PLÁSMIDOS

PLÁSMIDOS

Son pequeñas moléculas de ADN independientes, circulares, auto-replicantes que lleva sólo unos pocos genes, pesan de 1 Kb a 200 Kb y se pueden encontrar en las bacterias. Los plásmidos se

replican y se transmiten independientemente del cromosoma bacteriano. La replicación y la transcripción de los plásmidos dependen de las proteínas de su hospedero.

El número de plásmidos en una célula generalmente permanece constante de generación en generación. Los plásmidos son moléculas de carácter autónomo y existen en las células como genomas extracromosómicos, aunque algunos plásmidos se pueden insertar en un cromosoma bacteriano, donde se convierten en una parte permanente del genoma genoma bacteriano. bacteriano.

Es aquí que que ofrecen una una gran

funcionalidad en la ciencia molecular.

Los plásmidos son fáciles de manipular manipular y aislar el uso de bacterias.

Pueden ser integradas integradas en los

genomas de mamíferos, lo que confiere a las células de mamíferos cualquier funcionalidad genéticos que llevan. Por lo tanto, esto le da la capacidad de introducir genes en un organismo organismo dado mediante el uso de bacterias para amplificar los genes híbridos que son creados in vitro. vitro. Esta molécula de plásmido plásmido pequeño pero poderoso es la base d e la tecnología del ADN recombinante. Hay dos categorías de plásmidos. Plásmidos estrictas replicar sólo cuando el cromosoma se replica. Esto es bueno si se está trabajando con una proteína que es letal para la célula. Plásmidos tranquilo replicar por sí mismos. Esto le da una mayor proporción de los plásmidos en el cromosoma. cromosoma.

Universidad Nacional “José Faustino Sánchez Carrión” –

I.

E.A.P. Medicina Humana

TIPOS DE PLÁSMIDOS

Cada plásmido, dentro de la amplia diversidad de los que se conocen, se suele clasificar según el grupo de incompatibilidad al que pertenece (los grupos de incompatibilidad se suelen denominar con las siglas Inc seguidas de una letra mayúscula (por ejemplo IncP, IncFII, etc.). Se dice que dos plásmidos son incompatibles cuando no pueden coexistir establemente en la misma bacteria en ausencia de una presión selectiva permanente. Grupo de incompatibilidad es el conjunto de plásmidos incompatibles entre sí. La incompatibilidad depende del hecho de que los distintos miembros de un mismo grupo poseen el mismo tipo de sistema de control del número de copias y de reparto de dichas copias a las células hijas. Existe una amplia variedad de plásmidos. Los plásmidos bacterianos son de muchos tipos distintos, pero a grandes rasgos podemos clasificarlos atendiendo a diversos caracteres:

1. Según que sean autotransmisibles por conjugación o no: a. Plásmidos conjugativos. b.

Plásmidos no-conjugativos. Dentro de esta categoría se incluyen: i.

Plásmidos no movilizables

ii.

Plásmidos movilizables por otros que sí son conjugativos.

2. Según su control de replicación vegetativa: a.

Plásmidos de control estricto del número de copias: tienen bajo número de copias por cromosoma en la misma célula. Suelen ser plásmidos de tamaños medianos (unas 30 kb) a grandes (cientos de kb) P. ej., el factor F se mantiene a 1-2 copias por cromosoma.

b.

Plásmidos de control relajado: alto nº de copias por cromosoma (más de 10). Suelen ser plásmidos pequeños (menos de 10 kb). Algunos de ellos tienen un sistema de replicación especial, y son amplificables cuando a las bacterias que los poseen se les añade cloramfenicol: este antibiótico detiene la síntesis de proteínas. Lo que afecta a la replicación del cromosoma, ya que para que se inicie cada ciclo de replicación cromosómica se necesita un nuevo "pool" de determinadas enzimas. Pero esto no afecta a la replicación del plásmido, que de esta manera se "amplifica" y aumenta aún más su proporción respecto del cromosoma.

3. Según el tipo de fenotipos que codifican (y dejando aparte a los plásmidos crípticos, de los que se desconoce su función fenotípica): a.

