calor las muestras deben ser centrifugadas en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir el rotor con contenedor de aerosoles solamente en la cabina de seguridad. Después de la inactivación por calor se puede utilizar un rotor standard para centrifugar las muestras fuera de la cabina de seguridad. Observe las precauciones normales para preparar la amplicación. Es esencial que todos los materiales y reactivos usados para extracción de DNA y amplicación estén libres de DNasas.


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Cuando manipule los reactivos del kit debe tomar las siguientes medidas especiales de seguridad: La Solución de Desnaturalización (DEN) contiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel. El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Dimetil Sulfóxido y es irritante.

LIMITACIONES Antes de la amplicación, el ADN ha de ser aislado de cultivo bacteriano realizado por un método idóneo. Ha de tenerse la seguridad de que la muestra de ADN ha sido amplicada ecientemente durante la reacción de amplicación. El test sólo funciona dentro de los límites de las regiones genómicas para las que los primers y sondas han sido elegidos. El análisis de secuencias potenciales permanece reservado para la reanudación de investigaciones. La presencia de múltiples especies de bacterias en la muestra a analizar puede dicultar la interpretación de resultados. Como cualquier sistema de detección basado en la hibridación, este sistema contempla la posibilidad de que variaciones de las secuencias en las regiones genómicas que fueron elegidas para los primers y sondas, y la detección de regiones para las cuales el kit no fue diseñado, pueden conducir a resultados falsos. Debido a la gran variabilidad existente en los genomas bacterianos es posible que ciertos subtipos puedan no ser detectados. El test reeja los conocimientos de Hain Life- science. La utilización de este ensayo está limitada a personas cualicadas, bien entrenadas en el procedimiento de utilización del ensayo y familiarizadas con métodos de biología molecular. La evaluación de este sistema de análisis fue llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polimerasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las características de rendimiento de este ensayo no han sido validadas para todas las polimerasas disponibles comercialmente, el usuario es el encargado de evaluar la aplicabilidad de otras polimerasas distintas de las arriba mencionadas. 9.6. IDENTIFICACIÓN DEL COMPLEJO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

(GenoType MTBC) PRINCIPIO El kit GenoType MTBC está basado en la tecnología DNA•STRIP que permite en base a los polimorsmos genéticos, por los que la ADN girasa B diferencia genéticamete de especies/ cepas pertenecientes al grupo Mycobacterium tuberculosis complex: M. africanum, M. bovis BCG, M. bovis ssp. bovis, M. bovis ssp. caprae, M. microti, y M. tuberculosis/“M. canettii”. El procedimiento completo se divide en tres pasos: extracción de ADN procedente de cultivo (placas de cultivo/medio líquido; los reactivos necesarios no se suministran), una amplica ción múltiplex con primers marcados con biotina (la ADN polimerasa termoestable no se incluye), y una hibridación reversa. La hibridación incluye los siguientes pasos: desnaturalización química del producto a amplicar; hibridación de amplicones de una sola cadena, marcados con biotina, a sondas unidas a membrana; lavado astringente; adición de conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una reacción de tinción mediada por AP. Una plantilla asegura la interpretación sencilla y rápida del esquema de bandas obtenido. MATERIALES –Agua destilada (para uso en biología molecular) – Baño de agua –Baño de agua con agitación/TwinCubator –Baño de ultrasonidos –Centrífuga de mesa –Cronómetro –ADN polimerasa termoestable con tampón (recomendación: HotStarTaq DNA Polymerase de Qiagen) –Guantes desechables –Papel absorbente –Pinzas –Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μl –Plataforma de agitación/TwinCubator –Probeta graduada –Puntas de pipeta desechables con ltro –Reactivos para extracción de DNA, así como equipos necesarios –Termociclador (rango de calentamiento 3°C/ seg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión +/–0,2°C) – Termómetro calibrado – Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa


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dad y utilice directamente 5 μL del sobrenadante para la PCR. En caso de que la solución de PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ADN haya de almacenarse por períodos prolonLas muestras para extracción son a partir de gados de tiempo, transera el sobrenadante a colonias aisladas de cultivo sólido, suspendidas un tubo nuevo. en 300 μl agua ultrapura libre de DNasa y RNasa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. AMPLIFICACIÓN Las muestras también pueden extraerse a partir Prepare la mezcla de amplicación (45 μL) en de cultivos positivos en medio líquido, se trasla- una habitación libre de ADN. La muestra debe da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de añadirse en un área separada. DNasa y RNasa. Mezcle por tubo: PROCEDIMIENTO –35 µL de AM B – suministrado –10 µL de AM A- suministrado EXTRACCIÓN DE ADN –Añada 5 µL de solución de ADN (20-100 ng de Puede usarse un crecimiento bacteriano en ADN) para obtener un volumen nal de 50 µL placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi- (sin considerar el volumen de enzima). ddlebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC, MB-Check). Este test no puede usarse para Determine el número de muestras a amplicar detectar micobacterias directamente de mues- (número de muestras a analizar más las muestras de pacientes. La zona de trabajo ha de es- tras de control). Por ejemplo, un control de contar libre de ADN amplicado. Es crucial el ca- taminación contiene 5 µL de agua en lugar de lentamiento de las muestras a 95°C durante, solución de ADN. Prepare una mezcla que conal menos, 20 minutos con objeto de inactivar tenga todos los reactivos excepto la solución de bacterias vegetativas. Se puede seguir cual- ADN y mezcle bien. No utilice vórtex. Alicuote la quier procedimiento de extracción de ADN que mezcla madre en volúmenes de 45 µl en tubos produzca ADN de bacterias amplicable. El si- preparados de PCR. guiente protocolo rápido normalmente produce ADN adecuado para amplicación: 2) Perl de amplicación *) 1a. Cuando use crecimiento bacteriano en medio sólido, recoja las colonias de bacterias con un asa de inoculación y suspéndalas en aproximadamente 300 μl de agua (grado Biología Molecular). 1b. Cuando use crecimiento bacteriano procedente de medio líquido, aplique directamente 1 mL. Concentre las bacterias mediante centrifugación 15 min en una centrífuga de sobremesa en un rotor con contenedor de aerosoles y en una cabina de seguridad de clase II a 10000 x g aproximadamente. Deseche el sobrenadante y resuspenda las bacterias en 100-300 μL de agua (ver más arriba) con un vórtex. 2. Incube las bacterias procedentes del apartado 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño de agua. 3 Incube durante 15 min en un baño de ultrasonidos. 4 Centrifugue durante 5 min a máxima veloci-

Los productos para amplicación pueden al macenarse entre –20°C y 8°C. Para comprobar la reacción de amplicación, aplique directamente 5 μL de cada muestra a un gel de agarosa al 2% sin la adición de tampón de carga. Los amplicones tienen una longitud aproximada de 230 pb (Control de Género) y 200 pb (Control Universal/amplicon especie-especíco).


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HIBRIDACIÓN Preparación Precaliente en baño de agua con agitación o TwinCubator a 45°C; la máxima desviación tolerada en la temperatura idónea es de +/–1°C. Precaliente las soluciones HYB y STR a 3745°C antes de usar. Los reactivos han de estar libres de precipitado (tenga en cuenta, no obstante que la solución CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. Caliente a temperatura ambiente los restantes reactivos, con la excepción del CON-C y el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 con sus tampones respectivos (CON-C con CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperatura ambiente. Para cada tira añada 10 μL de concentrado a 1 mL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso. El SUB-C diluído es estable durante 4 semanas si se almacena a temperatura ambiente y se protege de la luz. 1. Dispense 20 μL de la Solución de Desnatu ralización (DEN, azul) en una esquina de cada uno de los pocillos usados. 2. Añada a la solución 20 μL de muestra am plicada, pipetee arriba y abajo para mezclar bien e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos usando pinzas e identifíquelas marcando bajo el marcador coloreado con un lápiz. Lleve siempre guantes cuando manipule tiras. 3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL de Tampón de Hibridación (HYB, verde) precalentado. Agite suavemente la bandeja hasta que la solución tenga un color homogéneo. Tenga la precaución de no derramar solución en los pocillos cercanos. 4. Ponga una tira en cada pocillo. Las tiras tienen que quedar completamente cubiertas por la solución y el lado con la sonda hacia arriba (identicable por el marcador coloreado próximo al extremo inferior). Usando pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran haberse girado durante su inmersión. Limpie cuidadosamente las pinzas después de cada uso

para evitar contaminación. Ello, es también de aplicación en los pasos siguientes. 5. Ponga la bandeja en el baño de agua con agitación o en el TwinCubator durante 30 minutos a 45°C. Ajuste la frecuencia de agitación del baño de agua para que realice una mezcla completa y constante de la solución. Para obtener una adecuada transferencia de calor, la bandeja debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de su altura. 6. Aspire completamente el Tampón de Hibridación. Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío. 7. Añada 1 mL de Solución de Lavado Astringente (STR, roja) a cada tira e incube durante 15 minutos a 45°C en un baño con agitación o TwinCubator. Desde este paso, en adelante, trabaje a temperatura ambiente. Elimine completamente la Solución de Lavado Astringente. Deseche la Solución de Lavado en un contenedor y elimine todo el líquido restante volcando la bandeja y golpeándola suavemente sobre un papel absorbente. Ello es también de aplicación a todos los demás pasos de lavado. 8. Lave una vez cada tira con 1 mL de Solución de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agitado del TwinCubator (elimine el RIN después de la incubación). 9. Añada 1 mL de Conjugado diluído (ver más arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos sobre la plataforma de agitado del TwinCubator. 10. Elimine la solución y lave cada tira dos veces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto aproximadamente con 1 ml de agua destilada (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de agitación del TwinCubator (deseche la solución cada vez). Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua después del lavado anterior. 11. Añada 1 mL de sustrato diluído (ver más arriba) a cada tira e incube sin agitación y pro tegiéndolas de la luz. Dependiendo de las condiciones del test (por ej. la temperatura ambiente), el tiempo de incubación del sustrato puede variar entre 3 y 20 minutos.


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Si esta zona y el Control de Conjugado se tiñen como positivas, pero el restante esquema de bandas no puede ser asignado a una micobacteria especíca, se deben aplicar métodos adicionales para identicar la especie bacteriana correspondiente. Solamente han de considerarse aquellas bandas cuyas intensidades sean tan fuertes, o más fuertes, que la intensidad del Control Universal.

Tiempos prolongados de incubación del sustrato pueden conducir a una tinción incrementada del fondo y podría dicultar la interpretación de los resultados. 12. Detenga la reacción aclarando brevemente por dos veces con agua destilada. 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande ja y séquelas entre dos capas de papel absorMTBC bente. Esta zona hibrida, como es conocido, con ampliRESULTADOS E INTERPRETACIÓN cones generados de todos los miembros conoPegue las tiras y almacénelas protegidas de la cidos de Mycobacterium tuberculosis complex. luz. Con cada kit se proporciona un formulario Otras bandas de evaluación. Cuando se utilice este formulario Sondas Especícas; para la evaluación ver la de evaluación, pegue las tiras reveladas en los tabla de interpretación. campos marcados, alineando las bandas CC y UC con las respectivas líneas del formulario. No todas las bandas de una tira han de mostrar Anote el número de las bandas positivas en la la misma intensidad. penúltima columna y determine la especie con Si fue usada una gran cantidad de amplicón, la ayuda de la tabla de interpretación y registre pueden aparecer bandas adicionales. el nombre de las especies identicadas en la última columna. La plantilla suministrada tam- TABLA DE INTERPRETACIÓN bién sirve como ayuda para evaluación y ha de ser alineada con las bandas UC y CC de la tira. Cada tira tiene un total de 13 zonas de reacción (ver esquema).

Control de Conjugado (CC) Debe aparecer una línea en esta zona, documentando la ecacia del conjugado unido y la reacción del sustrato. Control Universal (UC) Esta zona detecta, como es conocido, todas las micobacterias y miembros del grupo de bacterias gram-positivas con alto contenido de G+C.

PRECAUCIONES Almacene la Mezcla del Primer/Nucleótido (PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cual quier fuente potencial de ADN contaminante. Si se requiere almacenar durante más de 4 semanas, almacene a –20°C. A n de evitar conge laciones y descongelaciones repetidas, alicuote el PNM. Almacene el resto de los componentes del kit en 2-8°C. No utilice los reactivos después de su fecha de caducidad.


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Los especímenes de los pacientes y los cultivos realizados a partir de especímenes de pacientes deben ser considerados siempre como potencialmente infecciosos. Las muestras de pacientes de riesgo (infectados por microorganismos patógenos incluyendo Hepatitis B y Virus de Inmunodeciencia Humana (VIH)) y los cultivos realizados a partir de esas muestras deben ser etiquetados y manejados siempre bajo las condiciones de seguridad adecuadas, de acuerdo con las guías institucionales. Observe todas las normas medioambientales y de seguridad, tanto federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada. El tratamiento y preparación de la muestra, incluyendo el paso de inactivación por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II. Antes del paso de inactivación por calor las muestras deben ser centrifugadas en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir el rotor con contenedor de aerosoles solamente en la cabina de seguridad. Después de la inactivación por calor se puede utilizar un rotor standard para centrifugar las muestras fuera de la cabina de seguridad. Observe las precauciones normales para preparar la amplicación. Es esencial que todos los materiales y reactivos usados para extracción de ADN y amplicación estén libres de DNasas. Cuando manipule los reactivos del kit debe tomar las siguientes medidas especiales de seguridad: La Solución de Desnaturalización (DEN) contiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel. El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Dimetil Sulfóxido y es irritante.

