REMOCIÓN DE BIOFILMS Blga. Mariela Vinces Ing. Alan Castillo
¿Qué un biofilm? Es una población de células creciendo adheridas a una superficie y/o, entre ellas, en agregados y embebidas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares (SPE)
Thallinger, et. al., 2013
¿Qué tipos de biofilms se forman? El biofilm puede estar compuesto de:
• Monoespecies
• Diversas especies
• Mezcla de fenotipos de una especie dada
A
B
C D
Vías de contaminación en la industria Los microorganismos patógenos o de alteración pueden introducirse en el proceso de elaboración: Productos de limpieza
Materia prima Aire ambiental
Personal
Equipo contaminad o
Contacto directo
Recontaminación
Superficies de trabajo
Higiene deficiente
PRODUCTO FINAL
¿En qué tipos de superficies crece un biofilm? • Superficies duras • • • •
Vidrio Metal Polímeros Materiales (superficies pintadas, linóleum and azulejos plásticos)
• Superficies blandas • • • • • •
Algodón Poliéster Rayón Nylon Lana Celulosa
Biofilms y biocorrosión • Según un estimado, aproximadamente el 20% de la corrosión anual, los daños metales y no metales de equipos industriales han sido causados por biocorrosión o corrosión microbiana inducida (MIC)
Válvula
Microorganismos en biofilms y corrosion • Algunos microorganismos en biofilms catalizan reacciones químicas y biológicas. • Son causantes de corrosión del metal en tuberías, maquinaria de bombeo y tanques de almacenamiento
Bacterias Sulfato-reductoras • Las bacterias reductoras de sulfato (SRB), se han encontrado como responsables de los casos máximos de biocorrosión. • Forman biofilms sobre metales y su actividad genera H2S, que tienden a promover la corrosión y el ataque localizado.
Adhesión dependiente del tipo de acabado De izquierda a derecha de un acero inoxidable tipo 304 2b con acabo normal (1) hasta el final con electropulido (4)
1
2
3
4
Etapas de formación de un biofilm 1) 2) 3) 4) 5)
Adhesión inicial a la superficie Colonización y producción de SPE Estructura temprana del biofilm Estructura madura del biofilm Liberación y dispersión de células (a) liberación de células planctónicas móviles (b) liberación de un fragmento del biofilm.
b
1
2
3
4
5
a
Etapa 1: Adhesión inicial (adhesión irreversible) Una vez alcanzado el contacto célula-superficie, intervienen apéndices proteínicos de la superficie celular para su adhesion: 1) Fimbria 2) Pili 3) Flagelos
FAVORECEN LA ADHESIÓN A LAS SUPERFICIES Y ENTRE CÉLULAS (20 min – 4 h)
Adhesión dependiente del tipo de polímero Aplicación de microscopía de fuerza atómica (AFM)
nN
Mide la magnitud o fuerza repulsiva o de atracción sobre diferentes superficies: • minerales, • metálicas, • macromoléculas o • superficies microbianas
Etapa 2: Colonización y producción de SPE (Sustancia polimérica extracelular) •
La formación de la microcolonia será precedida de la adhesión irreversible dadas las condiciones de crecimiento apropiadas
•
Resultado simultáneo de la agregación y del crecimiento de microorganismos, proceso acompañado por la producción de SPE por los mismos microorganismos
Etapa 2: Colonización y producción de SPE (Sustancia polimérica extracelular) •
•
La producción de SPE es activada es respuesta a estímulos externos, así como la densidad celular, estrés o limitación de nutrientes En respuesta a la adhesión y estímulo ambiental, así como la presión osmótica, pH, temperatura e inanición
