PRÁCTICA “PRUEBAS DE INMUNOPRECIPITACIÓN”
INTRODUCCIÓN Las pruebas de inmunoprecipitación son procedimientos serológicos que demuestran la existencia de anticuerpos capaces de provocar la precipitación de sus correspondientes antígenos cuando ambos reactivos se encuentran en solución. Pueden ser realizadas en medios líquidos como en medios semi-sólidos (geles). En los primeros, la interacción de antígeno y anticuerpo resulta a menudo perturbada por la formación de corrientes y otros disturbios debido a cambios de temperatura y/o de pH. Los geles, por el el contrario, forman mallas mallas que estabilizan la solución, facilitando el revelado de la reacción antígeno-anticuerpo. Para que tenga lugar la inmunoprecipitación, es necesario que interactuen en solución anticuerpos que sean por lo menos bivalentes, con antígenos multivalentes; solo así, es posible que se configuren los agregados moleculares que, al entrelazarse, adquirirán la propiedad de precipitar. Los anticuerpos más frecuentemente involucrados en el fenómeno de inmunoprecipitación pertenecen a la clase IgG de las inmunoglobulinas, las IgM también pueden participar. La interacción de antígeno y anticuerpo puede ser facilitada dejándolos difundir espontáneamente en el seno de un gel (prueba de inmunodifusión) o acelerando su encuentro utilizando un campo eléctrico (electroinmunodifusión). También se pueden separar las fracciones moleculares de un muestra mediante electroforésis y luego realizar una inmunodifusión (inmunoelectroforésis). Las pruebas de inmunoprecipitación se pueden utilizar para identificar y cuantificar inmunoglobulinas u otras proteínas, identificación de bacterias, bacteria s, etc. En el estudio de estructuras de enzimas, hormonas y otras sustancias. Así mismo, los métodos de inmunodifusión nos nos permiten identificar compuestos antigénicos que pueden estar jugando un papel importante en la patogenicidad de una enfermedad. Para las pruebas de inmunoprecipitación, es necesario contar con antígenos hidrosolubles. “INMUNODIFUSIÓN EN GELES”
INMUNODIFUSIÓN DOBLE (PRUEBA DE OUCHTERLONY) La inmunodifusión doble se caracteriza porque el antígeno y el anticuerpo (colocados en pozos diferentes en un medio semisólido) difunden espontáneamente en
el gel; en el sitio donde se encuentran en zona de equivalencia forman una línea de precipitación visible. La interacción de ambos reactantes es consecuencia de la agitación térmica de las moléculas e iones y la velocidad será proporcional a la diferencia de concentraciones que existen entre el pozo y el gel circulante, la cual disminuirá progresivamente a medida que el reactivo se vaya diluyendo al difundir en la agarosa. Otros factores como temperatura de reacción, tamaño molecular de los reactantes y las carácteristicas físico-químicas del gel influencian la difusión de ambos reactantes. En general, la técnica de doble-inmunodifusión es sencilla y sensible (0,2 mg/ml) y usualmente nos permite observar los tres patrones básicos de precipitación:
1. REACCIÓN DE IDENTIDAD Cuando los antígenos son idénticos y el antisuero reacciona con ambos, se originan dos líneas de precipitación que se unen formando un arco simple.
2. REACCIÓN DE SEMI-IDENTIDAD Cuando hay antígenos serológicamente diferentes, pero que comparten determinantes antigénicos y existen anticuerpos para cada uno de los determinantes antigénicos, se producirá un a reacción cruzada y se observarán dos líneas de precipitación que se interceptan con una pequeña prolongación hacia uno de los orificios de los antígenos.
3. REACCIÓN DE NO IDENTIDAD En este caso, los antígenos son diferenes entre sí y el antisuero posee anticuerpos contra determinantes antigénicos distintos, presentes en cada uno de ellos, se forman dos líneas de precipitación independientes, que se cruzan entre sí.
INMUNODIFUSION DOBLE Reacción de Identidad
YZ
Semi-identidad
ZY
Z
Z
No identidad
g
g
ANÁLISIS SEMICUANTITATIVO DEL ANTISUERO X
X 1/2
X 1/32
X 1/4
X 1/16
X 1/8
Molde típico para la comparación semicualitativa de Ag´s o
:
Anticuerpo (antisuero) Ag: Antígeno (diluciones seriadas)
PRUEBA DE COGGINS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA Una de las principales aplicaciones de la prueba de inmunodifusión doble en medicina veterinaria es para el diagnóstico de la Anemia Infecciosa Equina (AIE). Esta prueba fue descrita por Coggins y colaboradores, en Cornell Veterinaria en Abril de 1970. La prueba está basada en la migración concurrente del antígeno y el anticuerpo a través del agar-gel. El antígeno AIE es un extracto de bazo de caballos infectados con anemia infecciosa.
OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA Realizar prueba de inmunodifusión doble:
Familiarizarse con la preparación de láminas y placas con agar para inmunodifusión
Aplicar la inmunodifusión doble para el análisis semicuantitativo (titulación) de los sueros obtenidos durante la práctica N°2
Aplicar pruebas de inmunodifusión para identificar reacciones de identidad y no identidad entre varias preparaciones de proteínas.
MATERIALES
Placas de petri Láminas de vidrio Pipetas de 5 y 10 ml Fiolas de Erlenmeyer Pipetas pasteur Baño de María Solución de agarosa al Sueros Micropipetas
METODOLOGÍA Preparación de placas con agar para Inmunodifusión: 1. El laboratorio dispondrá de la solución de agar preparada previamente (de acuerdo a las especificaciones de la técnica) en un buffer adecuado, la misma se mantendrá en baño de María a 56 °C. 2. Depositar 15 ml de la solución de agar caliente en cada cápsula de petri y 4 ml sobre las láminas de vidrio limpias y secas. Dejar solidificar a temperatura ambiente. 3. Labrar en el gel los pozos de acuerdo a un molde previamente seleccionado. Posteriormente se procede a retirar el agar de cada pozo mediante una aguja. Tenga mucho cuidado de no romper el agar alrededor del pozo. 4. Colocar el antígeno (suero de la especie animal contra la cual Ud. elaboró el antisuero) en el orificio del centro y las diluciones del antisuero en los pozos de la periferia. 5. Anotar las características de los reactivos y sus posiciones respectivas en una hoja aparte. 6. Incubar las placas en cámara húmeda durante 24 horas a 37°C 7. Efectuar la lectura de las líneas de precipitación y anotar los resultados.
PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES DE LOS ANTISUEROS PARA TITULACIÓN 1. En placa de microtécnica y utilizando la micropipeta, colocar 100 l del suero a titular en el primer pozo 2. Colocar 50 l de solución salina o del buffer adecuado en los siguientes 5 pozos. 3. Transferir 50 l del suero del primer pozo al segundo, mezclar bien y tomar 50 l para transferirlos al tercer pozo y así sucesivamente hasta el último pozo donde se descartan los 50 l restantes. De este modo las diluciones quedarán 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 y 1/32.
Nota: Realizar estas diluciones con cada uno de los sueros obtenidos por Ud. durante la práctica N° 2.
