I.
JUDUL PERCOBAAN
: Penentuan Kadar Asam Amino dalam
Sampel II.
HARI/TANGGAL HARI/TANGGA L PERCOBAAN PERCOBAA N
: 4 November 2014
III. TUJUAN
- Menentukan asam amino yang terdapat dalam sampel dengan kromatografi kertas IV. DASAR TEORI 1. Asam Amino
Asam amino adalah
senyawa organik yang memiliki gugus fungsional
karboksil (-COOH) dan amina (biasanya -NH2). Dalam biokimia seringkali pengertiannya diperse mpit: mpit: keduanya terikat pada satu atom karbon (C) yang sama (disebut atom C "alfa" atau α) α). Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina memberikan sifat basa. sifat basa. Dalam Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik: bersifat amfoterik: cenderung menjadi asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi karena asam amino mampu menjadi zwitter-ion. zwitter-ion. Asam amino termasuk golongan senyawa yang paling banyak dipelajari karena salah satu fungsinya sangat penting dalam organisme, dalam organisme, yaitu yaitu sebagai penyusun protein. penyusun protein. Struktur Struktur asam amino secara umum adalah satu atom C yang mengikat empat gugus: gugus amina (NH2), gugus karboksil gugus karboksil (COOH), atom hidrogen atom hidrogen (H), dan satu gugus sisa (R, dari residue) residue) atau disebut juga gugus atau rantai samping yang membedakan satu asam amino dengan asam amino lainnya. Gambar asam amino
Atom C pusat tersebut dinamai atom C α ("C-alfa") sesuai dengan penamaan senyawa bergugus karboksil, yaitu atom C yang berikatan langsung dengan gugus karboksil. Oleh karena gugus amina juga terikat pada atom C α ini, senyawa tersebut merupakan asam α-amino. α-amino. Asam amino biasanya diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia rantai samping tersebut menjadi empat kelompok. Rantai samping dapat membuat asam amino bersifat asam lemah, basa lemah, hidrofilik jika polar, dan hidrofobik hidrofobik jika nonpolar. nonpolar.
Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organik non polar seperti pada eter, aseton dam kloroform.Sifat asam amino ini berbeda dengan asam karboksilat maupun dengan asam amino.Asam karboksilat alifatik maupun aromatik yang terdiri atas beberapa atom karbon umunya kurang larut dalam air tetapi tet api larut pelarut organik (Poedjiadi, 1994). Kecuali glisin, dengan R = H, asam amino α memiliki pusat stereogenik pada karbon α. Dengan demikian, demikian, semua asam amino α kecuali glisin bers ifat aktif optis.
Asam amino dengan satu gugus amino amino dan satu sat u gugus karboksil lebih baik digambarkan sebagai struktur ion dipolar.
Gugus amino diprotonasi dan hadir sebagaiion amonium, sedangkan gugus karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai ion karboksilat. Struktur dipolar ini konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki titik leleh yang agak tinggi (bahkan yang paling sederhana, glisina, meleleh pada suhu 233°C) dan kelarutannya dalam pelarut organik relatif rendah). Asam amino bersifat amfoterik, artinya berperilaku sebagai asam dan mendonasikan proton pada basa kuat, atau dapat juga berperilaku sebagai basa dan menerima proton dari asam kuat.Perilaku ini dinyatakan dalam kesetimbangan berikut untuk asam amino dengan satu gugus amino dan satu gugus karboksil (Hart, 2003). Fungsi biologi asam amino
1. Penyusun protein, Penyusun protein, termasuk termasuk enzim. enzim. 2. Kerangka dasar sejumlah senyawa penting dalam metabolisme dalam metabolisme (terutama vitamin, hormon dan asam nukleat). 3. Pengikat ion logam penting yang diperlukan dalam dalam reaksi enzimatik (kofaktor).
Kegunaan dari beberapa asam amino
Asam amino esensial adalah asam amino yang tidak bisa diproduksi sendiri oleh tubuh, sehingga harus didapat dari konsumsi makanan. Asam amino non-esensial adalah asam amino yang bisa diprosuksi sendiri oleh tubuh, sehingga memiliki prioritas konsumsi yang lebih rendah dibandingkan dengan asam amino esensial. Asam amino esensial bersyarat adalah kelompok asam amino non-esensial, namun pada saat tertentu, seperti setelah latihan beban yang keras, produksi dalam tubuh tidak secepat dan tidak sebanyak yang diperlukan sehingga harus didapat dari makanan maupun suplemen protein.
Jenis-jenis asam amino essensial :
1.
Leucine (BCAA = Branched-Chain Amino Acids = Asam amino dengan rantai bercabang)
2.
Membantu mencegah penyusutan otot
Membantu pemulihan pada kulit dan tulang
Isoleucine (BCAA = Branched-Chain Amino Acids = Asam amino dengan rantai bercabang)
3.
