Comment procéder pour réaliser une analyse en Bactériologie? Pr DOSSO Mireille 2009
LA MICROBIOLOGIE
Etude des microorganismes : visibles au microscope -6 -6 De la taille du µm (1 0 m)
Généralités: Rappel
LA MICROBIOLOGIE
LES DIFFERENTS MICROORGANISMES
Bactéries
BACTERIOLOGIE
Cha ampignons mpignons
M MY YC OLOGIE VIROLOGIE VIROLOGIE P AR ASI TOLOGIE
Virus Virus Parasites Parasites
LES
MICROORG ANISMES
Bactéries
Champignons
:
Virus : Parasites :
EXEMPLES DE PATHOLOGIE : Infections urinaires, Diarrhées Tuberculose, Diphtérie, Tétanos
:
Mycoses, Teignes Sida,
Hépatite C, Rubéole
T Toxoplasmose,
Paludisme, Ténia (ver solitaire)
LES
MICROORG ANISMES
Les Champignons :
Champignons
filamenteux
(dermatophytes, moisissures) Ex : Penicillium, Aspergillus
Levures Ex : Levure de bière, levure de boulanger ndid a ryptococcus Ex : Ca ndid a , C ryptococcus Taille
: 10 µm
LES MICROORGANISMES
Les Virus : ± ± ± ±
Taille < 0.1 µm ADN ou ARN Pas d¶enzymes : besoin d¶une cellule hôte Reproduction par replication
Les Bactéries : ± ± ± ±
Taille : 1 µm ADN et ARN Enzymes : biosynthèses Reproduction par scissiparité
ETUDE DE LA B A CTERIE CTERIE
SON H A BIT BIT A T
Dans l·environnement :
Saprophyte
Chez l·homme
:
Flore normale = Flore commensale
SON H A BIT BIT A T DANS NOTRE ENVIRONNEMENT :
Dans le sol Dans l·air Dans l·eau Dans les aliments
SON H A BIT BIT A T CHEZ L¶HOMME EN BONNE SANTÉ
OUI Bouche Oreilles Voies respiratoires Intestins Voies génitales Peau .... Flore normale : en contact avec l¶extérieur
NON
Sang
Liquide céphalorachidien (LCR) Urine
Toujours stérile : cavités fermées
S A P A THOGENICITE L¶HOMME MALADE : La bactérie pathogène stricte :
Multiplication et dissémination dans l·organisme Résistance au système immunitaire Sécrétion d·enzymes : lésions des tissus Parfois secrétions de toxines
S A P A THOGENICITE Les bactéries toxigéniques La bactérie ne quitte pas le lieu de l'infection et la toxine seule provoque la maladie en diffusant diff usant dans l'organisme Ex :
- Clostridium tetani (tétanos) - Corynebacterium diphteriae (diphtérie)
Intoxinations alimentaires : - Staphylococcus aureus - Clo Clostr stridiu idium m bot botulin ulinum um Botulisme : ingestion d'aliments dans lesquels C. botulinum a élaboré sa toxine (non détruite dans le tube digestif) paralysies sies par atteinte neuro-musculaire paraly
SA PATHOGENICITE
La bactérie pathogène par opportunisme : Quelle bactérie ? Une bactérie saprophyte saprophyte ou de la flore normale dont la présence ne provoque habituellement pas de maladie Quand ? ± Lors d¶une déficience immunitaire de l'hôte barri ère naturelle ± Lors d¶une rupture de la barrière
Ex : E .
coli , présent dans la flore normale et occasionnellement mis en cause dans des infections urinaires, des septicémies septicémies... ...
S A P A THOGENICITE : EXEMPLES FLORE NORMALE
BACTERIES PATHOGENES
CAVITE OROORO-PHARINGEE -PHARINGEE :
treptocoques, Entérocoques S treptocoques, Neisseri a a C oryneb actéries oryneb a c téries
An a é robies... aérobies...