Etapa 2: Colonización y producción de SPE (Sustancia polimérica extracelular) Un biofilm es un material complejo de SPE:
1) Polisacáridos, 2) Proteínas,
3%
3) Glicoproteínas, 4) Ácidos nucleicos 5) Lípidos
Estructura de un biofilm maduro Biofilm Pseudomona aeruginosa desarrollado sobre acero inoxidable durante 48 h
Objetivo 40 X
Tinción VITAL
Un verdadero Biofilm debe contener al menos 104 ufc/cm2
20 µm
Formación de biofilms bacterianos
• • • • • • •
Pseudomonas spp. Listeria Enterobacter Flavobacterium Alcaligenes Staphylococcus Bacillus
Géneros que forman con facilidad
• • • • • •
Salmonella spp. Escherichia coli Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Campylobacter jejuni Yersinia enterocolitica
Importancia en relación con la seguridad alimentaria
Formación de biofilms fúngicos • • • • • • •
Saccharomyces cerevisiae Brettanomyces Hansenula Pichia Candida albicans Candida dubliniensis Aspergillus fumigatus
Hongos (filamentosos y levaduriformes)
Mecanismo de acción de los biocidas Ácidos nucleicos Aldehídos Óxido de etileno Peroxygens Halógenos
Membrana celular Compuestos de amonio cuaternario (QACs) Alcoholes Fenólicos ADN
ARNm Ribosomas
Pared celular Aldehídos Citoplasma, producción ATP Peroxygens Halógenos
Proteínas Metales pesados Yodóforos
Por qué es resistente un Biofilm:Quorum sensing Es un proceso de comunicación de célula a célula que permite a la bacteria compartir información y detectar la densidad celular y en consecuencia ajustar la expresión génica
¿Cómo funciona quorum sensing? El proceso está mediado por pequeñas moléculas, producidas y secretadas por las mismas células (autoinductoras o de señalización)
Células
Autoinductoras (AIs)
¿Cómo funciona quorum sensing? …y su síntesis es dependiente de la densidad celular
Más Biofilm
Menor Biofilm Así, la concentración de las moléculas AI’s representa una medida del número de células en el biofilm
AI’s: Hay dos tipos principales de moléculas
• Homoserinlactonas (A-HSL)
• Moléculas peptídicas (AIP)
Gram Negativas Gram Positivas
AI’s: Responsables de la regulación de varios procesos fisiológicos
Moléculas antibiofilm
Sustancias que intervengan en cada una de las diferentes etapas de formación de un biofilm Enzimas Células planctónicas Enzimas
Rendueles, O., Ghigo, JM. (2012) Multispecies-Biofilms: how to avoid unfriendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 1 – 18.
Métodos de detección y control
Métodos de detección
Métodos convencionales • Hisopos • Esponjas • Placas de contacto
• Fracciones de superficies 27
Métodos de detección
Métodos rápidos • Técnicas microscópicas (DEM) • Tinción directa del biofilm por producto • Sensores de higiene + método rápido
• Métodos enzimáticos (Detección de ATP por bioluminiscencia) 28
Microscopía de epifluorescencia directa
Tinción VITAL
29
Tinción de biofilm con productos
30
Detección por el método de cristal violeta Agregar 100 µl de agua destila y 25 µl de cristal violeta al (1% en agua) sobre los discos. Incubar 15 min a temperatura ambiente, enjuagar tres veces con 5 ml de agua destilada (total 15ml). Colocar los discos en frascos con 2 ml de etanol y 3 g de perlas. Agitar por 15 s. Leer la absorbancia de 125 µl de la solución cristal violeta-etanol a 595 nm con un lector de microplaca.
