ralstonia

“CULTIVO POR LOTE DE Rasltonia eutropha NRRLB-14690 EN MEDIO QUÍMICAMENTE DEFINIDO CON LIMITACIÓN DE NITRÓGENO” INTRODUCCIÓN: Ralstonia eutropha es una bacteria gram negativa, de un tamaño de 0.7 x 1.8-

2.6 um de la clase Betaproteobacteria común en los suelos. R. eutropha es una bacteria oxidante del idr!geno capa" de crecer en la

inter# inter#ace ace entre entre ambien ambientes tes aer!bi aer!bicos cos $ anaer! anaer!bic bicos. os. %uede %uede crecer crecer a &1'(. &1'(. %uede adaptarse con #acilidad entre un estilo de vida eterotr!#ico o autotr!#ico. %udiendo utili"ar tanto compuestos org)nicos como inorg)nicos como #uente de energ*a. %osee resistencia al +iel. R. eutropha puede e#ectuar una respiraci!n celular aer!bica o anaer!bica por

medio de una desnitri#icaci!n es decir la reducci!n de nitritos o nitratos a gas nitr!geno. (uando crece bao condiciones aut!tro#as R. eutropha es capa" de #ia #iarr carb carbon ono o por por medi medio o de la v*a v*a de las las pent pentos osas as #os# #os#at ato. o. R. eutropha es conocida por producir $ capturar pl)sticos de tipo %oliidroxialcanoato %/ cuando crece expuesta a un exceso de a"úcares como sustrato. l %/ puede acumularse asta niveles de aproximadamente el 304 del peso de la c5lula en seco. a bact bacter eria ia Ralstonia eutropha (( 17633 es la m)s estudiada para la producci!n de %/s, debido a su excelente capacidad para acumular una gran cantidad de pol*mero como el )cido %oliidroxibutirato %/B a partir de #uentes de carbono simples como #ructosa, glucosa, )cido ac5tico $ #uentes de carbono no convencionales como almidones, mela"as $ suero de lece. l %/ representa una #uente de almacenamiento de energ*a $ carbono, este compuesto a atra*do gran inter5s por lo ue se an desarrollado diversas aplicaciones t5cnicas e investigaciones sobre su utilidad. 9na 9na cepa cepa gen5 gen5tic ticam amen ente te modi modi#i#ica cada da tien tiene e meo meora rada da la abi abilid lidad ad para para inmovi inmovili"a li"arr iones iones

extern externos os de (d2: $ reduci reducirr los e#ecto e#ectoss nocivos nocivos de los

metales pesados en el crecimiento de las plantas de tabaco.

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA l genoma de R. eutrofa /16 es compuesto en dos cromosomas circulares de tamaño &.1 a 2.3 ;b. a bacteria es aislada de suelo $ gas idrogeno. n el pre presen sente tra trabao bao se rea reali" li"a una una cin cin5tic 5tica a micr micro obian biana a de este ste microorganismo con el prop!sito de observar la #ormaci!n de estos gr)nulos de %/ $ determinar si una limitaci!n de #uente de carbono en el medio es capa" de indu induci cirr la #orm #ormac aci! i!n n de los los gr)n gr)nul ulos os,, obte obteni nien endo do a la ve" ve" dato datoss de rendimiento $ consumo del sustrato, al igual ue el consumo de nitr!geno

1

E.A.P. E.A.P. Biotecnología Bio tecnología

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

MARCO TEÓRICO: De!"!#!$"% e&'()#')(* + ,(,!e.*.e& .e /& ,/!!.(!*/#*"*'& os %/ son pol*meros de )cidos idroxialcanoicos ue algunas bacterias, arueas $ microalgas acumulan intracelularmente como material de reserva, para para usar usarlo lo post poster erio iorm rmen ente te como como #uen #uente te de carbon carbono o $ ener energ* g*a. a.

a polipoli-

mer meri"ac i"aci! i!n n de los los )cidos idos idr idroxia oxialc lca anoic noico os, por por acci! ci!n de en"im n"ima as intracelulares, tiene lugar mediante condensaci!n del grupo carboxilo de un mon!me mon!mero ro )cido )cido idrox idroxial ialcan canoic oico, o, con el grupo grupo idrox idroxilo ilo del siguie siguiente nte,, #orm #orm)n )ndo dose se un enla enlace ce 5ste 5sterr de all* all* ue ue tamb tambi5 i5n n se les les cono cono"c "ca a como como biopoli5steres.
2


