mihasan_final_cu_coperti.pdf

Marius Mihăşan • Marius Ştefan Zenovia Olteanu

BIOLOGIE MOLECULARĂ Metode experimentale

Lucrare apărută cu sprijinul financiar al grantului CNCSIS-UEFISCSU PN II-RU 337/2010, contract nr. 117/30.07.2010

Referenţi știinifici: Prof.univ.dr. Emeritus Vlad Artenie, Universitatea „Alexandru Ioan Cuza” din Iași apl. Prof. em. Dr. rer. nat. Roderich Brandsch, Institute of Biochemistry and Molecular Biology, ZBMZ, Freiburg, Germania

Redactor: Oana BILAN Coperta: Manuela OBOROCEANU Tehnoredactor: Florentina CRUCERESCU ISBN 978-973-703-816-6 © Editura Universităţii „Alexandru Ioan Cuza”, 2012 700109 – Iaşi, str. Pinului, nr. 1A, tel./fax: (0232) 314947 http:// www.editura.uaic.ro e-mail: [email protected]

Marius Mihăşan • Marius Ştefan Zenovia Olteanu

BIOLOGIE MOLECULARĂ Metode experimentale Prefaţă de Gheorghe Benga

Editura Universităţii „Alexandru Ioan Cuza” Iaşi

2012

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României MIHĂŞAN, MARIUS, ȘTEFAN, MARIUS, OLTEANU, ZENOVIA Biologie moleculară: metode experimentale / Marius Mihăşan, Marius Ștefan, Zenovia Olteanu; prefaă de Gheorghe Benga. – Iaşi: Editura Universităţii „Al.I. Cuza”, 2012 Bibliogr. ISBN 978-973-703-816-6 I. Mihășan, Marius II. Ștefan, Marius III. Olteanu, Zenovia 577.2

CUPRINS PREFAȚĂ de GHEORGHE BENGA ....................................................................... XI INTRODUCERE ................................................................................................. 1 I. TEHNICI DE BAZĂ UTILIZATE ÎN LABORATORUL DE BIOLOGIE MOLECULARĂ .................................................................................................. 3 I.1 Sticlăria şi instrumentele din materiale plastice ..................................................... 3 Siliconarea sticlăriei şi a instrumentelor din materiale plastice .................................... 4 Spălarea şi uscarea vaselor de laborator ...................................................................... 5 I.2 Măsurarea volumelor ............................................................................................ 6 Măsurarea volumelor cu ajutorul pipetelor .................................................................. 7 I.3 Măsurarea maselor ............................................................................................. 12 Instrucţiuni privind utilizarea balanţei electronice analitice ...................................... 14 I.4 Centrifugarea ...................................................................................................... 15 Instrucţiuni privind utilizarea centrifugii ..................................................................... 16 I.5 Tehnici de bază folosite pentru manipularea microorganismelor .......................... 17 Măsuri de biosecuritate .............................................................................................. 17 Tehnici de sterilizare ................................................................................................... 21

II. METODE DE CULTIVARE A BACTERIEI ESCHERICHIA COLI ....... 29 II. 1 Medii utilizate pentru cultivarea bacteriei Escherichia coli ................................. 30 Medii de cultură minimale .......................................................................................... 31 Medii de cultură complexe ......................................................................................... 33 Medii de cultură solide ............................................................................................... 36 Medii minimale solide ............................................................................................ 36 Medii de cultură complexe solide .......................................................................... 36 Agar de acoperire ....................................................................................................... 37 Agar de conservare prin înţepare ............................................................................... 38 Antibiotice utilizate la prepararea mediilor de cultură ............................................... 39

VI

Cuprins

II. 2 Cultivarea E. coli pe medii solide ........................................................................ 41 Însămânţarea la suprafaţa mediilor de cultură solide ................................................ 42 Însămânţarea în profunzime a mediilor de cultură solide .......................................... 44 II. 3 Cultivarea E. coli în medii lichide........................................................................ 47 Inocularea şi cultivarea folosind volume mici de mediu ............................................. 47 Inocularea şi cultivarea folosind volume mari de mediu ............................................ 48 II.4 Monitorizarea creşterii bacteriei E. coli în mediile lichide .................................... 48 Determinarea densităţii optice cu ajutorul spectrofotometrului ............................... 49 Determinarea densităţii optice cu ajutorul hemocitometrului ................................... 51 Determinarea numărului de bacterii prin cultivare în plăci Petri ............................... 52 II. 5 Păstrarea culturilor de E. coli ............................................................................. 54 Păstrarea prin congelare la ‐80oC ................................................................................ 55

III. PLASMIDE ŞI TULPINI DE ESCHERICHIA COLI UTILIZATE FRECVENT ÎN BIOLOGIA MOLECULARĂ ............................................... 57 III.1 Vectori plasmidiali utilizaţi frecvent în ingineria genetică ................................... 59 Principalele caracteristici ale vectorilor plasmidiali utilizaţi în ingineria genetică ...... 61 Vectorul pUC19c .................................................................................................... 61 Vectorul pBlueScript II SK (+/‐) ............................................................................... 62 Vectorul pET‐21a .................................................................................................... 62 Vectorul pMAL‐c5x ................................................................................................. 62 III.2 Tulpini de Escherichia coli utilizate frecvent în ingineria genetică ....................... 63

IV. METODE ŞI TEHNICI FOLOSITE PENTRU IZOLAREA ŞI PURIFICAREA ADN‐ULUI ........................................................................... 73 IV.1 Izolarea ADN‐ului plasmidial ............................................................................. 75 Izolarea ADN‐ului plasmidial folosind metoda lizei alcaline........................................ 76 Izolarea ADN‐ului plasmidial utilizând metoda lizei prin fierbere ............................... 81 IV.2 Izolarea ADN‐ului genomic ................................................................................ 84 Izolarea ADN‐ului genomic din bacterii ...................................................................... 85 Izolarea ADN‐ului genomic din plante ........................................................................ 90 Izolarea ADN‐ului din ţesuturi animale ....................................................................... 95 IV. 3 Purificarea ADN‐ului din soluţii apoase ........................................................... 100

Cuprins

VII

IV. 4 Izolarea ADN‐ului din geluri de agaroză ........................................................... 103 IV. 5 Păstrarea ADN‐ului purificat ........................................................................... 107

V. AMPLIFICAREA ENZIMATICĂ IN VITRO A ACIZILOR NUCLEICI .................................................................................. 111 V.1 Amplificarea enzimatică in vitro a ADN‐ului sau PCR ......................................... 113 Amplificarea enzimatică in vitro a fragmentelor de ADN de până la 4 kb ................ 116 V.2 Criterii pentru alegerea oligonucleotidelor amorsă (primer) .............................. 126

VI. DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI ACIZILOR NUCLEICI ÎN SOLUŢIE ........................................................................................................ 133 V.1 Determinarea concentraţiei acizilor nucleici prin spectroscopie UV‐VIS ............. 133 Determinarea concentraţiei acizilor nucleici prin spectroscopie UV ........................ 134 V.2. Determinarea concentraţiei acizilor nucleici prin fluorimetrie .......................... 138 Determinarea concentraţiei acizilor nucleici folosind bromura de etidiu................. 139 Determinarea concentraţiei acizilor nucleici folosind metoda cu folie din plastic .... 141 Determinarea cantităţii de ADN pe geluri de agaroză .............................................. 143

VII. SEPARAREA ELECTROFORETICĂ A ADN‐ULUI ......................... 147 VII. 1 Electroforeza clasică în geluri de agaroză ....................................................... 150 VII. 2. Separarea ADN prin electroforeză în gel de poliacrilamidă cu gradient de agent denaturant ............................................................................................................ 157 VII.3 Detecţia ADN‐ului în geluri de agaroză ........................................................... 168 Detecţia ADN‐ului folosind bromura de etidiu ......................................................... 169 Detecţia ADN‐ului în geluri de agaroză folosind coloranţi de tip SYBR ..................... 171 Detecţia ADN‐ului în geluri de agaroză folosind albastrul de metilen ...................... 173

VIII. PURIFICAREA PROTEINELOR PRIN CROMATOGRAFIE DE AFINITATE FAŢĂ DE METALE ................................................................. 177 VIII.1 Strategii de clonare a genelor în vectori de expresie ...................................... 181 VIII.2 Identificarea condiţiilor optime de supraexpresie a proteinelor recombinate . 186

VIII

Cuprins

VIII.3 Purificarea prin IMAC a proteinelor recombinate în condiţii native ................ 192 VIII.4 Purificarea prin IMAC a proteinelor recombinate în condiţii denaturante ....... 198 VIII. 5 Determinarea maselor moleculare native utilizând cromatografia de filtrare prin gel (GF) .................................................................................................................. 200 Determinarea maselor moleculare native utilizând cromatografia de filtrare prin gel .................................................................................................................................. 206 Calibrarea coloanei de GF şi calcularea maselor molare .......................................... 208

IX. DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI PROTEINELOR .................. 215 IX.1 Determinarea concentraţiei proteinelor prin spectroscopie UV ........................ 216 IX.2 Metode colorimetrice de determinare a concentraţiei proteinelor ................... 219 Metoda Lowry ........................................................................................................... 219 Metoda Bradford ...................................................................................................... 224 Micrometoda Bradford de dozare a concentraţiei proteinelor ............................ 227 Metoda cu acid bicinchoninic (BCA) ......................................................................... 229 Micrometoda BCA de dozare a proteinelor ......................................................... 231 Macrometoda BCA de dozare a proteinelor ........................................................ 232 IX.3 Realizarea curbelor de etalonare şi prelucrarea datelor ................................... 234

X. SEPARAREA ELECTROFORETICĂ A PROTEINELOR ................... 241 X.1 Electroforeza nativă a proteinelor în sistem discontinuu ................................... 243 X.2 Electroforeza proteinelor în condiţii denaturante (SDS‐PAGE) ........................... 253 X.3 Detecţia proteinelor separate prin electroforeza pe geluri de poliacrilamidă ..... 257 Colorarea gelurilor de poliacrilamidă în vederea evidenţierii proteinelor ................ 257 Colorarea cu Comassie Brilliant Blue R‐250 ......................................................... 259 Colorarea cu argint a gelurilor de poliacrilamidă ................................................. 261 X.4 Fotografierea gelurilor şi analiza imaginilor. Stabilirea masei moleculare relative ............................................................................................................................. 264

XI. EVIDENŢIEREA IMUNOLOGICĂ A PROTEINELOR – TEHNICA WESTERN‐BLOT ......................................................................................... 273 XI.1 Obţinerea anticorpilor policlonali. Tehnici de imunizare .................................. 273

Cuprins

IX

Obţinerea anticorpilor policlonali folosind adjuvantul Freund ................................. 275 XI.2 Imunobloting‐ul .............................................................................................. 278 Electro‐transferul proteinelor pe membrane în sistem semi‐uscat .......................... 279 Imunodetecţia proteinelor transferate pe membrane de nitroceluloză ................... 282

XII. METODE COMPUTAŢIONALE DE STUDIU A PROTEINELOR . 285 XII.1 Fişiere FASTA şi operaţii simple cu secvenţe .................................................... 286 XII.2 Baze de date cu informaţii despre proteine..................................................... 290 Baze de date cu secvenţe proteice ........................................................................... 291 Baze de date cu structuri proteice ............................................................................ 294 XII. 3 Identificarea funcţiei proteinelor necunoscute cu ajutorul programului BLAST 295 XII.4 Modelarea computaţională a structurii tridimensionale a proteinelor ............ 308 Programe, servere şi metaservere ............................................................................ 311 Aplicaţii ale metodelor de modelare a structurilor tridimensionale a proteinelor .. 316 XII.5 Modelarea computaţională a complecşilor liganzi‐proteine ............................ 316 Problematica andocării moleculare .......................................................................... 317 Evaluarea rezultatelor obţinute prin andocare moleculară computerizată .............. 324 Aplicaţii ale andocării moleculare ............................................................................. 324

ANEXĂ ........................................................................................................... 335

PREFAŢĂ Biologia moleculară poate fi definită cel mai simplu ca fiind un concept de studiere a materiei vii prin prisma relaţiei structură-funcţie la nivel molecular. Este un concept ce a revoluţionat ştiinţele biologice şi medicale începând cu a doua jumătate a secolului XX. Dar pe lângă noile cunoştinţe teoretice, revoluţia produsă de biologia moleculară a fost posibilă şi datorită introducerii de noi metode şi tehnici de laborator. Toate lucrările experimentale de biologie moleculară implică utilizarea unor astfel de metode şi tehnici. De aici rezultă şi necesitatea unor cărţi care să-i ajute pe cercetători în munca zilnică la masa de laborator (“bench”). În România nu cunosc să se fi scris o asemenea carte, care să descrie toate metodele şi tehnicile de biologie moleculară la modul practic de lucru. Efortul tinerilor colegi Marius Mihăşan, Marius Ştefan şi Zenovia Olteanu de a redacta o astfel de carte mi se pare de aceea deosebit de lăudabil şi rezultatul este o lucrare de mare valoare. Merită subliniat că sunt descrise pe de o parte unele tehnici de bază în laboratorul de biologie moleculară (dar şi în laboratoarele de analize biomedicale, de biochimie şi chimie clinică, de microbiologie, de biofizică etc), precum: pregătirea sticlăriei şi a vaselor de laborator, măsurarea volumelor, a maselor, centrifugarea, tehnicile de bază folosite pentru manipularea microorganismelor, metodele de determinare a proteinelor, separarea electroforetică a proteinelor, tehnici de imunologie (obţinerea de anticorpi policlonali, imunodetecţia proteinelor transferate pe membrane de nitroceluloză) etc. Pe de altă parte sunt descrise metode specifice biologiei moleculare: plasmide şi tulpini de Escherichia coli folosite frecvent în biologia moleculară, izolarea ADN-ului, purificarea proteinelor prin cromatografie de afinitate, metode computaţionale de studiu a proteinelor. Descrierea metodelor şi a tehnicilor este foarte bine făcută, de la principiile teoretice, avantajele şi limitele, până la descrierea concretă a materialelor necesare şi a modului de lucru. În acest fel cartea este un valoros ghid pentru lucrul în laborator, atât pentru începători (studenţi, masteranzi, doctoranzi), cât şi pentru avansaţi (cercetători postdoctorali, cadre didactice din învăţământul

Prefață

XII

superior, tehnicieni de laborator cu experienţă) şi trebuie să se afle pe masa de lucru din laborator (ori aproape de masa de lucru). Fiind eu însumi autor al unei cărţi pentru laboratoarele clinice (Ion Manta, Mircea Cucuianu, Gheorghe Benga, Adriana Hodârnău, Metode biochimice în laboratorul clinic, Editura Dacia, Cluj-Napoca, 1975) şi al unui îndrumător pentru lucrările practice cu studenţii (Gh. Benga -Ed.Îndrumător pentru lucrările practice de biologie celulară şi moleculară, Editura Carpatica, Cluj-Napoca, 1997) îmi dau bine seama de dificultatea scrierii unei astfel de cărţi şi apreciez efortul foarte mare depus de autori. Recomand călduros lucrarea scrisă de cei trei autori tuturor categoriile de cititori (şi utilizatori) menţionaţi mai sus, dar şi celor care nu aplică sau nu vor aplica niciodată metodele şi tehnicile de laborator ale biologiei moleculare, dar care vor să se orienteze în metodele şi tehnicile laborator de biologie moleculară, spre a înţelege mai bine aplicaţiile acesteia în ştiinţele medicale şi biologice. Cluj-Napoca, 12 noiembrie 2012 Prof. Univ. Dr. Dhc. Gheorghe Benga Membru corespondent al Academiei Române Membru Titular al Academiei de Ştiinţe Medicale din România Medic specialist de Laborator Clinic, Chimist, Medic primar de Genetică Medicală, Laboratorul de Explorări Genetice I al Spitalului Clinic Judeţean de Urgenţă Cluj-Napoca Profesor Univ. Asociat, Disciplina de Biologie Celulară şi Moleculară, Universitatea de Vest „Vasile Goldiş” din Arad Preşedinte al Filialei Cluj a C.R.I.F.S.T. (Comitetul Român pentru Istoria şi Filosofia Stiinţei şi Tehnicii) al Academiei Române Honorary Associate, School of Molecular Biosciences, University of Sydney, Australia Past-President, Societatea Română de Medicină de Laborator Past-President, Balkan Federation of Clinical Laboratory E-mail: [email protected]

INTRODUCERE Dacă biologia clasică s-a dezvoltat şi a atins nivelul de cunoaştere de astăzi prin folosirea cu precădere a „studiilor observaţionale”, biologia modernă se bazează în mod fundamental pe noţiunea de „experiment” şi pe procesul de „experimentare” în scopul dobândirii de noi informaţii şi cunoştinţe. Experimentul are rolul de a verifica validitatea unei ipoteze formulate în prealabil utilizând pentru aceasta un ansamblu de tehnici şi metode. Reuşita unui experiment, adică formularea fără echivoc a unei concluzii legate de ipoteza de testat, depinde în mare măsură de capacitatea cercetătorului de a concepe un model de studiu, de a alege şi de a utiliza în mod corect una sau mai multe metode de investigaţie. Majoritatea lucrărilor de profil din ultima decadă, care descriu metode şi tehnici de laborator utilizate în biochimie, enzimologie, biologie celulară şi moleculară, au fost realizate cu precădere în scopuri didactice, fiind utilizate ca suport pentru prelegerile teoretice. Metodele experimentale sunt reduse frecvent la un set de indicaţii simple şi clare pe care studenţii să le poată urma cu uşurinţă. Lipsa unor informaţii generale despre principiile teoretice şi aplicabilitatea metodelor dau însă o falsă impresie de imuabilitate a protocoalelor experimentale, ceea ce face ca experimentatorul să fie pus deseori în dificultate atunci când trebuie să adapteze metoda în mod specific. În acest context, lucrarea de faţă se doreşte a fi un ghid detaliat al unor metode-cheie, utilizate frecvent în biologia moleculară, concentrându-se nu numai pe simpla formulare a unor protocoale experimentale, ci şi pe explicarea principiilor din spatele fiecărei metode în scopul precizării spectrului de aplicabilitate şi a rezultatelor scontate. Fiecare din metodele prezentate au fost testate şi utilizate de către autori în cadrul Laboratorului de Biochimie şi Biologie Moleculară al Facultăţii de Biologie, Universitatea „Alexandru Ioan Cuza” din Iaşi. Modul de prezentare este adaptat specificului fiecărei metode în parte, cuprinzând în general cinci secţiuni distincte: 1. principiul metodei – oferă informaţii legate de bazele teoretice ale metodei utilizate; 2. avantaje – furnizează informaţii legate de domeniul de aplicabilitate al metodei, rezultatele aşteptate corelate cu date legate de sensibilitate, randament etc.;

2

Biologie moleculară. Metode experimentale

3.

limitări – prezintă condiţiile în care metoda nu poate fi aplicată, dezavantajele sau inconvenientele sale în comparaţie cu metode similare; 4. materiale necesare – conţine lista completă a reactivilor, materialelor, instrumentelor şi aparaturii necesare, alături de instrucţiuni legate de prepararea reactivilor şi indicaţii privind potenţialele pericole care pot să apară în laborator; 5. mod de lucru – oferă indicaţii simple şi precise privind suita de operaţii care trebuie efectuate pentru obţinerea rezultatelor finale. Prin conţinut şi structură lucrarea se adresează cu precădere studenţilor care frecventează studiile masterale şi de doctorat, cercetătorilor post-doctorat, cadrelor didactice care coordonează lucrările de disertaţie şi doctorat, tinerilor angajaţi în activitatea de cercetare, care fac primii paşi în domeniul ştiinţelor vieţii, precum şi specialiştilor din domenii conexe. Prin aspectele teoretice abordate, prezenta lucrare poate fi utilă şi cercetătorilor şi tehnicienilor cu experienţă care au deprins şi utilizează aceste protocoale de ani buni, dar care nu au acordat suficientă importanţă cunoştinţelor teoretice care fundamentează metodele respective. Puţini vor fi cei care vor parcurge această lucrare de la un capăt la altul, dar sperăm că o vom regăsi pe masa de lucru a cât mai multor cercetători, funcţionând ca un ghid pentru selecţia, dezvoltarea şi adaptarea protocoalelor experimentare la nevoile specifice ale experimentatorului. Mesajul final pe care această lucrare doreşte să îl transmită este că reproducerea în detaliu a fiecărei etape a unui protocol nu este suficientă pentru utilizarea cu succes a acestuia. Este mai important poate de cunoscut cum funcţionează, în ce condiţii se poate utiliza, ce informaţii poate şi ce informaţii nu poate să ofere o anumită metodă, precum şi care sunt parametrii critici de care trebuie să se ţină cont la utilizarea unei tehnici experimentale. Mulţumim anticipat celor care vor transmite sugestii, observaţii şi recomandări care să conducă la completarea acestei lucrări în scopul îmbunătăţiri unei viitoare ediţii. Autorii

I. TEHNICI DE BAZĂ UTILIZATE ÎN LABORATORUL DE BIOLOGIE MOLECULARĂ I.1 Sticlăria şi instrumentele din materiale plastice În laborator se preferă, în general, utilizarea instrumentelor şi a vaselor din sticlă. Sticla utilizată pentru confecţionarea vaselor de reactivi, a flacoanelor şi paharelor este una termorezistentă care, suplimentar, poate fi supusă unui tratament special în vederea obţinerii unei suprafeţe cu aderenţă şi reactivitate chimică cât mai reduse. Deşi există numeroase denumiri sub care se comercializează sticla din care sunt confecţionate instrumentele şi vasele de laborator, ea are la bază acelaşi amestec de borosilicaţi de sodiu, magneziu, aluminiu şi zinc descris pentru prima dată de chimistul german Friedrich Otto Schott. Înainte de utilizare, indiferent de tipul de sticlă din care sunt confecţionate, toate instrumentele din sticlă trebuie sterilizate. Plasticul este un material care prezintă o serie de avantaje majore comparativ cu sticla. În primul rând este mult mai uşor, nu se sparge şi este mult mai ieftin de produs. Din aceste motive, instrumentele de laborator din materiale plastice au reuşit să le înlocuiască aproape complet pe cele din sticlă. Unele instrumente din plastic pot fi sterilizate înainte de utilizare, însă această operaţie este posibilă numai pentru anumite tipuri de materiale plastice (pentru detalii, consultaţi sub-capitolul Tehnici de sterilizare, pagina 21). De asemenea, deşi recipientele din materiale plastice (fie că este vorba despre polipropilenă, policarbonat sau Teflon) sunt inerte din punct de vedere chimic, înainte de a le pune în contact cu acizi, baze tari sau solvenţi organici este absolut necesară verificarea compatibilităţii lor chimice cu aceste substanţe (Tabelul A8 din Anexă pentru o compatibilitate generală, specificaţiile producătorului sau site-ul web http://www.coleparmer.com/TechInfo/ChemComp.asppentru compatibilitatea specifică).

4


Siliconarea sticlăriei şi a instrumentelor din materiale plastice Toate operaţiile de bază din laborator pot fi efectuate cu instrumente şi vase sterilizate, fără ca fenomenele de adsorbţie la suprafaţa sticlei sau a plasticului să genereze probleme. În cazul aplicaţiilor sensibile, ce presupun manipularea unor cantităţi foarte mici de acizi nucleici sau proteine este însă necesară acoperirea suprafeţelor cu un strat subţire de silicon. Pentru aceasta, se procedează după cum urmează: 1. se amplasează obiectele ce trebuie siliconate într-un exsicator de dimensiuni mari; exicatorul se racordează la o pompă cu vid prin intermediul unui tub prevăzut cu robinet şi a unei capcane de vapori; 2. pe o sticlă de ceas amplasată în interiorul exicatorului se pipetează 1 ml diclor-dimetil-silan;

Diclor-dimetil-silanul este toxic, volatil şi foarte inflamabil; toate operaţiile se vor realiza în nişa chimică. 3. se porneşte pompa şi se aplică vid până când diclor-dimetil-silanul începe să fiarbă; apoi se deconectează pompa prin rotirea robinetului conector şi se apasă butonul de oprire; în interiorul exsicatorului trebuie să se menţină vid; este esenţial ca pompa de vid să fie deconectată în momentul în care diclor-dimetil-silanul începe să fiarbă; în caz contrar, vaporii pot pătrunde în pompă şi pot distruge iremediabil garniturile acesteia; 4. după evaporarea completă a diclor-dimetil-silanului (1-2 ore) se deschide exicatorul în nişa chimică; instrumentele din sticlă astfel tratate se incubează apoi, timp de două ore, într-o etuvă la temperatura de 180oC; instrumentele din materiale ce nu permit sterilizarea se spală cu apă distilată. În cazul instrumentelor sau vaselor de dimensiuni mari, acestea se pot silicona prin imersarea sau spălarea cu o soluţie 5% de diclor-dimetilsilan în cloroform sau heptan. După evaporarea solventului, pe suprafeţe

Tehnici de bază

5

se depune un strat de diclor-dimetil-silan. În funcţie de natura materialului din care sunt confecţionateinstrumentele astfel tratate vor fi apoi spălate foarte bine cu apă distilată sau vor fi incubate timp de două ore într-o etuvă la temperatura de 180oC.

Spălarea şi uscarea vaselor de laborator Rezultatele analizelor de laborator, în special ale celor analitice, depind în mare măsură de modul în care se curăţă vasele utilizate. Vasele de laborator trebuie spălate imediat după utilizare pentru a se evita evaporarea solvenţilor, formarea crustelor şi a depozitelor care îngreunează mult procesul de spălare. În general, vasele din sticlă se spală foarte bine cu apă caldă şi detergent, după care se clătesc din abundenţă (de cel puţin trei ori) cu apă de robinet şi apoi de trei ori cu apă distilată înainte de a fi puse la uscat. La final, dacă vasul este bine spălat, apa distilată se scurge într-un strat continuu pe pereţii acestuia, fără a lăsa picături sau dâre. Deşi utilizarea detergenţilor este indicată, aceştia nu trebuie folosiţi în exces, deoarece numeroase reacţii chimice sau biologice sunt afectate de prezenţa lor. În cazul în care sticlăria prezintă urme persistente de grăsime, acestea sunt îndepărtate cu ajutorul solvenţilor organici (acetonă, hexan etc.), procedură urmată obligatoriu de spălare şi clătire cu apă distilată. În cazul precipitatele aderente, acestea se îndepărtează cu ajutorul unor perii cu dimensiuni adecvate (nu se utilizează baghete, sârme sau spatule care pot zgâria sticla), cu abur sau prin procedee chimice. Spălarea chimică se poate realiza cu diverse soluţii precum: acid azotic 1 M, aqua regia (o parte HNO3 concentrat şi trei părţi HCl concentrat), acid fluorhidric concentrat sau amestec sulfocromic. Amestecul sulfocromic se prepară prin dizolvarea a 90 g K2Cr2O7 în 100 ml apă distilată, la cald. Soluţia rezultată se răceşte, după care se adaugă cu atenţie, în fir subţire, sub agitare 900 ml H2SO4 concentrat. Amestecul sulfocromic se poate folosi la mai multe spălări, până când culoarea se schimbă sensibil, virând spre verde.


