Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PRACTINA NO________ DETERMINACION DE FOSFATASA ALCALINA (ALP) INTRODUCCION La fo sfatasa alcalina es una enzima ampliamente distribuida en el organismo. Hidroliz a los monoésteres del ácido ortofosfórico en medio alcalino. En el adulto proviene en parte del higado (termoestable) y en parte de hueso, sistema reticuloendotelial y vascular (termolabil) dando lugar a distintas izoenzimas. La actividad serica de ALP ósea, en condiciones normales alcanza su mayor actividad en los niños en edad de crecimiento, llegando a triplicar los niveles del adulto, debido a que esta izoenzima se localiza en los osteoblastos. También es fisiológico el aumento que se produce al final de primer trimestre de embarazo, a expensad de la izoenzima pla centaria que en este periodo alcanza niveles máximos. Entre las patologías que afect a la actividad sérica de ALP se pueden citar: carcinomas metastáticos en higado y hu eso, colestasis biliar, infarto al miocardio, pulmonar o renal. FUNDAMENTO La AL P hidroliza al p-nitrofenilfosfato, incoloro, produciendo fosftato y p-nitrofeni l a pH de 9.8, la velocidad de aparicion del anion p-nitrofenolto a 405nm, es pr oporcional a la actividad enzimatica en la muestra. La dietanolamina regula en p H de reaccion y actua como aceptor del fosftato liberado por la fosfatasa. ALP + p-NFF PO4 + p-Nitrofenol (pH 9.8) Esta prueba se realiza en el contexto de otra s pruebas hepáticas (GOT, GPT, Bilirrubina, GGT) y se utiliza para evaluar problem as hepáticos. Suele asociarse en la elevación de GGT excepto en problemas óseos donde solo se eleva la ALP. REACTIVO Buffer DEA : dietanolamina Sustrato pNFF MUESTRA Suero MATERIAL • Espectrofotómetro y cubetas • Baño maria • Agua destilada • Pipetas • Est r de calibración • Reactivos de ALP
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PARAMETROS Longitud de onda Temperatura de reacción Tiempo Vol final de reacción 405nm 25, 30 o 37ºC 3 minutos 2.52mL PROCEDIMIENTO Colocar en cubeta a temperatura de Reaccion: Sustrato reconstituid o 2.5mL Preincubar unos minutos, después agregar Muestra 20uL • • Leer absorbancia ini cial en espectro a 405nm, disparar cronómetro Registrar absorbancias después de 1,2 y 3 minutos después de la primera lectura. Determinar la diferencia promedio de Ab sorbancia / min (∆A/min), restando cada absorbancia y obteniendo el promedio. • CALCULOS ALP (U/I) = ∆A/min x 6812 RESULTADOS ALP= ______________ (U/I) VALORES DE REFERENCIA Adultos: Niños y adoles centes 25ºC = 40-190 U/I hasta 400 30ºC = 45-213 U/I hasta 450 37ºC = 65-300 U/I hasta 645 CONCLUSIONES
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PRACTICA NO. ____ DETERMINACION DE CREATININA DEPURACION DE CREATININA INTRODUCC ION La determinación de niveles séricos de creatinina, producto de la degradación de l a creatina, se utiliza como índice de funcionalismo renal, dado que su eliminación s e efectúa a través del riñón y casi exclusivamente por filtración. FUNDAMENTO La creatinin a reacciona con el picrato alcalino, según la reacción de Jaffé, para dar un cromógeno r ojizo. La cantidad de cromógeno que se forma bajo condiciones controladas, es dire ctamente proporcional a la concentración de creatinina en la muestra y se mide fot ométricamente a 490-510nm. La reacción de jaffé es una reacción no específica para creatin ina, pero las otras sustancias que reaccionan con el picrato alcalino, lo hacen durante los primeros 30 segundo de iniciada la reacción. MATERIAL REQUERIDO • Espect rofotómetro • Cubetas de lectura • Material volumétrico • Sistema de termostatizacion (2030ºC) • Cronómetro PARAMETROS Longitud de onda Temperatura Ajuste a cero PROCEDIMIENTO Pipetear en cubetas Estandar Muestra espectrofotométricas: Reactivo de Trabajo 2. 0mL 2.0mL Equilibrar a temperatura de trabajo y pipetear Estandar 0.4mL Muestra 0.4mL Mezclar inmediatamente y disparar el cronómetro A los 30 seg exactos de incu bación registrar las lecturas de Abs de S1 y M1. A los 5 minutos exactos de incuba cion registrar las lecturas de Abs de S2 y M2. CALCULOS *SUERO Creatinina (mg/L) = (M2-M1) x f 500nm (490-510) 25ºC agua destilada f= 20mg/L S2-S1 *ORINA DE 24 HORAS Creatinina (g/24h) = (M2 – M1) x f f= 0.020g/L x 50 x V S2-S1
