UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENT EXPERIMENTAL AL “ROMULO GALLEGOS” AREA DE INGENIERIA AGRONOMICA DIRECCION DE ESTUDIOS COMUNES DEPART DEPARTAMENTO DE ASIGNATURAS INSTRUME I NSTRUMENTALES NTALES CATEDRA DE BIOQUIMICA
PRACTICA Nº 1: Identificación de Aminoácidos y Proteínas Introducción: Las proteínas son sustancias químicas orgánicas de alto peso molecular, constituida por muchos aminoácidos, que juegan un papel muy importante en la estructura y dinámica de la materia viva. Solamen Solamente te 20 aminoác aminoácido idoss difere diferentes ntes se encuent encuentran ran forman formando do parte parte de las proteí proteínas nas;; sin embargo, no todas las proteínas contienen los 20 aminoácidos. En esta práctica vamos a realizar reacciones cualitativas de coloración, que nos permitirán detectar, la presencia de grupos químicos en aminoácidos y p roteínas. Fundamento de las Reacciones: 1) Reacció Reacción n de de la la ninh ninhidr idrina ina:: Esta es una reacción general para cualquier aminoácido y es debido a la presencia del grupo amino (NH2), de manera de que todos los alfa aminoácidos y por supuesto las proteínas dan positiva a esta reacci reacción. ón. No obstant obstante, e, cualqui cualquier er sustan sustancia cia protei proteica ca que contenga contenga un grupo grupo alfa-N alfa-NH H2 también de positiva a esta reacción, la reacción se efectúa en tres etapas.
1.1 .- Reducción de la ninhidrina oxidada por la acción del alfa alfa aminoácido
1.2 .- Hidrólisis Hidrólisis del Aminoácido Aminoácido producido producido para formar un alfa cetoácido, el cual se carboxila carboxila bajo las condiciones de la reacción.
1.3 .- Finalmente, el Amoniaco (NH3) reducido reacciona con cantidades equimolares de ninhidrina oxidada y ninhidrina reducida para formar un compuesto de color azul violeta, la intensidad del color es proporcionada a la cantidad de aminoácidos presentes.
La ecuación Global es
Azul Violeta
Esta reacción se desarrolla mejor a pH neutro. Todos los aminoácidos dan color azul violeta, con excepción de prolina e hidroxiprolina que da color amarillo. 2) Reacción de Biuret: Esta reacción es característica para aquellos compuestos que poseen dos o mas enlaces peptídicos. La denominación “Biuret” se debe a que el compuesto orgánico Biuret también da positiva a esta reacción. La reacción de Biuret se basa en las formaciones en medio alcalino, de un complejo de coordinación de color violeta entre el ión cúprico (Cu+2) y 4 átomos de nitrógeno, provenientes de las cadenas peptídicas.
3) Reacción Xantoproteica:
Con esta reacción podemos identificar la presencia de los aminoácidos aromáticos triptofano).
(tirosina,
La reacción se basa en la nitración del anillo bencénico con acido nítrico, produciendo derivados del nitrobenceno de color amarillo. Estos derivados amarillos se tornan anaranjados a la alcalinidad de la solución con NH4OH o NaOH. En las condiciones de la reacción la fenilalanina es difícil de nitrar por cuanto se requiere la presencia de un catalizador.
3) Reacción de Millón:
Esta reacción es específica para el grupo hidroxifenil. Por lo que el aminoácido tirosina da positiva a esta reacción. Se cree que el grupo hidroxifenil primero forma un derivado nitrato con el Acido Nitrico (HNO3), que luego reacciona con el mercurio y forma un complejo de color rojo. 4) Reacción Sakaguchi:
Esta es una reacción específica para el grupo Guanidrina. Por lo tanto el aminoácido arginina da positiva a esta reacción.
