Relatório referente à aula prática de Bioquímica I
Caracterização de lipídeos
Presidente Prudente 2012 1
SUMÁRIO 1. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 3 2. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 3 2.1. Lipídios ........................................................................................................................... 3 3. REAGENTES E PROCEDIMENTOS ............................................................................... 4 3.1. Esteróides: Caracterização e dosagem do colesterol ...................................................... 4 3.2. Reações para Lipídios saponificáveis ............................................................................. 5 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 7 4.1 Esteróis: Caracterização e dosagem de colesterol ........................................................... 7 4.2. Reações para lipídios saponificáveis .............................................................................. 8 4.3. Separação dos ácidos graxos......................................................................................... 10 4.4. Propriedades dos sabões e ácidos graxos ...................................................................... 10 5. CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 12 6. REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 13
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1. Objetivos
Caracterizar um esterol através de suas reações de coloração; Caracterizar triacilglicerois através de hidrólise alcalina (saponificação); Evidenciar a formação dos produtos de hidrólise (sabões) pelas suas propriedades.
2. Introdução Os lipídios constituem uma classe de compostos com estrutura bastante variada, caracterizados por sua alta solubilidade em solventes orgânicos e por serem praticamente insolúveis em água. Exercem diversas funções biológicas, como componentes de membranas, isolantes térmicos e reservas de energia; eles próprios ou seus derivados também participam em algumas funcões de vitaminas e hormônios. Muitos lipídios são compostos anfipáticos. ou seia. apresentam na molécula uma porção polar, hidrofflica, e uma porção apoiar, hidrofóbica [1]. Os ácidos graxos são ácidos monocarboxílicos anfipáticos. Geralmente com uma cadela carbônlca longa, com número par de átomos de carbono e sem ramificações, podendo ser saturada ou conter uma insaturação ou duas ou mais insaturacões. O grupo carboxila constitui a região polar, e a cadeia carbônica, a parte apoiar. Ácidos graxos livres são poucos encontrados nos organismos, estes sendo mais frequentemente estão ligados a um álcool, que pode ser o glicerol ou esfingosina. Os lipídios resultantes no primeiro caso são os triacilglicerois e os glicerofosfolipidios; no segundo caso são os esfingolipideos (Hgura 1). Os triacilgliceróis são uma forma de armazenamento de ácidos graxos: os glicerofosfolipídios e os esfingolipldeos, juntamente com o colesterol, fazem parte das membranas celulares [1].
Os triacilgliceróis constituem a maneira mais eficiente de armazenar energia nos seres vivos. O seu caráter fortemente hidrofóbico permite o armazenamento sob forma praticamente 3
anidra, ou seja, sem moléculas de água adsorvida, as quais aumentam muito o peso da reserva de energia. Além disso, como são compostos altamente reduzidos, sua oxidação libera muito mais energia que a oxidação de quantidades equivalentes de carboidratos ou proteínas. Nos vertebrados, os triacilgliceróis são depositados no tecido adiposo, de localização visceral e subcutãnea. que atua também como isolante térmico e como proteção contra traumas mecânicos [1]. Ao contrário dos triacilglioeróis, todos os outros lipídios mencionados anteriormente são moléculas anfipaticas. Nos fostolipídios (glicerotosfolipídios e esiingomieiinas) a porção hidrofilica é constituida pelo grupo iosfato, que apresenta carga negativa em pH fisiológico. ligado a uma outra molécula. também polar. Que pode ter carga positiva (colina e etanolamina). carga negativa (serina) ou não apresentar carga (inositol). Os glicolipidios (oerebrosldios e gangliosidios) contem açúcares hidrofílicos. que podem não apresentar carga (glicose e galactose) ou apresentar carga positiva devido à presença de grupos amino. A porção hidrofílica do colesterol é representada por uma hídroxila, e o restante da molécula é apoiar. A região hidrotóbica do colesterol é representada por uma hidroxila, e o restante da molécula é apolar. A região hidroióbica dos demais lipídios anfifllicos mencionados é
representada pelas cadeias de hidrocarboneto da esfingosina e/ou dos ácidos graxos. Os lipídios antipáticos são elementos estruturais importantes das membranas biológicas [1,2].