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez Donde 50 es el valor de dilución y V= vol de diuresis en litros en 24h. *DEPURACIO N DE CREATININA ENDOGENA D.C.E. ml/min = RESULTADOS Creatinina en Suero ________ ___________mg/L Creatinina en Orina ___________________g/24h D.C.E. ____________ _______ml/min VALORES DE REFERENCIA Suero 8-14mg/L Orina 8-23 mg/kg / 24h DCE 80 -140 ml/min CONCLUSION creatinina en orina (g/24h) Creatinina en suero (mg/L) x 694
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PRACTINA NO___ CLORO FUNDAMENTO El cloro reacciona con el tiocianato de mercurio para formar un compuesto coloreado. REACTIVO Reactivo: formado por tiocianato d e mercurio, nitrato de hierro y ácido nitrico. Estandar: Cloro MUESTRA Suero Plasm a heparinizado Orina PARAMETROS Longitud de onda Temperatura Cubeta Ajustar a ce ro PROCEDIMIENTO Blanco Reactivo 1mL Agua destilada 10Ul Estandar Muestra Mezcla r, incubar 5 minutos Leer abosrbancias (densidad optica DO) Color final estable 1 hora. CALCULO Muestra DO Estandar DO n= 100mEq/L 100mmol/L 335mg/dL RESULTADO Cloro = ___________mg/dL VALORES DE REFERENCIA Suero o plasma 98-107 mEq/L 98-10 7 mmol/L 348-380 mg/dL CONCLUSION xn Estandar 1mL 10uL 10uL Muestra 1mL 480nm 37ºC 1cm de paso de luz blanco de reactivo orina 110-250 mEq/24h 3900-8870 mg/24h
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PRACTICA NO._____ TRIGLICERIDOS PRINCIPIO DEL METODO Los triglicéridos son grasas que suministran energía a la célula, al igual el colesterol son transportados por LP L en la sangre. Una dieta alta en grasa eleva los triglicéridos, cirrosis, hepatit is, obstrucción biliar, pueden estar relacionadas con esta enfermedad. Los triglicér idos son incubados con LPL, liberan glicerol y ácidos grasos libres, el glicerol e s fosforilado por glicerofosfato deshidrogenada y ATP en presencia de glicerol q uinasa para producir glicerol 3 fosfato y ADP, el D3P es convertido en dihidroxi fosfato y peróxido de Hidrógeno por GPO. Al final el H2O2 reacciona con 4-AF y p-clo rofeno por la enzima peroxidasa provocando coloración roja. MUESTRA Suero o plasma PROCEDIMIENTO Longitud de onda Temperatura 37ºC o 15 a 20 ºC Ajustar el cero con ag ua destilada. 505nm Blanco Patron Muestra R ml 1mL 1mL 1mL Patrón uL 10uL Muestra uL 10uL Mezclar Incu bar 10 minutos a temperatura ambiente Leer absorbancia del calirador, de la mues tra frente a blanco. Color estable 30 min. CALCULOS ABS muestra ABS Patron x 200 (conc) =__________mg / dL RESULTADO Triglicéridos = ____________mg/dL VALORES DE REFERENCIA Hombres 40 a 160 mg/dL Mujeres 35 a 165 mg /dL CONCLUSION
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PRACTICA NO._____ COLESTEROL Los esteres de colesterol se hidrolizan por la acción de la colesterol ester hidrolasa para liberar colesterol y ácidos grasos. El cole sterol libre exisente junto con el producido por esta reacción se oxida por la acc ión de colesterol oxidasa en 4-colestenona y peróxido de hidrógeno. Este ultimo, en pr esencia de peroxidasa, oxida el sistema cromógeno (4-aminoantipirina/fenol) en un compuesto de color rojo. PRECAUCIONES ¡toxico! El estandar coniene 2-mettoxietanol , evitese la exposición, nocivo por inhalación, ingestión o contacto con la piel. Infl amable. Puede perjudicar la fertilidad, riesgo durante el embarazo de efectos ad versos para el feto. MUESTRAS Suero Plasma heparinizado PROCEDIMIENTO Longitud d e onda Temperatura Cubeta Leer contra blanco de reactivo Reactivo Agua destilada Estandar Muestra Blanco 1mL 10uL 500nm (492-550) 37ºC 1cm de paso de luz Estandar 1ml 10uL Muestra 1mL 10uL Mezclar, y tras una incubación de 5 min, leer la densidad óptica (DO) El color final se mantiene estable durante 1 hora. CALCULOS Muestra DO *n = Estandar DO n= con centración de std, 200mg/dL 2g/L 5.17mmol/DL RESULTADO CHOL= ___________mg/dL VALORES DE REFERENCIA 150-260 mg/dL 1.5 – 2.6 g/L 3.87 – 6.71 mmol/L CONCLUSION