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA os %/ tienen caracter*sticas #*sicas similares a las de los pl)sticos derivados del petr!leo, como el polipropileno $ polietileno, pero tienen la ventaa de ue pued pueden en ser ser sint sintet eti" i"ad ados os a part partir ir de #uen #uente tess de carb carbon ono o reno renova vabl bles es,, son son biodegradables pueden ser asimilados por mucos microorganismos $a sea de suelos, mares, lagos o aguas residuales $ son biocompatibles no causan e#ectos t!xicos. stas propiedades les con#ieren una gran importancia como substitutos de los pl)sticos convencionales. convencionales.

METODOLOGÍA: ELABORACIÓN 2 DI3EO DE MEDIO3 DE CULTIVO:
Me.! Me.! .e M*"'e" M*"'e"#!$ #!$" " 5PG2 5PG2-A*( -A*(77 ,*(* ,*(* /* #e #e,* ,* Ralstonia Eutropha NRRL B-14690

Composición Peptona Extracto de Levadura K 2HPO4 Glucosa Aar!Aar

gL

g!"ml

7 .0

0.105

3 .5

0.0525

1 .0 1 .4 20

0.015 0.021 0.3

ustar p/ 7.0 con 0.2 ; de /(l. /(l.

3


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA ntes de esterili"ar, acer ervir por 2 min la soluci!n para omogeni"ar el agar-agar. sterili"ar a 121 >( por 1? min.

Pesa#

#ada nutr&ente co%o &nd&ca en la /a'la 01

Dil$i#

15 %l de aua dest&lada en %atra-

Calenta#

#on %ec,ero unsen ,asta e'ull&r

Hasta aparecer 'ur'u(a

Agita#

Coloca#

En 5 tu'os de ensa)o con tapa *3%l en cada uno+.

Reposa#

1 ,ora

En autoclave a 121"# $ 15 %&n desde la pr&%era 'ur'u(a Este#ili%a#

Reposa#

4

ncl&nar

E.A.P. Biotecnología

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA @eali"ar el sembrado

Desin(ecta# Coloca#

Somete#

El %ed&o de tra'a(o con alco,ol "

a(o %ec,ero para un a%'&ente estr&l

El asa 'acter&ana al ueo a ro(o v&vo

El asa por las paredes del tu'o 6ue cont&ene la cepa En(#ia#

E)t#ae#

*lamea#

na asada de la clula desarrollada

El tu'o antes de cerrarlo

En 5 tu'os de ensa)o reparados con %ed&o sol&do aar Resem&#a#

Lle'a#

A##ast#a#

Inc$&a#

5

Por dentro del tu'o del %ed&o sol&do la a-ada

Por la superc&e desde adentro ,ac&a auera

1 a 2 ,oras


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Me.! (!# 5PG27 ,*(* /* #e,* Ralstonia Eutropha NRRL B-14690 C8,&!#!$" %eptona xtracto de evadura A2/%& Clucosa

L 1.0 1.0 1.0 1.&

08/ 0.0? 0.0? 0.0? 0.07

ustar p/ 7.0 con 0.2 ; de /(l. sterili"ar a 121 >( por 1? min. (onsiderando al (arbono como el nutriente limitante en el medio rico l*uido, se puede estimar la cantidad de biomasa #ormada para un crecimiento aer!bico= Y x D s

xf

=

&0 =

E 0 .6

?0

=

0.&8g D

g

0.&8E 1.& 0.672g D L =

%ara ?0 ml.= xf = 0.48∗( 0.07 )=0.0336

3! )" ;/)8e" .e 1 8L &e '(*&,*&* *&<,'!#*8e"'e * 1=0 8L .e ;/)8e" .e e(8e"'*#!$" 510 8L .e 8e.!7% e"'"#e& /* #"#e"'(*#!$" .e/ !"$#)/ e& 0>0?0@4 L?