Plásmidos R, que codifican una o más resistencias a drogas (antibióticos) y/o resistencia a metales pesados.

b.

Plásmidos

bacteriocinogénicos,

que

codifican

alguna

bacteriocina

y

simultáneamente confieren inmunidad frente a esa bacteriocina a la bacteria

Asignatura: Biología

Docente: Segami Salazar Hugo 2



que lo posee. Dentro de ellos, de los más estudiados son los plásmidos Col, que producen colicinas (bacteriocinas de E. coli). c.

Plásmidos de virulencia, que codifican funciones relacionadas con la virulencia en muchas bacterias patógenas. Por ejemplo:

d.

i.

plásmido de la toxina tetánica en Clostridium tetani.

ii.

plásmido de la toxina del ántrax en Bacillus anthracis.

Plásmidos que codifican factores de colonización (para la invasión de los tejidos de su hospedador).

e.

Plásmidos de cepas de Pseudomonas, que confieren rutas metabólicas capaces de utilizar como fuentes de carbono y energía sustancias que otros organismos no pueden catabolizar:

f.

i.

plásmidos OCT (degradación del octano);

ii.

plásmidos TOL/XYL (degradación del tolueno y xileno);

iii.

plásmidos NAF (degradación del naftaleno), etc.

Plásmidos de cepas de Rhizobium responsables de funciones relacionadas con el establecimiento de las simbiosis fijadoras de nitrógeno en los nódulos radicales de las leguminosas (pSym y otros tipos).

g.

Plásmidos Ti y Ri de Agrobacterium, responsables de la producción de tumores en numerosas plantas dicotiledóneas.

h.

Existen igualmente plásmidos que codifican más de un tipo de fenotipos: p. ej., plásmidos que suministran resistencia a antibióticos y capacidad de virulencia.

4.

Plásmidos según el grupo de incompatibilidad. Recordar la definición de incompatibilidad entre plásmidos, y la base de este fenómeno: dos plásmidos son incompatibles (no pueden permanecer establemente en la misma célula) porque comparten un mismo sistema de replicación y segregación de las copias. Como se sabe, los plásmidos se pueden clasificar según su pertenencia a un mismo grupo de incompatibilidad. a.

Así p. ej., el plásmido F pertenece al llamado grupo IncFI;

b.

Los plásmidos R1 y R100, de resistencia a antibióticos, pertenecen al grupo IncFII.

Dos plásmidos conjugativos pertenecientes a grupos de incompatibilidad diferentes pueden poseer regiones tra semejantes, y tipos de pelos sexuales parecidos. Esto es precisamente lo que ocurre con el F comparado con el R1 o el R100.




II.


ESTRUCTURA DE LOS PLÁSMIDOS Los plásmidos extraídos de una bacteria se encuentran principalmente en forma superenrollada. El ADN así enrollado adopta una configuración más compacta que el ADN menos enrollado y migra entonces más rápido que el otro durante una electroforesis.

Las formas de ADN Los plásmidos se encuentran principalmente en forma superenrollada en las bacterias. Las formas de ADN pueden visualizarse en el microscopio electrónico como círculos relajados o superenrollados. Además, pueden identificarse por electrof oresis o por centrifugación. En estos casos, la estructura compactada del ADN superenrollado aumenta su migración electroforética y su velocidad de sedimentación, lo cual permite diferenciarlo del ADN circular relajado o del ADN lineal.





Los tipos de plásmidos, clasificados de acuerdo al tipo de genes que transportan: F

("factor sexual") : en Escherichiacoli el plásmido F contiene 25 genes, algunos de los cuales controlan la producción de los pilis , "tubos" que se extienden desde la +

superficie de las células bacterianas "machos"( F ), a la de las células bacterianas -

hembras ( F ).

Se denomina episoma a un plásmido incorporado al cromosoma bacteriano. Los plásmidos se replican en manera similar al cromosoma bacteriano. En Escherichia coli se han reconocido muchos plásmidos, entre ellos el F ("factor sexual") y el R (resistencia a los antibióticos). El plásmido R confiere, a las células que lo poseen, resistencia a los antibióticos o drogas. Un plásmido R puede llegar a tener hasta 10 genes que confieren resistencia y pueden transferirse a otra bacteria de la misma especie, a virus e inclusive, a bacterias de diferentes especies.