S treptocoque treptocoque A
Pneumocoque
oryneb a c terium diptheri a e C oryneb acterium ae
ta phylococcus ureus a a ureus S t
aemophilus a e H a e mophilus influenz a e
TUBE DIGESTIF :
actéries Entérob a c téries
Entérocoques
Levures An a é robies... aérobies...
l monell a higell a almonell a , S higell a S a a , Ca mpylob acter E. coli, Yersini a mpylob a c ter
ae Vibrio choler a e
Toxine : C lostridium, lostridium, S . a ureus ureus
SA PATHOGENICITE : EXEMPLES FLORE NORMALE
BACTERIES PATHOGENES PEAU :
Staphylococcus epidermidis ± Staphylococcus ± Corynebactéries Propionibacterium rium acnes... ± Propionibacte
± ± ± ±
Staphylococcus aureus Streptococcus A Pasteurella Bacillus...
CAVITE CA VITE GENITALE GE NITALE : ± ± ± ±
Lactobacillus Mycoplasmes Anaérobies Flore d¶origine cutanée...
± ± ± ± ±
Gonocoque Streptocoque B Gardnerella vaginalis Treponema pallidum Haemophilus, Haemop hilus, Chlamydia...
S A FORME
COQUES
COCCO-B A CI CILLE
B A CI CILLE
SON MODE DE GROUPEMEN T COQUES
diplocoque
amas
B A CI CILLES
diplobacille
coccobacille
chainettes
S A STRUCTURE membrane cytoplasmique
capsule (facultatif)
ribosomes
paroi
flagelle (facultatif)
cytoplasme
pili ou adhésine
ADN
S A MOBILITE 1- Pas de flagelle : 1Bactérie immobile 2- Un flagelle : 2Bactérie mobile Déplacement : 3- Plusieurs flagelles : 3Bactérie mobile Déplacement :
SON ALIMEN T A TION ± Besoins élémentaire élémentairess Pour synthétiser les éléments constitutifs de la bactérie C, N, O, H, sels minéraux, ... ± Besoins en sucre Pour les dépenses dépenses énergétiques énergétiques de la bactérie glucose , lactose ± Besoins en facteurs de croissance Pour la croissance des bactéries difficiles vitamines, acides aminés ...
S A RESPIR A TION
Besoin
d·oxygène
Besoin
de moins d·oxygène Bactérie microaérophile
A Absence
Besoin
d·oxygène
de CO2
Bactérie
aérobie
Bactérie
anaérobie
Bactérie
capnophile
S A MUL TIPLIC A TION Division toutes les 20 mn
S A MUL TIPLIC A TION La vitesse de multiplication dépend de la température : Vitesse
Température 4°C
37°C
65°C
BOR A TOIRE LE LA BOR
DE B A CTERIO CTERIOLOGIE MEDIC ALE
SON ROLE
Trouver
le bon traitement pour le patient
?
COMMEN T ?
Isoler la bactérie responsable de l'infection Identifier cette bactérie Tester sa résistance envers différents antibiotiques
LES
ET A PES PES DU DI A GNOSTIC B A CTERIO CTERIOLOGIQUE Prélèvement Examen microscopique Culture Identification Antibiogramme A
LE
PRELEVEMEN T
LE
PRELEVEMEN T
PRELEVEMENT
MODE DE PRELEVEMENT
PATHOLOGIES
Urine
Infections urinaires
Selles
Infections intestinales, Intoxications alimentaires
Prélèvement génital
Ecou Ec ouvi vill llon on
Suppuration
Ecouvillon ou seringue
Vagini Vagi nite te,, ce cerv rvic icit ite, e, prostatite, uréthrite, MST... Abcès, Liquide péritonéal , plaie superficielle
LE PRELEVEMENT PRELEVEMENT
MODE DE PRELEVEMENT
Prélèvement de gorge
Eco couv uvil illo lon n
Infec Infe cti tion ons s OR ORL, L, angines..
Expectorations
Crachat ou aspiration bronchique
Infections pulmonaires, pneumonies ...
