osmometria

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Osmometría Las medidas de las propiedades coligativas (concentración molar) de la disolución de un  polímero involucra el cálculo de las moléculas de soluto (polímero) en una cantidad dada de disolvente, la cual proporciona una medida en número de moléculas. La única propiedad coligativa que se mide sin problema en los polímetros de alto peso molecular es la presión osmótica. La presión osmótica parte de la utilización de una membrana semipermeable por la cual  pasan libremente las moléculas del disolvente. Las membranas reales sólo brindan una versión aproximada de la semipermeabilidad ideal, siendo la limitación el paso por medio de la membrana de cadenas del polímero de bao peso molecular. !ebido a que la presión osmótica depende de las propiedades coligativas " del número de  partículas, la medida de esta presión (osmometría) podría aplicarse a la determinación de la  presión osmótica de disolventes en relación con las desilusiones de los polímeros.

Osmómetros Los osmómetros son instrumentos creados para medir la presión osmótica entre un solvente " una solución, aunque en algunos casos también son empleados para determinar la osmolaridad de la soluciones (la concentración de los solutos causantes de la presión osmótica). #xisten di$erentes tipos de osmómetros%

&'smómetro estático &'smómetro dinámico &'smómetro de presión a vapor  &'smómetros de descenso crioscópico

La ultracentrifugación analítica consiste en un conunto de métodos (velocidad " equilibrio de sedimentación) que permiten la determinación del tamao, la $orma global aproximada, " el grado de omogeneidad de proteínas " otras macromoléculas biológicas en disolución. #stos métodos están especialmente adaptados para la detección " la caracterización cuantitativa de las interacciones (proporción de especies, estequiometría, reversibilidad " a$inidad) que dan lugar a la $ormación de compleos macromoleculares, inclu"endo las interacciones proteína&proteína, !*+& proteína " receptor&ligando -olett et al . (/001) Curr. Opin. Chem. Biol . 20%340&3415 Leboitz et al . (/00/) Protein Sci. 22%/016&/0675 8inton (/000) Exp. Mol. Med . 4/%2&95 :ivas et al. (2777) Methods 27%273& /2/;.

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La Unidad posee una ultracentrífuga analítica modelo XL-I equipada con dos sistemas ópticos de detección: UV-VIS de longitud de onda variable e interferencia de aleig!" #sta $ltima t%cnica permite el estudio de macromol%culas en disoluciones con alta absorción en el UV-VIS"

&esde su creación en '((), esta Unidad del *I+ !a dado apoo cientíco-t%cnico en la caracteri.ación biofísica de proteínas  sus interacciones a un gran n$mero de grupos de investigación del *SI*, universidades, empresas, así como a otros centros de investigación nacionales  e/tran0eros" #sta Unidad cuenta con el asesoramiento  la colaboración de grandes e/pertos internacionales en estas metodologías" En 2009 el laboratorio consiguió la certifcación conorme a la norma ISO9001 con el código ER-02862009"

'7002.

La dispersión de luz dinámica proporciona in$ormación rápida " complementaria a la obtenida mediante ultracentri$ugación analítica, aportando dos grandes ventaas $rente a otros métodos analíticos como el bao volumen de muestra requerido (29&39 ?l) " la rapidez en la obtención de los resultados (@20 min). La técnica permite conocer el grado de  polidispersidad de una muestra, determinar el coe$iciente de di$usión traslacional de las especies macromoleculares en disolución " calcular su radio idrodinámico. #ste equipo (modelo !"naAro 8>BC, D"att =nc.) tiene un maneo mu" sencillo (cubeta) con un sistema de regulación de la temperatura por Aeltier (3&10E<) " se puede utilizar para el análisis de di$erentes tipos de macromoléculas como proteínas, polisacáridos " micelas lipídicas.

