UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS REPORTE: “Práctica No. “Deshidrogenacion
2”
del Ácido Succínico”
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA METABOLICA QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO 502 EQUIPO: 6 INTEGRANTES: CABA ÑAS RODRÍGUEZ JOSEL JOSEL I NE
LAGUNES VIRGEN ZULEIMA RAMOS AHUMADA EDITH RODRÍGUEZ RAMÍREZ JUAN IVÁN VAZQUEZ PEREZ MAYDELITH
CATEDRATICO: Q.F.B. MARGARITA MURILLO FIGUEIRAS
AGOSTO – NOVIEMBRE 2013
ORIZABA, VER.
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Práctica No. 2 Deshidrogenacion del Ácido Succínico.”
“
Objetivo. El alumno comprenderá y demostrará mediante un ensayo colorimétrico la conversión de Succinato a Fumarato, por la acción de la enzima Succinato Deshidrogenasa utilizando azul de metileno como aceptor de electrones e identificara esta reacción como parte del ciclo de Krebs.
Fundamento. El ciclo de Krebs (de los ácidos tricarboxílicos o del ácido cítrico) es una vía metabólica presente en todas las células aerobias, es decir, las que utilizan oxígeno como aceptor final de electrones en la respiración celular; el ciclo de Krebs ocurre en las mitocondrias de las células eucariotas y en el citoplasma de las células procariotas. En los organismos aerobios las rutas metabólicas responsables de la degradación de los glúcidos, ácidos grasos y aminoácidos convergen en el ciclo de Krebs, que a su vez aporta poder reductor a la cadena respiratoria y libera CO2. La enzima Succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa del ácido succínico es una Oxidorreductasa que cataliza la oxidación del succinato para formar fumarato siendo la coenzima el FAD. Esta enzima se localiza en eucariotes en la membrana mitocondrial interna. El H2 cedido por el succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el azul de metileno que al cambiar su estado Redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa.
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Las reacciones restantes del ciclo oxidan al succinato a oxalacetato, éste al regenerarse, permite otra vuelta del ciclo. Para que eso sea posible, el grupo metilo presente en el succinato tiene que convertirse en un carbonilo. Es la única reacción en el ciclo asociada a un grupo prostético flavínico (FAD) mediante el cual los equivalentes de reducción del succinato son transferidos a la ubiquinona, componente de la cadena de transporte de electrones. En general la función bioquímica del FAD es oxidar alcanos a alquenos, mientras que el NAD+ oxida alcoholes a aldehídos o cetonas. El malonato es un fuerte inhibidor competitivo de la enzima. Un inhibidor competitivo es una sustancia cuyas moléculas son semejantes en composición y morfología a las de ciertas sustancias activas. Éstas son capaces de unirse a ciertos receptores de las células y provocar un efecto. Aquéllas (No competitivas) se unen a los receptores sin provocar efecto alguno, así que 'compiten' con las moléculas activas e indirectamente actúan disminuyendo las oportunidades de éstas. Es importante mencionar que en los inhibidores competitivos, se aumenta el sustrato mientras se elimina el competidor; mientras que en las no competitivas, se forma el complejo pero no tan fuerte, lo cual da lugar a que no se elimine y permanezca dentro del complejo. No accioa
Materiales y reactivos.
4 tubos de ensayo
Azul de metileno 0.1%
Pipeta graduada de 5ml
Ácido Succínico
Gradilla
Ácido Malónico
Baño maría
Glucosa
Termómetro
Levadura
Parrilla eléctrica
Aceite Mineral o de inmersión.
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Técnica. 1. Se etiquetan 4 tubos de ensayo A, B, C y D. 2. Añadir 2 gotas de azul de metileno 0.1% a cada tubo. Sostener con los dedos cada tubo y mezclar. Continúe agregando la tintura de azul de metileno gota a gota mezclando al agregar hasta que la solución se torne de un azul ligero. 3. Sostenga cada tubo haciendo in ligero ángulo. Verter 1ml (aproximadamente) de aceite de inmersión haciendo bajar desde el borde, formando una película. 4. Colocar los tubos a baño maría a 37°C durante 40minutos. 5. Observar cambio de color.
