Preparing a Smear and Simple Stain

ABSTRACT PREPARING A SMEAR AND SIMPLE STAIN Materials: TSB of Escherichia coli TSA slant of Staphylococcus epidermidis Stain rack Bibulous paper Reverse osmosis water (lab quality) wash bottle [ marked H2O] Lens paper Microscope slides Inoculating loop Inoculating needle Bunsen burner Striker (to light Bunsen burner) Grease pencil Methylene blue stain Clothes pin Immersion oil OBJECTIVE  

Prepare and stain smear bacterial Evaluate the morphology

INTRODUCTION The smear and stain bacterial permit better observation of the morphology morphology cell Use reactive as Alanine derivative coal tar derivate of benzene. The dye adheres to the bacteria and m orphology (shape, arrangement, structure, size) can be more readily seen.

MORPHOLOGY OF BACTERIA ZISE

Difference of Cell Structure Cell and Sizes

FORM rods (bacilli) cocci (sphere)

DENOMINATE

LOCATION

Coccobacilli (Short bacilli)

Physical location of a cell within the same species

Pleomorphic

Example Diplococci Diplobacillus Tetras

(Change shape

The Chemistry of Staining

Staining is based on the principle of opposing charges Most bacteria when placed in an aqueous environment with pH 7 has negative electrical charge, these cells will attract positively charged molecules The dye used in microbiology is a salt containing two ions  

Cation (positive charge) Anion (negative charge)

The cation is chromophore, basic dyes such as  Metil Methylene blue  Violet crystal  safranine

Preparing Stains 

new slide sheet should be used.



spread a thin film of bacteria on the slide.



The smear must be thin.



To dry the smear.



After drying, slide the slide by bunsen burner several times To fix the organisms.



Avoid overheating the smear because it is distorted and therefore indistinguishable.



a good bacterial staining should be a little hard to see with the naked eye



A finished smear will last for months.

Prep 1 - Preparing Smears from Broth Cultures 1. Prepare slide sheet. 2. Make a circle on the slide with wax pencil. 3. Put the slide on the bac k (in order to prevent the wax from reaching the smear) 4. Obtain a tube that has TSB, which contains E. coli 5. Resuspend, by rotating the TSB tube to remove any inoculate. 6. Using aseptic techniques, the transfer with the sewing handle of the tube to the marked circle on the slide. 7. Flame the sowing handle after the transfer.

8. Allow the smear to dry. 9. After drying, slide the slide on t op of the flame of the bunsen burner (several times) 10. Use a clamp to hold the slide (to avoid burns on the fingers)

Prep 2 - Preparing Smears from Solid Media 1. draw 3 circles sizes of a coin on the slide 2. Then turn to keep smear wax 3. obtaining an inclined TSA inoculated with S.epidermidis 4. place a deplete of water in each of the circles 5. carefully, obtain small amount of bacteria and mix with the water of the 1st circle 6. Flame the seedling needle 7. Of the 1st circle to transfer microorganisms with the sowing handle to the 2nd circle 8. Repeat the 2nd step of the transfer to the 3rd circle 9. Flame the sowing handle 10. Allow the slide to dry 11. Then, fix the color of the microorganisms

Procedure 1 - Simple Staining Work area must be clear 1. Place the slides in the coloring stand in the sink 2. Cover the slide with methylene blue for 1 minute 3. After 1 minute grasp and tilt the slide to remove excess color 4. Language with Distilled Water 5. Remove all water (shake) 6. Dry on paper "do not rub" 7. Examine the smears stained under the microscope with immersion oil 8. Draw what is seen in the field

RESUMEN PREPARACION DE FORTIS Y TINCION SIMPLE

OBJETIVOS  

Preparar y teñir frotis bacteriano Evaluar la morfologia

1. INTRODUCCION Frotis bacteriano

teñir

la mejor observación

de células Reactivo alanina derivado Alquitrán de hulla

benceno

MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS

TAMAÑO

FORMAS

DENOMINACION

UBICACION

Diferencia de tamaños de célula,

Varrillas

cocobacilos (bacilos cortos)

Ubicación fisca de una celula denro de la

(bacilos)

estructura celular

misma especie cocos (esferas)

pleomorficos (cambian de forma)

Ejemplo Diplococos Diplobacilos tetrados

LA QUIMICA DE LA TINCION La tinción se basa en el principio de las cargas opuestas La mayoría de las bacterias cuando se coloca en un ambiente acuoso con pH 7 tiene la carga eléctrica negativo, estas células atraerán moléculas con carga positiva El colorante que se usa en mi crobiología es una sal que contiene dos iones  

Catión (carga positiva) Anión (carga negativa)

El catión es el cromoforo, tintes básicos tales como el 

Azul de metileno



cristal violeta safranina



PREPARACION DE TINCION        

se debe utilizar lamina portaobjeto nuevo extender una película delgada de bacterias en el portaobjeto el frotis debe ser delgada dejar secar el frotis después del secado, pasar el portaobjetos por mechero bunsen varias v eces para fijar los

Commented [R1]:

organismos

Commented [C2R1]:

evitar sobrecalentar el frotis ya que se distorsiona por consiguiente ser indistinguible una buena tinción bacteriana deber ser un poco difícil de ver a simple vista Un frotis teñido terminado tendrá una duración de meses.

Commented [C3R1]:

PREPARACION DE FROTIS DE CULTIVO DE CALDO 1.

Prepara la lamia portaobjeto

2. 3.

Hacer un circulo en el portaobjeto con l ápiz de cera Poner el portaobjeto al reverso(con el fin de evitar que la cera se meta al frotis)

4. 5. 6.

Obtener un tubo que tenga TSB, que contenga E.coli  Resuspender, haciendo girar el tubo TSB para retirar cualquier inoculo Usando técnicas asépticas, la transferencia con la asa de siembra del tubo al círculo marcado en el portaobjeto

7. 8.

Flamear el asa de siembra después de la transferencia Dejar secar el frotis

9.

Luego del secado, pasar el portaobjeto de la parte superior de la llama del

mechero bunsen (varias veces) 10. Utilizar una pinza para sostener el portaobjetos(para evitar quemaduras n los dedos) PREPARA FROTIS DE MEDIO SOLIDO 1. 2.

dibujar 3 círculos tamaños de una moneda en el portaobjeto luego girar para mantener la cera del frotis

3. 4. 5.

obtener un TSA inclinado inoculado con S.epidermidis colocar un agota de agua en cada uno de los círculos cuidadosamente, obtener pequeña cantidad de bacteria y mezclar con el agua del 1er circulo

6. 7. 8.

flamear la aguja de siembra del 1er circulo trasladar microorganismos con la asa de siembra al 2do circulo Repetir los paso del 2do circulo t ransferir al 3er circulo

9. Flamear el asa de siembra 10. Dejar secar el portaobjeto 11. Luego, fijar el color de los microorganismos

TINCION SIMPLE EL área de trabajo debe estar despejado 1. Colocar los portaobjetos en el soportador de coloración en el fregadero 2. Cubra el portaobjeto con azul de metileno durante 1 minuto 3. Luego de 1 minuto coger con pinza e inclinar el portaobjeto, para retira el exceso de color 4. Enjuague con agua destilada 5. Quitar todo el agua(sacuda) 6. Secar en papel y “no frotar” 7. Examinar el frotis teñidos en el microscopio con aceite de inmersión 8. Dibujar lo que se ve el en campo