PRUEBAS DE EFICACIA ANTIMICROBIANA SEGÚN SEGÚN USP 30 PARA FARMACEUTICOS Y COSMETICOS
1.
OBJETIVO
Evaluar la eficacia de los preservativos antimicrobianos incorporados en productos farmacéuticos no estériles y cosméticos de acuerdo con la cantidad de microorganismos eliminados o cuya proliferación sea inhibida a lo largo de un plan de muestro (28 días).
2. DEFINICIONES. Preservativo antimicrobiano: Sustancia que se adiciona a las formas farmacéuticas no estériles para protegerlas del crecimiento de microorganismos que sean introducidos inadvertidamente durante o posteriormente posteriormente al proceso proceso de manufactura. manufactura. antimicrobianos presentan propiedades
Todos los agentes agentes
tóxicas, por lo que para la máxima protección del
paciente, la concentración de preservativo en el producto final debe d ebe ser considerablemente más baja que la concentración a la concentración a la que pueda ser tóxica para el hombre.
Los agentes antimicrobianos antimicrobianos no substituyen las Buenas Buenas Prácticas de Manufactura. Manufactura. Estos solo se adicionan a los productos para disminuir el riesgo de una posible contaminación subsiguiente a la fabricación.
Repique: Transferencia de microorganismos de un cultivo estabilizado a un medio fresco. 3. PROCEDIMIENTO Principio o Fundamento Un sistema preservante involucra tanto los preservativos como la constitución físico-química del producto. Factores como pH, Aw, disponibilidad de nutrientes, concentración de agentes
tensoactivos, agentes secuestrantes, componentes no acuosos, ingredientes insolubles y materiales interferentes influirán en la preservación de cualquier fórmula cosmética. En el diseño de la formulación cosmética es necesario conocer muy bien todas las posibles interacciones del sistema preservativo para asegurar el cumplimiento del objetivo primordial de la preservación que es asegurar que el producto es microbiológicamente seguro y estable. El ensayo de la eficacia de un preservativo es una parte esencial en la garantía de la calidad de un producto cosmético. La meta de este ensayo, es determinar el tipo y la concentración mínima efectiva de preservativo que se requiere para preservar satisfactoriamente un producto, mientras esté en los canales de mercadeo y en las manos del consumidor. La importancia de dichos ensayos radica principalmente en:
Usar poco preservativo o uno inapropiado, permitirá el crecimiento microbiano.
Usar demasiado preservativo puede causar reacciones adversas en la piel lo cual ocasionara inconformidad en el usuario y costos elevados.
Pueden existir reacciones que inactiven la acción del preservativo en el sistema preservante usado.
La prueba de eficacia de preservativos requiere que se inoculen individualmente especies determinadas de microorganismos. Este enfrentamiento debería incluir representantes de especies de bacterias Gram positivas, Gram negativas, mohos y levaduras y en suficiente cantidad como para permitir que se obtenga información sobre la cinética de la reacción.
Materiales y Reactivos
Cepas de referencia ATCC: Las cepas a usar no deben tener más de cinco (5) repiques en relación con el cultivo original ATCC. - Escherichia coli ATCC 8739.
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. - Staphylococcus aureus ATCC 6538. - Candida albicans ATCC 10231. - Aspergillus Niger ATCC 16404.
Frascos de vidrio de 200 - 250 cm 3.
Micropipeta 0.1 – 1 cm3.
Puntas para Micropipeta estériles.
Gradillas.
Tubos de ensayo tapa rosca de 25 x 150 mm.
Solución salina.
Cajas de Petri estériles.
Agar TSA o PC.
Agar Sabauroud Cloranfenicol.
Tween 80.
Tubos con agar inclinado (TSA y Sabauroud).
Vasija con desinfectante en uso. Probeta de 100 cm3. Asa bacteriológica. Incubadora 22+2º C y 35 +2º C. Autoclave.
Procedimiento Técnico Para fines de la prueba, los productos se definieron dentro de 4 categorías.
CATEGORIA
DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO
1
Inyectables, otros parenterales incluyendo emulsiones, productos óticos, productos nasales estériles y productos oftálmicos con
bases o vehículos acuosos.
2
Productos empleados de manera tópica preparados con bases o vehículos acuosos, productos nasales no estériles y emulsiones, incluyendo aquellos que se aplican a membranas mucosas
3
Productos orales a excepción de antiácidos, preparados con bases o vehículos acuosos
4
Antiácidos preparados con una base acuosa
Preparación Del Inoculo. (Fase 1)
En el carro de acero inoxidable alistar:
Una vasija con el sanitizante en uso, un asa
bacteriológica plástica estéril, gradilla con 3 tubos de agar inclinado TSA o PC, o caja de petri con agar TSA o PC, 2 tubos de agar inclinado o caja de petri con Sabouraud + cloranfenicol , Cepas de referencia ATCC anteriormente mencionadas.