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PRACTINA NO______ BILIRRUBINA Significado Clínico La bilirrubina es un compuesto d e degradación de la Hemoglobina, captada por el hígado para su conjugación y excretada en la bilis. Alteraciones hepatocelulares u obstrucciones biliares pueden provo car su aumento (hiperbilirrubinemia). La determinación de la bilirrubina sérica en n iños recien nacidos es de gran importancia, ya que aumenta con un consecuente ries go de difución al sistema nervioso, esto se debe a que en la eritroblastosis fetal o anemia hemolítica del recien nacido, patología provocada por incompatibilidad mat erno-fetal, se produce una destrucción excesiva de glóbulos rojos. Fundamento del Méto do La bilirrubina reacciona con el ácido sulfanílico diazotado originando un product o color rojovioleta (azobilirrubina), que se mide a 530nm. La bilirrubina direct a reacciona con el diazorreactivo , pero la indirecta requiere de un desarrollad or acuoso. De manera, que para que reaccione la Bilirrubina Total (directa e ind irecta) de la muestra, es necesario agregar benzoato de cafeína al medio de reacción . Reactivos • Desarrollador solución acuosa de Benzoato de cafeina 0.13mol/L • Nitrito de Sodio • Reactivo Sulfanílico • Bilirrubina STD (no provista) • Agua destilada (no pr ovista) Muestra • Suero o Plasma heparinizado. Libre de hemolisis. Estable 48 hora s de 2 a 10ºC. la acción de la luz puede destruir en una hora el 50% de la bilirrubi na, es necesario proteger. Material • Espectrofotómetro • Pipetas y micropipetas • Reloj Condiciones de Reacción Longitud de Onda Temperatura de Reaccion Tiempo de Reacción Vol Muestra Vol final de Reaccion PROCEDIMIENTO Colocar en tubos separados Blan co Muestra 200Ul Agua destilada 2.5mL Desarrolador Reactivo Sulfanílico 200uL Diaz orreactivo 530nm en espectrofotómetro Ambiente 5 min 200uL 2.9mL Directa 200uL 2.5mL 200uL Total 200uL 2.5mL 200uL
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez CALCULOS Bilirrubina Total (mg/L) = Bilirrubina Directa Bilirrubina Indirecta (l ibre) Factor RESLTADOS Bilirrubina Directa Bilirrubina Indirecta Bilirrubina Tot al (T – B) x f (D – B) x f BR Total – Br Directa Calclar con en el Estandar de bilirru bina ____________mg/L ____________mg/L ____________mg/L VALORES NORMALES Adultos Directa hasta 2mg/L Total hasta 10mg/L Recien Nacidos S angre de cordon 24 horas 48 horas 3 a 5 dias CONCLUSION A termino 25mg/L 60mg/L 75mg/L 120mg/L prematuros 80mg/L 120mg/L 230mg/L
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PRACTICA NO.______ ELECTROLITOS EN SUERO CALCIO El calcio tiene numerosas funcio nes dentro del cuerpo, no solo es factor estructural de huesos y dientes sino qu e también se encuentra en la sangre y en la función neuromuscular. INCREMENTOS Hiper calemia se puede desarrollar en pacientes con enfermedad de Pager de hueso e hip erparatiroidismo, el incremento se debe al aumento de la reabsorción en los huesos causada por metastasis o factor humoral producido por celulas tumorales. DECREM ENTO Hipocalemia METODO Arsenazo III El Arsenazo III se combina con los iones de l calcio a pH de 6.75 y forma un cromoforo coloreado cuya absorbancia es directa mente proporcional a la concentración de calcio en la muestra. Arsenazo tiene alta afinidad por los iones de calcio y no muestra interferencia por los otros catio nes que se encuenran en suero, plasma u orina. Reactivo El reactivo esta listo p ara su uso Muestra Suero, plasma heparinizada u orina. Muestra estable 7 dias a temperatura de 2 a 8ºC y seis meses en congelación. PARAMETROS Longitud de Onda Volu men de la muestra Volumen de Reactivo Incubación Concentración STD Blanco 630nm 10/2 0 uL 500-1000uL 1 min a 37ºC 10mg/dL Reactivo STD 1000 20 20 MUESTRA 1000 PROCEDIMIENTO Pipetear dentro de BLANCO tubos marcados Reactivo 1000 Agua destil ada 20 Estándar Muestra Mezclar y leer absorbancia a 630nm CALCULOS Calcio mg/dL = ABS M / ABS STD X (Concentración STD) = RESULTADO Calcio = _______________mg/dL