6

Amestecul sulfocromic este extrem de coroziv. Pipetele din sticlă se spală prin umplerea lor completă cu soluţie conţinând detergent, urmată de clătirea de trei ori cu apă de robinet, apoi cu apă distilată (de cel puţin trei ori). Pentru îndepărtarea depunerilor de pe pipete, acestea se introduc complet şi se menţin pentru câteva ore în amestec sulfocromic, după care se spală cu apă de robinet şi se clătesc cu apă distilată. După spălare, vasele se usucă, fie aşezate cu gura în jos pe un suport, fie în etuvă. Vasele din sticlă pot fi uscate în etuvă, la temperaturi cuprinse între 105oC şi 110oC timp de cel puţin o oră. În trecut se considera că vasele folosite în volumetrie nu trebuie uscate la temperatură deoarece se pot decalibra. Diverse studii au demonstrat însă că acest lucru nu se întâmplă. Vasele nu vor fi şterse în nici un caz în interior, deoarece rămân scame sau pot fi murdărite din nou prin atingere cu mâna; de asemenea, este interzisă uscarea vaselor la flacără. O modalitate utilizată pentru a grăbi uscarea este clătirea vaselor, după spălare, cu acetonă, după care acestea sunt suflate cu aer cald. Acetona utilizată la spălarea sticlăriei poate fi colectată şi recuperată prin distilare.

I.2 Măsurarea volumelor Deoarece majoritatea reacţiilor chimice şi toate reacţiile enzimatice au loc în mediu apos, capacitatea de a măsura corect un volum de lichid este un element esenţial, absolut necesar pentru realizarea experimentelor şi măsurătorilor în laborator. Manipularea lichidelor este preferată în detrimentul manipulării substanţelor solide deoarece are câteva avantaje practice, dintre care amintim doar două: 1. lichidele, spre deosebire de substanţele solide, pot fi foarte uşor divizate în fragmente foarte mici, lucru ce permite dozarea şi măsurarea lor precisă; 2. reacţiile chimice dintre două lichide miscibile au loc în toată masa amestecului, viteza de reacţie fiind astfel foarte mare.

Tehnici de bază

7

Pentru realizarea soluţiilor titrate şi aplicarea metodelor de dozare volumetrică se utilizează o serie de vase din sticlă cu rezistenţe chimică şi termică mare (baloane cotate, biurete, pipete gradate etc.) curate şi perfect uscate. Pentru pregătirea soluţiilor de concentraţii normale sau molare se folosesc baloane cotate. Volumul marcat pe balon este atins atunci când meniscul lichidului (soluţiei) este tangent inferior la inelul marcat pe gâtul balonului. Pentru citire exactă, balonul trebuie ridicat sau coborât, până privirea persoanei care face măsurătoarea se află în dreptul inelului de marcaj. Poziţia balonului trebuie să fie verticală.

Măsurarea volumelor cu ajutorul pipetelor Cel mai utilizat instrument pentru măsurarea foarte precisă a volumelor de lichid în laborator este pipeta. Aceasta poate fi: mecanică sau din sticlă. Pipetele mecanice care pot măsura volume cuprinse între 0,2 şi 1000 μl poartă numele de micropipete, iar cele care permit măsurarea volumelor mai mari poartă numele de macropipete. De la inventarea lor în anul 1960 de către dr. Hanns Schmitz (Marburg, Germania), a apărut un număr foarte mare de tipuri de pipete mecanice, clasificarea lor fiind extrem de dificilă. Cele mai importante sisteme de clasificare ţin cont de volumul măsurat (pipete mecanice cu volum fix şi pipete mecanice cu volum variabil) sau de numărul de probe măsurate simultan (pipetele monocanal permit prelevarea şi măsurarea unei singure probe, pipetele multicanal permit prelevarea şi măsurarea a 12 probe simultan). Elementele care alcătuiesc o pipetă mecanică monocanal cu volum variabil sunt prezentate în Figura 1. Instrucţiuni generale privind manipularea pipetelor mecanice: 1. pipetele se menţin în permanenţă cu vârful în jos pentru a preîntâmpina pătrunderea lichidului în tija pipetei;


8

A A1

B

F A2 C

D E FIGURA 1. Pipetă mecanică monocanal cu volum variabil. A – buton pentru pipetare cu trei poziţii; A1 – eticheta pipetei; A2 – striaţii pentru manipularea prin rotire a butonului (doar la anumite modele); B – ecran şi buton pentru stabilirea volumului măsurat; C – tijă; D – pârghie pentru detaşarea vârfului; E – vârf detaşabil din material plastic; F – buton de comandă pentru detaşarea vârfului(după Tropschung, 2008) (1).

2.

3.

vârful pipetei trebuie să fie bine fixat pe tija pipetei pentru a se asigura etanşeitatea; după pipetare, vârfurile utilizate se detaşează prin apăsarea butonului F (Figura 1) şi se colectează în vase speciale; vârfurile nu se aruncă în chiuvetă sau la coşul de gunoi; în cazul pipetelor cu volum variabil, volumul maxim este înscris în partea superioară, pe butonul pentru pipetare (Figura 1, A1); stabilirea volumului de pipetat se face prin rotirea butonului B (Figura 1) într-un sens sau în celălalt până la afişarea volumului dorit pe ecranul pipetei (Tabelul 1); nu este permisă rotirea butonului peste volumul maxim admis, această operaţiune putând conduce la decalibrarea pipetei;

Tehnici de bază

9

TABEL 1. Corespondenţa volum de pipetat – vârf de utilizat şi stabilirea volumului de pipetat Pipeta Intervalul de volum utilizabil (minim-maxim)

20 2-20 μl

200 20-200 μl

1000 200-1000 μl

Culoarea vârfului de utilizat

galben

galben

albastru sau alb

12,5 μl

125 μl

0,75 ml

Mod de citire

Pipeta poate fi utilizată în două moduri distincte, după cum urmează. a. Pipetarea obişnuită – presupune parcurgerea a şase etape distincte (Figura 2): 1. amplasarea unui vârf convenabil în pipetă (conform Tabelului 1) – se realizează prin aplicarea unei forţe suficient de mari pentru a realiza etanşeitate perfectă; 2. evacuarea aerului din pipetă – se realizează în afara lichidului, prin apăsarea până la punctul 2 a pistonului pentru pipetare (Figura 2, A); 3. aspirarea lichidului în pipetă – vârful pipetei se introduce în lichid şi pistonul pentru pipetare este eliberat lent până la punctul 1 (Figura 2, B); 4. evacuarea lichidului din pipetă – vârful pipetei se lipeşte de peretele vasului în care se face pipetarea (sau se introduce în lichid) şi pistonul pentru pipetare se apasă lent până la punctul 2 (Figura 2, C); 5. evacuarea completă a lichidului din pipetă – cu vârful pipetei în lichid, pistonul pentru pipetare se apasă lent până la punctul 2 (Figura 2, D); lichidul a fost complet evacuat dacă în vârful pipetei apare o bulă de aer;


10

6. vârful pipetei se scoate din lichid şi pistonul pentru pipetare este eliberat lent până la punctul 1; se apasă butonul pentru eliberarea vârfului şi ciclul se reia pentru o nouă pipetare (Figura 2, E).

1 2 3

A

B

C

D

E

FIGURA 2. Măsurarea volumelor cu ajutorul pipetelor mecanice A – evacuarea aerului din pipetă; B – aspirarea lichidului în pipetă; C, D – evacuarea lichidului din pipetă; E – revenirea în poziţia iniţială

b. Pipetarea inversată – se foloseşte la pipetarea soluţiilor vâscoase şi presupune parcurgerea aceloraşi şase etape, cu deosebirea că evacuarea aerului se face apăsând pistonul pentru pipetare până la punctul 3.

Tehnici de bază

11

Aspirarea lichidului se face prin eliberarea pistonului pentru pipetare până la punctul 1. În acest mod în pipetă pătrunde o cantitate mai mare de lichid decât volumul fixat. Evacuarea lichidului din pipetă se face prin apăsarea pistonului până la punctul 2, după care vârful conţinând o cantitate mică de lichid se scoate din vas şi se aruncă. Pipetele din sticlă permit măsurarea volumelor mari, de ordinul mililitrilor, însă, există şi modele ce permit măsurarea volumelor sub 1 ml. Pipetele din sticlă se împart în două tipuri distincte: pipete cotate şi pipete gradate. Pipetele cotate permit transferarea unui volum fix de lichid prin umplerea până la semnul marcat în partea superioară şi golirea lor sub influenţa gravitaţiei, fără a elimina ultima picătură din vârf. Acest tip de pipete au, în partea superioară,marcată inscripţia TD (engl. to deliver = a elibera) şi trebuie separate de cele care sunt inscripţionate TC (engl. to contain = a conţine). În cazul acestora din urmă, umplerea se face identic dar golirea pipetei se realizează prin eliminarea completă a lichidului, incluzând ultima picătură. Un tip intermediar de pipete, cu două marcaje de umplere în partea superioară, poate fi utilizat în ambele moduri (marcajul superior – modul TC, marcajul inferior – modul TD). Pipetele gradate permit transferarea unor volume variabile de lichid prin umplerea lor până la semn şi golirea sub influenţa gravitaţiei până la volumul dorit. În funcţie de gradaţiile din vârf, mai frecvent utilizate sunt două tipuri distincte de pipete gradate: – pipete serologice, gradate pe toată lungimea lor, inclusiv în vârful pipetei; ultima gradaţie este una intermediară faţă de volumul maxim al pipetei; – pipete Mohr, gradate până aproape de vârf; ultima gradaţie este chiar volumul maxim al pipetei. Indiferent de tipul pipetei gradate, în laborator este indicată utilizarea tehnicii de pipetare prin diferenţă. Aceasta constă în umplerea pipetei până la un volum mai mare decât cel care urmează a fi utilizat şi golirea până la un semn intermediar. De exemplu, pentru pipetarea unui volum de 10 ml se va folosi o pipetă de 25 ml care se va umple până la diviziunea 15 şi se va goli până la diviziunea 5. Diferenţa între cele două diviziuni reprezintă volumul dorit – 10 ml. Umplerea pipetelor se va efectua întotdeauna folosind o pară din cauciuc sau un pipetor şi niciodată gura. Pentru a măsura cu pipeta un anumit volum, se ataşează para de cauciuc în capătul pipetei, se apasă


12

valva notată cu A şi concomitent se evacuează aerul din pară prin strângerea acesteia (Figura 3). Pentru a aspira lichid, vârful pipetei se introduce în lichid şi se apasă valva S până când lichidul depăşeşte gradaţia dorită. Se şterge vârful pipetei cu hârtie de filtru, apoi se apasă valva E şi se lasă să se scurgă lichidul până când marginea inferioară a meniscului este tangentă la semn. Se aduce apoi pipeta astfel încât vârful ei să atingă peretele inferior al vasului în care urmează să se introducă lichidul măsurat şi se lasă să se scurgă liber prin apăsarea valvei E. La câteva secunde după golire se trage uşor vârful pipetei de-a lungul peretelui vasului. După utilizare, pipetele se spală şi se aşează în stative speciale, cu vârful în jos. Pară de cauciuc

A

S

Valva A – armare

Valva S–sucţiune

10 ml

Pipetă

E Lichid de măsurat Valva E–evacuare

FIGURA 3. Folosirea parei din cauciuc pentru măsurarea unor volume de lichid folosind pipete din sticlă

I.3 Măsurarea maselor Balanţa şi cântarul sunt unele dintre cele mai frecvent utilizate instrumente de laborator. Deşi termenii de “balanţă” şi “cântar” au devenit sinonimi, există o serie de diferenţe de ordin tehnic între cele două instrumente.

Tehnici de bază

13

Masa şi greutatea. Atunci când se utilizează o balanţă sau un cântar se are în vedere determinarea masei unui obiect sau a unei substanţe. Termenul de masă se referă la cantitatea de materie dintr-un obiect şi se măsoară în grame (cu multiplii şi submultiplii corespunzători). Greutatea unui obiect, se referă la forţa gravitaţională pe care o exercită acel obiect şi se măsoară în newtoni (N). Deoarece forţa gravitaţională este similară (dar nu identică) pe toată suprafaţa Pământului, un obiect de o masă dată va avea aproape aceeaşi greutate indiferent de locaţia unde este măsurată. Diferenţele dintre masă şi greutate sunt mult mai vizibile în afara câmpului gravitaţional al Pământului. Dacă acelaşi obiect este măsurat pe Terra şi pe Lună, masa sa va fi constantă, dar greutatea pe Lună va fi doar 1/6 din greutatea sa pe Pământ (2). O balanţă mecanică funcţionează prin compararea masei obiectului cu cea a unei greutăţi calibrate. Aceasta face ca, indiferent unde este cântărit obiectul, pe Lună sau pe Pământ, o balanţă cu două talere oferă aceeaşi valoare a masei. Un cântar prevăzut cu un singur taler măsoară forţa pe care o exercită un obiect asupra talerului. Cântarul măsoară în mod direct greutatea unui obiect după care transformă valoarea obţinută în masă printr-un simplu calcul matematic. Valoarea pentru masa unui obiect măsurat pe Pământ cu ajutorul unei balanţe electronice va fi total diferită de cea măsurate pe Lună, diferenţa fiind dată de forţa gravitaţională. Micile variaţii ale forţei gravitaţionale ce pot apărea (de exemplu la modificarea altitudinii) fac să fie absolut necesară calibrarea balanţei electronice în locaţia unde se doreşte a fi utilizată. Balanţa electronică este un instrument electronic de măsurare a maselor, esenţial în orice laborator. Balanţa electronică nu este propriu-zis o balanţă, ci un cântar electronic performant care poate măsura greutatea unui obiect amplasat pe taler şi transformă valoarea în masă. Deoarece denumirea de balanţă electronică este cea încetăţenită, o vom utiliza ca atare în cele ce urmează. Datorită gamei largi de utilizare a balanţelor, au fost inventate numeroase tipuri constructive, fiecare adaptat la o aplicaţie specifică. Pentru alegerea în mod judicios a tipului de balanţă utilă într-un laborator, este absolut necesară cunoaştere semnificaţiei parametrilor de funcţionare ai acesteia. Dintre aceştia, cei mai importanţi sunt: 1. capacitatea – masa maximă ce poate fi amplasată pe taler; 2. precizia – valoarea celei mai mici diviziuni ce poate fi citită de pe ecranul balanţei;

14


3. repetabilitatea (reproductibilitatea) – capacitatea balanţei electronice de a afişa aceeaşi valoare la amplasarea repetată a aceluiaşi obiect pe taler. În general, într-un laborator sunt necesare cel puţin două balanţe, deoarece aceşti parametri funcţionali fac imposibilă utilizarea unei singure balanţe în toate situaţiile în care se doreşte măsurarea maselor. Cel mai frecvent este utilizată combinaţia dintre o balanţă de capacitate mare (600 g) şi precizie mică (0,1 g) şi o balanţă analitică cu capacitatea de 110 g şi precizia de 0,0001 g. Obiectele de cântărit nu se amplasează direct pe talerul balanţei. Din acest motiv, pentru măsurarea maselor sunt necesare alături de balanţă şi alte materiale, precum sticle de ceas, hârtie şi vase de cântărire de unică folosinţă. Acestea din urmă sunt, în general, confecţionate din material plastic non-absorbant, care nu produce electricitate statică, proprietate extrem de importantă când se doreşte cântărirea unor cantităţi foarte mici de substanţă.

Instrucţiuni privind utilizareabalanţei electronice analitice Măsurarea maselor cu ajutorul balanţei electronice analitice se realizează prin parcurgerea următoarelor etape: 1. se porneşte balanţa şi se aşteaptă până când pe ecranul acesteia este afişat 0,0000 g; 2. se deschide geamul de protecţie al balanţei şi se amplasează vasul de cântărire pe talerul balanţei; 3. se închide geamul de protecţie al balanţei şi se aşteaptă până când semnul specific pentru atingerea echilibrului este afişat; acest semn diferă de la un producător la altul şi din acest motiv se recomandă consultarea manualului balanţei pentru identificarea acestuia; 4. se apasă butonul de 0 (TARE) până când pe ecranul balanţei este afişat 0,0000 g; 5. se deschide geamul de protecţie al balanţei şi se adaugă cu atenţie, folosind o spatulă de dimensiuni adecvate, substanţa de cântărit în vasul de cântărire;

Tehnici de bază

15

6. se închide geamul de protecţie al balanţei; 7. se aşteaptă până când semnul specific pentru atingerea echilibrului este afişat, după care se citeşte valoarea masei; 8. se ia vasul de cântărire conţinând substanţa cântărită de pe taler; dacă se doreşte utilizarea repetată a vasului de cântărire, este indicat ca acesta să nu fie manipulat direct cu mâna, deoarece amprentele modifică masa vasului.

I.4 Centrifugarea Procesul care implică utilizarea forţelor centrifugale pentru sedimentarea amestecurilor neomogene poartă numele de centrifugare şi se realizează cu ajutorul unui dispozitiv numit centrifugă. Acţionată în general de un motor electric (deşi există modele care sunt acţionate manual), centrifuga roteşte eprubetele de centrifugă în jurul unui ax fix, aplicând o forţă perpendiculară pe acesta. Datorită acceleraţiei centripete apare fenomenul de sedimentare, substanţele mai dense migrând spre fundul eprubetei iar cele mai uşoare spre gura acesteia. Centrifuga este un echipament care nu trebuie să lipsească din dotarea nici unui laborator. Pentru a descrie corect operaţia de centrifugare şi pentru a asigura repetabilitatea ei în orice laborator, este necesară precizarea forţei de cetrifugare (RCF, măsurată în g). Această forţă corespunde unei anumite viteze (în rotaţii pe minut, rpm) pentru o centrifugă dată şi un anumit rotor. Folosind o altă centrifugă sau aceeaşi centrifugă dar cu un alt rotor, pentru aceeaşi viteză de rotaţie se va obţine o altă forţă de centrifugare. Relaţia care descrie legătura dintre forţa de centrifugare şi viteza de rotaţie este:

unde: RCF – forţa de centrifugare; r – distanţa de la axul rotorului până la fundul eprubetei aflată în poziţie normală în timpul centrifugării; rpm – viteza de rotaţie a rotorului măsurată în rotaţii pe minut (rpm).

16


O modalitate alternativă de transformare a vitezei de centrifugare în forţă de centrifugare şi viceversa este oferită de nomogramele din Anexă, Figurile A1şi A2. Toate centrifugările descrise în acest manual presupun utilizarea unor microeprubete de centrifugă de tip Eppendorf şi a rotoarelor corespunzătoare. În general, toate rotoarele construite pentru microeprubetele de tip Eppendorf au valori apropiate pentru r (aprox. 9,2 cm). De asemenea, o centrifugare descrisă în acest manual ca fiind ˝la viteză maximă˝ reprezintă o centrifugare efectuată la 14.000rpm.

Instrucţiuni privind utilizarea centrifugii Datorită numărului mare de modele şi tipuri constructive de centrifugi existente, formularea unor instrucţiuni universal valabile este extrem de dificilă. Din acest motiv, în cele ce urmează este prezentat modul de utilizare a centrifugiiHettich Rotina 420R. Deşi au caracter particular, instrucţiunile pot fi uşor aplicate la orice alt model de centrifugă prin simpla consultare a manualului de utilizare. Pornirea se realizează prin operarea butonului ON/OFF plasat în partea inferioară a corpului centrifugii, deschiderea capacului fiind posibilă prin apăsarea butonului roşu STOP/OPEN abia după apariţia mesajului OPEN. Închiderea capacului se efectuează prin apăsarea uşoară a acestuia. Stabilirea parametrilor de centrifugare: 1. timp – se apasă butonul TIME şi apoi prin manevrarea butonului rotativ se stabileşte valoare dorită în minute; prin apăsarea repetată a butonului TIME se selectează unităţile de măsurare a timpului (ore, minute, secunde); Apăsarea butonului START conduce la memorarea valorii stabilite; 2. viteza de rotaţie – se apasă butonul RPM apoi, prin manevrarea butonului rotativ, se stabileşte valoarea dorită în rotaţii pe minut; apăsarea butonului START duce la memorarea valorii stabilite; dacă se doreşte stabilirea forţei de centrifugare în rcf, se foloseşte butonul RCF;

Tehnici de bază

17

3. Temperatura – se apasă butonul ToC apoi, prin manevrarea butonului rotativ, se stabileşte valoare dorită în grade Celsius; apăsarea butonului START conduce la memorarea valorii stabilite. Centrifugarea se realizează: 1. numai după echilibrarea corectă a eprubetelor cu probe, plasate pe diagonală; nu se acceptă diferenţe mai mari de 0,5 g între poziţiile diagonale (1-3, 2-4); 2. toate dispozitivele port-probe trebuie să fie prevăzute cu adaptoare pentru eprubete; 3. capacele galbene trebuie înfiletate pe dispozitivele port probe.

Capacele prezintă o garnitură circulară care poate fi uşor pierdută Pornirea centrifugii: 1. se realizează prin apăsarea butonului START; centrifugarea poate fi oricând oprită prin apăsarea butonului roşu STOP/OPEN; 2. la epuizarea timpului stabilit pentru centrifugare, centrifuga se opreşte automat; emiterea unui semnal sonor împreună cu afişarea mesajului OPEN indică faptul că poate fi deschis capacul prin apăsare butonul roşu STOP/OPEN).

I.5 Tehnici de bază folosite pentru manipularea microorganismelor Măsuri de biosecuritate Utilizarea microorganismelor în laboratorul de biologie moleculară presupune respectarea unor reguli minime de biosecuritate. Aceste reguli se referă la un set de măsuri necesare atât pentru protecţia personalului care lucrează, cât şi pentru prevenirea contaminării culturilor microbiene, mediilor de cultură şi soluţiilor stoc cu microorganisme nedorite. Deoarece scopul oricărui cercetător este să cultive microorganisme (celule procariote

18


sau eucariote) fără introducerea altor organisme străine, aplicarea în laborator a măsurilor de biosecuritate este esenţială pentru acurateţea şi reuşita experimentelor. Trebuie avut în vedere de la început faptul că un mediu de lucru complet steril nu există (3). Cu toate acestea, pot fi aplicate o serie de măsuri simple care pot reduce riscul contaminării cu microorganisme: 1. spaţiile de lucru în condiţii sterile trebuie plasate departe de ferestre deschise, instalaţii de aer condiţionat, ventilatoare etc.; 2. depozitarea deşeurilor biologice trebuie făcută în containere speciale, închise, depozitate în alte spaţii decât cele în care se lucrează; 3. curăţarea şi dezinfectarea suprafeţelor de lucru înainte de utilizare; 4. limitarea pe cât posibil a duratei de timp cât recipientele în care se află culturile microbiene sunt lăsate fără dop sau capac; 5. păstrarea plăcilor Petri cu capacul închis atâta vreme cât este posibil; 6. sterilizarea eficientă a anselor de însămânţare precum şi a tuturor instrumentelor care vin în contact cu microorganismele; 7. evitarea contactului instrumentelor şi mediilor sterile cu aerul expirat. În principiu, aplicarea unor standarde înalte de curăţenie poate elimina riscul contaminării zonelor de lucru. Praful şi murdăria trebuie îndepărtate cu regularitate; suprafeţele de lucru trebuie spălate imediat după utilizare cu soluţie hipoclorit de sodiu 10% sau cu soluţii speciale de dezinfectare disponibile în comerţ; utilizarea dezinfectanţilor organici precum alcool etilic 70% este, în general, mai puţin eficientă din cauza faptului că etanolul se poate evapora înainte de a steriliza suprafeţele. Persoanele care lucrează în laborator trebuie să se spele pe mâini de mai multe ori pe zi, în special înainte de a efectua manipularea culturilor microbiene; de asemenea trebuie să poarte halat de protecţie, îmbrăcămintea de exterior fiind păstrată în dulapuri situate în afara laboratorului. Cel mai simplu mod de a crea un mediu relativ steril în laborator presupune utilizarea becului de gaz (arzătorului Bunsen). Acest echipament funcţionează prin arderea continuă a unui gaz inflamabil, de obicei gazul metan. Principiul utilizării sale constă în crearea unei zone de aer cald în jurul flăcării care reduce viabilitatea organismelor şi suspendă particulele de praf, permiţând lucrul în condiţii sterile. De asemenea,

Tehnici de bază

19

datorită flăcării ce degajă o temperatură de 1200-1500oC, becul de gaz poate fi utilizat şi pentru sterilizarea anselor de însămânţare, a gurii eprubetelor şi baloanelor din sticlă, flambarea lamelor din sticlă etc. Prevenirea contaminării culturilor microbiene sau a reactivilor se poate realiza mult mai eficient prin utilizarea hotei cu flux de aer laminar. Acest echipament furnizează o zonă de lucru cu aer steril, împiedicând pătrunderea aerului cu microorganisme şi impurităţi din laborator. Sterilizarea aerului introdus în zona de lucru se realizează prin filtrare, utilizând filtre speciale – HEPA (engl.High-Efficiency Particulate Air– filtre cu o eficienţă ridicată de filtrare), care pot reţine 99,97% din particulele de praf, polen, fungi, bacterii cu dimensiuni mai mari de 0,3 μm la un debit de 85 litri/min. Aerul din încăpere este mai întâi prefiltrat pentru a îndepărta particulele cu dimensiuni mari care pot bloca filtrele HEPA după care este filtrat, îndepărtându-se toate bacteriile. După filtrare, aerul ajunge în zona de lucru sub forma unei perdele uniforme, la o viteză constantă, împiedicând pătrunderea microorganismelor din încăpere în interiorul hotei. În funcţie de orientarea perdelei de aer steril, hotele cu flux de aer laminar pot fi împărţite în două tipuri constructive distincte:  hote cu flux de aer laminar orizontal (Figura 4, A), care asigură o foarte bună protecţie a obiectelor de pe suprafaţa de lucru dar nu şi a operatorului, aerul potenţial contaminat cu microorganismele manipulate fiind direcţionat către acesta;  hote cu flux de aer laminar vertical (Figura 4, B), ce asigură o foarte bună protecţie atât a obiectelor de pe suprafaţa de lucru cât şi a operatorului; în acest caz aerul potenţial contaminat cu microorganismele manipulate este filtrat şi apoi eliminat. Oricare ar fi tipul constructiv de hotă, blocarea filtrelor HEPA sau întreruperea perdelei de aer filtrat permit introducerea de microorganisme contaminante în interiorul zonei de lucru.