Encender la Cabina y dejar circular el aire por espacio de 10 minutos.
Rotular cada uno de los tubos o cajas con el nombre, código de las cepas ATCC, Fecha y Responsable.
Repicar las cepas ATCC en los tubos de agar inclinado o cajas de TSA - PC para bacterias y Sabouraud más cloranfenicol para el hongo y la levadura.
Estandarización De Las Cepas. ( Día 2)
A partir de la cepa de cada microorganismo, realizar una suspensión inicial, en solución salina al 0.85%, equivalente a al tubo 1 de la escala de Mc Farland (3 x 10 8 UFC/mL) para las bacterias y una suspensión de levadura y moho (el inoculo del moho realizarlo en
solución salina al 0.85% con adición de tween 80 al 0.05%)
las cuales se llevarán a
recuento en placa para conocer la concentración de dicho inoculo.
Nota: La suspensión bacteriana y de levadura puede ser almacenada hasta por 24 horas en refrigeración antes de ser utilizada en la prueba, la suspensión del moho puede ser almacenada en refrigeración hasta 7 días. Se debe tener en cuenta que el volumen del inoculo empleado debe ser del 0.5 a 1% del volumen de la muestra y este volumen de inoculo debe asegurar que se presente una concentración final de 1x10 5 a 1x106 UFC/mL de producto (esto para productos de categoría 1, 2 3). Para productos de categoría 4 la concentración final debe estar entre 1x10 3 a 1x104 UFC/mL.
Para llegar a obtener la concentración requerida en los productos de categoría 1, 2, 3, los recuentos de
levadura y moho deben tener una concentración del inoculo sea de
aproximadamente 9x107 UFC/mL. Para el caso de las bacterias al tener una concentración de 3x 108 UFC/mL en la suspensión inicial tomar 3 mL de la suspensión y llevar a 7 mL de agua peptonada para obtener una concentración final de 9 x10 7 UFC/mL.
Inoculación Del Producto
En 5 frascos estériles pesar o medir 20g/mL del producto. Rotular cada uno de los frascos con el número de referencia interno de la muestra, fecha y con cada uno de los nombres de los microorganismos o asignándoles un número así: 1 = E. coli 2 = S. aureus 3 = P. aeruginosa 4 = C. albicans 5 =A. niger
A partir de los inoculos de los microorganismos en concentración 9x10 7 UFC/mL tomar 0.2 mL y llevar a cada uno de los respectivos frascos. Homogenizar uniformemente el inoculo sobre la totalidad del producto.
Mediante la adición de 0.2 mL del inoculo a una concentración de 9 x 10 7 UFC/mL se está obteniendo una concentración final de 9 x 10 5 UFC/ mL de producto, requerida para los productos de categoría 1 a 3.
9 x 107 UFC ------ mL X
------- 0.2 mL(1% del volumen total de producto)
X = 18000000 UFC/0.2mL
18x106 UFC/0.2mL ----- 1 g X
------ 20g (volumen de producto)
X = 9X105 UFC Adicionalmente al montaje de la muestra realizar un control positivo. Para esto tomar 5 frascos con solución salina estéril o caldo tripticasa de soya con un volumen de 20mL e inocular 0.2 mL de las suspensiones de los microorganismos.
Finalizado el proceso de inoculación de la muestra tomar tubos de dilución de 9mL de caldo Letheen (agente inactivador o neutralizante – lecitina), hacer las respectivas diluciones (10 -2, 10-3) para realizar recuento en placa y estimar las concentraciones de los microorganismos. Llevar a incubación a 35+/-2ºC durante 24 – 48 horas para bacterias y 22+/-2ºC durante 5 días, para mohos y levaduras.
Realizar el mismo procedimiento para el control positivo pero las diluciones deben ser realizadas en tubos de 9 mL de agua peptonada. Se sugiere realizar diluciones (10 -3 y 10-4)
Los frascos con muestra inoculados y el control positivo se deben llevar a incubación a 22 +/- 2ºC, durante el periodo establecido según la categoría del producto.
Nota: La periodicidad de siembra se debe realizar en base al tipo de categoría del producto (Ver anexo 1). Para esto se deben tomar los frascos incubados previamente inoculados, se confirma la concentración mediante el recuento en placa. Se debe tener en cuenta que teóricamente la concentración debe disminuir en al menos 1 ciclo logarítmico por lo que las diluciones a servir deben ser inferiores a las realizadas en el día 0.