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez MAGNESIO El magnesio forma coloracion purpura al reaccionar con la calmadita en medio alcalino, proporcional a la concentración de Mg en la muestra. Es el segundo cation mas numeroso en el organismo. Niveles altos de Mg se hallan en uremia, f allo renal o enfermedad de Addison. REACTIVOS Reactivo 1 Reactivo 2 Magnesium ca l amino metil propanol - EGTA Calmagita Patron de Mg MUESTRA Suero o plasma heparonizado libre de hemolisis, estable 7 dias a tempera tura de 2 a 8ºC. tambien puede utilizarse orina. PROCEDIMIENTO Longitud de onda Te mperatura Ajustar Pipetear en cubeta Rt Ml Patron uL Muestra uL CALCULOS ABS M / ABS P X 2 (CONC PAT) = mg / dL de Mg. RESULTADO Magnesio : _______________mg/dL Blanco 1 520 nm 371C o 15-20 con agua destilada Patron 1 10 Muestra 1 10 VALORES NORMALES Suero o plasma Orina 1.5 a 2.5 mg/ dL 24 a 244 mg /dL
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez FOSFORO INTRODUCCION El fósforo es esencial para la formación de tejido oseo y en el metabolismo energético celular. Aprox. El 85% se encuentra en hueso y dientes. Ni veles bajos se deben a hipervitaminosis D, hipertiroidismo, desordenes renales, mala absorción. Niveles altos se atribuyen a la dieta, metástasis de huesos, alcohol ismo, diarreas, alteraciones de hígado. FUNDAMENTO Método para detección de fósforo inor gánico. El Pi reacciona en medio ácido con molibdato amónico formando un complejo fosf omolibdico de color amarillo, de intensidad proporcional a la concentración de Pi presente en la Muestra. REACTIVO R molibdico Phosphorus Cal MUESTRA Suero o plas ma libre de hemolisis Orina PARAMETROS Longitud de onda Cubeta Temperatura Ajust ar a cero 340nm 1cm 37-30-25ºC con agua destilada PROCEDIMIENTO Pipetear en una cubeta Blanco Patrón Reactivo 1Ml 1mL Patrón 10uL Mues tra Mezclar e incubar 5 min Leer abs Patron y Muestra frente a Blanco de Reactiv o. CALCULOS Suero ABS M x 5 (conc. P) = mg/dL ABS P Orina 24h ABS M ABS P x 5 x Vol (dL) orina /24h = mg/24h Muestra 1mL 10uL RESULTADO Fósforo = _____________mg/dL VALORES NORMALES Suero o plasma Orina Niños 4 -7mg/dL Adultos 2.5-5mg/dL 0.4-1.3g/24h
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PRACTICA NO.____ ALBUMINA FUNDAMENTO La albúmina se une al azul de bromocresol a p H ligeramente ácido produciendo coloración amarilla a azul verdoso dependiendo de la concentración de la albúmina en la muestra. La albúmina es una proteína plasmática import ante producida por el hígado, sus niveles se alteran en enfermedades hepáticas, desn utrición, dermatitis. REACTIVO Verde bromocresol pH 4.2 Patrón primario acuoso de al búmina MUESTRA Suero o plasma libre de hemólisis Estable 1 mes a 2-8ºC. PARAMETROS Lon gitud de onda Temperatura Cubeta Ajustar a cero PROCEDIMIENTO Blanco Patrón Muestr a Reactivo 1mL 1mL 1mL Patron 5uL Muestra 5uL Mezclar, incubar 10 minutos a temp eratura ambiente. Leer absorbancia de Patrón y Muestra contra blanco, color establ e 1 hora. CALCULOS ABS M X 5 (conc. Patrón) = g/dL ABS P 630nm 15-25ºC 1cm agua dest ilada RESULTADO Albúmina = _______________g/dL VALORES NORMALES 3.5 a 5 g/dL CONCLUSIONES