LIMITACIONES Antes de la amplicación, el ADN ha de ser aislado de cultivo bacteriano realizado por un método idóneo. Ha de tenerse la seguridad de que la muestra de ADN ha sido amplicada ecientemente durante la reacción de amplicación. El test sólo funciona dentro de los límites de las regiones genómicas para las que los primers y sondas han sido elegidos. El análisis de

secuencias potenciales permanece reservado para la reanudación de investigaciones. La presencia de múltiples especies de bacterias en la muestra a analizar puede dicultar la interpretación de resultados. Como cualquier sistema de detección basado en la hibridación, este sistema contempla la posibilidad de que variaciones de las secuencias en las regiones genómicas que fueron elegidas para los primers y sondas, y la detección de regiones para las cuales el kit no fue diseñado, pueden conducir a resultados falsos. Debido a la gran variabilidad existente en los genomas bacterianos es posible que ciertos subtipos puedan no ser detectados. El test reeja los conocimientos de Hain Life- science. La utilización de este ensayo está limitada a personas cualicadas, bien entrenadas en el procedimiento de utilización del ensayo y familiarizadas con métodos de biología molecular. La evaluación de este sistema de análisis fue llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polimerasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las características de rendimiento de este ensayo no han sido validadas para todas las polimerasas disponibles comercialmente, el usuario es el encargado de evaluar la aplicabilidad de otras polimerasas distintas de las arriba mencionadas.

9.5. IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES ADICIONALES (GenoType Mycobacterium AS) PRINCIPIO El kit GenoType Mycobacterium AS (Additinonal Species) está basado en la tecnología DNA•STRIP y permite la identicación de las siguientes especies de micobacterias: M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M. celatum, M. smegmatis, M. genavense, M. lentiavum, M. heckeshornense, M. szulgai/M. intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum, y M. shimoidei.


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de cultivos positivos en medio líquido, se traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de El procedimiento completo se divide en tres pa- DNasa y RNasa. sos: aislamiento de ADN procedente de cultivo (placas de cultivo/medio líquido; los reactivos PROCEDIMIENTO necesarios no se suministran), una amplica - EXTRACCIÓN DE ADN ción múltiplex con primers marcados con biotina Puede usarse un crecimiento bacteriano en pla(la ADN polimerasa termoestable no se incluye), cas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Middy una hibridación reversa. lebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC, MBLa hibridación incluye los siguientes pasos: des- Check). Este test no puede usarse para detectar naturalización química del producto a amplicar; micobacterias directamente de muestras de pahibridación de amplicones de una sola cadena, cientes. La zona de trabajo ha de estar libre de marcados con biotina, a sondas unidas a mem- ADN amplicado. Es crucial el calentamiento brana; lavado astringente; adición de conjugado de las muestras a 95°C durante, al menos, 20 de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una minutos con objeto de inactivar bacterias vegereacción de tinción mediada por AP. Una planti- tativas. Se puede seguir cualquier procedimienlla asegura la interpretación sencilla y rápida del to de extracción de ADN que produzca ADN de esquema de bandas obtenido. bacterias amplicable. El siguiente protocolo rápido normalmente produce ADN adecuado para MATERIALES amplicación: – Agua destilada (para uso en biología molecu- Cuando use crecimiento bacteriano en medio lar) sólido, recoja las colonias de bacterias con un – Baño de agua asa de inoculación y suspéndalas en aproxima – Baño de agua con agitación/TwinCubator damente 300 μl de agua (grado Biología Mole – Baño de ultrasonidos cular). – Centrífuga de mesa 1b. Cuando use crecimiento bacteriano proce – Cronómetro dente de medio líquido, aplique directamente 1 – ADN polimerasa termoestable con tampón ml. Concentre las bacterias mediante centrifu(recomendación: HotStarTaq DNA Polymerase gación 15 min en una centrífuga de sobremesa de Qiagen) en un rotor con contenedor de aerosoles y en – Guantes desechables una cabina de seguridad de clase II a 10000 x – Papel absorbente g aproximadamente. Deseche el sobrenadante – Pinzas y resuspenda las bacterias en 100-300 μL de – Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μl agua (ver más arriba) con un vórtex. – Plataforma de agitación/TwinCubator 2. Incube las bacterias procedentes del aparta – Probeta graduada do 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño – Puntas de pipeta desechables con ltro de agua. – Reactivos para extracción de ADN, así como 3 Incube durante 15 min en un baño de ultrasoequipos necesarios nidos. – Termociclador (rango de calentamiento 3°C/ 4 Centrifugue durante 5 min a máxima velociseg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión dad y utilice directamente 5 μl del sobrenadan+/–0,2°C) te para la PCR. En caso de que la solución de – Termómetro calibrado ADN haya de almacenarse por períodos prolon – Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa gados de tiempo, transera el sobrenadante a un tubo nuevo. PREPARACIÒN DE LA MUESTRA Las muestras para extracción son a partir de AMPLIFICACIÓN colonias aisladas de cultivo sólido, suspendidas Prepare la mezcla de amplicación (45 μL) en en 300 μl agua ultrapura libre de DNasa y RNa- una habitación libre de ADN. La muestra debe sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. añadirse en un área separada. Las muestras también pueden extraerse a partir Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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2) Perl de amplicación *) Mezcle por tubo: –35 µL de PNM – suministrado –5 µL 10x de tampón para incubación de polimerasa – no suministrado. –x µL de solución MgCl 1) – no suministrado –1-2 unidades de DNA polimerasa termoestable (consulte el manual) – no suministrado –y µL de agua para obtener un volumen de 45 µl (sin considerar el volumen de enzima) – no suministrado. –Añada 5 µL de solución de ADN (20-100 ng de ADN) para obtener un volumen nal de 50 µL (sin considerar el volumen de enzima). 1) Dependiendo del sistema enzima/tampón usado, la concentración óptima de MgCl puede variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta que algunos tampones para incubación ya contienen MgCl . Los productos para amplicación pueden almacenarse entre–20°CY 8 °C La evaluación del rendimiento del ensayo Ge- Para comprobar la reacción de amplicación, noType Mycobacterium AS fue realizada uti- aplique directamente 5 μl de cada muestra a un lizando la Polimerasa HotStarTaq DNA de Qia- gel de agarosa al 2% sin la adición de tampón gen. Las cantidades necesarias por muestra de carga. Los amplicones tienen una longitud cuando utilice esta enzima son las siguientes: aproximada de 230 pb (Control de Género) y 200 pb (Control Universal/amplicon espe –35 µL de PNM – suministrado cie-especíco). –5 µL 10x PCR Buer de la HotStarTaq (contieHIBRIDACIÓN ne 15 mM de MgCl2) – no suministrado –2 µL25 mM de solución MgCl2 – no suminis- Preparación trado Precaliente en baño de agua con agitación o –0,2 µL (1 U) de HotStarTaq – no suministrado TwinCubator a 45°C; la máxima desviación to –3 µL de agua (para uso en biología molecular) lerada en la temperatura idónea es de +/–1°C. – no suministrado Precaliente las soluciones HYB y STR a 37 –5 µL de solución de DNA (añada el DNA en 45°C antes de usar. una zona distinta) Los reactivos han de estar libres de precipitado La concentración nal de MgCL2 en la mezcla (tenga en cuenta, no obstante que la solución de amplicación será de 2,5 mM. CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. Caliente a temperatura ambiente los restanDetermine el número de muestras a amplicar tes reactivos, con la excepción del CON-C y (número de muestras a analizar más las mues- el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el tras de control). Por ejemplo, un control de con- Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el taminación contiene 5 µL de agua en lugar de Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 solución de ADN. Prepare una mezcla que con- con sus tampones respectivos (CON-C con tenga todos los reactivos excepto la solución de CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades ADN y mezcle bien. No utilice vórtex. Alicuote la necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperamezcla madre en volúmenes de 45 µL en tubos tura ambiente. Para cada tira añada 10 μL de preparados de PCR. concentrado a 1 mlL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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El SUB-C diluído es estable durante 4 semanas si se almacena a temperatura ambiente y se protege de la luz. 1. Dispense 20 μL de la Solución de Desnaturalización (DEN, azul) en una esquina de cada uno de los pocillos usados. 2. Añada a la solución 20 μL de muestra amplicada, pipetee arriba y abajo para mezclar bien e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos usando pinzas e identifíquelas marcando bajo el marcador coloreado con un lápiz. Lleve siempre guantes cuando manipule tiras. 3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL de Tampón de Hibridación (HYB, verde) precalentado. Agite suavemente la bandeja hasta que la solución tenga un color homogéneo. Tenga la precaución de no derramar solución en los pocillos cercanos. 4. Ponga una tira en cada pocillo. Las tiras tienen que quedar completamente cubiertas por la solución y el lado con la sonda hacia arriba (identicable por el marcador coloreado próximo al extremo inferior). Usando pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran haberse girado durante su inmersión. Limpie cuidadosamente las pinzas después de cada uso para evitar contaminación. Ello, es también de aplicación en los pasos siguientes. 5. Ponga la bandeja en el baño de agua con agitación o en el TwinCubator durante 30 minutos a 45°C. Ajuste la frecuencia de agitación del baño de agua para que realice una mezcla completa y constante de la solución. Para obtener una adecuada transferencia de calor, la bandeja debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de su altura. 6. Aspire completamente el Tampón de Hibridación. Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío. 7. Añada 1 mL de Solución de Lavado Astringente (STR, roja) a cada tira e incube durante 15 minutos a 45°C en un baño con agitación o TwinCubator. Desde este paso, en adelante, trabaje a temperatura ambiente. Elimine completamente la

Solución de Lavado Astringente. Deseche la Solución de Lavado en un contenedor y elimine todo el líquido restante volcando la bandeja y golpeándola suavemente sobre un papel absorbente. Ello es también de aplicación a todos los demás pasos de lavado. 8. Lave una vez cada tira con 1 mL de Solución de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agitado del TwinCubator (elimine el RIN después de la incubación). 9. Añada 1 mL de Conjugado diluído (ver más arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos sobre la plataforma de agitado del TwinCubator. 10. Elimine la solución y lave cada tira dos veces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto aproximadamente con 1 ml de agua destilada (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de agitación del TwinCubator (deseche la solución cada vez). Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua después del lavado anterior. 11. Añada 1 mL de sustrato diluído (ver más arriba) a cada tira e incube sin agitación y pro tegiéndolas de la luz. Dependiendo de las condiciones del test (por ej. la temperatura ambiente), el tiempo de incubación del sustrato puede variar entre 3 y 20 minutos. Tiempos prolongados de incubación del sustrato pueden conducir a una tinción incrementada del fondo y podría dicultar la inter pretación de los resultados. 12. Detenga la reacción aclarando brevemente por dos veces con agua destilada. 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande ja y séquelas entre dos capas de papel absorbente.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN Pegue las tiras y almacénelas protegidas de la luz. Con cada kit se proporciona un formulario de evaluación. Cuando se utilice este formulario de evaluación, pegue las tiras reveladas en los campos marcados, alineando las bandas CC y UC con las respectivas líneas del formulario. Anote el número de las bandas positivas en la penúltima columna y determine la especie con la ayuda de la tabla de interpretación y registre el nombre de las especies identicadas en la última columna.


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especie, la reacción de amplicación se llevó acabo correctamente y el resultado del ensayo La plantilla suministrada también sirve como es válido. ayuda para evaluación y ha de ser alineada Cuando no aparece patrón de bandas especícon las bandas UC y CC de la tira. Cada tira co de especie, un patrón que indique la pretiene un total de 17 zonas de reacción (ver es - sencia de una bacteria gram-positiva con alto quema). contenido en G+C puede, en casos raros, estar originado por una Micobacteria que no puede ser detectada por este kit. Por favor, tenga en cuenta que puede identicar especias adicio nales de micobacterias con el kit GenoType Mycobacterium AS. Otras bandas Sondas Especícas; para la evaluación ver la tabla de interpretación. No todas las bandas de una tira han de mostrar la misma intensidad. Si fue usada una gran cantidad de amplicón, pueden aparecer bandas adicionales.

Control de Conjugado (CC) TABLA DE INTERPRETACIÓN Debe aparecer una línea en esta zona, documentando la ecacia del conjugado unido y la reacción del sustrato. Control Universal (UC) Esta zona detecta, como es conocido, todas las micobacterias y miembros del grupo de bacterias gram-positivas con alto contenido de G+C. Si esta zona y el Control de Conjugado se tiñen como positivas, pero el restante esquema de bandas no puede ser asignado a una micobacteria especíca, se deben aplicar métodos adicionales para identicar la especie bacteriana correspondiente. Solamente han de considerarse aquellas bandas cuyas intensidades sean tan fuertes, o más fuertes, que la intensidad del Control Universal. Control de Género (GC) La coloración en esta zona documenta, como conocida, la presencia de un miembro del género Mycobacterium. La intensidad de esta banda varía dependiendo de la especie de Micobacteria. La banda del Control de Género puede desaparecer a pesar de la presencia de DNA micobacteriano; sin embargo, siempre que esté presente un patrón de bandeo especíco de

Cuando utilice bacterias crecidas en medio líquido, la contaminación bacteriana puede posiblemente generar el mismo patrón de bandas. Este resultado, por tanto, es válido únicamente cuando el DNA fue aislado del crecimiento bacteriano en medio sólido (colonias individuales/ idéntica morfología de colonias).