Membantu mencegah penyusutan otot
Membantu dalam pembentukan sel darah merah
Valine (BCAA = Branched-Chain Amino Acids = Asam amino dengan rantai bercabang)
Tidak diproses di organ hati, dan lebih langsung diserap oleh otot
Membantu
dalam
mengirimkan
asam
amino
lain
(tryptophan,
phenylalanine, tyrosine) ke otak 4.
Lycine
Kekurangan lycine akan mempengaruhi pembuatan protein pada otot dan jaringan penghubugn lainnya
Bersama dengan Vitamin C membentuk L-Carnitine
Membantu dalam pembentukan kolagen maupun jaringan penghubung tubuh lainnya (cartilage dan persendian)
5.
Tyyptophan
Pemicu serotonin (hormon yang memiliki efek relaksasi)
Merangsang pelepasan hormon pertumbuhan
6.
Methionine
Prekusor dari cysteine dan creatine
Menurunkan kadar kolestrol darah
Membantu membuang zat racun pada organ hati dan membantuk regenerasi jaringan baru pada hati dan ginjal
7.
8.
Threonine
Salah satu asam amino yang membantu detoksifikasi
Membantu pencegahan penumpukan lemak pada organ hati
Komponen penting dari kolagen
Biasanya kekurangannya diderita oleh vegetarian
Phenylalanine
Prekursor untuk tyrosine
Meningkatkan daya ingat, mood, fokus mental
Digunakan dalam terapi depresi
Membantuk menekan nafsu makan
Jenis-jenis asam amino non-essensial :
1.
2.
Aspartic Acid
Membantu mengubah karbohidrat menjadi energy
Membangun daya tahan tubuh melalui immunoglobulin dan antibody
Meredakan tingkat ammonia dalam darah setelah latihan
Glyicine
Membantu tubuh membentuk asam amino lain
Merupakan bagian dari sel darah merah dan cytochrome (enzim yang terlibat dalam produksi energi)
3.
Memproduksi glucagon yang mengaktifkan glikogen
Berpotensi menghambat keinginan akan gula
Alanine
Membantu tubuh mengembangkan daya tahan
Merupakan salah satu kunci dari siklus glukosa alanine yang memungkinkan otot dan jaringan lain untuk mendapatkan energi dari asam amino
4.
Serine
Diperlukan untuk memproduksi energi pada tingkat sel
Membantuk dalam fungsi otak (daya ingat) dan syaraf
2. Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis adalah metode analisis kualitatif dan kuantitatif yang didasarkan pada distribusi diferensial komponen sampel diantara dua fasa, fasa diam dan fasa bergerak. a.
Fasa dian KLT
Fasa diam KLT terbuat dari serbuk halus dengan ukuran 5 sampai 50 µm. Serbuk halus ini dapat berupa suatu adsorben, suatu penukar ion , suatu pengayak molekul, atau dapat merupakan penyagga yang dilapisi suatu cairan. Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel alumina, dan serbuk selulosa. (Soebagio, 2003) b.
Fasa gerak KLT
Fasa gerak dalam kromatografi lapis tipis adalah eluen.dalam kromatografi ini, pengelusi eluen naik sejalan dengan polaritasnya. Eluen pengembang dapat berupa pelarut tunggal dan campuran pelarut dengan susunan tertentu. Pelarut pelarut pengembang harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Terdapatnya sejumlah kecil air atau zat pengotor lainnya dapat menghasilkan kromatografi yang tidak diharapkan. (Soebagio, 2003) 3.
