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Journal of Bacteriology, 1969 de septiembre, p. 720-729 Copyrigt ! 1969 "ociedad #mericana de $icrobiolog%a Complejo Nitrato Reductasa de Escherichia coli K-12: Participación de formiato deshidrogenasa específica citocromo !" componentes en nitrato reducción#
J&"' ()*+-'(('(# #/ J. #. /'$&"" /epartment ofBiology, )niersity )niersity of California, "an /iego, a Jolla, California 9207 (eceied for publication 9 June 1969. "e estudi3 la participaci3n de distintas desidrogenasas de formiato y componentes del citocromo en la reducci3n de nitratos por 'scericia coli. a actiidad de formiato desidrogenasa presente en e4tractos preparados a partir de c5lulas inducidas por nitrato de la cepa fr fue actia con arios aceptores de electrones, incluyendo aul de metileno, metosulfato de fenaina y iroleno de bencilo. Ciertos mutantes ue son incapa incapace cess de reduc reducir ir el nitrat nitratoo ten%an ten%an niele nieless ba8os ba8os o indete indetecta ctable bless de actii actiidad dad de formia formiato to desidrogenasa ensayados con aul de metileno o metosulfato de fenaina como aceptor de electrones. /e nuee de estos mutantes, cinco produ8eron gas cuando se crecieron anaerobicamente sin nitrato y pose%an una acti actii ida dadd de form formia iato to des desid idro roge gena nasa sa liga ligada da a iti itile leno no de benc bencil ilo, o, lo u uee sugi sugier eree u uee dist distin inta tass desidrogenasas de formiato participan en los sistemas de nitrato reductasa y dim5rica. os otros cuatro mutantes formaron poco gas cuando se crecieron anaerobicamente en ausencia de nitrato y carec%an de la decil-formiato desidrogenasa ligada a iroleno de bencilo as% como la actiidad unida al aul de metileno o al metosulfato de fenaina. 'l citocromo b1 presentin nitrato inducida por las c5lulas se distingue por sus propiedades espectrales y su control gen5tico de los principales componentes del citocromo b1 de las c5lulas aer3bicas y de las c5lulas cultiadas anaerobically en ausencia de nitrato. 'l citocromo b espec%fico de nitrato se redu8o completa y r:pidamente en 1 mm de formiato pero no se redu8o en 1 mm de nicotinamida adenina dinucle3tido reducido; 'l ascorbato redu8o s3lo una parte del citocromo b1 ue se redu8o por formiato. Cuando se a
2, 2?. 'n tales c5lulas, se induce la formate des desid idro roge gena nasa sa,, el cito citocr crom omoo b1 y la nitr nitrat atoo redu reduct ctas asaa a nie niele less rela relati tia ame ment ntee alto altoss en comparaci3n con los de las c5lulas cultiadas en aus ausenc encia de nitra trato >2, 17 17,, 2 2??. 'st 'stos tres tres componentes est:n presentes en las fracciones de membrana >6? y an sido parcialmente purificados como una unidad a partir de e4tractos celulares >@?. Aina Ainalm lmen ente te,, los los muta mutant ntes es de '. coli coli u uee son son incapa incapace cess de produc producir ir nitrit nitritoo a partir partir de nitrat nitratoo >mutantes (7? carecen de formiato /esidrogenasa o nitrato reductasa o combinaciones de estas actiidades y el citocromo b >1, 16, 17, 22?. a propue propuesta sta de ue formia formiato to desid desidrog rogena enasa sa y citocr citocromo omo bi son compon component entes es espec% espec%fic ficos os del sistem sistemaa de reducc reducci3n i3n de nitrat nitratoo plante planteaa alguna algunass
cuestiones importantes sobre la relaci3n de esta %a con otras %as de transporte de electrones 'n '. coli. a formamida desidrogenasa debe ser tambi5n un componente del sistema de idrogenidasa >1?, as% como de la formiato o4idasa. 'stas 'stas funcio funciones nes m=ltip m=ltiples les de la desid desidrog rogena enasa sa formiato an sido preiamente reconocidas, y se a sugerido ue al menos dos formaciones distintas de desidrogenasas, en forma de part%culas y solubles, est:n formadas por '. coli >, ?. a participaci3n del citocromo b en la reducci3n del nitrato crea una situaci3n a=n m:s comple8a, ya ue el cito itocrom cromoo b1 es un unoo de los los pri princip ncipaales les citocr citocromo omoss presen presentes tes en las c5lula c5lulass aer3bi aer3bicas cas y anaerobias de '. coli y por lo tanto debe funcionar en otros sistemas de transporte de electrones >, 10, 1@?. 'n la actualidad no se conoce si el citocromo B1 componentes est:n inolucrados en diferentes %as de electrones o en u5 grado interact=an tales %as. Dara Dara defini definirr los compon component entes es del comple comple8o 8o de nitr nitrat atoo redu reduct ctas asaa y su rela relaci ci3n 3n con con otra otrass %as %as metab3licas, se estudiaron los eentos biou%micos inolucrados en la reducci3n de nitratos en el '. coli de tipo sala8e y en un n=mero de mutantes (.