Sang
Pris Pr ise e de sa sang ng
Sept Se ptic icém émie ie
LCR
Ponction lombaire
Méningite
PATHOLOGIES
LCR = Liquide Céphalo-rachidien
LE
PRELEVEMEN T
Prélèvements pluri-microbiens :
Flore normale + Agent pathogène
Prélèvements : cutanés
digestifs vaginaux, urétraux des voies respiratoires ... On observe plusieurs bactéries
Prélèvements mono-microbiens : Prélèvements :
LCR, sang, urine
On observe une seule bactérie
Agent pathogène seul
LE
PRELEVEMEN T
Conditions
de prélèvement
Matériel de prélèvement stérile. Désinfecter autour de la zone de prélèvement avant de prélever
(ex : toilette locale lors du recueil d'urine)
LE TRANSPORT DU PRELEVEMENT Ensemencer im Ensemencer immé immédiatement médi diat atem emen entt le prélèvement ou Utiliser un milieu de transport
POURQUOI ? Ce sont sont des organimes vivants vivants ! il faut : 1- les gard garder er viva vivants nts 2- évite éviterr leur leur multipl multiplication ication
QUAND ? labo éloigné du site de prélèvement : prélèvement à domicile, au lit du malade .
LE
TR ANSPORT DU PRELEVEMEN T
Si le prélèvement doit attendre avant inoculation sur milieu de culture, Conditions de conservation : 4°C 4° °C Urine, selles
37°°C 37 °C et/ou Milieu de transport
Prélèvements Prélèv ements génitaux, LCR, sang, pus
? Pas de multiplication bactérienne souhaitée
Possibilité de germes fragiles
Possibilité de germes anaérobies
Le milieu de transport a l¶ava l¶ avantage ntage d¶éviter la dessication
L·EX A ME MEN
MICROSCOPIQUE
Procédures opératoires à utiliser au Laboratoire de microscopie.
Procédures opératoires identifiables identifiables dans un Laboratoire de microscopie et réception des échantillons - Tri et enregistrement des échantillons - Traitement des échantillons - Stockage des échantillons et conservation des frottis.
- Accueil
Phase prépré-analytique -analytique:
A A
ccueil et réception des échantillons ccueil
réception tous les jours ouvrables - noter date et heure d·arrivée - vérifier la fic he de demande d·analyse - vérifier la concordance: nom / éc hantillon - procéder à l·enregistrement des échantillons
-
Poste de Tri des échantillons
la concordance: nom / éc hantillon - vérifier la quantité et la qualité - rétention ou rejet de l·échantillon - si rejet: rédaction de la fiche de non conformité - remise d·un exemplaire au demandeur avant son départ
- vérifier
Enregistrement des échantillons
attribuer un numéro de série à c haque échantillon - procéder à l·enregistrement:
-
-
* d·abord physique * puis magnétique (si possible)
indiquer la conformité ou la non-conformité
ttention: Ne A A ttention:
pas jeter systématiquement les échantillonss difficiles à obtenir!!! échantillon
Phase analytique:
Traitement des échantillons
ranger les échantillons dans l·ordre croissant - réalisation des frottis - fixer les frottis - colorer les frottis - procéder à la lecture des lames - rendre les résultats
-
Phase postpost-analytique -analytique Stockage des échantillons et conservation des lames
stockage jusqu·au rendu des résultats - conservation
-
* à +4° +4°C ou à température ambiante ² 80°C (biopsies) * à ²8 * les frottis positif * 1/10 frottis négatif
MEN L·EX A ME Première étape
MICROSCOPIQUE : 1 - L' L'ex L'examen exam amen en direct direc dir ectt (ou état frais)
1 goutte entre lame et lamelle : Obj. x 40, à sec.
INTERET :
Présence et abondance des bactéries Morphologie et mode de groupement Mobilité
Cytologie
: observation des cellules
ex : Leucocytes (témoins de l·infection)
L¶EXAMEN MICROSCOPIQUE : 2-L LE E GRAM GRAM GR Coloration la plus utilisée en bactériologie Permet de faire une classification des bactéries
Gram +
Violet
Gram -
Rose
L¶EXAMEN MICROSCOPIQUE : Coloration de Gram : Principe Repose sur la différence différence de perméabilité perméabilité de la paroi bactérienne bactérienne
1 - Vio Violet let de Gentiane Gentiane Gentian e ou Crystal Crystal Cryst al - V Violet iole io lett traversent traver sent la paroi et colorent toute la bactérie
2 - Solut Solution ion d'iode d'iode ou ou Lugol Lugol favorise la fixation du colorant
3 - Déco Décoloratio Décoloration loration n à l'Alcool l'Alcool - A Acétone céto cé tone ne Les bactéries dites Gram (-) se décolorent Les bactéries dites Gram (+) restent violettes
4 - La fuchsine fuchsine fuchsin e ou la safranine safranine safrani ne Coloration des bactéries Gram (-) en rose
lecture objectif x 100 à immersion (huile)
L¶ EXAMEN MICROS MICROSCOPIQU COPIQUE E: 3 - Au Autres tres Color Coloratio Colorations ations ns Coloration au bleu de méthylène pour visualiser les bactéries intra-leucocytaires i ntra-leucocytaires ex : gonocoques Coloration de Giemsa pour les parasites sanguins et intra-cellulaires Coloration de Ziehl - N Neelsen eels ee lse en pour les Mycobactéries Acridine orange Fluorescence pour les prélèvements à faible concentration bactérienne
LA CUL TURE
LA CUL TURE
Pour obtenir une croissance bactérienne, il faut : Répondre aux exigences de la bactérie :
Milieu nutritif A Atmosphère adaptée T Température adaptée
LA CUL TURE
Choisir
le bon milieu de culture :
en fonction de la bactérie recherchée en fonction du prélèvement
? Milieu de base ?