K2HPO4 Extracto de levadura Peptona

A(o#a#

A(o#a# 15 %l Aua dest&lada

10 %l Aua dest&lada

Este#ili%a# /odo lo anter&or en autoclave por 15 %&n

Me.! .e #)/'!; ,*(* */#*"*( 1? L .e !8*&* !"*/ e" e/ 8*'(* .e 1000 8L 5CULTIVO POR LOTE7 .e&.e  0> 0?0@4 L? @eali"ar un diseño de medios para
• • • •

7


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA • •

;antenimiento Formaci!n de producto

mpleamos= Ralstonia eutropha

• • • • • • •

Biomasa G 1.?grD er!bico +utriente limitante = +itr!geno ;antenimiento G 0 %roducto G 0 xceso G ?04

E/e8e"' ( + ;g < A % Fe E/e8e"'

N)'(!e"'e

N)'(!e"'e Clucosa +/&2<& ;g<&.7/2 +/&2<& A/2%& A/2%& Fe<&

E?C ?0 4 1&4 0,?4 14 14 H4 0.24

E/e8e"'

E/e8e"' e" N)'(!e"'e  &0

&0D?0 E 0.6 G 0?4@

1.?D0.&8G?1

H.1HE1.?G 4?69

2&

3

3

(

Clucosa

e" #
+

+/&2<&

1&4

21.21

21.21D1& E 1 G 1?=

1.?D1.?2G 0?99

0.33E1 G 0?99

;g

;g<&.7/2

0,?4

3.87

3.87D0.?E 1 G19?4

1.?D13.7&G 0?0@

0.08E1.?G 0?1=

<

+/&2<&

14

2&.2&

2&.2&D1 E 1 G =4?=4

1.?D2&.2&G0?06

0.06E1.?G 0?04

A

A/2%&

14

28.63

28.63D1 E 1 G =@?69

1.?D28.63G 0?0

0.0?E1.?G 0?0

% Fe

A2/%& Fe<&

H4 0.24

17.77 H6,76

17.77DHE 1 G ?9= H6.76D0.2 E 1 G 1@?@

1.?D?.32G 0?= 1.?D18H.8G0?00@

0.2?E1.?G 0? 0.008E1.? G 0?01=

C8,&!#!$" A2/%& +/&2<& Clucosa ;g<&.7/2 +/&2<& A/2%& Fe<& I sterili"ar a 121 > ( por 1?min.

L 0.H7? 0.33 &.63? 0.12 0.0& 0.07? 0.012 20

108/ 0.0?62? 0.1&8? 0.70&2? 0.018 0.006 sales E8/A 9 K2HPO4Otras 9 *:H4+2;O4 0.0112? 0.0018 H

A(o#a# 25 %l Aua dest&lada

<

A(o#a# 100


Este#ili%a# /odo lo anter&or en autoclave por 15 %&n




E/e8e"'& 8e"(e& + '(**& - 1; ;g<&.7/2

1mD medio

- 10 m; de Fe<&.7/2 en 1; /(l

1.? mD  medio

- ; minerales tra"as

1.? mD medio

ustar a p/G7.0 austado con +a/ H;, /( H ;, si se desea se puede diluir un poco la base $ el )cido para poder llegar al p/ reuerido. (uando se trabae en el #ermentador si se debe austar el p/ a 7.0 J 0.1, autom)ticamente.

3/)#!$" &'# .e /& e/e8e"'& T(**& 8!"e(*/e& 5MT7 C8,&!#!$" (a(l2.2/2



L 1.&7


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA - ;n(l2.&/2 - (o(l2.6/2 - (u(l2.2/2 - Kn<&.7/2

1.38 2.H8 1.70 2.30

C)*"'!!#*#!$" .e *)#*(e& (e.)#'(e& #" e/ 8<'. DN3 5% .!"!'( &*/!#H/!#7: E)!,& + M*'e(!*/e& spectro#ot!metro 10 ubos de ensa$o Cradilla uipo de Baño ;ar*a Balan"a

• • • • •

• • • •

gitador /ielo en cubos Bier Fiola

•

P(e,*(*#!$" .e/ (e*#'!; % .!"!'( &*/!#H/!# • • •

Lcido H,?-dinitrosalic*lico artrato s!dico pot)sico /idr!xido s!dico •

•

P(#e.!8!e"' ,*(* ,(e,*(*( e/ (e*#'!; Iisolver 10 g de )cido H,?-dinitrosalis*lico $ H00 g de tartrato s!dico pot)sico en 200 ml de idr!xido s!dico 2 ; 16 g de +a/ en 200 ml

• •

de agua destilada Iiluir asta 1000 ml con agua destilada. l reactivo debe guardarse en bote oscuro color topacio, siendo estable durante varias semanas.