20

Filtru HEPA

Filtru HEPA

Filtru HEPA Perete de protecţie din sticlă

Suprafaţa de lucru

Pre-filtru Suprafaţa de lucru

A

B

FIGURA 4. Tipuri constructive de hote cu flux de aer laminar: orizontal (A) şi vertical (B)(după Bykowski şi Stevenson, 2008 (3)) Instrucţiuni de utilizare a hotei cu flux de aer laminar: 1. Înainte de începerea lucrului se recomandă îndepărtarea bijuteriilor de pe mâini, legarea părului la spate şi îmbrăcarea halatului de protecţie. 2. Se spală mâinile şi se utilizează mănuşi de unică folosinţă; suprafaţa exterioară a mănuşilor se acoperă cu soluţie dezinfectantă şi se freacă bine pentru o sterilizare eficientă înainte de introducerea mâinilor în hotă. 3. Mâinile se păstrează în interiorul zonei de lucru fără a atinge pe cât posibil părul, faţa sau hainele; pericolul de contaminare creşte de fiecare dată când se ating recipiente sau alte obiecte nesterile; din acest motiv se recomandă repetarea periodic a procedurii de dezinfectare a mănuşilor. 4. În vederea utilizării, hota cu flux de aer laminar trebuie pornită cu cel puţin 30 de minute înainte de începerea efectivă a lucrului. 5. Înainte de utilizare, hota trebuie curăţată şi dezinfectată; zona de lucru se acoperă cu alcool etilic 70% sau alţi cu dezinfectanţi disponibili în comerţ şi se şterge cu şerveţele care nu lasă puf. 6. Orice obiect ce urmează a fi introdus în zona de lucru, chiar şi recipiente din material plastic sau sticlărie considerate sterile

Tehnici de bază

21

trebuie dezinfectate prin ştergerea suprafeţelor exterioare cu alcool etilic 70%; se îndepărtează întotdeauna ambalajele sau pungile în care sunt împachetate pipetele, ansele de unică folosinţă, plăcile Petri etc. la marginea zonei de lucru înainte de a fi introduse în hotă. 7. Pentru reducerea contaminării se păstrează tot timpul în interiorul hotei un set de pipete sau alte instrumente necesare cu care se lucrează exclusiv în această incintă. 8. Se organizează spaţiul de lucru astfel încât să se lase o zonă liberă în centru şi să existe acces la toate obiectele din interior; se evită în acest fel pericolul producerii unor accidente precum şi cel al contaminării recipientelor lăsate deschise în interior. 9. În cazul scurgerii unor lichide contaminate se curăţă imediat zona respectivă cu apă distilată sterilă şi alcool etilic 70% sau cu alţi dezinfectanţi, după care se reia lucrul. 10. Nu se plasează obiecte mari în dreptul orificiilor prin care iese aerul filtrat în interiorul zonei de lucru; se evită astfel blocarea fluxului de aer precum şi contaminarea cu microorganisme. 11. La terminarea lucrului, se îndepărtează toate obiectele inutile şi se curăţă suprafeţele cu alcool etilic 70%. 12. Nu se păstrează în interiorul hotei resturi, culturi vechi, cutii goale, caiete, cărţi, pixuri etc. 13. Majoritatea hotelor cu flux de aer laminar sunt dotate cu lămpi UV care pot fi pornite la sfârşitul lucrului în scopul sterilizării suprafeţelor interioare; nu se lasă în acest timp culturi cu microorganisme în interiorul hotei; se recomandă ca pe toată durata sterilizării cu UV în încăpere să nu se afle nicio persoană.

Tehnici de sterilizare Desfăşurarea experimentelor în condiţii de asepsie presupune sterilizarea – distrugerea completă sau eliminarea tuturor organismelor viabile de pe instrumentele sau din reactivii utilizaţi. Există şi reactivi care nu necesită sterilizare: etanol, fenol, detergenţi concentraţi sau reactivi sterili furnizaţi de către producători şi care pot fi utilizaţi direct. Există mai multe tehnici de sterilizare care pot fi folosite cu succes în laborator, bazate pe utilizarea temperaturilor sau presiunilor ridicate,

22


substanţelor chimice (lichide sau gaze), radiaţiilor sau pe îndepărtarea fizică a microorganismelor. Sterilizarea anselor de însămânţare se realizează prin încălzire la roşu în flacăra unui bec de gaz (4). Se introduce firul metalic al ansei în partea superioară a flăcării unde temperatura degajată este maximă şi se menţine până la înroşire. Înainte de utilizare trebuie avută în vedere răcirea completă a ansei pentru a se evita distrugerea microorganismelor ce urmează a fi însămânţate. Pentru răcire se păstrează ansa în apropierea becului de gaz; nu se suflă peste ansă, nu se agită şi nu se atinge de obiecte sau suprafeţe nesterile, deoarece există pericolul de contaminare. Ansa se utilizează imediat după sterilizare, iar după folosire se sterilizează din nou. Tehnica poate fi utilizată şi pentru sterilizarea altor obiecte metalice: spatule, ace de seringă etc. Flambarea se utilizează pentru sterilizarea unor obiecte din sticlă (gâtul baloanelor şi eprubetelor, lame din sticlă etc.) şi constă în trecerea rapidă şi repetată prin flacăra becului de gaz. Măsuri de securitate Deoarece există riscul apariţiei unor incendii sau al unor arsuri, utilizarea becului de gaz impune o serie de măsuri de siguranţă: 1. flacăra becului se lasă aprinsă doar cât timp se lucrează; uneori flacăra albastră este greu de observat, motiv pentru care se recomandă să nu se lase becul de gaz deschis, nesupravegheat; 2. deoarece arsurile reprezintă cel mai frecvent accident care poate să apară în laborator, se recomandă ca faţa, mâinile, părul şi hainele să fie ţinute departe de flacăra becului de gaz; 3. temperatura flăcării atinge frecvent 1500oC, motiv pentru care obiectele din sticlă sau metalice introduse în flacără se încălzesc foarte repede; toate aceste obiecte au nevoie de timp ca să se răcească, astfel încât să poată fi folosite în siguranţă; 4. este absolut necesar ca substanţele inflamabile sau materialele combustibile să fie ţinute departe de flacăra becului de gaz; 5. se recomandă dotarea laboratorului cu stingătoare de incendiu şi verificarea periodică a instalaţiei de gaz. Sterilizarea cu ajutorul etuvei Etuva poate fi utilizată pentru sterilizarea unor obiecte din sticlă

Tehnici de bază

23

(eprubete, plăci Petri, pahare, baloane etc.), metalice sau alte obiecte care nu se topesc la temperaturi cuprinse între 121oC şi 180oC căldură uscată. Deoarece căldura uscată are o putere mai mică de penetrare în celulele vii, fiind necesar un timp mai mare de transfer, sterilizarea cu ajutorul etuvei se realizează timp de două ore la temperatura de 160oC sau o oră la temperatura de 180oC. Procedeul nu poate fi utilizat în cazul lichidelor sau al obiectelor din cauciuc sau material plastic. Cu toate acestea, sterilizarea cu ajutorul etuvei prezintă unele avantaje: nu determină ruginirea obiectelor metalice; inactivează enzimele care degradează ARN-ul (ARN-aze) permiţând astfel sterilizarea sticlăriei folosite în experimentele în care sunt implicaţi acizii nucleici; poate fi utilizată pentru sterilizarea pulberilor sau altor substanţe afectate de sterilizarea prin autoclavare. Autoclavarea Această tehnică de sterilizare se bazează pe acţiunea vaporilor de apă aflaţi sub presiune şi presupune utilizarea autoclavului. Prin autoclavare pot fi sterilizate rapid majoritatea obiectelor, mediilor de cultură şi substanţelor care nu sunt termolabile. Vasele sau mediile de cultură care conţin solvenţi, substanţe chimice volatile sau corozive (fenol, acid tricloracetic, eteri, cloroform) sau orice fel de izotopi radioactivi nu pot fi autoclavate sub nicio formă. Autoclavarea se realizează la temperatura de 121oC, presiunea de aproximativ 1 atm, timp de 20-30 minute, condiţii care permit distrugerea tuturor formelor de viaţă, inclusiv a endosporilor bacterieni. Timpul şi temperatura de sterilizare pot varia în funcţie de cantitatea şi tipul materialelor care urmează a fi autoclavate. Astfel, în anumite situaţii (obiecte cu suprafaţă care nu permite un transfer termic rapid sau cu o capacitate mică de penetrare la vaporii de apă, volume de mediu mai mari de un litru, tuburi de centrifugă acoperite cu folie de aluminiu, microorganisme patogene) se vor creşte timpul, temperatura şi presiunea de autoclavare (30-60 min, 134oC, aproximativ 2 atm). Prin această tehnică este posibilă sterilizarea unor obiecte din material plastic, mai precis a celor din polipropilenă şi policarbonat. Obiectele din polietilenă sau polietilenă de înaltă densitate nu pot fi autoclavate. Pentru siguranţă se urmăresc simbolurile de identificare a materialului prezente pe obiectele respective: PP = polipropilenă; PC = policarbonat; PE = polietilenă; HDPE = polietilenă de înaltă densitate.

24


Modul de utilizare a autoclavului: 1. Se introduce în autoclav apă distilată până la nivelul indicat. 2. Obiectele de sterilizat se introduc în coşul din material inoxidabil, care se acoperă cu hârtie pentru a se evita umezirea lor de către apa de condesare a vaporilor de pe capac; toate materialele trebuie ambalate în pungi speciale de autoclavare sau în tuburi din oţel inoxidabil; materialele uscate se ambalează în folie de aluminiu pentru a se evita umezirea şi recontaminarea lor după sterilizare; recipientele goale din sticlă se umplu cu apă, 3-5 cm, pentru a se evita spargerea fundului; nu se aglomerează interiorul autoclavului pentru a se permite o sterilizare eficientă. 3. Lichidele se sterilizează separat în recipiente din sticlă; se recomandă utilizarea unor recipiente din sticlă termorezistentă (borosilicat) având un volum dublu faţă de volumul lichidului ce urmează a fi sterilizat, iar capacul nu se strânge foarte tare; se evită astfel pericolul scurgerii sau exploziei datorat presiunii ridicate din timpul autoclavării. 4. Se închide etanş capacul autoclavului prin strângerea mânerului. 5. Se selectează temperatura şi timpul de sterilizare (sau în cazul unui program presetat numărul acestuia) şi se apasă butonul Start; temperatura din interior va începe să crească, ceea ce duce la fierberea apei, formarea de vapori şi creşterea presiunii interioare; temperatura şi presiunea sunt menţinute la valori constante pe toată durata sterilizării; la finele autoclavării încălzirea apei este oprită, temperatura din interior scade ceea ce duce la condensarea vaporilor de apă şi la scăderea presiunii interioare; când presiunea ajunge la 0 atm procesul de sterilizare se încheie. 6. Se aşteaptă semnalul sonor de sfârşit al procesului de sterilizare şi se deschide cu grijă capacul autoclavului. Pentru optimizarea autoclavării în laborator pot fi utilizate două tipuri de cicluri de evacuare a vaporilor de aer: 1. ciclu de evacuare rapidă – se utilizează pentru toate materialele uscate cum ar fi sticlărie, vârfuri de pipete automate, tuburi de centrifugă etc.; în acest caz, la sfârşitul ciclului de sterilizare se deschide o valvă care permite evacuarea rapidă a vaporilor de apă astfel încât presiunea interioară se egalizează rapid cu cea atmosferică; 2. ciclu de evacuare lentă – se utilizează pentru lichide şi previne

Tehnici de bază

25

riscul apariţiei unor explozii sau al scurgerilor datorate fierberii; în acest caz, la finele autoclavării vaporii de apă sunt evacuaţi lent ceea ce permite lichidelor foarte fierbinţi să se răcească treptat. Pentru a se verifica dacă autoclavarea a decurs cu succes, materialele sau recipientele se marchează cu o hârtie indicatoare specială care conţine substanţe chimice ce îşi modifică culoarea la o temperatură egală cu cea la care are loc sterilizarea. Măsuri de securitate Deoarece funcţionarea autoclavului se bazează pe acţiunea vaporilor de apă aflaţi sub presiune, există riscul apariţiei unor explozii sau a unor arsuri severe. Din aceste motive se impun anumite măsuri care să limiteze aceste riscuri: 1. în timpul folosirii autoclavului se recomandă utilizarea halatului de protecţie, ochelarilor de protecţie şi a mănuşilor termorezistente; 2. cele mai multe accidente pot apare în momentul deschiderii capacului; din acest motiv, după încheierea sterilizării, se aşteaptă scăderea presiunii la 0 atm înainte de deschidere; 3. se recomandă ca deschiderea capacului să fie făcută lent, lăsând iniţial o fantă prin care să poată ieşi vaporii de apă; 4. lichidele sterilizate sunt foarte fierbinţi, chiar dacă autoclavarea s-a încheiat, existând în continuare pericol de explozie sau de scurgere; se recomandă lăsarea capacului deschis timp de 10-20min pentru o răcire adecvată şi apoi scoaterea recipientelor. Filtrarea Mediile de cultură complexe şi unii compuşi precum antibioticele, glucidele, aminoacizii sau vitaminele nu pot fi sterilizate prin autoclavare deoarece suferă procese de denaturare în prezenţa căldurii. Pentru a putea fi sterilizate se apelează la filtrare, procedeu prin care se îndepărtează fizic organismele vii, sporii etc. Filtrarea nu este o metodă de sterilizare perfectă, deoarece virusurile şi chiar unele bacterii pot traversa pereţii filtrelor. Cea mai mare parte a organismelor vii este reţinută de filtre cu dimensiuni medii ale porilor de 0,45 μm. Bacteriile pot trece prin astfel de filtre şi, prin urmare, pentru îndepărtarea lor este necesară utilizarea unor filtre cu dimensiuni ale porilor de 0,22 μm. Unele bacterii (de exemplu, speciile genului Leptospira) pot străbate aceste filtre, însă ele necesită condiţii speciale de cultivare şi din acest motiv nu prezintă o problemă din punct de vedere al contaminării în laboratorul de biologie moleculară.

26


Pentru a uşura filtrarea, în laborator se utilizează elemente filtrante care pot fi ataşate la seringile din material plastic (Figura 5). Astfel de filtre de unică folosinţă, cu dimensiuni diferite ale porilor, sunt disponibile în comerţ. Filtrarea se realizează de obicei în hota cu flux de aer laminar sau în apropierea flăcării becului de gaz pentru a se reduce riscul recontaminării lichidelor sterilizate.

FIGURA 5. Elemente filtrante de unică folosinţă utilizate pentru sterilizarea soluţiilor Sterilizarea cu radiaţii ultraviolete Radiaţiile ultraviolete (UV) pot fi utilizate pentru distrugerea microorganismelor prin alterarea ADN-ului, permiţând sterilizarea suprafeţelor de lucru precum şi a atmosferei din camera în care se lucrează. Aceste radiaţii nu pot penetra prin sticlă, prin urmare nu pot fi utilizate pentru sterilizarea conţinutului unor recipiente din sticlă. Măsuri de securitate Lumina ultravioletă este dăunătoare pentru om, determinând orbirea sau arsuri ale pielii. Prin urmare, se recomandă să nu se utilizeze lămpile cu lumină UV când există persoane în încăpere şi să nu se privească direct în lumina UV fără ochelari de protecţie speciali.

Tehnici de bază

27

Bibliografie 1. Tropschung, M. (2008) – Praktikum der Biochemie und Molekular Biologie I&II, p. 6. 2. Guzy, M. (2008) – Weight measurement in Current Protocols Essential Laboratory Techniques (Gallagher, S., Wiley, E., Eds.), p. 1.2.11.2.11. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA. 3. Bykowski, T., Stevenson, B. (2008) – Aseptic Techniques in Current Protocols Essential Laboratory Techniques (Gallagher, S., Wiley, E., Eds.). John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA. 4. Dunca, S., Ailiesei, O., Nimiţan, E., Stefan, M. (2001) – Microbiologie aplicată, p. 300. Ed. Tehnopress, Iaşi.

II. METODE DE CULTIVARE A BACTERIEI ESCHERICHIA COLI Bacteria Escherichia coli este cel mai bine studiat microorganism, fiind utilizat ca model experimental în diferite ramuri ale biologiei (1). Descoperită în anul 1885 de către medicul Theodor Escherich, E. coli (Figura 6) este un bacil Gram negativ, facultativ anaerob şi nesporulat, cu un cromozom circular format din trei milioane perechi de baze şi cu dimensiuni de aproximativ 2 µm lungime şi 0,5 µm lăţime.

FIGURA 6. Escherichia coli – imagine electronomicroscopică E. coli poate creşte pe medii minimale care conţin un compus cu carbon (de exemplu glucoza care serveşte atât ca sursă de carbon cât şi ca sursă de energie) şi săruri care asigură necesarul de azot şi fosfor. Bacteria poate creşte mai rapid pe medii îmbogăţite care conţin aminoacizi, precursori ai nucleotidelor, vitamine sau alţi metaboliţi pe care celulele ar trebui să le sintetizeze în alte condiţii. Se dezvoltă în intestin, făcând parte din microbiota normală, naturală intestinală, jucând roluri importante: sursă de vitamine B12 şi K; împiedică colonizarea intestinului cu bacterii patogene. Există şi situaţii când E. coli devine patogenă: atunci când contaminează tractul urinar (este cea mai importantă bacterie în etiologia infecţiilor urinare); când trece prin peretele intestinal şi pătrunde în abdomen; în situaţia

30


pătrunderii în organism a unor tulpini virulente. Această bacterie este utilizată în prezent atât în laborator cât şi la nivel industrial pentru obţinerea unor cantităţi mari de ADN, proteine sau metaboliţi datorită ritmului său rapid de creştere şi a faptului că tehnicile de manipulare genetică sunt foarte bine puse la punct. Un exemplu în acest sens îl constituie modificarea genetică realizată de compania Eli Lilly în anul 1982 prin care gena umană care codifică insulina a fost introdusă în genomul E. coli, permiţând obţinerea şi izolarea într-o manieră simplă a acestui hormon. Cu foarte puţine excepţii, cea mai mare parte a tulpinilor de E. coli utilizate în laboratoarele de biologie moleculare sunt derivate din tulpina K-12 (2).

II. 1 Medii utilizate pentru cultivarea bacteriei Escherichia coli Mediile de cultură artificiale sunt substraturi nutritive (lichide sau solide, organice sau anorganice) ce pot asigura dezvoltarea şi multiplicarea microorganismelor în condiţii de laborator (3). Mediile se folosesc pentru izolarea şi păstrarea sub formă de culturi pure a microorganismelor, precum şi pentru identificarea speciilor în funcţie de proprietăţile lor fiziologice. Din aceste motive, ele trebuie să fie cât mai asemănătoare cu substraturile naturale. Dacă necesităţile nutritive ale E. coli sunt bine cunoscute, cele ale altor bacterii variază foarte mult, fiind uneori necesare medii de cultură şi condiţii de creştere care depind de fiecare specie în parte. Deşi eforturile de mai bine de un secol ale oamenilor de ştiinţă s-au finalizat prin cultivarea in vitro a mai multor bacterii de interes (în special cele patogene), se apreciază în prezent că doar 1% din totalul speciilor bacteriene pot fi cultivate în laborator (1). În funcţie de compoziţie, există mai multe medii de cultură uzuale folosite pentru cultivarea bacteriei E. coli: 1. medii minimale– conţin minimul de substanţe nutritive necesare creşterii celulelor în absenţa aminoacizilor; acest tip de medii au o compoziţie bine definită, ingredientele fiind adăugate în concentraţii precise; ele conţin în general o sursă de carbon şi energie care poate fi reprezentată de un glucid (de exemplu glucoza) sau o sursă mai săracă în energie cum este succinatul, diferite săruri care asigură necesarul de magneziu, azot,

Metode de cultivare a bacteriei Escherichia coli

31

fosfor, sulf, permiţând bacteriilor să sintetizeze proteine şi acizi nucleici; mediile minimale sunt folosite frecvent pentru studii privind metabolismul sau pentru selecţia tulpinilor recombinate. În anumite situaţii mediile minimale pot fi suplimentate cu un compus folosit pentru selecţie (de regulă un aminoacid sau un glucid) în scopul cultivării selective a unor tulpini modificate genetic, auxotrofe pentru compusul respectiv. 2. medii complexe– conţin ingrediente a căror compoziţie nu poate fi definită foarte precis; un exemplu îl constituie mediul LB care conţine extract de drojdii alcătuit din toate componentele unei celule levuriene; aceste medii sunt folosite pentru cultivări uzuale ale bacteriilor deoarece asigură un mediu bogat în nutrienţi, bacteriile nefiind supuse unui stres nutritiv şi nu sunt forţate să sintetizeze compuşii de care au nevoie pornind de la precursori.

Medii de cultură minimale Ingredientele folosite pentru prepararea acestor medii se adaugă în apă, fiind încălzite şi agitate până la dizolvare completă. Ulterior se repartizează în recipiente separate, se sterilizează prin autoclavare timp de 15 min la presiunea de 1 atm. Suplimentele nutritive sau antibioticele sterilizate prin filtrare se adaugă după autoclavare, când mediul are o temperatură mai mică de 50oC. După răcire completă, capacul recipientelor se strânge bine, iar mediile pot fi păstrate la temperatura camerei sau la 4oC pe o perioadă nedefinită. Pentru păstrare se pot adăuga 50 ml cloroform care are rol de conservant (cloroformul se separă sub forma unui strat la fundul vasului astfel încât poate fi evitată utilizarea sa la prepararea mediului 1X). Înainte de utilizare, mediile concentrate 5X se diluează cu apă în proporţie de 1:5 şi se adăugă următoarele soluţii sterilizate prin filtrare: 1. MgSO4 x 7H2O 1 M – 1 ml; 2. sursă de carbon 20% (de obicei glucoză sau glicerol) – 10 ml; sursa de carbon se alege în funcţie de necesităţile tulpinii folosite sau de natura experimentului. În funcţie de necesităţi, în mediile minimale se pot adăuga: 1. vitamina B1 (tiamină) 0,5% – 0,1 ml; 2. amestec aminoacizi proveniţi prin hidroliza acidă a cazeinei 20% –5 ml; 3. L-aminoacizi – 40 μg/ml;


32

4. DL-aminoacizi – 80 μg/ml 5. antibiotice (Tabelul 2, pagina 40) În cele ce urmează sunt prezentate reţetele unor medii de cultură minimale folosite cel mai frecvent pentru cultivarea bacteriei E. coli în laborator. Mediu M9(stoc concentrat 5X) Na2HPO4 KH2PO4 NH4Cl NaCl CaCl2 (opţional) Apă distilată

30 g 15 g 5g 2,5 g 0,015 g până la 1000 ml

Mediu M63(stoc concentrat 5X) (NH4)2SO4 10 g KH2PO4 68 g 2,5 mg FeSO4 · 7H2O Apă distilată până la 1000 ml pH=7; se ajustează cu KOH Mediu A (stoc concentrat 5X) (NH4)2SO4 KH2PO4 K2HPO4 Citrat de sodiu X 2H2O Apă distilată

5g 22,5 g 52,5 g 2,5 g până la 1000 ml


33

Medii de cultură complexe Aceste medii se sterilizează de regulă prin autoclavare la presiunea de 1 atm, timp de 25 minute. Suplimentele nutritive sau antibioticele se pot adăuga după răcirea prealabilă a mediilor, consecutiv sterilizării. În continuare sunt prezentate câteva din cele mai folosite medii complexe. Bulion Lambda Triptonă NaCl Apă distilată

100 g 2,5 g până la 1000 ml

Triptonă NaCl Apă distilată

10 g 5g până la 1000 ml

Triptonă NaCl Apă distilată

10 g 8g până la 1000 ml

Triptonă Extract de drojdii NaCl Apă distilată

10 g 5g

Bulion-triptonă

Mediu H

Mediu LB (Luria-Bertani)

5g până la 1000 ml

pH=7; se corectează prin adăugarea de soluţie NaOH 1N. Se sterilizează prin autoclavare, timp de 20 min, la presiunea de 1 atm.

34


Bulion NZC N-Z-Amine A (Sigma) NaCl MgCl2 X 6H2O Apă distilată

10 g 5g 2g până la 1000 ml

Se autoclavează la presiunea de 1 atm timp de 30 minute după care se adaugă 5 ml soluţie amestec aminoacizi 20% proveniţi prin hidroliza acidă a cazeinei sterilizată prin filtrare. Mediu NZCYCM N-Z-Amine A (Sigma) NaCl Extract de drojdii MgSO4 x 7H2O Amestec aminoacizi proveniţi din caseină Apă distilată

10 g 5g 5g 2g 1g până la 1000 ml

Se agită până la dizolvare completă; se ajustează pH-ul la 7 cu NaOH 5N (aproximativ 0,2 ml). Se sterilizează prin autoclavare timp de 20 minute la la presiunea de 1 atm. Mediu NZYM N-Z-Amine A (Sigma) NaCl Extract de drojdii MgSO4 x 7H2O Apă distilată

10 g 5g 5g 2g până la 1000 ml

Mediu NZM N-Z-Amine A (Sigma) NaCl

10 g 5g


35

MgSO4 x 7H2O Apă distilată

2g până la 1000 ml

Triptonă Extract de drojdii NaCl NaOH 1 N Apă distilată

32 g 20 g 5g 5 ml până la 1000 ml

Triptonă Extract de drojdii NaCl Apă distilată

20 g 5g 0,5 g până la 980 ml

Mediu SB (super-bulion)

Mediu SOB

Amestecul se agită până la dizolvare completă. Se adaugă 10 ml soluţie KCl 250 mM (1,86 g KCl în 100 ml apă distilată). Se ajustează pH-ul la 7 cu NaOH 5 N (aproximativ 0,2 ml). Se sterilizează prin autoclavare timp de 20 minute la presiunea de 1 atm. Înainte de utilizare se adaugă 5 ml soluţie MgCl2 2M (19 g MgCl2 în 90 ml apă distilată; se ajustează volumul la 100 ml şi se autoclavează timp de 20 minute la presiunea de 1atm). Mediu SOC

Triptonă Extract de drojdii NaCl 1 M KCl 1 M Apă distilată

20 g 5g 10 ml 2,5 ml până la 980 ml

După autoclavare se răceşte mediul până la temperatura de 45oC şi se adaugă 10 ml soluţie MgCl2 2M şi 20 ml soluţie glucoză 20% (w/v) sterilizate în prealabil prin filtrare.

36


Medii de cultură solide Mediile de cultură lichide pot fi solidificate cu ajutorul agarului. În cazul mediilor minimale se recomandă sterilizarea separată a agarului în apă deoarece autoclavarea împreună creşte riscul apariţiei unui precipitat insolubil. Pentru mediile de cultură complexe se poate face autoclavarea tuturor ingredientelor împreună cu agarul. După sterilizare, mediile cu agar pot fi turnate în plăci Petri la o temperatură de 50oC; dacă temperatura scade sub 45oC agarul se solidifică, iar turnarea mediului de cultură devine dificilă. Se recomandă ca plăcile cu mediul proaspăt turnat să fie uscate înainte de însămânţare deoarece excesul de umiditate poate împiedica etalarea sau dezvoltarea normală a bacteriilor. Pentru uscare plăcile pot fi lăsate fără capac timp de 30 minute în hota cu flux de aer laminar sau cu capac, la temperatura camerei, pe masa din laborator, timp de 2-3 zile. Plăcile uscate pot fi păstrate cu capacul în jos la temperatura de 4oC ambalate în pungi din plastic.

Medii minimale solide Se adaugă 15 g agar în 800 ml apă şi se autoclavează la presiunea de 1 atm timp de 15 min. După răcire la temperatura de 50oC se adaugă mediul minimal concentrat, sursa de carbon, soluţia de antibiotic şi se repartizează în plăci Petri câte 15-20 ml/placă.