Milieu riche ?
Milieu chromogène ?
Milieu sélectif ?
LA
Les
CUL TURE
différents types de milieux de culture
milieu de base : éléments nutritifs minimum
milieu enrichi : milieu de base + sang, facteurs de croissance...
milieu sélectif : addition d'antibiotiques ou autres milieu chromogène : addition de substrats chromogènes qui donnent des colonies colorées
Les milieux peuvent être à la fois sélectifs et enrichis, ou
sélectifs et chromogènes ...
LA CUL TURE
Urine : CPS ID 2
Selles
Gélose sang
: Selenite
: Exemples
Prélèvement génital :
Hektoen
Chocolat
BCP
Sang ANC
Yersinia CIN
Candida ID
Campylosel
Mac Conkey
LA CULTURE
Choisir
la bonne température :
± Bactéries : 37°C ± Champignons : 30°C
Etuve ? 30° C
37° C
LA CULTURE
Les differents types respiratoires 1
2
3
4
LA CULTURE 1 - Bact Bactérie Bactéries éries s aérobies aérobiess strictes aérobie strictess stricte Ne peuvent vivre qu'en présence d'oxygène d'oxygène tirent leur énergie en utilisant l'oxygène de l'air : C'est la respiration (métabolisme oxydatif) e x : Pseudomonas, Mycobactéries
2-A Aéroéro-anaérobies -anaérobies facultatives Se développent avec ou sans air, mais la majorité de l'énergie produite provient de la fermentation e x : E n ntérobactéries térobactéries
LA CULTURE 3-A Anaérobies naérobies naér obies stric strictes tes Ne se développent qu'en l'absence d'air. d'air. L'oxygène leur est toxique. La totalité de l'énergie est produite par fermentation (métabolisme fermentatif). e x : Fusobacterium, E ubacterium ubacterium
4 - Mi Micro Microaérophiles croaér aéroph ophile iless Préférent une pression partielle d'O2 inférieure à celle de l'air. e x : Campylobacter Campylobacter,, Mycoplasmes
5 - Bac Bactér Bactéries téries ies capnop cap capnophiles nophil hiles es Certains germes préfèrent une atmosphère enrichie en CO2,elle est indispensable à d'autres. e x : Neisseria gonorrhoeae
LA CULTURE Choisir
la bonne atmosphère :
± Bactérie aérobie ± Bactérie aéro-anaérobie ± Bactérie µ-aérophile
Pas de générateur
Générateur microaer
± Bactérie anaérobie
Générateur anaer
± Bactérie capnophile
Générateur CO2
Jarre
LA CULTURE
Croissance en milieu solide : Sur boite de Pétri Une bactérie déposée à la surface d'une gélose nutritive, se multiplie et forme 1 amas visible à l'oeil nu : la colonie = 1 million de bactéries = 20 générations
POUR L¶ISOLEMENT
LA CUL TURE
Croissance en milieu liquide : En bouillon Une bactérie introduit dans un bouillon b ouillon nutritif se multiplie, et crée un trouble visible à l'oeil nu. n u. ne culture en bouillon ne permet pa s de différencier une pousse U ne polymicrobienne d'une pousse monomicrobienne.
POUR L¶ENRICHISSEMENT
Ex : bouillon Cur-cervelle,T Cur-cervelle,Trypcase-soja rypcase-soja ...