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de acuerdo con las guías institucionales. Observe todas las normas medioambientales y de seguridad, tanto federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada. El tratamiento y preparación de la muestra, incluyendo el paso de inactivación por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II. Antes del paso de inactivación por calor las muestras deben ser centrifugadas en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir el rotor con contenedor de aerosoles solamente en la cabina de seguridad. Después de la inactivación por calor se puede utilizar un rotor standard para centrifugar las muestras fuera de la cabina de seguridad. Observe las precauciones normales para preparar la amplicación. Es esencial que todos los materiales y reactivos usados para extracción 2) M. nebraskense muestra el mismo patrón de de DNA y amplicación estén libres de DNasas. bandas que M. haemophilum. 3) Si se genera este patrón de bandas con el Cuando manipule los reactivos del kit debe tokit GenoType Mycobacterium AS, se puede di- mar las siguientes medidas especiales de seferencia entre M. szulgai y M. intermedium utili- guridad: zando GenoType Mycobacterium CM.. M szul- La Solución de Desnaturalización (DEN) contiegai mostrará bandeo en las bandas 1, 2, 3, 10 ne <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel. y 11, y M. Intermedium mostrará bandeo en las El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Dibandas 1, 2, 3 y 10. metil Sulfóxido y es irritante. 4) Debido a variaciones de secuencia M. kansasii puede producir 4 patrones diferentes de LIMITACIONES bandeo. Antes de la amplicación, el ADN ha de ser aislado de cultivo bacteriano realizado por un méPRECAUCIONES todo idóneo. Ha de tenerse la seguridad de que Almacene la Mezcla del Primer/Nucleótido la muestra de ADN ha sido amplicada ecien (PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cual- temente durante la reacción de amplicación. quier fuente potencial de DNA contaminante. Si El test sólo funciona dentro de los límites de las se requiere almacenar durante más de 4 sema- regiones genómicas para las que los primers nas, almacene a –20°C. A n de evitar congela- y sondas han sido elegidos. El análisis de seciones y descongelaciones repetidas, alicuote cuencias potenciales permanece reservado el PNM. Almacene el resto de los componentes para la reanudación de investigaciones. del kit en 2-8°C. No utilice los reactivos después de su fecha de caducidad. La presencia de múltiples especies de bacterias Los especímenes de los pacientes y los culti- en la muestra a analizar puede dicultar la inter vos realizados a partir de especímenes de pa- pretación de resultados. cientes deben ser considerados siempre como potencialmente infecciosos. Las muestras de Como cualquier sistema de detección basado pacientes de riesgo (infectados por microorga- en la hibridación, este sistema contempla la nismos patógenos incluyendo Hepatitis B y Vi- posibilidad de que variaciones de las secuenrus de Inmunodeciencia Humana (VIH)) y los cias en las regiones genómicas que fueron elecultivos realizados a partir de esas muestras gidas para los primers y sondas, y la detección deben ser etiquetados y manejados siempre de regiones para las cuales el kit no fue diseñabajo las condiciones de seguridad adecuadas, do, pueden conducir a resultados falsos. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Debido a la gran variabilidad existente en los genomas bacterianos es posible que ciertos subtipos puedan no ser detectados. El test reeja los conocimientos de Hain Life- science. La utilización de este ensayo está limitada a personas cualicadas, bien entrenadas en el procedimiento de utilización del ensayo y familiarizadas con métodos de biología molecular. La evaluación de este sistema de análisis fue llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polimerasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las características de rendimiento de este ensayo no han sido validadas para todas las polimerasas disponibles comercialmente, el usuario es el encargado de evaluar la aplicabilidad de otras polimerasas distintas de las arriba mencionadas.

9.6. IDENTIFICACIÓN DEL COMPLEJO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (GenoType MTBC) PRINCIPIO El kit GenoType MTBC está basado en la tecnología DNA•STRIP que permite en base a los polimorsmos genéticos, por los que la ADN girasa B diferencia genéticamete de especies/ cepas pertenecientes al grupo Mycobacterium tuberculosis complex: M. africanum, M. bovis BCG, M. bovis ssp. bovis, M. bovis ssp. caprae, M. microti, y M. tuberculosis/“M. canettii”. El procedimiento completo se divide en tres pasos: extracción de ADN procedente de cultivo (placas de cultivo/medio líquido; los reactivos necesarios no se suministran), una amplica ción múltiplex con primers marcados con biotina (la ADN polimerasa termoestable no se incluye), y una hibridación reversa. La hibridación incluye los siguientes pasos: desnaturalización química del producto a amplicar; hibridación de amplicones de una sola cadena, marcados con biotina, a sondas unidas a membrana; lavado astringente; adición de conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una reacción de tinción mediada por AP. Una plantilla asegura la interpretación sencilla y rápida del esquema de bandas obtenido.

MATERIALES – Agua destilada (para uso en biología molecular) – Baño de agua – Baño de agua con agitación/TwinCubator – Baño de ultrasonidos – Centrífuga de mesa – Cronómetro – ADN polimerasa termoestable con tampón (recomendación: HotStarTaq DNA Polymerase de Qiagen) – Guantes desechables – Papel absorbente – Pinzas – Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μl – Plataforma de agitación/TwinCubator – Probeta graduada – Puntas de pipeta desechables con ltro – Reactivos para extracción de DNA, así como equipos necesarios – Termociclador (rango de calentamiento 3°C/ seg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión +/–0,2°C) – Termómetro calibrado – Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Las muestras para extracción son a partir de colonias aisladas de cultivo sólido, suspendidas en 300 μl agua ultrapura libre de DNasa y RNasa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. Las muestras también pueden extraerse a partir de cultivos positivos en medio líquido, se traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de DNasa y RNasa. PROCEDIMIENTO EXTRACCIÓN DE ADN Puede usarse un crecimiento bacteriano en placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Middlebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC, MB-Check). Este test no puede usarse para detectar micobacterias directamente de muestras de pacientes. La zona de trabajo ha de estar libre de ADN amplicado. Es crucial el calentamiento de las muestras a 95°C durante, al menos, 20 minutos con objeto de inactivar bacterias vegetativas.


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solución de ADN. Prepare una mezcla que contenga todos los reactivos excepto la solución de 20 minutos con objeto de inactivar bacterias ADN y mezcle bien. No utilice vórtex. Alicuote la vegetativas. Se puede seguir cualquier proce- mezcla madre en volúmenes de 45 µl en tubos dimiento de extracción de ADN que produzca preparados de PCR. ADN de bacterias amplicable. El siguiente protocolo rápido normalmente produce ADN ade- 2) Perl de amplicación *) cuado para amplicación: 1a. Cuando use crecimiento bacteriano en medio sólido, recoja las colonias de bacterias con un asa de inoculación y suspéndalas en aproximadamente 300 μl de agua (grado Biología Molecular). 1b. Cuando use crecimiento bacteriano procedente de medio líquido, aplique directamente 1 mL. Concentre las bacterias mediante centrifugación 15 min en una centrífuga de sobremesa en un rotor con contenedor de aerosoles y en una cabina de seguridad de clase II a 10000 x g aproximadamente. Deseche el sobrenadante y resuspenda las bacterias en 100-300 μL de agua (ver más arriba) con un vórtex. 2. Incube las bacterias procedentes del apartado 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño de agua. 3 Incube durante 15 min en un baño de ultrasonidos. 4 Centrifugue durante 5 min a máxima velocidad y utilice directamente 5 μL del sobrenadante para la PCR. En caso de que la solución de ADN haya de almacenarse por períodos prolongados de tiempo, transera el sobrenadante a un tubo nuevo.

Los productos para amplicación pueden almacenarse entre –20°C y 8°C. Para comprobar la reacción de amplicación, aplique directamente 5 μL de cada muestra a un gel de agarosa al 2% sin la adición de tampón de carga. Los amplicones tienen una longitud aproximada de 230 pb (Control de Género) y 200 pb (Control Universal/amplicon especie-especíco).

HIBRIDACIÓN Preparación Precaliente en baño de agua con agitación o TwinCubator a 45°C; la máxima desviación toAMPLIFICACIÓN lerada en la temperatura idónea es de +/–1°C. Prepare la mezcla de amplicación (45 μL) en Precaliente las soluciones HYB y STR a 37una habitación libre de ADN. La muestra debe 45°C antes de usar. añadirse en un área separada. Los reactivos han de estar libres de precipitado Mezcle por tubo: (tenga en cuenta, no obstante que la solución –35 µL de AM B – suministrado CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. –10 µL de AM A- suministrado Caliente a temperatura ambiente los restan –Añada 5 µL de solución de ADN (20-100 ng de tes reactivos, con la excepción del CON-C y ADN) para obtener un volumen nal de 50 µL el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el (sin considerar el volumen de enzima). Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 Determine el número de muestras a amplicar con sus tampones respectivos (CON-C con (número de muestras a analizar más las mues- CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades tras de control). Por ejemplo, un control de con- necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperataminación contiene 5 µL de agua en lugar de tura ambiente. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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en las cantidades necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperatura ambiente. Para cada tira añada 10 μL de concentrado a 1 mL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso. El SUB-C diluído es estable durante 4 semanas si se almacena a temperatura ambiente y se protege de la luz. 1. Dispense 20 μL de la Solución de Desnaturalización (DEN, azul) en una esquina de cada uno de los pocillos usados. 2. Añada a la solución 20 μL de muestra amplicada, pipetee arriba y abajo para mezclar bien e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos usando pinzas e identifíquelas marcando bajo el marcador coloreado con un lápiz. Lleve siempre guantes cuando manipule tiras. 3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL de Tampón de Hibridación (HYB, verde) precalentado. Agite suavemente la bandeja hasta que la solución tenga un color homogéneo. Tenga la precaución de no derramar solución en los pocillos cercanos. 4. Ponga una tira en cada pocillo. Las tiras tienen que quedar completamente cubiertas por la solución y el lado con la sonda hacia arriba (identicable por el marcador co loreado próximo al extremo inferior). Usando pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran haberse girado durante su inmersión. Limpie cuidadosamente las pinzas después de cada uso para evitar contaminación. Ello, es también de aplicación en los pasos siguientes. 5. Ponga la bandeja en el baño de agua con agitación o en el TwinCubator durante 30 minutos a 45°C. Ajuste la frecuencia de agitación del baño de agua para que realice una mezcla completa y constante de la solución. Para obtener una adecuada transferencia de calor, la bandeja debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de su altura. 6. Aspire completamente el Tampón de Hibridación. Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío. 7. Añada 1 mL de Solución de Lavado Astringente (STR, roja) a cada tira e incube durante 15 minutos a 45°C en un baño con agitación o TwinCubator.

Desde este paso, en adelante, trabaje a temperatura ambiente. Elimine completamente la Solución de Lavado Astringente. Deseche la Solución de Lavado en un contenedor y elimine todo el líquido restante volcando la bandeja y golpeándola suavemente sobre un papel absorbente. Ello es también de aplicación a todos los demás pasos de lavado. 8. Lave una vez cada tira con 1 mL de Solución de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agitado del TwinCubator (elimine el RIN después de la incubación). 9. Añada 1 mL de Conjugado diluído (ver más arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos sobre la plataforma de agitado del TwinCubator. 10. Elimine la solución y lave cada tira dos veces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto aproximadamente con 1 ml de agua destilada (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de agitación del TwinCubator (deseche la solución cada vez). Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua después del lavado anterior. 11. Añada 1 mL de sustrato diluído (ver más arriba) a cada tira e incube sin agitación y pro tegiéndolas de la luz. Dependiendo de las condiciones del test (por ej. la temperatura ambiente), el tiempo de incubación del sustrato puede variar entre 3 y 20 minutos. Tiempos prolongados de incubación del sustrato pueden conducir a una tinción incrementada del fondo y podría dicultar la inter pretación de los resultados. 12. Detenga la reacción aclarando brevemente por dos veces con agua destilada. 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande ja y séquelas entre dos capas de papel absorbente.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN Pegue las tiras y almacénelas protegidas de la luz. Con cada kit se proporciona un formulario de evaluación. Cuando se utilice este formulario de evaluación, pegue las tiras reveladas en los campos marcados, alineando las bandas CC y UC con las respectivas líneas del formulario. Anote el número de las bandas positivas en la penúltima columna y determine la especie con la ayuda de la tabla de interpretación y registre el nombre de las especies identicadas en la


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No todas las bandas de una tira han de mostrar la misma intensidad. última columna. La plantilla suministrada tam- Si fue usada una gran cantidad de amplicón, bién sirve como ayuda para evaluación y ha de pueden aparecer bandas adicionales. ser alineada con las bandas UC y CC de la tira. Cada tira tiene un total de 13 zonas de reacción TABLA DE INTERPRETACIÓN (ver esquema).

Control de Conjugado (CC) Debe aparecer una línea en esta zona, documentando la ecacia del conjugado unido y la reacción del sustrato. Control Universal (UC) Esta zona detecta, como es conocido, todas las micobacterias y miembros del grupo de bacterias gram-positivas con alto contenido de G+C. Si esta zona y el Control de Conjugado se tiñen como positivas, pero el restante esquema de bandas no puede ser asignado a una micobacteria especíca, se deben aplicar métodos adicionales para identicar la especie bacteriana correspondiente. Solamente han de considerarse aquellas bandas cuyas intensidades sean tan fuertes, o más fuertes, que la intensidad del Control Universal. MTBC Esta zona hibrida, como es conocido, con amplicones generados de todos los miembros conocidos de Mycobacterium tuberculosis complex. Otras bandas Sondas Especícas; para la evaluación ver la tabla de interpretación.