3. Reagentes e Procedimentos 3.1 Esteróides: Caracterização e dosagem do colesterol a) Reação de Salkowski (qualitativa) Reativos: Solução clorofórmica de colesterol 1% Ácido sulfúrico concentrado.
Técnica: Em um tubo de ensaio bem seco colocar 1 mL de solução clorofórmica de colesterol e acrescentar 1 mL de ácido sulfúrico concentrado.
b) Reação de Liebermann-Burchard (quantitativa) Reativos: Solução padrão de colesterol a 0,2% em ácido acético glacial.
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Reagente cromogênico: anidrido acético 220 mL + ácido acético glacial 200 mL + ácido sulfúrico concentrado 30mL Soro humano
Tubos Padrão de colesterol 0,2 % (mL) Ácido acético glacial (mL) Amostra de soro (mL) Reativo cromogênico (mL)
1 0,5 6,0
2 0,1 0,4 6,0
3 0,2 0,3 6,0
4 0,4 0,1 6,0
5 0,5 6,0
6 0,4 0,1 6,0
Técnica: Misturar e levar os tubos ao banho-maria a 37°C por 20 minutos e ler as absorbâncias em fotocolorimetro com filtro vermelho (660 nm).
3.2 Reações para Lipídeos saponificáveis 1. Solubilidade: Técnica: Colocar em 3 tubos de ensaio numerados, respectivamente, 1mL de água destilada, 1 mL de álcool etílico e 1 mL de éter. Juntar a cada tubo 5 gotas de óleo vegetal de soja e notar a solubilidade do Óleo em cada um dos solventes. Em um 4° tubo de ensaio, coloque 5 mL de água destilada e transfira cuidadosamente pelas paredes deste tubo, a solução etérea contida no tubo 3, de maneira a formar uma camada de separação água-éter. Agitar suavemente e observar o aparecimento de emulsão (camada constituída por gordura cuja parte polar liga-se à água e a parte apolar ao Óleo) de óleo em água na interface. Em um 5° tubo de ensaio, prepare o tubo controle, colocando 5mL de água destilada e 1 mL de éter, para servir de comparação com o quarto tubo.
2. Saponificação: Técnica: Colocar em um tubo de ensaio grande 1 mL de óleo vegetal de soja. Adicionar 2 mL de solução alcoólica de hidróxido de potássio a 10%. Aquecer cuidadosamente em banho de água fervente durante aproximadamente 8 minutos. Adicionar 10 mL de água destilada e agitar com bastão de vidro, continuando o aquecimento em banho-fervente por 10 minutos.
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3. Separação de ácidos graxos: Técnica: Transferir metade do conteúdo do tubo contendo sabões (obtido no ensaio 2, de saponificação) para outro tubo de ensaio. Verificar o pH desta solução mergulhando um bastão de vidro e testando com papel tornassol. Juntar a solução contida no tubo, HCl 1:2 gota a gota até pH ácido, observado pela mudança de cor no papel de tornassol. Verificar a separação da mistura em duas camadas, Deixar o tubo em banho-fervente até a fusão da camada superior. Conservar o tubo em banho fervente para ensaios posteriores e colocar também um outro tubo de ensaio contendo 5 mL de água destilada para aquecer neste banho fervente. 4. Propriedades dos sabões e ácidos graxos: Técnica: a) Solubilidade dos sabões: Ao tubo contendo a solução restante do sabão (obtido no ensaio 2 de saponificação), adicionar 5 mL da solução saturada de cloreto de sódio. b) Formação de sabões por redissolução dos ácidos graxos: Com auxílio de uma pipeta de vidro transferir 3 gotas do óleo obtido no ensaio 3 (separação de ácidos graxos), para um tubo contendo cerca de 5 mL de água destilada quente (conforme experimento 3). Adicionar gotas de solução KOH 1M até a solubilidade da fase oleosa. Agitar suavemente o tubo e verificar a formação de espuma. Conservar esse tubo para ensaios posteriores. Não o despreze.