LA CUL TURE
Courbe de croissance bactérienne
Quantité de bactéries
3 2
4
1 Temps 24H
48H
LA CUL TURE
Courbe
de croissance bactérienne
1 - Phase de latence Métabolisme réduit : adaptation de la population bactérienne aux nouvelles conditions condition s de culture. 2-
Phase de croissance exponentielle Multiplication bactérienne très active.
3 - Phase de ralentissement et phase stationnaire Epuisement des éléments nutritifs, accumulation de produits toxiques dans le milieu. 4 - Phase de déclin Mortalité par autolyse des bactéries
TION L·IDEN TIFIC A
L·
IDEN TIFIC A TION B A CTERIE CTERIENNE
La condition : Obtenir une culture pure (si prélèvement polymicrob polymicrobien) ien)
Première étape : L'ISOLEMEN T Etalement du prélèvement sur une gélose nutritive
1 bactérie
1 colonie
L·
IDEN TIFIC A TION B A CTERIE CTERIENNE
L'isolement 1 2
3 4
L¶ IDENTIFICATION BACTERIENNE L'isolement 1 2
3 4
L·
IDEN TIFIC A TION B A CTERIE CTERIENNE
Deuxième étape : L'IDEN TIFIC A TION
Les bactéries sont classées par : Famille Genre Espèce icrococc a ce a e M M icrococc exemple : a ce ae S t t a a phylococcus Enterob nterob a cteri a ce a e exemple : E a cteri a ce a e Escherichi E scherichi a coli oli a c
ureus a ureus
S. aureus
E .
coli
L·
IDEN TIFIC A TION B A CTERIE CTERIENNE
L·examen microscopique : Coques ou bacilles Mode de groupement Gram + ou Gram -
Observation des colonies sur sur boîtes de Pétri : aille, couleur, aspect, odeur (!) Présence d'une hémolyse sur milieu au sang S treptocoques... treptocoques... ) ( S T
L·
IDEN TIFIC A TION B A CTERIE CTERIENNE L¶HEMOLYSE
Hémolyse E : hémolyse partielle (halo verdâtre sous la colonie) Ex : Pneumocoque
Hémolyse F : hémolyse totale (halo clair sous la colonie) Ex : Streptocoque groupe A, B ...
Hémolyse H : pas d'hémolyse Ex : E nterococcus nterococcus faecalis, faecium
L·
IDEN TIFIC A TION B A CTERIE CTERIENNE
T Tests
d'orientation :
recherche des enzymes "respir a t oires" atoires" Catalase
: Dégradation Dégradation de l·eau l·eau oxygénée oxygénée 2
H2O2
2
H2O + O2
c a at a a t a l l a se s e
Oxy Oxydase xyda dasse : TMPD
incolore
TMPD
oxyd a s e ase
oxydé
rose carmin
( TMPD = N Tetra methyl - para - phénylène - diamine)
L·
IDEN TIFIC A TION B A CTERIE CTERIENNE
Les résultats des tests d'orientation : - Morphologie : Gram Catalase, oxydase permettent de définir la famille ou le genre, et donc de choisir les tests ou galeries d'identification
Exemples : Cocci, Gram +, Catalase + Cocci, Gram +, Catalase
Bacilles,
Gram -, Oxydase -
S t t a a phylocoques
treptocoques S treptocoques Entérob a c téries actéries
L·
IDEN TIFIC A TION B A CTERIE CTERIENNE
Etude des caractères biochimiques :
Etude du métabolisme de la bactérie (enzymes...) Glucose fermenté Production d¶acide
Exemple : Glucose
Enzyme
pH
Virage de l¶indicateur coloré
TEST (+)
Pas d¶enzyme
TEST (-)
4
- IIDE DEN TIFIC A TION B A CTERIE CTERIENNE LES TESTS BIOCHIMIQUES
Métabolisme glucidique : oxydation ou fermentation d·un sucre : glucose , lactose, saccharose, arabinose...
Métabolisme protéique Protéines : gélatine, lait, sang ... protéases, uréase, désaminases, décarboxylases
Métabolisme lipidique lipase, lécithinase ...
