PRACTICA 1
PROTEINAS INTRODUCCIÓN Dada la compleja estructura proteica y por lo tanto su elevado peso molecular, molecular, las proteínas son consideradas como macromoléculas. Este carácter macr macrom omol olec ecul ular ar,, dete determ rmin ina a una una seri serie e de prop propie ieda dade dess que que posi posibi bilit litan an el aislamiento y análisis de las proteínas. Lo anterior determina que las proteínas sean incapaces de atravesar membranas semipermeables, lo que posibilita que en una solución en donde exis existe ten n prot prote eínas ínas y otro otross cons onstitu tituye yent ntes es de menor nor pes peso mole olecul cular (aminoácidos, monosacáridos, urea, creatinina, sales, iones, etc., las primeras pued pueden en ser ser sepa separa rada dass al no pode poderr pasa pasarr a trav través és de los los poro poross de las las membranas semipermeables! en tanto que los otros constituyentes, de menor peso molecular pasarán sin problema al"uno. En el experimento #, se aplicará esta propiedad, para aislar las proteínas del del suer suero o san" san"uí uíne neo. o. $"ua $"ualm lmen ente te se iden identiti%ic %icar arán án los los & "ran "rande dess tipos tipos de proteínas del suero san"uíneo (alb'mina y "lobulina por su solubilidad en el a"ua y en soluciones salinas diluidas. De otro lado, las proteínas tienen un rol muy destacado en el control del p celular y extracelular. Esta acción amorti"uadora se explica por la presencia de "rupos ioni)ables en las cadenas laterales de los aminoácidos, los cuales son capaces de %ijar protones y evitar que el p baje! o ceder protones al medio para neutrali)ar los oxi*idrilos y evitar de este modo que el p aumente (+i"ura #. La concentración de *idro"eniones en el medio en que se encuentra disuelta una proteína, determina importantes variaciones en la car"a eléctrica de la misma. En "eneral, una proteína se car"a positivamente cuando se encuentra disuelta en un medio de p in%erior al de su punto isoeléctrico ($! en tanto que se car"a ne"ativamente cuando el p del medio en que se encuentra es superior al valor de su $. El punt punto o isoe isoelé léct ctri rico co de las las prot proteí eína nass con con un alto alto cont conten enid ido o en aminoácidos básicos (*istidina, lisina y ar"inina, es alto, como el caso del citocromo c, que tiene un valor de $ de #-.. /uando una proteína tiene un alto contenido en aminoácidos dicarboxílicos (aspártico y "lutámico, tendrán un $ bajo, como el caso de la pepsina que tiene un $ cercano a #. En "eneral, la mayor parte de las proteínas "lobulares tienen un $ que varía entre 0.- y 1.-. /uando la proteína está en un medio de p que coincide con el valor de su $, no sólo es incapa) de mi"rar en un campo eléctrico sino que su
solubilidad lle"a al mínimo, incluso al"unas lle"an a precipitar, como lo apreciaremos en el experimento &.. 2n aspecto muy importante que debe tenerse en cuenta al *ablar de las proteínas, es que la actividad bioló"ica de estas macromoléculas depende de la inte"ridad de su estructura en todos los niveles de estructuración. /uando esta estructura se ve a%ectada, como cuando la proteína se desplie"a o se plie"a en %orma di%erente a la proteína nativa, se dice que la proteína se *a desnaturali)ado y en esta situación, la %unción bioló"ica de la proteína, se pierde. En esta práctica ( Experimento 3 comprobaremos, como la desnaturali)ación de una proteína (catalasa determina la perdida de su %unción catali)adora.
+i"ura #.4 5ecanismo de acción de los "rupos ioni)ables de los aminoácidos para explicar la acción tampón de las proteínas La separación electro%orética de las proteínas del suero constituye un procedimiento muy utili)ado para el dia"nóstico de diversas en%ermedades. 6l tomar las %racciones proteicas del suero , di%erente intensidad de car"a al ser puestas a determinado p, se podrán separar por su velocidad de mi"ración en un campo eléctrico.
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS #. 7eparación de proteínas por diálisis. &. Estudio de la solubilidad de la caseína a di%erentes p 3.4Desnaturali)ación de las proteínas y actividad bioló"ica
EXPERIMENTO 1 7E686/$9: DE 89;E$:67 98 D$6L$7$7 Objetivos #. En base al carácter macromolecular de las proteínas utili)ar un método para separarlas de otros componentes de menor peso molecular. &. Estudiar el e%ecto de la %uer)a iónica sobre la solubilidad de las proteínas del suero san"uíneo. 3. /onstatar la acción del ácido tricloroacético (;/6 como a"ente precipitante de las proteínas. Método Diálisis del suero san"uíneo utili)ando como membrana semipermeable una bolsa de celo%án. Procedimieto #. 5edir en el interior de una bolsa de celo%án, 0 ml. de suero san"uíneo y cerrar la bolsa. &. /olocar la bolsa de celo%án en el interior de un beaadirle 0 ml. de ácido tricloroacético al #-?. 9bservar lo que sucede. 0. ;rate de disolver el precipitado que quedó en el tubo de centrí%u"a utili)ando a"ua destilada! de no ser posible, a>ada unas "otas de :a/l al #-? y observe si dio resultado.