P(#e.!8!e"'& ,*(* /* #)(;* .e #*/!(*#!$"

10


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA •

T •

•

•

1 •

•

2 •

•

J K

3/)#! $" 8*.(e

•

1 . 8 1 . & 1

A &* 40 "8

• •

A) *

•

0.3

•

0.1

•

•

0.7

•

0.H

•

•

0.?

•

0.?

•

•

0.&

•

0.6

•

•

0.2

•

0.8

•

H •

•

& •

•

? •

•

6 •

•

7

•

•

8

•

•

3

•

1

1

•

0 . 8 0 . & 0 . 1 0 . 0 8 0 . 0 & 0 . 0 1 0 . 0 0 8

•

0.0?

•

0,3?

•

•

0.0&

•

0.36

•

•

0.02

•

0.38

•

•

0.00?

•

•

0.00&

•

0.33 ? 0.33 6

•

•


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA C)*.(: •

•

@eali"ar la curva de abs vs M N. uego sacar 1 ml de la muestra a anali"ar :1ml de I+< llevar al calor

• •

• •

a 100>( por ?-10 minutos uego en#riar en un baño de ielo durante H minutos. gregar 10 ml de agua destilada, dear reposar ? minutos $ leer al espectro#ot!metro a ?&0 nm. •

@eactivo I+<

A+ADIR

1 ml

En cada tubo de ensayo. En cada

,E-CLAR ;91ml$I+<1ml CALENTAR

En baño maría hasta ebullición.

gua en ielo

EN*RIAR gua destilada

Tiempo:

A ADIR

10ml

LEER

Absorbancia a 540 nm

P(#e.!8!e"' ,*(* e/ *"/!&!& .e !8*&*: •

E/*(*#!$" De C*,*#&: •

•

CON*ECCI

Con papel aluminio capachos

2



•

DESECAR

os capachos en la estu!a

DESECAR

En la campana de $auss

PESAR

En la balan%a

• • • •

•

•

•

De"&!.*. $,'!#*: 1 Iel volumen extra*do se procede a leerlo por espectrometr*a a 6&0nm con un blanco de C9. = (entri#ugar durante 1? min.  Iesecar el sobrenadante $ luego agregar agua destilada asta completar los ?ml. 4 Oolver a centri#ugar por 1? min.  Iesecar nuevamente el sobrenadante $ colocar lo restante en los capacos. 6 (olocar los capacos en la estu#a a 80'( por 2& oras.  Finalmente pesar los capacos. • • •

•

?ml

•

(ultivo

C@C@

n 10 tubos

•

•

(+@PF9C@

10 tubos a 1? min

•

•

B@

3

l sobredanante



•

•

? ml

gua

C@C@

l tubo

•

•

•

@%P@

2 veces

•

•

(+@PF9C@

os 10 tubos por 1? min

•

•

•

1 ml

C@C@

 cada tubo

gua

•

•

CP@ /asta disolver el pellet

•

•

@%P@

2 veces

•

•

P+(9B@

80'( D2& oras

•



De'e(8!"*#!$" .e /* #)(;* .e #"#e"'(*#!$" #e/)/*( e" *&e &e#* 58<'. ')(!.!8<'(!#7 •

@eali"ar diluciones al 1=1, 1=2, 1=H, 1=&, 1=?, 1=6, 1=7, 1=8, 1=3, 1=10 Hml

•

Ie cada diluci!n reali"ar lecturas de absorbancia 6&0 nm

4


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA Cra#icar la biomasa en peso seco vs absorbancia $ se determinar la

•

ecuaci!n de la recta. •

A"/!&!& .e .*'& .e /* #)*"'!!#*#!$" .e !8*&* ,( ,e& &e# + .e"&!.*. $,'!#* •

n la presente curva la concentraci!n estar) seguida entre

•

concentracion

() g L

=

gramosde biomasa mililitrosde medio

•

•

de biomasa. %ara determinar de manera inicial la relaci!n lineal entre las dos variables se debe elaborar un diagrama de dispersi!n. •

;edio $ agua

•

1=1Q 1=2Q 1=HQ 1=&Q 1=?Q @eali"ar

•

1=6Q 1=7Q 1=8Q 1=3Q 1=10

a disoluci!n en 10 tubos

•

eer

5

 6&0 nm



•

concentraci!n $ se obtendr) la pendiente es decir la velocidad de crecimiento.

