PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012 110212 (1).pdf

PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012

ORGANISMO NACIONAL DE NORMALIZACIÓN DEL COFOCALEC

PROYECTO DE NORMA MEXICANA PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012 SISTEMA SISTEMA PRODUCTO LECHE – ALIMENT AL IMENTO O – LÁCTEO LÁ CTEO – LECHE CRUDA DE VACA VA CA – ESPECIFICACIONES ESPECIFICACIONES FISICOQUÍMI FISICOQUÍMICAS, CAS, SANITARIAS SANITA RIAS Y MÉTODOS MÉTODOS DE PRUEBA.


PROYECTO DE NORMA MEXICANA PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012 SISTEMA PRODUCTO LECHE - ALIMENTO – LÁCTEO – LECHE CRUDA DE VACA – ESPECIFICACIONES FISICOQUÍMICAS, SANITARIAS Y MÉTODOS DE PRUEBA. PREFACIO En la elaboración del presente Proyecto de Norma Mexicana, participaron las siguientes empresas e instituciones: -

ASOCIACIÓN DE PROFESIONALES EN TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS, A.C. (APTA, A.C.)

-

CÁMARA NACIONAL DE INDUSTRIALES DE LA LECHE (CANILEC)

- CONFEDERACIÓN NACIONAL DE ORGANIZACIONES GANADERAS GANADERAS (CNOG) -

CONSEJO PARA EL FOMENTO FOMENTO DE LA CALIDAD DE LA LECHE Y SUS SUS DERIVADOS, A.C. (COFOCALEC, A.C.)

-

GANADEROS PRODUCTORES DE LECHE PURA, S.A. DE C.V.

- INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE OCCIDENTE (ITESO) -

LECHERA GUADALAJARA, S.A. DE C.V.

- LICONSA, S.A. DE C.V. -

SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA, DESARROLLO RURAL, PESCA Y ALIMENTACIÓN (SAGARPA) Coordinación General de Ganadería

-

UNIÓN DE PASTEURIZADORES DE JUÁREZ, S.A. DE C.V.

-

UNIÓN GANADERA REGIONAL DE JALISCO (UGRJ)

- UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO (UNAM) Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

2


INDICE DEL CONTENIDO NÚMERO DE CAPÍTULO 0.

Introducción

1.

Objetivo

2.

Campo de aplicación

3.

Referencias

4.

Definiciones

5.

Símbolos y abreviaturas

6.

Especificaciones fisicoquímicas y sanitarias

7.

Muestreo

8.

Métodos de Prueba

9.

Bibliografía

10. Concordancia con Normas Internacionales Apéndice Normativo A – Métodos de Prueba Apéndice Informativo A – Ensayo de colaboración del conteo de células somáticas (Método de referencia) Apéndice Informativo B – Tinción de leche de cabra para el conteo de células somáticas Apéndice Informativo C – Distribución de Poisson Apéndice Informativo D - Evaluación de la calidad microbiológica de la leche por pruebas de reducción de colorantes Apéndice Informativo E – Listado de Normas Mexicanas que describen métodos de prueba rápidos aplicables a leche cruda de vaca

3


0. INTRODUCCIÓN La importancia alimenticia de la leche en la nutrición humana, reside básicamente en la calidad de sus proteínas, su alta digestibilidad y alto valor biológico, así como en su contenido de calcio y de vitaminas A, B 1 y B2. Es un alimento energético y complementario para toda la familia, en particular para los niños, mujeres embarazadas y ancianos, que forma parte de la dieta de los mexicanos y es materia prima para la elaboración de numerosos productos. Por sus características fisicoquímicas y de composición, la leche es altamente susceptible a la contaminación y el deterioro, afectándose su calidad por las condiciones higiénicas y sanitarias de producción, almacenamiento y transporte, además de que puede constituirse en un excelente vehículo de organismos patógenos. Por lo anterior, es necesario contar con una Norma Mexicana que establezca las especificaciones de la leche cruda en el país, con la finalidad de uniformizar los requisitos que la industria solicita a los productores de leche. 1. OBJETIVO El presente Proyecto de Norma Mexicana tiene tiene por objeto establecer las especificaciones de calidad de la leche cruda de vaca y los métodos de prueba usados para su evaluación. 2.- C AMPO DE APLICACIÓN El presente Proyecto de Norma Mexicana es aplicable a la leche leche cruda de vaca, de origen nacional o extranjera, destinada a la fabricación e industrialización de productos para consumo humano en territorio nacional. 3. REFERENCIAS Para la correcta aplicación de éste Proyecto de Norma Mexicana se deben consultar las siguientes Normas Oficiales Mexicanas y Normas Mexicanas vigentes: NOM-008-SCFI-2002

Sistema General de Unidades de Medida. Publicada en el Diario Oficial de la Federación el 27 de noviembre de 2002.

NOM-155-SCFI-2003

Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado – Denominaciones, especificaciones fisicoquímicas y

4


métodos de prueba. Publicada en el Diario Oficial de la Federación el 12 septiembre de 2003. NOM-243-SSA1-2010

Productos y servicios. Leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado y derivados lácteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Métodos de prueba, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 27 de septiembre de 2010.

NMX-F-718-COFOCALEC-2006

Sistema Producto Leche – Alimentos – Lácteos – Guía para el muestreo de leche y productos lácteos, declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 9 de noviembre de 2006.


Sistema Producto Leche – Alimentos – Lácteos – Prácticas de higiene recomendadas para la obtención de leche , declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 7 de agosto de 2008.


Sistema Producto Leche - Alimentos Lácteos - Determinación de la densidad en leche fluida y fórmula láctea - Método de prueba, declaratoria de vigencia publicada en el Diario Oficial de la Federación el 21 de julio de 2010.

4. DEFINICIONES Para fines del presente Proyecto de Norma Mexicana se entiende por: 4.1 Alimento, cualquier sustancia o producto, sólido, semisólido o líquido natural o transformado, destinado al consumo humano, que proporciona al organismo elementos para su nutrición por vía oral. 4.2 Almacenamiento , acción de guardar en un silo o sitio específico la leche para su conservación, custodia, suministro, futuro procesamiento o venta. 4.3 Calostro, secreción de la glándula mamaria obtenida en el periodo comprendido de 5 días antes a 5 días después del parto, que difiere de la leche principalmente por su alto contenido de inmunoglobulinas (anticuerpos), células somáticas, cloruros y la presencia de eritrocitos, y cuyo color va del amarillo al rosado.

5


4.4 Características de calidad, conjunto de propiedades de la leche de vaca, que le confieren la aptitud para satisfacer las necesidades implícitas o explícitas para su uso y consumo. 4.5 Clase, rango establecido por los parámetros que determinan el grado de calidad. 4.6 Clarificación, proceso por el cual se eliminan de la leche las impurezas macroscópicas, los grumos y de manera parcial los microorganismos, leucocitos y otras células, principalmente mediante una centrifugación continua. 4.7 Conservación, acción de mantener la leche en buen estado, almacenándola cuidadosamente, para que no pierda sus características a través del tiempo. 4.8 Contaminación, cuando la leche contenga microorganismos, hormonas, bacteriostáticos, plaguicidas, radioisótopos, así como cualquier materia o sustancia no autorizada o en cantidades que rebasen los límites máximos permitidos por la autoridad competente. 4.9 Filtración, proceso por el cual se separan de la leche las partículas ajenas al producto. 4.10 Higiene, todas las medidas necesarias para garantizar la sanidad e inocuidad de la leche en todas las fases del proceso desde su obtención hasta su uso o consumo final. 4.11 Leche crud a de vaca, es la secreción natural de las glándulas mamarias de las vacas, sin calostro y sin substracción alguna de sus componentes, que no ha sido sometida a tratamientos térmicos. 4.12 Materia extraña, toda aquella sustancia, resto o desecho orgánico o no, que se presenta en la leche sea por contaminación o por manejo poco higiénico de la misma durante su obtención, almacenamiento o transporte, considerándose entre otros: excretas y pelos de cualquier especie, fragmentos de insectos y otros. 4.13 Métodos de prueba, procedimientos analíticos utilizados en el laboratorio para comprobar que un producto satisface las especificaciones que establece la norma. 4.14 Muestra, al total de unidades de producto provenientes de un lote y que representan las características y condiciones del mismo. 4.15 Refrigeración, método de conservación físico que se emplea en los alimentos para retardar el crecimiento de la mayoría de los organismos, reducir las reacciones bioquímicas y el deterioro propio de los alimentos.