La ultracentrifugación

*onsiste en someter una me.cla !omogenei.ada a una velocidad de rotación mu alta, de forma que, a velocidades m1s lentas, sedimentan los componentes m1s grandes,  a velocidades maores, los componentes m1s peque2os" #s decir, que aunque las masas de diferentes partículas sean mu similares, sedimentan en tiempos distintos" #l instrumento utili.ado es la ultracentrífuga"

3456&6S &# UL57*#85I9U7*I;8 787L<5I*7 #8 #L *I+: *onsideraciones generales  aspectos pr1cticos" !elocidad de Sedimentación

9undamentos" #n un e/perimento de velocidad de sedimentación las macromol%culas se someten a un campo centrífugo elevado tal que la fuer.a de centrifugación es maor que la de difusión, por lo que e/iste un transporte neto de material !acia el fondo de la celda" #s un m%todo !idrodin1mico de transporte que permite fraccionar las macromol%culas en base a las diferencias en coeciente de sedimentación =una función de la masa, la densidad  la forma macromolecular>" 7plicaciones" La primera información que estos e/perimentos nos dar1n es el grado de !omogeneidad o !eterogeneidad de las especies macromoleculares que sedimentan" #ste fraccionamiento tambi%n puede ser mu $til para detectar  cuanticar la estequiometría  la anidad de comple0os macromoleculares" &e esta información podemos tambi%n estimar la forma apro/imada de macromol%culas en disolución" 7n1lisis preliminar" *1lculo de coecientes de sedimentación: programas S#&9I5  SV#&+# =accesibles en los enlaces relacionados indicados en la p1gina ?eb del Servicio>" 7spectos pr1cticos" @ La absorbancia de la muestra frente a su correspondiente tampón !a de ser menor de ',A =unidades de absorción a la longitud de onda de traba0o>" #s necesario poner en cada celda de la ultracentrífuga el tampón de muestra =que se usa como referencia>" @ Se recomienda !acer el e/perimento a varias concentraciones =al menos tres>" @ Volumen de muestra: ABB-)BB CL" @ 5iempo apro/imado del e/perimento: D !"

E"uilibrio de Sedimentación

9undamento" #n la modalidad de equilibrio de sedimentación las muestras se someten a campos centrífugos moderados !asta que se igualan las fuer. as opuestas de centrifugación  difusión =condición de equilibrio>" #n estas condiciones, las especies macromoleculares se distribuen formando un gradiente de concentración que se caracteri.a porque a> no varía con el tiempo, b> es independiente de las propiedades !idrodin1micas =forma> de las macromol%culas  c> depende $nicamente de la masa molecular de la especie que sedimenta" #ste $ltimo punto es mu importante, a que implica que esta t%cnica permite estudiar procesos de asociación en los que no es posible separar físicamente las diferentes especies moleculares presentes =por e0emplo, interacciones d%biles>" Si conocemos la dependencia con la composición de la masa molecular, es posible modelar dic!a dependencia en el conte/to de diferentes esquemas de asociación" 7plicaciones" #sta t%cnica permite la determinación de la masa molecular de las especies macromoleculares que sedimentan, así como la detección  el an1lisis cuantitativo =en t%rminos de estequiometría, anidad  reversibilidad> de las asociaciones que dan lugar a la formación de comple0os macromoleculares en disolución" 7n1lisis preliminar" *1lculo de masas moleculares promedio: programas #E7SS6*  XL7#E, paquete de programas de an1lisis que se suministran con el equipo,  S#&FG75 =accesibles en el sitio 7S3+, ver enlaces relacionados>" 7spectos pr1cticos" @ La absorbancia de cada muestra en la celda, medida frente a su correspondiente tampón, !a de estar en el intervalo de B"'-B"H unidades de absorción a la longitud de onda elegida =preferiblemente en un m1/imo de absorción, en el intervalo entre DDB  HBB nm>" #s necesario poner en cada celda de medida de la ultracentrífuga el tampón de muestra =que se usa como referencia>" @ La medida de la absorbancia se suele reali.ar en un espectrofotómetro con una cubeta de paso óptico de ' cm" Fara correlacionar esta medida con la se2al que se detectar1 en las celdas de la ultracentrífuga debe tenerse en cuenta el paso óptico de dic!as celdas" 7> Las pie.as centrales que se emplean m1s !abitualmente tienen un paso óptico de '"D cm" #n este caso, una absorbancia de '"B en el espectrofotómetro daría '"D en la ultracentrífuga" +> Si las muestras dan una absorbancia superior a B"H pueden emplearse celdas de paso óptico de B"A cm =donde una absorción de '"B U7, medida espectrofotom%tricamente, daría una se2al en la ultracentrífuga de B"A>" @ Se recomienda !acer el e/perimento a varias concentraciones de muestra =al menos tres>  a varias velocidades angulares =al menos dos>" @ Volumen de muestra: normalmente B CL, aunque puede ser de HB-'DB CL =a maor volumen maor precisión en el an1lisis, pero a costa de que el tiempo necesario para alcan.ar el equilibrio de sedimentación aumenta considerablemente>" @ 5iempo apro/imado del e/perimento: 'J-D) ! =B CL>" 3uestras l1biles: se pueden reducir estos tiempos usando procedimientos e/perimentales especícos"