c) Formação de sabões insolúveis: Dividir o tubo contendo os sabões obtidos no ensaio 4-b em duas partes, numerando os tubos 1 e 2. Dobrar visualmente o volume de cada tubo com adição de água destilada. Ao primeiro tubo adicionar 4 gotas de cloreto de cálcio a 5% e ao segundo adicionar 4 gotas de acetato de chumbo a 1%. Agitar os tubos. d) Formação da acroleína: Colocar em um tubo de ensaio uma “ponta de espátula” de bissulfato de potássio sólido
e 5 gotas de óleo de soja. Aquecer cuidadosamente em chama direta, segurando o tubo com uma garra de madeira, até desprendimento de acroleína, detectável pelo odor característico. e) Adição de iodo: 6
Colocar em 3 tubos de ensaio enumerados, respectivamente, 1 mL de óleo de canola, 1 mL de óleo de soja e 1 mL de óleo de girassol. Diluir o conteúdo de cada tubo com 2 mL de clorofórmio. Preparar um controle representado pelo tubo número 4, com 2 mL de clorofórmio. Adicionar 3 gotas de solução de iodo clorofórmica a 1% em cada tubo, agitar. Deixar em repouso na estante, SEM AGITAR OS TUBOS e acompanhar a descoloração das soluções , anotando o tempo inicial de descoloração para cada tubo.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES 4.1 Esteróides: Caracterização e dosagem do colesterol a-Reação de Salkowski (qualitativa) Tabela 01- Dados experimentais Reação de Salkowski Reativos Observações Solução clorofórmica de colesterol 1% + Foi observado o desenvolvimento de uma Ácido sulfúrico concentrado coloração vermelha devida ao colesterol
b-Reação de Liebermann-Burchard (quantitativa) Tabela 02- Dados experimentais Reação de Lieberman-Burchard Tubos 1 2 3 Padrão de colesterol 0,2 % (mL) 0,1 0,2 Ácido acético glacial (mL) 0,5 0,4 0,3 Amostra de soro (mL) Reativo cromogênico (mL) 6,0 6,0 6,0 Absorbância 0,0 0.103 0,125
4 0,4 0,1 6,0 0,221
5 0,5 6,0 0.255
6 0,4 0,5 6,0 0.264
Gráfico da curva padrão de colesterol. Cálculo dos Resultados
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Camostra = CP x
ΔAamostra (mg/mL) ΔApadrão
ΔAamostra/P =
(Aamostra/P - Abranco)
Fator de conversão: C (mg/mL) x 0,022586 = C (mmol/mL) Obs: Nossa amostra apresentou um valor aproximado de 186,5mg% de colesterol séricos totais.
4.2 Reação para lipídeos saponificáveis 1-Solubilidade Tabela 03- Solubilidade dos lipídios em água e em solventes orgânicos Tubos Solubilidade insolúvel 1 pouco solúvel 2 solúvel 3 Ordem de solubilidade: tubo 3 > tubo 2 > tubo 1 A solubilidade foi maior no tubo 3, que continha 1 mL de éter e cinco gotas de óleo de soja, pois apesar do éter ser polar ele é menos polar que á agua devido aos grupos metila presentes nas extremidades de sua cadeia. Estes grupos permitem ao éter solvatar as moléculas de lipídeos. A solubilidade do tubo 2, que continha 1 mL de álcool etílico e cinco gotas de óleo, foi
menor, pois apesar do álcool ser polar sua solubilização é parcial, formando uma emulsão que é quando gotas de uma fase permanecem em suspensão na outra fase, devido as densidades das soluções serem bastante próximas. No tubo 1, que continha 1 mL de água destilada e cinco gotas de óleo de soja, não houve solubilização, pois a água que é bastante polar não interage com as moléculas de lipídeo, formando duas fases, uma de água e outra de óleo.
Comparação tubo 4 com tubo 5 (controle): 8
Ao transferirmos a solução etérea do tubo 3 a um outro tubo de ensaio (tubo 4) que continha 5 mL de água destilada observarmos a formação de uma interface água-éter. Por ser pouco polar o éter não se mistura com a água que é bastante polar, formando duas fases. Quando agitada, a mistura forma uma emulsão, pois o óleo contido na solução etérea se deposita na forma de pequenas gotículas sobre a água.