6


5. SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS Cuando en éste Proyecto de Norma Mexicana se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas, se entiende por: g/L mL g µg/kg +/m/m v/v % ºC ºH mín. máx. UFC/mL CS/mL < > cm2 mm2 mm

gramos por litro mililitros gramos microgramos por kilogramo más o menos que masa por masa volumen por volumen porcentaje grados Celsius grados Horvert mínimo máximo unidades formadoras de colonias por mililitro células somáticas por mililitro menor o igual que mayor o igual que centímetros cuadrados milímetros cuadrados milímetros

6. ESPECIFICACIONES FISICOQUÍMICAS Y SANITARIAS 6.1 La leche cruda de vaca debe cumplir con las especificaciones descritas en las tablas 1 y 2 (véanse tablas), en el lugar donde se acuerde la transferencia de propiedad. 6.2 Una vez obtenida la leche cruda de vaca debe ser filtrada y refrigerada lo más pronto posible, preferentemente a una temperatura de 4 ºC o menor sin llegar a la congelación. 6.2.1 No se podrán usar conservadores, ni realizar ninguna manipulación de la leche cruda que modifique sus características sanitarias, salvo las que expresamente autorice la Secretaría de Salud. 6.3 La leche cruda puede clarificarse en la explotación lechera si se cuenta con la infraestructura. Debe clarificarse en el centro de acopio o en la planta procesadora de leche.

7


TABLA 1. Especificaciones fis icoquímicas para leche crud a de vaca. Parámetro Especificación Densidad a 15ºC g/ml 1,0295 mín. Grasa butírica g/L Clase A > 32 Clase B 31 mín. Clase C 30 mín. Proteínas totales g/L Clase A > 31 Clase B 30 a 30,9 Clase C 28 a 29,9 Caseína g/L 23 mín. Lactosa g/L 43 a 50 Sólidos no grasos g/L 83 mín. Punto Crioscópico ºC Entre -0,515 y -0,536 NOTA – Punto Crioscópico expresado en ºH: Entre -0,535 y -0.560

Método de Prueba NMX-F-737-COFOCALEC-2010 NOM-155-SCFI-2003

NOM-155-SCFI-2003 NOM-155-SCFI-2003 NOM-155-SCFI-2003 NOM-155-SCFI-2003 NOM-155-SCFI-2003

TABLA 2. Especif icaciones sanitari as para leche cru da de vaca. Parámetro Acidez (como ácido láctico) g/L Prueba de alcohol al 72 % v /v Materia extraña Inhibidores Aflatoxina M1 µg/kg Cuenta total de Bacterias Mesofílicas Aerobias UFC/mL Clase 1 Clase 2 Clase 3 Clase 4 Conteo de Células Somáticas CS/mL Clase 1 Clase 2 Clase 3 Clase 4

Especificación 1,3 a 1,6 Negativa Libre Negativo 0,5 máx. < 100 000 101 000 a 300 000 301 000 a 599 000 600 000 a 1 200 000 < 400 000 401 000 a 500 000 501 000 a 749 000 750 000 a 1 000 000

Método de Prueba NOM-155-SCFI-2003 Véase inciso 1 del Apéndice Normativo A Véase inciso 2 del Apéndice Normativo A NOM-243-SSA1-2010 NOM-243-SSA1-2010

NOM-243-SSA1-2010

Véase inciso 3 del Apéndice Normativo A

7. MUESTREO Para fines de muestreo del producto objeto de este Proyecto de Norma Mexicana se propone el uso de la Norma Mexicana NMX-F-718-COFOCALEC-2006 (Ver el punto 2 Referencias). 8. MÉTODOS DE PRUEBA Para la verificación de las especificaciones que se establecen en el presente Proyecto de Norma Mexicana se deben aplicar los métodos de prueba señalados en las tablas 1 y 2 (véanse tablas).

8


9. BIBLIOGRAFIA CODEX STAN 206-1999. Norma General para el uso de Términos Lecheros. International Standard ISO 13366-1:2008|IDF148-1:2008 Milk – Enumeration of somatic cells – Part 1: Microscopic method (Reference method). 10. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES Este Proyecto de Norma Mexicana coincide básicamente con la Norma Internacional ISO 13366-1:2008 Milk – Enumeration of somatic cells – Part 1: Microscopic method (Reference method), en el punto 3 del Apéndice Normativo A y los Apéndices Informativos A, B y C. Difiere en el resto de su contenido por no existir Norma Internacional sobre el tema tratado.

A PENDICE NORMATIVO A

9


- Métodos de prueba A.1. Prueb a del alcohol al 72 % v/v A.1.1 FUNDAMENTO Cuando se mezcla un volumen dado de alcohol con leche, provoca una deshidratación parcial de ciertos coloides hidrofílicos presentes en la muestra, desnaturalizándolos y alcanzando un estado de desequilibrio entre sus dos fases discontinuas (emulsión grasa y suspensión coloidal) por lo que floculan. Este cambio sólo se produce cuando la mezcla final alcanza un cierto contenido de alcohol, abajo del cual la leche térmicamente estable no floculará y por lo tanto la leche resistirá un tratamiento térmico. A.1.2 REACTIVOS Y M ATERIALES A.1.2.1 Alcohol etílico al 72 % v/v A.1.2.2 Tubos de ensayo de 10 ml. A.1.2.3 Pipetas de 20 ml. A.1.2.4 Alcoholímetro o aerómetro graduado. A.1.2.5 Probeta. A.1.3 PROCEDIMIENTO Medir 2 ml de muestra y colocarla en un tubo de ensayo, agregar 2 ml de alcohol etílico al 72 % v/v, mezclar y observar si hay formación de grumos. A.1.4 C ÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS La formación de grumos (reacción positiva), es clara evidencia de que la estabilidad de la suspensión coloidal de la leche se encuentra afectada, por lo que no resistirá el proceso térmico de la pasteurización. Expresar el resultado como positivo o negativo. A. 2. Determinac ión d e materia extr aña en leche A.2.1 FUNDAMENTO Se filtra una cantidad predeterminada de leche (a temperatura de 32 a 38 ºC), a través de un disco de algodón, para retener la materia extraña y comparar la cantidad obtenida contra estándares preparados de acuerdo con este procedimiento. 10


A.2.2 EQUIPOS Y MATERIALES A.2.2.1 Analizador. De construcción simple, de fácil limpieza y ajustable entre muestreos para permitir la limpieza sanitaria del disco utilizado y su reemplazo con uno limpio. Antes de utilizar, evaluar la reproducibilidad del analizador de acuerdo con lo descrito en el punto 2.3.4. La leche o la materia extraña no debe sobrepasar el disco. Seleccione el tipo de acuerdo con el método de muestreo: A.2.2.1.1 Método para muestras compuestas. Tipo de vacío, gravedad o presión: A.2.2.1.1.1 Para muestras de 3,785 L utilice un aditamento apropiado que filtre la muestra a través del disco con un área de exposición de 28,6 mm de diámetro. A.2.2.1.1.2 Para muestras de 473 mL, prepare la unidad con un filtro que tenga un área de filtrado de 10 mm de diámetro, o utilice algún aditamento que tenga un área de filtrado de 10 mm de diámetro. A.2.2.1.2 Método del fondo. Puede ser para dos tipos de unidades. En el caso de unidad simple para la toma de 473 mL sobre el movimiento ascendente del émbolo y descarga a través del disco en el movimiento descendente del émbolo. En el caso del tipo de dos unidades, la primera para la remoción de 473 mL de leche del fondo de la cántara de leche y otra para el filtrado de la muestra. Utilice el aditamento de muestreo con la longitud suficiente para alcanzar el fondo del cántara de leche y que tenga un área de filtrado de un diámetro de 28,6 mm. A.2.2.2 Discos de algodón para materia extraña. Discos de algodón estándar o almohadillas de 28,6 mm de diámetro, para utilizarse sobre pantallas planas de alambre en el analizador y que tienen un área de exposición de 28,6 mm de diámetro. El disco no debe contener residuos de resinas fenólicas u otros químicos que puedan contaminar la leche. Pruebe los discos de materia extraña de la siguiente manera: Filtre a través de la almohadilla 12 mg de una mezcla estándar de materia extraña (alícuota de 60 mL, ver el punto 2.3.1 utilizando matraces limpios para recibir el filtrado. Transfiera el filtrado a un vaso de precipitado, enjuague 3 veces el matraz con agua destilada y vierta los enjuagues al vaso de precipitado. Filtre a través de papel filtro de 7 ó 9 cm que haya sido lavado previamente con 200 mL de agua destilada, secado a peso constante a 100 °C y enfriado en un plato cubierto en el desecador antes de pesar. Enjuague completamente el vaso de precipitado y el papel filtro y seque a peso constante como se describe anteriormente. Pruebe ≥ 3 discos; el peso promedio del sedimento que pase a través de cada disco debe ser ≤ 2,8 mg. Además, el disco estándar preparado con la mezcla fina no debe aparecer como si tuviera materia extraña oculta bajo la superficie.