III.


FUNCIONES DE LOS PLÁSMIDOS

En función de que los plásmidos sean o no transmisibles de una bacteria a otra por medio de contactos intercelulares, se pueden distinguir: A. PlásmidosConjugativos (auto transmisible):Que son aquellos que se transfieren entre cepas por medio de fenómenos de conjugación. Algunos de estos plásmidos no sólo se transfieren entre cepas de la misma especie, sino que son capaces de hacerlo entre especies y géneros muy diversos, recibiendo el muy apropiado nombre de plásmidos promiscuos o de amplio espectro de hospedadores, permitiendo transferencia horizontal de información genética entre grupos bacterianos filogenéticamente alejados.

B. Plásmidos No Conjugativos: Carentes de esta propiedad de conjugación. Dentro de esta categoría existe un subgrupo, el de los plásmidos movilizables: son aquel no auto transmisible que pueden ser transferidos por la acción de un plásmido conjugativo coexistente en la misma bacteria. Existe una variedad de fenotipos y funciones determinados por plásmidos: 

Resistencia a antibióticos (plásmidos R).



Resistencia a metales pesados (por ejemplo, resistencia a mercurio).



Plásmidos de virulencia: producción de toxinas, factores de penetración en tejidos, adherencia a tejidos del hospedador, etc., en ciertas bacterias patógenas.



Producción de bacteriocinas (proteínas tóxicas producidas por bacterias que matan a otras de la misma especie). 3+



Producción de sideróforos (quelatos para secuestrar iones Fe ).



Utilización de determinados azúcares.



Utilización de hidrocarburos, incluyendo algunos cíclicos recalcitrantes (degradación de tolueno, xileno, alcanfor, etc.) en Pseudomonas.



Inducción de tumores en plantas (plásmido Ti de Agrobacteriumtumefaciens).



Interacciones simbióticas y fijación de nitrógeno en ciertos Rhizobium.

IV.

DESCRIPCIÓN DEL PLÁSMIDO F Y DE SUS FUNCIONES BÁSICAS El factor responsable de la fertilidad de E. coli K12, o sea, el plásmido F, es un ejemplo de plásmido conjugativo que tiene la capacidad de interaccionar con el cromosoma bacteriano para integrarse en él (episoma). El factor F puede encontrarse en uno de tres posibles estados: +



Autónomo, en las células F ;



Integrado (como episoma), en las células Hfr;







Autónomo, pero con un trozo de cromosoma, en las cepas F' En estos tres estados realiza el mismo tipo de funciones esenciales. 4.1.

Estructura física:



ADN circular de cadena doble, cerrado covalentemente (C.C.C.);



Superenrollado negativamente (requiere la acción de la girasa); Tamaño: 100 kilobases. El mapa físico de F posee coordenadas en kb de 0 a 100 (obviamente el 0 y el 100 son el mismo punto), tomando como punto arbitrario de referencia (0/100) el borde izquierdo de la secuencia de inserción IS3a. 4.2.

Organización genética y funcional:

Se han identificado unos 60 genes en el plásmido F. Vamos a echar una ojeada al mapa de F para describir los principales grupos de genes según las funciones que realizan: 1.

Porción tra (genes que codifican funciones relacionadas con la transferencia

conjugativa). Existen unos 25 genes tra, repartidos en unas 33 kb (o sea, casi la tercera parte de F está dedicado a genes de conjugación). La mayor parte de esos genes están formando parte de un gran operón 2.

traY……Z (unos

20 genes).

Regiones para la replicación vegetativa del plásmido F: la zona RepFIA es la

más importante, y posee genes relacionados con la replicación vegetativa, con la incompatibilidad de F respecto de otros plásmidos (Inc) de tipo similar, y con el reparto de las copias replicadas de F a las células hijas.

V.