*romatografía de permeación en gel La cromatografía de permeación en gel, tambi%n conocida como cromatografía de e/clusión es una variante de la *L7# que consiste en una columna cromatogr1ca empacada de tal manera que las partículas de dic!o empacamiento tienen diferentes tama2os de poros o de redes de poros con el n de que las mol%culas de soluto sean retenidas o e/cluidas bas1ndose en su forma  tama2o  no en el peso molecular" +a0o este entendido, las mol%culas de maor tama2o no caben dentro de los poros  son arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son e/cluidas  eluen en el volumen de Kcama de vacío de la fase móvil" For el contrario, las partículas de menor tama2o eluen !asta el nal porque tiene m1s espacio de columna que recorrer debido a un fenómeno de difusión !acía los poros que tienen accesibles" Las mol%culas de tama2os intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a la cantidad de poros por los que puedan pasar"

#mpaquetamientos de columna" #/isten distintos tipos de empacamientos columna" #ntre ellos est1n los polímeros macromoleculares semirígidos, los entrecru.ados, las sílices rígidas ó las de Kporo controlado" Los materiales semirígidos se !inc!an ligeramente se debe tener cierto cuidado en su uso a que se limitan a una presión de ABBpsi" Las cuentas de poliestireno parcialmente sulfonado que tienen un tama2o usual de JCm, son buenas para usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados son compatibles con sistemas no acosos" 6tro tipo de empacamiento !idrofílico poroso es preparado mediante una polimeri.ación por suspensión de metacrilato de D-!idro/ietilo con dimetacrilato de etileno" #stos empacamientos resisten presiones de !asta ABBBpsi  pueden ser usados con sistemas acuosos  una amplia gama de disolventes org1nicos polares" &isolventes" La cromatografía de e/clusión requiere un solo disolvente durante el an1lisis en el cual se pueda disolver la muestra" #l $nico inconveniente que pude presentarse con los disolventes es la relación de viscosidades" *uando la viscosidad de la muestra inectada diere muc!o con la viscosidad de la fase móvil se pueden dar, una distorsión en los picos cromatogr1cos  cambios anómalos en los tiempos de retención" La cromatografía de permeación en gel =F*>  la cromatografía de e/clusión por tama2o =S#*> son t%cnicas utili.adas para medir la distribución del peso molecular de los polímeros naturales  sint%ticos" #sta característica inM ue en muc!os de los par1metros físicos de los materiales tales como la fuer.a, la rigide.  la resistencia química" La F*  S#* son t%cnicas cromatogr1 cas que separan cadenas de polímeros individuales en función de su tama2o en la disolución  no en función de sus características químicas" La F* se utili.a para describir el an1lisis de polímeros en disolventes org1nicos, tales como el tetra!idrofurano" For su parte, la S#* se emplea para describir el an1lisis de polímeros en agua  disolventes basados en agua, tales como disoluciones tampón" 7mbas t%cnicas constituen el $nico m%todo probado para obtener una completa comprensión de la distribución del peso molecular de los polímeros" 3ecanismos de F*NS#* @ Las mol%culas de polímeros se disuelven en soluciones para formar espirales cuo tama2o depende de su peso molecular @ #spirales de polímeros introducidas al M u0o de elución a trav%s de una columna @ *olumna rellena con perlas porosas insolubles con una estructura porosa bien de nida @ 5ama2o de los poros similar al de las espirales de polímeros @ Las espirales de polímeros se difunden dentro  fuera de los poros @ #l resultado es una elución basada en el tama2o: las espirales de maor tama2o primeroO las de menor tama2o, despu%s @ Separación por tama2o convertida a separación por peso molecular mediante el empleo de una curva de calibración formada por el uso de patrones de polímeros