Medii de cultură complexe solide Agar Lambda

Mediu H

Triptonă NaCl Agar Apă distilată

10 g 2,5 g 15 g până la 1000 ml


10 g 8g 15 g până la 1000 ml


Mediu LB (Luria-Bertani)

Triptonă Extract de drojdii NaCl Agar sau agaroză Apă distilată

37

10 g 5g 5g 15 g până la 1000 ml

În compoziţia acestor medii se mai pot adăuga în funcţie de necesităţi: 1. antibiotice – ampicilină (50 μg/ml), tetraciclină (12 μg/ml), alte antibiotice; 2. galactozide – Xgal (20 μg/ml), IPTG (0,1 mM), alte galactozide.

Agar de acoperire Mediul se utilizează pentru a asigura repartiţia uniformă a fagilor sau celulelor bacteriene într-un strat subţire de agar la suprafaţa altui mediu de cultură. Într-o astfel de aplicaţie, agarul topit este amestecat cu celulele, apoi este turnat deasupra mediului de cultură dintr-o placă Petri şi este lăsat să se solidifice. Acest strat de celule se va dezvolta abundent, formând o plajă de colonii fuzionate. Agarul de acoperire conţine mai puţin agar (0,75%) decât se adaugă în mod obişnuit la prepararea mediilor de cultură solide, din acest motiv poate rămâne în stare topită mai multe zile dacă este menţinut la temperatura de 45oC. În locul agarului se poate folosi şi agaroza atunci când aplicaţiile vizează extracţia directă a ADN-ului din fagii cultivaţi. Mediul se prepară în recipiente de 1000 ml, se autoclavează timp de 15 min la presiunea de 1 atm, se răceşte la temperatura de 50oC, se agită pentru omogenizare, se separă în recipiente de 100 ml şi se sterilizează, putând fi ulterior păstrat la temperatura camerei. Înainte de utilizare se topeşte agarul prin încălzire pe o baie de apă sau într-un cuptor cu microunde, apoi se răceşte la temperatura de 45oC şi poate fi turnat în plăci Petri.


38

Agar de acoperire H Triptonă NaCl Agar Apă distilată


Triptonă Extract de drojdii NaCl Agar Apă distilată

10 g 5g 5g 7g până la 1000 ml


10 g 2,5 g 7g până la 1000 ml

Triptonă NaCl Agaroză Apă distilată


Agar de acoperire LB

Agar de acoperire Lambda

Agaroză de acoperire

Agar de conservare prin înţepare Este folosit pentru păstrarea un timp mai îndelungat a culturilor bacteriene la temperatura de 4oC.Cisteina se adaugă în scopul creşterii timpului de conservare a bacteriilor prin această metodă. Nutrient Broth NaCl Agar Cisteină

10 g 5g 6g 10 mg


Tiamină Apă distilată

39

10 mg până la 1000 ml

Antibiotice utilizate la prepararea mediilor de cultură Antibioticele sunt substanţe chimice care au capacitatea de a distruge sau inhiba dezvoltarea microorganismelor procariote, fără a avea efect toxic asupra organismelor eucariote. În general, se adaugă ca suplimente în mediile de cultură folosite pentru cultivarea E. coli în scopul prevenirii dezvoltării altor bacterii care nu conţin genele rezistenţei la antibiotice şi pentru a asigura stabilitatea plasmidelor în celulele bacteriene (1). Pentru a preveni alterarea lor, antibioticele se adaugă în mediile de cultură după răcirea acestora, la temperaturi mai mici de 50oC. Înainte de adăugare, soluţiile care conţin antibiotice se sterilizează prin filtrare, folosind filtre de 0,22 μm. Antibioticele în soluţii alcoolice nu necesită sterilizare. În situaţii de urgenţă antibioticele pot fi adăugate direct pe mediile solide din plăci în volume care să asigure concentraţia finală dorită; se lasă plăcile în repaus aproximativ o oră, timp în care antibioticul difuzează în mediul de cultură. În mod obişnuit se preferă prepararea unor soluţii stoc de antibiotice pentru a uşura munca în laborator. În Tabelul 2 sunt prezentate soluţiile stoc, concentraţiile de lucru precum şi mecanismul de acţiune al principalelor antibiotice adăugate în mediile de cultură folosite pentru cultivarea bacteriei E. coli. Se recomandă ca soluţiile concentrate de antibiotice să se păstreze la temperatura de 4oC nu mai mult de o lună sau la temperatura de -20oC nu mai mult de 6 luni. De asemenea, mediile de cultură care conţin antibiotice nu trebuie folosite dacă au fost păstrate pentru mai mult de o lună la frigider; mediile suplimentate cu antibiotice fotosensibile (tetraciclină, rifampicină) trebuie păstrate la întuneric sau învelite în folie de aluminiu.


40

TABEL 2. Principalele antibiotice folosite pentru cultivarea bacteriei Escherichia coli Antibiotic1

Concentraţie soluţie stoc (mg/ml) 5

Concentraţie soluţie de lucru (μg/ml) 15

10 (în H2O)

50

Carbenicilină2

10 (în H2O)

50

Cloramfenicol

6 (în etanol 100%)

30

D-cicloserină3

10 (în 0,1 M tampot fosfat de sodiu, pH=8)

200

Eritromicină

10 (în H2O)

50

Gentamicină

3 (în H2O)

15

Kanamicină

10 (în H2O)

50

Kasugamicină

10 (în H2O)

1000

Acidul nalidixic (pH până la 1 cu NaOH) Ampicilină (sare de sodiu)

Mecanism de acţiune Bacteriostatic; inhibă sinteza ADN. Bactericid; antibiotic βlactamic care împiedică sinteza peretelui celular prin inhibarea formării legăturilor peptidoglicanice. Acelaşi mecanism descris pentru ampicilină. Bacteriostatic; împiedică sinteza proteinelor prin inhibarea translaţiei la nivelul subunităţii 50 S a ribozomului datorită blocării reacţiei de transpeptidare şi elongare a lanţului de aminoacizi. Bactericid; inhibă sinteza peretelui celular prin împiedicarea formării D-alaninei din L-alanină şi formarea legăturilor peptidice ce presupun D-alanină. Bacteriostatic; antibiotic din grupa macrolidelor care se leagă de subunitatea 50 S a ribozomului şi inhibă translaţia prin blocarea reacţiei de transpeptidare. Bactericid; antibiotic din grupa aminoglicozidelor care inhibă sinteza proteinelor prin legarea de subunitatea 30 S a ribozomului. Bactericid; inhibă sinteza proteinelor. Bactericid; inhibă sinteza proteinelor prin alterarea

Metode de cultivare a bacteriei Escherichia coli Antibiotic1

Rifampicină4

Concentraţie soluţie stoc (mg/ml)

Concentraţie soluţie de lucru (μg/ml)

20 (în metanol sau DMSO)

100

Spectinomicină

20 (în H2O)

100

Streptomicină

10 (în H2O)

50

Tetraciclină4

2,5 (în etanol 50%)

12,5

41 Mecanism de acţiune reacţiei de metilare a ARN 16 S. Bactericid; inhibă iniţierea transcripţiei ARN prin legare de ARN polimerază. Bactericid; antibiotic din grupa aminoglicozidelor care inhibă sinteza proteinelor prin legare de subunitatea 30 S a ribozomului. Bactericid; antibiotic din grupa aminoglicozidelor care inhibă sinteza proteinelor prin legare de subunitatea 30 S a ribozomului. Bacteriostatic; inhibă sinteza proteinelor prin legare de subunitatea 30 S a ribozomului.

1

Toate antibioticele trebuie păstrate la temperatura de 4oC, cu excepţia tetraciclinei care se păstrează la -20oC. Carbenicilina poate fi păstrată în soluţie 50% etanol/50% apă la temperatura de -20oC. 3 Soluţiile de D-cicloserină sunt instabile; din acest motiv trebuie utilizate imediat după preparare. 4 Antibiotic sensibil la lumină; soluţiile stoc se păstrează la întuneric. Bactericid = omoară bacteriile. Bacteriostatic = inhibă creşterea şi multiplicarea bacteriilor. 2

II. 2 Cultivarea E. coli pe medii solide Numeroase bacterii printre care şi E. coli au capacitatea de a forma colonii izolate atunci când sunt cultivate pe medii solide. Fiecare colonie rezultă prin creşterea şi multiplicarea unei singure celule; deoarece E. coli se divide asexuat, toate celulele dintr-o colonie sunt identice din punct de vedere genetic, fiind denumite „clone”. Deoarece fiecare colonie reprezintă o populaţie de clone şi fiecare colonie poate fi diferită de celelalte colonii dintr-o placă, se recomandă ca în cadrul experimentelor să fie folosite doar colonii izolate. Studiul unor populaţii mixte de celule duce frecvent la obţinerea unor rezultate neconcludente (1).

42


Însămânţarea la suprafaţa mediilor de cultură solide Culturile de E. coli pot fi uşor însămânţate la suprafaţa mediilor de cultură solide folosind o baghetă de etalare în felul următor: 1. la mijlocul plăcii se depune cu ajutorul unei pipete un volum din cultura de însămânţat (50-500 μl); 2. se sterilizează prin flambare bagheta de etalare după care se răceşte atingând porţiuni ale mediului de cultură care nu se vor folosi; 3. se răspândeşte inoculul uniform pe toată suprafaţa mediului de cultură; 4. după finalizare se pune bagheta de etalare într-un pahar cu etanol; 5. se lasă mediul de cultură să se usuce; 6. se incubează la temperatura optimă de creştere (în general 37oC). Pentru inoculare se poate folosi şi o ansă de însămânţare, caz în care procedeul se numeşte însămânţare prin descriere de striuri: 1. se sterilizează ansa prin încălzire la roşu; 2. se preia cu ansa din cultura microbiană de însămânţat (din mediu lichid sau solid); 3. se trasează cu ansa, la suprafaţa mediului, o linie de 2-3 cm lungime la o margine a plăcii Petri (Figura 7); 4. se sterilizează ansa din nou şi se răceşte pe o porţiune de mediu; 5. se trece o dată, uşor, ansa peste linia trasată iniţial, apoi se continuă descrierea de striuri în zig-zag pe o parte din suprafaţa mediului de cultură, având grijă să nu se suprapună striurile descrise; 6. se sterilizează ansa din nou şi se răceşte; 7. se trece ansa o dată peste ultimul striu descris anterior, apoi se continuă în zig-zag descrierea unui nou set de striuri; 8. se repetă aceşti paşi până la descrierea a trei seturi de striuri; 9. la final se sterilizează ansa de însămânţare; 10. se incubează plăcile astfel inoculate cu capacul în jos, la temperatura optimă dezvoltării (37oC).


43

Incubare Striuri

Colonie izolată

FIGURA 7. Însămânţarea bacteriei E. coli la suprafaţa mediului de cultură prin descriere de striuri. Prin trasarea celor trei seturi de striuri se realizează o diluţie a inocului bacterian ceea ce permite obţinerea de colonii izolate.

Mediile de cultură pot fi însămânţate şi printr-un procedeu care permite obţinerea de replici ale unei plăci Petri pe suprafaţa căreia sunt deja dezvoltate colonii. Această tehnică permite transferarea coloniilor de pe o placă Petri pe altă placă, menţinând paternul original al coloniilor. Metoda are numeroase aplicaţii în experimentele care se bazează pe ADN recombinat, oferind avantajul testării simultane a unui număr mare de colonii din punct de vedere al capacităţii lor de a se dezvolta în condiţii diferite de cultivare. Pentru realizarea plăcilor replică este necesar un dispozitiv alcătuit dintr-un bloc rotund de lemn sau metal care poate intra fix într-o placă Petri, un inel metalic şi o bucată de catifea sterilă (Figura 8).

44


placă Petri

catifea sterilă inel metalic

bloc de metal sau lemn

FIGURA 8. Dispozitiv folosit pentru obţinerea unei plăci replică Pentru inoculare, bucata de catifea sterilă este prinsă de bloc cu ajutorul inelului metalic. Apoi placa Petri pe care se află coloniile dezvoltate se apasă uşor peste bucata de catifea; plăcile care se utilizează trebuie să conţină un număr de 50-100 colonii izolate. Nu se apasă foarte tare pentru că este posibil transferul coloniilor în totalitate sau este posibilă desprinderea mediului de cultură. Placa Petri cu mediul steril se aşează peste bucata de catifea păstrând orientarea plăcii originale, astfel încât să se realizeze transferul coloniilor. Prin acest procedeu se pot obţine până la 10 replici ale plăcii originale. La final, bucata de catifea poate fi spălată, sterilizată şi refolosită.

Însămânţarea în profunzime a mediilor de cultură solide Însămânţarea în profunzimea mediilor solide se poate face prin încorporare sau prin înţepare. Pentru însămânţarea prin încorporare, mediile de cultură se topesc şi se răcesc la temperatura de 50oC. Se introduce apoi o


45

cantitate din cultura de însămânţat. Se omogenizează amestecul prin agitare, fără a se introduce bule de aer, după care mediile însămânţate sunt lăsate să se solidifice. Însămânţarea prin înţepare se efectuează cu ajutorul ansei, aşa cum este prezentat în Figura 9.

FIGURA 9. Însămânţarea mediilor de cultură solide prin înţepare Ca rezultat al manipulărilor genetice folosind E. coli (transformări sau mutageneză) rezultă populaţii mixte de celule care trebuie separate. O cultură saturată tipică poate avea o concentraţie de 1 x 109 celule/ml. În astfel de situaţii, obţinerea coloniilor izolate (clone) presupune inocularea mediilor de cultură la suprafaţă folosind diluţii ale culturilor de interes (2). Obţinerea unei serii de diluţii se poate realiza în felul următor: Materiale necesare – mediu LB lichid; – mediu LB solid repartizat în plăci Petri cu diametrul de 10 cm; – eprubete sterile cu diametrul de 16 mm sau 18 mm;


46

Modul de lucru 1. cu ajutorul unei pipete se introduc câte 5 ml LB în trei eprubete sterile care se notează cu 1, 2 respectiv 3; 2. se transferă 5 μl din cultura bacteriană în eprubeta 1 şi se agită cu ajutorul unui vortex timp de 5 secunde; 3. se înlocuieşte vârful pipetei cu unul steril şi se transferă 5 μl lichid din eprubeta 1 în eprubeta 2; se agită timp de 5 secunde folosind vortexul; 4. se repetă pasul 3 până la obţinerea unei serii de diluţii în cele trei eprubete: în eprubeta 1 proba iniţială a fost diluată de 1 x 103 ori (1.000 de ori), în eprubeta 2 de 1 x 106 ori (1.000.000 ori), iar în eprubeta 3 de 1 x 109 ori. 5. se inoculează câte o placă Petri ce conţine mediu LB cu câte 100 μl din fiecare diluţie şi se etalează; 6. se incubează peste noapte la temperatura de 37oC; 7. se numără coloniile dezvoltate, ţinându-se cont că în fiecare placă s-au dezvoltat celulele prezente în 1/10 dintr-un mililitru provenit din fiecare diluţie în parte; prin urmare, pentru a afla numărul de celule/ml trebuie înmulţit numărul de colonii cu 10 şi apoi cu diluţia utilizată pentru însămânţare; de exemplu, dacă s-au dezvoltat 69 de colonii din diluţia 10-6, numărul de celule/ml va fi: 69 x 10 x 106 sau 6,9 x 108; 8. pentru că fiecare colonie izolată poate fi ulterior folosită, se recomandă păstrarea plăcilor la temperatura de 4oC învelite cu Parafilm sau folie din plastic. Pentru obţinerea coloniilor izolate se poate utiliza şi tehnica descrierii de striuri prezentată anterior (Figura 7). Metoda este mai uşor de utilizat în comparaţie cu cea care presupune obţinerea de diluţii, însă nu permite şi numărarea celulelor dintr-o cultură. În situaţia în care se doreşte obţinerea de colonii izolate din mai multe culturi bacteriene se preferă, din motive practice, împărţirea suprafeţei unei plăci Petri în 4, 6 sau 8 sectoare, inoculându-se fiecare sector în parte.


47

II. 3 Cultivarea E. coli în medii lichide Creşterea bacteriei E. coli în medii de cultură lichide este stimulată de prezenţa oxigenului, deoarece ciclul Krebs şi reacţiile de fosforilare oxidativă necesită oxigen pentru catabolizarea completă a surselor complexe de carbon până la CO2(1). Din aceste motive culturile în mediile lichide necesită agitare permanentă pe durata incubării (de regulă 200 rpm). Pentru cultivarea unor volume mai mari de 50 ml se recomandă utilizarea unor baloane Erlenmeyer prevăzute cu piedică ce au rolul de a agita mediul de cultură şi de a permite dizolvarea oxigenului. Pentru culturi cu un volum mai mic de 10 ml se pot folosi eprubete de centrifugă cu capac sau eprubete cu dop; în comerţ sunt disponibile o varietate de eprubete, baloane din sticlă prevăzute cu dopuri din plastic sau metal, care pot fi folosite pentru cultivarea E. coli în medii lichide. Pentru a permite o mai bună oxigenare se recomandă ca volumul de mediu de cultură să nu depăşească 1/3 din capacitatea maximă a recipientului în care se adaugă.

Inocularea şi cultivarea folosind volume mici de mediu O cultură cu un volum mai mic de 10 ml poate fi uşor obţinută prin cultivare peste noapte în mediu LB pornind de la o singură colonie. Inocularea unei singure colonii în volume mai mari de medii (100 ml) cu o concentraţie ridicată de nutrienţi (mediul TB) permite de asemenea creşterea culturii peste noapte până la faza staţionară. Pentru inoculare se procedează în felul următor (1): 1. se sterilizează ansa de însămânţare; 2. cu ajutorul ansei răcite (sau a unei scobitori sterile) se prelevează o porţiune dintr-o colonie izolată; 3. se introduce ansa sau scobitoarea în mediul de cultură lichid, descărcând produsul microbian pe pereţi chiar deasupra lichidului şi se agită uşor; inoculul va pătrunde în mediul de cultură imediat după agitare; nu este necesar să se poată observa celulele bacteriene în mediul lichid, fiind necesare doar câteva celule pentru a se atinge, după incubare, o densitate ridicată; capacul tubului trebuie pus

48


imediat înapoi astfel încât să se evite contaminarea mediului de cultură cu aer nesteril; 4. se introduce cultura inoculată într-un termostat cu agitare, la temperatura de 37oC şi turaţia de 200 rpm şi se incubează peste noapte; după 6 ore se poate atinge o densitate optică ce indică prezenţa a aproximativ 1-2 x 109 celule/ml (2); pentru incubare se pot folosi şi băi de apă termostatate, situaţie în care apa trebuie să prezinte acelaşi nivel ca mediul de cultură din recipientele inoculate.

Inocularea şi cultivarea folosind volume mari de mediu Volume mari de culturi de E. coli se pot obţine folosind drept inocul pre-culturi cultivate peste noapte în volume mici (10 ml). Pentru inoculare se diluează pre-cultura 1:100 şi se introduce în baloane Erlenmeyer cu un volum de cinci ori mai mare decât al culturii propriuzise. Se incubează apoi peste noapte la temperatura de 37oC cu agitare (200 rpm).

II.4 Monitorizarea creşterii bacteriei E. coli în mediile lichide Dezvoltarea unei populaţii bacteriene într-un mediu de cultură lichid presupune parcurgerea mai multor faze: lag (de întârziere), exponenţială (logaritmică), staţionară şi de declin (Figura 10). Faza de lag (de întârziere) presupune o adaptare a celulelor bacteriene la noul mediu de viaţă, fiind caracterizată prin absenţa creşterii. Durata fazei de lag poate fi scurtată atunci când bacteriile sunt transferate dintr-o cultură aflată în faza exponenţială într-un mediu identic. Consecutiv fazei de lag este faza exponenţială în care celulele bacteriene se divid, iar numărul lor creşte logartimic. Ca urmare a creşterii masive a numărului de celule, nutrienţii disponibili în mediul de cultură diminuează în paralel cu scăderea concentraţiei oxigenului dizolvat şi cu acumularea unor produşi toxici de metabolism. Cultura intră în faza staţionară caracterizată prin menţinerea unui număr relativ constant al


49

celulelor. La final apare moartea celulară, numărul celulelor scăzând pe parcursul fazei de declin. Evoluţia unei culturi bacteriene şi fazele creşterii pot fi urmărite prin determinarea numărului de celule folosind o serie de tehnici prezentate în cele ce urmează. Fază de creștere exponențială

Fază Fază de declin staționară

log nr. celule

Fază de lag

Timp (ore)

FIGURA 10. Curba de creştere a unei populaţii bacteriene în medii de cultură lichide

Determinarea densităţii optice cu ajutorul spectrofotometrului O metodă simplă şi rapidă de apreciere a creşterii constă în măsurarea turbidităţii unei culturi bacteriene cu ajutorul spectrofotometrului (1). Principiul metodei Creşterea numărului de celule determină o intensificare a turbidităţii culturii care poate fi înregistrată prin măsurarea cantităţii de lumină împrăştiată de cultură la o lungime de undă de 600 nm. Cu ajutorul spectrofotometrului se măsoară absorbanţa sau densitatea optică (DO).

50


Limitări: Turbiditatea culturii este determinată atât de celulele vii, cât şi de cele moarte, respectiv de alte particule prezente în mediul de cultură. Turbiditatea nu este influenţată numai de numărul, ci şi de forma, dimensiunea şi compoziţia celulelor. În plus celulele bacteriene îşi pot schimba forma şi dimensiunile în diferite faze ale creşterii şi în diferite medii de cultură. Toate aceste motive se pot constitui ca surse de erori la stabilirea numărului de celule dintr-o cultură bacteriană prin folosirea spectrofotometrului. Mod de lucru: Se aduce spectrofotometrul la 0 folosind mediu de cultură steril. Se măsoară densitatea optică a probelor la lungimea de undă de 600 nm: valorile DO finale ar trebui să varieze într-un interval optim cuprins între 0,1 şi 1. În situaţia în care densitatea celulelor este prea mare (DO > 1), pentru măsurători precise este necesară diluarea probelor cu mediu steril, folosind o rată de diluţie zecimală (1/10) până când valorile DO se încadrează în intervalul optim. În general, se consideră că pentru fiecare 0,1 unităţi DO corespund 1 x 108 celule/ml. însă este important de reţinut faptul că aceasta este doar o estimare (4),(1). Pentru a determina mai precis numărul de celule folosind spectrofotometrul este necesară construirea unei curbe standard utilizând alte metode de numărare a celulelor mai precise aşa cum sunt observarea folosind camera de numărare sau determinarea numărului de celule viabile prin cultivare în plăci Petri. După construirea curbei standard, DO a culturii poate fi determinată cu ajutorul spectrofotometrului iar numărul de celule poate fi citit de pe curbă. Deoarece diferitele specii şi tulpini bacteriene au celule cu forme şi dimensiuni diferite este necesară întocmirea de curbe standard pentru fiecare specie sau tulpină.


51

Determinarea densităţii optice cu ajutorul hemocitometrului Hemocitometrul sau orice alt tip de cameră de numărare poate fi utilizată pentru determinarea la microscop a densităţii celulare a unei culturi. Aceste dispozitive constau dintr-o lamă de sticlă prevăzută cu o reţea fină de grile gravate şi dintr-o lamelă care se aşează deasupra (Figura 11). Între cele două lame se delimitează un spaţiu cu un volum cunoscut în care pătrunde prin capilaritate lichidul cu microorganismele de numărat. În vederea numărării celulelor, se aşează mai întâi lamela pe lama de sticlă. Se adaugă pe fiecare parte a lamei de sticlă, sub lamelă, câte 10 μl din proba nediluată sau diluată (în funcţie de densitatea celulară a culturii); datorită capilarităţii, lichidul este atras către suprafaţa de numărat pe măsură ce este adăugat încet pe margini. Se lasă apoi lama de sticlă în repaus câteva minute după care se numără la microscop celulele din 5 pătrate precum cele ilustrate în Figura 11. Pentru a determina numărul de celule bacteriene/ml se utilizează următoarea formulă: Număr celule bacteriene/ml= număr de celule numărate x diluţia (dacă se utilizează) x 50.000 unde 50.000 = 10 (adâncimea de 0,1 mm) x 5.000 (5 pătrate numărate x 1.000 mm3), 1.000 mm3 = 1 ml Se recomandă ca în funcţie de modelul camerei de numărare utilizate să se citească înainte instrucţiunile de utilizare.


52

Lamelă de sticlă Lamă de sticlă

Reţea de grile

FIGURA 11. Cameră de numărat Bürker-Türk folosită pentru determinarea numărului de celule cu ajutorul microscopului

Determinarea numărului de bacterii prin cultivare în plăci Petri O altă metodă comună de determinare a numărului de celule constă în însămânţarea mediului de cultură lichid pe medii de cultură solide aflate în plăci Petri, incubarea şi numărătoarea coloniilor dezvoltate(3). Această tehnică poate fi uşor realizată în orice laborator de microbiologie conferind avantajul determinării numărului de celule viabile din totalul celulelor (vii şi moarte) prezente în mediul de cultură. Principiul metodei Fiecare celulă bacteriană viabilă prezentă în mediul de cultură lichid formează o colonie, astfel încât numărul total de colonii dezvoltate pe placa Petri indică numărul de microorganisme conţinute în mediul iniţial, capabile să crească în condiţiile de cultivare folosite.


53

Limitări: Un dezavantaj major al acestei metode constă în presupunerea că fiecare colonie are la origine o celulă. În realitate această situaţie este rareori valabilă, deoarece mai multe celule se pot agrega, ducând la formarea unei singure colonii. Din acest motiv se recomandă diluarea probei, utilizarea unui volum mic de inocul şi etalarea cât mai corectă a acestuia pe suprafaţa mediului de cultură. Un alt dezavantaj este dat de timpul de incubare, de la momentul inoculării şi până la momentul numărării fiind necesare aproximativ 18-24 ore. În situaţia în care este necesar să se cunoască densitatea celulară a unei culturi bacteriene într-un timp mai scurt se recomandă utilizarea celorlalte tehnici de numărare prezentate anterior. Mod de lucru: 1.

efectuarea diluţiilor – proba de analizat este diluată în scopul obţinerii pe o placă Petri a unui număr de colonii cuprins între 30 şi 300; în acest scop se utilizează o serie de diluţii zecimale (Figura 12); 1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Cultură de E. coli în LB

Fiecare eprubetă conţine 9 ml LB steril 0,1 μl 0,1 μl

0,1 μl 10-3 Etalare FIGURA 12. Tehnica efectuării diluţiilor zecimale

10-4

10-5

54


2.

Însămânţarea – din diluţiile efectuate se fac însămânţări, introducând volume mai mici de 0,1 ml din fiecare diluţie într-o placă cu mediu topit şi răcit la temperatura de 45oC; plăcile se rotesc uşor pentru distribuirea uniformă a inoculului în mediu; pentru fiecare diluţie se recomandă să se însămânţeze câte 2-3 plăci, făcându-se apoi media numărului de colonii dezvoltate;

3.