"e presenta la eidencia de ue una forma espec%fica de desidrogenasa, dos componentes distintos del citocromo b1 y la nitrato reductasa son componentes obligatorios de un comple8o de nitrato reductasa en '. coli. $#E'(*#'" F $GE&/&" as cepas de '. coli usadas en estos estudios, fr y #B2102, y los mutantes (- deriados de ellos se describieron preiamente >17?. Eodas las cepas se cultiaron en un medio completo ue conten%a una base de sal >20?, cloridrato de tiamina > g H ml?, caldo nutriente >/ifco? al 0,I y glucosa al 1I >esteriliada por separado?. Cuando se indic3, el medio se suplement3 con nitrato de potasio al 1I y formiato s3dico al 0,I. Dara medir las actiidades, los cultios se cultiaron en matraces con braos laterales del tubo de lett a 7KC en un bap 6,@ 3 7,?, y (esuspendido en el mismo tamp3n. 'sta suspensi3n se us3 como tal >c5lulas enteras? o se congel3 durante la noce a -1KC antes de su uso >c5lulas congeladas-descongeladas?. os e4tractos libres de c5lulas se prepararon mediante tres tratamientos de 1 segundos cada uno en un sonificador Branson de 10 c, seguido de centrifugaci3n a 000 4 g durante 10 minutos para eliminar c5lulas enteras. a forma desidrogenasa se midi3 con diferentes aceptores de electrones utiliando un radioensayo o un ensayo espectrofotom5trico descrito anteriormente >17?, o mediante el siguiente procedimiento manom5trico usando un aparato de Oarburg. 'n el compartimento principal se colocaron 0,2 ml de celdas o e4tracto, 10 Pmol de aceptor de electrones y 0,0 P$ de tamp3n de fosfato de potasio >p 6,@? en un olumen total de 2,7 ml; 0, se colocaron pocillos de formiato en el brao lateral. os frascos y los man3metros se laaron con 2 y se euilibraron a 7KC antes de inclinar el formiato en el compartimiento principal. a actiidad se e4pres3 como microlitros de C&2 eolucionado por minuto por miligramo de prote%na. o se produ8o C&2 en ausencia de receptores de electrones a
/e tamp3n de fosfato de potasio >p 6,@?, 1,0, burbu8as de iroleno de bencilo, 60 Q mu l de formiato s3dico y c5lulas o e4tracto en un olumen final de ,0 ml. os tubos se en8uagaron con 2, y la reducci3n del itileno de bencilo se sigui3 por el uso de un color%metro lett con un filtro de 660 nm. 'l desarrollo del color no fue lineal y, por lo tanto, los resultados se e4presaron cualitatiamente. a idrogenidasa f3rmica se ensay3 manom5tricamente siguiendo el desprendimiento de idr3geno del formiato >1?. a producci3n de gas por cultios en crecimiento se ealu3 obserando la acumulaci3n de gas en iales inertidos sumergidos en tubos del medio de cultio. a nitrato reductasa se ensay3 con formiato o iologeno de metilo reducido como donadores de electrones, como se describi3 anteriormente >17?. Con otros donantes de electrones se sigui3 el procedimiento utiliado con formiato, sustituyendo el donante de electrones por formiato. R os espectros de absorci3n de los citocromos se determinaron con un espectrofot3metro de grabaci3n de a simple construido y amablemente disponible por Oarren Butler en la )niersidad de California en "an /iego. a lu monocrom:tica de 1,0 nm de anco de banda fue proporcionada por un monocromador de re8illa Bausc S omb. a salida del fot3metro y un potenci3metro orientado al tambor de longitud de onda proporcionaron las se1 Pm de di:metro?, se congel3 en 2 l%uido, F se coloca en un matra de /eUar ue contiene 2 en el compartimento celular del instrumento. Dara la medici3n de la reducci3n absoluta # temperatura ambiente, se sigui3 el mismo procedimiento general, omitiendo el 2 l%uido. Dara determinar los espectros diferenciales, se utili3 un accesorio ue proporcion3 un a diidido. 