PRECAUCIONES Almacene la Mezcla del Primer/Nucleótido (PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cualquier fuente potencial de ADN contaminante. Si se requiere almacenar durante más de 4 semanas, almacene a –20°C. A n de evitar congelaciones y descongelaciones repetidas, alicuote el PNM. Almacene el resto de los componentes del kit en 2-8°C. No utilice los reactivos después de su fecha de caducidad. Los especímenes de los pacientes y los cultivos realizados a partir de especímenes de pacientes deben ser considerados siempre como potencialmente infecciosos. Las muestras de pacientes de riesgo (infectados por microorganismos patógenos incluyendo Hepatitis B y Virus de Inmunodeciencia Humana (VIH)) y los cultivos realizados a partir de esas muestras deben ser etiquetados y manejados siempre bajo las condiciones de seguridad adecuadas, de acuerdo con las guías institucionales. Observe todas las normas medioambientales y de seguridad, tanto federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada.


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El tratamiento y preparación de la muestra, incluyendo el paso de inactivación por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II. Antes del paso de inactivación por calor las muestras deben ser centrifugadas en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir el rotor con contenedor de aerosoles solamente en la cabina de seguridad. Después de la inactivación por calor se puede utilizar un rotor standard para centrifugar las muestras fuera de la cabina de seguridad. Observe las precauciones normales para preparar la amplicación. Es esencial que todos los materiales y reactivos usados para extracción de ADN y amplicación estén libres de DNasas.

eja los conocimientos de Hain Life- science. La utilización de este ensayo está limitada a personas cualicadas, bien entrenadas en el procedimiento de utilización del ensayo y familiarizadas con métodos de biología molecular. La evaluación de este sistema de análisis fue llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polimerasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las características de rendimiento de este ensayo no han sido validadas para todas las polimerasas disponibles comercialmente, el usuario es el encargado de evaluar la aplicabilidad de otras polimerasas distintas de las arriba mencionadas.

10. SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA Cuando manipule los reactivos del kit debe to- 10.1. INTRODUCCIÓN mar las siguientes medidas especiales de seLa tuberculosis (Tb) es una enfermedad ree guridad: La Solución de Desnaturalización (DEN) contie- mergente causada principalmente por Mycone <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel. bacterium tuberculosis y que infecta a un tercio El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- de la población mundial. Dentro de los principales objetivos en el desarrollo de procedimienmetil Sulfóxido y es irritante. tos para realizar susceptibilidad antibiótica es poder identicar la presencia de cepas resisten LIMITACIONES tes y multiresistentes. Antes de la amplicación, el ADN ha de ser ais- Para el tratamiento se utilizan varios medicalado de cultivo bacteriano realizado por un mé- mentos para evitar la aparición de resistencias todo idóneo. Ha de tenerse la seguridad de que por mutaciones naturales en las micobacterias. la muestra de ADN ha sido amplicada ecien - Las drogas de primera línea son rifampicina (RIF), isoniacida (INH), estreptomicina (SM) y temente durante la reacción de amplicación. El test sólo funciona dentro de los límites de las etambutol (EMB); todas tienen cierto grado de regiones genómicas para las que los primers toxicidad pero son relativamente seguras y cauy sondas han sido elegidos. El análisis de se- san pocos efectos secundarios. cuencias potenciales permanece reservado Los test de susceptibilidad desempeñan un papel muy importante en epidemiología, debido a para la reanudación de investigaciones. La presencia de múltiples especies de bacte- que detectan la aparición de resistencia provorias en la muestra a analizar puede dicultar la cada por fallas en la administración o en la supervisión de un tratamiento adecuado. También interpretación de resultados. Como cualquier sistema de detección basado es importante porque los resultados pueden ser en la hibridación, este sistema contempla la utilizados como una guía para iniciar la terapia, posibilidad de que variaciones de las secuen- para conrmar la resistencia antibiótica en un cias en las regiones genómicas que fueron paciente que demuestra respuesta insatisfactoelegidas para los primers y sondas, y la detec- ria al tratamiento y para la evaluar la tendencia ción de regiones para las cuales el kit no fue de resistencia primaria y adquirida dentro de diseñado, pueden conducir a resultados falsos. una comunidad. Debido a la gran variabilidad existente en los En Guatemala las pruebas de susceptibilidad a genomas bacterianos es posible que ciertos fármacos no se llevan a cabo rutinariamente, subtipos puedan no ser detectados. El test re- lo cual hace surgir la posibilidad de esquemas inadecuados de tratamiento para pacientes Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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miten que las fuentes de infección se detengan. El esquema se divide en dos fases: con cepas multiresistentes. Fase intensiva: durante la cual se toma el tratamiento todos los días. a. Tratamiento. Fase de continuación: durante la cual los me El tratamiento está condicionado al compor- dicamentos se toman dos ó tres veces por setamiento en el crecimiento del bacilo, a partir mana. de un bacilo se origina una colonia, luego se multiplica dependiendo de las características 10.2. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN de cada bacilo el crecimiento puede ser inerte DE SENSIBILIDAD ANTIFÍMICA ó con metabolismo inactivo, lento ó intermedio; cuando se alcanza cierto número de bacilos se 10.2.1. MÉTODO DE LAS PROPORCIOempiezan a producir mutaciones naturales y NES DE CANETII espontáneas, ésta mutación da lugar a la aparición de resistencias de tipo cromosómicas y Un método utilizado para la determinación de la por ello irreversibles las cuáles se encuentran susceptibilidad de micobacterias es el método en relación con el número de bacilos presentes modicado de las proporciones. Los resultados y el fármaco utilizado, es por ello que el trata- de éste método son reportados como un porcenmiento debe ser combinado ya que no todos taje del total de la población bacteriana, el cuál los elementos de las colonias poseen el mismo es denido por la cantidad de crecimiento en comportamiento frente a las drogas. un medio que contiene el medicamento, comparada con el crecimiento en un medio control b. Drogas de primera línea. libre de medicamento. Cuando más del 1% de INH, RIF, SM, EMB y Pirazinamida (PZA) son la población bacilar es resistente a la concenlos cinco medicamentos clasicados como dro - tración crítica de la droga, la micobacteria se gas de primera línea debido a que poseen baja considera resistente. La concentración crítica toxicidad y por la actividad que poseen, la INH del medicamento es aquella a la cual se inhibe es la droga de mayor utilidad y de mayor uso. el crecimiento de la mayoría de bacterias. Entre las dosis utilizadas de las drogas para el El principio del método se basa en que una sustratamiento del Tb se pueden mencionar: pensión estandarizada del organismo a evaluar INH 300mg diarios Posee baja toxicidad para se inocula en cajas de agar 7H10 que contiene el hígado. un agente antimicrobiano, generalmente droRIF 600mg diarios Posee baja toxicidad. gas de primera línea INH, RIF, SM, EMB comSM De uso limitado debido a su forma de admi- parado con un control que no contiene droga. nistración (vía intramuscular), causa citotoxici- Entre las ventajas de este método se pueden dad y disfunción renal. citar que de los métodos que existen en la acEMB 15mg/kg/día Posee baja toxicidad. tualidad, éste es el más accesible y aplicable PZA 25mg/kg/día Es hepatotóxica y produ- para la mayoría de los laboratorios de salud ce hiperuricemia. del país. Entre las desventajas están, que las micobacterias algunas veces se agrupan en c. Drogas de segunda línea. grumos, o no crecen satisfactoriamente por lo Este grupo de drogas es poco utilizado, excep- tanto es difícil obtener suspensiones homogéto en áreas en las que existen rangos grandes neas del inóculo. Es un método que requiere de resistencia a las drogas de primera línea, personal capacitado por ser un método muy laéste grupo incluye ooxacina, cicloserina, ca - borioso en cuanto a tiempo para preparación de preomicina, etionamida, tiacetazona, kanamici- medios, además el procedimiento es minuciona/amikacina. so. Utiliza un medio de cultivo muy enriquecido y si no se tiene el equipo y las condiciones de d. Esquemas de tratamiento. esterilidad que exige el método, puede conta Si los esquemas de tratamiento se siguen de minarse fácilmente. forma adecuada y con supervisión estricta perRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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PROCEDIMIENTO El método modicado de las proporciones fue seleccionado por las condiciones de laboratorio con las que se cuenta actualmente, se considera reproducible y exacto. El mismo consiste en utilizar los antibióticos de primera línea seleccionados a diferentes valores de concentración. Cada antibiótico reconstituido se incorpora al agar Middlebrook 7H10 previamente enriquecido con ácido oleico-albúmina-dextrosa-catalasa (OADC) y luego se prepara en cajas de Petri de cuatro cuadrantes, o 15x125 mm. (10 ml. aprox.) o con 13x100 mm (6 ml aprox). Diluciones estandarizadas de las micobacterias son inoculadas en el agar con antibiótico. Las cajas de Petri se colocan en una incubadora a 37ºC y se observan durante 2 a 3 semanas para detectar crecimiento.

- Disolver 106 mg (100,000μg) de INH en 10 ml de agua destilada. Esta es una solución de 10,000μg/ml. - Esterilizar con ltro millipore. - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril. Esta es una solución 1,000μg/ml. - Agregar 1ml de 1,000μg/ml a 9ml de agua destilada estéril. Esta es una solución de 100μg/ml. -Agregar 0.5 ml de 100μg/ml a 250ml de medio para obtener una concentración nal de 0.2μg INH/ml de medio. - Agregar 0.25 mL de 1,000μg/ml a 250ml de medio para obtener una concentración nal de 1μg INH/ml de medio.

Estreptomicina (SM) en caja - 131.4 mg dihidrosulfato de SM = 100mg de SM - Disolver 131.4 mg de dihidrosulfato de estreptomicina en 10 ml de agua destilada. Esta es una solución de 10,000μg/ml. - Esterilizar con ltro millipore. Cada erlenmeyer con 225 middlebrook agar a - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril. esto se le agrega 25 mL de OADC TOTAL: 250 Esta es una solución 1,000μg/ml. mL - Agregar 0.4ml de solución 1,000μg/ml a 200ml A. Preparación de soluciones antimicrobianas de medio para obtener una concentración nal • Preparar 1,000μg/ml de soluciones stock de de 2.0μg SM/ml de medio. isoniacida, estreptomicina, rifampicina y etambutol de la casa sigma. Estreptomicina (SM) en tubo • Alicuotar la solución stock en tubos de poli - - 131.4 mg dihidrosulfato de SM = 100mg de propileno estériles y congelar por no más de 12 SM meses a -20ºC (preferiblemente a -70ºC). - Disolver 131.4 mg de dihidrosulfato de estrepIsoniacida (INH) en caja tomicina en 10 ml de agua destilada. Esta es - 106mg INH = 100 mg INH una solución de 10,000μg/ml. - Disolver 106 mg (100,000μg) de INH en 10 - Esterilizar con ltro millipore. ml de agua destilada. Esta es una solución de - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril. 10,000μg/ml. Esta es una solución 1,000μg/ml. - Esterilizar con ltro millipore. - Agregar 0.5ml de solución 1,000μg/ml a 250ml - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril. de medio para obtener una concentración nal Esta es una solución 1,000μg/ml. de 2.0 μg SM/ml de medio. - Agregar 1ml de 1,000μg/ml a 9ml de agua destilada estéril. Esta es una solución de 100μg/ml. Rifampicina (RIF) (Rifampin) en caja - Agregar 0.4ml de 100μg/ml a 200ml de medio - 105 mg rifampicina = 100mg de rifampina. para obtener una concentración nal de 0.2μg - Disolver 105 mg. de rifampicina en 2 ml. de INH/ml de medio. dimetil sulfóxido (DMSO) ó dimetilformami- Agregar 0.2 mL de 1,000μg/ml a 200ml de meda y completar hasta 10 mL con agua destiladio para obtener una concentración nal de 1μg da (8 mL agua). para hacer una solución de INH/ml de medio. 10,000μg/ml. -Esterilizar con ltro millipore Isoniacida (INH) en tubo - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril. - 106mg INH = 100 mg INH Esta es una solución 1,000μg/ml. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Agregar 0.2 ml de solución 1,000μg/ml a 200ml de medio para obtener una concentración nal de 1.0 μg rifampicina/ml de medio.