Incubarea – plăcile însămânţate se incubează la temperatura de 37oC;

4.

numărarea coloniilor – coloniile bacteriene se numără obişnuit după 24 ore, cu ochiul liber sau cu ajutorul lupei; pentru determinarea numărului de celule/ml se utilizează formula: 10

unde: UFC = unităţi formatoare de colonii (se foloseşte în loc de celule/ml); a = număr mediu al coloniilor dezvoltate după însămânţare; 10n = diluţie folosită pentru însămânţare (cu semn schimbat); V = volum (în ml) de suspensie folosit la însămânţare Utilizarea acestei tehnici presupune realizarea cu atenţie a diluţiilor şi însămânţărilor astfel încât să se evite eventualele erori care pot apărea. Pentru siguranţă se recomandă numărarea coloniilor provenite prin însămânţarea şi incubarea a două diluţii diferite; valoarea finală obţinută în cele două situaţii ar trebui să indice concentraţii celulare similare. Rata de creştere a diverselor tulpini de E. coli este diferită, prin urmare timpul de incubare trebuie ajustat în funcţie de fiecare tulpină utilizată în cadrul experimentelor.

II. 5 Păstrarea culturilor de E. coli Culturile de E. coli pot fi păstrate în laborator intervale variabile de timp, de la câteva zile până la perioade nedefinite. O importanţă deosebită trebuie însă acordată modalităţii de păstrare pe termen lung, în


55

special în cazurile în care tulpinile respective sunt recombinate genetic (1). Tulpinile de E. coli păstrate în plăci Petri sunt viabile până la 2 săptămâni păstrate la temperatura de 4oC dacă plăcile au fost sigilate cu Parafilm. Nu se recomandă însă păstrarea culturilor în medii lichide mai mult decât este necesară atingerea unei densităţi celulare ridicate. În plus, în cazul acestor culturi, este important în multe situaţii ca celulele să nu atingă faza staţionară, deoarece poate fi afectată stabilitatea ADN-ului recombinat. Păstrarea culturilor un timp îndelungat în laborator se poate realiza prin congelare la temperatura de -80oC sau prin utilizarea unor containere speciale cu azot lichid.

Păstrarea prin congelare la -80oC Materiale necesare: 1. medii de cultură lichide complexe (bulion LB sau TB); 2. tuburi de criostocare; 3. glicerol 50% (v/v): 50 ml glicerol se dizolvă în 50 ml apă distilată şi se sterilizeză prin filtrare. Mod de lucru: 1. cu o zi înainte de criostocare se inoculează tulpina de E. coli în 5 sau 10 ml bulion LB sau TB în care se adaugă antibioticul corespunzător; 2. se incubează la temperatura de 37oC cu agitare, peste noapte; 3. în cultura dezvoltată se adaugă glicerol 50 % (v/v) în raport 1:1 (concentraţie finală de glicerol este de 25%); glicerolul este o substanţă crioprotectoare care are rolul de a preveni leziunile celulare provocate de îngheţare; în locul glicerolului se poate utiliza şi o soluţie dimetilsufoxid 7% care oferă avantajul unei pipetări mai uşoare (2);


56

4. se agită bine amestecul şi se transferă în eprubete de criostocare (două sau mai multe microeprubete pentru tulpinile mai importante); 5. se îngheaţă rapid eprubetele împreună cu conţinutul lor prin aşezare pe o baie cu gheaţă uscată/etanol sau prin utilizarea azotului lichid, după care se introduc în congelator la temperatura de -80oC; alternativ, eprubetele de criostocare pot fi introduse direct în congelator; 6. stocurile de glicerol pot fi păstrate la temperatura de -80oC o perioadă nedefinită de timp. Pentru a re-activa tulpinile bacteriene, se scot eprubetele de criostocare din congelator şi, cu ajutorul unei anse, se prelevează din conţinutul acestora o parte care se inoculează pe un mediu de cultură proaspăt. Stocurile de glicerol se introduc imediat în congelator. Nu se recomandă dezgheţarea completă deoarece ciclurile îngheţ-dezgheţ succesive pot afecta semnificativ viabilitatea culturii. Bibliografie 1.

2.

3. 4.

Riley, S. P., Woodman, M. E., Stevenson, B. (2008) – Culture of Escherichia coli and Related Bacteria in Current Protocols Essential Laboratory Techniques (Gallagher, S. R., Wiley, E. A., Eds.), p 806. John Wiley & Sons. Elbing, K., Brent, R. (2003) – Escherichia coli, in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. A., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Eds.), p 4755. John Wiley & Sons. Dunca, S., Ailiesei, O., Nimiţan, E., Stefan, M. –(2004) Microbiologie aplicată, p 300. Ed. Tehnopress, Iaşi. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) – Molecular Cloning – A Laboratory Manual, p 1.21-1.53. Cold Spring Harbour Laboratory Press.

III. PLASMIDE ŞI TULPINI DE ESCHERICHIA COLI UTILIZATE FRECVENT ÎN BIOLOGIA MOLECULARĂ Câteva descoperiri din domeniul geneticii au condus la elaborarea unor tehnici de laborator care au permis cercetătorilor să analizeze şi să manipuleze moleculele de ADN într-o manieră fără precedent, realizând o adevărată revoluţie în toate domeniile biologiei. Organismele modificate genetic şi terapia genică sunt doar două dintre aplicaţiile ingineriei genetice– domeniu cu o dezvoltare deosebită ce nu ar fi fost posibilă fără implicarea microorganismelor. Ingineria genetică îşi are începuturile în anii '60 (1), când a fost descoperită o nouă clasă de enzime bacteriene numite endonucleaze. Acestea au rolul de a recunoşte ADN-ul străin care pătrunde în celulă pe diverse căi şi de a-l inactiva prin clivare. Important este că mecanismul de clivare al moleculelor de ADN nu se realizează la întâmplare, ci are loc în locaţii precise dictate de o secvenţă specifică de 4-6 nucleotide. De la izolarea primei enzime de restricţie - HindIII în anul 1970 (2) şi până în prezent au fost descrise nu mai puţin de 4000 enzime de restricţie (3), fiecare clivând ADN-ul într-un situs specific unic. Cercetătorul are astfel posibilitatea de a utiliza aceste enzime pentru a cliva ADN-ul în mod specific asemenea unui foarfece molecular foarte precis. Deoarece moleculele de ADN au aceleaşi proprietăţi indiferent dacă provin de la plante, animale, fungi sau microorganisme, fragmente din surse foarte variate pot fi unite pentru a forma o moleculă nouă. Astfel, nu cu mult timp după izolarea primelor enzime de restricţie, acestea au fost utilizate pentru obţinerea primei molecule de ADN recombinat creată de om (4),(5),(6). Obţinerea acesteia a implicat izolarea şi clivarea a două fragmente de ADN din două surse diferite, proceduri urmate de utilizarea ADN-ligazei pentru lipirea celor două fragmente şi obţinerea unei molecule noi (Figura13).


58

Sursa 1

HindIII

Sursa 2

HindIII

Fragmentele se ''amestecă'' şi se ''lipesc'' cu ADN-ligaza Moleculă ADN recombinat FIGURA 13. Obţinerea unei molecule ADN recombinate. Prin clivarea ADN-ului din două surse diferite cu aceeaşi enzimă de restricţie (HindIII) se formează capete coezive compatibile, ce facilitează procesul de ligare.

Un alt punct cheie în dezvoltarea ingineriei genetice este apariţia procesului de clonare. Deşi termenul este utilizat şi pentru a descrie producerea de celule sau organisme identice din punct de vedere genetic, în sensul său strict clonarea reprezintă producerea de copii identice ale unei molecule de ADN în număr foarte mare. Procesul de clonare constă din 4 etape distincte (7) – Figura 14: 1. izolarea fragmentelor de interes şi clivarea lor cu enzime de restricţie; 2. ligarea celor două fragmente şi obţinerea moleculei recombinate; 3. transfecţia (transformarea) celulelor (cel mai frecvent de Escherichia coli) cu noile molecule recombinate; 4. selecţia celulelor ce au fost transformate cu succes şi care conţin noua moleculă de ADN recombinat. Pentru a putea parcurge cele 4 etape în scopul clonării unei gene sunt necesare cel puţin două elemente: 1. un vector reprezentat de o moleculă de ADN purtătoare capabilă să se autoreplice; secvenţa de clonat este inserată în interiorul vectorului şi se replică odată cu acesta;

Plasmide şi tulpini de Escherichia coli

59

2. un organism gazdă în care vectorul urmează să se replice; cel mai frecvent utilizate fiind tulpinile de E. coli. Vector

Fragmentul ADN de interes Digestie cu enzime de restriţie

Ligare Vector recombinat Transformare

Celulă bacteriană Replicarea vectorului gazdă Multiplicare bacteriană FIGURA 14. Clonarea genelor. Fragmentele de ADN clivate cu ajutorul enzimelor de restricţie sunt inserate într-un vector clivat cu aceleaşi enzime. Molecula recombinată este introdusă în celula bacteriană unde se replică şi duce la multiplicarea numărului de copii.

III.1 Vectori plasmidiali utilizaţi frecvent în ingineria genetică Principalele caracteristici necesare unui vector pentru a se propaga în celulele de E. coli sunt: 1. capacitatea de autoreplicare independentă de cromozomul bacterian; vectorul trebuie să conţină o origine de replicare compatibilă cu celula gazdă; pentru plasmidele replicabile în E. coli cel mai frecvent se foloseşte originea OriC;

60


2.

să prezinte dimensiuni mici pentru a putea fi simplu de izolat, manipulat şi transferat în celula gazdă; să conţină un marker selectabil pentru a putea diferenţia uşor celulele ce conţin vectorul de cele care nu îl conţin; cel mai frecvent acest marker este reprezentat de rezistenţa la antibiotice codificată de gene aflate pe plasmid; când celulele bacteriene sunt etalate pe medii de cultură care conţin antibiotice, doar celulele ce conţin plasmidul care codifică rezistenţa vor supravieţui, realizându-se astfel o selecţie; să conţină o singură copie dintr-un situs specific de restricţie.

3.

4.

Primii vectori plasmidiali utilizaţi au fost o serie de vectori simpli, ce conţineau o origine de replicare, o genă a unui marker selectabil şi câteva situsuri de restricţie amplasate aleator. Folosirea acestora în clonarea genelor a fost dificilă şi prin urmare au fost dezvoltaţi vectori de clonare specializaţi, care conţineau, pe lângă elementele amintite, şi o zonă redusă ca dimensiuni cu numeroase situsuri de restricţie foarte frecvent utilizate. Zona respectivă a primit numele de situs multiplu de clonare (engl.Multiple Cloning Site – MCS), ea uşurând mult procesul de clonare. În vederea expresiei genelor clonate în E. coli sunt necesare alte tipuri de vectori denumiţi vectori de expresie. Aceştia trebuie să permită atât clonarea genelor cât şi expresia lor, motiv pentru care conţin suplimentar, pe lângă elementele enumerate la vectorii de clonare şi elemente necesare expresiei reprezentate prin: 1. promotor puternic sub controlul căruia este pusă gena de interes, cel mai frecvent fiind utilizaţi promotorul bacteriofagului λ PL, promotorul trp-lac sau promotorul bacteriofagului T7; înainte de promotor se află MCS; 2. operatorul specific promotorului utilizat; 3. situs-ul de legare al ribozomului, (engl.Ribosome Binding Site –RBS); 4. zona de semnalizare a sfârşitului transcripţiei. Situsul multiplu de clonare este amplasat întotdeauna după situsul de legare al ribozomului, în aşa fel încât prin clonarea genei de interes aceasta să fie pusă sub controlul promotorului (Figura 15). Vectori de expresie mai pot conţine, de asemenea, şi alte sisteme de control strict al expresiei. De exemplu, în cazul sistemului de expresie care utilizează promotorul bacteriofagului T7, în plasmid este şi gena pentru lisozim din


61

fagul T7, un inhibitor al ARN-polimerazei T7 care elimină expresia constitutivă a acesteia. RBS

MCS

Secvenţă terminatoare

Operator

Promotor

Marker selectabil ORI FIGURA 15. Vector plasmidial de expresie tipic RBS– situs-ul de legare a ribozomului; MCS– situs multiplu de clonare; ORI– origine de replicare

Principalele caracteristici ale vectorilor plasmidiali utilizaţi în ingineria genetică Vectorul pUC19c – vector de clonare de dimensiuni mici (2,7 kb). Un vector similar pUC18 ce diferă de pUC19c doar prin secvenţa situsului de clonare; – secvenţa completă a plasmidului se găseşte în baza de date GeneBank/EMBL cu indicativul L09137; – număr mare de copii în celulă;

62


– conţine gena responsabilă de rezistenţa la ampicilină; – permit realizarea selecţiei alb/albastru prin complementare alfa folosind plăci cu Xgal; – comercializat de New England Biolabs; – harta situsurilor de restricţie este prezentată în Anexă, Figura A3.

Vectorul pBlueScript II SK (+/-) – vector de clonare plasmidial a cărui origine de replicare provine de la un fag; – codifică rezistenţa la ampicilină; – comercializat de Stratagene; – harta situsurilor de restricţie este prezentată în Anexă, Figura A4.

Vectorul pET-21a – vector de clonare şi expresie având dimensiunea de 5,4kb; – expresia proteinei se induce prin adăugarea în mediu a lactozei sau a unui derivat al acesteia (IPTG); – proteina produsă este recombinată având la capătul N terminal 6 resturi de histidină şi o coadă T7; resturile de histidină permit purificarea proteinei produse prin cromatografie de afinitate pentru metale, iar coada T7 permite purificarea proteinei prin tehnici imuno-cromatografice. – comercializat de Novagen; – harta situsurilor de restricţie este prezentată în Anexă, Figura A5.

Vectorul pMAL-c5x – vector de clonare şi expresie; – proteina clonată este pusă sub controlul promotorului tac, expresia putând fi indusă prinadăugarea în mediu a lactozei sau a unui derivat al acesteia (IPTG); – proteina produsă este fuzionată cu MBP (engl.Maltose Binding Protein), proteină cu afinitate pentru maltoză din E. coli, oferind astfel o modalitate simplă de purificare prin cromatografie de afinitate – comercializat de NewEngland Biolabs; – harta situsurilor de restricţie este prezentată în Anexă, Figura A6.


63

III.2 Tulpini de Escherichia coli utilizate frecvent în ingineria genetică Tehnicile de manipulare ale ADN-ului au folosit microorganismul Eschericia coli încă de la începutul utilizării lor, indiferent de domeniul în care au fost aplicate. Din acest motiv, de-a lungul timpului a apărut un număr mare de tulpini de E. coli derivate de la tulpina sălbatică, special selectate pentru a funcţiona ca celulă gazdă şi a realiza funcţii specifice, precum replicarea ADN-ului recombinat sau expresia de proteine. Aceste tulpini au fost în mod artificial modificate şi adaptate la condiţiile oferite de mediile de cultură folosite în laborator. Ele şi-au pierdut abilitatea de a coloniza intestinul gros, fiind în marea lor majoritate auxotrofe pentru diferiţi compuşi şi neputându-se dezvolta în afara laboratorului. Majoritatea tulpinilor utilizate în laborator provin din două tulpini principale: E. coli K-12 şi E. coli B. Aceste două tulpini diferă în principal prin comportamentul lor faţă de ADN-ul exogen. Tulpina E. coli K-12 conţine sistemul de metilare-restricţie codificat de genele hsdRMS(EcoKI) şi va distruge ADN-ul care nu este metilat la adenina din secvenţa AA*C[N6]GTGC sau GCA*C[N6]GTT. ADN-ul izolat din această tulpina va fi în consecinţă metilat în aceste poziţii. Tulpina E. coli B conţine sistemul de metilare-restricţie codificat de genele hsdRMS(EcoBI) şi va distruge ADN-ul nemetilat la nivelul adeninei din secvenţele TGA*[N8]TGCT sau AGCA*[N8]TCA. Plecând de la aceste două tulpini, cercetătorii au creat numeroase tulpini cu utilizare precisă, aducând modificări specifice la nivelul genelor cromozomiale sau introducând material genetic extra-cromozomial suplimentar. Pentru a putea caracteriza fiecare din aceste tulpini este necesară precizarea în mod explicit a modificărilor şi îmbunătăţirilor aduse la nivelul genomului. Pentru aceasta, se consideră că toate genele din celule sunt normale, exceptând pe cele care sunt în mod explicit precizate ca fiind mutante. Semnul Δ înainte unei gene indică lipsa genei respective (deleţie). Notaţiile standard pentru cele mai frecvente mutaţii şi manifestările lor fenotipice la tulpinile de E.coli cu utilizare în laborator sunt prezente în Tabelul 3.


64

TABEL 3. Notaţii standard pentru cele mai frecvente mutaţii şi manifestările lor fenotipice la tulpini de E. coli cu utilizare în laborator Notare

Manifestare fenotipică

-

nu conţine plasmidul conjugativ F

+

F

conţine plasmidul conjugativ F; celulele pot realiza procesul de conjugare şi transfera plasmidul la celulele F-

F'[ ]

conţine un plasmid conjugativ F în care au fost integrate gene cromozomiale; celulele pot realiza procesul de conjugare şi pot transfera plasmidul la celulele F-; genele cromozomiale integrate în plasmid sunt reprezentate între paranteze pătrate.

rB/K+/-

indică linia celulară; semnele +/- indică faptul că tulpina prezintă sau nu sisteme active de restricţie specifice pentru E. coli

mB/K+/-

indică linia celulară; semnele +/- indică faptul că tulpina prezintă sau nu sisteme de metilare active ale ADN-ului specifice pentru E. coli

hsdS

sisteme de metilare şi restricţie inactivate pentru anumite secvenţe; transferul ADN-ului izolat din această tulpină în tulpini sălbatice de E. coli va duce la degradarea acestuia

hsdR

indică transformarea eficientă cu ADN ne-metilat, obţinut de exemplu prin reacţia de amplificare in vitro (PCR)

INV( )

inversare la nivel cromozomial între locaţiile indicate

ahpC

mutaţie la nivelul genei alchil-hidroperoxid reductazei ce conferă enzimei şi capacitatea de a reduce legăturile disulfidice

ara-14

tulpina nu poate metaboliza arabinoza

araD

mutaţie la nivelul genei pentru L-ribulozo-4-fosfat epimeraza ce blochează metabolismul arabinozei

cycA

mutaţie la nivelul sistemului de transport al alaninei; tulpina nu poate utiliza alanina ca sursă de carbon

dapD

mutaţie la nivelul genei care codifică succinil-

F


Notare

65

Manifestare fenotipică diaminopimelat-transferaza care conduce la inactivarea acesteia; tulpina are nevoie de acid succinic sau lizină şi metionină în mediu pentru a se dezvolta

Δ( )

deleţia la nivel cromozomial a genelor cuprinse între poziţiile dintre paranteze

dam

metilarea adeninei din secvenţa GATC este activă; sistemul de reparaţie a ADN-ului este activ

dcm

metilarea carbonului din poziţia a doua în secvenţa CCWGG este activă; în general, cele doua proprietăţi, dam şi dcm, sunt prezente şi nu sunt precizate în mod explicit; lipsa lor este însă întotdeauna precizată sub forma notaţiilor dam- şi dcm-

deoR

expresia constitutivă a genelor responsabile de sinteza deoxiribozei; permite transformarea celulelor cu plasmide de dimensiuni mari (8)

dut1

activitatea dUTP-azică este inactivată, ducând la creşterea concentraţiei de dUTP şi încorporarea U în loc de T în ADN

endA 1

endonucleaza I este inactivată, ceea ce permite o mai uşoară izolare a ADN-ului

galE

mutaţie asociată, în general, cu o competenţă crescută şi rezistenţă la 2-deoxi-galactoză (9)

galk

tulpina nu poate metaboliza galactoza şi este rezistentă la 2-deoxi-galactoza

galU

tulpina nu poate metaboliza galactoza

gor

mutaţie la nivelul glutation-reductazei; îmbunătăţeşte formarea legăturilor disulfidice

gyrA96

mutaţie la nivelul genei ce codifică ADN giraza; rezistenţă la acid nalidixic

gyrA462

mutaţie la nivelul genei ce codifica ADN giraza; rezistenţă la toxina colicina ccdB

Δ(lac)X74

deleţia întregului operon lac şi a zonelor adiacente (10)


66

Notare


lacIq sau lacIQ

supraproducţia proteinei represor lac; regiunea -35 în promotorul din faţa lacI este modificată din GCGCAA în GTGCAA

lacIQ1

supraproducţia proteinei represor lac; conţine o deleţie de 15 pb pentru a crea o regiune -35 optimă în promotorul din faţa lacI

lacY

tulpina este deficientă în transportul şi metabolizarea lactozei datorită deleţiei genei pentru lactoz-permează

lacZΔM15

deleţia parţială a genei lacZ, ceea ce permite alfa complementarea genei pentru β-galactozidază; necesară pentru realizarea selecţiei alb/albastru pe baza fenomenului de complementare alfa folosind plăci cu Xgal

leuB

necesită leucină în mediu pentru dezvoltare

Δlon

deleţia proteazei lon

malA

tulpina nu poate metaboliza maltoza

mcrA

mutaţie ce elimină sistemul de restricţie a ADN-ului metilat la nivelul secvenţei CmCGG

mcrB

mutaţie ce elimină sistemul de restricţie a ADN-ului metilat la nivelul secvenţei RmC

metB

necesită metionină în mediu pentru dezvoltare

metC

necesită metionină în mediu pentru dezvoltare

mrr

mutaţie ce elimină sistemul de restricţie al ADN-ului metilat la nivelul secvenţei CmAG sau GmAC

mtlA

nu poate metaboliza manitolul

mutS

mutaţie ce inhibă procesul de reparaţie al ADN-ului

nupG

vezi deoR

ompT

mutaţie la nivelul genei ce codifică proteaza extracelulară VII, reducând astfel proteoliza proteinelor supraexprimate

(P1)

conţine profagul P1; tulpina exprimă sistemul de restricţie P1


67

Notare


(P2)

conţine profagul P2

PlysS

conţine plasmidul pLysS ce codifică rezistenţa la cloramfenicol şi atenuează activitatea T7 RNA-polimerazei

proA/B

necesită prolină în mediu pentru creştere şi dezvoltare

recA1

tulpină sensibilă la radiaţii UV; sistemul de reparaţie al ADN-ului este deficitar

recBCD

mutaţii la nivelul exonucleazei V; mutaţia la nivelul genelor RecB sau RecC ce reduce frecvenţa proceselor recombinatorii de 100 de ori; tulpină sensibilă la radiaţii UV; sistemul de reparaţie al ADN-ului este deficitar

relA

fenotip relaxat, sinteza ARN-ului este permisă în lipsa sintezei proteice

rha

metabolismul ramnozei este blocat

rnc

conţine ribonuclează III

rne

codifică ribonuclează E

rpsL

mutaţie la nivelul proteinei ribozomale S12 ce duce la rezistenţă pentru streptomicină

sr1

metabolismul sorbitolului este blocat

supE

glnV

supF

tyrT

thi

necesită tiamină în mediu pentru creştere şi dezvoltare

thyA

necesită timină în mediu pentru creştere şi dezvoltare

Tn10

conţine transpozonul 10 ce codifică în mod normal şi rezistenţa la tetraciclină

Tn5

conţine transpozonul 5 ce codifică în mod normal şi rezistenţa la kanamicină

tonA

mutaţie le nivelul unei proteine din membrana externă ce conferă rezistenţă la fagii T1 şi T5

traD

mutaţie ce inactivează factorul de transfer, celulele nu pot iniţia sau accepta transferul plamidului F


68

Notare


trxB

mutaţie la nivelul tioredoxin reductazei, îmbunătăţeşte formarea punţilor disulfidice în citoplasmă

tsx

mutaţie le nivelul unei proteine din membrana externă ce conferă rezistenţă la T6 şi la colicina K

ung1

permite încorporarea uracilului în ADN-ul plasmidial

xyl-5

metabolismul xilozei este blocat

SmR

rezistenţă la streptomicină

În cele ce urmează sunt prezentate succint principalele tulpini de E. coli utilizate în laborator alături de genotipul acestora şi utilizările specifice. Tulpina E. coli BL21 –F-dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal [malB+]K-12(λS); – regiunea "malB" a fost transferată de la tulpina K-12 (11). TulpinaE. coli BL21(DE3) – F-ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene1 ind1 sam7 nin5]); – tulpină derivată din E. coli B ce conţine DE3 – un λ profag cu genele pentru ARN polimeraza T7 şi lacIq; – utilizată în special drept gazdă pentru expresia de proteine recombinate clonate în vectori plasmidiali specifici şi puse sub controlul promotorului bacteriofagului T7; prin adăugarea în mediul de cultură a lactozei sau a unui compus similar cu aceasta (de exemplu IPTG), ARN polimeraza T7 este activată şi va duce la transcripţia genelor aflate sub controlul promotorului bacteriofagului T7, supraexprimandu-le (12); – întregul genom al acestei tulpini a fost secvenţiat (13). Tulpina E. coli BL21 (DE3) pLysS – F-ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3) pLysS(cmR); – este identică cu tulpina E. coli BL21(DE3), dar conţine suplimentar plasmidul pLysS; – plasmidul pLysS conferă tulpinii rezistenţă la cloramfenicol şi de


69

asemenea conţine gena pentru lizozim din fagul T7, un inhibitor al ARNpolimerazei T7; acesta elimină expresia constitutivă a ARN-polimerazei T7, aspect extrem de util în clonarea genelor toxice pentru E. coli; – nu poate fi utilizată drept gazdă pentru propagarea vectorilor, deoarece plasmidul deja existent interferă cu izolarea acestora. TulpinaE. coliDH1 –endA1 recA1 gyrA96 thi-1 glnV44 relA1 hsdR17(rK-mK+) λ-; – derivată din tulpina Hoffman-Berling 1100; – permite transformarea eficientă a plasmidelor de dimensiuni mari (4060 kb); – rezistentă la acid nalidixic (14). Tulpina E. coliDH5α – F-endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-mK+), λ-; – derivată din tulpina E. coliDH1; – rezistentă la acid nalidixic; – una dintre cele mai utilizate gazde pentru vectori. Tulpina E. coliRosetta(DE3)pLysS –F-ompT hsdSB(RB-mB-) gal dcm λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) pLysSRARE (CamR); – tulpină derivată din E. coli B ce conţine DE3, un λ profag cu genele pentru ARN-polimeraza T7 şi lacIq; – utilizată în special drept gazdă pentru expresia de proteine recombinate clonate în vectori plasmidiali specifici şi puse sub controlul promotorului bacteriofagului T7; prin adăugarea în mediul de cultură a lactozei sau a unui compus similar cu aceasta (de exemplu IPTG), ARN polimeraza T7 este activată şi va duce la transcripţia genelor aflate sub controlul promotorului bacteriofagului T7, supra-exprimandu-le (12); – rezistentă la cloramfenicol; – conţine plasmidul pLysSRARE; acesta permite utilizarea în E. coli a codonilor rari AGG, AGA, AUA, CUA, CCC şi GGA, deoarece codifică genele ARNt pentru argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL, metT, thrT, tyrU, şi thrU; – plasmidul pLysSRARE conţine, de asemenea, gena pentru lizozim din

70


fagul T7, un inhibitor al ARN-polimerazei T7; aceasta elimină expresia constitutivă a ARN-polimerazei T7, comportarea fiind extrem de utilă în clonarea genelor toxice pentru E. coli; – utilă pentru supraexprimarea unor gene ce conţin codoni rari pentru E. coli, cum ar fi gene din eucariote de exemplu; – nu poate fi utilizată drept gazdă pentru propagarea vectorilor, deoarece plasmidul deja existent interferă cu izolarea acestora. Tulpina E. coli XL1-Blue (Stratagene) –endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[::Tn10 proAB+lacIqΔ(lacZ)M15] hsdR17(rK-mK+); – rezistentă la acid nalidixic şi la tetraciclină; – folosită drept gazdă pentru propagarea şi izolarea plasmidelor, dar şi pentru expresia de proteine. Tulpina E. coliXL2-Blue (Stratagene) – endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[::Tn10 proAB+lacIqΔ(lacZ)M15 Amy CmR] hsdR17(rK-mK+); – rezistentă la acid nalidixic şi la tetraciclină; – rezistentă la cloramfenicol în concentraţii mai mici de 40 mg/ml; – sensibilă la cloramfenicol în concentraţii mai mari de 100 mg/ml; – folosită drept gazdă pentru propagarea şi izolarea plasmidelor, dar şi pentru expresia de proteine. Tulpina XL1-Red (Stratagene) – F- endA1 gyrA96(nalR) thi-1 relA1 lac glnV44 hsdR17(rK-mK+) mutS mutT mutD5 Tn10; – rezistentă la acid nalidixic şi la tetraciclină; – tulpină ce acumulează foarte frecvent mutaţii; ADN–ul transferat este foarte instabil. Tulpina XL10-Gold (Stratagene) –endA1 glnV44 recA1 thi-1 gyrA96 relA1 lac Hte Δ(mcrA)183 Δ(mcrCBhsdSMR-mrr)173 tetRF'[proAB lacIqZΔM15 Tn10(TetRAmy CmR)]; – rezistentă la acid nalidixic, tetraciclină şi cloramfenicol; – fenotipul hte permite transformarea cu plasmide de dimensiuni foarte mari.