*6375679<7 &# #X*LUSI;8 Las t%cnicas cromatogr1cas est1n basadas en la separación de los componentes de una me.cla, aprovec!ando la distribución de dic!os componentes entre dos fases: la fase móvil  la fase estacionaria" eneralmente, mediante el empleo de una columna que contiene la fase estacionaria, los compuestos a separar son arrastrados por la fase móvil  son anali.ados a su paso por el detector" Si la fase móvil es un gas, da lugar a la cromatografía de gases, mientras que si es un líquido, se denomina cromatografía líquida" La cromatografía de e/clusión es un tipo de cromatografía líquida en la cual la fase estacionaria es sólida  la fase móvil es líquida" Se utili.a el t%rmino de K*romatografía de e/clusión por tama2o"  5ambi%n se denomina Kcromatografía de permeabilidad sobre gel =F*> o de permeación en gel" Su principal aplicación es la separación de las mol%culas en función de su tama2o con la nalidad de estudiar el peso molecular  distribución de los polímerosA>" #l inicio de esta t%cnica se estableció a partir de la preparación de microesferas de geles de compuestos org1nicos  biológicos solubles en agua, los cuales se aplicaron a la separación de

polímeros disueltos en disolventes org1nicos utili.ando un relleno de poliestireno" #n consecuencia, la t%cnica se denominó permeabilidad en gel =F*>" 7ctualmente esta tecnología es r1pida  permite traba0ar a presiones elevadas mediante el empleo de nuevos rellenos con una distribución de poros mu precisa  una resistencia mec1nica apropiada para altas presiones" Las principales características de esta t%cnica cromatogr1ca son: P 9ase estacionaria es inerte, por lo que la columna no se desactiva" P La muestra no interacciona químicamente con la fase estacionaria, ni con la fase móvil" P Los solutos son generalmente sustancias de peso molecular elevado =maores de DBBB>" &ependiendo de su medida  estructura, %stos se retienen o se eluen a trav%s de la columna" 8o se pueden emplear gradientes de elución en la fase móvil" #n la gura ' se muestra el esquema típico de un equipo F*"

#l relleno de columna se comporta como un tami. o ltro dónde se distinguen tres tipos de mol%culas: - 3ol%culas permeables: mol%culas peque2as que entran el interior del relleno poroso, pasan lentamente  quedan retenidas en el poro" - 3ol%culas fraccionables: mol%culas intermedias que entran de manera parcial en el relleno poroso" - 3ol%culas e/cluidas: mol%culas de medida superior al poro del relleno que no entran en el relleno  pasan r1pidamente por %l" La gura D muestra el esquema correspondiente al relleno de la columna"