Rifampicina (RIF) (Rifampin) en tubo - 105 mg rifampicina = 100mg de rifampina. - Disolver 105 mg. de rifampicina en 2 ml. de dimetil sulfóxido (DMSO) ó dimetilformamida y completar hasta 10 mL con agua destilada (8 mL agua). para hacer una solución de 10,000μg/ml. - Esterilizar con ltro millipore. - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril. Esta es una solución 1,000μg/ml. - Agregar 0.25ml de solución 1,000μg/ml a 250ml de medio para obtener una concentración nal de 1.0μg rifampicina/ml de medio. Etambutol (EMB) en caja - 136 mg d-etambutol = 100mg de EMB - Disolver 100mg de d-etambutol en 10 ml de agua destilada. - Esterilizar con ltro millipore. - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril. Esta es una solución 1,000μg/ml. - Agregar 1.0 ml de solución 1,000μg/ml a 200ml de medio para obtener una concentración nal de 5 μg etambutol/ml de medio. Etambutol (EMB) en tubo - 136mg d-etambutol = 100mg de EMB - Disolver 100mg de d-etambutol en 10 ml de agua destilada. - Esterilizar con ltro millipore. - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estéril. Esta es una solución 1,000μg/ml. - Agregar 1.25ml de solución 1,000μg/ml a 250ml de medio para obtener una concentración nal de 5 μg etambutol/ml de medio. B. Preparación de medios. 1. Calentar el baño de agua a 50-56ºC. 2. Preparar el agar base 7H10 3. Agregar 1,800ml de agua destilada a un balón de 2 litros. 4. Agregar un magneto para agitación, y agitar el agar en una estufa con agitación magnética a velocidad media y a temperatura media a elevada. 5. Pesar la cantidad de agar Middlebrook 7H10

especicada por el fabricante, y lentamente agregar al agua. Permitir que el medio se disuelva ligeramente antes de agregar más. Agregar el medio al agua de una sola vez puede causar grumos que no se disolverán. 6. Agregar 10ml de glicerol al balón y continuar mezclando por otros 3 a 5 minutos. Continuar calentando (con agitación constante) hasta que el medio se aclare (aproximadamente son 20 minutos) 7. Remover el balón del calor. 8. Usar la probeta de 500ml, y alicuotar el agar derretido dentro de los balones como sigue: - Agregar 180ml de agar a 6 balones de 500ml - Agregar 540ml de agar a 1 balón de 1 litro - Agregar un magneto a cada balón - Cubrir los balones con tapaderas plásticas de tapón de rosca, tapones de esponja, o papel aluminio, y autoclavear por 15 minutos a 121ºC. 9. Después de autoclavear, colocar los balones en un baño de agua ó en horno programado a 50 a 56ºC para enfriar. 10. Si se desea, el agar puede dejarse solidicar a temperatura ambiente y guardado en envases bien tapados protegidos de la luz a 2-8ºC hasta por 2 semanas. Previo a la preparación de ca jas, derretir el agar colocando el envase en un baño de agua hirviendo.

EN TUBO 11. Usar la probeta de 500ml, y alicuotar el agar derretido dentro de los balones como sigue: - Agregar 225ml de agar a 6 balones de 500ml (PARA ANTIBIOTICOS) - Agregar 250ml de agar a 1 balón de 1 litro (PARA CONTROL DE CRECIMIENTO) - Agregar un magneto a cada balón Cubrir los balones con tapaderas plásticas de tapón de rosca, tapones de esponja, o papel aluminio, y autoclavear por 15 minutos a 121ºC AGREGAR 25 mL de OADC (ESTO ES PARA 20 TUBOS MÁXIMO 25 TUBOS EXACTOS) C. Etiquetado de las cajas. 1. Preparar 70 cajas cuadriplate en dos columnas de 35 cajas cada una. 2. Etiquetar todas las cajas de una columna con el número 1. 3. Etiquetar todas las cajas de la segunda columna con el número 2.


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antimicrobianos. 4. El número en la caja es un código para los antimicrobianos dispensados en esa caja. Tabla No. 8 Número de organismos por campo

NOTA: - Contar un acumulo como un solo organismo. - Utilizar objetivo de aceite de inmersión (para conteo de organismos teñidos con carbolfucshina) - Utilizar objetivo seco fuerte (para conteo de organismos teñidos con uorocromo) D. Preparación de cajas. 1. Permitir que los antimicrobianos se descongelen a temperatura ambiente, y usarlos lo más rápido posible. Nunca permitir que se recongelen. 2. Retirar un frasco de 200ml de enriquecedor OADC del refrigerador, y atemperar. 3. Retirar un frasco de tapón de rosca de 500ml conteniendo 180ml de agar Middlebrook 7H10 y agitar en un plato de agitación para homogenizar el medio (sin calor) 4. Agregarle 20ml de enriquecedor OADC cuando el agar tenga una temperatura de 56˚C y homogenizar (no aplicar calor) 5. Agregar la cantidad apropiada de antimicrobiano para obtener una concentración nal de 0.2μm de INH y continuar la agitación por 1 a 2 min (ver tabla No. 9) 6. Utilizando una pipeta estéril o un dispensador, dispensar 5ml de agar con INH en el cuadrante II de las 35 cajas etiquetadas con 1 (ver tabla No. 9) 7. Repetir los pasos del 1 al 6 para los otros antimicrobianos y dispensarlos dentro de los cuadrantes de las cajas 1 y 2 (ver tabla No. 9)

(μg/ml)= microgramos por mililitro a = la solución stock de antimicrobianos (1,000μg/ml excepto que se especique otro) se agrega a 180ml de agar con 20mL OADC. *1=100 ug/ml 8. Retirar un frasco de tapón de rosca conteniendo 360ml de agar a 56˚C. 9. Agregar 40ml de OADC al frasco y agitar lentamente (no aplicar calor) 10. Continuar la agitación por 1 a 2min. 11. Utilizando una pipeta estéril o un dispensador, dispensar 5ml del agar libre de droga dentro del cuadrante I de las 70 cajas. 12. Permitir que el agar se solidique a temperatura ambiente dentro de una campana de u jo laminar. 13. Cuando el agar esté solidicado colocarlo en bolsas plásticas y guardar a 2-8˚C en la os curidad. 14. Etiquetar con una fecha de expiración de 1 mes. . Preparación del inóculo.

1.Escoger de 3-5 colonias (representando todos los tipos de colonias si se encuentran múltiples tipos) y emulsicarlas en 4ml de caldo Dubos-Tween-albúmina contenido en un tubo de vidrio (13x100mm) al cual se le han agregado de seis a ocho perlas de vidrio. 2. Agitar en vórtex por 1 a 2 min. 3. Dejar reposar el tubo por 30 minutos, de modo que las partículas grandes sedimenten. 4. Decantar el sobrenadante y transferirlo a otro Tabla No 9. Preparación de cajas con tubo de vidrio estéril (13x100). Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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absorbido dentro del medio (aproximadamente por una hora). 5. Ajustar la turbidez de la suspensión del so- 12. Envolver cada caja en una bolsa de poliprobrenadante con caldo Dubos-Tween-albúmina pileno permeable a CO2 y colocar las cajas con hasta alcanzar el estándar 1.0 de McFarland el agar hacia abajo. (Conteniendo aproximadamente 107 UFC/ml). 13. Incubar las cajas a 36ºC en una atmósfera 6. Diluir la suspensión a 10-2 y 10-4 con agua de 5 al 10% de CO2. destilada estéril. G. Lectura de cajas. F. Inoculación e incubación. 1. Después de 1 a 2 días de incubación, exami1. Para cada organismo a ser evaluado, llevar a nar el agar sangre y el agar Middlebrook 7H10 temperatura ambiente 2 grupos de cajas cuadri- para evidenciar bacterias contaminantes. Si se plate con el medio para susceptibilidad (un gru- detecta contaminación, descartar todas las capo de cajas incluye: una caja etiquetada como jas y repetir la evaluación con un nuevo inóculo. 1 y otra como 2). Asegurar que la supercie (Algunas veces es necesario preparar varios del agar este seca (secar cualquier gota con un subcultivos para obtener un inóculo puro). hisopo de algodón estéril). Incubar y continuar examinando la pureza del 2. Etiquetar estas dos cajas para la evaluación agar sangre diariamente por 7 días y la pureza de susceptibilidad con el número de cultivo del del agar 7H10 semanalmente mientras dure la paciente y la dilución, por ejemplo 10-2. evaluación. 3. Inocular este primer grupo de cajas para 2. Examinar el cuadrante control (sin antimicroevaluar susceptibilidad de dilución 10-2 con la biano) semanalmente. Cuando se observe cresuspensión de la dilución 10-2 de la siguiente cimiento de 1+ o más (ver tabla 2), leer todas manera. las cajas. Si el crecimiento no es suciente 4. Usando una pipeta estéril con algodón en el entre 2 y 3 semanas de incubación, se repite el extremo posterior, inocular una gota de la sus- test. Es importante tener en cuenta que: pensión a evaluar, sin que la pipeta toque la No hay que dar un reporte nal de resultados supercie del medio, en cada esquina de cada de resistencia o susceptibilidad hasta que las cuadrante (3 gotas por cuadrante). cajas hayan sido incubadas por 3 semanas. 5. Mantener la pipeta perpendicular al agar para 3. Examinar todos los cuadrantes, y estimar asegurar la uniformidad de las gotas, tener cui- el número de colonias creciendo en cada cuadado de no tocar la supercie del agar con la drante (contando el número total de colonias punta de la pipeta. creciendo en los tres círculos de crecimiento). 6. Tener cuidado de colocar las gotas de modo 4. Cuanticar el crecimiento como se especica que no se corran al borde de la caja de petri (es a continuación. difícil contar colonias en el borde de la caja). 5. Se debe notar la presencia de cualquier mi7. Repetir el procedimiento anterior para cada crocolonia como las colonias en el medio concuadrante de la caja. teniendo antibiótico que son más pequeñas que 8. Etiquetar e inocular el segundo grupo de aquellas en el medio control. cajas para evaluación de susceptibilidad con la 6. Cuanticar el crecimiento y registrar el númedilución 10-4 de la misma manera. ro de colonias. 9. Evaluar una cepa de control de calidad a di- 7. Calcular el porcentaje de resistencia dividienluciones 10-2 y 10-4. do el número de colonias creciendo en el medio 10. Inocular una caja de agar sangre y una caja con antibiótico dentro del número de colonias de agar Middlebrook 7H10 con 1 ó 2 gotas de creciendo en el medio control y multiplicando la suspensión anterior y estriarlas con asa en por 100. argolla a manera de aislar colonias. 11. Permitir que las cajas inoculadas permanez- Tabla No.10 Cuanticación del crecican con el agar hacia arriba a temperatura am- miento de colonias de micobacterias biente (en la campana) hasta que el inóculo sea en cajas de agar. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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1 Cantidad exacta de colonias contadas. H. Resultados. 1. Interpretación. Si el control de calidad es aceptable, interpretar como se especica a continuación: 1.1. Interpretar los resultados de la dilución de organismos que presente un número contable de colonias (idealmente de 50 a 100) en el crecimiento del cuadrante control. 1.2. Nunca utilizar la dilución con recuento de colonias ≤50. 1.3. Utilizar la dilución con recuento de colonias de 4+ con precaución. 1.4. Si ambas diluciones muestran crecimiento 4+ y el organismo es susceptible a todos los antibióticos, interpretar los resultados. Si el organismo muestra resistencia a cualquier antibiótico, la resistencia puede deberse a un inóculo muy cargado. Repetir completamente la prueba.

Tabla No. 11

Ejemplos de reportes.

1.5. La presencia de microcolonias sugiere que el aislamiento puede ser resistente al antibiótico pero que tiene algún efecto en el organismo y puede ser efectivo en combinación con otras drogas. 1.6. Interpretar un resultado como resistente cuando la proporción del crecimiento en el medio conteniendo antibiótico es ≥1% del crecimiento en el medio libre de antibiótico. 1.7. Ejemplos: Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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a. nterpretación de resistencia. Crecimiento control (cuadrante I) 200 colonias (3+) INH, 0.2 μg/ml (cuadrante II) 7 colonias 7 colonias x 100% = 3.5%, i.e., Resistente. 200 colonias No es necesario realizar un recuento real de las colonias para aquellas concentraciones cuando el crecimiento es obviamente <1% ó ≥1%. b. Con un control de calidad aceptable, reportar como sigue el siguiente ejemplo.

Tabla No. 12 Control de calidad

INH= isoniacida, SM= estreptomicina, RIF= rifampicina, EMB= etambutol R= resistente, S= susceptible (μg/ml)= microgramos por mililitro.

El kit GenoType® MTBDRplus está basado en la tecnología DNA•STRIP® y permite la identicación mediante genética molecular del complejo Mycobacterium tuberculosis y su resistencia a rifampicina y/o isonizida, desde cultivo o muestras clínicas pulmonares baciloscopia positivas. La identicación de la resistencia a rifampicina es posible gracias a la detección de las mutaciones más signicativas del gen rpoB (que codica por la subunidad β de la ARN polimerasa). Para testar la resistencia de isoniazida de alto nivel es examinado el gen katG (que codica por la catalasa perioxidasa), y para testar la resistencia a isoniazida de bajo nivel, es examinada la región del promotor del gen inhA (que codica por la NADH enoil ACP reductasa). El procedimiento completo se divide en tres pasos: aislamiento de DNA procedente de cultivo (medio sólido/medio líquido) o de muestra clínica (muestras pulmonares baciloscopia positivas decontaminadas) – los reactivos necesarios no se suministran – una amplicación múltiplex con primers marcados con biotina (la DNA polimerasa termoestable no se incluye), y una hibridación reversa. La hibridación incluye los siguientes pasos: desnaturalización química del producto a amplicar, hibridación de amplicones en una sola cadena, marcados con biotina, a sondas unidas a membrana, lavado astringente, adición de conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una reacción de tinción mediada por AP. Una plantilla asegura la interpretación sencilla y rápida del esquema de bandas obtenido.

Médicos experimentados algunas veces utilizan el porcentaje de organismos resistentes al agente antimicrobiano como una guía para la ecacia de la terapia. Por ello es importante calcular y registrar el porcentaje de resistencia en una hoja de trabajo, y mantener esta información disponible para los médicos que la requieran.