!

bsorbancia en #unci!n del %eso




•

A&(*"#!* >   Pe& 3e# : constante ue var*a con la longitud de onda utili"ada $ representa la inversa del peso seco del microorganismo ue produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia 1DR 0.

•

Re*/!*( /* #)(;* .e #*/!(*#!$" .e !8*&* .)(*"'e /* e(8e"'*#!$": a curva de calibraci!n es estable. +o a$ necesidad de reali"ar una nueva curva para cada lote de determinaci!n o aún para nuevos reactivos. sterili"ar las pipetas $ rotular %reparar viales $ rotularlos %reparar el inoculo ;e"clar en un matra" el medio de #ermentaci!n con parte del in!culo (uando se me"cla el inoculo se deber) sacar dos muestras ue ser)n

• • • • •

•

el tiempo cero $ luego leer en el espectro#ot!metro Iespu5s de una ora sacar ?ml de muestra $ colocarlo en un tubo (olocar en agua irviendo eer en el espectro#ot!metro 6&0nm. levar a centri#ugar por 10 min $ el sobrenadante colocarlo en un vial uego el sedimento lavarlo con tamp!n asta los ?ml $ llevarlo a

•

centri#ugaci!n por 10 min @etirar de nuevo el sobrenadante $ colocar el sedimento en un

• • • •

• •

•

capaco @epetir esa operaci!n @eali"ar la curva de calibraci!n
se saca la glucosa gD.

7


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA 0.< 0.

Concent#ación gL

*x+ = 0.3x ! 0.03 >? = 0.

0.4 0.2

0 0.2 0.4 0. 0.< 1 1.2 1.4 1. 1.<

A&so#&ancia • •

/all)ndose la ecuaci!n $ G 0.H??1x - 0.0281, siendo $=

concentraci!n, x= absorbancia. •

P(#e.!8!e"' .e/ #)/'!; .e /* e(8e"'*#!$" •

3

15 %l *10 D+

•

. a r o , a d a c n e l % 5 a r a e r t s e u % e ; •

•

•

Bed&o de %antenc&n 15%l

Bed&o r&co *C50

@er%entac&n *150

•

•

•

a biomasa inicial del medio rico ser)= 0.0HH6Q la biomasa incial en el

medio de #ermentaci!n ser) 0.00HH6. •

C 1. V 1 =C 2. V 2

•

0.0HH61?GSo1?0 •

SoG0,00HH6 •

<



•

(onc entra ci!n de gluco sa gD

•

•

•

bs orba ncia

•

•

•

•

•

•

•

•

• •

• •

•

0.?? 83 0.H6 12 0.H1 73 0.2? 6& 0.1& 78 0.06 18

•

1.8

•

1.2

•

1

•

0.8

•

0.?

•

0.2

RE3ULTADO3:

•

P.

<9<@

*? C)(;* .e #*/!(*. .e /)#&* •

•

•

•

•

•

•





C$#'a /e cali&#a/o /e gl$cosa 0. *x+ = 0.31x ! 0 >? = 1

0.5 0.4

A&so#'ancia

0.3 0.2 0.1 0 0

0.2

0.4

0.

0.<

1

1.2

1.4

1.

1.<

2

Concent#acion /e gl$cosa 0gL1

•

•

•

•

•

•

•

•

•

(on el uso de la ecuaci!n de recta de la curva de calibrado de glucosa obtenemos la concentraci!n de glucosa, •

•

•

•

•

•

10


a b s UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA or b a n ci ? Le#')(*& .e *&(*"#!* a 0. 1 ? 2 3 0. 1 & 7 H 0. 1 H 2 2 0. 1 #? C)(;* .e DN3 H & 0. 1 (once bsor 1 ie ntraci! bancia 8 n gD 8 12.1?2 H.7717 0. 0 3 6016 1 12.1&7 H.7700 2 H 2132 1 1 12.1H2 H.76?H & 2 H&88 0. 2 H.76?8 1 12.1H& 3H6 2 H 12.118 H.7611 3 8 7??2 & & 0. 12.121 H.7613 1 ? & 82?6 2 12.123 H.76&& 6 6 & 6?76 1 12.126 H.76H& 0. 7 1 &1&& 1 12.110 H.7?8& 1 8 1 7?0& 0 12.11? H.7601 1 & 2016 0. 3 12.120 H.7616 1 1 ? & 0. 1 •

•



•

•

•

•

0

•

•

•

•

1

•

;e real&- la lectura en el espectroot%etro a una

•

•

•

•

2

•

•

•

•

•

H

•

•

•

•

&

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

?