DESCRIPCIÓN DEL PLÁSMIDO R Y SUS FUNCIONES BÁSICAS

EL PLÁSMIDO R: La resistencia a los antibióticos ha sido encontrada en gérmenes patógenos causantes de enfermedades tales como: tifoidea, meningitis, gonorrea y otras. Actúan proporcionando la información necesaria para destruir el antibiótico o para circunvalar el bloqueo que produce el antibiótico en la vía metabólica bacteriana. En el caso de una infección viral, el uso indebido o innecesario de antibióticos matará a la población bacteriana normal, quedando (o seleccionando) las que tengan el factor R; éstas pueden reproducirse aún en presencia del antibiótico. La próxima vez que tenga una infección bacteriana, las bacterias con factores R estarán listas para transferir su factor a la nueva bacteria invasoras, que se harán resistentes a los antibióticos.




VI.


MECANISMO DE TRANSMISIÓN DE GENES

Las bacterias tienen tres mecanismos para el intercambio y la incorporación del material genético. Son transformación (la admisión de ADN extracelular), transducción (los fagos transfieren genes bacterianos a partir de una célula hospedadora a otra) y conjugación (transferencia genómica directa entre las células bacterianas temporalmente unidas).

1. TRANSFORMACIÓN Transformar una bacteria ó una levadura, consiste en introducirle una molécula de ADN extranjero, introducir un plásmido en una bacteria es transformar una bacteria, o sea una transformación. Para las células eucariotas (no las levaduras), no se dice transformar sino transfectar (transformar una célula eucariota quiere decir hacerla eterna o hacerla cancerosa). Existen varios métodos para introducir un plásmido en una célula. Cada uno es en sí una receta y cada uno tiene una propia.

TRANSFORMACIÓN CON CACL2 + CHOQUE TÉRMICO: Consiste en añadir plásmidos a las bacterias tratadas con CaCl 2 y de someterlas a un breve choque térmico (42°C). La utilización de otras sales de CaCl 2 y la adición de iones metálicos aumenta la eficiencia de la transformación. Para plásmidos de 3 kb, una transformación eficaz produce alrededor de 10+8 colonias/mg de ADN plasmídico superenrollado. Otros métodos de transformación: Utilizando por ejemplo liposomas y son más costosos. La eficiencia de la transformación es inversamente proporcional a la talla del plásmido. Para identificar las bacterias transformadas, se utilizan marcadores de selección proporcionados por plásmidos. Los marcadores de selección más utilizados son los genes de resistencia a antibióticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina. Como r egla, las bacterias transformadas se cultivan en presencia del antibiótico para evitar que la bacteria pierda el plásmido que se le ha introducido.

2. TRANSDUCCIÓN Es la transferencia de material genético entre bacterias, usando como vehículo un bacteriófago. No todos los ciclos virales son iguales, pudiendo destacar dos ciclos principales, el lisogénico y el lítico. Si la respuesta es lítica, el virus se va replicando, formando una serie de nuevos fagos a la vez, que usan a la bacteria como elemento parasitado, hasta que son capaces de parasitar ya por ellos mismos. La segunda respuesta que podemos encontrar es la lisogénica, en la que el genoma del fago se integra en el de la bacteria, de forma que puede permanecer en este estado estacionario bastante tiempo hasta que se produzca el ciclo lítico. Este proceso es similar a la integración o desintegración del factor F, aunque la diferencia es que en la transducción, la integración del profago siempre es en el mismo punto del





cromosoma bacteriano, mientras que el factor F podía integrarse en más de un punto determinado. Podemos encontrar transducción especializada y generalizada, estando relacionadas con el ciclo que acabamos de ver.