Analisis Asam Amino
Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupunkuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut. Analisis asam amino dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa metode, salah satu diantaranya kromatografi lapis tipis. Pemisahan asam amino dengan metode inididasari oleh kemampuan suatu jenis asam amino yang terlarut dalam suatu campuran pelarut tertentu pada fase stationer, dimana suatu zat terlarut yang
terdistribusi dalam dua pelarut dengan volume yang sama dan tidak saling bercampur sehingga perbandingan konsentrasi zat terlarut didalam kedua pelarut seimbang (Patong, 2007).Asam amino yang diperoleh dari larutan hidrolisis protein adalah asam amino α. Artinya, gugus amino berada pada atom karbon α, yaitu disebelah gugus karboksil. Kromatografi adalah suatu metode analitik untuk pemurnian dan pemisahan senyawa-senyawa organik dan senyawa anorganik.Metode ini berguna untuk fraksionasi campuran kompleks dan pemisahan suatu senyawa-senyawa yang sejenis.Pada tahun 1941, Martin dan Synge mengembangkan kromatografi partisi, sedangkan Gordon menemukan kromatografi kertas. Kromatografi partisi terutama dilakukan pada kromatografi kertas (Khopkar, 1984). Dalam semua teknik kromatografi, zat terlarut yang akan dipisahkan bermigrasi sepanjang suatu kolom (atau sepanjang sepert i dalam kromatografi kertas atau lapisan tipis, padanan fisika dari suatu kolom), dan tentu saja dasar pemisahan terletak dalam berbeda-bedanya laju dari migrasi untuk zat terlarut yang berlainan. Kita dapat membayangkan migrasi dari zat yang terlarut sebagai suatu resultan dua faktor, satu cenderung untuk menggerakkan zat terlarut, dan yang lain untuk menghambatnya (Day dan Underwood. 2002). Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan fisik, dimanakomponenkomponen yang dipisahkan didistribusikan di antara dua fasa, salahsatu fasa tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas,yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut sepanjang landasan stasioner. Fase stasioner dapat berupa padatan maupun cairan, sedangkan fase bergerak dapat berupa cairan maupun gas. Dalam semua teknik kromatografi, zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom, dan tentu saja laju pemisahan terlatak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk larutan yang berbeda. Zat terlarut di dalam suatu fasa gerak mengalir pada suatu fasa diam. Zat terlarut yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak yang lebih besar akan tertahanlebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang afinitasnya terhadap fasagerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan
demikiansenyawa-senyawa dapat dipisahkan komponen demi komponen akibat perbedaanmigrasi di dalam fasa gerak dan fasa diam. Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.Fasa diam berupa padatan/cair yang dilapiskan pada padatan/gel. Pada pemisahan ini senyawasenyawa yang akan dipisahkan ditempatkan dalam sistem yang bergerak mengalir melalui suatu sistem yang diam, dan selama pengaliran fasa gerak akan terjadi pelarutan, adsorpsi, dan penguapan. Pada prinsipnya semua cara pemisahan kromatografi mengalami proses yang sama yaitu adanya distribusi komponenkomponen dalam fasa diam dan fasa gerak dengan memanfaatkan perbedaan perbedaan sifat-sifat fisik komponen yang akan dipisahkan. Perbedaaan sifat tersebut diantaranya :
Kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut
Sifat untuk bertaut (adsorpsi) yang berbeda satu sama lain dengan suatu serbuk bahan padat
Sifat dapat menguap pada temperatur yang berbeda satu sama lain.
Pelarut akan naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa senyawasenyawa dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam pelarut tertentu itu, misalnya pelarut organik, akan terbawa naik lebih jauhdaripada yang sukar larut. Setelah pelarut mencapai bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat dari pelarut kemudian dibiarkan kering dengan sendirinya diudara. Dengan proses ini, asam-asam amino akan terpisah satu dengan yang lain,dan dengan menyemprotkan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebutakan tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino yang terpisah itu.
Reaksi ninhidrin yang digunakan untuk mendeteksi dan menduga asam amino secara kuantitatif dalam jumlah kecil. Pemanasan dengan ninhidrin berlebih menghasilkan produk berwarna ungu pada semua asam amino yang mempunyai gugus α amino bebas, sedangkan produk yang dihasilkan oleh protein berwarna kuning, karena pada molekul ini terjadi substitusi gugus α amino.Pada kondisi yang sesuai intensits warna yang dihasilkan dapat dipergunakan untuk mengukur asam amino secara kolorimetrik.Metode ini amat sensitif bagi pengukuran konsentrasi asam amino (Lehninger, 1982). Asam-asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin membentuk suatu produk yang disebut ungu Ruhmann. Reaksi ini biasanya digunakan sebagai uji bercak untuk mendeteksi adanya asam amino pada kertas kromatografi. Adapun reaksi umum secara keseluruhannya, adalah sebagai berikut :
+
ninhidrin
anion ungu + RCHO + CO 2 + 3H2O + H+
Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik, dapat digunakandua fase pelarut, misalnya pasangan fenol – air, n-butanol – air atau dengan tigafase pelarut, misalnya n-butanol – asam asetat – air, dimana setiap jenis asam amino mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Pada kromatografi partisi, kertas digunakan sebagai pendukung air (fase stasioner). Campuran
komponen-komponen
yang
akan
dipisahkan
ditempatkan
pada
fasestasioner (zat padat), kemudian dihubungkan dengan fasa mobile (zat cair), makafasa mobile akan melalui fasa stasioner, sambil membawa komponenkomponen tersebut, dimana perbandingan kecepatan perpindahan komponen dengan kecepatan permukaan fasa mobile merupakan dasar untuk mengidentifikasi komponen-komponen yang dipisahkan. Perbandingan kecepatan ini disingkat dengan Rf.
=
Nilai Rf asam amino : Asam amino
Rf
Alanin
0,38
Arginin
0,20
Asparagin
0,5
Asam aspartat
0,24
Sistein
0,4
Glutamin
0,13
Asam glutamat
0,30
Glisin
0,26
Histidin
0,11
Isoleusin
0,72
Leusin
0,73
Lisin
0,14
Metionin
0,55
Fenilalanin
0,68
Prolin
0,43
Serin
0,27
Treonin
0,35
Tirosin
0,45
Tripsin
0,66
Valin
0,61
V.