'n este caso, se colocaron muestras id5nticas de ,0 ml en c5lulas de absorci3n de idrio >%a luminosa de 10 nm?. 'l contenido de una cubeta se o4id3 en8uagando con aire durante 0 segundos, y el otro se redu8o con ditionito s3dico s3lido Dara obtener el espectro reducido-menos-o4idado. os nieles de citocromo se calcularon como sigue. "e dibu83 una l%nea basal entre 0 y 70 nm, y se midi3 la altura del pico de la banda a desde esta l%nea de base. as unidades de densidad 3ptica se calcularon, y el niel de citocromo se e4presa como unidades de densidad 3ptica por miligramo de prote%na. a cin5tica de reducci3n y o4idaci3n del citocromo b1 se sigui3 con un espectrofot3metro de
longitud de onda doble #minco-Cance a KC oa temperatura ambiente. a prote%na se determin3 mediante el procedimiento de oUry et al. >12?.
('")E#/&" as propiedades generales del sistema de reducci3n de nitratos presentes en las cepas silestres utiliadas en estos estudios correspondieron a las descritas anteriormente >2, 6, @?. 'n las c5lulas inducidas por nitratos de las cepas fr, el formiato fue un donador de electrones m:s efectio para la reducci3n de nitratos ue la glucosa >Eabla 1?. 'n c5lulas congeladas-descongeladas o en e4tractos celulares, arios reactios act=an como donadores de electrones para la reducci3n de nitratos >Eabla 1?. 'l metil iolVgeno reducido, ue transfiere electrones directamente a la nitrato reductasa >21?, fue el donador de electrones m:s efica, pero el formiato fue del 0 al 0I tan actio como el metil iolVgeno reducido en las c5lulas congeladasdescongeladas. a reducci3n de nitrato con formiato como donador de electrones fue completamente inibida por n-eptil idro4iuinolina--34ido >&W&? 0,01 m$, mientras ue un aumento de 100 eces en la concentraci3n del inibidor no afect3 a la reducci3n de nitrato con metil iolVgeno o ascorbato reducido como el donador de electrones. a formiato desidrogenasa presente en las c5lulas inducidas por nitrato de la cepa fr utili3 arios aceptores de electrones >Eabla 2?. a
as c5lulas inducidas por nitrato se cultiaron y se
b
'4presado como micromoles de nitrato por minuto por miligramo de prote%na. LLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL 'l aul de metileno y el metosulfato de fenaina fueron los aceptores m:s eficaces, mientras ue el ferricianuro de potasio, el i- lenol de bencilo y el cloruro de trifeniltetraolio fueron muco menos eficaces. emos medido rutinariamente la formiato desidrogenasa siguiendo la reducci3n de diclorofenol indofenol >/CD*D? en presencia de cantidades catal%ticas metosulfato de fenaina >17?. #unue el /CD*D s3lo se reduce lentamente mediante una mecla de e4tracto crudo y formiato, en presencia de peue17? nos permiti3 probar directamente la posibilidad de ue distintas formaciones desidrogenasas est:n implicadas en el metabolismo de E. coli. #unue la actiidad de formiato desidrogenasa ue utilia aul de metileno o metosulfato de fenaina como aceptor de electrones no pudo ser detectada o era muy ba8a en tales mutantes, algunos de los mutantes toda%a formaban gas cuando se cultiaban en condiciones ue conduc%an a la formaci3n del sistema de idrogenasa formica en el medio silestre >Eabla ? a
a concentraci3n de aceptores de electrones utiliada fue de ,1 8smoles H ml >e4cepto para el
trataron como se describe. a reducci3n de nitrato se ensay3 como se a descrito, con los siguientes nieles de donadores de electrones en un olumen final de 2, mlX @ Ymoles de glucosa, @ Ymoles de formiato, 0.2 Ymoles de metil iolVgeno >reducido?, 2.@ Ymoles de ditionito s3dico, 10 Ymoles de ascorbato, 6 Ymoles de formiato.
