Real Time PCR PCR adalah singkatan dari Polymerase dari Polymerase Chain Reaction. Reaction. Jika dialih bahasakan ke dalam Bahasa Indonesia menjadi reaksi berantai menggunakan aktivitas enzim Polymerase. PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang sangat kecil. Real Time PCR (qPCR) adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Dalam ilmu biologi molekular, Real Time PCR (juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic polymerase chain reaction), reaction), adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa. Real Time PCR (qPCR) atau dapat pula disebut kuantitatif PCR real time (qPCR) atau PCR kinetik adalah teknik laboratorium berdasarkan PCR, yang digunakan untuk mengamplifikasi dan secara simultan mengukur molekul DNA target. Untuk satu atau lebih urutan tertentu dalam sampel DNA, Real Time-PCR memungkinkan deteksi dan kuantifikasi secara bersamaan. Kuantitas yang didapat berupa jumlah salinan mutlak atau jumlah relatif ketika dinormalisasi untuk DNA yang dimasukkan atau gen normalisasi tambahan. Pada analisa PCR konvensional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforesis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik.
Cara kerja Real Time PCR mengikuti prinsip umum reaksi PCR; utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Terdapat 2 (dua) metode kuantifikasi yang umum digunakan antara lain : (1) Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda (dsDNA) misalnya SyBr Green, dan (2) Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang dihasilkan.
Prinsip Real Time PCR (qPCR)
PCR adalah suatu molekul perbanyakan DNA secara enzimatik sehingga DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis penelitian. DNA yang jumlahnya sangat sedikit juga dapat dikarakterisasi dengan metode ini. Saat ini PCR sudah digunakan secara meluas pada kedokteran forensik, diagnosis genetika, hingga teknik ini banyak digunakan karena cukup spesifik, efisien, dan memiliki derajat keberhasilan yang tinggi
Real-Time PCR memiliki keunggulan daripada konvensional PCR yaitu pada Real-Time sistem pengukuran analisis menggunakan molekul probes yang dapat diukur pada tiap siklus reaksinya, pada konvensional PCR deteksinya memerlukan gel agarosa untuk proses elektroporesis DNA pada deteksi produk hasil amplifikasi DNA tersebut Real-Time PCR dapat mendeteksi produk amplifikasi pada tiap siklus pada proses penggandaan DNA. Pada sistem Real-Time PCR ini terdapat enzim DNA polimerase yang memiliki aktivitas pada DNA yang memiliki fungsi exonuclease pada rantai DNA 5’ menuju 3’. DNA polimerase ini dapat menguraikan molekul probes yang terikat pada untaian tunggal DNA sehingga dapat digunakan untuk deteksi amplikon pada target DNA yang spesifik. Molekul probes ini mengikat oligonukleotida dan akan mengikat sekuen DNA target. Probes ini terikat pada ujung 5’P dan pada ujung 3’ Molekul probes ini memiliki bagian reporter dye pada ujung 5’ yang dapat mengeluarkan floresensi sedangkan pada ujung 3’ ter dapat quencher yang dapat meredam floresensi pada reporter dye. Sehingga sebelum reaksi emisi dari reporter dye tidak dapat terbaca pada detektor
Sekuen DNA Pada Primer hewan Forward primer (F) Hewan Sekuen (5’-3’) Posisi
Reverse primer (R) AT Sekuen (5’-3’)
Posisi
CGGTGGCTA AGCAGTCTGC Ayam
TGAGTGTGA
F:311-292
R:43-58
67 °C
R:42-61
63 °C
R:37-56
60 °C
R:38-55
57 °C
R:31-52
60 °C
CTCATG GG TATGAGGGT TAGCAGTATG Kalkun
GAGAAGTA
F:304-287 CCTCATCACT
A GTTGCTATA Babi
TAGGCATCTG F:304-287
ACGGTAAAT
CCTAATCTTG
GGACGTATC
GGAATCTGCC
Sapi
F:323-307 CTATAAAT
TAATCCTA
ATGCTGTGG
CCTAGGCATTT
Biri-Biri
F:305-289 CTATTGTC
GCTTAATTTTA
DAFTAR PUSTAKA Gibson, U.E.M., Heid, CA & Williams, M.P. (1996) A novel method for real ime quantitative RT-PCR. Genome Research, 6, 986-995 Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J. & Williams, M.P. (1996) Real Time quantitative PCR, Genome Research 6, 995-1001