Observaciones. Tabla 1.- Modo de preparación de los tubos para la práctica B C A Levadura Levadura Glucosa Glucosa ADM ADM ADM H2O Ac. Succínico Ac. Malónico Aceite Aceite Aceite NOTA: La
D Levadura Glucosa ADM Suc/Mal Aceite
levadura se añadió al final para que las reacciones se llevaran a cabo al mismo
tiempo y no hubiera variación en los resultados.
Se rotularon 4 tubos de ensayo y a cada tubo se añadió lo indicado en la Tabla 1.
Cabe mencionar que se añade Azul de Metileno para hacer una detección cuantitativa del estado de oxidación-reducción. Este colorante es un aceptor electrónico artificial coloreado cuando se encuentra oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida en que se reoxida la coenzima FAD. Es importante tener en cuenta que se utiliza este colorante debido a que su valor estándar de Redox es de mientras que el de la reacción de Succinato a Fumarato es de lo cual indica que el azul de metileno es más positivo, lo que indica que es un mayor atractor de electrones.
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Los tubos se homogenizaron una vez que se añadió la levadura; posteriormente se añadió aceite a modo de formar una película ya que cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxígeno del aire se reoxida tomando la coloración azul y formando peróxido de hidrogeno, por esta razón el sistema se aísla mediante la capa de aceite añadido.
Se llevó a baño maría durante 40minutos controlando la temperatura a 37°C; durante este proceso se pudo visualizar el proceso de fermentación, por medio del desprendimiento de CO2, excepto en el tubo A.
Pasado los 40 minutos se pudieron observar los resultados finales.
Esquema.
Fi g. 1 Tubos después de agre-
garse los reactivos y previo al calentamiento.
Fig.2 Decoloración después
de iniciado el calentamiento.
Fig.3 Resultados finales
Resultados. Tabla 2.- Resultados esperados según la bibliografía. CONTENIDO COLOR INICIAL Control Azul A c. Succínico Celeste B Ác. Malónico Celeste C Ác. Celeste D Suc/Malónico
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COLOR FINAL Azul Azul cielo Azul Anillo azul cielo
CODIGO DE CRUCES ++++ + +++ ++
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Tabla 3.- Resultados finales obtenidos por tubo. CONTENIDO COLOR INICIAL Control Azul A Ác. Succínico Celeste B Ác. Malónico Celeste C c. Suc / Celeste D Malónico
TUBO A: No
TUBO B:
COLOR FINAL Azul Azul cielo Anillo azul Anillo azul cielo
CODIGO DE CRUCES ++++ + ½+ ½+
existió ninguna reacción debido a que solo era un patrón de referencia.
Se pudo comprobar que se efectuó la Deshidrogenacion del Ácido
succínico debido a la decoloración del complejo Succinato-SDH; se sabe que se efectuó esta reacción ya que se aumentó el sustrato.
TUBO C: Teóricamente
no debió de existir decoloración en el complejo, puesto que
la enzima SDH es específica para el Ácido Succínico pero no para el Ác. Malónico.
TUBO D: Según
la bibliografía se esperaba obtener una reacción no competitiva ya
que se debió formar un complejo que es tan fuerte la unión enzima-sustrato que no se puede eliminar el competidor (Ác. Malónico), sin embargo, se obtuvo una reacción competitiva ya que se produjo una decoloración lo que indica que se eliminó el competidor.
Conclusión. Con la realización de esta práctica se pudo demostrar la Deshidrogenacion del ácido succínico por acción de la enzima Succinato Deshidrogenasa puesto que el azul de metileno actuó como el receptor de hidrógenos sobre el FAD al haber ocurrido la reducción del indicador Redox.
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