aire?. b
as c5lulas inducidas por nitrato de fr se cultiaron y se rompieron en un Branson "onifier, y el e4tracto se prepar3 como se indic3 en $ateriales
y $5todos, pero se congel3 antes de su uso. a forma desidrogenasa se ensay3 mediante la liberaci3n de C&2 radiactio a partir del formiato C, y los nanomoles de C&2 se calcularon a partir de la actiidad espec%fica del formiato >@,20 cuentas por minuto por mol? utiliado. os resultados mostrados se e4presan como nanomoles de C&2 por minuto por miligramo de prote%na. Cuando se us3 irVgeno de bencilo como aceptor de electrones, la eoluci3n del C&2 a partir del formiato o la reducci3n del colorante en presencia de formiato no fue lineal con el tiempo y, por lo tanto, se e4pres3 cualitatiamente. 'stos resultados apoyan la ip3tesis de ue dos desidrogenasas de formiato biou%micamente distintas est:n implicadas en la reducci3n de nitratos y la formaci3n de idr3geno en E. coli. "in embargo, las desidrogenasas de formiato pueden no ser gen5ticamente distintas ya ue en algunos de los mutantes ( -, se pierden tanto la formiato desidrogenasa espec%fica de nitrato como la formiato desidrogenasa implicada en el sistema de idrogenasa formica >Eabla ? como resultado de mutaciones ue aparecen Dara ser =nico, mutaciones puntuales sobre la base de las tasas de reersi3n >17?. Cuando E. coli se desarrolla anaerobiamente, la adici3n de nitrato prooca un aumento en el niel de citocromo b 1 >17, 2?.LLLLLLLLLLLLLLLLLL a
" e
ealu3 la formaci3n de gas en cultios ue crecen anaerobicamente en medio completo sin nitrato en tubos ue contienen iales inertidos para atrapar gas. os cultios se de8aron incubar al menos d%as y se consideraron positios >Z? si formaban m:s del 10I del gas obserado en el tipo sala8e. b
'l ensayo de formiato desidrogenasa con beniol iologeno fue cualitatio. Eodos los ensayos se
realiaron con e4tractos celulares frescos preparados a partir de c5lulas cultiadas anaerobiamente en medio completo >ensayo de itileno de bencilo? o en medio completo suplementado con nitrato >radioensayo y ensayo colorim5trico?. os resultados se e4presan como micromoles de C0 2 por minuto por miligramo de prote%na; os resultados para benyl iologen se e4presan cualitatiamente. c
a actiidad con aul de metileno se calcul3 como micromoles de C&2 liberado de formiato >actiidad espec%fica, 22.@00 cuentas por minuto por mol?. LLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL 'l siguiente an:lisis espectral demuestra ue los componentes del citocromo b 1 formados en presencia y ausencia de nitrato son tambi5n cualitatiamente distintos. os espectros absolutos de las c5lulas congeladas-descongeladas reducidas con ditionito se muestran en la Aig. 1. as c5lulas cultiadas en presencia de nitrato mostraron solamente dos picos mayores entre 00 y 600 nm. Gstos eran 26 nm >bandas [? y nm >banda \? a temperaturas de nitr3geno l%uido y 2@ y @ nm a temperatura ambiente. Dor otro lado, las c5lulas cultiadas en ausencia de nitrato presentaron picos mayores a 2@ y @ nm, un ombro a 9 nm >citocromo c? a temperatura de nitr3geno l%uido y picos a 0 y 60 nm a temperatura ambiente. a distinci3n entre estos componentes b y b@ >identificados por sus picos de una banda a la temperatura del nitr3geno l%uido? fue eidente en algunos mutantes (- ue ab%an reducido los nieles de citocromo b 1. Cuando tales mutantes se icieron crecer en condiciones anaerobias en presencia de nitrato, ambos componentes eran eidentes en el espectro reducido >Aigura 2, mutante EO-1?. #dem:s, un segundo tipo de mutante, ue no formaba ning=n componente citocromo b detectable cuando se creci3 anaer3bicamente con nitrato >Aigura 2, cepa (B-12?, form3 nieles normales de los componentes b @ cuando creci3 anaerVbicamente