3. CONJUGACIÓN Tenemos una cepa receptora junto con material genético que aporta otra célula, de forma que a partir de ahí, puede producirse la conjugación, que es la transferencia de material; aunque para que sea viable, debe darse la recombinación gracias al proceso del entrecruzamiento. El intercambio genético no tiene lugar entre dos genomas completos como ocurre en eucariota, sino que, tiene lugar entre un genoma completo (F-) que se denomina endogenote, y otro incompleto, del donante, denominado exogenote. Obtendremos un merocigoto (diploide parcial). La genética bacteriana es la genética de la merocigosis. Para que la recombinación dé algún cromosoma viable (que podrá ser circular), debe producirse un número par de entrecruzamientos, puesto que si no, no obtendremos ningún producto viable, sino un cromosoma largo lineal y extraño, parcialmente diploide. Si se da este número par de entrecruzamientos, obtendremos dos productos, uno que se perderá durante el crecimiento celular y otro que será viable. Producción del proceso: podemos usar los datos de la conjugación interrumpida para realizar un mapa con frecuencias de recombinación, usando la conjugación, primero tenemos que asegurarnos de que los marcadores han pasado al cromosoma receptor, teniendo en cuenta que gracias al gradiente de transferencia natural, pasan con mayor frecuencia y facilidad, aquellos marcadores que se encuentran más cerca del punto de entrada. Esto es debido a que el apareamiento entre las bacterias suele interrumpirse espontáneamente, de forma que la transferencia de los marcadores suele ocurrir en el orden en que estos están presentes en el DNA a partir del punto de inicio de la transferencia del mismo factor F. Nosotros seleccionamos para un determinado marcador, teniendo que controlar qué marcadores pasan, pudiendo estimar que se produce un punto de entrecruzamiento hacia el último marcador. Podemos





deducir el orden de los genes que entran gracias a las frecuencias relativas de recombinantes en cruzamientos recíprocos entre los genotipos parentales. Podemos encontrar procesos relacionados con la conjugación, tales como la sexducción, en el que se usan elementos F´ para crear diploides parciales. El F´ es un caso de factor F modificado, encontrándose en algunas cepas Hfr . Podemos obtener estirpes F´ con fragmentos muy grandes del cromosoma bacteriano. Los factores F´ son más fáciles de recombinar porque poseen más puntos para recombinar.

FISIOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA CONJUGACIÓN Podemos distinguir en la conjugación dos grandes fases:  Contactos

entre células F + (o, en su caso, Hfr) y F--;

 Transferencia

del ADN.

CONTACTOS ENTRE CÉLULAS F + Y F-+

Las células F (o las Hfr) forman de 1 a 10 pelos sexuales (repasar aquí lo que se dijo oportunamente en el cap. 11 sobre este tipo de pelos, que son distintos de las fimbrias de tipo adhesivo). El pelo interacciona específicamente, a través de su punta, con un --

receptor de la célula F (concretamente, parece ser que se trata de la proteína OmpA, de la membrana externa). En los cruces se ha visto que más que parejas de cruce existen agregados de cruce, donde varias células de ambos tipos (hasta unas 20) se encuentran relacionadas por contactos directos. Las cosas ocurren de la siguiente manera: +

Una célula F contacta por medio de la punta de su pelo F con el receptor de superficie --

de una F El pelo F se va despolimerizando desde su base, lo cual provoca la apariencia --

de que se va retrayendo. En ese movimiento de retracción, la célula F se va acercando +

a la F . Cuando el pelo se termina de desintegrar, las células se ponen en contacto directo pared-pared. Se forma un puente conjugativo que pone en contacto los citoplasmas de ambas células Las parejas o agregados de cruce se estabilizan por la --

acción de los genes traN y traG del plásmido F, y de ompA de la célula F . La proteína producida por traD (localizada en ambas membranas, citoplásmica y externa) parece que facilita el transporte del ADN a la célula receptora. Tras cierto tiempo de conjugación, el agregado se desagrega de forma activa. Un fenómeno interesante, que tiene que ver con las interacciones entre superficies celulares: se trata de la exclusión superficial, y consiste en un sistema por el que se evita +

+

que las células de tipo F puedan actuar como receptoras frente a otras F . Se sabe que la acción de dos genes del plásmido F realiza esta función:





traT : su producto se sitúa en la membrana externa, impidiendo la formación de



+

contactos con pelos sexuales de otra célula F . traS: su producto, situado en la membrana citoplásmica, evita la entrada de ADN



+

--

Otro fenómeno que se puede observar en los cruces F x F es la zigosis letal. Ocurre +

--

cuando la proporción de células F es muy superior a la de F (p. ej., de 10:1). En este caso, las células receptoras pueden morir, debido a que están siendo modificadas en muchos puntos de su superficie por numerosos contactos con células +

F .