Alat dan Bahan Alat
-
Kertas kromatografi ukuran 4x10cm
(1 buah)
-
Pipa kapiler
(1 buah)
-
Bejana / gelas kimia besar
(1 buah)
-
Botol semprot (Ninhidrin)
(1 buah)
-
Oven
(1 buah)
-
larutan sampel
(2 tetes pipa kapiler)
-
asam asetat glacial
(6 mL)
-
n-butanol
(25 mL)
-
akuades
(25 mL)
-
larutan asam amino
-
HCl pekat
VI. Alur Percobaan
1. Pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak)
25 mL n-butanol + 6 mL asam asetat glasial + 25 mL aquades - Dicampurkan sambil dikocok - Larutan tersebut ditempatkan dalam lemari kromatografi dan dijenuhkan dengan uapnya Hasil
2. Penentuan komponen asam amino Kertas kromatografi
- Diteteskan 4 macam larutan (A,B,C, dan sampel) berda mpingan dengan jarak 1 cm, larutan ujung 0,5 cm dari pinggir kertas - Tiap – tiap tetesan dikeringkan sebelum tetesan berikutnya diletakkan diatasnya - Besar noda tidak lebih dari 0,4 cm Kertas kromatografi bernoda - Kertas digantungkan di dalam lemari kromatografi untuk penjenuhan - Setelah penjenuhan tercapai baru digunakan elusi. Dimana dapat dipakai kromatografi menurun atau kromatografi mendaki Kertas kromatografi setelah dielusi
- Setelah elusi berjalan baik, kertas dikeluarkan, batas larutan ditandai dengan pensil, kertas disemprot dengan ninhidrin o - Dikeringkan pada 105 – 110 C selama 5 menit, noda asam amino akan terlihat - Hitung nilai Rf lalu ditetapkan komponen asam amino dengan membandingkan harga Rf pada asam amino standar Hasil
VII. Hasil Pengamatan Perlakuan
Hasil Pengamatan
Dugaan atau Reaksi
Kesimpulan
1. Pembuatan Larutan Pengelmusi (Fasa Gerak)
25 mL n-butanol + 6 mL CH3COOH glasial + 25 mL aquades
- Dicampurkan sambil dikocok - Larutan tersebut ditempatkan dalam lemari kromatografi dan dijenuhkan dengan uapnya
n-butanol : tidak berwarna
CH3COOH glasial: tidak
Eluen yang digunakan
berwarna
terdiri dari n-butanol, +
Aquades : tak berwarna
Setelah dicampurkan : tidak
dan air dengan
berwarna dan keruh
perbandingan
25 : 6 : 25
Eluen : tidak berwarna
Hasil
2.Menentukan Komponen Asam Amino Kertas kromatografi - Diteteskan 4 macam larutan (A,B,C, dan sampel) berdampingan dengan jarak 1 cm, larutan ujung 0,5 cm dari pinggir kertas - Tiap – tiap tetesan dikeringkan sebelum tetesan berikutnya diletakkan diatasnya - Besar noda tidak lebih dari 0,4 cm Kertas kromatografi bernoda - Kertas digantungkan di dalam lemari kromatografi untuk penjenuhan - Setelah penjenuhan tercapai baru digunakan elusi. Dimana dapat dipakai kromatografi menurun atau kromatografi mendaki Kertas kromatografi setelah dielusi
harga Rf pada asam amino sta ndar
Nilai Rf dari sampel
Larutan A : tidak berwarna
Larutan B : tidak berwarna
Larutan C : tidak berwarna
Setelah disemprotkan ninhidrin timbul
sampel merupakan
Larutan Sampel : tidak
noda ungu karena asam amino bereaksi
larutan yang
berwarna
dengan ninhidrin.
mengandung asam
adalah 0,3116, artinya
glutamat.
Kertas kromatografi : perak Ninhidrin : larutan tidak berwarna
Larutan ditotolkan di kertas kromatografi setelah kering totolannya tidak berbekas
Setelah dioven 105o-110oC terbentuk noda berwarna
Nilai Rf : A : (2,9 cm / 7,7 cm) = 0,3766 B : (2,7 cm / 7,7 cm) = 0,3506 C : (2,4 cm / 7,7 cm) = 0,3116 Sampel : (2,4cm / 7,7 cm) =
Hasil
Ninhidrin : Sebagai penampak noda
ungu - Setelah elusi berjalan baik, kertas dikeluarkan, batas larutan ditandai dengan pensil, kertas disemprot dengan ninhidrin o - Dikeringkan pada 105 – 110 C selama 5 menit, noda asam amino akan terlihat - Hitung nilai Rf lalu dit etapkan komponen asam amino dengan membandingkan
CH3COOH glasial,
Reaksi :
2.Menentukan Komponen Asam Amino Kertas kromatografi - Diteteskan 4 macam larutan (A,B,C, dan sampel) berdampingan dengan jarak 1 cm, larutan ujung 0,5 cm dari pinggir kertas - Tiap – tiap tetesan dikeringkan sebelum tetesan berikutnya diletakkan diatasnya - Besar noda tidak lebih dari 0,4 cm Kertas kromatografi bernoda - Kertas digantungkan di dalam lemari kromatografi untuk penjenuhan - Setelah penjenuhan tercapai baru digunakan elusi. Dimana dapat dipakai kromatografi menurun atau kromatografi mendaki Kertas kromatografi setelah dielusi
harga Rf pada asam amino sta ndar
Nilai Rf dari sampel
Larutan A : tidak berwarna
Larutan B : tidak berwarna
Larutan C : tidak berwarna
Setelah disemprotkan ninhidrin timbul
sampel merupakan
Larutan Sampel : tidak
noda ungu karena asam amino bereaksi
larutan yang
berwarna
dengan ninhidrin.