en ausencia de nitrato >no mostrado, ]er espectro no inducido de tipo silestre, Aig. 1?. Cuando las cepas de tipo silestre se cultiaron aer3bicamente, las bandas de los principales componentes del citocromo b se encontraban a y 62 nm >a temperatura de nitr3geno l%uido?. "obre la base de las obseraciones siguientes con mutantes (, los componentes b encontrados en c5lulas anaerobias inducidas por nitrato parecer%an ser distintos del componente b en c5lulas aer3bicas. (mutantes, ue an alterado los nieles de la b componente cuando se creci3 anaerobicamente con
nitrato, form3 una distribuci3n normal de los componentes del citocromo, incluido un componente b, cuando se cultiaron en condiciones aerobias >Aig. 2^. os espectros absolutos mostrados para las c5lulas aer3bicas son id5nticos a los encontrados en las c5lulas de tipo sala8e aer3bico cultiadas ba8o estas condiciones, mostrando picos a y 62 nm. Dor lo tanto, el principal componente del citocromo b encontrado
en las c5lulas cultiadas anaerVbicamente en presencia de nitrato parece ser fisiol3gica y gen5ticamente distintos de los componentes del citocromo b encontrados en otras condiciones de crecimiento. as siguientes obseraciones implican directamente al componente b en el sistema de reducci3n de nitrato y proporcionan eidencia de ue est: compuesto de dos citocromos distintos ue poseen caracter%sticas espectrales id5nticas.
A*_. 1. 'spectro absoluto ditionito-reducido de la cepa fr cultiada con y sin nitrato. as c5lulas se cultiaron anaerobicamente en medio completo con >c5lulas inducidas? y sin >c5lulas no inducidas? nitrato de potasio y se trataron como se indica. "e usaron suspensiones de c5lulas congeladas-descongeladas a una concentraci3n de prote%na de ,0@ mg H ml para las c5lulas no inducidas y de 1,7 mg H ml para las c5lulas inducidas. os espectros se determinaron a temperatura 2 >#? y temperatura ambiente >B?. as barras en el centro de la figura muestran la escala de unidades de densidad 3ptica para cada una de las curas. Cuando se sigui3 la cin5tica de reducci3n y o4idaci3n del citocromo b1 en un espectrofot3metro de registro de longitud de onda doble #mincoCance, se encontr3 ue las adiciones repetidas de dinucle3tido de nicotinamida adenina >#/? reducido de 1 mm no causaron la reducci3n del componente citocromo b1 presente en reparaciones de c5lulas inducidas por nitrato cdescongelado >Aig. ?. #l aumentar la concentraci3n de #/ a 100 m$, fue posible efectuar una reducci3n del citocromo b1, pero consideramos esto como un niel no fisiol3gico de #/. "e obtuieron resultados similares utiliando e4tractos brutos. Cuando se aAig. ?. "3lo una parte del citocromo se o4id3 inmediatamente y el resto se o4id3 despu5s de un desfase temporal definido. Con alg=n tiempo de retraso, el ascorbato
tambi5n caus3 la reducci3n del citocromo 1. "in embargo, en este caso el citocromo reducido se o4id3 completamente en una sola etapa tras la adici3n de nitrato >Aigura #?. #l parecer, s3lo se redu8o una parte del citocromo b1, ya ue la adici3n posterior de formiato caus3 la reducci3n de m:s citocromo, y en este caso la cin5tica bif:sica se obser3 para la o4idaci3n por nitrato. 'sta diferencia en la e4tensi3n de la reducci3n del componente citocromo causada por formiato y ascorbato se erific3 mediante el e4perimento mostrado en la Aig. B, en la ue la adici3n de formiato inmediatamente despu5s del ascorbato prooc3 un incremento adicional de la reducci3n del citocromo. 'stos resultados sugieren ue dos componentes del citocromo b, se redu8eron por el formiato, uno de los cuales se reduce por el ascorbato, y ue el nitrato o4idado ambos componentes del citocromo, pero uno de ellos s3lo despu5s de un desfase definitio en el tiempo lag.