11


A.2.2.3 Equipo para la filtración de la materia extraña. A.2.2.3.1 Para diámetros estándar de 28,6 mm. El equipo debe soportar discos para materia extraña de 31,8 mm y tener un área efectiva de filtración de 28,6 mm de diámetro. Esta área no debe ser obstruida excepto por la pantalla de alambre o por ésta y el soporte para el disco de filtrado. El equipo debe contar con matraces de filtración de tal manera que pueda ser utilizado vacío para lograr una filtración rápida o un matraz con salida de aire de tal forma que al cerrarlo se detenga la filtración. El equipo debe tener un embudo de 80 ° con una capacidad de entre 80 a 450 mL. Pruebe el equipo filtrando la suspensión de agua que se describe en el punto 2.3.4 a través del disco estándar. El disco debe tener una orilla claramente definida. Cuando la suspensión de la materia extraña es filtrada, debe ser homogéneamente distribuida sobre el disco procurando no establecer un patrón de distribución. A.2.2.3.2 Para diámetros estándar de 10 mm. Equipo con vacío que soporta discos para materia extraña de 31,8 mm y utiliza sólo un área de filtración de 10 mm de diámetro. Pruebe el equipo de acuerdo con el procedimiento descrito en el punto anterior. A.2.3 PROCEDIMIENTO A.2.3.1 Preparación de estándares de discos con materia extraña gruesa. Prepare una mezcla uniforme de materiales secados al horno (100 °C), durante 3 o 4 horas, que reúnan las siguientes especificaciones para malla o tamizado. Muela todos los materiales a mano con un mortero y pistilo. Estiércol de vaca, a través de una malla o tamiz No.40.......................................... Estiércol de vaca, a través de una malla o tamiz No. 20, retenido en el No. 40…. Tierra de jardín, a través de una malla o tamiz No. 40............................................ Carbón, a través de una malla o tamiz No. 40........................................................ Carbón, a través de una malla o tamiz No. 20, retenido en el No. 40....................

53 % 2 % 7 % 14 % 4 %

Coloque 2 g de la mezcla antes descrita en un frasco volumétrico de 100 mL, humedezca completamente con 4 a 6 mL de la solución Aerosol OT (preparar solución 1 al 2% en acetona y diluir con agua) o cualquier otro agente humidificante apropiado, agregue 46 mL de la solución goma de algarrobo al 0,75%, y lleve el nivel del líquido hasta el cuello del frasco añadiendo solución de sacarosa (sucrosa) al 50% (por peso). Deje reposar ≥ 30 minutos, añada pocas gotas de alcohol y diluya a volumen con la solución de sacarosa (sucrosa). Mezcle muy bien y vierta en un vaso de precipitado de 250 mL o cualquier otro recipiente adecuado y agite con un agitador mecánico o magnético a una velocidad tal (200 a 300 rpm) que la mezcla sea completamente agitada pero cuidando que no se formen burbujas en la suspensión. Observe contra la luz brillante que la suspensión se encuentre uniformemente mezclada.

12


Transfiera, mientras agita, una porción de 10 mL (200 mg de sedimento estándar) con una pipeta graduada de punta amplia a un matraz volumétrico de 1 L y diluya al volumen con la solución de sacarosa (sucrosa) al 50%. Cuando se encuentre completamente mezclada, cada mL contiene 0,2 mg de sedimento. Mezcle y vierta en un vaso de precipitado y agite de la misma manera que anteriormente. Si las partículas se acumulan en los lados del vaso, resuspéndalas con la misma suspensión de materia extraña o con la punta de la pipeta. Mientras agita, saque con la pipeta volúmenes definidos de la suspensión con materia extraña y agréguelas a 0,35 L de leche descremada dulce filtrada. Mezcle bien y pase la mezcla a través del disco de materia extraña estándar del equipo de filtración (véase A.2.2.3 y A.2.2.3.1). Con cuidado vierta la leche hacia el equipo de filtrado y filtre con muy poca o nada de succión. Lave el recipiente rápidamente con un 0,11 L de leche descremada filtrada. Deje que la última parte de la leche fluya a través de la almohadilla sin aplicar succión. Si la materia extraña no parece estar uniformemente distribuida en la almohadilla, agregue 15 o 20 mL de leche descremada y fíltrela sin succión. Repita este procedimiento hasta que la materia extraña aparezca homogéneamente distribuida. Aspire aire a través del disco por aproximadamente 1 minuto para remover el exceso de leche descremada. Para registros permanentes, monte y rocíe los discos con solución de formaldehído al 40% o con una solución alcohólica que contenga 2,5 g tanto de mentol como de timol en 100 mL. No obstante, si toda la leche es eliminada a través de la aspiración no es necesario aplicar conservadores. Las almohadillas secas pueden ser recubiertas con cemento plástico transparente diluido con 1:3 volúmenes de acetona de tal manera que la mezcla sea lo suficientemente delgada que permita su fácil aplicación. Si la acetona disuelve el pigmento del papel o mancha las almohadillas, coloque éstas últimas en un cristal plano para la aplicación del cemento diluido. Mueva las almohadillas mientras se secan para evitar que se peguen al cristal. Cuando las almohadillas están casi secas, coloque un objeto ligero (por ejemplo caja de Petri) encima de las mismas para evitar que se enrosquen. Las almohadillas pueden ser montadas con cemento plástico. (Los discos estándar hechos con estiércol de vaca contienen grandes cantidades de clorofila y no pueden ser recubiertos con cemento plástico debido a que el solvente extrae la clorofila y mancha de verde las almohadillas. Utilice este método de conservación de las almohadillas solo si no hay deslave de pigmentos del sedimento al aplicarse cemento plástico diluido). Después de llevar a cabo el método antes descrito, prepare diferentes discos con la mezcla de materia extraña utilizando las siguientes cantidades: 0,0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 12,0, y 14,0 mg. Marque el disco con la cantidad de materia extraña utilizada para preparar cada almohadilla. Evite utilizar como estándar aquellas almohadillas en las que la materia extraña no se encuentre uniformemente distribuida. Para realizar comparaciones entre muestras se pueden utilizar series completas de discos pero por lo general es más conveniente seleccionar pocos discos que demuestren diferencias en el contenido de materia extraña que sean aplicables a la investigación que se esté llevando a cabo. En aquellos caso en que se elaboren 13


informes y tablas comparativas, es importante señalar el tipo de muestra utilizada (mezclada o muestra del fondo de la cantara). Si los estándares se van a utilizar por un periodo prolongado, protéjalos con cristal o con hojas de plástico o cualquier otro material adecuado. Al utilizar estándares, use cualquier de los siguientes métodos: Califique el disco de materia extraña con el disco estándar más cercano sin importar si la cantidad de sedimento es inferior o superior al estándar; o Califique el disco de materia extraña de la muestra como “más de ____ mg” o “menos de ___ mg”. Elija los estándares que se ajusten al método de calificación. Cuando califique los discos, elimine las piezas burdas (moscas completas, pelos, pedazos grandes de estiércol o lodo, etc.), pero si dichos materiales se encuentran presentes señálelos de manera separada en el informe. A.2.3.2 Preparación de estándares de discos con materia extraña fina. A.2.3.2.1 Estándar de 28,6 mm de diámetro. Muela estiércol de vaca secado en el horno (100 °C), tierra de jardín y carbón de madera (entero) en un molino Wiley (o equivalente) con malla o tamiz fino. Pase el estiércol de vaca por el molino 2 ó 3 veces. Separe los materiales en cantidades máximas de 50 g, como sigue: Seque 25 a 50 g a 100 °C por 3 a 4 horas. Mientras está todavía caliente, coloque en una malla o tamiz de 203 mm No. 140 que se encuentre unido a una malla o tamiz No. 230. Ponga la cubierta y el recibidor. Sacuda los tamices con la mano durante 5 minutos a 120 movimientos por minuto. Separe los tamices y elimine el material que se haya pegado en la parte de abajo del tamiz 230 y elimine antes de vaciar el tamiz. Seque el material retenido en el tamiz No. 230 por aproximadamente 2 horas (cantidad máxima de 20 g) y vuelva a sacudir durante 5 minutos, como se describió anteriormente. Separe los tamices y elimine el material que se haya pegado a la parte de abajo del tamiz No. 230 antes de vaciarlo. Utilice las fracciones del tamiz No. 230 de la segunda sacudida y mézclelas uniformemente en las siguientes proporciones: estiércol de vaca 66%, tierra de jardín 28% y carbón 6%. Combine las dos fracciones de arriba “140” de cada uno de los materiales y sacuda nuevamente como se hizo anteriormente, con la excepción de utilizar un tamiz No. 120 conectado sobre el No. 140. Reagite la fracción nueva “140”, retenga la fracción “140” de la segunda agitada. (Seque antes de cada agitada y elimine el material acumulado en la parte baja del tamiz No. 140 antes de vaciarlo). Mezcle el estiércol, la tierra y el carbón en las proporciones mencionadas anteriormente. Coloque 1,8 g de la mezcla de la fracción “230” y 0,2 g de la mezcla de la fracción “140” en un matraz volumétrico de 100 mL. Repetir los mismos pasos que se describen en A.2.3.1, empezando en … “humedezca completamente con 4 a 6 mL 14