71

Bibliografie: 1. Arber, W., Linn, S. (1969)– DNA modification and restriction, Annual Review of Biochemistry,38, 467-500. 2. Roberts, R. J. (2005) – How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102, 5905-8. 3. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. (2010) – REBASE--a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes, Nucleic Acids Research, 38, D234-6. 4. Jackson, D. A. (1972) – Biochemical Method for Inserting New Genetic Information into DNA of Simian Virus 40: Circular SV40 DNA Molecules Containing Lambda Phage Genes and the Galactose Operon of Escherichia coli, Proceedings of the National Academy of Sciences, 69, 2904-2909. 5. Cohen, S. N., Chang, A. C., Boyer, H. W., Helling, R. B. (1973)– Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 70, 3240-4. 6. Lobban, P. (1973)– Enzymatic end-to-end joining of DNA molecules, Journal of Molecular Biology, 78, 453-460. 7. Brown, T. A. (2010) – Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction (Brown, T., Ed.) 6th ed. Wiley&Blackwell. 8. Durfee, T., Nelson, R., Baldwin, S., Plunkett, G., Burland, V., Mau, B., Petrosino, J. F., Qin, X., Muzny, D. M., Ayele, M., Gibbs, R. A., Csörgo, B., Pósfai, G., Weinstock, G. M., Blattner, F. R. (2008) – The complete genome sequence of Escherichia coli DH10B: insights into the biology of a laboratory workhorse, Journal of Bacteriology, 190, 2597-606. 9. Hanahan, D., Jessee, J., Bloom, F. R. (1991) – Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria, Methods in Enzymology, 204, 63-113. 10. Ferrández, A., Garciá, J. L., Díaz, E. (1997) – Genetic characterization and expression in heterologous hosts of the 3-(3hydroxyphenyl)propionate catabolic pathway of Escherichia coli K-12, Journal of Bacteriology, 179, 2573-81. 11. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. (2009) – Understanding the differences between genome sequences

72


of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12 genomes, Journal of Molecular Biology, 394, 653-80. 12. Studier, F. W., Moffatt, B. A. (1986)– Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, Journal of Molecular Biology, 189, 113-30. 13. Jeong, H., Barbe, V., Lee, C. H., Vallenet, D., Yu, D. S., Choi, S.-H., Couloux, A., Lee, S.-W., Yoon, S. H., Cattolico, L., Hur, C.-G., Park, H.-S., Ségurens, B., Kim, S. C., Oh, T. K., Lenski, R. E., Studier, F. W., Daegelen, P., Kim, J. F. (2009) – Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3), Journal of Molecular Biology, 394, 644-52. 14. Meselson, M., Yuan, R. (1968) – DNA Restriction Enzyme from E. coli, Nature, 217, 1110-1114.

IV. METODE ŞI TEHNICI FOLOSITE PENTRU IZOLAREA ŞI PURIFICAREA ADN-ULUI Capacitatea de a izola molecule de acizi nucleici din diverse surse reprezintă un punct de plecare pentru dezvoltarea unor experimente foarte variate precum digestia cu enzime de restricţie, amplificarea in vitro, secvenţierea, clonarea de fragmente sau dezvoltarea unor biblioteci de secvenţe. Din aceste motive protocoalele care au în vedere purificarea acizilor nucleici au devenit deosebit de comune în laboratoarele de cercetare. Purificarea ADN-ului din ţesuturi şi celule presupune parcurgerea a cel puţin două etape mai mult sau mai puţin separate: 1. liza celulelor în scopul eliberării acizilor nucleici; 2. separarea acizilor nucleici de moleculele contaminante. Liza celulelor şi ţesuturilor se realizează prin acţiunea combinată a detergenţilor, enzimelor litice, agenţilor chimici sau fizici. Detergenţii au capacitatea de a solubiliza membranele celulare, ducând la eliberarea conţinutului celular. Cel mai frecvent utilizaţi sunt SDS (dodecil sulfat de sodiu sau lauril sulfat de sodiu), Triton X-100 şi CTAB (bromură de cetil trimetil amoniu). CTAB poate precipita ADN-ul genomic şi are de asemenea avantajul că elimină polizaharidele din extractele vegetale şi bacteriene (1). Enzimele litice sunt, în general, adăugate într-o soluţie tampon de liză ce conţine detergenţi. Lizozimul este utilizat pentru liza bacteriilor Gram pozitive. Zimolaza şi murienaza sunt utilizate pentru producerea de protoplaşti din drojdii. Proteinaza K lizează glicoproteinele şi inactivează parţial nucleazele. Agenţii denaturanţi precum ureea sau sărurile de guanidină pot fi utilizaţi între anumite concentraţii pentru liza celulelor fără a afecta moleculele de ADN. În cazul celulelor cu pereţi celulari duri se apelează la procedeul de sonicare. Mojararea în azot lichid sau măcinarea cu ajutorul morilor cu bile sunt câteva dintre metodele mecanice ce pot fi utilizate pentru liza învelişului celular dur.

74


Separarea acizilor nucleici de moleculele contaminante implică două etape: –separarea acizilor nucleici de moleculele de alta natură (proteine, lipide, glucide, compuşi fenolici); – separarea moleculelor de acizi nucleici de interes de celelate molecule de aceeaşi natură. Separarea acizilor nucleici de moleculele de alta natură se poate realiza prin: 1. precipitare selectivă a proteinelor şi polizaharidelor prin saltingout, metodă utilizată în special în purificarea ADN-ului plasmidial; 2. precipitare cu agenţi chaotropici şi extracţie cu solvenţi organici – cea mai utilizată metodă pentru izolarea ADN-ului genomic din diverse specii; 3. metode ce utilizează răşini de siliciu – acizii nucleici au capacitatea de a se lega de răşinile de siliciu prin intermediul interacţiilor hidrofobe; tăria acestor legături creşte în condiţii denaturate (de exemplu în prezenţa clorurii de guanidină) (2), iar eliminarea agenţilor denaturanţi duce la dispariţia legăturilor şi recuperarea acizilor nucleici; 4. metode ce utilizează schimbătorii de ioni – datorită sarcinii negative de -1/nucleotidă (respectiv -2/pereche nucleotide) acizii nucleici se leagă puternic de suporturile cromatografice încărcate pozitiv. După spălări repetate cu soluţii de concentraţii reduse în săruri pentru eliminarea contaminanţilor, moleculele de acizi nucleici sunt eluate cu soluţii tampon cu concentraţii mari de săruri; 5. metode bazate pe hidroxiapatită – acizii nucleici au capacitatea de a se lega de fosfatul de calciu cristalin prin interacţiunea dintre ionii Ca2+ şi resturile fosfat din structura nucleotidelor. Separarea moleculelor de acizi nucleici de interes de celelalte molecule de aceeaşi natură se relizează prin diferite proceduri: 1. pentru izolarea ADN dintr-un amestec ce conţine ADN şi ARN se utilizează tratamente cu RN-aze; 2. pentru izolarea ARN-ului dintr-un amestec ce conţine ADN şi ARN se utilizează tratamente cu DN-aze; 3. pentru izolarea ADN-ului plasmidial de ADN-ul genomic se utilizează proprietatea plasmidelor de a se renatura mult mai rapid

Izolarea şi purificarea ADN-ului

75

decât ADN-ul genomic; cele mai utilizate metode sunt liza alcalină (3) sau liza prin fierbere (4); o altă metodă mai puţin utilizată pentru separarea ADN-ului plasmidial este centrifugarea în gradient de CsCl; 4. pentru izolarea ADN-ului de o anumită dimensiune se utilizează electroforeza în geluri de agaroză sau poliacrilamidă. Dezvoltarea diverselor tehnici de manipulare in vitro a acizilor nucleici a condus la necesitatea ca, pe lângă sursele tradiţionale de izolare precum celule sau ţesuturi bacteriene, fungice, vegetale sau animale să se dezvolte protocoale de izolare şi purificare a acizilor nucleici din soluţiile apoase rezultate în urma reacţiilor de amplificare in vitro, digestie enzimatică, fosforilare sau defosforilare, marcare radioactivă etc. În general, aceste din urmă tehnici utilizează filtrarea prin gel sau membrane de siliciu (5). În ultima perioadă se poate constata diminuarea frecvenţei utilizării metodelor tradiţionale de izolare a acizilor nucleici în favoarea folosirii diverselor truse (kit-uri) specifice. Acestea conţin toate materialele necesare pentru a izola acizii nucleici de un anumit tip şi au avantajul rapidităţii de realizare a experimentului. Vom încerca pe cât posibil ca la fiecare din metodele de izolare a ADN-ului prezentate în continuare să precizăm atât trusele ce pot fi utilizate cât şi firmele ce le furnizează.

IV.1 Izolarea ADN-ului plasmidial Pentru izolarea ADN-ului plasmidial trebuie depăşită o problemă destul de dificilă reprezentată de separarea plasmidelor de alte molecule de aceeaşi natură (ADN-cromozomial). Radloff (6) a reuşit să izoleze pentru prima dată ADN-plasmidial folosind o metodă care se bazează pe absorbţia diferenţiată a bromurii de etidiu. De atunci au fost descrise diverse alte metode, ce se bazează pe gel-filtrare, cromatografie cu schimbători de ioni sau precipitare diferenţiată (7). Dintre acestea, cele mai utilizate metode, datorită simplităţii şi randamentului mare, sunt cele ce folosesc precipitarea diferenţiată. Aceste metode se bazează pe proprietatea ADN-ului plasmidial de a se renatura mult mai rapid decât ADN-ul genomic, acesta din urmă fiind precipitat împreună cu moleculele proteice. Două metode de izolare a ADN-ului plasmidial au

76


devenit clasice în biologia moleculară: liza alcalină (3) şi liza prin fierbere (4). Acestea se pot utiliza numai pentru plasmidele de dimensiuni mici (până la 10 kb), pentru cei de dimensiuni mari utilizându-se metode mai puţin invazive, precum centrifugarea în gradient de CsCl (8). Sambrook (7) descrie un număr foarte variat de protocoale pentru prepararea ADNului plasmidial, protocoale ce se pot adapta uşor condiţiilor şi dotării existente în orice laborator. Truse (kit-uri) comerciale disponibile pentru prepararea ADN-ului plasmidial: ► QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen; ► Strataprep Plasmid Miniprep Kit, Stratagene; ► Quantum Prep Plasmid Miniprep Kit, Biorad; ► Illustra plasmidPrep Mini Spin Kit, Amersham Biosciences.

Izolarea ADN-ului plasmidial folosind metoda lizei alcaline Metoda a fost descrisă pentru prima data de Birnboim şi Doly, (1979) (3) şi constă în două etape distincte, liza celulară şi precipitarea selectivă a ADN-ului plasmidial, urmate de precipitarea ADN-ului cu solvenţi organici. Prima etapă, cea de liză celulară şi precipitare selectivă a ADN-lui plasmidial se bazează pe faptul că plasmidele au dimensiuni mici şi sunt puternic supra-spiralizat, pe când ADN-ul genomic are dimensiuni mari şi este mai puţin răsucit. Această diferenţă de topologie permite precipitarea selectivă a ADN-ului genomic împreună cu proteinele, ADN-ul plasmidial şi ARN-ul rămânând în soluţie. Celulele sunt lizate în condiţii de alcalinitate, iar ADN-ul şi proteinele se denaturează. Soluţia este apoi neutralizată prin adăugare de acetat de potasiu, creându-se astfel condiţii în care proteinele şi ADN-ul cromozomial nu se pot renatura şi precipită. ADN-ul plasmidial, datorită dimensiunilor mici se poate renatura şi rămâne solubil. Prin centrifugare se separă precipitatul, alcătuit din proteine şi ADN cromozomial, de sepernatantul care conţine ADN plasmidial.


77

Precipitarea cu solvenţi organici Din supernatantul rezultat, ADN-ul este precipitat în vederea eliminării compuşilor micromoleculari cu ajutorul unor solvenţi organici cum ar fi izopropanol (concentraţie finală 40-50%) sau etanol (75-80%) (8). Solvenţii organici au proprietatea de a induce, în prezenţa unor concentraţii mari de cationi monovalenţi (0,1-0,5 M), o serie de modificări structurale la nivelul moleculelor de acizi nucleici, determinând agregarea şi precipitarea acestora. Deoarece majoritatea sărurilor şi compuşilor micromoleculari sunt solubili în etanol 70%, această etapă asigură şi eliminarea moleculelor de acest tip. Izopropanolul are avantajul că poate fi utilizat în volume mici, însă prezintă şi dezavantajul că sărurile au o solubilitate mai mică în acest alcool, precipitând odată cu ADN-ul (1). Un aspect foarte important în realizarea etapei de precipitare cu solvenţi organici a ADN-ului îl reprezintă concentraţia de sare, deoarece cationii din structura sărurilor intervin în mod direct în proces. Cationii ecranează grupările fosfat, elimină forţele de respingere şi permit astfel împachetarea strânsă a moleculelor şi ca urmare precipitarea. În general, pentru precipitarea ADN-ului, se preferă acetatul de amoniu deoarece este volatil şi prin urmare uşor de eliminat (5). Pentru precipitare se pot utiliza şi alţi compuşi precum: 1. PEG (polietilen-glicol) – are dezavantajul de a fi deosebit de greu de eliminat din reacţie, iar precipitarea nu se poate realiza decât cu soluţii în care ADN-ul are o concentraţie mai mare de 10 mg/ml(9); 2. TCA (acid tricloracetic) – precipită molecule de dimensiuni mici dar acizii nucleici recuperaţi nu sunt funcţionali(5). Principiul metodei Celulele bacteriene sunt lizate prin acţiunea NaOH (denaturează ADN-ul) şi SDS-ului (denaturează proteinele) în vederea eliberării conţinutului celular. Soluţia obţinută este neutralizată rapid, ceea ce face ca ADN-ul cromozomial, proteinele şi SDS-ul să precipite. Componentele insolubile sunt eliminate prin centrifugare. Datorită dimensiunilor mici ADN-ul plasmidial se renaturează şi îşi păstrează solubilitatea, fiind astfel separat de componentele celulare. ADN-ul plasmidial este recuperat din supernatant prin precipitare cu etanol.


78

Avantaje: 1. separarea moleculelor de ADN dublu catenar închise, cu dimensiuni mai mici de 10 kDa; pentru plasmidele de dimensiuni mai mari se recomandă utilizarea altor metode de liză (8); 2. uşor de scalat între volume de 1 ml (mini-prep) şi 1 L (maxi-prep) mediu de cultură, permiţând obţinerea unor cantităţi mari de ADN-plasmidial; 3. timpul de lucru este de sub o oră pentru 12 probe, fiind o metodă mai rapidă decât metoda prin fierbere, dar mai lentă decât metoda care foloseşte litiu (10); 4. randamentul de recuperare tipic este de 3-5 μg ADN/ml mediu de cultură, folosind plasmizi ce se replică în număr mare (precum Xf3 sau pUC); cantitatea de ADN-plasmidial rezultată depinde de numărul de copii în care plasmidul există în celulă; pentru creşterea randamentului recuperării este recomandat să se utilizeze medii de cultură îmbogăţite (de exemplu Terrific Broth, TB) sau să se efectueze un tratament cu cloramfenicol a culturilor bacteriene; cloramfenicolul are capacitatea de a inhiba sinteza de proteine ceea ce conduce la oprirea diviziunii celulare, dar nu afectează multiplicarea plasmidelor (8); deşi acest tratament nu mai este necesar pentru vectorii plasmidiali moderni, el este totuşi utilizat în ideea reducerii balastului proteic. Limitări: 1. expunerea prelungită la valori mari de pH poate duce la denaturarea ireversibilă (11) sau chiar ruperea catenelor ADN-ului plasmidial (12); 2. calitatea preparatului depinde de tulpina ce conţine plasmidul, cele mai bune rezultate obţinându-se cu tulpini cu activitate redusă a endonucleazei A care produc puţine poliglucide (C600, DH1, LE392).


79

Materiale necesare: 1. mediu Luria-Bertani (LB) – 10 g NaCl, 5 g extract de drojdii şi 10 g peptonă se dizolvă în 800 ml apă, se corectează pH-ul la 7 şi se autoclavează; mediul steril este stabil la temperatura camerei timp nelimitat; 2. soluţie glucoză-Tris-EDTA (GTE) – glucoză 50 mM, Tris 25 mM, EDTA 10 mM, pH 8; soluţia nesterilă nu este stabilă la temperatura camerei; dacă se prepară cantităţi mai mari, soluţia se repartizează în flacoane de 100 ml, se sterilizeză şi se păstrează la temperatura de 4oC; 3. soluţie Tris-HC1 1 M, pH 8,0; soluţia se filtrează şi se autoclavează; 4. soluţie EDTA 0,5M – se cântăreşte cantitatea de EDTA şi se dizolvă în aproximativ 70% din volumul de apă; se adaugă NaOH solid până când soluţia se clarifică, după care se verifică pH-ul; dacă este necesar se adaugă NaOH până când pH-ul se situează în intervalul 7-8 după care soluţia se filtrează şi se autoclavează; se păstrează la frigider; 5. soluţie tampon TrisCl-EDTA (TE) – 10 mM TrisCl, 1 mM EDTA, pH 8; pentru prepararea a 100 ml, într-un cilindru gradat de 100 ml se introduc 1 ml Tris-HCl 1 M pH 8,0, 0,2 ml EDTA 0,5 M şi se completează la semn cu apă distilată; 6. soluţie NaOH/SDS – SDS 1% în NaOH 0,2 N, 7. Acetat de potasiu 3 M – se prepară prin combinarea a 60 ml acetat de potasiu 5 M, 11,5 ml acid acetic concentrat, 28,5 ml apă distilată; 8. etanol 95% şi 70%; 9. microeprubete de 1,5 ml; 10. microcentrifugă; 11. facultativ: RN-ază 10 mg/ml (enzima trebuie să fie lipsită de activitate DN-azică), concentrator cu vacuum centrifugal (SpeedVac concentrator, Eppendorf).

80


Mod de lucru: 1. 5 ml mediu LB steril conţinând antibioticul corespunzător se inoculează cu o colonie bacteriană purtătoare a plasmidului de interes. Cultura se incubează în vederea creşterii bacteriei până la atingerea fazei staţionare, urmând protocolul specific pentru microorganismul cu care se lucrează (pentru E. coli, 37oC, 190 rpm, peste noapte, într-un agitator termostatat). 2. 1,5 ml cultură bacteriană se centrifughează timp de 20 secunde la 13000 rpm în vederea recuperării celulelor. Supernatantul reprezentat de mediul de cultură clar se aruncă. Centrifugarea se poate realiza la temperatura camerei sau la temperatura de 4oC. 3. Depozitul se resuspendă în 100 μl soluţie GTE şi se incubează timp de 5 minute la temperatura camerei. Dacă depozitul nu este complet resuspendat şi dislocat (sunt vizibile fragmente în masa lichidului), randamentul izolării scade foarte mult. 4. Se adaugă 200 μl soluţie NaOH/SDS, se amestecă prin răsturnarea microeprubetei şi se incubează pe gheaţă timp de 5 minute. Lizatul obţinut trebuie să fie clar. 5. Peste lizat se adaugă 150 μl soluţie acetat de potasiu şi se agită imediat prin răsturnarea microeprubetei. Pentru precipitare completă se menţine microeprubeta pe gheaţă timp de 5 minute. 6. Precipitatul este colectat pe fundul eprubetei prin centrifugare timp de 3 minute la 13.000rpm. 7. Supernatantul este transferat într-o microeprubetă nouă, se adaugă 0,8 ml etanol 95% şi se incubează timp de 2 minute la temperatura camerei pentru precipitarea acizilor nucleici. 8. ADN-ul şi ARN-ul sunt recuperaţi prin centrifugare timp de 1 minut la 13.000rpm 9. Supernatantul este înlăturat, iar depozitul este resuspendat în etanol 70%. Acizii nucleici sunt recuperaţi prin centrifugare timp de 1 minut la 13.000rpm. Această etapă de spălare are rolul de a elimina sărurile precipitate în prima etapă.


81

10. Precipitatul este apoi uscat la temperatura camerei sau folosind SpeedVac-ul. Dacă uscarea nu este completă, etanolul va interfera cu enzimele de restricţie şi polimerazele. 11. Depozitul se resuspendă în apă dacă se utilizează imediat sau în tampon TE, dacă se doreşte păstrarea ADN-lui. În cazul în care preparatul este contaminat cu RNA se adaugă 1 μl soluţie RN-ază, 10 mg/ml. 5 μl din preparatul obţinut pot fi utilizaţi pentru efectuarea reacţiilor de clivare cu enzime de restricţie. Metoda poate fi scalată pentru volume de până la 1 L mediu de cultură prin mărirea corespunzătoare a volumului componenţilor utilizaţi. Metode ce descriu producerea de ADN plasmidial din volume mari de cultură sunt de asemenea descrise în literatura de specialitate (8).

Izolarea ADN-ului plasmidial utilizând metoda lizei prin fierbere Metoda a fost descrisă şi utilizată pentru prima dată de Holmes (4) şi constă, ca şi metoda descrisă anterior, dintr-o etapă de liză şi denaturare a componentelor celulare, realizată prin acţiunea căldurii, o etapă de precipitare diferenţiată a componentelor celulare şi o etapă de recuperare a ADN-ului plasmidial. Principiul metodei Celulele bacteriene conţinând plasmidul de interes sunt lizate prin acţiunea lizozimului şi a căldurii. Temperatura ridicată realizează, în plus, denaturarea proteinelor şi acizilor nucleici. Prin răcirea lizatului, moleculele de dimensiuni mari (proteine şi ADN cromozomial) nu se pot renatura şi devin insolubile, precipitând. După eliminarea precipitatului prin centrifugare, ADN-ul plasmidial renaturat, solubil, este recuperat prin precipitare cu etanol.


82

Avantaje: 1. metoda este foarte asemănătoare cu cea care foloseşte liza alcalină, având aceleaşi avantaje şi aplicaţii; 2. este mai simplă şi mai economică decât metoda prin liză alcalină, necesitând mai puţini reactivi. Limitări: 1. cantitatea de ADN obţinut este, în general, mai mică prin comparaţie cu metoda care foloseşte liza alcalină; 2. calitatea preparatului depinde de tulpina ce conţine plasmidul; tulpinile derivate de la HB101 sau TG1 au un conţinut ridicat de poliglucide şi de aceea este indicată utilizarea metodei prin liză alcalină(1); 3. observaţiile privind cantitatea de ADN recuperată în cazul lizei alcaline sunt valabile şi în cazul lizei prin fierbere. Materiale necesare: 1. mediu LB – 10 g NaCl, 5 g extract de drojdii şi 10 g peptonă se dizolvă în 1000 ml apă, se corectează pH-ul la 7 şi se autoclavează; mediul steril este stabil la temperatura camerei timp nelimitat; 2. soluţie Tris-HC1 1 M, pH 8; soluţia se filtrează şi se autoclavează; 3. soluţie NaCl 5 M – 29 g NaCl se dizolvă într-un volum final de 100 ml apă distilată; soluţia obţinută se filtrează şi se autoclavează; 4. soluţie EDTA 0,5 M – se cântăreşte cantitatea de EDTA şi se dizolvă în aproximativ 70% din volumul de apă; se adaugă NaOH solid până când soluţia se clarifică, după care se verifică pH-ul; dacă este necesar se adaugă NaOH până când pH-ul atinge o valoare situată în intervalul 7-8, după care soluţia se filtrează şi se autoclavează; soluţia obţinută se păstrează la frigider; 5. soluţie STET (Sare/Tris/EDTA/Triton X-100) – 0,1 M NaCl, 10 mM TrisCl, 1 mM EDTA, 5% Triton X-100, pH 8; pentru a


83

prepara 100 ml, se introduc într-un cilindru gradat de 100 ml 2 ml NaCl 1 M, 1 ml Tris-HCl pH 8,0, 0,2 ml EDTA 0,5 M, 5 ml Triton X-100 şi se completează la semn cu apă distilată; 6. lizozim; 7. izopropanol, rece; 8. etanol 80%, facultativ; 9. tampon TE – 10 mM TrisCl, 1 mM EDTA, pH 8; într-un cilindru gradat de 100 ml se introduc 1 ml Tris-HCl 1 M pH 8,0, 0,2 ml EDTA 0,5 M şi se completează la semn cu apă distilată. 10. soluţie RN-ază 10 mg/ml; 11. microeprubete de 1,5 ml; 12. baie de apă. Mod de lucru: 1. 5 ml mediu LB steril conţinând antibioticul corespunzător se inoculează cu o colonie bacteriană purtătoare a plasmidului de interes; cultura se incubează în vederea creşterii bacteriei până la atingerea fazei staţionare, urmând protocolul specific pentru microorganismul cu care se lucrează (pentru E. coli, 37oC, 190 rpm, peste noapte); 2. 1,5 ml cultură bacteriană se centrifughează timp de 20 secunde la 13.000rpm în vederea recuperării celulelor; supernatantul reprezentat de mediul de cultură clar se aruncă; centrifugarea se poate realiza la temperatura camerei sau la temperatura de 4oC; 3. depozitul conţinând celulele bacteriene se resuspendă prin pipetare în 300 μl soluţie STET conţinând 200 μg lizozim; suspensia poate fi vortexată pentru a resuspenda foarte bine celulele; 4. microeprubetele se incubează pe gheaţă timp de 10 minute; 5. se incubează pe baia de apă la fierbere (100°C) 1-2 minute; 6. lizatul obţinut se centrifughează timp de 30 minute la 13.000rpm pentru separarea componentelor insolubile; 7. supernatantul se transferă într-o microeprubetă nouă, fără a se disloca depozitul;

84


8. se adaugă 200 μl izopropanol rece şi se incubează la temperatura de -20°C timp de 30 minute; ADN-ul plasmidial precipitat este recuperat prin centrifugare la 13.000 rpm timp de 5 minute; 9. dacă preparatul este contaminat cu săruri (ADN-ul nu este clivat de enzimele de restricţie) se poate introduce o etapă de spălare cu etanol 80%; 10. supernatantul se aruncă şi depozitul se usucă la temperatura camerei sau folosind concentratorul centrifugal SpeedVac (Eppendorf); 11. depozitul se resuspendă în apă dacă se utilizează imediat sau în tampon TE dacă se doreşte păstrarea ADN-lui.