Aigura 2. os espectros de citocromo de dos mutantes ( crecen ba8o diferentes condiciones. os espectros se determinaron a una temperatura de 2 l%uido sobre suspensiones de c5lulas eladas-descongeladas y se prepararon como se a descrito. as concentraciones de prote%na fueron 6,2 mg H ml para (B-12 >anaer3bico?, ,2 mg H ml >aer3bico?, 6,@2 mg H ml para EO-1 mg H ml >anaer3bico? y ,72 mg H ml para EO-1 >aerobio?. os efectos de &W& sobre la o4idaci3n del citocromo b1 Droporcion3 eidencia adicional de ue dos citocromos distinguibles estaban siendo reducidos y o4idados en este e4perimento.Cuando se aAigura B?, s3lo una parte de la reducci3n del citocromo se reo4id3 mediante nitrato y la o4idaci3n se produ8o inmediatamente en un solo paso. "e obtuieron resultados id5nticos cuando el citocromo se redu8o s3lo por formiato, es decir, el segundo paso de la cin5tica bif:sica fue completamente inibido por &W&. #dem:s, otra e la reducci3n de del citocromo o4idado por fomato fue eitada por &W& >Aigura B?. Dor el contrario, la porci3n de citocromo b1 ue se redu8o por ascorbato no fue impedida por &W& de ser o4idado por nitrato >Aigura _?. a adici3n de m:s nitrato no tuo efecto adicional y, en este caso, &W& no impidi3 ue el formiato redu8era al menos parte del citocromo. Dara demostrar ue estos resultados se debieron espec%ficamente al comportamiento del citocromo b, se lle3 a cabo una serie similar de e4perimentos en los ue se determinaron los espectros a temperatura ambiente con la fi8aci3n por a diidido para el espectrofot3metro >Aigura #?.
a forma reducida citocromo b e4ibi3 una banda alfa, a @ nm a temperatura ambiente, ue corresponde al componente b >figura 1B?. 'l nitrato reo4id3 completamente al citocromo, pero cuando se a
c5lulas inducidas por nitrato ue pueden ser reducidas por el formiato y o4idadas por el o4%geno >Aigura 7?. a presencia de &W& inibir%a el flu8o de electrones entre ambos citocromos, permitiendo ue s3lo un citocromo se o4idase r:pidamente en presencia de e4ceso de formiato, ya ue el formate continuar%a reduciendo el citocromo antes del bloue. 'l eco de ue &W& no tuo ning=n efecto sobre la o4idaci3n de citocromos cuando se utili3 un ba8o niel de formiato sugiere ue ambos citocromos son autoo4idables. /*"C)"*`
'stos resultados pueden e4plicarse asumiendo la participaci3n en la reducci3n de nitrato de dos citocromos con espectros id5nticos ue difieren s3lo en sus potenciales redo4 >er Aig. 7?. &tra eidencia de tal ip3tesis se obtuo al analiar la autoo4idaci3n del citocromo b1 en las c5lulas inducidas por nitrato >Aigura 6?. 'l formiato a una concentraci3n de @, T 10 $ redu8o r:pidamente el citocromo bi >cura a?. /espu5s de burbu8ear aire a tra5s de la suspensi3n de c5lulas durante 1 minuto, el citocromo se o4id3 completamente >cura b?. Cuando se acura c?. Cuando la concentraci3n de formiato era menor > T 10- $?, &W& no inibi3 la o4idaci3n del citocromo >curas d, e, f?. ueamente, estos resultados pueden interpretarse asumiendo la e4istencia de dos citocromos en las