Reporte de Resultados Usando las concentraciones calculadas de UFC/cm 3 presentes al inicio de la prueba, calcular el cambio en porcentajes en valores del
log 10 de la concentración de UFC/cm 3 para cada
microorganismo a los días de incubación 7, 14 y 28 días (dependiendo de la categoría del producto). Expresar los cambios en términos de reducciones logarítmicas. Emitir el concepto de cumplimiento en base al criterio expuesto en la Tabla 1, según categoría del producto.
4. REFERENCIAS USP 30. Pruebas de eficacia antimicrobiana. Página 85 - 87. Año 2006.
5. ANEXOS: Criterios para microorganismos evaluados (Tabla 1)
Tabla 1. Criterios para microorganismos evaluados
Categoría
Microorganismo
Criterio
1
Bacterias
A los 7 días, se debe presentar
una
reducción
logarítmica de no menos de1.0 desde el recuento calculado en el inicio; a los 14
días,
una
reducción
logarítmica de no menos de 3.0 del recuento inicial; y ningún
incremento
del
recuento entre los 14 y 28 días. Levadura y Moho
Ningún incremento a los 7, 14 y 28 días respecto al recuento inicial.
2
Bacterias
A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 2.0,
desde
el
recuento
inicial; y ningún incremento del recuento entre los 14 y 28 días. Levadura y Moho
Ningún incremento a los 14 y
28
días
respecto
al
recuento inicial 3
Bacterias
A los 14 días una reducción
logarítmica de no menos de 1.0 del recuento inicial y ningún
incremento
del
recuento entre los días 14 y 28. Levadura y Moho
Ningún incremento a los 14 y
28
días
respecto
al
recuento inicial 4
Bacterias, levadura y moho
Ningún incremento a los 14 y
28
días
recuento inicial
respecto
al
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NIT 830.101.160 830.101.160 -5 --5
Bogotá, D.C., 06 Junio del 2014
Señores:
SOMINCORP IPS Dra. Janeth Arias Palacios Directora Carreras de Microbiología Industrial Bogotá D.C.
Referencia: Informe de resultados prueba de Challenge Test.
Respetada Doctora: Adjunto encontrará los resultados microbiológicos de la muestra enviada para prueba de efectividad antimicrobiana, el día 29 de Abril de 2014. Certificado de análisis Nº M-14-11587. Esta muestra se analizó siguiendo la metodología de la USP 30 para Evaluación microbiológica de eficacia antimicrobiana (Challenge Test o Pruebas de desafío).
Cualquier aclaración o inquietud con gusto será suministrada.
Cordialmente,
BIOTRENDS LABORATORIOS S.A.S
Fernando Murcia Rubiano Director Técnico
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INFORME N° M-14-091 ANEXO AL CERTIFICADO DE ANÁLISIS N°. M – 14-11587
CLIENTE: ATENCIÓN: DIRECCIÓN: TELEFONO: CIUDAD: FECHA DE MUESTREO: FECHA DE RECEPCION: FECHA DE ANALISIS: FECHA DEL INFORME:
SOMINCORP IPS Dra. Janeth Arias Palacios Calle 50 No 8 - 27 oficina 302 3208320 ext 4076 Bogotá D.C. N.E. 29 de Abril de 2014 29 de Abril de 2014 06 de Junio de 2014
IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA REF. BIOTRENDS MUESTRA LOTE FECHA DE PRODUCCIÓN FECHA DE VENCIMIENTO FABRICANTE
14-11587 GEL ANTIBACTERIAL Y REPARADOR - OZODERM G-130801 N.E 01-08-2014 N.E
1. OBJETIVO. Evaluar la efectividad antimicrobiana del preservante en la muestra mencionada para garantizar que el producto es microbiológicamente seguro y estable.
2. METODOLOGÍA USADA. El método utilizado es el recomendado por la United States Pharmacopea (USP 30). Evaluación a los 0, 14 y 28 días para productos categoría 2: Productos de uso tópico con bases o vehículos acuosos, productos nasales no estériles y emulsiones incluyendo aquellas que se aplican a mucosas.
3. RESULTADOS OBTENIDOS. Resultados prueba de Challenge Test (VER ANEXO No 1) Informe Nº M - 14-091. Página 1 de 3
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4. SELECCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS Esta muestra se evaluó siguiendo la metodología de la USP 30 para Evaluación microbiológica de eficacia antimicrobiana (Challenge Test o Pruebas de desafío). Los microorganismos utilizados fueron los siguientes: Aspergillus níger ATCC 16404 : En la evaluación se utiliza este microorganismo debido a que los hongos filamentosos son a menudo agentes causales de daño a productos preservados. Candida albicans ATCC 10231: En la evaluación se utiliza este microorganismo debido a su patogenicidad y porque representa resistencia a los preservativos. Staphylococcus aureus ATCC 6538: En la evaluación se utiliza este microorganismo como representante de cocos gram positivos que son patógenos y están presentes en la piel y pueden presentar inconvenientes en los productos cosméticos durante el uso. Escherichia coli ATCC 8739: En la evaluación se utiliza este microorganismo como representante de bacilos gram negativos fermentadores, que son indicadores de contaminación fecal y de fallas de higiene. Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027: En la evaluación se utiliza este microorganismo debido a su patogenicidad, a su presencia en diferentes ambientes y además por su capacidad de proliferar en el agua y adaptarse a varios sustratos, a su alta resistencia a varios sistemas de preservativos, a su potencialidad de degradación del producto, y por ser representativa de fallas de higiene en los procesos de manufactura.