de solución Aerosol OT al 1%...” excepto que se utiliza agua en lugar de la solución al 50% de sacarosa (sucrosa) para diluir una alícuota de 10 mL a 1 L. En donde se describe en A.2.3.1 que “Mientras agita, saque con la pipeta volúmenes definidos...”, proceda de la siguiente manera: Determine la capacidad del embudo del equipo de filtrado (véase A.2.2.3.1), al vaciar agua destilada en el equipo ensamblado con la salida de aire del frasco de filtrado cerrado. Incluya el agua destilada que se filtra como parte de la capacidad del embudo. Mientras agita, transfiera alícuotas de la suspensión de materia extraña hacia los vasos de precipitado. Agregue agua destilada para hacer un volumen total de 20 a 50 mL menor que la capacidad del embudo, utilizando el volumen total de entre 60 a 400 mL. Con la salida del aire del matraz de filtración cerrada para evitar la filtración, mezcle la alícuota diluida y vacíela al equipo (véase A.2.2.3.1), provisto con un disco estándar húmedo (véase A.2.2.2.) (Use alcohol o agente humidificador cuando sea necesario para mojar el disco). Añada 20 a 50 mL de agua al vaso de precipitado y enjuague girando el vaso. Vacíe en el embudo, manteniendo el labio del vaso tocando la superficie de agua en lo posible. (El agua de enjuague debe casi llenar el embudo si la capacidad es de ≤ 450 mL). Abra la salida de aire del matraz. Después de que el agua ha sido filtrada a través de la almohadilla, aplique vacío y aspire el disco por espacio de 1 minuto. Remueva la almohadilla y déjela secar en una caja cubierta. Si la materia extraña no se encuentra uniformemente distribuida, elimine la almohadilla. Después de algo de práctica, aproximadamente el 75% de las almohadillas preparadas deben ser aceptables. No se requiere conservador. Las almohadillas pueden ser cubiertas con cemento plástico diluido y utilizadas como se describe en A.2.3.1. A.2.3.2.2 Estándar de 10,2 mm de diámetro. Mientras agita, transferir con la pipeta 100 mL de la suspensión fina diluida descrita anteriormente en un contenedor apropiado y diluir a 800 mL con agua destilada. Cada mL contiene 0,025 mg de sedimento y cuando se filtra a través de un área de 0,40 de diámetro es equivalente a un filtrado de 0,2 mg a través de un área de 28,6 de diámetro. Prepare varios estándares filtrando alícuotas adecuadas a través de los discos en el equipo (véase A.2.2.3.2). Diluya cada alícuota a 50 a 60 mL y filtre con una succión mínima. Enjuague el vaso con un volumen pequeño de agua destilada y vierta al embudo. Con mucho cuidado enjuague los lados del embudo con un volumen pequeño de agua destilada. Utilice la succión mínima necesaria para remover el exceso de agua del disco. Designar el diámetro de 10,2 mm como “__mg equivalente” y utilice en la calificación 473 mL de la muestra mezclada para discos de prueba de la misma manera en que son utilizados los estándares de 28,6 mm de diámetro. A.2.3.3 Estándares en fotografía.- Pueden ser utilizados como una guía en la calificación de las almohadillas de materia extraña, sin embargo es preferible usar discos reales como los preparados según se describió en A.2.3.1 y A.2.3.2. (véanse puntos) En cada caso se deben utilizar los estándares que más se 15


acerquen al disco que está siendo calificado. No utilice fotografías que se han deteriorado, manchado o dañado. A.2.3.4 Verificación de los analizadores de materia extraña. Para verificar los aditamentos para evaluación de materia extraña es necesario llevar a cabo las siguientes actividades: Mida el volumen real de leche entregado para asegurarse que los 473 mL son retirados y pasados a través del disco. Transfiera 10 mL de la solución al 2% de la suspensión de sedimento en sacarosa (véase A.2.2.4), utilizando una pipeta graduada de punta amplia a un bote de leche con 37,8 L de agua destilada limpia filtrada. Después de agitar la mezcla bien, remueva 473 mL con un medida que asegure dicho volumen y fíltrelos a través de un disco de sedimentos con un área diámetro de 28,6 mm (véase A.2.2.2), ensamblado en un embudo apropiado de tamaño correcto (por ejemplo véase A.2.2.3.1). Después de una agitación adecuada del contenido de la cantara de leche, de nuevo remueva una muestra de 473 mL con el aditamento de prueba de sedimentos y páselo a través del disco exactamente de la misma forma en que se evalúa la leche. Repita esta operación con el analizador varias veces para determinar si los discos obtenidos de esta manera proporcionan la misma materia extraña que el disco obtenido a través de la filtración por el embudo (véase A.2.2.3.1). A.2.3.5 Obtención de la muestra A.2.3.5.1 Método de muestra de prueba mezclada. Para cantaras de leche, de 20 a 40 L, y tanques de almacenamiento, utilizar muestras de 473 mL ó 3,78 L. Antes de mezclar la leche, transfiera con un colador pequeño cualquier materia extraña flotante, tal como moscas, pelo, pedazos grandes de restos, etc., al disco instalado (véase A.2.3.6.1), o instale un disco separado adecuadamente identificado. Mezcle adecuadamente la leche en la cantara antes de tomar la muestra para prueba. Evite contaminar la muestra con materia extraña que vaya en los agitadores o por cualquier otro medio. Para contenedores de comercializadores tome 473 mL del contenedor mezclado o el número suficiente de muestras para lograr un volumen de 3,78 L. Lleve a cabo las actividades de acuerdo con lo descrito en A.2.3.6.1. A.2.3.5.2 Método del fondo. Para cántaras de leche de 20 a 40 L tome muestras de 473 mL mediante cualquiera de los probadores de fondo de cantaras de leche sin agitar. Antes de sacar la muestra, remueva con un colador pequeño cualquier materia extraña flotante como en el punto anterior. Tome una muestra a < 6,4 mm del fondo de una cántara de leche sin agitar introduciendo el aditamento para muestrear y, durante el movimiento hacia arriba del embolo, mover la cabeza del instrumento cruzando una vez el diámetro del fondo de la cántara o alrededor de la circunferencia si el bote tiene un centro elevado. Expulse la leche con la pistola en la cántara y después con un golpe corto remueva el exceso de fluido de la almohadilla. Proceder como se describe en A.2.3.6.2. A.2.3.6 Determinación 16


A.2.3.6.1 Muestras mezcladas. Pase las muestras de prueba a través del disco apropiadamente ajustado (véase A.2.2.2) sostenido en la posición correcta el analizador. Caliente 473 mL de leche a una temperatura de 32 a 38 ° C y filtre a través del área restringida del diámetro de 10,2 mm (véase A.2.2.1.1). Si se utiliza una unidad sencilla del analizador del fondo con cabeza especial, caliente una muestra mayor de 473 mL a una temperatura de 32 a 38 ° C y retire 473 mL con el analizador mientras agita o retire 473 mL hacia el analizador y caliente la leche sosteniendo el analizador bajo el chorro de agua caliente antes de descargar la leche en el disco. Caliente 3,78 L de la muestra a una temperatura de 26 a 32 ° C o filtre en frío a través del área del disco con diámetro de 28,6 mm (véase A.2.2.2). Si la leche es filtrada a temperatura de 32 °C, enjuague el disco con 236 mL de agua destilada caliente libre de sedimentos antes de removerlo del probador. Si la leche va a ser recuperada no diluir con agua. (La leche varía en su velocidad de flujo a través de los discos; la leche pasteurizada puede ser más difícil de filtrar que la leche cruda. Otros factores que pueden influir en la velocidad de flujo son la temperatura, contenido de grasa, grado de agrupamiento de los glóbulos de grasa, la etapa de lactación, presencia de leche de vacas con mastitis y cantidad de sedimentos en la muestra). Quitar el disco del analizador y colocarlo en papel de tamaño especial o almacenar en sobres individuales transparentes y encerados. (Si el disco es colocado en papel o en sobre cuando todavía se encuentra húmedo, el secado de la leche puede actuar como adhesivo). Califique por comparación con discos estándar (véase A.2.3.1 y A.2.3.2), e indicar en el reporte si la almohadilla fue calificada húmeda o seca. (El carácter de la materia extraña puede ser determinada a través del examen microscópico). Para prevenir la descomposición durante el almacenamiento, el disco puede ser rociado con una solución de formaldehído o una solución alcohólica de mentol – timol como se describe en A.2.3.1 No utilice pegamento para fijar el disco al papel; si el disco se desprende, humedezca con pocas gotas de agua y vuélvalo a fijar. Protéjalos de la contaminación. A.2.3.6.2 Muestras del fondo. Remueva disco del analizador (véase A.2.3.5.2) y proceda como lo indica el punto anterior, párrafo tercero, empezando “...colocarlo en papel de tamaño especial…” A.2.4 C ÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Califique el disco de la muestra, eliminando la materia burda (moscas completas, pelos, trozos grandes de estiércol o lodo, etc.), contra el disco estándar más cercano y reporte la cantidad de materia extraña de la muestra como “más de ____ mg” o “menos de ___ mg”, incluyendo en el informe, si es el caso, de la presencia de materia burda. 17