a participaci3n de la formiato desidrogenasa, citocromo b1 y nitrato reductasa en la reducci3n de nitratos por '. coli a sido propuesta por arios inestigadores >6, @, 17, 2?. os resultados presentados au%, 8unto con los resultados de los estudios sobre (-mutantes >17?, indican ue diferentes formas de estos componentes est:n inolucrados en el sistema de reducci3n de nitratos y ue ay poca interacci3n con otras cadenas de transporte de electrones, es decir, la reducci3n de nitratos se produce Drincipalmente por el funcionamiento secuencial de la desidrogenasa formiato, el citocromo b y la nitrato reductasa. os inestigadores de "eerla an demostrado ue el #/ puede serir como donante de electrones para la reducci3n de nitratos en e4tractos libres de c5lulas de '. coli >2, , 6, 1?. "in embargo, los mutantes (- ue carecen de formiato desidrogenasa pero poseen nitrato reductasa no forman nitrito ni eliminan nitrato del medio durante el crecimiento >datos no publicados?. "in embargo, cuando tales mutantes llegan a la fase estacionaria, el nitrito comiena a acumularse, lo ue sugiere ue el #/ puede serir como donante de electrones para la reducci3n de nitratos s3lo en c5lulas de fase estacionaria. 'n contraste, el padre de tipo sala8e acumula grandes cantidades de nitrito durante el crecimiento en las mismas condiciones, y esta acumulaci3n contin=a durante la fase estacionaria. 'n ninguno de estos casos se reduce a=n m:s el nitrito, presumiblemente porue utiliamos 1I de nitrato, una condici3n ue suprime la formaci3n del sistema de nitritos reductasa en '. coli >2?. 'l papel espec%fico de la actiidad nitrato reductasa ligada al #/ y su relaci3n con la actiidad nitrato reductasa asociada con formiato desidrogenasa es, en la actualidad, desconocida.
nitrato en presencia de &W&. as c5lulas de fr se cultiaron anaerVbicamente en medio completo suplementado con nitrato de potasio al 1I y se usaron como una suspensi3n congeladadescongelada. 'n este caso, se a,0 ml ue conten%a 2.0 mg de prote%na por ml? a cada cubeta. # la cubeta de referencia, se a
FIG. 4. Reducción y oxidación del citocromo b1 y efecto de HOQNO. Se prepararon la c!lula y la condicione fueron como en la Fi". #$ excepto %ue la upenión celular fro&ent'a(ed e trató con deoxirribonucleaa )*.+ ," - ml para reducir la /icoidad. Se a0adieron formiato ódico y acorbato ódico )cido acórbico a2utado a pH 3. con 'idróxido ódico como .1 ml de olucione 1. 5 a 4. ml de upenión celular )4.6 m" - ml.
Aig. . 'spectro diferencial del citocromo b 1 reducido por formiato y ascorbato y o4idado por
o :cido asc3rbico s3lido.
A*_. 6. #uto-o4idaci3n del citocromo b 1 y efecto de &W&. as c5lulas se prepararon como en la Aig. y se us3 a una concentraci3n de prote%na de 2. mg H ml. os espectros de diferencia se determinaron a temperatura ambiente con el espectrofot3metro de a diidido. a suspensi3n de c5lulas de referencia se o4id3 burbu8eando con aire a tra5s de una pipeta pasteur. >a? "uspensi3n celular m:s @. Ymoles de formato de sodio por ml; >b? la suspensi3n >a? burbu8e3 con aire por 1 min; >c? suspensi3n >a? m:s @. T 10- $ &W&, burbu8e3 con aire durante @ min; >d? suspensi3n de c5lulas m:s 0. Ymoles de formiato s3dico por ml; >e? la suspensi3n >d? burbu8e3 con aire durante 1 minutoX >f? suspensi3n
>d? m:s @. T 10 - $ &W&, burbu8e3 con aire durante 1 min.
FIG. 3. 7%uema u"erido para el comple2o de nitrato reductaa de Escherichia coli.