MATERIALES • Agua destilada (para uso en biología molecular) • Baño de agua • Baño de agua con agitación/TwinCubator • Baño de ultrasonidos • Centrífuga de mesa • Cronómetro 10.2.2. MÉTODO DE PCR: IDENTIFI- • DNA polimerasa termoestable con tampón (reCACIÓN DEL COMPLEJO MYCOBAC- comendación: HotStarTaq DNA Polymerase de TERIUM TUBERCULOSIS (GenoType® Qiagen) • Guantes desechables MTBDRplus) • Papel absorbente PRINCIPIO Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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una cabina de seguridad de clase II a 10000 x g aproximadamente. Deseche el sobrenadan• Pinzas te y resuspenda las bacterias en 100-300 μl de • Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 μl agua (ver más arriba) con un vortex. • Plataforma de agitación/TwinCubator 2. Incube las bacterias procedentes del aparta• Probeta graduada do 1a o 1b durante 20 min a 95°C en un baño • Puntas de pipeta desechables con ltro • Reactivos para extracción de DNA, así como de agua. 3 Incube durante 15 min en un baño de ultrasoequipos necesarios •Termociclador (rango de calentamiento 3°C/ nidos. seg., rango de enfriamiento 2°C/seg., precisión 4 Centrifugue durante 5 min a máxima velocidad y utilice directamente 5 μl del sobrenadan+/–0,2°C) te para la PCR. En caso de que la solución de • Termómetro calibrado DNA haya de almacenarse por períodos prolon• Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa gados de tiempo, transera el sobrenadante a un tubo nuevo. PREPARACIÒN DE LA MUESTRA Las muestras para extracción son a partir de colonias aisladas de cultivo sólido, suspendidas AMPLIFICACIÓN en 300 μl agua ultrapura libre de DNasa y RNa- Prepare la mezcla de amplicación (45 μl) en sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa. una habitación libre de DNA. La muestra debe Las muestras también pueden extraerse a partir añadirse en un área separada. de cultivos positivos en medio líquido, se traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de Mezcle por tubo: –35 µl de AM B – suministrado DNasa y RNasa. –10 µl de AM A- suministrado –Añada 10 µl de solución de DNA (20-100 ng PROCEDIMIENTO de DNA) para obtener un volumen nal de 55 µl EXTRACCIÓN DE ADN Puede usarse un crecimiento bacteriano en (sin considerar el volumen de enzima). placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Middlebrook), o en medio líquido (ej.: BACTEC, Determine el número de muestras a amplicar MB-Check). Este test no puede usarse para (número de muestras a analizar más las mues detectar micobacterias directamente de muestras de control). Por ejemplo, un control de contras de pacientes. La zona de trabajo ha de es- taminación contiene 5 µl de agua en lugar de tar libre de DNA amplicado. Es crucial el ca- solución de DNA. Prepare una mezcla que conlentamiento de las muestras a 95°C durante, tenga todos los reactivos excepto la solución de al menos, 20 minutos con objeto de inactivar DNA y mezcle bién. No utilice vortex. Alicuote la bacterias vegetativas. Se puede seguir cual- mezcla madre en volúmenes de 45 µl en tubos quier procedimiento de extracción de DNA que preparados de PCR. produzca DNA de bacterias amplicable. El siguiente protocolo rápido normalmente produce 2) Perl de amplicación *) DNA adecuado para amplicación: 1a. Cuando use crecimiento bacteriano en medio sólido, recoja bacterias con un asa de inoculación y suspéndalas en aproximadamente 300 μl de agua (grado Biología Molecular). 1b. Cuando use crecimiento bacteriano procedente de medio líquido, aplique directamente 1 ml. Concentre las bacterias mediante centrifugación 15 min en una centrífuga de sobremesa en un rotor con contenedor de aerosoles y en Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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Los productos para amplicación pueden almacenarse entre +8 y –20°C. Para comprobar la reacción de amplicación, aplique directamente 5 μl de cada muestra a un gel de agarosa al 2% sin la adición de tampón de carga. Los amplicones tienen una longitud aproximada de 230 pb (Control de Género) y 200 pb (Control Universal/amplicon especie-especíco).

HIBRIDACIÓN Preparación Precaliente en baño de agua con agitación o TwinCubator a 45°C; la máxima desviación tolerada en la temperatura idónea es de +/–1°C. Precaliente las soluciones HYB y STR a 3745°C antes de usar. Los reactivos han de estar libres de precipitado (tenga en cuenta, no obstante que la solución CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. Caliente a temperatura ambiente los restantes reactivos, con la excepción del CON-C y el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 con sus tampones respectivos (CON-C con CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperatura ambiente. Para cada tira añada 10 μl de concentrado a 1 ml de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso. El SUB-C diluído es estable durante 4 semanas si se almacena a temperatura ambiente y se protege de la luz. 1. Dispense 20 μl de la Solución de Desnaturalización (DEN, azul) en una esquina de cada uno de los pocillos usados. 2. Añada a la solución 20 μl de muestra amplicada, pipetee arriba y abajo para mezclar bien e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos usando pinzas e identifíquelas marcando bajo el marcador coloreado con un lápiz. Lleve siempre guantes cuando manipule tiras. 3. Añada cuidadosamente a cada pocillo 1 ml de Tampón de Hibridación (HYB, verde) precalentado. Agite suavemente la bandeja hasta que la solución tenga un color homogéneo.

Tenga la precaución de no derramar solución en los pocillos cercanos. 4. Ponga una tira en cada pocillo. Las tiras tienen que quedar completamente cubiertas por la solución y el lado con la sonda hacia arriba (identicable por el marcador coloreado próximo al extremo inferior). Usando pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran haberse girado durante su inmersión. Limpie cuidadosamente las pinzas después de cada uso para evitar contaminación. Ello, es también de aplicación en los pasos siguientes. 5. Ponga la bandeja en el baño de agua con agitación o en el TwinCubator durante 30 minutos a 45°C. Ajuste la frecuencia de agitación del baño de agua para que realice una mezcla completa y constante de la solución. Para obtener una adecuada transferencia de calor, la bandeja debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de su altura. 6. Aspire completamente el Tampón de Hibridación. Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío. 7. Añada 1 ml de Solución de Lavado Astringente (STR, roja) a cada tira e incube durante 15 minutos a 45°C en un baño con agitación o TwinCubator. Desde este paso, en adelante, trabaje a temperatura ambiente. Elimine completamente la Solución de Lavado Astringente. Deseche la Solución de Lavado en un contenedor y elimine todo el líquido restante volcando la bandeja y golpeándola suavemente sobre un papel absorbente. Ello es también de aplicación a todos los demás pasos de lavado. 8. Lave una vez cada tira con 1 ml de Solución de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agitado del TwinCubator (elimine el RIN después de la incubación). 9. Añada 1 ml de Conjugado diluído (ver más arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos sobre la plataforma de agitado del TwinCubator. 10. Elimine la solución y lave cada tira dos veces durante 1 minuto con 1 ml de Solución de Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto aproximadamente con 1 ml de agua destilada (ej.: botella de lavado) ) sobre la plataforma de agitación del TwinCubator (deseche la solución cada vez).


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Control de Conjugado (CC) Asegúrese de eliminar cualquier resto de agua Debe aparecer una línea en esta zona, docudespués del lavado anterior. mentando la ecacia del conjugado unido y la 11. Añada 1 ml de sustrato diluído (ver más arri- reacción del sustrato. ba) a cada tira e incube sin agitación y proteControl Universal (UC) giéndolas de la luz. Dependiendo de las condiciones del test (por Esta zona detecta, como es conocido, todas las ej. la temperatura ambiente), el tiempo de in- micobacterias y miembros del grupo de bactecubación del sustrato puede variar entre 3 y 20 rias gram-positivas con alto contenido de G+C. minutos. Tiempos prolongados de incubación Si esta zona y el Control de Conjugado se tiñen del sustrato pueden conducir a una tinción in- como positivas, pero el restante esquema de crementada del fondo y podría dicultar la inter - bandas no puede ser asignado a una micobacpretación de los resultados. teria especíca, se deben aplicar métodos adi 12. Detenga la reacción aclarando brevemente cionales para identicar la especie bacteriana por dos veces con agua destilada. correspondiente. 13. Usando pinzas, saque las tiras de la bande- Solamente han de considerarse aquellas ban ja y séquelas entre dos capas de papel absor- das cuyas intensidades sean tan fuertes, o más fuertes, que la intensidad del Control Universal. bente. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN Pegue las tiras y almacénelas protegidas de la luz. Con cada kit se proporciona un formulario de evaluación. Cuando se utilice este formulario de evaluación, pegue las tiras reveladas en los campos marcados, alineando las bandas CC y AC con las respectivas líneas del formulario. Por razones técnicas, la distancia entre cada sonda de la tira puede variar ligeramente. Por tanto, para una lectura precisa, por favor utilice la plantilla que encontrará en cada kit, y alinee separadamente para cada uno de los tres loci detectados, con su respectivo Locus Control. Determine el estado de la resistencia y anote en las respectivas columnas. Como ayuda para la interpretación se dan ejemplos de evaluaciones en el siguiente apartado. No todas las bandas de una tira muestran la misma intensidad. Cada tira tiene un total de 27 zonas de reacción (ver esquema).

M. tuberculosis complex (TUB) Esta zona hibrida, como es conocido, con amplicones generados de todos los miembros conocidos de Mycobacterium tuberculosis complex. Si la zona TUB es negativa, la bacteria testada no pertenece al complejo M. tuberculosis y no puede ser evaluada mediante este sistema. Locus Control (rpoB, katG, y inhA) Las zonas del Locus Control detectan una región del gen especíca para cada respectivo locus y siempre han de ser positivas, cuando la banda de TUB haya documentado la presencia de M. tuberculosis. Sondas Wild type Las sondas wild type comprenden las áreas de resistencia más importantes de los genes respectivos (ver gura 1, tabla 1, 2 y 3) Cuando todas las sondas Wild type de un gen son positivas, no se detectan mutaciones en las regiones examinadas. La cepa testada es sensible para el respectivo antibiótico. En caso de una mutación, el respectivo amplicón no puede unirse a la correspondiente sonda Wild type. La ausencia de señal en al menos una de las sondas Wild type indica, por tanto, resistencia de la cepa testada al respectivo antibiótico. Solamente serán consideradas como positivas aquellas bandas cuya intensidad sea igual o mayor que la banda de Control de Amplicación.


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Cada patrón que se desvíe del patrón wild type indica resistencia de la cepa testada. El patrón de bandas obtenido con las sondas rpoB permite dibujar una conclusión sobre la resistencia a rifampicina de las cepas testadas, el patrón de bandas obtenido con las sondas katG permite dibujar una conclusión sobre las resistencias de alto nivel a isoniazida, el patrón de bandas obtenido con las sondas inhA permiten dibujar una conclusión sobre las resistencias de bajo nivel a isoniazida de las cepas testadas, respectivamente.

Sondas de mutación Las sondas de mutación detectan algunas de las resistencias más comunes mediadas por mutaciones (ver 1, 2 y 3). Comparadas con otras muestras, las señales positivas de las sondas de mutación rpoB MUT2A y MUT2B pueden mostrar una señal más débil. Solamente deben ser consideradas aquellas bandas cuya intensidad es de la misma intensidad o mayor que las del Control de Amplica ción. Cada patrón que se desvíe del patrón del wild type indica resistencia de la cepa testada. El patrón de bandas obtenido con la sonda rpoB permite dibujar una conclusión sobre la resistencia a rifampicina de la cepa testada, el patrón de bandas del katG sobre un nivel alto y el patrón de bandas del inhA sobre una nivel bajo de resistencia a isoniazida respectivamente. TABLA DE INTERPRETACIÓN

Si todas las bandas wild type muestra señal, este resultado es clasicado como positivo y marcaremos la columna de WT de los respetivos genes con el signo “+”. Si la menos una de las bandas de Wild type está ausente, este resultado es clasicado como negativo y marcaremos la columna de WT de los mismos genes con “–“. Las columnas de mutación solamente se marcarán con un signo negativo cuando no aparezca ninguna de las bandas correspondientes a las mutaciones. Si al menos una de las bandas de mutación aparece positive, este resultado se clasicará como positivo, y la columna MUT del respectivo gen se marcará con un “+”. Seguidamente se explican dos de los ejemplos arriba mostrados: El ejemplo 1 muestra el patrón de bandas del wild type. Todas las sondas de Wild type muestran señal, pero ninguna de las sondas de mutación lo hacen, por tanto, la tarjeta de evaluación muestra un “+” en las tres columnas del wild type y un “–“ en las tres columnas de las mutaciones. De acuerdo a estos datos, las casillas „RMP sensitive“ e „INH sensitive“ se marcarán „+“. Una de las sondas de rpoB y de katG wild type están ausentes en el ejemplo 5; por tanto en las casillas de rpoB WT y katG WT se marcará “–“. Ya que ninguna de las sondas de mutación son positivas, estas casillas se marcarán también con “–“. La región promotora de inhA no se desvía del patrón wild type. La cepa es evaluada como RMP e INH resistente. La resistencia a INH está causada por una mutación en el gen katG y es por tanto una resistencia a isoniazida de alto nivel.