A.3. Cont eo d e célul as s om áticas (Métod o d e refer enc ia) A.3.1 OBJETIVO Y ALCANCE Establecer el método de prueba microscópico (método de referencia) para el conteo de células somáticas en leche cruda y leche conservada por medios químicos. El método es aplicable para el conteo de células somáticas en la leche de vaca, siempre que los requisitos antes mencionados se cumplan. Este método es adecuado para la preparación de muestras patrón de prueba y la determinación de los valores del método de referencia requeridos para la calibración del método mecánico y automatizado de enumeración de células somáticas. ADVERTENCIA- El uso de éste método de prueba implica el manejo de materiales peligrosos, operaciones y equipos. El alcance de este procedimiento no aborda todos los problemas asociados con su utilización. Es responsabilidad del usuario del método establecer las medidas de seguridad adecuadas, y determinar la aplicación de restricciones reglamentarias antes de su utilización.

A.3.2 DEFINICIONES Para los fines de este método de prueba aplica la siguiente definición: A.3.2.1 Células somáticas, son células con núcleo (leucocitos y células epiteliales) de acuerdo con el procedimiento descrito en este método de prueba. A.3.3 FUNDAMENTO Se prepara un frotis extendiendo sobre un portaobjetos una porción de la muestra leche por analizar. El frotis se seca y se tiñe. Posteriormente las células somáticas teñidas son contadas usando un microscopio. El número de células somáticas contadas en un área determinada se multiplican por el factor de trabajo, para obtener el número de células somáticas por mililitro.

A.3.4 REACTIVOS Y MATERIALES

18


Los reactivos deben ser grado analítico a menos que se especifique algún otro requerimiento y por agua se entiende agua destilada o desionizada o agua de pureza equivalente. A.3.4.1 Disoluciones colorantes ADVERTENCIA.- El tetracloroetano es venenoso. El bromuro de etidio es mutagénico. Atienda l as medidas de seguridad vigentes para su manejo, uso y disposición. La preparación y aplicación de la disolución colorante debe llevarse a cabo en una campana de extracción de humos, utilizando equipos de protección.

A.3.4.1.1 Disolución colorante modificada Newman-Lampert (Modificación Levowitz - Weber) A.3.4.1.1.1 Componentes Etanol 95% Tetracloroetano Azul de metileno Acido acético, glacial Alternativamente puede usarse xileno en la para el tetracloroetano.

54,0 mL 40,0 mL 0,6 g 6,0 mL misma cantidad de volumen que la descrita

A.3.4.1.1.2 Preparación Mezclar el etanol y el tetracloroetano en un frasco con tapa. Calentar la mezcla en un baño María a 65 °C, agregar el azul de metileno en una campana de extracción de humos y mezclar cuidadosamente. Enfriar la mezcla a 4 °C. Agregar el acido acético glacial y mezclar de nuevo cuidadosamente. Filtrar la disolución, colocarla en un frasco adecuado con tapa de cierre hermético y almacenarla en dichas condiciones. Antes de usar la disolución de tinción Newman Lampert filtrarla de nuevo. A.3.4.1.2 Disolución colorante de bromuro de etidio A.3.4.1.2.1 Disolución patrón colorante. A.3.4.1.2.1.1 Composición Bromuro de etidio Agua desmineralizada

A.3.4.1.2.2 Preparación 19

0,25 g 100


La preparación de la disolución debe realizarse en una campana de extracción de humos. Disolver el bromuro de etidio en agua desmineralizada previamente calentada a 40 °C. Enfriar la disolución a temperatura ambiente. Ajustar a 100 mL con agua desmineralizada. La disolución patrón colorante de bromuro de etidio se puede mantener durante dos meses máximo cuando se almacena en la oscuridad a 2 °C +/- 2 °C. A.3.4.1.3 Disolución amortiguadora. A.3.4.1.3.1 Composición Ftalato ácido de potasio Hidróxido de potasio Agua desmineralizada

0,51 g 0,162 g 100

A.3.4.1.3.2 Preparación Disolver por separado el ftalato ácido de potasio y el hidróxido de potasio en agua desmineralizada. La disolución amortiguadora se conservara durante dos meses máximo cuando se almacena en la oscuridad a 2 °C +/- 2 °C. A.3.4.1.4 Disolución colorante de trabajo de bromuro de etidio. A.3.4.1.4.1 Composición Disolución patrón colorante de bromuro de 2 mL etidio Disolución amortiguadora. 8 mL Triton X10 0,1 mL Agua desmineralizada 90 mL Temperaturas elevadas pueden reducir la capacidad de tinción del bromuro de etidio.

A.3.4.1.4.2 Preparación Sucesivamente añadir en el agua desmineralizada la disolución colorante patrón de bromuro de etidio, la disolución amortiguadora y el Triton X-100 y mezclar cuidadosamente. Preparar la disolución colorante de trabajo de bromuro de etidio inmediatamente antes de su uso.

20


A.3.4.1.5 Disolución amortiguadora de fosfato (PBS) A.3.4.1.5.1 Composición NaCl

8g

KCl Na2HPO 47H2O KH2PO4 Agua desmineralizada

0,2 g 1,15 g 0,2 g 1000

A.3.4.1.5.2 Preparación Disolver las sales en agua desmineralizada. Ajustar a 1000 mL con el agua desmineralizada restante. Ajuste el pH a 7,2 +/- 0,1 NOTA - También es posible utilizar una disolución amortiguadora de fosfato comercialmente disponible con un pH = 7,2

A.3.5 APARATOS Y EQUIPOS Material habitual de laboratorio y, en particular, los siguientes: A.3.5.1 Baño María, capaz de mantener una temperatura de 40 °C + 2 °C, 50 °C + 2 °C y 65 °C + 2 °C. A.3.5.2 Filtro, resistente a los solventes utilizados, con un tamaño de poro de 10 µ a 12 µ. A.3.5.3 Microscopio, con ampliación de 500x a 1000x, pueden ser utilizados objetivos de inmersión en aceite. A.3.5.4 Cuando se utiliza el bromuro de etidio, se requiere de microscopio de fluorescencia. A.3.5.5 Microjeringa, para la distribución de un volumen fijo de 0,01 mL de leche, con un máximo de tolerancia de un 2%. A.3.5.6 Micrómetro calibrado A.3.5.7 Portaobjetos, previamente marcado con un contorno de forma rectangular o circular. Con una superficie de 1 cm 2 +  5 % (95 mm2 ó 105 mm2) o un portaobjeto estándar con una plantilla de dimensiones de 20 mm x 5 mm o con un diámetro de 11,28 mm. A.3.5.7.1 Selección del portaobjeto 21


Trabajar preferentemente con un área fija previamente marcada o una plantilla, a fin de evitar un nuevo cálculo del factor de trabajo en cada conteo. A.3.5.7.2 Formas Para obtener una forma rectangular, el ancho interno superior e inferior y la altura derecha e izquierda, no deben diferir en más de 0,2 mm. Para obtener una forma circular, el diámetro interno vertical y horizontal no debe diferir en más de 0,2 mm A.3.6 MUESTREO Debe enviarse al laboratorio una muestra representativa. La muestra no debe dañarse o alterarse durante el transporte o el almacenamiento. El muestreo no es parte de este procedimiento. La NMX-F-718-COFOCALEC2006 describe los requisitos y recomendaciones para el muestreo (Ver punto 2. Referencias de este Proyecto de Norma Mexicana). A.3.7 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO A.3.7.1 Almacenamiento Conservar las muestras de ensayo almacenándolas a una temperatura de 4 °C + 2 °C. Analizar las muestras de ensayo dentro de 6 horas después del muestreo. En caso de requerirse un almacenamiento prolongado, añadir conservadores químicos como el acido bórico, bronopol o dicromato de potasio. La concentración del acido bórico no excederá 0,6 g por cada 100 ml de muestra para ensayo. La concentración final de bronopol no deberá exceder de 0,05 g por cada 100 ml de prueba muestra. La concentración final de dicromato de potasio no debe de exceder de 0,1 g por cada 100 ml de muestra para ensayos. Conservar la muestra a una temperatura de 4 °C por un tiempo no mayor a 6 días. Por razones ambientales, se recomienda restringir el uso del dicromato de potasio solamente para muestras que requieren una larga vida útil. A.3.7.2 Preparación Calentar la muestra de ensayo en un baño María mantenido a 40 °C y mezclarla cuidadosamente para su homogeneización. Enfriar la muestra a la temperatura a la que la microjeringa ha sido calibrada, por ejemplo, a 20 °C. Diluir las muestras de ensayo con una cuenta estimada de células somáticas por encima de 1 000 000 células/mL, con una solución amortiguadora de fosfato, para 22


obtener una cuenta aproximada de células somáticas de 500 000 células/mL para cada muestra diluida.