•

•

•

6

•

•

7

•

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•

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•

•

•

•

•

•

•

•

8 •

3

11 •

1

•

•


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA 10

&

7216

Concent#acion /e 2l$cosa 0gL1 3.7< 3.77 3.77

concentrac&on *FL+

3.7 3.7 3.75 0

1

2

3

4

5



7

<

 10

•

•

•

•

•

•

•

• •

.? C!"<'!#* .e #(e#!8!e"' •

12


bi o m UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA a conce s a ntraci!  n gD g D   3 . 3 H.7717 2  6016 0 6 0 . 0 0 H.7700 0 0 2132 ? & 7 2 0 . 0 0 H.76?H 0 0 H&88 ? 1 3 2 0 . 0 0 H.76?8 0 0 3H6 ? 1 H 6 0 H.7611 . 7??2 0 0 0 0 ? 0 2 & 0 H.7613 •

•



•

• •

•

•

•

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•

0

•

•

•

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1

•

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•

2

•

•

•

H

•

&

13 •

•

•

•

•

•


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA 4 3.5 3 2.5 #&net&ca de #rec&%&ento >. eutroa

2

lucosa

1.5 1 0.5 0 0

1

2

3

4

5



7

<

 10

•

•

• •

•

•

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•

•

•

•

•

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•

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•

14


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA DEN3IDAD OPTICA D A ! &( / * ) "#! # * ! $ " 1 0,0 = HH& 0 1 1 0,0 = H02 0 2 1 0,0 = 226 0 PE3O H N1 CON 0,0 BIOM = 131 A3A 0 & 1 0,0 = 18 0,H80 0 1? 8 1 0,0 = 1H? 0 6 0,&H3 1 0,0 2= H 126 0 7 1 0,0 = 088 0,H8& 0 H8 8 1 0,0 = 037 0 3 1 0,0 = 087 15 1 0 •

•

•

BIOMA3A

•

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•

• •

•

•

•

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•

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•

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•

•

PE3O3 3ECO PE3O 3IN BIOMA 3A

0,H8

•

•

0,&H83

•

•

0,H8&2

•

•

•

•

• •

••

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

B I O M A 3 A 0 , 0 0 0 8 0 , 0 0 0 & 0 , 0 0 0

CONCEN TRACION 5L7

•

0,00016

•

0,00016

•

0,00012


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA ab CONCEN D TRACIO 6so N 5L7 rv 0,&HH 0,&H28 0 an 6 , ci 0 a 0 0,0HH& 0, 000 1= 801 0,H?& 0,H?H7 0 6 1 , 0,0H02 0, 000 1= 001 06 &0, 0,0226 0,&0H 0,&023 000 1= 2 , 01 02 08 0,0131 01= H0? 0,018 8 1= 0? 0,01H? 6 1= 0? •

•

&

•

?

•

6

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

8-0?

•

•

8-0?

•

6-0?

•

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•

•

•

•

•

•

•

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•

•

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•

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•

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•

(omo sacamos ? ml para allar el peso seco entonces para allar la •

•

•

•

•

•

•

•

1



•

•

C$#'a /e cali&#a/o /e Biomasa 0 0 0

*x+ = 0.01x ! 0 >? = 0.

0

a'sorvanc&a

0

L&near *a'sorvanc&a+

0 0 0 0 0 0.01

0.02

0.02

0.03

0.03

0.04

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

I?

CINTICA DE FERMENTACIÓN • •

•

17

I+

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA T ! e 8 , 

* &( ;* "#! * •

•

0 •

•

2 •

•

H •

•

& •

•

? •

•

6 •

•

7 •

•

8 •

•

•

1<

3 1 0

•

0,0 10 7 0,0 18 7 0,0 18 2 0,0 18 1 0,0 17 3 0,0 18 ? 0,0 28 1 0,0 20 3 0,0 18 7 0,0 21 8



DENSIDAD PTICA 0.03 0.03 0.02

8E:;8A8 OP/#A

0.02 0.01 0.01 0 0

2

3

4

5



7

<



10

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

1


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA T ! e 8 , 

* &( * "#! * •

•

0

0,0 10 7

•

• • •

2

0,0 18 7 •

• •

H

0,0 18 2 •

• •

&

0,0 18 1 •

• •

?