(O’Toole and Kolter 1998) 31
Detección de ATP por bioluminiscencia
Luciérnaga (Photinus pyralis)
Adenosin trifosfato (Adenosine TriphosPhate)
Propiedad de producir luz que tienen algunos organismos
Equivalente a la cantidad de ATP Luciferina-luciferasa + ATP de muestra Lectura en luminómetro Unidades Relativas de Luz (URL)
hʋ
O2 + Mg2+ 32
Luz + Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2
Contenido de ATP en microorganismos
Shama, G., Malik, D.J., The uses and abuses of rapid bioluminescence-based ATP assays. Int. J. Hyg. Environ. Health (2012), http://dx.doi.org/10.1016/j.ijheh.2012.03.009
33
METODO ENZIMATICO
Es un producto químico especializado para la detección de biofilms y contaminación en superficies en la industria alimentaria, farmacéutica y en restauración, etc… Actúa como auxiliar en el control de la higiene, diseñado especialmente para superficies abiertas 34
Fruto de un proyecto de I + D en colaboración con:
Composición y propiedades físico-químicas • Composición: Otros reactivos Tensioactivos Blanqueantes oxigenados • Propiedades físico-químicas Aspecto: Líquido transparente Viscosidad: 300 – 500 cP Color: Anaranjado pH: 4,5 – 5,5 36
BioFinder: Un método rápido • Puede
ser clasificado como un método rápido microbiológico
• Específicamente como un método enzimático • Se basa en la reacción del biofilm con el peróxido de
hidrógeno debido a la presencia de la enzima catalasa proveniente de los microorganismos que forman el biofilm 37
BioFinder: Un método enzimático cualitativo • Por
tanto, la reacción microorganismos viables
solo
es
posible
en
• La reacción es detectada visualmente • BioFinder
(método cualitativo) es similar a la detección de Trifosfato de adenosina (ATP) por bioluminiscencia (método semi-cuantitativo)
38
Reacción enzimática • La enzima catalasa (naturaleza proteica) cataliza la
degradación de dos moléculas de peróxido de hidrógeno a dos moléculas de agua y una de oxígeno. Catalasa
• El
oxígeno liberado será el responsable de la formación de las microburbujas que desarrollarán a su vez una espuma blanquecina
39
Con cuáles microorganismos reacciona • Con microorganismos catalasa-positivos • Las
enzimas catalasas enzimas antioxidantes (proteínas) que está presentes en la mayoría de organismos vivos, incluyendo microorganismos como: La mayoría de microorganismos aerobios (bacterias,
levaduras y hongos) Anaerobios facultativos o aerotolerantes, como Lactobacillus plantarum
40
Recomendaciones de aplicación • Usar puro, no diluir, ni agitar el producto para su aplicación • Aplicar a temperatura ambiente • Aplicarlo después de los procesos de limpieza y desinfección* • En caso de una reacción positiva con el producto, repetir el procedimiento de higienización en las zonas afectadas. * Muy importante, ya que de ésta manera tendremos la seguridad que la reacción será debida a un biofilm 41
¿Cómo se aplica? • Pulverizar suavemente con BioFinder las superficies de la instalación a una distancia de 10 – 15 cm (temperatura ambiente)
42
Visual reaction • Observe the surface REACCCIÓN NEGATIVA
43
REACCIÓN DÉBIL POSITIVA
6,60E+04
1,64E+05
2,01E+06
3,03E+06
Mezcladora (borde debajo de junta plástica)
REACCIÓN FUERTEMENE POSITIVA
44
Cisterna de leche (toma para la transferencia)
45
Tanque receptor de leche (toma para la transferencia)
46
Rejillas de canal de drenaje
Mesas de trabajo
Mesas de trabajo
Mesas de trabajo
Lateral del separador en banda transportadora
Cajas de acero inoxidable
Cajas plásticas
Cajas plásticas
Lavamos
Lateral plástico de equipo de trabajo
Máquina automática de corte
Rodillo de máquina automática de corte
Máquina picadora de carne
Utensilios de trabajo
Utensilios de trabajo
Corchos
Haragán o jalador
Estropajo
Biofilm compuesto de una mezcla de Salmonella Typhimurium con Pseudomonas aeruginosa desarrollado durante 48 h a 37°C sobre una superficie de acero inoxidable.
ANTES DE PRODUCTO ENZIMÁTICO
DESPUÉS DE PRODUCTO ENZIMÁTICO
Biofilm compuesto de una mezcla de Salmonella Typhimurium con Pseudomonas aeruginosa desarrollado durante 48 h a 37°C sobre una superficie de acero inoxidable
ANTES DE PRODUCTO ENZIMÁTICO
DESPUÉS DE PRODUCTO DESINFECTANTE
Biofilm compuesto de una mezcla de Salmonella Typhimurium con Pseudomonas aeruginosa desarrollado durante 48 h a 37°C sobre una superficie de acero inoxidable
ANTES DE PRODUCTO ENZIMÁTICO
SIN PRODUCTO ENZIMÁTICO Y DESPUÉS DE PRODUCTO DESINFECTANTE