#n lo que respecta a la fase estacionaria, se utili.a un material poroso con las siguientes características: uniformidad en la granulometría de las esferas  en la medida de los porosO estabilidad química =sobre todo al pG  a la temperatura>O m1/ima inercia frente a los compuestos a separarO preparación r1pida  sencillaO  resistencia mec1nica a las alta presiones" #stos materiales pueden clasicarse seg$n su constitución química =inorg1nicos u org1nicos>, Me/ibilidad de su estructura =!inc!ables o rígidos>, microestructura =aerosoles, /erosoles o mi/tos>  origen =natural, sint%ticos o combinados>" Fara seleccionar la fase estacionaria !a que tener en cuenta el tipo de separación a efectuar =resolución total o separación en dos fracciones>, la selectividad del gel respecto a los productos que se quieren separar  la distribución de pesos moleculares de los componentes de la muestra" La característica principal del eluente empleado como fase móvil es que debe arrastrar los diferentes componentes, sin interaccionar ni con la muestra ni con la fase estacionaria" For tanto, la muestra debe ser soluble en la fase móvil para evitar interferencias en los resultados" 7dem1s de la estabilidad química, !a otros par1metros a tener en cuenta: P 7 maor viscosidad, menos reproducibles son los resultados" P #l aumento de la temperatura favorece la resolución de la muestra, a que la difusión se produce con maor facilidad" P Los valores ba0os de fuer.a iónica favorecen las interacciones iónicas soluto fase estacionaria, mientras los valores altos favorecen las interacciones !idrofóbicas" P #l pG inMue en la ioni.ación de los solutos  grupos activos de la fase estacionaria" P 7l aumentar el Mu0o del eluente se produce una disminución de la ecacia de la columna" Las columnas pueden ser de vidrio borosilicato o de material pl1stico transparente" 8o se utili.an columnas met1licas para evitar fenómenos de cat1lisis, que pueden provocar degradaciones del gel o de la muestra" Las columnas =gura A> deben ser f1ciles de limpiar e instalar  deben tener un di1metro de partículas uniforme" 8o tienen que disponer de vol$menes muertos que puedan producir fenómenos de disolución o de difusión de la muestra =se recomienda que el volumen muerto no supere el B,'Q del volumen del gel>"

La dispersión de lu. din1mica =&LS> es una t%cnica óptica utili.ada para estimar la FS& de un l1te/, requiri%ndose adem1s resolver un problema inverso mal condicionado =FI3*>" #n general, las t%cnicas ópticas se caracteri.an por su ba0a resolución, que impide discriminar tama2os de partícula mu cercanos" Una forma de incrementar la resolución de la &5F estimada es combinando mediciones independientes" #n

 =3onterroso et al" =DB'A> Methods J(: A)(RAHDO del *astillo et al. =DB''> Biochemistry , JB: '(('RDBBA> !ttps:NNboos"google"com"m/NboosT id96oba7s)p)*WpgF7'B'WlpgF7'B'WdqosmometriapolimerosWsourceblWo tsDqYXvFpIvWsig.Z0Z[V+dcXdYZArSEndFp?')n3W!lesWsaXWvedBa!U[#?iut e0LbGZ7!U&E*\[GaJ*3#EH7#I.77]vonepageWqosmometria QDBpolimerosWffalse !ttps:NNboos"google"com"m/NboosT id(Y^/nV).s*WpgF7)'WdqEU##SL76S363#5I7W!lesWsaXWredirYes c]vonepageWqEU#QDB#SQDBL7QDB6S363#5I7Wffalse !ttps:NNboos"google"com"m/NboosT idAUc!6iLvcE*WpgF7AJBWdq6S363#5I7#8F6LI3#6SW!lesWsaXWredir  Yesc]vonepageWq6S363#5I7QDB#8QDBF6LI3#6SWffalse !ttps:NNboos"google"com"m/NboosT idvL(Erp6[sEc*WpgF7^BWdq6S363#5I7W!lesWsaXWredirYesc]vonepa geWq6S363#5I7Wffalse !ttp:NNtecnopolimeros"blogspot"m/NDB'DNB'Ncaracteri.acion-de-macromoleculas"!tml !ttps:NNboos"google"com"m/NboosT id96oba7s)p)*WpgF7'')WdqUL57*#85I9U7*I68#8F6LI3#6SW!lesW saXWredirYesc]vonepageWqUL57*#85I9U7*I68QDB#8 QDBF6LI3#6SWffalse Introducción a la química de los polímetros Escrito por Raimond B. Seymour,Charles E. Carraher 