IV.2 Izolarea ADN-ului genomic Pentru izolarea ADN-ului cromozomial din diverse surse au fost descrise o serie de metode, alegerea uneia sau alteia depinzând de aplicaţia în care preparatul va fi utilizat. Unele aplicaţii, cum ar fi reacţiile de digestie enzimatică, necesită cantităţi relativ mari de ADN de puritate foarte mare. În aceste cazuri se parcurg etape mai elaborate de purificare, ce sunt descrise în continuare. Alte aplicaţii, precum cele care au la bază amplificarea in vitro a moleculelor de acizi nucleici sunt mult mai permisive în privinţa cantităţii şi calităţii, motive pentru care este posibilă utilizarea unor metode mai simple şi mai rapide de izolare a ADN-ului, precum cele descrise pentru bacterii (13). Toate metodele prezentate în cele ce urmează au la bază metoda clasică de extracţie cu fenol/cloroform/alcool izoamilic descrisă pentru prima dată de Chomczynski (14). Lizatul celular conţinând acizi nucleici este pus în contact cu un amestec organic nemiscibil cu apa, alcătuit din fenol, cloroform şi alcool izoamilic. Fiecare dintre cele 3 componente ale fazei organice are un rol bine stabilit în sensul că: - fenolul realizează denaturarea proteinelor şi solubilizarea lor parţială în faza organică; – cloroformul asigură o mai bună separare între faza apoasă şi cea organică, reducând cantitatea de apă reţinută de aceasta din urmă (15),(16); – alcoolul izoamilic preîntâmpină formarea spumei ajutând la separarea celor două faze şi mărind randamentul extracţiei (1).


85

Proteinele denaturate se separă la interfaţa dintre faza organică şi faza apoasă, iar ADN-ul rămâne în cea din urmă. Din faza apoasă ADN-ul este izolat prin precipitare cu alcooli (etanol, izopropanol), urmând principiile descrise anterior (pentru detalii, consultaţi protocolul Izolarea ADN-ului plasmidial folosind metoda lizei alcaline, pagina 76).

Izolarea ADN-ului genomic din bacterii Metodele tradiţionale, precum cele descrise de Meade et al., 1982 (17) se bazează pe liza celulelor cu ajutorul lizozimului, proteazelor şi detergenţilor, urmate de extracţia acizilor nucleici cu ajutorul sistemului de solvenţi fenol/cloroform. Aceste metode permit eliminarea foarte eficientă a moleculelor proteice, dar nu pot fi utilizate pentru tulpini care produc cantităţi mari de exopoliglucide precumPseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Myxococcus şi Brudyrhizobium. O îmbunătăţire evidentă a acestor metode a fost realizată deKate Wilson (1) prin introducerea unei etape de precipitare cu CTAB (bromură de cetil-trimetil-amoniu), compus care elimină exopoliglucidele din extract. Metoda, descrisă în cele ce urmează, permite izolarea ADN-ului genomic bacterian utilizabil direct pentru digestia enzimatică folosind ca sursă un spectru foarte larg de bacterii Gram-negative sau Gram-pozitive. Truse (kit-uri) disponibile: ™

► GenElute Bacterial Genomic DNA Kit (SigmaAldrich); ► AxyPrep™ Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit (Axygen); ► Illustra bacteria genomic Prep Mini Spin Kit (Amersham); ► ChargeSwitch® gDNA Mini Bacteria Kit (Invitrogen).

Principiul metodei Celulele bacteriene sunt lizate şi proteinele distruse prin acţiunea proteinazei K. Fragmentele din peretele celular, poliglucidele şi restul de proteine sunt precipitate selectiv cu CTAB, iar ADN-ul cu masă moleculară mare este recuperat prin precipitare cu izopropanol.


86

Avantaje: 1. randamentul este în general de 5-20 μg/ml cultură bacteriană. Limitări: 1. unul dintre elementele cheie al metodei este conţinutul de NaCl, care nu trebuie să depăşească 0,5 M; dacă se depăşeşte această concentraţie, ADN-ul cromozomial precipită(18); 2. toate operaţiile trebuie realizate la temperaturi mai mari de 15oC deoarece sub această temperatură se produce precipitarea CTAB. Materiale necesare: 1. soluţie Tris-HC1 1 M, pH 8 – soluţia se filtrează şi se autoclavează; 2. soluţie EDTA 0,5 M – se cântăreşte cantitatea de EDTA şi se dizolvă în aproximativ 70% din volumul de apă; se adaugă NaOH solid până când soluţia se clarifică, după care se verifică pH-ul; dacă este necesar se adaugă NaOH până când pH-ul se încadrează în domeniul 7-8, după care soluţia se filtrează şi se autoclavează; soluţia se păstrează la frigider; 3. soluţie tampon TE – 10 mM TrisCl, 1 mM EDTA, pH 8; pentru a preparara 100 ml, într-un cilindru gradat de 100 ml se introduc 1 ml Tris-HCl 1 M pH 8, 0,2 ml EDTA 0,5 M şi se completează la semn cu apă distilată; 4. soluţie SDS 10%– 10 g SDS se dizolvă în 90 ml apă distilată; 5. proteinază K 20 mg/ml – 20 mg proteinază K se dizolvă în 1 ml apă distilată; soluţia obţinută se repartizează în microeprubete, câte4 μL/microeprubetă şi se păstrează la temperatura de -20°C; nu se recongelează; 6. soluţie NaCl 5 M – 29 g NaCl se dizolvă într-un volum final de 100 ml apă distilată; 7. soluţie CTAB/NaCl – 10% CTAB în NaCl 0,7 M – pentru prepararea a 100 ml soluţie, într-un cilindru gradat se introduc


87

10 g CTAB, 14 ml NaCl 5 M şi 60 ml apă distilată; Se agită amestecul şi se încălzeşte la temperatura de 65oC până la dizolvarea completă a detergentului, după care se aduce la semn; soluţia se păstrează la temperatura camerei, fiind stabilă câţiva ani; 8. 8-hidroxichinolină; 9. soluţie TRIS bază 50 mM, pH 10,5, neajustat – 6,05 g Tris bază se dizolvă în 1000 ml apă distilată; 10. soluţie Tris-HCl 50 mM, pH 8 – 6,05 g Tris bază se dizolvă în 800 ml apă; se corectează pH-ul cu HCl şi se aduce la 1000 ml cu apă distilată; 11. cloroform; 12. alcool izoamilic; 13. fenol lichid Fenolul este toxic şi coroziv, cauzând arsuri ale pielii şi materialelor textile. Este obligatoriu să se poarte echipament de protecţie (mănuşi, ochelari şi halat, iar manipularea fenolului se face numai sub nişă. Pentru unele aplicaţii se poate folosi fenol 88% fără a fi necesară purificarea acestuia. Dacă fragmentele ADN care se purifică vor fi utilizate pentru clonare, este indicat ca fenolul să fie redistilat deoarece compuşii de oxidare ai fenolului introduc leziuni în catenele de acizi nucleici. Fenolul redistilat este disponibil de la diverşi furnizori, la fel ca şi soluţia fenol/cloroform/alcool izoamilic 25:24:1 (v/v/v). 14. fenol tamponat pH 8 –într-un pahar din sticlă cu capacitatea de 2 L se introduc 5 g 8-hidroxichinolină şi, cu atenţie, 500 ml fenol lichid (lichefiat sau topit pe o baie de apă la temperatura de 65°C); soluţia va deveni galbenă datorită 8-hidroxichinolinei, care are rol antioxidant; se adaugă 500 ml Tris bază 50 mM şi se menţine sub agitare pe un agitator magnetic timp de 10 minute la temperatura camerei; se opreşte agitarea şi se separă faza apoasă prin decantare sau cu ajutorul unei pipete; se adaugă 500 ml TrisCl 50 mM, pH 8; se repetă operaţia de agitare timp de 10 minute după care se incubează fără agitare şi se separă faza apoasă; pH-ul soluţiei se verifică cu ajutorul hârtiei indicatoare; dacă pH-ul nu este 8, tratamentele cu TrisCl, pH 8 se reiau până la obţinerea pH-ului


88

necesar; după atingerea pH-ului dorit se adaugă 250 ml TrisCl 50 mM, pH 8; soluţia obţinută este stabilă la temperatura de 4°C, în sticle brune, pentru mai mult de 2 luni; 15. soluţie fenol/cloroform/alcool izoamilic 25:24:1 (v/v/v) – se amestecă 25 ml fenol tamponat (faza galbenă a soluţiei menţinută la temperatura de 4oC) cu 24 volume cloroform şi 1 volum alcool izoamilic; amestecul obţinut se păstrează la frigider în sticle brune şi este stabil pentru cel mult 2 luni; 16. soluţie cloroform/alcool izoamilic 24:1(v/v) – 24 ml cloroform se combină cu 1 ml alcool izoamilic; 17. isopropanol; 18. soluţie etanol 70%. Mod de lucru: 1. 5 ml mediu LB steril conţinând antibioticul corespunzător se inoculează cu o colonie bacteriană purtătoare a plasmidului de interes; cultura se incubează în vederea creşterii bacteriei până la atingerea fazei staţionare, urmând protocolul specific pentru microorganismul cu care se lucrează (pentru E. coli, 37oC, 190 rpm, peste noapte); 2. 1,5 ml cultură bacteriană se centrifughează timp de 20 secunde la 13.000 rpm în vederea recuperării celulelor; supernatantul reprezentat de mediul de cultură clar se aruncă; centrifugarea se poate realiza la temperatura camerei sau la temperatura de 4oC; 3. depozitul format se resuspendă în 567 μl tampon TE prin pipetări repetate; se adaugă 30 μl SDS 10% şi 3 μl proteinază K 20 mg/ml (concentraţia finală 100 μg/ml proteinază K în SDS 0,5%); se agită cu atenţie şi se incubează timp de o oră la temperatura de 37°C; soluţia nu se vortexează, această operaţiune putând conduce la fragmentarea moleculelor ADN; 4. peste lizat se adaugă 100 μl NaCl 5 M şi se agită prin pipetări repetate; această etapă este deosebit de importantă deoarece complexele CTAB-acizi nucleici vor precipita în condiţiile în care, la temperatura camerei, concentraţia în săruri scade sub 0,5 M;


89

5. se adaugă 80 μl soluţie CTAB/NaCl, se agită şi se incubează timp de 10 minute la temperatura de 65°C; 6. se adaugă un volum aproximativ egal de cloroform/alcool izoamilic (0,7-0,8 ml), se agită energic şi se centrifughează timp de 4-5 minute într-o microcentrifugă; 7. supernatantul vâscos, reprezentat de faza apoasă se transvazează într-o altă microeprubetă şi se adaugă un volum egal de fenol/cloroform/alcool izoamilic; se agită energic şi se centrifughează în aceleaşi condiţii ca în etapa anterioară; 8. supernatantul rezultat se transferă într-o microeprubetă nouă şi se adaugă 0,6 volume izopropanol în scopul precipitării aciziilor nucleici; microeprubeta se agită prin răsturnare până când apare un precipitat sub forma unui fir foarte fin care reprezintă ADN; acesta se recuperează printr-o centrifugare scurtă la 4.000 rpm; se poate întâmpla ca precipitatul format să nu prezinte aspect de fir, deoarece ADN-ul cromozomial a fost fragmentat, caz în care acesta mai poate fi folosit doar pentru anumite aplicaţii (digestie enzimatică, Southern blot); 9. precipitatul se spală cu etanol 70% pentru eliminarea CTAB rezidual, după care se centrifughează timp de 5 minute la temperatura camerei; supernatantul se aruncă, iar depozitul se usucă la temperatura camerei, într-un SpeedVac sau liofilizator; 10. depozitul se resuspendă în 100 μl tampon TE timp de o oră.

90


Izolarea ADN-ului genomic din plante Metodele de izolare a acizilor nucleici din plante constau în liza celulelor, separarea acizilor nucleici prin centrifugare în gradient de CsCl (1) sau precipitarea cu CTAB, extracţia cu amestec cloroform/octanol şi precipitare cu izopropanol (19). Metoda descrisă în continuare se bazează, în principiu, pe solubilitatea diferită a complexului CTAB-acizi nucleici în soluţii de clorură de sodiu de concentraţii diferite şi a fost utilizată iniţial pentru izolarea acizilor nucleici din bacterii (20). Materialul biologic folosit pentru izolarea ADN-ului poate fi reprezentat de seminţe, seminţe germinate, frunze, calus, endosperm, embrioni sau polen în stare proaspătă sau uscată. Datorită numărului mare de endonucleaze, trebuie acordată o atenţie deosebită pregătirii şi păstrării materialului vegetal în vederea extracţiei. Este indicat ca imediat după colectare, materialul biologic să fie congelat sau păstrat pe gheaţă uscată. Metoda cea mai indicată de uscare a materialului biologic este liofilizarea. Pentru probe de material vegetal se mai poate recurge la uscarea peste noapte la temperatura de 65oC sau sub vacuum (19). În general, aceste ultime două metode de uscare conduc la diminuarea randamentului de izolare şi la fragmentarea acizilor nucleici. Truse (kit-uri) disponibile pentru izolarea ADN-ului din plante: ► ChargeSwitch® gDNAPlant Kit (Invitrogen); ► DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen); ► AquaPure Genomic DNA Isolation Kits (BioRad); ► GenomicPrep™ Cells and Tissue DNA Isolation Kit (Amersham). Principiul metodei Metoda descrisă se bazează pe proprietatea detergentului CTAB de a precipita diferenţiat moleculele de acizi nucleici. La concentraţii mai mari de 0,5 M NaCl complexul CTAB-acizi nucleici este solubil, iar la concentraţii mai mici de 0,5 M devine insolubil. Materialul biologic este solubilizat cu ajutorul CTAB într-o soluţie tampon cu un conţinut mare de NaCl, după care pigmenţii clorofilieni şi


91

proteinele sunt extrase cu amestec cloroform/octanol. Prin scăderea concentraţiei NaCl, acizii nucleici sunt precipitaţi, iar supernatantul conţinând poliglucide şi compuşi fenolici este îndepărtat. Depozitul insolubil CTAB-acizi nucleici este resolubilizat într-o soluţie al cărei conţinut de NaCl este mare. Pentru eliminarea detergentului, acizii nucleici sunt supuşi unei precipitări cu izopropanol, urmate de spălare cu etanol 80%. Depozitul obţinut, conţinând ADN şi ARN este dizolvat în tampon TE. Avantaje: 1. în general, se obţin 100-500 μg ADN din 1 g ţesut proaspăt; 2. dimensiunile fragmentelor obţinute sunt mai mari de 50 kb dacă se acordă o atenţie deosebită manipulării soluţiilor ce conţin acizi nucleici (nu se vortexează, pipetarea soluţiilor se realizează utilizând pipete cu vârf larg) şi se elimină nucleazele (prin rehidratarea sau dezgheţarea probelor numai în prezenţa soluţiilor de CTAB); 3. metoda poate fi utilizată şi pentru cantităţi mai mici de ţesut vegetal (minipreparate din rondele cu dimensiunea de 1 cm2) (1); 4. metoda este mai rapidă decât cea care utilizează centrifugarea în gradient de CsCl Limitări: 1. în protocolul descris toate componentele celulare sunt lizate, astfel încât ADN-ul izolat este alcătuit din ADN cromozomial (în cea mai mare parte, dar şi din ADN mitocondrial şi ADN plastidial) o metodă de separare a ADN-ului cromozomial de cel mitocondrial şi plastidial a fost descrisă de Watson si Thomson, 1986 (21). Materiale necesare: 1. tampon 1 M Tris-HC1, pH 8 – soluţia se filtrează şi se autoclavează;

92


2. NaCl 5 M – 29 g NaCl se dizolvă într-un volum final de 100 ml apă distilată; soluţia obţinută se filtrează şi se autoclavează; 3. EDTA 0,5 M – se cântăreşte cantitatea de EDTA şi se dizolvă în aproximativ 70% din volumul de apă. Se adugă NaOH solid până când soluţia se clarifică, după care se verifică pH-ul; dacă este necesar se adaugă NaOH până când pH-ul se situează în intervalul 7-8, după care soluţia se filtrează şi se autoclavează; se păstrează în frigider; 4. tampon de extracţie CTAB 2% (w/v), EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M înTris-HCl 0,1 M, pH 8 – pentru prepararea a 100 ml tampon de extracţie, într-un cilindru gradat de 100 ml se introduc 4 ml EDTA 0,5 M, 28 ml NaCl 5 M, 10 ml Tris-HC1 0,1 M, pH 8, 30 ml apă distilată şi 2 g CTAB; soluţia se agită şi se încălzeşte la temperatura de 65oC până la dizolvarea completă a detergentului, după care se aduce la semn; soluţia se păstrează la temperatura camerei, fiind stabilă timp de câţiva ani; 5. soluţie CTAB/NaCl – CTAB 10% în NaCl 0,7 M – pentru prepararea a 100 ml soluţie, într-un cilindru gradat se introduc 10 g CTAB, 14 ml NaCl 5 M şi 60 ml apă distilată; amestecul se agită şi se încălzeşte la temperatura de 65oC până la dizolvarea completă a detergentului, după care se aduce la semn; soluţia se păstrează la temperatura camerei, fiind stabilă timp de câţiva ani; 6. soluţie de precipitare– CTAB 1% (w/v), EDTA 10 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8; pentru prepararea a 100 ml soluţie de precipitare, într-un cilindru gradat de 100 ml se introduc 2 ml EDTA 0,5 M, 5 ml Tris-HC11 M, pH 8, 80 ml apă distilată şi 1 g CTAB; soluţia se agită şi se încălzeşte la temperatura de 65oC până la dizolvarea completă a detergentului, după care se aduce la semn; soluţia se păstrează la temperatura camerei, fiind stabilă timp de câţiva ani; 7. mercaptoetanol; 8. tampon TE/NaCl – NaCl 1 M, EDTA 0,1 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8 –pentru prepararea a 100 ml, într-un cilindru gradat de 100 ml se introduc 20 ml NaCl 5M, 1 ml Tris-HCl 1 M pH 8, 0,2 ml EDTA 0,5 M şi se completează la semn cu apă distilată; soluţia este stabilă la temperatura camerei timp de câţiva ani; 9. tampon TE – EDTA 0,1 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8 –pentru prepararea a 100 ml, într-un cilindru gradat de 100 ml se introduc 20 ml NaCl 5 M, 1 ml Tris-HCl 1 M pH 8, 0,2 ml EDTA 0,5 M şi


93

se completează la semn cu apă distilată; soluţia este stabilă la temperatura camerei timp de câţiva ani; 10. cloroform/octanol 24:1 (v/v) sau cloroform/alcool izoamilic 24/1 (v/v) – 24 ml cloroform se combină cu 1 ml octanol sau cu 1 ml alcool izoamilic; soluţia rezultată se păstrează la temperatura camerei, la întuneric; 11. etanol 80%; 12. omogenizator – mojar cu pistil, blender de laborator (Waring), omogenizator cu lame (Polytron, Brinkmann), omogenizator cu bile (Precellys 24, PeqLab) sau echivalent; 13. eprubete rezistente la solvenţi organici; 14. baie de apă termostatată; 15. centrifugă; 16. SpeedVac; 17. azot lichid sau gheaţă uscată. Mod de lucru: Extracţia acizilor nucleici: 1. înainte de utilizare, 1 ml de 2-mercaptoetanol se introduce în 100 ml tampon de extracţie cu CTAB, iar soluţia obţinută se încălzeşte la temperatura de 65oC; pentru procesarea a 1 g ţesut vegetal proaspăt sunt necesare aproximativ 4 ml tampon de extracţie cu CTAB şi 0,5 ml soluţie TAB/NaCl; dacă se utilizează ţesut liofilizat sau seminţe uscate, tamponul de extracţie cu CTAB trebuie diluat în proporţie de 1:1; 2. 1 g ţesut vegetal proaspăt (sau echivalent în ţesut liofilizat) se introduce într-un mojar curat, răcit în prealabil şi se mojarează cu azot lichid până la obţinerea unei pulberi fine; în loc de mojar se pot utiliza diverse omogenizatoare (cu lamă, cu bile), cazuri în care trebuie acordată o atenţie deosebită eliminării posibilităţilor de contaminare între probe (vasul în care se realizează omogenizarea trebuie foarte bine curăţat după fiecare probă, prin utilizarea unor perii şi a aerului sub presiune (19); atunci când se lucrează cu frunze se recomandă eliminarea nervurilor proeminente, deoarece acestea sporesc conţinutul de carbohidraţi (19); o soluţie constă în utilizarea

94


de frunze tinere sau prelevarea probei de analizat sub formă de rondele recoltate din zonele dintre nervuri; 3. pulberea obţinută se transferă într-o eprubetă rezistentă la solvenţi în care se mai adaugă 4 ml tampon de extracţie încălzit care conţine CTAB şi 2-mercaptoetanol; amestecul se omogenizează prin agitare lentă şi se incubează timp de 30 minute la temperatura de 65°C, agitând ocazional; mărirea timpului de incubare la o oră conduce la creşterea cantităţii de acizi nucleici izolate; dacă randamentul nu este important, este suficientă o incubare timp de 10 minute; compuşii fenolici prezenţi în multe plante pot fi eliminaţi prin tratarea amestecului cu 1% (v/v) polivinilpirolidonă (1); Nu se foloseşte vortexul deoarece agitarea energică poate conduce la ruperea moleculelor de acizi nucleici 4. omogenatul este supus extracţiei cu un volum egal (4 ml) de cloroform/alcool izoamilic; microeprubeta se agită prin răsturnare, după care se centrifughează timp de 5 minute la turaţia de 7500 x g şi temperatura de 4°C; după centrifugare, se separă două faze, la interfaţa cărora se află resturi celulare insolubile; faza apoasă se separă prin transvazare sau pipetare într-o eprubetă curată; dacă transvazarea se realizează prin pipetare, este absolut necesar să se utilizeze pipete cu vârf larg, pentru a se elimina pericolul fragmentării moleculelor de ADN; unii cercetători preferă extracţia cu cloroform/octanol care conduce la un randament de extracţie mai bun (21); 5. peste faza apoasă recuperată se introduc 1⁄10 volume (0,4 ml) CTAB/NaCl încălzit la temperatura de 65oC şi se agită prin răsturnare; 6. soluţia este supusă unei noi extracţii cu un volum egal (4,4 ml) cloroform/alcool izoamilc; eprubeta se agită după care se recuperează faza organică, procedând ca în etapa 4.


95

Precipitarea acizilor nucleici: 1. peste faza apoasă obţinută în etapa anterioară se introduce un volum (4,4 ml) de soluţie de precipitare CTAB, după care microeprubeta se agită prin răsturnare; dacă se constată apariţia unui precipitat, se trece la etapa următoare; dacă nu, amestecul se incubează timp de 30 minute la temperatura de 65oC; 2. se centrifughează amestecul timp de 5 minute la 500 x g şi temperatura de 4°C; dacă nu apare un precipitat se adaugă mai multă soluţie de precipitare CTAB (până la 0,9 ml) şi se incubează la temperatura de 37oC, peste noapte; 3. supernatantul obţinut se transferă într-o nouă microeprubetă, dar nu se aruncă. Precipitatul conţinând acizii nucleici se dizolvă în soluţie tampon TE/NaCl (0,5-1 ml pentru 1 g material vegetal luat în lucru); uneori este dificil de resuspendat depozitul, operaţiunea necesitând incubare timp de 30 minute la temperatura de 65°C; se citeşte extincţia supernatantului la 260 nm (pentru detalii consultati capitolul VI. – Determinarea concentraţiei acizilor în soluţie, pagina 133) şi, dacă nu sunt prezenţi acizi nucleici, acesta se aruncă; 4. ADN-ul dizolvat în tampon TE/NaCl este precipitat prin adăugarea a 0,6 volume izopropanol (0,6 ml izopropanol pentru 1 ml tampon TE/NaCl); amestecul se agită şi se centrifughează timp de 15 minute la 7500 x g şi temperatura de 4°C; 5. precipitatul se spală cu etanol 80%, se usucă la temperatura camerei sau în SpeedVac şi se resuspendă într-un volum minim de tampon TE; dacă preparatul obţinut este contaminat cu ARN se poate realiza un tratament cu RN-ază, iar dacă este contaminat cu proteine se poate realiza un tratament cu proteinază K (1).

Izolarea ADN-ului din ţesuturi animale În cazul celulelor animale ADN-ul este organizat sub formă de cromozomi cu dimensiuni de 12-60 ori mai mari decât cromozomul de la Escherichia coli (22). În procesul de izolare a ADN-ului cromozomial eucariot de cele mai multe ori acesta este fragmentat, gradul de fragmentare având o importanţă deosebită asupra aplicaţiilor în care poate


96

fi utilizat preparatul. Metodele care utilizează manipulări „agresive” au tendinţa de a fragmenta lanţul dublu catenar al moleculelor de ADN în fragmente mai mici de 50 kb, ce pot fi utilizate pentru reacţii de amplificarea in vitro sau Southern blotting, dar nu pot fi utilizate pentru aplicaţii mai pretenţioase precum realizarea de biblioteci genomice (22). Metoda descrisă în cele ce urmează a fost utilizată pentru prima dată de Blin si Stafford în 1976 (23) fiind apoi modificată şi adaptată de Garner (22) pentru a permite obţinerea de fragmente de ADN cu dimensiuni de peste 200 kb. Sursa de ADN este ţesutul solid dar, cu modificări minime, metoda poate fi utilizată şi pentru sânge sau culturi de celule. Protocoale care utilizează asemenea materiale biologice sunt descrise de Garner (22). Kit-uri (truse) disponibile: ► DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen), ► AquaPure Genomic DNA Isolation Kits (Biorad); ► GenomicPrep™ Cells and Tissue DNA Isolation Kit (Amersham); ► DNA IQ™ System (Promega). Principiul metodei Ţesutul animal mojarat este tratat cu proteinază K ce clivează nespecific proteinele, determinând liza celulelor. Lizatul obţinut este supus unor extracţii succesive cu fenol, ADN-ul din faza apoasă fiind în final precipitat cu etanol. Avantaje: 

atunci când metoda se utilizează cu atenţie, dintr-un gram de ţesut animal se obţin aproximativ 2 mg ADN cu dimensiuni de cel puţin 100 kb; ADN-ul este uşor tăiat de enzimele de restricţie, fără a fi necesare operaţii suplimentare.