mengandung asam
adalah 0,3116, artinya
glutamat.
Kertas kromatografi : perak Ninhidrin : larutan tidak berwarna
Larutan ditotolkan di kertas kromatografi setelah kering totolannya tidak berbekas
Setelah dioven 105o-110oC terbentuk noda berwarna ungu
- Setelah elusi berjalan baik, kertas dikeluarkan, batas larutan ditandai dengan pensil, kertas disemprot dengan ninhidrin o - Dikeringkan pada 105 – 110 C selama 5 menit, noda asam amino akan terlihat - Hitung nilai Rf lalu dit etapkan komponen asam amino dengan membandingkan
Ninhidrin : Sebagai penampak noda
Nilai Rf : A : (2,9 cm / 7,7 cm) = 0,3766 B : (2,7 cm / 7,7 cm) = 0,3506 C : (2,4 cm / 7,7 cm) = 0,3116 Sampel : (2,4cm / 7,7 cm) =
Hasil
0,3116 Artinya : Larutan A : Alanin Larutan B : treonin Larutan C : Asam glutamat Larutan Sampel : Asam glutamat
Reaksi :
0,3116 Artinya : Larutan A : Alanin Larutan B : treonin Larutan C : Asam glutamat Larutan Sampel : Asam glutamat
VIII. Pembahasan
Pada percobaan penentuan kadar asam amino dalam sampel ini tujuannya adalah untuk menentukan asam amino yang terdapat dalam sampel dengan kromatografi kertas. Kromatografi sendiri adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fase gerak (mobile). Pada percobaan ini dilakukan identifikasi asam amino pada suatu sampel dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT), dan dilakukan perhitungan nilai Rf tiga asam amino yang digunakan dan asam amino sampel yang akan diidentifikasi. Percobaan ini dilakukan dengan dua tahap, yaitu pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak), dan menentukan komponen asam amino. Pada pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak), hal pertama yang dilakukan adalah membuat eluen dari bahan 25 mL n-butanol, 6 mL asam asetat glasial dan 25 mL aquades. Ketiga bahan tersebut dicampur dan dikocok. Kemudian ditempatkan di dalam lemari kromatografi. Setelah itu, larutan pengemulsi dijenuhkan dengan uapnya. Penjenuhan lemari kromatografi ini bertujuan untuk menghilangkan uap air atau gas
VIII. Pembahasan
Pada percobaan penentuan kadar asam amino dalam sampel ini tujuannya adalah untuk menentukan asam amino yang terdapat dalam sampel dengan kromatografi kertas. Kromatografi sendiri adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fase gerak (mobile). Pada percobaan ini dilakukan identifikasi asam amino pada suatu sampel dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT), dan dilakukan perhitungan nilai Rf tiga asam amino yang digunakan dan asam amino sampel yang akan diidentifikasi. Percobaan ini dilakukan dengan dua tahap, yaitu pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak), dan menentukan komponen asam amino. Pada pembuatan larutan pengemulsi (fasa gerak), hal pertama yang dilakukan adalah membuat eluen dari bahan 25 mL n-butanol, 6 mL asam asetat glasial dan 25 mL aquades. Ketiga bahan tersebut dicampur dan dikocok. Kemudian ditempatkan di dalam lemari kromatografi. Setelah itu, larutan pengemulsi dijenuhkan dengan uapnya. Penjenuhan lemari kromatografi ini bertujuan untuk menghilangkan uap air atau gas lain yang mengisi fase penyerap (adsorben) yang akan menghalangi laju eluen, dengan kata lain kondisi lemari kromatografi supaya jenuh untuk memudahkan eluen bergerak. Larutan pengemulsi yang dihasilkan terdiri dari campuran antara larutan n-butanol, asam asetat glasial, dan air dengan perbandingan 25 : 6 : 25. Pemilihan pengemulsi ini karena ketiga komponen larutannya memiliki kepolaran yang berbeda. Urutan kepolarannya adalah kepolaran air > n-butanol > asam asetat glasial. Adanya perbedaan kepolaran inilah yang digunakan sebagai dasar dalam pemisahan asam amino, karena asam amino tertentu memiliki kemampuan larut pada pelarut dengan kepolaran yang berbeda-beda. Ketika dicampur, ketiga larutan tersebut tidak menimbulkan perubahan warna, karena ketiga komponen pelarut tersebut tidak dapat saling bercampur karena memiliki kepolaran yang berbeda sehingga tetap jernih (tidak berwarna), karena masing-masing dari ketiga larutan itu (tidak berwarna). Reaksi yang terjadi pada tahap ini adalah reaksi esterifikasi yang ditunjukkan sebagai berikut :
+