En donde: es el factor de dilución para obtener un análisis adecuado de células somáticas en la toma de muestra de alrededor de 500 000 células/mL. V s, es el volumen de la muestra en mL. V b, es el volumen del amortiguador utilizado para diluir la muestra en mL. d,

Registrar el factor de dilución necesario d , el volumen de la muestra V s y el volumen del amortiguador V b utilizado para obtener la dilución requerida. A.3.8 PROCEDIMIENTO Preparar por lo menos dos frotis por cada muestra y considerar el mejor para la enumeración (por ejemplo el frotis no dañado por el proceso de tinción). Sumergir los portaobjetos en etanol (95% v/v). Flamear y dejar enfriar. A.3.8.1 Preparación del frotis y tinción. Para la preparación del frotis y la tinción, siga cualquiera de los procedimientos descritos en A.3.8.1.1 ó en A.3.8.1.2. NOTA - La tinción de la leche de cabra se describe en el Apéndice Informativo B.

A.3.8.1.1 Preparación del frotis y tinción con disolución colorante Newman Lampert. Tomar con la microjeringa 0,01 ml de la muestra (eventualmente diluida). Enjuagar la microjeringa con la muestra de ensayo. Si es necesario, limpiar con cuidado y suavemente la parte exterior de la microjeringa que ha estado en contacto con la muestra de ensayo. Colocar la muestra en un portaobjetos limpio con una superficie de 1 cm 2. Con la punta extender la muestra de manera uniforme sobre toda el área definida, garantizando al mismo tiempo que la zona cercana al perímetro esté cubierta uniformemente. Dejar el frotis a temperatura ambiente hasta que esté completamente seco. Empapar el portaobjetos con el frotis seco con la disolución colorante modificada de Newman-Lampert, por lo menos durante 15 minutos. Secar el frotis a temperatura ambiente.

23


Mojar suavemente el frotis con agua de la llave hasta que todo el colorante excedente se elimine con el lavado. Secar de nuevo y almacenar protegido del polvo. A.3.8.1.2 Tinción con disolución colorante de bromuro de etidio y preparación del frotis. Mezclar 1 mL de la muestra preparada con 1 mL de solución colorante de trabajo de bromuro de etidio en un tubo de ensayo. Mantener la muestra protegida de la luz. Calentar el tubo en un baño de agua a 50 °C por 3 min. Enfriar a temperatura ambiente. Con la microjeringa tomar 0,01 mL de la mezcla. Enjuagar la microjeringa con la mezcla. Si es necesario, limpiar cuidadosa y suavemente la parte exterior de la microjeringa que ha estado en contacto con la mezcla. Colocar la muestra en un portaobjetos con una superficie de 1 cm 2. Con la punta, distribuir la mezcla uniformemente sobre toda el área definida, asegurando al mismo tiempo que la zona cercana al perímetro esté cubierta uniformemente. Mantener el frotis a temperatura ambiente hasta que esté completamente seco. A.3.8.2 Determinación A.3.8.2.1 Optimización de la lectura. Con el microscopio contar los núcleos de las células en el frotis. Elegir la ampliación (de 500x a 1000x) que mejor permita tener un número promedio máximo de 20 células en cada campo. Las células poseen un núcleo teñido. Las células generalmente son de 8 µ o más grandes. No contar las células menores de 4 µ (véase figura 1). Contar fragmentos solo si más del 50% del material nuclear es visible. Contar grupos de células solo si la(s) unidad(es) nuclear(es) está claramente separada. Véase también figuras 2 y 3.

24


Macrófagos 8-30 µm La relación entre citoplasma/núcleo es grande. Fagositosis, antígeno presente, secreción de factores quimiotácticos

PMN 10-14 µm 90% de la mastitis aguda 60% crónica. La relación entre citoplasma/núcleo es pequeña. Fagocitosis. Primera línea de defensa contra la mastitis.

Linfocitos 5-10 µm La relación entre citoplasma/núcleo es pequeña. Núcleos intensamente teñidos. T auxiliares y T superiores de células B

FIGURA 1 - Ejemplos de células

Longitudes de células: L1 = 9,79 μm y L2 = 2,77 μm

FIGURA 2 - Ejemplos de células de leche de vaca a granel (aumento 1 000x)

25

Célula epitelial 10-14 µm Núcleo redondo. Citoplasma débilmente teñido


(Aumento 500x)

(Aumento 1000x)

Longitudes de células: L22 = 9,08 μm; L23 = 8,27 μm; L24 = 4,95 μm; L25 = 7,39 μm; L26 = 6,37 μm and L27 = 3,58 μm. FIGURA 3 - Ejemplos de células de leche de vaca a granel

NOTA - El entrenamiento y la habilidad del analista es el principal factor crítico de éxito para la correcta ejecución del método. La frecuente ejecución del método y la participación en ensayos interlaboratorio son esenciales para garantizar un nivel adecuado de contar.

Generalmente, las células en la leche se distribuyen según una distribución de Poisson (véase Apéndice Informativo C). El número mínimo (N) de células que deben ser contadas en relación con el nivel de recuento de células, para llegar a los coeficientes de variación enumerados, se indican en la tabla 3 (véase tabla). Para una correcta ejecución del método, es esencial que se cuente el número mínimo de células. Los campos y las líneas a contar se elegirán de forma que se obtenga un recuento representativo de todo el frotis.

TABLA 3 - Número mínimo de células

26

PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012 Concentración (x1000 célul as/mL)

CV %

N célul as

< 150

10

100

150 a 250

7

200

250 a 400

6

300

> 400

5

400

A.3.8.2.2 Contar en campos sucesivos. Contar los núcleos en campos sucesivos, en líneas verticales de campos espaciados regularmente (véase figura 4 y tabla 3). a).- Comenzar en la distancia, d L, desde el lado izquierdo. En forma circular, empezar desde una distancia suficiente, d L, desde el lado izquierdo del diámetro horizontal, a fin de poder contar con un mínimo de 5 campos en la parte superior de la línea. Una distancia, d L, de 0,5 mm es adecuada tanto para las formas rectangulares como para las circulares. b).- Colocar el borde superior o inferior de la circunferencia del campo tangencial en el interior de los límites superior o inferior de la plantilla (este último no debe aparecer en el campo). En el caso de una superficie al descubierto cerca del borde de la plantilla, ajustar el campo al borde del frotis. c).- Después de haber contado el primer campo, mover el objetivo a una distancia de espacio fijo, d H, abajo o arriba de la siguiente graduación en la dirección del borde inferior o superior y contar en el nuevo campo. Una distancia, dH, de 1 mm se considera adecuada. d).- A partir del último campo contado, repetir el procedimiento descrito en el inciso c), hasta que el lado opuesto (parte inferior o superior) de la línea se alcance. Elegir entre las siguientes dos opciones. - Opción 1 El último campo no debe ser contado. - Opción 2 Si el borde inferior o superior aparece y ocupa menos de la mitad de la superficie del campo, el conteo se realiza después de subir el objetivo hasta que el borde desaparece por completo del campo y solo cubre el frotis.