a formiato desidrogenasa implicada en la reducci3n de nitratos parece ser distinta de la formiato desidrogenasa implicada en el sistema formiato de idrogenidasa. 'sta distinci3n se basa en parte en la especificidad de aceptor de electrones de la formiato desidrogenasa asociada con estos dos sistemas >?, pero se demuestra m:s claramente por la e4istencia de un sistema formiato de idrogenasa formiato y una desidrogenasa de formiato espec%fica de benilo iologeno en mutantes (ue carecen a formiato desidrogenasa espec%fica de metosulfato de fenaina asociada con la reducci3n de nitrato. 'l eco de ue algunos (mutantes carecan de estas dos desidrogenasas formadas, como se muestra au% y por otros >1, 22?, sugiere ue ambas actiidades dependen de un elemento gen5tico com=n, tal e el gen estructural para la desidrogenasa formiato. "i ambos son especificados por el mismo gen, las ariaciones gen5ticas y fisiol3gicas obseradas para las dos desidrogenasas de formiato deben resultar de una interacci3n y asociaci3n del producto g5nico con distintos componentes de transporte de electrones. )na interpretaci3n alternatia es ue ambas actiidades se pierden como resultado de una alteraci3n pleiotr3pica ue afecta a los componentes de membrana de la c5lula >1?. 'n cualuier caso, una comprensi3n clara de las ariaciones gen5ticas obseradas para las desidrogenasas de formiato reuerir: un an:lisis gen5tico y biou%mico detallado de esta enima y su participaci3n en distintas %as. 'l esuema de la Aig. 7 se propone e4plicar la interacci3n del citocromo b, con los diferentes donantes de electrones, su o4idaci3n por nitrato y los efectos del inibidor &W& sobre estos procesos. ]arios de los ecos presentados au% sugieren ue dos componentes distintos del citocromo b son o4idados por el nitrato. >*? 'l nitrato prooca una o4idaci3n bif:sica del citocromo b. >**? 'l ascorbato, un donador de electrones de potencial redo4 moderadamente alto, redu8o s3lo una parte >apro4imadamente el 0I? del citocromo b espec%fico del nitrato ue reducen el ditionito o el formiato. >***? &W& inibe la o4idaci3n de nitro de la parte del citocromo b formada por formiato >apro4imadamente 0I?, pero no inibe la o4idaci3n del citocromo b reducido por ascorbato por nitrato. 'stas obseraciones, 8unto con el eco de ue &W& inibe completamente la reducci3n de nitrato por formiato, se e4plican m:s
f:cilmente por la propuesta de la Aig. 7 ue dos componentes del citocromo b con diferentes potenciales de o4idaci3n-reducci3n funcionan secuencialmente en la transferencia de electrones de formiato a nitrato. $ientras ue ditionito y formiato >%a formiato desidrogenasa? reducir%an ambos componentes, el ascorbato reducir%a solamente el segundo componente del citocromo. os efectos selectios de &W& resultar%an de su inibici3n de la transferencia de electrones entre los dos componentes del citocromo. a cin5tica bif:sica de la o4idaci3n por nitrato se debe a la capacidad del formiato, mientras est5 presente, de mantener el citocromo * reducido incluso en presencia de citocromo ** o4idado. 'ste modelo podr%a e4plicar por u5 mucos (mutantes ue carecen de nitrato reductasa o formiato desidrogenasa tambi5n presentan nieles disminuidos pero intermedios del citocromo b >17?; yo. '., )no o el otro de los dos componentes del citocromo puede no ser formado. #dem:s, los informes de ue el citocromo bi est: asociado tanto con formiato desidrogenasa >7, 11? y con nitrato reductasa >9? despu5s de ue estas enimas ab%an sido resueltas unas de otras puede e4plicarse asumiendo ue un componente citocromo b1 permanece asociado con formiato desidrogenasa y el otro con nitrato reductasa durante los procedimientos de purificaci3n. 'st: claro ue los componentes del citocromo b espec%ficos del nitrato son distintos del componente citocromo b formado en condiciones aerobias, ya ue los mutantes (-ue carecen del citocromo b inducido por nitrato toda%a forman componentes normales del citocromo b1 en condiciones aerobias. 'stas obseraciones no establecen si es el mismo citocromo b 1 asociado con diferentes componentes o ue E. coli especifica una serie de componentes distintos de citocromo b 1 para diersos sistemas de transporte de electrones. 'n cualuier caso, la formaci3n de componentes del citocromo debe ser regulada espec%ficamente por los otros componentes catal%ticos con los ue est:n normalmente asociados. 'sa reducci3n de nitratos es cataliada por un comple8o de enimas asociado f%sicamente ue s3lo puede establecerse por el aislamiento de la unidad catal%tica. "in embargo, la asociaci3n de membranas de los componentes, la e4istencia de mutaciones pleiotr3picas ue afectan las actiidades y la aparente falta de interacci3n de este sistema con otras cadenas de transporte de electrones argumentan la e4istencia de tal comple8o.