Pada percobaan penentuan komponen asam amino, yang dilakukan adalah menyiapkan kertas kromatografi dengan ukuran 4x10 cm yang dioven selama 10 menit. Hal ini bertujuan untuk mengurangi kadar air pada kertas kromatografi dan untuk mengaktifkan daya serap kertas kromatografi terhadap eluen. Dalam hal ini, absorben selulosa diaktifkan dengan pemanasan sehingga air yang diserap dapat dikeluarkan, dan kertas kromatografi tersebut dapat mengikat molekul lain sehingga noda yang didapatkan tampak jelas. Kertas kromatografi tersebut kemudian diberi batas atas dan batas
bawah
menggunakan
pensil
untuk
membatasi
totolan
dan
naiknya
eluen/pengemulsi sehingga dapat ditentukan nilai Rfnya. Batas atasnya sebesar 0,5 cm dari ujung atas kertas dan batas bawahnya 1 cm dari ujung bawah kertas. Setelah itu, kertas kromatografi diberi tanda dengan pensil sebagai tempat penotolan untuk 4 macam larutan yang diberi label A, B, C dan S yang berjarak 1 cm tiap totolan. Kemudian empat macam larutan (A, B, C, dan Sampel) yang masing-masing tidak berwarna dan belum diketahui jenis asam amino nya, diteteskan menggunakan pipa kapiler pada kertas kromatografi tadi secara berdampingan dengan jarak 1cm dan larutan ujung ada pada 0,5cm dari pinggir kertas. Tiap-tiap tetesan harus dikeringkan dahulu sebelum tetesan berikutnya diletakkan di atasnya. Setiap macam larutan, diteteskan sebanyak dua kali. Noda yang diteteskan hendaknya memiliki diameter tidak melebihi 0,4cm. Selanjutnya, kertas kromatografi dimasukkan ke dalam lemari kromatrografi yang telah dijenuhkan dengan uap pengemulsi dan ditutup dengan kaca. Setelah itu ditunggu sampai larutan pengemulsi bergerak sampai batas atas pada kertas kromatografi. Dalam proses kromatografi ini, fase diam adalah kertas kromatografi yaitu kertas saring dimana abdsorbennya adalah selulosa. Sedangkan fasa geraknya adalah larutan pengemulsi/eluennya. Prinsip dasar pemisahan dengan kromatografi kertas adalah perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Saat larutan bergerak ke atas pada kertas kromatografi secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino antara fase gerak dan fase diam yang teradsorbsi pada selulosa berlangsung
berulang-ulang. Saat larutan bergerak ke atas, asam amino akan terbawa oleh pergerakan eluen. Perbedaan kelarutan asam-asam
amino dalam eluen akan
mengakibatkan kecepatan pergerakan asam-asam amino yang berbeda pada kertas kromatografi tersebut. Asam amino yang lebih larut dalam eluen akan bergerak lebih cepat karena hanya tertahan kecil dalam fasa diamnya. Sedangkan asam amino yang lebih susah larut dalam eluen akan lebih lama tertahan pada fase diamnya, sehingga laju geraknya lebih lambat. Dengan adanya perbedaan pergerakan ini, asam amino-asam amino dapat dipisahkan. Pergerakan eluen tersebut dilakukan hingga eluen mencapai batas atas pada kertas kromatografi. Kelarutan asam amino dalam eluen tergantung dari sifat kepolarannya. Eluen yang digunakan dalam percobaan ini terdiri dari larutan n-butanol, asam asetat glacial, dan air dengan perbandingan 25:6:25. Dari pelarut-pelarut tersebut larutan yang bersifat paling polar adalah air, sedangkan kedua pelarut lainnya lebih bersifat non polar. Dari perbandingannya, eluen yang dipakai tersebut lebih bersifat non polar. Dalam proses kromatografi ini, partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan pengemulsi atau eluen. Asam amino yang bersifat nonpolar akan susah larut dalam molekul air yang bersifat polar yang ada pada eluen dan lebih sulit tertahan oleh kompleks selulosa-air pada fase diam. Oleh karenya, asam amino yan bersifat non polar tersebut akan mudah larut pada fase gerak yang bersifat non polar juga. Akibatnya asam amino yang bersifat non polar tersebut akan bergerak cepat bersama dengan fase gerak. Dengan demikian, sampel yang pergerakannya paling atas merupakan sampel yang paling larut dalam pelarut yang artinya bersifat paling non polar dibandingkan sampel asam amino lainnya, sehingga nilai Rf nya relatif tinggi. Sebaliknya, asam amino polar akan mudah larut dalam molekul air yang ada pada eluen dan kurang larut pada pelarut non polar lainnya. Sehingga asam amino tersebut akan lebih tertahan pada fase diam dan kompleks selulose-air. Akibatnya, pergerakannya lambat dan nilai Rf nya rendah. Dengan demikian, sampel yang pergerakannya hanya sampai bagian bawah kertas kromatografi merupakan sampel yang kurang dapat larut dalam pelarut yang artinya bersifat paling polar dibandingkan sampel asam amino lainnya. Ketika pelarut mencapai batas atas kertas proses dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai Rf masing-masing asam amino diidentifikasi.