PRECAUCIONES Almacene la Mezcla del Primer/Nucleótido (PNM) a 2-8°C a su llegada aislándola de cual quier fuente potencial de DNA contaminante. Si se requiere almacenar durante más de 4 semanas, almacene a –20°C. A n de evitar congelaciones y descongelaciones repetidas, alicuote el PNM. Almacene el resto de los componentes del kit en 2-8°C. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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No utilice los reactivos después de su fecha de caducidad. Los especímenes de los pacientes y los cultivos realizados a partir de especímenes de pacientes deben ser considerados siempre como potencialmente infecciosos. Las muestras de pacientes de riesgo (infectados por microorganismos patógenos incluyendo Hepatitis B y Virus de Inmunodeciencia Humana (VIH)) y los cultivos realizados a partir de esas muestras deben ser etiquetados y manejados siempre bajo las condiciones de seguridad adecuadas, de acuerdo con las guías institucionales. Observe todas las normas medioambientales y de seguridad, tanto federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada. El tratamiento y preparación de la muestra, incluyendo el paso de inactivación por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II. Antes del paso de inactivación por calor las muestras deben ser centrifugadas en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir el rotor con contenedor de aerosoles solamente en la cabina de seguridad. Después de la inactivación por calor se puede utilizar un rotor standard para centrifugar las muestras fuera de la cabina de seguridad. Observe las precauciones normales para preparar la amplicación. Es esencial que todos los materiales y reactivos usados para extracción de DNA y amplicación estén libres de DNasas. Cuando manipule los reactivos del kit debe tomar las siguientes medidas especiales de seguridad: La Solución de Desnaturalización (DEN) contiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel. El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Dimetil Sulfóxido y es irritante.

LIMITACIONES La declaración dada en este manual con respecto a la capacidad del método, se reere a muestras de cultivos y muestras clínicas pulmonares baciloscopia positivas. Los datos disponibles sobre muestras clínicas extrapulmonares baciloscopia positivas no son sucientes para trazar una conclusión acerca de su aplica-

bilidad. Como en cualquier análisis basado en DNA, este test sólamente analiza la secuencia de ácidos nucléicos y no la de aminoácidos. Es posible, por tanto, que mutaciones que no causan un cambio de aminoácido (mutaciones si lenciosas) podrían producir la ausencia de una de las sondas wild type. Los datos más recientes indican que a pesar de aparezca una mutación L533P en la respectiva cepa, esta puede todavía ser sensible a RMP. Por tanto, si la banda WT8 está ausente y la sonda de la mutación rpoB MUT3 no se tiñe, deben ser considerados los resultados de la resistencia fenotípica. En los últimos años han sido publicadas mutaciones adicionales dentro de las testadas en la región del gen rpoB causantes de la resistencia a rifampicina. Ya que estas mutaciones son muy raras, estas no fueron accesibles para la validación de este sistema y fueron solamente detectadas in silico. Sin embargo, una detección in silico no excluye la posibilidad de que alguna de las mutaciones no pueda ser detectada in vitro. El GenoType® MTBDRplus solamente detecta aquellas resistencias del M. tuberculosis complex que tienen sus orígenes en la regiones de rpoB, katG e inhA examinadas aquí. Resistencias que tienen sus orígenes en mutaciones en otros genes o regiones de genes, así como, otras resistencias o mecanismos de resistencia rifampicina e isoniazida no serán detectados por este test. El usuario debe tener o adquirir información sobre el patrón de distribución de las mutaciones locales de los genes investigados con este test. La presencia de múltiples especies de bacterias en la muestra a analizar puede dicultar la interpretación de resultados. Teóricamente, puede existir resistencia a pesar de que aparezca un modelo wild type. Si, en un ensayo, la muestra contiene una cepa que ha desarrollado una he- teroresistencia y la resistencia se debida a una mutación no cubierta por las sondas, aparecerá el patrón de bandas de wild type. Del mismo modo, si la muestra contie nen más de una cepa del complejo M. tuberculosis (debido a un cultivo mixto o una contaminación) y una de ellas alberga una mutación que no está cubierta por las sondas


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de mutación, aparecerá también el patrón de bandas de wild type. Como en el caso de otras pruebas de diagnóstico, los resultados de este ensayo sólo pueden interpretarse en conjunción con otros datos clínicos y de laboratorio adicionales a disposición del facultativo responsable. Antes de la amplicación, amplicación, el DNA ha de ser aisaislado de cultivo bacteriano o muestras clínicas pulmonares baciloscopia positivas, utilizando un método idóneo. Ha de tenerse la seguridad de que la muestra de DNA ha sido amplicada ecientemente durante la reacción de amplicaamplica ción. El test solo funciona dentro de los límites de las regiones genómicas para las que los primers y sondas han sido elegidos. El análisis de secuencias potenciales permanece reservado para la reanudación r eanudación de investigaciones. Como cualquier sistema de detección basado en la hibridación, este sistema contempla la posibilidad de que variaciones de las secuencias en las regiones genómicas que fueron elegidas para los primers y sondas, y la detección de regiones para las cuales el kit no fue diseñado, pueden conducir a resultados falsos. Debido a la gran variabilidad existente en los genomas bacterianos es posible que ciertos sub-tipos puedan no ser detectados. El test reeja los coco nocimientos de Hain Lifescience. La utilización de este ensayo está limitada a personas cualicadas, bien entrenadas en el procedimiento de utilización del ensayo y familiarizadas con métodos de biología molecular. molecular. La evaluación de este sistema de análisis fue llevada acabo utilizando la HotStarTaq polimerasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las características de rendimiento de este ensayo no han sido validadas para todas las polimerasas disponibles comercialmente, el usuario es el encargado de evaluar la aplicabilidad de otras polimerasas distintas de las arriba mencionadas.

10.2.3. MÉTODO DE SENSIBILID SENSIBILIDAD AD ANTIFÍMICA POR BACTEC MGIT 960 SIRE KIT Principio El tubo MGIT para detección de crecimiento micobateriano es caldo midlebrook 7H9 con compuesto uorescente el cual es sensible al oxí -

geno disuelto en caldo por crecimiento de los microorganismos. El kit BACTEC MGIT 960 SIRE es un análisis cualitativo con duración de 4 a 13 días. El análisis se basa en la comparación del crecimiento de la cepa aislada de M. tuberculosis en un tubo que contiene antibiótico con el crecimiento en un tubo sin antibiótico (control del crecimiencrecimien to). El instrumento BACTEC MGIT controla los tubos para detectar un aumento de su uoreuore cencia. Utiliza el análisis de la uorecencia del tubo con antibiótico en comparación de la uo recencia del tubo de control de crecimiento para determinar los resultados de sensibilidad.

Materiales Kit SIRE contiene frascos individuales liolizalioliza dos de estreptomicina 332 ug, isoniazida 33.2 ug, rifampicina 332 ug y etambutol 1,660 ug y 8 frascos de suplemento SIRE. Suplemento BACTEC BACTEC SIRE contienen 20 ml de de medio de enriquecimiento Middlebrook OADC. Formula por litro de agua: Albumina bovina 50 gr. gr. Catalasa 0,03gr 0,03gr.. Dextrosa Dextros a 20 gr. Ácido oleico 0,6 gr. Suminstrados: Kit BACTEC MGIT 90 SIRE con un frasco de cada antibiótico liolizado y ocho frascos de suplemento SIRE (se obtiene apro ximadamente 40 análisis por cada antibiótico del kit).No sumisntrados: Tubos de crecimiento MGIT 7 ml, medios de cultivo auxiliares como Middlebrook caldo 7H9, reactivos como solución salina estéril, cepas ATCC para el control de calidad y equipo de laboratorio para el proceso como vortex, nefelómetro,etc. Almacenamiento Los antibióticos antibióticos liolizados deben estar a 2 -8°C. Una vez reconstituidos se puede congelar y almacenar a temperatura igual o menor a -20°C durante un máximo de 6 meses siempre que no se pase la fecha de caducidad original. Una vez descongeladas deben usarse inmediatamente, desechar cualquier porción no utilizada. Suplemente SIRE debe almacenar en lugar oscuro de 2 -8 °C. Evitar congelación congelación y sobrecalentamiento. Abrir y usar antes de la fecha de caducidad. Reducir al mínimo la exposición a la luz


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Procedimiento Preparación antimicos: Reconstituir cada frasfras co de liolizado del kit SIRE con 4 ml de agua estéril destilada/desionizada para preparar soso luciones de reserva de estreptomicina de 83 ug/ml, de isoniazida de 8.3 ug/ml, rifampicina de 83 ug/ml y de etambutol de 415 ug/ml Preparación del inóculo: Todos las preparaciones deben realizarse a partir de cultivos puros de M. M. tuberculosis. tuberculosis. Deben estar previamente previamente identicadas y aseguras que es de cultivo puro. El inoculo puede prepararse a partir de un medio sólido de un tubo BATEC MGIT 7 ml positivo, además los que crecen en medios líquidos y sólidos se pueden utilizar para preparar un tubo MGITi MGITi de siembra que que sirve para preparar el inóculo.

8. Diluir 1 ml de la suspensión ajustada en 4 ml de solución solución salina salina estéril (dilucion 1:5). 1:5). Conti Conti-nuar con el proceso de inoculación para el análisis de sensibilidad. A partir de un tuboBACTEC MGIT de 7 ml positivos: 1. El primer día en que el instrumento registra un resultado positivo para un tubo MGIT se considera el días 0. 2. Para preparación del inóculo de análisis, debe usarse un tubo MGIT de 7 ml positivo el día después de que el instrumento BACTEC MGIT registre el resultado positivo (día 1) hasta el quinto día, inclusive (día 5) después de que el instrumento registre el resultado positivo. Si un tubo á permanecido positivo más de cinco días, se debe hacer un subcultivo en un nuevo tubo MGIR de7 ml que contenga suplemento para crecimiento BACTEC MGIT MGIT,, analizarlo en el instrumento BACTEC MGIT hasta que se registre positivo y utilizarlo de uno a cinco días después de mostrar positividad. 3. Si el tubo es positivo los días 1 ó 2, utilice el caldo de suspensión MGIT para los procedimientos de inoculación. Mezcla bien. Continuar con el proceso de inoculación para el análisis de sesibilidad. Preparación de un tubo MGIT de siembra a partir de medios sólidos 1. Con un asa de inoculación estéril retire el crecimiento del agar inclinado y añádalo a un tubo MGIT de 7 ml suplementado con 0.8 ml de suplemento para crecimiento BACTEC MGIT. 2. Cierre bien y mezcle suavemente invistiendo 2 a 3 veces. 3. Ponga el tubo en el instrumento BACTEC MGIT y analice hasta obtener un resultado positivo. El tiempo para para obtener positivo positivo debe ser igual o superior a 4 días para su uso como inóculo AST. Si se vuelve positivo antes de los 4 días volver al paso 1 y preparar un tubo nuevo de siembra. 4. Proceda a utilizar el tubo durante el día uno al cinco después de la positividad. Continuar con el procedimiento a partir de un tubo BACTEC 7 ml positivo.

A partir partir de Medios Sólidos: 1. Aagregar 4 ml de cald Middlebrook 7H9 o caldo de MGIT a un tubo estéril de 16.5 x 128 mm con tapon de rosca con 8 a 10 microesferas de vidrio. 2. Con un asa estéril separar el mayor número de colonias de un cultivo de 14 días como máximo, evitando evitando recoger medio sólido. Poner en suspensión las colonias en el caldo Middlebrook 7H9. 3. Agitar la suspensión en un agitador Vortex durante 2 – 3 min para dispensar los grumos más granes. La turbidez de la suspensión debe superar el patrón 1.0 de McFarland. 4. Dejar que la suspensión repose durante 20 minutos sin moverla. 5. Transferir el líquido sobrenadante a otro tubo estéril de 16.5 x 128 mm con tapón (evitar transferir parte del sedimento) y deja reposar por 15 minutos. 6. Transferir el líquido sobrenadante (debe eses tar homogéneo sin grumos) a un tercer tubo estéril de 16.5 por 128 mm. (en este paso la suspensión el microorganismo debe ser superior a 0.5 de MacFArland MacFArland 7. Ajustar la suspensión a un patrón 0.5 de MacFarlan mediante comparación visual con Procedimiento de inoculación para el análisis un patrón 0.5 o con con u nefelómetro. nefelómetro. No ajustar de sensibilidad con el kit BACTEC MGIT 960 por debajo del 0.5 de Mac fArland. SIRE: Revista No. 1 Enero Enero - Marzo Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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1. Etiquetar cinco tubos MGIT de 7 ml para cada cepa aislada analizada. Etiquetar uno como CC (control de crecimiento), uno como STR, uno como INH, uno como RIF y uno como EMB. Colocar los tubos en la secuencia correcta en el transportador del tamaño apropiado para el conjunto de AST. 2. Agregar asépticamente 0.8 mL de suplemento BACTEC MGIT SIRE a cada tubo. Importante utilizar el suplemento suministrado con el kit. 3. Con una micropipeta, transferir asépticamente 100 ul de la solución MGIT STR de 83 ug/mL al tubo MGIT que tiene la etiqueta coco rrespondiente. Con una micropipeta, transferir asépticamente 100 uL de la solución MGIT INH de 8.3 ug/mL al tubo MGIT con la etiqueta co correspondiente. Con una micropipeta 100 100 uL de RIF de 83 ug/mL al tubo MGIT con la etiqueta correspondiente. Con una micropipeta transferir 100 uL de EMB de 415 ug/mL al tubo MGIT con la etiqueta cocorrespondiente. Importante agregar el antifímiantifímico apropiad apropiad al tubo corresponiente. corresponiente. No agregar antifímico al tubo de control de crecimiento.