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PRACTICA NO.____ PROTEÍNAS TOTALES En medio alcalino las proteínas dan color violeta azulado en presencia de sales de cobre, la intensidad es proporcional a la conc entración de la proteína total en la muestra. Las proteínas se encuentran distribuidas en el organismo actuando estructuralmente y de transporte. Se dividen en dos fr acciones: Albúmina y Globulina Se detección es util para detección de: Hiperproteinemi a Hipoproteinemia. REACTIVO Reactivo de Biuret T protein Cal MUESTRA Suero o pla sma heparinizado. Estable un mes en nevera a 2-8ºC PARAMETROS Longitud de onda Cub eta Temperatura Ajustar a cero PROCEDIMIENTO Reactivo Patron Muestra 25uL Mezcla r, incubar 5 min a 37ºC o 10 minutos a temperatura ambiente. Leer absorbancia de P atrón y Muestra contra blanco, color estable 30 min. CALCULOS Abs M Abs P x 7 (con c. P) = g/dL Blanco 1ml Patrón 1mL 25uL Muestra 1mL 540nm 1cm 37ºC/15-25ºC con agua de stilada RESULTADOS Proteinas Totales = ___________g/dL VALORES NORMALES Adultos : 6.6-8. 3 g/dL Recien Nacidos : 5.2-9.1 g/dL CONCLUSIONES
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PRACTICA NO__ AST ASPARTATO AMINOTRASMINASA INTRODUCCION La AST tiene una alta c oncentración en el músculo cardiaco, las células hepáticas, las células músculo esquelétic en menores grados en otros tejidos. Aunque un nivel elevado se AST en el suero n o es especifico de la enfermedad hepática, se utiliza principalmente para diagnost icar y verificar el curso de esta enfermedad ( junto con otras enzimas como la A LT, ALP y bilirrubina) Tambien se ha usado para monitorear a los pacientes con l os ataque cardiacos, pero es mucho menos especifica que los izo enzimas CPK y DH L para este propósito. MUESTRA Suero sin hemolisis Plasma EDTA Reactivo 1 L- aspar tato LDH Acida sodica Reactivo 2 a-cetogluterato NADH azida sodica PARAMETROS • • • • 340 nm longitud de onda 30-37°C Cubeta de 1 cm paso de luz Blanco agua destilada PROCEDIMIENTO Procedimiento de un reactivo Reactivo de trabajo Muestra 1 ml 100 ul Mezclar uncubar un minuto, medir cambio de densidad óptica durante 3 min. Procedim iento de dos reactivos Reactivo 1 1mL Muestra 100uL Mezclar y esperar 1 minuto R eactivo 2 100uL Mezclar, incubar 1 minuto, y medir cambio de Densidad Optica por 3 minutos Obtener Diferenta promedio de Densidad Optica. CALCULOS 340nm : activ idad U/L = cambio DO/ min x 334mn : actividad U/L = cambio DO/ min x 365mn : act ividad U/L = cambio DO/ min x RESULTADO AST = _______________ U/L VALORES NORMAL ES 30°C hasta 30 U/L 37°C hasta 46 U/L CONCLUSION: Un reactivo 2 reactivos 1.746 1.7 80 3.235 1.942 3.529 1.905
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez ALT ALANINA AMINO TRANSAMINASA INTRODUCCION Este examen se usa para determinar s i un paciente tiene lesión hepática. La ALT es una enzima que involucrada en el meta bolismo del aminoácido alanita y se encuentra en varios tejidos, pero presenta con centraciones mayores en el hígado. Cualquier lesión en el hígado hace que se libere es ta enzima a la sangre. MUESTRA Suero sin hemólisis Plasma EDTA PARAMETROS • 340nm lo ngitud de onda • 30-37°C • Cubeta de 1 cm paso de luz • Blanco agua destilada PROCEDIMIE NTO Procedimiento de un reactivo Reactivo de trabajo Muestra Reactivo 1 L-alanin a LDH Azida sodica Reactivo 2 a-cetogluterato NADH azida sodica 1ml 100ul Mezclar, incubar un minuto, medir cambio de densidad optica durante 3 min. Procedimiento de dos reactivos Reactivo 1 1ml Muestra 100uL Mezclar y esperar 1 minuto Reactivo 2 100uL Mezclar, incubar 1 minuto, y medir cambio de Densidad Op tica por 3 minutos Obtener Diferenta promedio de Densidad Optica. CALCULOS 340nm : actividad U/L = cambio DO/ min x 334nm : actividad U/L = cambio DO/ min x 365nm : actividad U/L = cambio DO/ min x RESULTADOS ALT = ___________ _______UL VALORES NORMALES 30°C hasta 35 UL 37°C hasta 49 UL CONCLUSION un reactivo 1.746 1.780 3.235 2 reactivos 1,905 1,942 3,529