Setelah eluen telah sampai pada tanda atas atas, kertas kromatografi dikeluarkan dan dikeringkan pada suhu 105 o-110oC selama 5 menit. Setelah pemanasan, noda asam amino tidak terlihat karena asam amino tidak berwarna. Oleh karena itu, digunakan ninhidrin agar noda yang muncul tampak pada kertas. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna khas ungu. Terbentuknya noda berwarna ungu ini disebabkan karena terjadinya reaksi antara hidrat dari triketon siklik (ninhidrin) dengan asam amino. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut :
Noda yang nampak dihitung jarak tempuhnya. Ternyata, masing- masing noda memiliki jarak tempuh sebagai berikut:
Larutan
Jarak tempuh noda
Larutan A
2,9 cm
Larutan B
2,7 cm
Larutan C
2,4 cm
Larutan Sampel
2,4 cm
Setelah dihitung jarak tempuh noda, dihitung pula nilai Rf nya dengan cara:
=
Dengan cara tersebut, didapatkan nilai Rf dari masing- masing larutan (A,B , C, dan Sampel) sebagai berikut: Larutan
Rf
Jenis Asam Amino
Larutan A
0,3766
Alanin
Larutan B
0,3506
Treonin
Larutan C
0,3116
Asam glutamat
Larutan Sampel
0,3116
Asam glutamat
Berdasarkan data di atas, masing-masing larutan yang memiliki Rf tersebut mengandung A = alanin, B= treonin, dan C= asam glutamat. Nilai Rf larutan sampel berkisar pada nilai Rf larutan C, hal ini berarti asam amino yang terkandung pada sampel sama dengan asam amino yang terkandung pada larutan C, yaitu asam amino asam glutamat. Struktur asam amino tersebut dapat dilihat pada gambar di bawah ini:
Pada data tabel diatas diketahui harga Rf
alanin> Rf treonin > Rf asam
glutamat. Hal ini dikarenakan alanin merupakan asam amino non-polar sehingga tidak menyukai air atau bersifat hidrofobik. Asam amino yang bersifat nonpolar (hidrofobik) ini akan susah larut dalam molekul air yang bersifat polar yang ada pada eluen dan lebih sulit tertahan oleh kompleks selulosa-air pada fase diam. Oleh karena itu, asam amino yan bersifat non polar tersebut akan mudah larut pada fase gerak yang bersifat non polar juga. Akibatnya asam amino yang bersifat non polar tersebut akan bergerak cepat bersama dengan fase gerak. Dengan demikian, sampel yang pergerakannya paling atas merupakan sampel yang paling larut dalam pelarut yang artinya bersifat paling non polar dibandingkan sampel asam amino lainnya, sehingga nilai Rf alanin paling t inggi dibandingkan dengan yang lainnya. Pada larutan B yang mengandung treonin memiliki nilai Rf yang lebih besar jika dibandingkan dengan asam glutamat. Hal ini dikarenakan treonin merupakan asa m amino polar yang tidak bermuatan sedangkan asam glutamat merupakan asam amino bermuatan negatif. Bila dilihat dari kepolarannya, asam amino yang bermuatan negatif akan lebih bersifat polar jika dibandigkan dengan asam amino yang tidak bermuatan. Hal ini bisa dilihat pada nilai Rf dari asam amino treonin dan asam glutamat. Asam amino treonin memiliki nilai Rf yang lebih besar dari pada asam glutamat. Hal ini berarti asam amino treonin bersifat lebih non-polar dari pada asam glutamat karena asam amino treonin yang bersifat non polar ini akan mudah larut pada fase gerak yang bersifat non polar juga. Akibatnya treonin yang bersifat non polar tersebut akan bergerak cepat bersama de ngan fase gerak. Dengan demikian, treonin memiliki nilai Rf lebih besar dari pada asam glutamat. Begitu pula sebaliknya, larutan C dan Sampel yang mengandung asam glutamat memiliki nilai Rf yang paling kecil bila dibandingkan dengan asam amino
yang lain. Hal ini dikarenakan asam glutamat memiliki sifat paling polar dibandingkan asam amino treonin dan alanin. Asam amino glutamat yang bersifat polar ini berarti dia lebih menyukai air atau yang biasa disebut sbeagai hidrofilik. Semakin polar suatu asam amino, maka akan semakin tinggi nilai Rf nya karena asam amino polar akan mudah larut dalam molekul air yang ada pada eluen dan kurang larut pada pelarut non polar lainnya. Sehingga asam amino tersebut akan lebih tertahan pada fase diam dan kompleks selulose-air. Akibatnya, pergerakannya lambat dan nilai Rf nya rendah. Dengan demikian, sampel yang pergerakannya paling lambat dan jaraknya paling kecil dengan batas bawah kertas kromatografi merupakan sampel yang kurang dapat larut dalam pelarut yang artinya bersifat paling polar dibandingkan sampel asam amino lainnya. Oleh karena itu, asam glutamat memiliki nilai Rf yang paling kecil diantara asam amino lainnya, yaitu alanin dan treonin.