La Guanadina en Solución alcalina, da un color rojo en presencia de alfa-naftol e Hipodromito de Sodio. PREGUNTAS DE PRE LABORATORIO:
1.- Defina las siguientes palabras: Aminoácido Proteína Peptido 2.- Dibuje la estructura general de los aminoácidos, identificando cada uno de los grupos funcionales que poseen. 3.- Dibuje a Estructura de los siguientes aminoácidos: Tirosina, Leucina, Metionina, Lisina, Triptofano y arginina 4.- Haga la clasificación de los aminoácidos según su grupo R
PARTE EXPERIMENTAL OBJETIVOS:
a) Reconocer los Grupos ∞-aminos de los aminoácidos. b) Diferenciar aminoácidos libres de compuestos con dos o mas enlaces peptídicos.
c) Identificar aminoácidos aromáticos. d) Identificar el aminoácido arginina. e) Identificar una solución problema. MATERIALES Y REACTIVOS: • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
Tubos de ensayo. Gradillas Metálicas para tubos de ensayo Beakers de 600 ml. Pipetas Graduadas de 5 ml y de 10 ml Plancha de Calentamiento Frascos goteros. Frascos de vidrio Pinzas de Madera Solución de ninhidrina al 0,1%. Solución de Hidróxido de Sodio (NaOH) al 2,5 N. Solución de Sulfato de Cobre Cu(SO4) al 1%. Acido Nítrico (HNO3) Concentrado. Hidróxido de Amonio (NH4OH) concentrado o Amoniaco ( NH3) Reactivo de Millón (solución de Mercurio en Acido nítrico Concentrado) Solución alcohólica de ∞-naftol al 1%. Solución de Hidróxido de sodio (NaOH) al 5%. Solución de hipoclorito de Sodio (NaCLO) al 10%. Solución al 0,1% de: Arginina, Leucina, Metionina, Lisina, Triptofano, Tirosina. Soluciones al 1% de Albúmina de Huevo.
PROCEDIMIENTO Experimento Nº 1: REACCION DE NINHIDRINA.
a.- Tome 4 tubos de ensayo limpios b.- Coloque 2,5 ml de cada una de las soluciones de aminoácidos o ensayo, como se muestra en la figura
Tubo Nº1 Leucina al 0.1%
Tubo Nº 2 Albumina de huevo al 1%
Tubo Nº 3 Solución Problema
proteínas, en diferentes tubos de
Tubo Nº 4 Agua Destilada (Testigo)
c.- Con una Pipeta graduada limpia, agregue 1 ml de Solución de Ninhidrina al 0,1% a cada tubo de ensayo. d.- Coloque los tubos de ensayo en un baño de agua hirviente por unos 10 minutos.
e.- Retire los tubos del baño de maria y deje enfriar en la gradilla. f.- Anote sus Observaciones y resultados Tubo Nº 1: _______________________________________________________________________________ _____________________________ Resultado: _____________________________ ____________ Tubo Nº 2: ______________________________________________________________________ ____________________________ Resultado: ______________________________ ___________
Tubo Nº 3: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado: _____ ______________________________________ Tubo Nº 4: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado: _____ ______________________________________
Experimento Nº 2: REACCION DE BIURET. a.- Tome 3 tubos de ensayo limpios b.- Con una pipeta graduada limpia, coloque 2,5 ml de cada una de las soluciones de aminoácidos o proteínas, en diferentes tubos de ensayo, como se muestra en la figura
Tubo Nº1 Leucina o Lisina al 0.1%
Tubo Nº 2
Tubo Nº 3
Albumina de Huevo al 1%
Solución Problema
c.- Con una pipeta graduada limpia, agregue 0,5 ml de NaOH 2,5 N a cada tubo de ensayo. d.- Agregue 3 gotas de solución de sulfato cúprico al 1% a cada tubo de ensayo. E.- Agite cada tubo de ensayo e.- Observe si se desarrolla algún Color. f.- Anote sus Observaciones y resultados Tubo Nº 1: _______________________________________________________________________________ _____________________________ Resultado: _____________________________ ____________ Tubo Nº 2: ______________________________________________________________________ ____________________________ Resultado: ______________________________ ___________
Tubo Nº 3: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado: _____ ______________________________________
EXPERIMENTO Nº 3: REACCION XANTOPROTEICA.