• •

6

0,0 17 3 0,0 18 ?

•

• • •

7

0,0 28 1 •

• •

8

0,0 20 3 •

• •

20

3

0,0 18 7

! 8* &* 5 L7 3,3 206 0,0 00 0? &7 2 0,0 00 0? 13 2 0,0 00 0? 1H 6 0,0 00 0? 02 & 0,0 00 0? H6 0,0 00 10 7H 6 0,0 00 06 70 & 0,0 00 0? &7 2


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA • •

1 0

•

0,0 21 8

0,0 00 07 20 8

•

•

C#ecimiento /e la Biomasa en la *e#mentación 0 0 0

8ens&dad Opst&ca @e%entac&on

0 0 0 0 0

2

3

4

5



7

<

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

21



•

•

•

•

22


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA II?

23

CONCENTRACION DE 8


L ! "5 8*& DEL SANTA  UNIVERSIDAD NACIONAL T!e *  5L7 07 3,32 0 0 -06 1, 7 0 7 6 7 6 0,00 H 00?& ? 2 72 2 1, 6 ? ? 1 ?1 0,00 1 00?1 ? H 32 1 1, 6 & & H 0 6 0,00 7 00?1 H & H6 8 1, 6 2 2 2 ? 8 0,00 6 00?0 0 ? 2& 1 1, 6 8 6 3 3 6 0,00 1 00?H & 6 6 7 0,00 2, 7 0107 H H6 8 1 •

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

24

•

•



Ln03341 3 2.5 2

Ln*F0+

1.5 1 0.5 0 0

2

3

4

5



7

<



10

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

Ie esta gr)#ica solo tomaremos la #ase de crecimiento es decir los H puntos para as* poder determinar el m)x, pues es donde apreciamos crecimiento $ los dem)s es constante $ en declive. =

• •

•

• •

?

0,0 00 0? 02 &

•

• •

•

• •

25

•

6 7

•

0,0 00 0? H6 0,0 00 10 7H 6

•

1,6 22 2? 86 01 1,6 86 33 61 &7 2,H 81 6H &7 ?2



DETERMINACION DE 8 3 2.5 *x+ = 0.3? = 0.<1

2 1.5

L&near *+ 1 0.5 0 5



7

•

•

•

•

•

•

•

•

•

DETERMINACION DE  •

•

U G nVx Dt U G 0,368?7388?

•

RENDIMIENTO •

•

2

WSD< G 0,010088 D 0,00006216


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA WSD< G 0,006161776

•

TIEMPO DE DUPLICACIÓN •

tdG n2D Umax

•

td G 1,82??12722

•

• •

• •

•

•

e? P(e&e"#!* .e PA e" #
•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

27



•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

•

DI3CU3IÓN:

• •

*(e( AG% 5=00@7 cita ue el pol*mero se acumula en grandes cantidades en la c5lula $ se puede utili"ar para diversas aplicaciones, e#ectivamente el %/ allado en las c5lulas de @alstonia eutropa se acumul! a tal #orma ue se i"o reconocible por medio del microscopio en nuestra experiencia. •

•

3e" 3,!ee(8*"" 519997 menciona el colorante oxa"ina a"ul +ilo  $ su #orma oxa"one #luorescente, roo +ilo, se utili"aron para desarrollar un m5todo de tinci!n simple $ altamente sensible para detectar poli )cido Hidroxibut*rico $ otros )cidos pol$$drox$alanoic %/ directamente en el crecimiento de colonias bacterianas. ste m5todo de tinci!n viablecolonia era aplicable en particular a las bacterias gram-negativas tales como "otobacter vinelandii, scericia coli, %seudomonas putida, $ @alstonia eutropa. +o empleamos este colorante para detectar la presencia de %/ en los microorganismos pero si pudimos distinguir unas peueñas #ormaciones dentro de las c5lulas las cuales las presentamos en #otogra#*as. •

•

R. eutropha , sin embargo, no se limita a los %/ $ pol*meros relacionados

con %/ como poli )cidos mercaptoalcanoico, $a ue tambi5n se puede

2<


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA emplear para la producci!n de una gama de otros pol*meros interesantes, citado por *(e( 5=00@7S la acumulaci!n de %/ en las c5lulas se debi! principalmente a la carencia del nutriente limitante nitr!geno, por ello su producci!n de otros pol*meros mencionados es causado por nutrientes limitantes de otra naturale"a. •