IX. Kesimpulan
1. Didapatkan Nilai Rf sebagai berikut :
Rf noda A
= 0,3766 cm
Rf noda B
= 0,3506 cm
Rf noda C
= 0,3116 cm
Rf noda Sampel = 0,3116 cm
2. Larutan sampel mengandung asam amino asam glutamat karena nilai Rf noda sampel
= Rf noda C, yaitu bernilai 0,3116 yang berarti larutan sa mpel mengandung asam amino (asam glutamat).
Jawaban Pertanyaan
1. Apakah keuntungan dan kerugian dari metode pemisahan dengan kromatografi kertas? Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam.Fase gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Keuntungan :
Kromatografi kertas dua arah dapat digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahan substansi yang memiliki nilai R f yang sangat serupa.
Kerugian : Pelarut yang digunakan harus sesuai dengan sampe l yang akan digunakan. Misalnya ketika menggunakan pelarut polar, molekul-molekul po lar akan memiliki atraksi yang tinggi untuk molekul-molekul air dan kurang untuk pelarut yang non polar. Dan karenanya, cenderung untuk larut dalam lapisan tipis air sekitar serat lebih besar daripada pelarut yang bergerak. Karena molekul-molekul ini menghabiskan waktu untuk larut dalam fase diam dan kurang dalam fase gerak, molekul-molekul tidak akan bergerak sangat cepat pada kertas.
2. Apakah metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisa kuantitatif? Y a , kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisa kuantitatif.Kareana pada prinsipnyakromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi komponen-komponennya.Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan ataucairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas).Jadi, jenis kromatografi ini banyak di gunakan untuk identifikasi kualitatif maupun analisa kuantitatif.
3. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf? Rf merupakan nilai dari jarak relative pada pelarut. Harga Rf dihitung sebagai jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak tempuh oleh eluen ( fase gerak )untuk setiap senyawa. Faktor yang mempengaruhi harga Rf adalah jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat. Karena jarak tempuh relative pada pelarut adalah konstan untuk senyawa tertentu.
DAFTAR PUSTAKA
Fessenden. 1992. Kimia Organik jilid 2. Jakarta : Erlangga Lehninger. 1982. Dasar – dasar Biokimia. Surabaya : Erlangga Mahabbah.2011. PERCOBAAN III kromatografi kertas pada asam – asam amino.http://id.scribd.com/doc/53670991/PERCOBAAN-III-Biokimia-Kromatografi .(8 November 2014) Soebagio, dkk. 2003. COMMON TEXTBOOK KIMIA ANALITIK II. Malang : Jurusan Kimia Universitas Negeri Malang Tama. 2011. Asam amino. http://northma-tama.blogspot.com/2011/07/asam-amino.html (Diakses 8 November 2014) Taufik.2011. Rumus struktur asam amino. (8 November 2014) TIM. 2012. PETUNJUK PRAKTIKUM BIOKIMIA I . Surabaya : Unesa Press
LAMPIRAN PERHITUNGAN Perhitungan
Rf =
Rf A = Rf B = Rf C =
2,9 5,5 2,9 5,5 2,4 5,5
Rf Sampel =
= 0,3766
= 0,3506
= 0,3116 cm 2,4 5,5
= 0,3116
LAMPIRAN FOTO
Larutan A, B, C, dan Sampel (masing-masing tidak berwarna) yang akan ditotolkan pada plat KLT
Plat KLT dioven terlebih dahulu selama 10 menit untuk mengurangi kadar air yang terkandung di dalamnya
Plat KLT diberi tanda batas atas dan batas bawah serta diberi titik-titik untuk tempat penotolaan larutan A, B, C,
Penotolan Larutan A, B, C, dan Sampel pada plat KLT
Plat KLT yang telah ditotoli larutan dan sampel diletakkan dalam chamber yang telah berisi eluen
Noda asam amino nampak setelah disemprot dengan ninhidrin