Res!"t#dos #. Escriba si observó precipitado en el interior de la bolsa y a qué puede corresponder.
&. @Aué observó al a>adir el ácido tricloroacético al #-?B
3. +ue posible disolver el precipitado del tubo con a"ua destiladaB. CCCCCCCCCCCCCCCCCC @Aué ocurrió al a>adir el :a /l al #-?B
INTERRO$ANTES #. @or qué es necesario renovar el a"ua destilada del bea
$LO%ULINAS
7olubilidad en el a"ua 7olubilidad en soluciones salinas diluidas
EXPERIMENTO ' E7;2D$9 DE L6 79L2$L$D6D DE L6 /67EF:6 6 D$+E8E:;E7 p Objetivos #. Demostrar como varia la solubilidad de una proteína en %unción del p &. recisar las alteraciones que ocurren en la solubilidad déla caserna cuando se encuentra en un medio de p cercano al valor de su $. 3. Determinar experimentalmente el $ aproximado de una proteína, como la caseína. Método 6preciar la solubilidad de la caseína en medios de di%erente p. Procedimieto #. 8otular una serie de 1 tubos de ensayo, del # al 1 &. En el tubo # medir 1 ml. de ácido acético -.#G :. 3. En el tubo & medir 1 ml. de la solución de ácido acético preparada me)clando #- ml. de ácido acético -.#G : y #-ml de a"ua destilada. =. En el tubo 3 medir 1 ml de la solución de ácido acético obtenida al me)clar #- ml. de la solución anterior con #- ml de a"ua destilada. 0. roceder sucesivamente con la misma dilución pro"resiva, *asta completar los 1 tubos. H. 6 cada uno de los 1 tubos, a>ada # ml. de la solución de caseína al -.0? en acetato de sodio -.# :. . 5e)clar bien y observar la turbide) o precipitación, inmediatamente y a los #0 minutos. G. /on ayuda del papel indicador estime el p en cada uno de loa tubos.
E()resi* de Res!"t#dos 6note sus resultados en la si"uiente ;abla
TU%OS + 8elación 76LIJ/$D9
1
'
,
-
.
/
0
p (teórico p (estimado con papel indicador recipitación o insolubilidad a los #0K (cruces -40
INTERRO$ANTES #. @/uál es el $ de la caseínaB +undamente su respuesta. CCCCCCCC &. 7e altera la estructura primaria de las proteínas, cuando se encuentra a un p que coincide con el valor de su $B CCCC +undamente su respuesta. 3. @or qué precipita la caseína en su $B @Es este proceso reversibleB =. El $ de la ureasa es 0.- será mayor su solubilidad si se encuentra disuelta en un tampón acetato =. o si se encuentra disuelta en un tampón %os%ato .G. @or quéB
EXPERIMENTO , DE7:6;286L$6/$9: DE L67 89;E$:67 M 6/;$N$D6D $9L9O$/6 Objetivos #. Neri%icar como la desnaturali)ación de la proteína, determina la pérdida de su actividad bioló"ica. &. Neri%icar la acción de varios a"entes desnaturali)antes. Método Estudio de la actividad de la catalasa de los *ematíes en presencia de diversos a"entes desnaturali)antes. Procedimieto #. 8otular = tubos de ensayo del # al = y medir respectivamente, -.# ml. de san"re diluida (una "ota de san"re en #-- ml. de a"ua destilada, -.# ml. de san"re diluida *ervida, san"re diluida en presencia de urea G5 y san"re diluida en 7D7 al 3 ? (-.# mil. &. 5edir encada tubo 0 ml. de peróxido de *idró"eno -.-0 5 y 5e)clar. 3. /on ayuda de una varilla de vidrio depositar en el %ondo de cada tubo un circuito de papel %iltro y tomar el tiempo que toma en cada tubo para subir
2
*asta la super%icie. E()resi* de Res!"t#dos /omplete la si"uiente ;abla.
TU%O ;iempo que tarda en subir el papel *asta la super%icie
1
'
,
-
INTERRO$ANTES #. Escriba el mecanismo de acción de la urea G5, 7D7 y D;;. &. Escriba la reacción química catali)ada por la catalasa 3. @Es la catalasa una proteína simple o conju"adaB +undamente su respuesta. =. @/on qué experimento (s podría demostrar que la desnaturali)ación no a%ecta la estructura primaria de la proteínaB 0. @Aué importancia podría tener en clínica la b'squeda de actividad catalásica en la orinaB
.