3e" M*('!"e 5=0107

•

menciona ue el in!culo se prepar! en

rlenma$er de 1  conteniendo 200 m del medio descrito anteriormente, en saer orbital durante 2&  a 200 rpm $ H?'( ? n comparaci!n con el nuesto ue #ue en un matras de 200 ml con un agitaci!n de 200 rpm $ 28'(Q la di#erencia recae en la temperatura por lo ue encontramos nuestra baa producci!n de biomasa. l cultivo de #ermentaci!n lo e#ectuaron a H00 rpm. n 60 oras de #ermentaci!n con nitr!geno limitante se produeron 22.? gD de biomasa. • •

n este per*odo, se consumieron 1.? gD de #uente de nitr!geno $ se

metaboli"aron 26.2 gD de glicerol. a s*ntesis de %/B, producto de inter5s, comen"! a las H2 oras $ lleg! a una concentraci!n #inal de H.H gD. •

CONCLU3IÓN:

l crecimiento en lote de Rasltonia eutropha en un medio u*micamente

•

de#inido pero con limitaciones del nutriente nitr!geno gener! cambios #isiol!gicos debido a la acumulaci!n del compuesto de reserva %/. a acumulaci!n $ reserva de %/ responde a la de#iciencia de un nutriente

•

en el medio, en este caso la #uente de nitr!geno, $a ue detiene el crecimiento exponencial. (omo se observ! en el microscopio. 9na posible causa del poco crecimiento es por la temperatura puesta a

•

28'( $a ue en la bibliogra#*a encontramos a H0'(. •

•



BIBLIOGRAFÍA:

2





@einece F,


<aosseini, <.


operena, C. ;. 2010. %roducci!n microbiana de biopol*meros a partir de glicerol. Departamento de Bioingeniería , 1-10.

•

•

ANEO3:

CALCULO3 DEL MEDIO: E/e8e"' e" ")'(!e"'e: •

#*(": %.; G 12 GLUCO3A > C61=06 P?M .e /)#&* >1@0 ( •

180 gr de glucosa

1004 de .+

•

72 gr de carbono

x 4 de .+

•

•

•

x=

72∗100 180

x G &0 4

•

•

•

30

N!'($e" : %.; G 1& 3)/*' .e *8"! > 5+/&2<& P?M .e &)/*' .e *8"! >1= ( E.A.P. Biotecnología


1H2 gr de sul#ato de amonio 28 gr de nitr!geno

•

x=

•

1004 de .( x 4 de .(

28∗100 132

x G1.214

•

•

M*"e&! : %.; G 2&.H 3)/*' .e 8*"e&! e,'*!.(*'*. > ;g<&.7/2 P?M .e &)/*' .e 8*"e&! >=46?0 (

•

•

•

2&6.H gr de sul#ato de magnesio

1004 de .(

2&.H gr de magnesio

•

x=

•

x 4 de .(

24.3∗100 246.3

x G 3.874

•

A)(e : %.; G H2 3)/*' .e *8"! > 5+/&2<& P?M .e &)/*' .e *8"! >1= (

•

•

1H2 gr de sul#ato de amonio H2 gr de a"u#re

•

x=

•

1004 de .( x 4 de .(

32∗100 132

x G 2&.2&4

•

• •

P'*&! : %.; G H3 F&*' .e ,'*&! 8"&!# > A/2%& P?M .e &*' .e ,'*&! >1?9 (

•

•

•

1H?.3 gr de #os#ato de potasio H3 gr de potasio

1004 de .( x 4 de .(

•

31


UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA x=

•

39∗100 135.9

x G 28.634

•

• •

F&( : %.; G H0.3 F&*' .!#!. .e ,'*&! > A2/%& P?M .e &*' .e ,'*&! >1?9 (

•

•

17H.3 gr de #os#ato de potasio

1004 de .(

H0.3 gr de #os#oro

•

x 4 de .(

•

x =

•

30.9∗100 173.9

x G17.774

•

• • • •

!e(( : %.; G ??.8 3)/*' .e !e(( > Fe<& P?M .e &)/*' .e !e(( >11?@ (

•

1?1.8 gr de sul#ato de ierro

•

??.8 gr de ierro

•

1004 de .( x 4 de .(

•

•

•

x=

55.8∗100 151.8

xG H6.764

•

•

•

•

32


ralstonia

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