TRANSFERENCIA Y PROCESAMIENTO DEL ADN CONJUGATIVO +

--

La transferencia de ADN desde una célula F a una F es un proceso especial de replicación asimétrica por círculo rodante. 

Una de las dos cadenas parentales del plásmido F pasa a la célula receptora, replicándose en ella;



La otra cadena parental se queda en el donador, sirviendo a su vez como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Esto explica porqué las células F

+

+

siguen siendo F tras la conjugación. Por lo tanto, la transferencia de ADN no implica que la doble hélice de F desaparezca del donador para aparecer en el receptor, sino que al final, ambos miembros de la pareja poseen un plásmido F completo. Resumiendo

el

modelo,

la

transferencia

conjugativa del plásmido F ocurre de la siguiente manera: 

En

la

célula

+

F,

una

endonucleasa

específica codificada por uno de los genes tra reconoce y corta en una de las cadenas

de

la

secuencia

oriT del

plásmido. 

La cadena así cortada sej ve desplazada por una helicasa codifica por otro gen tra del plámido.



Los

productos

de

otros

genes

tra

transfieren la cadena cortada al receptor. Al parecer, los extremos de esa cadena permanecen "anclados" a otra proteína Tra (es

decir,

durante

el

proceso

nunca





quedan extremos libres como tales).

Transferencia de ADN por conjugación entre plásmidos.

PLÁSMIDOS RECOMBINADOS: Los plásmidos son excelentes vectores de clonaje. Puede ser "cortado" con una ó dos enzimas de restricción ó puede incorporársele un fragmento de ADN que ha sido previamente cortado usando mas mismas enzimas de restricción. Los plásmidos así modificados se los denomina plásmidos recombinados. En éste estado, se los introduce entonces en una bacteria donde serán replicados.

EMARCADOR DE SELECCIÓN: Es crucial el poder distinguir entre las colonias que contienen los plásmidos recombinados de aquellas que contiene ya sea plásmidos no recombinados o que no contienen ningún plásmido. Varios métodos existen para realizar ésta distinción y se basan en el uso de un marcador de selección. En el ejemplo de abajo por ejemplo, el marcador de selección es la ampicilina.

A.

EL INSERTO DE UN SEGMENTO DE ADN EXTRANJERO EN UN PLÁSMIDO.





B.

TRANSFORMACIÓN DE BACTERIAS POR EL PLÁSMIDO. C.

SELECCIÓN DE BACTERIAS TRANSFORMADAS. CUALIDADES DE UN VECTOR DE CLONADO Los plásmidos deben ser pequeños y de replicación con control relajado. La mayoría de los plásmidos en uso contienen un replicón derivado del plásmido pMB1, inicialmente aislado de una muestra clínica. En condiciones normales de cultivo, se encuentra un mínimo de 15 a 20 copias de plásmido que contienen el replicón en cada célula bacteriana. Deben contener marcadores genéticos particulares, como gens de resistencia a antibióticos ó el gen que codifica la ß-galactosidasa. Deben contener uno ó más sitios de restricción únicos en una región que no sea esencial para la replicación del plásmido.

Si es posible, debe tener sitios de restricción únicos en los gens codantes de marcadores selectivos. Esos marcadores son inactivados cuando en ellos se inserta un fragmento de ADN extranjero.

VII.

REPLICACIÓN DE LOS PLÁSMIDOS

Como dijimos, los plásmidos son replicones, es decir, unidades de replicación autónoma, pero ello no significa que codifiquen toda la maquinaria para su propia replicación. De hecho, la mayoría de los plásmidos sólo codifican unas pocas proteínas para este fin, y aprovechan la maquinaria de replicación de la bacteria huésped (ADN polimerasas, ligasas, primasas, etc.),





que actúa sobre unas secuencias del plásmido denominadas secuencias oriV , donde tiene lugar el inicio de esa replicación. Cada tipo de plásmido se replica por uno de dos principales tipos de mecanismos: 

Modelo de replicación en

(theta): comienza por la separación de las dos cadenas

en el sitio oriV , creando una estructura que se parece a la letra griega

 (theta).