L¶ IDENTIFICATION BACTERIENNE Applications
Milieux d'identification en tubes
Galeries d'identification 2 6
ex :
Galeries AP API, I, VITEK
ID 32,
2 1
1 6
1 1
6
1
2 7
2 2
1 7
1 2
7
2
2 8
2 3
1 8
1 3
8
3
2 9
2 4
1 9
1 4
9
4
3 0
2 5
2 0
1 5
1 0
5
cartes
L·
IDEN TIFIC A TION B A CTERIE CTERIENNE
Etude des caractères antigéniques Réaction immunologique : antigène - anticorps Anticorps fixés sur des particules de latex Agglutination sur lame en présence de l·antigène correspondant (bactérie...) AGGLUTINATION latex avec anticorps
bactérie
à partir de colonies isolées - ou directement à partir des prélèvements. ( ré a ction immédi a te) vantage van anta tage ge : r a A v a pidité a ction a te) -
L·
IDEN TIFIC A TION B A CTERIE CTERIENNE
Identification sur milieux chromogènes : Permet d·identifier d·identifier la bactérie à la couleur de sa colonie sur la boite Pour les prélèvements fréquents Et pour les bactéries les plus fréquemment f réquemment rencontrées
Urine (E.coli, Proteus, Strepto. D) Ex : CPS ID 2 I ntér nntérêt térêt térêt êt : g a in de temps et d· a rgent a in a rgent
L¶ IDENTIFICATION BACTERIENNE Identification
par biologie moléculaire :
Permet d¶identifier la bactérie par un fragment spécifique de son ADN ± A partir des colonies ± Ou directement à partir du prélèvement
Ex : Gen Probe
Mycobactéries, Mycob actéries, Gonocoque, Chlamydia...
Intérêt : Spécific Intérêt Spé Spécificité, cificité, ité, gain gain de temps temps
MME L· AN TIBIOGR A MME
L¶ ANTI ANTIBIO BIOGRAMM GRAMME E Guérir rapidement BUT : Trouver un traitement efficace pour le malade
L· AN TIBIOGR A MME MME Etudier « in vitro » l'activité des antibiotiques sur la bactérie isolée
A A
réaliser uniquement sur l'agent pathogène (pas sur la flore normale)
Interpréter l'activité de l'antibiotique « in vivo » : Risques potentiels de succès ou d'échec
pour le traitement
L¶ ANTI ANTIBIO BIOGRAMM GRAMME E LES ANTIBIOTIQUES agents antibactériens
1928 : Fleming découvre la Pénicilline
L· AN TIBIOGR A MME MME LES ANTIBIOTIQUES
Origine : - biolo biologique gique : élaborés élaborés par des micro-orga micro-organismes nismes : champignons, bactéries - chimiq chimique ue : produits produits par par synthès synthèse e
Action : variable selon la famille d'antibiotiques - inhib inhibition ition de la synthès synthèse e de la paroi bactérienn bactérienne e - altéra altération tion de la membrane membrane cytoplas cytoplasmique mique - actio action n sur la synt synthèse hèse d'enzym d'enzymes es - inhib inhibition ition de la synthèse synthèse des acides acides nucléiques nucléiques
L¶ ANTI ANTIBIO BIOGRAMM GRAMME E Les résultats sont rendus au médecin en :
S
Sensible
R
Résistant
I
Intermédiaire
L·AN TIBIOGR A MME MME LES RESULTATS
Bactérie
sensible : S
La bactérie ne pousse pas en présence de l·antibiotique Le traitement avec cet antibiotique sera un succès
Bactérie
résistante : R
La bactérie pousse en présence de l·antibiotique
Le traitement avec cet antibiotique sera un échec
Bactérie
intermédiaire : I
Résultat intermédiare
L· AN TIBIOGR A MME MME
Résistance bactérienne
Naturelle :
Résistance toujours retrouvée chez une même bactérie : C·est un comportement normal et connu Ex : Proteus mir a abilis b ilis résistant à la Tétracycline
A A
cquise :
Résistance nouvelle acquise par mutation génétique : C·est un comportement anormal Cette
résistance peut apparaître puis disparaître
A cause des résistances acquises (donc surprises), il faut faire un antibiogramme pour chaque bactérie identifiée identifi ée
L· AN TIBIOGR A MME MME
Etude de la CMI : CONCEN TR ATION
MINIM ALE INHIBI TRICE Plus faible concentration d'antibiotique capable d'inhiber toute croissance visible de la souche étudiée.