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PRACTICA NO_____ LIPASA FUNDAMENTO La lipasa en una enzima que se usan en el org anismo para disgregar las grasas de los alimentos de manera que se puedan absorb er. La enzima se encuentra en la leche materna y, según estudios bioquimicos, es i déntica a la enzima colesterol esterasa (o lipasa pancreática no especifica) por lo que se supone que le origen que el origen es pancreático y llega a las glándulas mam arias a través de la circulación sanguínea. La lipasa gástrica, producida por las glándula s gástricas, reduce los triglicéridos, u tipo de lípidos presentes en la leche, a ácidos grasos y glicerol. REACTIVOS • • Reactivo de trabajo Patron de lipasa MUESTRA • Suero PROCEDIMIENTO 1. Precalentar reactivo de trabajo a 37°C durante unos minutos 2. Pi petear a una cubeta Reactivo de trabajo Muestra/Patron 750 ul 15 ul 3. Mezclar e insertar en los portacubetas del termostalizado a 37°C. poner el cron ometro en marcha, a los 3-5 minutos añadir: Reactivo C 250uL Mezclar 4. leer y anotar abs orbencias inicial y cada minuto durante 3 minutos 5. Comprobar que las difencias sean sensiblemente iguales, obtener incremento de absorbencia por minuto promed io (∆A/min) CALCULOS (∆A/min)MUESTRA (∆A/min)PATRON X Concentración del patron = U/L RESULTADOS Lipasa = _________________U/L VALORES NORMALES 7-59 U/L
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez AMILASA INTRODUCCION La amilasa es una enzima que tiene la función de dirigir el g licógeno y el almidón para formar azucares simples, se produce principalmente en las glándulas salivares ( glándulas partidas) y en el páncreas. Cuando una de estas glándul as se inflama derrama amilasa a la sangre y aparece elevado su nivel en el análisi s de la amilasa serica. MUESTRA • • • Suero Plasma heparinizado Orina diluida una part e en dos de agua PROCEDIMIENTO Longitud de onda 405 nm Temperatura 30 a 37° C Cubeta 1 cm Blanco Ag ua destilada REACTIVO MUESTRA 30°C 1mL 25uL 37°C 1mL 15uL Mezclar y medir densidad optica por minuto durante 3 minutos Obtener (∆A/min) CALC ULOS Actividad Cambio Densidad Optica / min X 2715 a 30°C Cambio Densidad Optica / min X 4640 a 3 7°C RESULTADOS Amilasa = _______________ U/L VALORES DE REFENCIA En suero: • <67 U/L a 30°C • <86 U/L a 37°C CONCLUSION
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez PRACTICA NO. PRUEBAS SEROLOGICAS PROTEINA C REACTIVA Es una tecnica de aglutinación en porta para la detección cualit ativa y semicuantitativa de PCR en suero humano. Las particulas de latex recubie rtas con anticuerpos anti PCR humana son aglutinadas por molecuas de PCR present es en la muestra del paciente. La proteina C Reactiva es una proteina de fase ag uda presente en sueros de pacientes sanos la cual puede incrementrase en proceso s infecciones bacterianos, virales, inflamación, y neoplasias malignas. El increme nto se produce después de unas horas de desarrollarse inflamación alcanzando niveles de 300mg/L en 12-24h. Reactivos: Latex Control (rojo) Control (azul) Suspensión d e latex cubiertas de IgG de cabra anti PCR humana. Suero humano Suero animal Muestra: Suero fresco estable 7 dias a 2-8ºC o 3 meses a -20. No hemolisadas ni li pémicas. PROCEDIMIENTO Cualitativo. 1. Atemperar muestras y reactivo a temperatura ambiente. 2. en un portaobjetos, depositar 50uL de M, y una gota de los control es positivo y negativo. 3. homogeneizar suavemente el reactivo de PCR latex y de positar una gota (50uL) junto a cada una de las gotas anteriores. 4. mezclar las gotas con un palillo y extender la mezcla por el interior del circulo. Con pali llos distintos. 5. situar el porta sobre el agitador rotatorio a 80-100 rpm y ag itar durante dos minutos sin exceso. Semicuantitativo. 1. realizar diluciones do bles de la muestra en solución salina 9g/L 2. proceder para cada dilución como la pr ueba cualitativa. LECTURA E INTERPRETACION Examinar microscópicamente presencia o ausencia de aglutinación inmediatamente al retirar el agitador. Aglutinación positiv a indica una concentración de PCR igual o mayor a 6mg/L En el semicuantitativo, se define el titulo como la dilución mayor que da resultado positivo. CALCULOS La co ncentración de PCR aproximada en la Muestra se obtiene con la siguiente formula: 6 xTitulo de PCR = mg/L VALORES DE REFERENCIA Hasta 6mg/L RESULTADO Aglutinación: __ ________________ CONCLUSION:
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez FACTORES REUMATOIDES PRINCIPIO DEL METODO FR Latex es una tecnica de aglutinación en porta para deteccion cualitativa y semicuantitativa de los factores reuimatoi des en el suero humano. Las particulas de latex recubiertas con Gammaglobulina h umana son aglutinadas por factores reumatoides presentes en la muestra. Los FR s on un grupo de anticuerpos dirigidos contra la fraccioin Fc de inmunoglobulinas G. Su interés clínico es el diagnóstico de la Artritis Reumatoides, aunque estan prese ntes tambien en Lupus eritematoso y sintrome de Sjorgen. Reactivos Latex Control Rojo Control Azul suspensión de latex cubierto con gammaglobulina humana Suero hu mano Suero animal Muestra: Suero fresco estable 7 dias a 2-8ºC o 3 meses a -20. No hemolisadas ni li pémicas. PROCEDIMIENTO Cualitativo. 1. Atemperar muestras y reactivo a temperatura ambiente. 2. En un portaobjetos, depositar 50uL de M, y una gota de los control es positivo y negativo. En circulos distintos. 3. Homogeneizar el reactivo FR La tex y depositar una gota junto a cada una de las gotas anteriores. 4. Mezclar la s gotas con un palillo y extender la mezcla por el interior del circulo. Con pal illos distintos. 5. Situar el porta sobre el agitador rotatorio a 80-100 rpm y a gitar durante dos minutos sin exceso. Semicuantitativo. 1. realizar diluciones d obles de la muestra en solución salina 9g/L 2. proceder para cada dilución como la p rueba cualitativa. LECTURA E INTERPRETACION Examinar microscópicamente presencia o ausencia de aglutinación inmediatamente al retirar el agitador. Aglutinación positi va indica una concentración de FR Latex igual o mayor a 8UI/mL En el semicuantitat ivo, se define el titulo como la dilución mayor que da resultado positivo. CALCULO S 8 X TITULO DE FR = UI/mL VALORES DE REFERENCIA Hasta 8 UI/ mL RESULTADO Agluti nación: _____________________ CONCLUSIÓN
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez REACCIONES FEBRILES INTRODUCCION Los antígenos febriles se usan para detectar anticuerpos en el suero del paciente contra la Salmonella, Brucella y Rickettisia (reaccion cruzada con Proteus OX-19. Salmonella. La reacción de Widal en un método serológico usado comúnmente en el diagnóstico de las fiebres tifoideas, entérica y ondulante, la reacción mide el título del suero contra una suspensión de microorganismo conocidos. La Salmonella s on bacilos no esporurlados aerobios gramnegativos. Hay tres especies clínicamente importantes de Salmonella: enteritidis, choleraeauis y thyphi. Tres síndromes prin cipales, resultan de la infección por salmonella. 1. gastroenteritis ( la forma más común ). 2. fiebre tifoidea. 3. septicemia. Brucella. En esta prueba se detectan a nticuerpos contra Brucella, casi todas las infecciones humanas por Brucella, se deben a B abortus, B suis o B melitensis. La brucelosis es una enfermedad aguda o crónica que se manifiesta principalmente por escalofríos, fiebre y debilidad, ocas ionalmente episodios febriles ondulatorios que han dado lugar al nombre de “fiebre ondulante” de la enfermedad. Rickettsias. Las especies de Rickettisias que causan tifo tienen componentes antigénos idiotípicos con Proteus ( OX-19, OX-2 OX-K), esta relación se usó en el diagnóstico de tifo. Las especies de Rickettsia son cocobaciolo s pequeños plemórfos que funcionan como parásitos intracelulares. La inmunidad por lo general es de