En

algunos plásmidos, la replicación es unidireccional (sólo hay una horquilla de replicación, que avanza a lo largo de la molécula, hasta que vuelve al sitio oriV, en el que las dos moléculas hijas se separan). Otros plásmidos se replican en

 por

un

modelo bidireccional (dos horquillas de replicación de sentidos opuestos, que se encuentran cerca de la mitad de la molécula). La replicación en

 es

frecuente en

plásmidos de bacterias Gram-negativas. 

Modelo de replicación en s (sigma), o modelo del círculo rodante: una de las dos cadenas es rota a nivel de oriV , de modo que el extremo 3’ suministra el cebador para la replicación de la “cadena adelantada”. La cadena desplazada (cadena “menos”) funciona como cadena retrasada (“lagging”) y debe ser replicada a partir de sitios de cebado especiales. Este tipo de replicación es frecuente en plásmidos de bacterias Gram-positivas.

REGULACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS La regulación del número medio de copias de cada plásmido en cada bacteria es una propiedad característica dependiente de cómo se controla el inicio de replicación, siendo diferentes los mecanismos en los plásmidos de alto número de copias (con control relajado) y en los plásmidos de bajo número de copias (de control estricto). 

En general, los plásmidos de control relajado tienen mecanismos que inhiben el inicio de replicación sólo cuando el número de copias ha llegado a un cierto nivel.



En cambio, los plásmidos de control estricto tienen mecanismos que logran que sólo se repliquen una vez o un pequeño número de veces en cada ciclo celular.

REPARTO DE LAS COPIAS A LAS CÉLULAS HIJAS Muchos plásmidos poseen sistemas de reparto (= partición), que tienden a asegurar que una vez que el plásmido ha sido replicado, cada una de las células hijas va a recibir al menos una copia. A falta de un tal sistema, y si el reparto fuera aleatorio, de vez en cuando, las propias fluctuaciones de la segregación aleatoria harían que parte de la progenie no recibiera una copia, con lo que quedaría curada de ese plásmido. El reparto de las copias a las células hijas se suele deber a las llamadas funciones par , que están cerca de los genes rep y de la zona ori . Se trata de cortas secuencias de ADN que de





alguna manera aún no aclarada, debe unirse a alguna zona de la membrana de la bacteria que se duplica durante la división celular, de modo que cada copia, unida a una de esas zonas, se segrega a una célula hija.

VIII.

PLÁSMIDOS Y MAMÍFEROS

1. PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN EN MAMÍFEROS Se pueden utilizar plásmidos para la expresión de clones de ADNc en mamíferos. El ADNc se inserta en el sitio de clonaje. El plásmido se multiplica en la E.coli utilizando para la selección un gen de resistencia a la ampicilina. El plásmido así preparado se inserta en las células de mamíferos utilizando los métodos de asemblaje ya descritos como cuando se usa la E.coli.

Promotor, intrones y cola poly (A): La figura aquí muestra uno de ésos plásmidos. La mayoría de los gens de mamíferos son monocistrónicos. En la práctica eso significa que cada gen tiene su propio inductor/promotor y su cola poly(A). La adición de un intrón (una chimera de un intrón de la ß-globina y de IgG) a lo largo del sitio de clonaje fa cilita la transcripción. Los promotores que se utilizan son de origen viral (cytomegalovirus y Simian virus 40 ó SV40), que son promotores fuertes. Cada gen termina por una cola poly(A).

Dos genes de selección: El gen de resistencia a la ampicilina sirve para la propagación del vector en las bacterias. El gen de resistencia a la neomicina sirve para seleccionar las células de mamíferos transfectadas. Las células de mamíferos son insensibles a la neomicina. En contra, el aminoglycósido G418 es tóxico para los procariotas y los eucariotas. Las células eucariotas transfectadas con el pCInéo sin embargo resisten al G418.