27


e).- A continuación, desplazar el objetivo hacia la derecha a una distancia, d w (por ejemplo d w = 1,5 mm o d w = 2 mm dependiendo del número de campos necesarios), y comenzar una nueva línea en la dirección opuesta (parte superior o inferior). f).- Repetir el procedimiento desde el inciso b) al inciso e) hasta que se llegue al lado derecho de la plantilla. g).- En caso que se cuente un número insuficiente de campos (véase tabla 3), se pueden contar campos adicionales. Para ello, enfocar el objetivo del microscopio en otros lugares (por ejemplo, cambiando el punto de partida y/o adecuando paso a paso las distancias por recorrer) a fin de obtener un número adecuado de campos que sean representativos de todo el frotis. h).- Calcular el resultado como se describe en el A.3.9.1 para una forma rectangular, o en A.3.9.3 para una forma circular. NOTA - Para formas rectangulares, son posibles 5 campos separados a 1 mm en líneas verticales y 10 líneas espaciadas a 2 mm, por lo que es posible contar 50 campos. Se obtiene aproximadamente el mismo número de campos para formas circulares, utilizando las mismas distancias. Las distancias de los desplazamientos (espacios) se miden con el vernier desde la misma ubicación de los campos (ajuste en el borde superior o inferior) para que incluya el diámetro del campo.

A.3.8.2.3 Contar líneas en forma rectangular Conteo de núcleos espaciados regularmente en líneas verticales (véase figura 5 y tabla 3). a).- Partir de una distancia, d L, desde el lado izquierdo. Una distancia, d L, de 0,5 mm se considera adecuada. b).- Comenzar a contar desde el borde superior o inferior del área rectangular. Colocar el borde del área en el centro del campo del microscopio. Después de haber contado todas las células, mover el objetivo en dirección opuesta del borde y contar todas la células que aparecen en esta banda hasta que el borde opuesto se alcance. Registrar el número de células contadas. c).- A continuación, desplazar el objetivo hacia la derecha con una distancia, d w, y empezar a contar una nueva banda (por ejemplo, d w = 3 mm a 4 mm, en función del número de bandas necesarias para una cuenta representativa de todo el frotis). Repetir los incisos b) y c) hasta que el lado derecho de la plantilla se alcance. En el caso de que se cuente un número insuficiente de bandas (véase tabla 3), se pueden contar bandas adicionales. En este caso el objetivo del microscopio se centra en otros lugares (por ejemplo cambiando el punto de partida y/o

28


adecuando d w). A fin de obtener las bandas apropiadas que sean representativas de todo el frotis. Calcular el resultado como se describe en A.3.9.2.

Clave I hacia abajo hasta el borde inferior

FIGURA 4 - Líneas verticales en campos espaciados regularmente de forma circular o rectangular

FIGURA 5 - Bandas verticales espaciadas regularmente

29


A.3.9 Cálculo y expresión de resultados A.3.9.1 Contando campos sucesivos en forma rectangular Utilizando las graduaciones y el vernier del microscopio, verificar que los valores objetivo para la longitud Ls, y el ancho, W s, del frotis fue de 20,0 y 5,0 mm. Calcular la concentración total, c , de células utilizando la siguiente ecuación:

O

O con el factor constante de trabajo, f w

En donde: c,

es la concentración total, expresada en un número de células por mililitro.

W s,

es el ancho, en milímetros, del frotis.

Ls,

es la longitud, en milímetros, del frotis.

N t,

es el número total de células contadas.

Df, N f,

30

es el diámetro, en milímetros, del campo del microscopio. es el número de campos de un recuento completo.


V m, es el volumen, en mililitros, de la muestra teñida (véase A.3.8.1.1 ó A.3.8.1.2)

[Si se utilizó la disolución colorante modificada de Newman - Lampert para la tinción (véase A.3.8.1.1), V m = 0,01 mL. Si se utilizó la disolución colorante de bromuro de etidio para la tinción (véase A.3.8.1.2), V m = 0,005 mL]. d,

es el factor de dilución utilizado en A.3.7.2 (si no se requirió de dilución, d = 1; con dilución 1:1, d = 0,5).

A.3.9.2 Contando bandas en forma rectangular Utilizando las graduaciones y el vernier del microscopio, verificar que los valores objetivo para la longitud y el ancho del frotis fue de 20,0 y 5,0 mm. Calcular la concentración total, c , de células utilizando la siguiente ecuación:

O

Con el factor constante de trabajo, f w.

En Donde: N b, es el número de bandas contadas por completo

Los otros símbolos fueron definidos en A.3.9.1 A.3.9.3 Contando campos sucesivos en forma circular Utilizando las graduaciones y el vernier del microscopio verificar que el diámetro del frotis fue de 11,28 mm. Calcular la concentración total, c, de células utilizando la siguiente ecuación: 31


O

Con el factor constante de trabajo, f w.

En donde: Dc , es el diámetro, en milímetros, del frotis.

Los otros símbolos fueron definidos en A.3.9.1 A.3.9.4 Expresión de resultados. Expresar los resultados de la prueba en números enteros de miles (por ejemplo 401 586 células/mL expresarlo como 402 000 células/mL). A.3.10 Precisión Los valores de repetibilidad y reproducibilidad se han derivado de los resultados de un estudio interlaboratorios llevado a cabo de acuerdo con las normas aplicables para determinar la exactitud (veracidad y precisión) de resultados y métodos de medición 1. Los detalles de este estudio interlaboratorios se resumen en el Apéndice Informativo A. 1

ISO 5725-1, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 1: General principles and definitions, e ISO 5725-2, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method. 32


Los valores de esta prueba interlaboratorios pueden no ser aplicables a rangos de concentración y matrices distintas de las indicadas. A.3.10.1 Repetibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de un ensayo único, que se obtiene utilizando el mismo método, la misma muestra, en el mismo laboratorio, por el mismo analista, utilizando el mismo equipo, en un corto intervalo de tiempo, será en no más del 5% de los casos mayor que los valores dados en la tabla 4 (véase tabla). TABLA 4 - Valores de repetibili dad Concentración (x 1000 células/mL )

Sr (x 1000 células/mL )

r (x 1000 células/mL )

245

38

107

455

43

121

679

69

192

791

110

308

3.10.2 Reproducibilidad La diferencia absoluta entre dos resultados de prueba, que se obtiene utilizando el mismo método, misma muestra, en diferente laboratorio, con distinto analista y utilizando equipos diferentes, será en no más del 5% de los casos mayor que los valores dados en la tabla 5 (véase tabla). TABLA 5 - Valores de reprodu cibilidad Concentración (x1000 células/ml )

sR

R

(x 1000 células/ml )

(x 1000 células/ml )

245

41

114

455

62

174

679

78

218

791

110

308

A.3.11 Informe de prueba 33


El informe de ensayo deberá especificar: a) Toda la información necesaria para la identificación de la muestra; b) El método de muestreo utilizado, si se conoce; c) El método de prueba, con referencia a este Proyecto de Norma Mexicana; d) Todos los detalles de análisis no establecidos en este Proyecto de Norma Mexicana, o considerados como opcionales, junto con detalles de cualquier incidente que pueda haber influido en el resultado de la prueba; e) El resultado de la prueba obtenido o, si la repetición se ha comprobado, el resultado final obtenido.

34


A PÉNDICE INFORMATIVO A – Ensayo d e colaboración del c onteo de células somáticas (Método d e referencia) General Un estudio de colaboración internacional para leche de vaca, que involucró dieciocho laboratorios y trece países, se llevó a cabo en octubre de 2005. La prueba incluyó 8 muestras en cuatro niveles de células/mL y se dividió en 16 duplicados ciegos. Los valores medios para cada nivel fueron respectivamente: -

Nivel 1, muestras A y B:

245 000 células/mL;

-

Nivel 2, muestras C y D: 455 000 células/mL;

-

Nivel 3, muestras E y F:

-

Nivel 4, muestras G y H: 791 000 células/mL.