5. ANALISIS DE RESULTADOS La muestra que se analizó se expuso a los siguientes microorganismos en las concentraciones recomendadas:
Aspergillus níger ATCC 16404 . Se encontró una reducción de 99.10% (2.05 ciclos logarítmicos) a los 14 días de incubación que se mantuvo hasta los 28 días de incubación. De esta manera se cumplen los requisitos de USP 30 que exige que no se presente incremento del recuento inicial durante el periodo de evaluación.
Candida albicans ATCC 10231 . Se encontró una reducción de 99.10% (2.05 ciclos logarítmicos) a los 14 días de incubación que se mantuvo hasta los 28 días de incubación. De esta manera se cumplen los requisitos de USP 30 que exige que no se presente incremento del recuento inicial durante el periodo de evaluación. Informe Nº M - 14-091. Página 2 de 3
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Staphylococcus aureus ATCC 6538. Se encontró una reducción de 99.10% (2.05 ciclos logarítmicos) a los 14 días de incubación que se mantuvo hasta los 28 días de incubación. Cumpliendo con los requisitos de reducción según USP 30, en el que se debe presentar una reducción de bacterias del 99% a los 14 días de incubación y mantenerse en este margen luego de 28 días de estudio.
Escherichia coli ATCC 8739. Se encontró una reducción de 99.10% (2.05 ciclos logarítmicos) a los 14 días de incubación que se mantuvo hasta los 28 días de incubación. Cumpliendo con los requisitos de reducción según USP 30, en el que se debe presentar una reducción de bacterias del 99% a los 14 días de incubación y mantenerse en este margen luego de 28 días de estudio.
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Se encontró una reducción de 99.10% (2.05 ciclos logarítmicos) a los 14 días de incubación que se mantuvo hasta los 28 días de incubación. Cumpliendo con los requisitos de reducción según USP 30, en el que se debe presentar una reducción de bacterias del 99% a los 14 días de incubación y mantenerse en este margen luego de 28 días de estudio.
6. CONCLUSIONES. Después de observar el comportamiento microbiológico de la muestra con el preservante, se concluye que el sistema preservante es efectivo frente a la eliminación de microorganismos, contribuyendo así con la protección, estabilidad microbiológica y seguridad del producto, favoreciendo a futuro la vida útil de este y garantizando su buen desempeño durante su vida de estantería.
Cordialmente,
BIOTRENDS LABORATORIOS S.A.S
Fernando Murcia Rubiano Director Técnico
Analizado por: C 22 Revisado por: C 26 Informe Nº M - 14-091. Página 3 de 3
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ANEXO 1: REPORTE DE RESULTADOS - CERTIFICADO DE ANALISIS No: M-14-11587 PRUEBAS DE EFICACIA ANTIMICROBIANA (CHALLENGE TEST)
SOMINCORP IPS MUESTRA
0 días
RECUENTOS 14 días
A. niger
10E+02 10E+02 10E+02 10E+02 10E+02
09E+00 09E+00 09E+00 09E+00 09E+00
09E+00 09E+00 09E+00 09E+00 09E+00
MUESTRA
0 días
% DE REDUCCIÓN 14 días
28 días
Aspergillus niger
NA NA NA NA NA
99,10 99,10 99,10 99,10 99,10
99,10 99,10 99,10 99,10 99,10
MUESTRA
0 días
REDUCCIÓN EN CICLOS LOG 14 días
28 días
Aspergillus niger
NA NA NA NA NA
2,05 2,05 2,05 2,05 2,05
2,05 2,05 2,05 2,05 2,05
SOLUCIÓN SALINA 0,85%
0 días
RECUENTOS 14 días
28 días
A. niger C. albicans S. aureus E. coli Ps. aeruginosa
02E+06 05E+06 04E+06 04E+06 04E+06
10E+08 26E+08 02E+10 01E+10 83E+08
45E+08 03E+10 03E+10 12E+10 03E+10
%
CICLOS LOG
99
2
C. albicans S. aureus E. coli Ps. aeruginosa
Candida albicans Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
Candida albicans Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
CONTROL
REQUISITOS DE REDUCCIÓN (14 DÍAS)* USP 30 Bacterias Mohos y levaduras
28 días
No incremento en los 28 días
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