Transfecciones transitorias y estables: Se denomina transfección transitoria aquella en la que el plásmido no ha sido integrado a uno de los cromosomas eucarióticos. Se habla de transfección estable cuando el plásmido se ha integrado a uno ó más cromosomas eucariotas. La transfección se puede realizar utilizando los métodos procariotas. Los transfectantes son seleccionados añadiendo G418 al medio de cultivo. Para obtener transfectantes estables, se cultiva simplemente las células varias semanas en presencia de G418. Es necesario sin embargo verificar de vez en cuando que las células no han eliminado el inserto ó que sólo conservan el gen de resistencia.

Cotransfección: La Cotransfección es la transfección simultánea de varios plásmidos. Mediante la cotransfección se puede verificar si la transfección se ha realizado correctamente. Para lograrlo se cotransfecta un plásmido cuya presencia es verificada por una reacción rápida y simple que indica que el plásmido de interés ha sido bien transfectado. Se puede también cotransfectar plásmidos complementarios: la proteína codificada por una condición de expresión que es dependiente de otra.

IX.

ENFERMEDADES RELACIONADAS A LOS PLÁSMIDOS BASES GENÉTICAS DE LA RESISTENCIA BACTERIANA Debido a que muchos plásmidos R son trasnsmitibles, incluso intergenéticamente, su presencia en una enterobacteria intestinal representa su potencial transmisión a una cepa patógena que entre en contacto con la cepa resistente. Es por eso que los plásmidos R representan un grave peligro para la salud humana y animal.

ENZIMAS

La bacteria produce enzimas que escinden y destruyen los antibióticos.





PARED DE LA CÉLULA

La pared de la bacteria aumenta de espesor e impide por efecto rebote la penetración del fármaco en el interior de la célula.

TRANSFERENCIA GENÉTICA DE PLÁSMIDOS

La bacteria desarrolla capacidad para mutar. Las mutaciones confieren al germen resistencia a los antibióticos y esta característica se transfiere a otros microorganismos a través de segmentos de DNA llamados plásmidos.



La resistencia a los antibióticos ha sido encontrada en gérmenes patógenos causantes de enfermedades tales como: tifoidea, meningitis, gonorrea, Leiomiomatosis, Nefritis Hereditaria, Dermatofibrosarcoma, Enfermedad de von Willebrand, entre otras.



Uretritis: La uretritis puede ser causada por bacterias o virus. Las mismas bacterias que causan las infecciones urinarias (E. coli) y algunas enfermedades de transmisión sexual (clamidia, gonorrea) pueden llevar a que se presente uretritis. Las causas virales de la uretritis incluyen el virus del herpes simple y el citomegalovirus.



Epidermólisis Ampollosa Distrófica : Es un grupo de trastornos hereditarios en los que se desarrollan ampollas en la piel como respuesta a una lesión menor.





X. CONCLUSIONES

1.

En general, los plásmidos no son esenciales para la supervivencia de bacterias, sino que pueden sin embargo codificar una variedad amplia de determinantes genéticos, que permiten que sus anfitriones bacterianos sobrevivan mejor en un ambiente adverso o compitan mejor con otros microorganismos que ocupan el mismo lugar ecológico.

2.

La importancia médica de los plásmidos que codifican para la resistencia antibiótica, tan bien como rasgos específicos de la virulencia se ha documentado y demostró bien el papel importante juego genético bacteriano de estos elementos en naturaleza.

3.

El análisis molecular y genético de plásmidos bacterianos condujo a los conceptos básicos tales como "el operon" y "el replicon"

4.

En microorganismos patógenos, los plásmidos que contribuyen directamente a la autogénesis microbiano en plantas y animales.

5.

Una de las características que guardan plásmidos en la vanguardia de la microbiología es su capacidad de llevar y de transmitir los genes que codifican resistencia a los compuestos antimicrobianos. La resistencia a los antibióticos ha sido encontrada en gérmenes patógenos causantes de enfermedades tales como: tifoidea, meningitis, gonorrea y otras. Actúan proporcionando la información necesaria para destruir el antibiótico o para circunvalar el bloqueo que produce el antibiótico en la vía metabólica bacteriana.



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