larga duración, con algunas excepciones. El tifus endémico puede causa r recaíadas 10 o 20 años después de la aparente recuperación (enfermedad de Grill Zinsee r). La fiebre de las trincheras se caracteriza por las recaídas. FUNDAMENTO. Estas reacciones se basan en el hecho de que cuando el organismo humano es invadido p or agentes infecciosos, responde produciento anticuerpos aglutinantes contra ell os los cuales se ponen de manifiesto al entrar en contacto el anticuerpo con el anticuerpo específico. El título del anticuerpo depende del tipo y curso de la enfer medad. Para que los resultados tengan un valor diagnóstico el título de ellos debe a umentar MUESTRA Suero libre de hemolisis REACTIVOS Paratifico A Paratifico B Tif ico O Tifico H Proteus OX Brucella PROCEDIMIENTO. Puede efectuarse por medio de dos maneras. Método de aglutinación rápida en placa. 1. Anotar el antígeno correspondien te en la placa de vidrio. 2. Depositar en cada cuadro 0.04ml de suero del pacien te para cada uno de los antígenos que se vayan a utiliza. 3. A cada gota de suero añadir una gota de cada antígeno. 4. Mezclar con un aplicador limpio ( utilizar un a plicador para cada antígeno. 5. Agitar suavemente la placa por rotación (120 r.p.m) durante 2 ó 3 minutos. 6. Observar la aglutinación con ayuda de una lámpara. Cuando ha y reacción positiva se repite la técnica con diluciones las cuales se obtienen con e l uso de las siguientes cantidades del suero en la siguiente forma.
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez Mililitros de suero 0.08 0.04 0.02 0.01 0.005 Dilución 1:20 1:40 1:80 1:160 1:329 INTERPRETACION Reportar el resultado, empleando la recíproca de la dilución más alta q ue presenta aglutinación. Grado de aglutinación. • 100% ++++ Sedimentación de los grumos y el sobrenadante claro. • 75% +++ grumos sedimentados casi totalmente y sobrenad ante claro. • 50% ++ sedimentación marcada y sobrenadante ligeramente claro. • Negativ o. Ninguna evidencia de aglutinación, sobrenadante idéntico al control. RESULTADO Pa ratifico A Paratifico B Tifico O Tifico H Proteus OX Brucilla __________________ __________________ __________________ __________________ __________________ ___ _______________ CONCLUSION
Química Clínica Manual de Prácticas de Laboratorio Eduardo Otoniel Bermúdez Chávez VDRL INTRODUCCION La prueba del VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) cons tituye una técnica serológica con la suficiente sensibilidad y especificidad para co mplementar el diagnóstico de sífilis y analizar la respuesta al tratamiento específico . Su costo y complejidad la hacen ideal para el estudio de esta enfermedad de tr asmisión sexual en grandes masas de población.1-4 El Médico de la Familia es el máximo r esponsable de los programas nacionales para el control de las enfermedades sexua lmente trasmisibles; por tanto, entre sus funciones básicas se encuentran la indic ación y la interpretación a primera instancia de los resultados de ésta.5,6 El VDRL es una técnica de floculación que utiliza el antígeno de cardiolipina para detectar anti cuerpos antitreponémicos inespecíficos producidos por el individuo ante una infección sifilítica. Se practica normalmente en lámina de cristal, en la que se mezcla el sue ro del paciente (previamente calentado para inactivar el complemento), con una s uspensión fresca de antígeno de cardiolipina; esta mezcla se agita de forma rotatori a y al cabo de pocos minutos puede observarse la floculación utilizando un microsc opio de bajo aumento; sus resultados pueden expresarse tanto cualitativa como cu antitativamente. MUESTRA Suero o plasma libre de hemolisis. PROCEDIMIENTO En un porta, depositar una gota (50uL) de suero del paciente, Añadir una gota de reactiv o y mezclar con un palillo de madera extendiendo por todo el circulo Observar el resultado. RESULTADO VDRL ____________________ CONCLUSION