a.- Tome 4 tubos de ensayo limpios b.- Con una Pipeta Graduada limpia, coloque 1 ml de cada una de las soluciones de aminoácidos o proteínas, en diferentes tubos de ensayo, como se muestra en la figura
Tubo Nº1 Triptofano al 0.1%
Tubo Nº 2 Metionina al 0.1%
Tubo Nº 3 Albumina de huevo al 1%
Tubo Nº 4 Solución Problema
c.-Agregue con una pipeta graduada, 0,5 ml de HNO3 concentrado en cada tubo, en la campana de extracción. d.- Caliente los tubos en un baño de agua hirviente por 10 minutos. d.-Retire los tubos del baño y déjelos enfriar. e.-Agregue lentamente 1 ml de Amoniaco (NH4OH) concentrado en la campana de extracción y observe el cambio de color amarillo hacia anaranjado en la interfase. f.- Anote sus observaciones y resultados Tubo Nº 1: _______________________________________________________________________________ _____________________________ Resultado: _____________________________ ____________ Tubo Nº 2: ______________________________________________________________________________ ____________________________ Resultado: ______________________________ ___________ Tubo Nº 3: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado:_________ __________________________________ Tubo Nº 4: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado: _____ ______________________________________
EXPERIMENTO Nº 4: REACCION DE MILLON.
a.- Tome 4 tubos de ensayo limpios b.- Con una Pipeta Graduada limpia, coloque 1,5 ml de cada una de las soluciones de aminoácidos o proteínas, en diferentes tubos de ensayo, como se muestra en la figura
Tubo Nº1 Tirosina al 0.1%
Tubo Nº 2 Leucina al 0.1%
Tubo Nº 3 Albumina de huevo al 1%
Tubo Nº 4 Solución Problema
c.- Con una pipeta o con un gotero, agregue 15 gotas del Reactivo de Millón a cada tubo de ensayo. d.- Caliente los tubos en un baño de agua hirviente por unos 10 min. e.- Retire con cuidado los tubos de ensayo del baño de María y colóquelos en la gradilla f.- Anote sus Observaciones y resultados. Tubo Nº 1: _______________________________________________________________________________ _____________________________ Resultado: _____________________________ ____________ Tubo Nº 2: ______________________________________________________________________________ ____________________________ Resultado: ______________________________ ___________ Tubo Nº 3: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado:_________ __________________________________ Tubo Nº 4: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado: _____ ______________________________________
EXPERIMENTO Nº 5: REACCION DE SAKAGUCHI.
a.- Tome 4 tubos de ensayo limpios b.- Con una Pipeta Graduada limpia, coloque 1,5 ml de cada una de las soluciones de aminoácidos o proteínas, en diferentes tubos de ensayo, como se muestra en la figura
Tubo Nº1 Arginina al 0.1%
Tubo Nº 2 Metionina al 0.1%
Tubo Nº 3 Albumina de huevo al 1%
Tubo Nº 4 Solución Problema
c.- Agregue con una pipeta limpia, 0,5 ml de Hidróxido de Sodio (NaOH) al 5% a cada tubo de ensayo. d.- Agregue con un gotero, 2 gotas de alfa-naftol al 1% a cada tubo de ensayo. e.- Agregue 2 con un gotero, 2 gotas de hipoclorito de Sodio al 10% a cada tubo. f.- Anote sus Observaciones y Resultados. Tubo Nº 1: _______________________________________________________________________________ _____________________________ Resultado: _____________________________ ____________ Tubo Nº 2: ______________________________________________________________________________ ____________________________ Resultado: ______________________________ ___________ Tubo Nº 3: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado:_________ __________________________________ Tubo Nº 4: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado: _____ ______________________________________
PREGUNTAS DE POST LABORATORIO
1.- ¿Qué grupos funcionales se revelan en la reacción de ninhidrina? 2.- ¿Es adecuada la reacción de ninhidrina para distinguir aminoácidos de proteínas? Expique 3.- Explique el uso y la importancia de la reacción de Biuret? 4.- ¿Con que reacción distinguiría usted, un aminoácido de una proteína? 5.- Escriba la formula estructural de la tirosina e identifique el grupo responsable de la reacción de Millón. 6.- ¿Qué otros aminoácidos dan positiva a la reacción de Millón? 7.- ¿La Lisina podría dar positiva a la reacción Xantoproteica? 8.- Describa la formula estructural de la Arginina y señale el grupo guanidina.
BIBLIOGRAFIA: •
CONN. EE y STUMPF. Bioquímica Fundamental. Segunda Edición. Editorial LimusaWiley S.A. 1992.
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DANIEL, LJ. And L. NEAL. Laboratory in biochemistry. V. OF CORNELL, New Cork. LITWACK C. bioquímica Experimental. Un manual de Laboratorio. Ediciones Omega. S.A. Barcelona, España, 1990.