679 000 células/mL;

La prueba fue organizada por A.I.A., Laboratorio Standard Latte, Maccarese-Roma (Italia), quién también realizó el análisis estadístico de los datos de acuerdo con las normas aplicadas1 para dar los datos de precisión que se muestran en la tabla A.1 (véase tabla) TABLA A.1 - Resultados del ensayo interlaboratorios Nivel 1

2

3

4

24

23

24

24

245 38

455 43

679 69

791 110

169

9

10

14

107 41

121 62

192 78

308 110

Coeficiente de variación de la reproducibilidad (%)

17

14

11

14

Límite de reproducibilidad (2,8 SR) (x 1000 células/mL)

114

174

218

308

Número de participantes después de la eliminación de valores atípicos Valor medio (x 1000 células/mL) Desviación estándar de repetibilidad, Sr (x 1000 células/mL) Coeficiente de variación de la repetibilidad (%) Límite de repetibilidad (2,8 Sr ) (x 1000 células/mL) Desviación estándar de reproducibilidad SR (x 1000 células/mL)

A PÉNDICE INFORMATIVO B–

35


Tinció n de leche de cabra para el conteo de células som áticas B.1 Disoluciones colorantes para leche de cabra B.1.1 Fijador de Carnoy B.1.1.1 Componentes Cloroformo Ácido acético glacial Alcohol etílico 100%

60 mL 20 mL 120 mL

B.1.1.2 Preparación Agregar sucesivamente el cloroformo y el ácido acético glacial en el alcohol etílico y mezclar cuidadosamente. B.1.2 Disolución colorante verde de metilo - pironina Y B.1.2.1 Componentes Pironina Y Verde de metilo Agua desmineralizada

1,0 g 0,56 g 196 mL

B.1.2.2 Preparación Sucesivamente adicionar la pironina Y y el verde de metilo en una botella con agua desmineralizada y mezclar con cuidado. Filtrar a través de un filtro adecuado (tamaño de poro de 10 μ a 12 μ) y guardar en un frasco ámbar. Antes de usar filtrar nuevamente a través de un filtro adecuado. B.2 Preparación del frotis Preparar el frotis con el esquema de tinción siguiente: 1. Fijador Carnoy, durante 5 minutos; 2. Etanol al 50%, durante 1 minuto; 3. Etanol al 30%, durante 1 minuto; 4. Agua, durante 1 minuto; 5. Disolución colorante verde de metilo – pironina Y, durante 6 minutos; 6. Lavar brevemente con N-butil alcohol y luego con xileno; 7. Almacenar el frotis protegido del polvo. A PÉNDICE INFORMATIVO C 36


– Distr ib uc ión d e Poi ss on Generalmente, las células en la leche están distribuidas de acuerdo a la distribución de Poisson. La distribución de Poisson presupone que: M = V = s2

donde M es el valor promedio; V es la varianza; s es la desviación estándar. El coeficiente de variación, CV, es entonces: CV =

s M

x 100 %

o CV = 100 % s

o CV = 100 % √M

En donde: M, es el valor promedio el cual, en el caso de contar el número de células somáticas, es el número de partículas (células) contadas.

A PÉNDICE INFORMATIVO D 37


– Eval uac ió n d e la calidad micr ob io lógi ca d e la lech e po r p ru ebas d e reducción de colorantes. Se utilizan con este fin colorantes como el azul de metileno o la resazurina, que se decoloran a una velocidad proporcional a la actividad de las reductasas microbianas. D.1 Reducción de azul de metileno D.1.1 FUNDAMENTO Cuando se añade una pequeña cantidad de azul de metileno a la leche y la mezcla se incuba a 37 ºC, se produce una decoloración debida al metabolismo bacteriano; la velocidad a la que se produce el cambio de color es directamente proporcional al número de gérmenes presentes. NOTA - La mayor parte de los microorganismos cuando se multiplican son capaces de modificar el potencial de oxido-reducción (rH) de la leche lo suficiente como para transformar el azul de metileno en su derivado incoloro, pero lo hacen de forma sensiblemente diferente según sus características. Algunas especies reducen el rH mucho más rápidamente que otras. Por lo tanto, esta prueba de reducción no se puede considerar como una prueba exacta para valorar el número de bacterias realmente presentes pero en la práctica resulta de gran utilidad.

D.1.2 M ATERIALES Y REACTIVOS D.1.2.1 Tubos con tapón de baquelita 16 X 160 estériles D.1.2.2 Pipetas graduadas de 10 mL estériles D.1.2.3 Frascos color ámbar con tapón de rosca de 200 mL estériles D.1.2.4 Solución de azul de metileno, disolver 5 mg de azul de metileno en 100 mL de agua destilada estéril. Esta solución se conserva durante dos semanas protegida de la luz, en un frasco bien cerrado y a una de temperatura de 4 ºC. NOTA - Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras de leche por analizarse deben esterilizarse mediante: 

Horno, durante 2 horas a 170 - 175 ºC ó 1 hora a 180 ºC



Autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ºC + 1 ºC

D.1.3 EQUIPO D.1.3.1Baño con circulación mecánica a 37 ºC

38


D.1.4 PROCEDIMIENTO Colocar de manera aséptica 10 mL de la muestra de leche por analizar en un tubo estéril y añadir de igual forma 1 mL de la solución de azul de metileno. Cerrar el tubo con el tapón e invertir el tubo una o dos veces para mezclar la leche con el colorante. Incubar a 37 ºC en baño de agua, cuidando que el nivel del agua del baño sobrepase el de la mezcla de leche contenida en el tubo. Registrar con precisión la hora de la inmersión. Observar el tubo cada media hora, para controlar la reacción. Los tubos con la mezcla de leche decolorada se sacan del baño, registrando el tiempo en el que se ha producido la decoloración. Los tubos cuyo contenido permanece azul, se invierten una vez cada media hora y se continúa la incubación hasta la desaparición del color azul. Es frecuente que en la zona de contacto de la leche con el aire persista una franja coloreada que no se toma en cuenta para la interpretación de la prueba. D.1.5 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Se pueden calcular aproximadamente los resultados de la prueba del azul de metileno de la siguiente forma: Tiempo de decolor ación

Calidad d e la leche

5 horas

Número estimado de bacterias por mL 100 000 a 200 000

2 a 4 horas

200 000 a 2 millones

Buena a regular

menos de 2 horas

2 a 10 millones

Mala

Buena

D.2 Reducci ón de resazurin a D.2.1 FUNDAMENTO Cuando se añade una pequeña cantidad de resazurina a la leche y la mezcla se incuba a 37 ºC, se produce una decoloración debida al metabolismo bacteriano; la velocidad a la que se produce el cambio de color es directamente proporcional al número de gérmenes presentes. La reducción pasa por una serie de etapas intermedias caracterizadas por diferentes coloraciones: azul, violeta, malva, rosavioleta, malva-rosa y rosa, hasta la transformación de la resazurina en resofurina; en este momento la reacción es irreversible por la acción del oxígeno. La reducción continúa con una última modificación que implica una decoloración completa; la resofurina se transforma en dihidro-.resofurina incolora, que por la acción del oxígeno atmosférico vuelve a tomar color rosa. NOTA - Las células somáticas presentes en la muestra de leche también reducen el colorante; por éste motivo se ha recomendado esta reacción para el diagnóstico rápido de mastitis.

D.2.2 M ATERIALES Y REACTIVOS 39


D.2.2.1 Tubos calibrados de 10 mL con tapón estériles D.2.2.2 Pipetas graduadas de 10 mL estériles D.2.2.3 Frascos color ámbar con tapón de rosca de 200 mL estériles D.2.2.4 Solución estándar de resazurina D.2.2.4.1 Añadir 0,1 g de resazurina en polvo a 200 mL de agua destilada, mezclar y calentar en baño de agua hirviendo durante una media hora; se lleva de nuevo el volumen a 200 mL y se conserva a 4 ºC en frasco de vidrio herméticamente cerrado. En el momento del empleo, preparar la solución de trabajo, diluyendo la cantidad necesaria de solución estándar con agua destilada estéril en proporción 1/10. NOTA - Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras de leche por analizarse deben esterilizarse mediante: 

Horno, durante 2 horas a 170 - 175 ºC ó 1 hora a 180 ºC



Autoclave, durante 15 minutos como mínimo a 121 ºC + 1 º C

D.2.3 EQUIPO D.2.3.1 Baño con circulación mecánica a 37 ºC D.2.3.2 Disco comparador Lovibond D.2.4 PROCEDIMIENTO Colocar de manera aséptica 10 mL de la muestra de leche por analizar en un tubo estéril y añadir de igual forma 1 mL de la solución de resazurina (solución de trabajo). Cerrar el tubo con el tapón e invertir el tubo una o dos veces para mezclar la leche con el colorante. Incubar a 37 ºC en baño de agua, cuidando que el nivel del agua del baño sobrepase el de la mezcla de leche contenida en el tubo. Registrar con precisión la hora de la inmersión e incubar por 1 hora. Sacan los tubos del baño y leer en el comparador Lovibond como se indica a continuación: Se coloca en el compartimiento de la izquierda del comparador un tubo con la leche analizada sin el colorante (prueba en blanco); el que contiene el reactivo y acaba de salir del baño de agua, se coloca a la derecha. Desplazando el disco con los colores patrón, se define el color del tubo de la reacción. D.2.5 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Después de una hora de incubación a 37 ºC:

40


Coloración de la leche Azul (disco 6) Violeta (disco 5) Malva (disco 4) Rosa – Violeta (disco 3) Malva – Rosa (disco 2) Rosa (disco 1) Decoloración total

Calidad de la leche Buena Regular Mala

A PÉNDICE INFORMATIVO E – List ado de Normas Mexi can as q ue d esc riben m étodos de p ru eba r ápidos aplicables a leche crud a de vaca

41

PROY-NMX-F-700-COFOCALEC-2012 110212 (1).pdf

Recommend Documents