Méthode de dilution en milieu liquide Ex :
CMI = 1µg/ml
Concentration d¶antibiotique (µg/ml) 0
0,5
1
2
4
8
L· AN TIBIOGR A MME MME
LES DIFFERENTES TECHNIQUES
Diffusion en gélose (disques) Galeries ATB Cartes Vitek
L· AN TIBIOGR A MME MME
Méthode de diffusion en gélose Utilisation d'un disque de papier filtre sur lequel un antibiotique a été incorporé et séché.
inoculation de toute la surface de la gélose avec la suspension bactérienne. les disques sont placés sur la surface de la boîte. les antibiotiques vont alors diffuser dans la gélose.
A Après 20 heures
d'incubation, une zone d'inhibition apparaît autour du disque. La taille de la zone est proportionnelle à la valeur de la CMI.
L· AN TIBIOGR A MME MME
B
A
C
G
Mesure du diamètre d¶inhibition pour chaque antibiotique
Ce diamètre correspond à la CMI
Ce diamètre est reporté en S, R, I en fonction des diamètres officiels donnés par les comités d¶experts
H
D
F E
L¶ ANTI ANTIBIO BIOGRAMM GRAMME E Pour être fiable la méthode doit être standardisée STANDARDISATION : - de l'inoculum l'inocu l'ino culu lum m : quantité de bactéries - de la gélose gélose MuellerMueller Muel ler -Hinton -Hinton : composition du milieu - de l'épaisseur l'épaisseur l'épaiss eur de de la gélose gélose : diffusion de l'antibiotique - de la charge charge d¶antibiotique d¶antibiotique d¶antibio tique du du disque
L· AN TIBIOGR A MME MME
Galeries ATB : On teste chaque antibiotique ( A,B,C,D...) à 2 concentrations différentes (c et C ) = Pas de croissance bactérienne = Croissance bactérienne
c 0
C Témoin de croissanc croissance e
A
S
B
R
C
I
D
S
L¶ ANTI ANTIBIO BIOGRAMM GRAMME E Les concentrations critiques Pour chaque antibiotique, les différents comités de l'antibiogramme fixent un intervalle critique permettant de savoir si l'antibiotique sera efficace in vivo (aux doses thérapeutiques) C : concentration critique supérieure c : concentration critique inférieure Concentrations déterminées en fonction de la - fixa fixation tion sur sur les proté protéines ines,, pharmacocinétique : - péné pénétrati tration on dans cert certains ains sites sites,, - abs absorptio orption, n, métabo métabolisme lisme et et exc excrétion rétion..
L¶ ANTI ANTIBIO BIOGRAMM GRAMME E
Souche sensible : CMI < c L'antibiotique testé est actif sur la souche bactérienne.
Souche intermédiaire : c < CMI < C Ne répondra pas à un traitement à doses usuelles, mais peut-être à un traitement par voie générale à haute dose ou par voie locale. C'est l'intervalle de risque.
Souche résistante : CMI > C La souche résiste aux plus fortes concentrations. L'antibiotique ne sera pas actif in viv vivo. o.
L¶ ANTI ANTIBIO BIOGRAMM GRAMME E
Méthodes automatisées : Etude de la croissance bactérienne dans un milieu liquide ou semi-liquide en présence d'une ou plusieurs concentrations d'antibiotiques -A ATB TB Express Ex Expression pression ion - mi mini ni API API
2 6
2 7
2 1
1 6
1 1
6
1
2 2
1 7
1 2
7
2
2 8
2 3
1 8
1 3
8
3
2 9
2 4
1 9
1 4
9
4
3 0
2 5
2 0
1 5
1 0
5
-V VITEK ITE IT EK
EN RESUME 1- PRELEVEMEN T 2-
EX A ME MEN MICROSCOPIQUE
Etat frais Gram 3 - CUL TURE 4 - TESTS D'ORIEN TATION Catalase Oxydase 5 - IDEN TIFIC A TION Manuelle : Galerie API Semi-automate : ATB Expression - mini API Automate complet : VI TEK A MME 6 - AN TIBIOGR A MME Diffusion en milieu gélosé (disques) Milieu semi-gélosé (galeries ATB ) Milieu liquide (cartes VI TEK)