Los antifímicos se reconstituyen con 4 ml de agua estéril/desionizada para lograr la concen tración adecuada 4. Preparación de inóculo del tubo de Control de Crecimiento: Con una pipeta, transferir asépticamente 0.1 mL de la suspensión de microorganismos (Preparación de inóculo) a 10 ml de solución salina estéril para preparar la suspensión 1:100 de control de crecimiento. crecimiento. Mezclar bien la suspensión de control de crecimiento. Inocular 0.5 mL de la suspensión 1:100 de control de crecimiento en el tubo MGIT que tiene la etiqueta CC

precauciones estándar y las normas operativas de seguridad. El trabajo con cultivos de M. tuberculosis requiere prácticas, equipo de contención e instalaciones de nivel des eguridad biológica (BSL)3. Antes de usar debe revisar los tubos y frascos en busca de indicios de contaminación o daño. Desecharse los que no parezcan aptos. No deben usarse tubos con daños. En caso que se rompa un tubo: 1. Cierre los cajones del instrumento 2. Apagar el instrumento. 3. Desalojar la zona inmediatamente 4. Consultar las normar de manejo de manipulación de líquidos y materias contaminadas así como aerosol de micobacterias descritas. 4. Preparación de inóculo del tubo de Control de Crecimiento: Con una pipeta, transferir asépticamente 0.1 mL de la suspensión de microorganismos (Preparación de inóculo) a 10 ml de solución salina estéril para preparar la suspensión 1:100 1:100 de control de crecimiento. Mezclar bien la suspensión de control de crecimiento. Inocular 0.5 mL de la suspensión 1:100 de control de crecimiento en el tubo MGIT que tiene la etiqueta CC

Advertencias y Precauciones Toda muestra para análisis debe manejarse como potencialmente infecciosas y seguirse las precauciones estándar y las normas operativas de seguridad. El trabajo con cultivos de M. tuberculosis requiere prácticas, equipo de contención e instalaciones de nivel des eguridad biológica (BSL)3. Antes de usar debe revisar los tubos y frascos en busca de indicios de contaminación o daño. Desecharse los que no parezcan aptos. No deben usarse tubos con daños. En caso que se rompa un tubo: 1. Cierre los cajones del instrumento 2. Apagar el instrumento. 3. Desalojar la zona inmediatamente 4. Consultar las normar de manejo de manipulación de líquidos y materias contaminadas así como aerosol de micobacterias descritas.

Advertencias y Precauciones Toda muestra para análisis debe manejarse como potencialmente infecciosas y seguirse las Revista No. 1 Enero Enero - Marzo Marzo 2016 Clinica Clinica de Enfermedades Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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NORMAS DE PUBLICACIÓN 2014 La revista de Medicina Interna de Guatemala es el órgano ocial de divulgación de la Asociación de Medicina Interna de Guatemala (AMIG) y tiene como principal objetivo establecer un eje de comunicación e integración entre los médicos internistas de Guatemala. La publicación es cuatrimestral y es distribuida en hospitales, facultades de ciencias de la salud, clínicas, instituciones educadoras y de investigación, así como por vía electrónica y colocada en la página electrónica de la AMIG. Nuestros principales lectores son especialistas en Medicina Interna y sub-especialistas de Medicina Interna. El contenido de la revista puede ser consultado vía internet, en el sitio www.asomigua.org o a través de Facebook: Asociación de Medicina Interna de Guatemala. La revista recibe trabajos en español, con resumen en inglés, y está constituida por secciones de editorial, artículos originales, artículos de revisión (actualización), notas previas/cartas al editor, derecho a respuesta (una sola), fotos clínicas, casos interesantes. Asimismo, la revista ofrece cobertura e información sobre los principales eventos cientícos relacionados a la especialidad. Los artículos de revisión (actualización) serán solicitados por el comité editorial según las necesi dades epidemiológicas y clínicas para Guatemala. Los manuscritos en triplicado serán dirigidos al Dr. Carlos Rodolfo Mejía Villatoro coordinador del comité editorial de la revista y recibidos en la sede de la Asociación de Medicina Interna de Guatemala en la 12 calle 2-04, zona 9, edicio Plaza del Sol, ocina 319 nivel 3, ciudad de Gua temala. Se puede remitir el texto por vía electrónica a la dirección [email protected] en formato Word utilizando letra arial 12 a doble espacio en una solo columna. Los trabajos serán evaluados por el coordinador del comité editorial y por dos especialistas anónimos elegidos entre los miembros del comité Editorial y entre los aliados de la Asociación de Medicina Interna de Guatemala con reconocida experiencia en el asunto. El comité Editorial tiene la facultad de rechazar aquellos trabajos que no juzgue apropiados, así como de proponer modi caciones cuando lo considere necesario. La correspondencia con los autores será realizada, por correo electrónico exclusivamente.

Los trabajos deben de seguir la siguiente estructura: 1. Carta de presentación Los trabajos deberán ser precedidos de una carta de presentación dirigida al coordinador del comité editorial, en la que se incluya el título del trabajo, un párrafo destacando la importancia del artículo y la sección en la que se solicita la publicación. Los autores deben explicitar que el trabajo no ha sido publicado con anterioridad ni ha sido enviado simultáneamente a otra revista. Asimismo, se indicará que todos los autores están de acuerdo con el contenido del trabajo, que ceden los derechos de publicación a la Revista Medicina interna de Guatemala y que no existen conicto de intereses. El formato general para las diversas secciones de la Revista se presenta de la siguiente manera:


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2. Primera pagina La primera página del trabajo incluirá obligatoriamente los siguientes puntos: - Título del trabajo conciso, completo y explicativo sobre el asunto al que se reere. - Nombre completo de los autores, sin abreviaciones. Los autores deberán indicar la forma en que deseen ser citados. - Título académico completo de los autores, con el nombre y la dirección de la institución de trabajo a la que están aliados. - Especicación de la unidad o departamento de la institución donde el trabajo fue realizado. - Nombre, dirección, e-mail y número de teléfono/fax del autor designado para recibir la correspondencia. 3. Resumen: El resumen debe presentar los siguientes puntos: Ser enviado en el idioma original (español o inglés). En los casos de artículos en inglés, se deben enviar el resumen en español e inglés. Extensión máxima de 300 palabras para los artículos originales y revisiones, y de 250 palabras para las notas previas y relatos de casos. Ser informativos y no indicativos, explicando de forma clara los objetivos, métodos, resultados y conclusiones derivadas del estudio. En los descriptores deben incluirse por lo menos 3 y hasta un máximo de 10 palabras-clave, en el idioma original y en inglés, empleadas en el DeCS Descriptores en Ciencias de la Salud, publicación de la BIREME (Centro Latino-Americano y del Caribe de información en ciencias de la Salud), disponible en http://decs.bvs.br o en el índex Medicus (Medical Subject Headings), disponible en http://www.ncbi.nlm.gov/entrez/meshbrower.cgi Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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4. Cuerpo del texto El trabajo debe de ser dividido en las siguientes partes: Introducción: debe de ser sucinta, proporcionando únicamente la información necesaria para comprender el trabajo que será presentado posteriormente. No se deben incluir datos ni conclusiones. El último párrafo deberá exponer de forma clara los objetivos del trabajo. Materiales (o Pacientes) y Métodos: debe explicar la metodología utilizada, los criterios de selec ción empleado información sobre la población, estudiada, datos sobre los análisis estadísticos e información concerniente a los aspectos éticos del estudio. Aspectos Éticos: los artículos sobre investigaciones con seres humanos deben presentar la autorización previa del Comité de Ética de la institución en la que se realizó el estudio, así como mencionar la obtención de consentimiento por escrito, después que el paciente, sus familiares o su representante legal (en el caso de menores o discapacitados) hayan sido informados sobre los procedimientos o estudios a ser realizados. Los artículos sobre ensayos con modelos biológicos deben presentar la aprobación de los protocolos obtenidos. Los nombres comerciales de los medicamentos deben ser acompañados del nombre genérico correspondiente, esclareciendo siempre las dosis y la vías de administración. Resultados: deben de exponerse exclusivamente la descripción y no la interpretación de los datos obtenidos con la metodología utilizada en el trabajo. Deben de resumir las observaciones más importantes con cuidado de no repetir las informaciones mostradas en tablas, guras o grácos. En caso que se requiera presentar un volumen grande de datos, deberá preferirse los grácos en lugar de las tablas. Discusión: deben de resaltarse las conclusiones y los aspectos más i mportantes del trabajo. Deberá evitarse repetir las informaciones ya presentadas. Se resaltaran las inferencias de los resultados, las deducciones elaboradas y también las limitaciones del estudio. Deberá de comparase los resultados con los de otros estudios y confrontar las observaciones nales con los objetivos del trabajo. Agradecimientos: deben ser limitados a los individuos e instituciones que efectivamente contribuyeron para la realización del estudio. Financiamientos: información detallada sobre la fuente de nanciamiento. Si no existe ayuda  nanciera, los autores deberán declarar que no existe conicto de intereses.

5.Material ilustrativo Cualquier material utilizado para ilustrar el trabajo (tablas, guras o fotografías) debe ser presentado en hojas aparte, al nal del texto, cada una en una página diferente. Tablas: deben ser numeradas conforme el orden de parecimiento en el texto, utilizando número arábigos y deben ser auto explicativas. El título debe ser claro e informativo. Las observaciones necesarias para esclarecer abreviaturas u otros serán colocadas al pie de la tabla. El formato de la misma debe de utilizar los comandos de tabulación (tab) y nueva línea (enter).


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Figuras: Deben de ser numeradas conforme orden de aparecimiento en el texto, en números arábigos. Todas las explicaciones deben de ser presentadas en las leyendas. Los grácos y guras deben de ser enviados en “power point”. En el caso de guras y fotografías, se deberá colocar en el dorso una etiqueta adhesiva en la que se indique el nombre del primer autor y una echa señalando el margen superior. Las fotografías digitales deben de ser enviadas con buena de nición (mínimo 300DPI). De ser necesario, utilizar siempre imágenes producidas por impresoras de alta resolución y en blanco y negro.

6. Referencias bibliográcas Las referencias deben ser numeradas consecutivamente en el orden en que fueron mencionadas en el texto, debiendo ser identicadas en números arábigos colocados como exponentes. Los nombres de las revistas deben ser abreviados de acuerdo con el “Índex Medicus”, disponible en: http://www.ncbi.nlm.gv/jrbrowser.cgi. Las citas deberán comprobarse sobre los artículos originales y se ordenaran según las normas de Vancouver (1997, edición revisada de Octubre de 2001), disponible en: http://www.icmje.org. Todos los autores deben ser citados, independientemente de su numero y deberá evitarse escribir para números grandes de autores: et al. No se emplearan frases como “comunicaciones personales”. Los trabajos aceptados y no publicados en el momento de ser citados pueden ser incluidos en las referencias, especicando el nombre de la revista, seguido de la expresión “en prensa” entre paréntesis. A continuación se citan algunos ejemplos de los principales tipos de referencias utilizadas. a) Artículo de revista: 1. Bryan CS, Reynolds Kl. Bacteremic nosocomial pneumonia. Am Respir Dis 1984;129:668-671. 2. Carratala J, Guidol R, Pallares R, Dorca J, Verdaguer R, Ariza J, et al. Risk factors for nosocomial Legionella pneumophila pneumonia.Am Rev Respir 1994; 149:625-629.

b) Trabajo publicado por una institución o corporación: Ministerio de Sanidad y consumo. Liga Española para la Lucha Contra la Hipertensión. Sociedad Española de Hipertensión. Control de la hipertensión arterial en España. Rev Esp Salud Pública 1996; 70:139-210. OMS. Informe Anual de Mortalidad Materna en las Américas. Año: xxxxx. Disponible en: www. who.org por ejemplo. Encuesta Nacional de Salud Materno Infantil, Guatemala: Año: xxxxs c) Volumen con suplemento: Vogel F. Sequential Therapy in the hospital management of lower respiratory infections. Am J Med 1995; 99 (Supl 6B) : 13S-19S d) Libros, tesis y monogracas: 1. Hawe P, Degeling D, Hall J. evaluación en promoción de la salud. Guía para trabajadores de la salud. 1st ed. Barcelona: Masson;1993. 2.World Health Organization. International drug monitoring the role of national centers. Technical Report Series Nº 498.Geneva: 1972. 3.Kaplan SJ. Post-hospital home health care: the elderly`s access and utilization (dissertation). St. Louis (MO): Washinton Univ.;1995. Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt

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4. Nuñes L. Aspectos clínicos, hematológicos e inmunológicos en la estrongyloidiasis. Tesis Universidad Central de Venezuela; 1993.

e) Capítulo de libro: Rawlins MD, Thompson JW. Mechanisms of adverse drugs reaction. En Davies DM, editor. Textbook of Adverse Drug Reaction.4th ed. Oxford University Press; 1991 p 18-45. f) Resumen de congreso: Vettorello ML. A inuencia de fatores climaticos na incidencia dos acidentes loxoscelicos no Municipio de Curitiba, no period de 1998 a2001. XXXIX Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 008 TL. Belem, 2003 g) Articulo de fuente o revista electrónica 1. The Counter Bioterrrorism Research Agenda of the National I nstitute of allergy and Infectious Diseases for CDC Category A Agents. Washington, DC: National Institute of Allergy and Infectious Diseases; February 202. Disponible en: http://www.nih.gov/dmid/pdf/bioresearchagenda. pdf. 2. Carucci JA, McGovern TW, Norton SA. Cutaneos anthrax management algorithm. J Am Acad Dermatol 2001; Nov 21. Disponible en: http://www.harcourthealth.com/scripts/om.dll/server?arttype=full&article=a121613.


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