2- Saponificação A reação de saponificação, realizada no experimento, consistiu da hidrólise alcalina das moléculas lipídicas, isto é, o processo de quebra das ligações éster existentes nas moléculas de triacilglicerol do óleo de soja vegetal, na presença de solução alcóolica de hidróxido de potássio 10 %, e mediante aquecimento (banho-maria), tendo como produtos sais de ácidos graxos e glicerol, conforme apresentado na equação química abaixo:
Triacilglicerol
Potassa alcoólica
Glicerol
Sabão
Inicialmente o líquido apresentou duas fases distintas, representando o óleo e o KOH. Com o passar do tempo, houve uma redução do volume de óleo, à medida que gotas deste iam dispersando-se sobre o KOH. Após o aquecimento, por 5 minutos, obteve-se por completa a
reação de hidrólise alcalina com a produção do sabão e do glicerol, que juntos formaram no tubo um sistema monofásico. Para conferir maior efetividade à reação, procedeu-se à agitação do tubo, uma vez que tal procedimento favorece o contato do triacilglicerol com a potassa alcóolica, permitindo a colisão de um número maior de moléculas de reagentes, e, portanto, uma maior concentração de produtos finais.
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4.3 Separação de ácidos graxos A adição de HCl a uma solução aquosa de sabão provoca a precipitação do ácido graxo, que é pouco solúvel em água e, em solução aquosa, tende a formar dímeros através de fortes ligações de hidrogênio, e, portanto a divisão da mistura em duas fases, sendo a fase sólida composta pelo ácido graxo. A equação química abaixo representa a reação:
4.4 Propriedades dos sabões e ácidos graxos a- Solubilidade dos sabões
O exemplo acima demonstra a formação de um sal de potássio. Os sabões constituídos por sais de potássio (K+) são solúveis. Em contrapartida, os sais de cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+), formados a partir da reação do lipídeo com Ca(OH)2 e Mg(OH)2, respectivamente, são insolúveis e precipitam. A precipitação é muito útil no processo de purificação dos sabões e também pode ser feita por adição de NaCl(aq).
b- Formação de sabões por redissolução dos ácidos graxos Estamos redissolvendo o precipitado que obtemos no item (a), após a adição da solução concentrada de cloreto de sódio houve a precipitação visto anteriormente (deslocamento do 10
equilíbrio químico), ao acrescentar novamente a solução de hiroxido de potássio reestabelecemos o equilíbrio, e assim a dissolução “total” do sabão.
c- Formação de sabões insolúveis
Reações de sabões com cloreto de cálcio e acetato de chumbo formando precipitados.
d- Formação de acroleína Como a decomposição do óleo de soja gera glicerol, este reage com o bissulfato de sódio formando a acroleína, que foi identificada pelo odor característico.
e- Adição de Iodo Pelo fato dos ácidos graxos insaturados nos triacilgliceróis terem ligações duplas, eles sofrem reações de adição típicas dos alquenos. A adição de iodo por exemplo, constitui-se em uma base para a determinação do grau de insaturação (quanto mais ligações duplas no ácido graxo, mais iodo pode ser adicionado), i.e., quanto maior o índice de iodo, mais insaturados são os ácidos graxos do lipídio. Portanto o óleo que possui mais ácidos graxos insaturados é o de soja, seguido pelo do canola e por fim o que é mais pobre em ácidos graxos insaturados é o óleo de girassol
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5. Conclusão Evidenciou-se que os lipídios são moléculas que, apesar de quimicamente diferentes entre si, tem a insolubilidade em água como característica comum; apresentando solubilidade em solventes apolares como, por exemplo, o éter. Através das reações foi possível compreender as propriedades físicas e químicas dos ácidos graxos e triacilgliceróis, bem como a formação de sabões e sua separação por adição de sais, analisando o aumento da saturação da solução e da tensão superficial do líquido. Portanto, sua compreensão é de fundamental importância para entender bioquimicamente os diversos processos que ocorrem na natureza.
6. Referências Bibliográficas 12
CAMPBELL, M. K. Bioquímica. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2001.
NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: Princípios de Bioquímica. 4. ed. São Paulo: Sarvier, 2006.
HIDRÓLISE- departamento de engenharia química. Disponível em: . Acesso em: 23 maio 2012. NELSON, L. N; COX, M. M. Lehninger princípios de bioquímica. 4.ed. São Paulo: SARVIER, 2006. POLISSACARÍDEOS: Reação com o iodo. Disponível em . Acesso em: 23 maio 2012.
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