!ttp:NNiespoetaclaudio"centros"educa"0cl"esNsitioNuploadNBJ"ultracentrifugacion"pdf  !ttp:NN???"cib"csic"esNrepositorioYbdNdepartamentoNJN!tmlNU*7-*I+"'AoctDBBJ"pdf  !ttp:NN???"agilent"comNcsNlibrarNselectionguideNpublicNJ((B-HH#S"pdf  !ttp:NNdepa"fquim"unam"m/NamdNarc!iveroN3"*romatogrcosYH^BB"pdf 

#aracteri$ación de %acromol&culas La caracteri.ación de los polímeros comprende diferentes m%todos  t%cnicas de evaluación de par1metros" &e acuerdo a lo que se requiera en cada caso podemos distribuirlas de la siguiente forma:

'&cnica o e"ui(o

)(licación t*(ica

#om(osición "u*mica + microestructura 7n1lisis elemental"

*omposición química"

esonancia magn%tica nuclear de alta resolución =G83>  de carbono trece"

3icroestructura =ramicaciones  secuencia en copolímeros>"

#spectroscopia de infrarro0o"

*omposición química" amicación  cristalinidad en algunos polímeros" #structura química 7n1lisis de compuestos vol1tiles en polímeros  formulaciones"

*romatografía de gases"

*aracteri.ación por degradación t%rmica, de polímeros" Fure.a de monómeros  disolventes" Identicación  cuanticación de aditivos vol1tiles"

,esos moleculares + su distribución 6smometría de 3embrana"

Fromedio num%rico de peso molecular =3n>" Fromedio pesado de peso molecular =3?>"

&ispersión de la lu."

Far1metros estadísticos de tama2o =radio de giro  distancia de e/tremo a e/tremo>" 9orma de macromol%culas en solución" &eterminación de ramicaciones"

Ultracentrifugación"

Fromedios de peso molecular 3.  3.'" Fromedio viscosim%trico de peso molecular 3v"

Viscosimetría de soluciones

Viscosidad intrínseca" amicaciones"

*romatografía de permeación en gel =F*>"

&istribución de pesos moleculares"

*orrelaciones"

&iferentes promedios"

Fromedio de peso molecular"

Orden en estado sólido + estructura

#structuras cristalinas" 3icroscopia electrónica de barrido =S#3>"

#structuras de fracturas" #structuras en perles  películas" #studio de inclusiones, aglomerados  !uecos en matrices polim%ricas"

3icroscopia electrónica de transmisión =3#5>"

#studio de la forma de cristales" #structuras brilares" Forcenta0es de cristalinidad" 3edida de dimensiones de cristales"

&ifracción de raos X =&X>"

#studio de fases en me.clas polim%ricas" 7gregados moleculares"

#om(ortamiento t&rmico  5emperaturas de transición en polímeros" *alorimetría diferencial de barrido =&S*>"

&eterminación de capacidades calorícas" #stabilidad t%rmica" *ristalinidad" #valuación de antio/idantes" *uanticación de sustancias vol1tiles"

7n1lisis termogravim%trico =57>"

#studios de termoestabilidad" *uanticación de ceni.as" *ambios de volumen en función de la temperatura"

7n1lisis t%rmico-mec1nico =537>"

 5ransiciones de fase" 3ódulo tensil" Funto de reblandecimiento"

7n1lisis din1mico mec1nico =&37>"

#studio de propiedades viscoel1sticas de polímeros" &eterminación de transiciones de segundo orden"