97

Limitări: 



procedura este destul de laborioasă, necesitând incubare îndelungată pentru liza ţesutului precum şi utilizarea de reactivi toxici; o metodă mai rapidă ce poate fi utilizată pentru extracţia ADN-ului din sânge este cea descrisă de Lahiri şi Nurnberger, 1991 (24), metodă care nu face uz de extracţii cu fenol sau de enzime; cantitatea de ADN obţinută prin aceasta ultimă metodă este mai mare, dar dimensiunile fragmentelor sunt mai mici; pentru obţinerea de fragmente de ADN cu dimensiuni mari se vor avea în vedere trei factori: 1. manipularea cu foarte mare atenţie a soluţiilor care conţin ADN pentru a minimiza forţele ce ar putea conduce la ruperea macromoleculelor de ADN; 2. izolarea, îngheţarea şi pulverizarea foarte rapide a ţesutului pentru a se elimina acţiunea DN-azelor; 3. utilizarea dializei pentru eliminarea sărurilor din preparat.

Materiale necesare: 1. 2. 3. 4. 5.

azot lichid; mojar cu pistil, răcite la temperatura de -20°C; spatule; pahare de laborator cu capacitatea de 600 ml; soluţie tampon Tris-HC1 1 M, pH 8; soluţia se filtrează şi se autoclavează; 6. soluţie EDTA 0,5 M, pH 8 – se cântăreşte cantitatea de EDTA şi se dizolvă în aproximativ 70% din volumul necesar de apă; se adaugă NaOH solid până când soluţia se clarifică, după care se verifică pH-ul; dacă este necesar se adaugă NaOH până când pH-ul se încadrează în domeniul 7-8, după care soluţia se filtrează şi se autoclavează; soluţia se păstrează la frigider; 7. soluţie tampon TE – Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8 – pentru prepararea a 100 ml, într-un cilindru gradat de 100 ml se introduc, 1 ml Tris-HCl 1 M pH 8, 0,2 ml EDTA 0,5 M şi se completează la semn cu apă distilată; soluţia se autoclavează şi este stabilă la temperatura camerei timp nelimitat;


98

8. soluţie fenol saturată cu TE – se prepară la fel cu soluţia fenol tamponată pH 8 numai că soluţia Tris pH 8 este înlocuită cu TE (pentru detalii consultaţi protocolul Izolarea ADN-ului genomic din bacterii, pagina 85); 9. NaCl 5 M – 29 g NaCl se dizolvă într-un volum final de 100 ml cu apă distilată; soluţia obţinută se filtrează şi se autoclavează; 10. soluţie SDS 10%– 10 g SDS se dizolva în 90 ml apă distilată; 11. tampon de extracţie – EDTA 0,1 M, NaCl 0,2 M, Tris-HC1 0,05 M pH 8, SDS 0,5%, RN-ază 50 μg/ml – pentru prepararea a 100 ml tampon de extracţie, într-un balon cotat se introduc 5 mg RN-aza, 20 ml EDTA 0,5 M pH 8, 5 ml NaCl 5M şi 5 ml Tris-HC1 1 M pH 8; după dizolvare se completează volumul la semn cu apă distilată; înainte de utilizare soluţia se fierbe pentru inhibarea activităţii DN-azei; 12. soluţie proteinază K 20 mg/ml în apă sterilă; dacă se prepară cantităţi mai mari, acestea se distribuie în microeprubete pentru o singură utilizare şi se păstrează la temperatura de -20oC; nu se recongelează; 13. membrane de dializă – acestea se fierb înainte de utilizare într-o soluţie EDTA 1 mM după care se clătesc cu apă distilată; 14. acetat de sodiu 3M pH 6 – 24,6 g acetat de sodiu se dizolvă într-un volum minim de apă distilată; se corectează pH-ul cu acid acetic la valoarea de 6 şi se completează până la 100 ml cu apă distilată; 15. etanol absolut; 16. etanol 70%; 17. pipete Pasteur ataşate la o pompă de vid. Mod de lucru: 1. fragmentul de ţesut proaspăt excizat este imediat congelat prin scufundare în azot lichid; organele de dimensiuni mari trebuie tăiate în fragmente mici de 1 cm3; extracţia se poate realiza din orice organ; în cazul izolării de ADN din ficat este necesar ca animalul de experiment să fie înfometat timp de 24 ore; odată îngheţată, proba de ţesut poate fi utilizată imediat sau poate fi păstrată la temperatura de -70°C timp de câţiva ani;


99

2. se toarnă azot lichid în mojarul răcit după care se introduce imediat poba (aproximativ 1 cm3) şi se mojarează până la obţinerea unei pulberi; dacă este necesar, se mai adaugă azot lichid pentru a menţine proba rece; 3. după mojarare, se aşteaptă evaporarea azotului şi cu ajutorul unei spatule se tranferă ţesutul pulverulent peste 20 ml tampon de extracţie, se agită cu atenţie, se adaugă 100 μl proteinază K (concentraţia finală 100 μg/ml) şi se incubează la temperatura de 37°C peste noapte; după incubare soluţia trebuie să fie clară şi să prezinte o consistenţă vâscoasă; 4. se adaugă 20 ml fenol echilibrat cu TE şi se amestecă prin răsturnare timp de 10-15 minute; este recomandat ca în această etapă suprafaţa de separare să fie cât mai mare; după agitare trebuie să se formeze o suspensie; amestecul se omogenizează cu atenţie, fără vortexare, pentru a reduce ruperea macromoleculelor de ADN; 5. amestecul se transferă într-o eprubetă din plastic cu capacitatea de 50 ml şi se centrifughează la l500 x g timp de 10 minute; 6. faza fenolică inferioară se aspiră cu ajutorul unei pipete Pasteur conectată la vacuum sau prin intermediul unei pipete obişnuite; se va acorda atenţie deosebită la introducerea pipetei în soluţie pentru a se evita amestecarea celor două faze; 7. etapele 3-6 se repetă de cel puţin trei ori; faza apoasă obţinută în final trebuie să fie clară. 8. pentru recuperare sunt posibile două modalităţi: a) faza apoasă se dializează faţă de 1000 volume tampon TE; dializa se realizează la temperatura camerei timp de 30 minute, după care se menţine peste noapte la temperatura de 40oC; b) peste faza apoasă se adaugă acetat de sodiu până la concentraţia finală 0,3 M; se agită uşor şi se adaugă două volume etanol absolut; ADN-ul va precipita treptat sub forma unor fire fine de culoare albă; cu ajutorul unei pipete Pasteur îndoită la vârf se culeg firele obţinute, se scufundă în etanol 70%, după care se usucă la temperatura camerei; ADN-ul precipitat obţinut se dizolvă cu atenţie în tampon TE;


100

9. se verifică puritatea preparatului prin măsurarea raportului absorbanţelor la 260/280 nm; dacă raportul este mai mic de 1,8 se repetă etapele 3-9; soluţia poate fi păstrată la temperatura de 4°C.

IV. 3 Purificarea ADN-ului din soluţii apoase În urma diverselor reacţii realizate in vitro(amplificare, digestie enzimatică), rezultă fragmente de ADN dizolvate într-o soluţie cu o compoziţie relativ simplă, care conţine cel mai frecvent tampon de reacţie, nucleozid trifosfaţi, 1-2 enzime şi compuşi cu masă moleculară mică. Deseori concentraţia în acizi nucleici sau compoziţia soluţiei tampon nu sunt compatibile cu etapele ce urmează a fi efectuate şi de aceea este necesară izolarea din amestec a moleculelor de interes. Metoda utilizează extracţia clasică cu fenol/cloroform/alcool isoamilic şi a fost descrisă pentru prima dată de Chomczynski (14). Kit-uri (truse) disponibile: ► QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen); ► PCR Kleen Spin Columns (Biorad); ► Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega); ► SpinPrep PCR Clean-up Kit (Novagen). Principiul metodei Soluţia de ADN este supusă extracţiei cu un amestec de fenol/cloroform/alcool isoamilic. ADN-ul rămâne în faza apoasă de unde este apoi precipitat cu etanol 100%. Avantaje: 1. simplitate, rapiditate; 2. randament de extracţie şi puritate a preparatelor mai bune decât în cazul utilizării metodelor bazate pe membrane de siliciu (1); 3. concentraţia ADN în soluţia de purificat trebuie să fie ≤ 1 mg/ml.


101

Limitări: 1. expunerea îndelungată la fenol poate duce la degradarea ADN-ului (1); 2. toxicitate deosebită a fenolului; 3. timp de procesare a probelor mai mare comparativ cu metodele bazate pe membrane de siliciu. Materiale necesare: 1. fenol/cloroform/alcool izoamilic 25:24:1 (v/v/v) (pentru detalii privind prepararea acestui reactiv,c onsultaţi protocolul Izolarea ADN-ului genomic din bacterii, pagina 85) 2. acetat de sodiu 3 M pH 5,2 – 408 g acetat de sodiu x 3H2O se dizolvă în 800 ml apă distilată; pH-ul se ajustează la 5,2 cu acid acetic 3M şi apoi se completează balonul cotat la semn, 1000 ml, cu apă distilată; 3. etanol 100%, răcit; 4. etanol 70%, la temperatura camerei; 5. tampon TE pH 8 – Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 8; 6. desicator sau concentrator centrifugal (Speedvac sau echivalent).

Mod de lucru: 1. într-o microeprubetă se pipetează soluţia care conţine ADN-ul de purificat (un volum cuprins între 200 şi 400 μl) şi se adaugă un volum egal de fenol/cloroform/ alcool izoamilic; 2. amestecul se agită energic (prin utilizarea unui vortex) şi se centrifughează timp de 15 secunde într-o microcentrifugă la viteză maximă; fazele organică şi cea apoasă trebuie să se separe foarte clar; uneori, datorită conţinutului mare de sare din probă (mai mare de 0,5 M), cele două faze se pot inversa, faza organică putând fi uşor identificată datorită culorii galbene; dacă separarea între faze nu este

102


perfectă, sau faza apoasă care conţine ADN-ul este vâscoasă, se repetă centrifugarea pentru încă 1-2 minute. 3. faza apoasă (de deasupra) se transferă, cu atenţie, prin intermediul unei pipete de 200 μl într-o nouă microeprubetă; dacă această fază conţine un precipitat alb se repetă etapele anterioare; 4. se adugă 1/10 volume acetat de sodiu 3 M, pH 5,2 peste soluţia conţinând ADN şi se agită prin răsturnarea microeprubetei de câteva ori; dacă soluţia iniţială conţine concentraţii mari de NaCl această etapă nu este necesară; 5. se adaugă 2,5 volume etanol 100%, rece, se agită energic prin vortexare şi se incubează pe gheaţă timp de 5-10 minute; 6. se centrifugheză timp de 5 minute la viteza maximă a microcentrifugii (14.000 rpm) iar supernatantul rezultat se aruncă; 7. precipitatul format se spală cu 1 ml etanol 70%; microeprubeta se agită prin răsturnare de câteva ori şi precipitatul se separă prin centrifugare timp de 5 minute la 14.000 rpm; dacă moleculele de ADN sunt mai mici de 200 pb, se utilizează etanol 95%; 8. supernatantul este eliminat şi precipitatul se usucă într-un desicator sau în Speedvac; după spălarea cu etanol 70% precipitatul nu aderă foarte bine la pereţii microeprubetei, de aceea eliminarea supernatantului trebuie să se realizeze cu mare atenţie; 9. ADN-ul din precipitatul rezultat se dizolvă într-un volum de apă (de obicei 20-40 μl) dacă va fi utilizat imediat sau în acelaşi volum de tampon TE dacă se doreşte păstrarea pentru un timp mai îndelungat; Pentru a facilita dizolvarea precipitatului, concentraţia finală a ADN-ului trebuie păstrată sub 1 mg/ml. Cantităţi mici de ADN (mai puţin de 25 μg) se dizolvă relativ uşor, însă pentru dizolvarea unor cantităţi mai mari ar putea fi necesară încalzirea (5 minute la temperatura de 65°C) (1). Fragmentele de ADN genomic de dimensiuni mari nu trebuie vortexate, iar dizolvarea lor necesită incubarea sub agitare uşoară timp de 1-2 zile.


103

IV. 4 Izolarea ADN-ului din geluri de agaroză Electroforeza în geluri de agaroză nu este doar o metodă de vizualizare a fragmentelor de ADN izolat, ci este, în principal, o metodă de separare a fragmentelor de ADN în funcţie de dimensiuni (pentru detalii privind electroforeza în geluri de agaroză consultaţi capitolul VII – Separarea electroforetică a ADN-ului, pagina 147). Pentru ca fragmentul de interes separat prin electroforeză să poată fi utilizat ulterior în alte aplicaţii (ligări, transformări, fosforilări) este necesară izolarea lui din gelul de agaroză şi solubilizarea într-o soluţie tampon convenabilă. De-a lungul timpului au fost dezvoltate mai multe metode de izolare a ADN-ului din geluri de agaroză, metode ce utilizează electroeluţia (25), transferul prin electroforeză a ADN-ului din gel pe un fragment de hidroxiapatită (26), dizolvarea agarozei cu ajutorul iodurii de potasiu (27) sau a agarazei. Protocoale de lucru pentru izolarea ADN-ului utilizând metodele enumerate mai sus sunt prezentate de Ausubel et al. (1) şi de Sambrook et al. (7). Metoda descrisă în cele ce urmează se bazează pe observaţiile lui Vogelstein şi Gillespie (28) legate de proprietatea sticlei de a lega fragmentele de ADN (1). Kit-uri (truse) disponibile: ► QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen); ► Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega); ► PureLink™ Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) ; ► SpinPrep™ Gel DNA Kit (Novagen). Principiul metodei Fragmentul ADN de interes este tăiat din gel cu ajutorul unui bisturiu. Agaroza este apoi topită la temperatura de 50oC în prezenţa agentilor chaotropici (compuşi ce distrug structurile macromoleculelor), iar ADN-ul este izolat utilizând coloane cu membrane de siliciu. Acestea au capacitatea de a lega fragmentele de ADN la concentraţii mari de săruri, eluarea realizându-se prin modificarea tăriei ionice şi a pH-ului.


104

Avantaje:  

simplitate, rapiditate; utilitate pentru izolarea fragmentelor mai mari de 500 pb; fragmentele mai mici se leagă practic ireversibil de membrană (5).

Limitări:  

eluţia nu este întotdeauna completă, existând ADN neeluat, cu atât mai mult cu cât dimensiunea fragmentelor este mai redusă; randament de extracţie mai redus (60%-80%) comparativ cu metodele bazate pe electroeluţie sau cu cele care folosesc agaroza cu punct de topire scăzut (1).

Materiale necesare: 1. soluţie NaI 6 M – se introduc 89,93 g NaI într-un balon cotat de 100 ml care se aduce la semn cu apă distilată; soluţia se filtrează prin hârtie de filtru şi este stabilă până la 3 luni dacă este menţinută la întuneric şi temperatura de 4°C; 2. soluţie tampon de legare – 0,75 g Na2SO3 şi 57,3 g clorură de guanidină se dizolvă în 35 ml apă distilată; se completează cu apă distilată până la 100 ml şi se sterilizează; soluţia este stabilă timp de 3-4 luni la frigider, în sticlă brună şi învelită în folie de aluminiu; dacă se observă formarea unui precipitat, soluţia nu mai poate fi utilizată; 3. soluţie Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 – 1,21 g Tris bază se dizolvă în 800 ml H2O şi se ajustează pH-ul la 7,5 cu HCl concentrat; se completează la 1000 ml cu apă distilată; important: pH-ul soluţiei variază semnificativ cu temperatura (aproximativ 0,028 unităţi de pH/oC) şi de aceea este indicat ca stabilirea valorii pH-ului necesar să se realizeze la temperatura la care se va lucra; deoarece pKa pentru Tris este 8,08, această soluţie tampon nu poate fi utilizată pentru valori de pH mai mici de 7,2 sau peste 9; soluţia este stabilă timp nelimitat;


105

4. soluţie NaCl 100 mM – 58,4 g NaCl se dizolvă într-un balon cotat de 1000 ml după care se aduce la semn cu apă distilată; 5. tampon de spălare – se prepară prin combinarea a unei părţi de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, o parte NaCl 10 mM şi patru părţi etanol (concentraţia finală de etanol 80%); 6. tampon TE – Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 8 – pentru prepararea a 100 ml, într-un cilindru gradat de 100 ml se introduc 1 ml Tris-HCl 1 M pH 8, 0,2 ml EDTA 0,5 M şi se completează la semn cu apă distilată; soluţia se autoclavează şi este stabilă la temperatura camerei timp nelimitat; 7. microeprubete de centrifugă Eppendorf de 1,5 ml; 8. baie de apă termostatată (45°C - 50°C); 9. bisturiu; 10. coloane cu membrane de siliciu pentru microcentrifugă (produse de Qiagen, Promega, Invitrogen sau Novagen). Mod de lucru: 1. după terminarea separării electroforetice (pentru detalii privind separarea electroforetică a ADN-ului în geluri de agaroză consultaţi capitolul VII – Separarea electroforetică a ADN-ului, pagina 147) se excizează din gel porţiunea care conţine fragmentul de interes cu ajutorul unui bisturiu; fragmentul de gel se plasează într-o microeprubetă de centrifugă cântărită în prealabil şi i se determină masa; dacă excizia se realizează sub lampa de ultraviolete este obligatoriu echipamentul de protecţie: mănuşi de nitril (dacă gelul conţine bromură de etidiu) şi mască sau ochelari de protecţie; 2. peste fragmentul de agaroză se pipetează 2,5 până la 3 volume de NaI 6 M (de exemplu dacă masa gelului este 200 mg se adaugă 500-600 μl soluţie); această metodă ce foloseşte NaI drept agent chaotrop nu este indicată pentru geluri care au fost migrate în tampon TBE (TRIS-borat-EDTA, pentru detalii, consultaţi capitolul VII – Separarea electroforetică a ADN-ului, pagina 147), deoarece TBE poate inhiba legarea moleculelor de ADN de membrana de siliciu; în acest caz este indicată utilizarea percloratului de sodiu sau a izotiocianatului de sodiu ca agenţi chaotropi, iar pH-ul trebuie menţinut la valoarea de 6,5;

106


3. se incubează timp de 5 minute la temperatura de 45°C - 50°C până la dizolvarea agarozei; dacă după 5 minute agaroza nu este complet dizolvată, se poate continua încălzirea pentru încă 1-2 minute, dar nu mai mult decât este necesar pentru dizolvarea gelului; 4. peste soluţia cu agaroză dizolvată se adaugă 2 volume soluţie tampon de legare şi se agită foarte bine; 5. supernatantul se aplică pe o coloană cu membrană de siliciu care se plasează în microeprubeta colectoare corespunzătoare şi se centrifughează timp de 1 minut la viteza maximă (14.000 rpm) a centrifugii; aplicarea supernatantului trebuie realizată cu atenţie pentru a nu atinge cu vârful pipetei membrana, aceasta putând fi uşor perforată; lichidul se aruncă, iar coloana se introduce în aceeaşi eprubeta colectoare; 6. membrana se spală prin aplicarea a 750 μl tampon de spălare şi se centrifugează timp de un minut la viteză maximă; lichidul de spălare se aruncă, iar coloana se reintroduce în microeprubeta de colectare; 7. se centrifughează din nou timp de un minut la viteză maximă a centrifugii, pentru eliminarea etanolului rezidual; etapa este importantă în special dacă ADN-ul produs trebuie utilizat în reacţii de restricţie sau în ligări; 8. coloana se transferă într-o microeprubetă de centrifugă de 1,5 ml şi se adaugă 75-100 μl tampon TE sau apă distilată (tratată pentru eliminarea nucleazelor); se incubează timp de 2-10 minute la temperatura camerei şi apoi se centrifughează timp de un minut la viteza maximă a centrifugii; 9. ADN-ul colectat se păstrează la temperatura de 4°C dacă se utilizează în termen de câteva zile sau la temperatura de -80oC dacă se doreşte păstrarea lui timp îndelungat.


107

IV. 5 Păstrarea ADN-ului purificat Integritatea moleculelor de ADN în soluţie poate fi compromisă de factori precum prezenţa nucleazelor, valori de pH mai mici de 6 şi mai mari de 9, prezenţa metalelor grele, radiatii UV şi prezenţa radicalilor liberi (5). Din aceste motive, atunci când se doreşte păstrarea soluţiilor ce conţin ADN este necesară eliminarea acestor factori. Nu este indicată păstrarea ADN-ului izolat direct în apă, ci în soluţii tampon. Cea mai indicată soluţie tampon este soluţia TE, deoarece Tris-ul asigură un sistem de tamponare foarte eficient în intervalul de pH 7-8 şi nu are proprietatea de a genera radicali liberi aşa cum se întâmplă în cazul tamponul fosfat salin (PBS) (29). În plus, EDTA-ul chelatează ioni bivalenţi reducând astfel activitatea nucleazelor şi efectul negativ al metalelor grele. Temperaturile scăzute sunt de asemenea un factor important care asigură o mai bună stabilitate a ADN-ului în soluţii. Păstrarea soluţiilor conţinând ADN la temperaturi de 4oC este recomandată doar pentru perioade scurte de timp (de ordinul zilelor). O mai bună stabilitate se obţine prin îngheţarea şi păstrarea probelor la temperatura de -80oC. Dacă nu este disponibil un congelator care să asigure asemenea temperaturi joase, ADN-ul purificat poate fi păstrat şi la temperatura de -20oC, pentru protejare fiind necesară adăugarea de ADN-transportor (30). Bibliografie: 1. Ausubel, M. F., Brent, R., Kingston, E. R., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, A. J., Struhl, K. (2002) –Short Protocols in Molecular Biology, p 1.23-1.27. John Wiley & Sons Inc. 2. Neudecker, F., Grimm, S. (2000) –High-throughput method for isolating plasmid DNA with reduced lipopolysaccharide content., BioTechniques, 28, 107-9. 3. Birnboim, H. C., Doly, J. (1979) –A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA., Nucleic Acids Research, 7, 1513-23. 4. Holmes, D. S., Quigley, M. (1981) –A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids., Analytical Biochemistry, 114, 1937.

108


5. Gerstein, A. S. (2001) –Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide (Gerstein, A. S., Ed.), p 167-197. 6. Radloff, R., Bauer, W., Vinograd, J. (1967) –A dye-buoyant-density method for the detection and isolation of closed circular duplex DNA: the closed circular DNA in HeLa cells., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 57, 1514-21. 7. Sambrook, J. (2001) –Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p 1.311.59. Spring Harbor Laboratory Press. 8. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) –Molecular Cloning - A Laboratory Manual, p 1.21-1.53. Cold Spring Harbour Laboratory Press. 9. Lis, J. T., and Schleif, R. (1975) –Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol., Nucleic Acids Research, 2, 383-9. 10. He, M., Wilde, A., Kaderbhai, M. A. (1990) –A simple single-step procedure for small-scale preparation of Escherichia coli plasmids., Nucleic Acids Research, 18, 1660. 11. Vinograd, J., Lebowitz, J. (1966) –Physical and topological properties of circular DNA., The Journal of General Physiology, 49, 103-25. 12. Liou, J. T., Shieh, B. H., Chen, S. W., Li, C. (1999) –An improved alkaline lysis method for minipreparation of plasmid DNA., Preparative Biochemistry & Biotechnology, 29, 49-54. 13. Chachaty, E., Saulni, P. (2000) –Isolating ChromosomalDNA from Bacteria inThe Nucleic Acid Protocols Handbook (Ralph, R., Ed.). Humana Press. 14. Chomczynski, P., Sacchi, N. (1987) –Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction., Analytical Biochemistry, 162, 156-9. 15. Palmiter, R. D. (1974) –Magnesium precipitation of ribonucleoprotein complexes. Expedient techniques for the isolation of undergraded polysomes and messenger ribonucleic acid., Biochemistry, 13, 3606-15. 16. Penman, S. (1966) –RNA metabolism in the HeLa cell nucleus, Journal of Molecular Biology, 17, 117-IN4. 17. Meade, H. M., Long, S. R., Ruvkun, G. B., Brown, S. E., Ausubel, F. M. (1982) –Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenesis., Journal of Bacteriology, 149, 114-22. 18. Murray, M. G., Thompson, W. F. (1980) –Rapid isolation of high


109

molecular weight plant DNA., Nucleic Acids Research, 8, 4321-5. 19. Stacey, J., Isaac, P. G. (2000) –Isolation and Purificationof DNA from Plants in The Nucleic Acid Protocols Handbook (R., R., Ed.), p 1317. Humana Press. 20. Jones, A. S. (1953) –The isolation of bacterial nucleic acids using cetyltrimethylammonium bromide (cetavlon)., Biochimica et Biophysica Acta, 10, 607-12. 21. Watson, J., Thompson, W. (1986) –Purification and restriction endonuclease analysis of plant nuclear DNA, Methods in Enzymology, 118, 57-75. 22. Garner, I. (2000) –Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Animal Cells in The Nucleic Acid Protocols Handbook (Rapley, R., Ed.), p 3-9. Humana Press. 23. Blin, N., Stafford, D. W. (1976) –A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes., Nucleic Acids Research, 3, 2303-8. 24. Lahiri, D. K., Nurnberger, J. I. (1991) –A rapid non-enzymatic method for the preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies., Nucleic Acids Research, 19, 5444. 25. Wienand, U., Schwarz, Z., Feix, G. (1979) –Electrophoretic elution of nucleic acids from gels adapted for subsequent biological tests. Application for analysis of mRNAs from maize endosperm., FEBS Letters, 98, 319-23. 26. Tabak, H. F., Flavell, R. A. (1978) –A method for the recovery of DNA from agarose gels., Nucleic Acids Research, 5, 2321-32. 27. Blin, N., von Gabain, A., Bujard, H. (1975) –Isolation of large molecular weight DNA from agarose gels for further digestion by restriction enzymes., FEBS Letters, 53, 84-6. 28. Vogelstein, B., Gillespie, D. (1979) –Preparative and analytical purification of DNA from agarose., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 76, 615-9. 29. Müller, J., Janz, S. (1993) –Modulation of the H2O2-induced SOS response in Escherichia coli PQ300 by amino acids, metal chelators, antioxidants, and scavengers of reactive oxygen species., Environmental and Molecular Mutagenesis, 22, 157-63. 30. Halfon, P., Khiri, H., Gerolami, V., Bourliere, M., Feryn, J. M., Reynier, P., Gauthier, A., Cartouzou, G. (1996) –Impact of various handling and storage conditions on quantitative detection of hepatitis C virus RNA., Journal of Hepatology, 25, 307-11.

V. AMPLIFICAREA ENZIMATICĂ IN VITRO A ACIZILOR NUCLEICI Folosind oricare din metodele descrise în capitolul anterior, purificarea acizilor nucleici din diverse surse devine o sarcină relativ simplă, ADN-ul obţinut putând fi folosit direct în aplicaţii diverse. În unele cazuri însă, metodele descrise duc la obţinerea unor cantităţi mici, inutilizabile de ADN. Un exemplu în acest sens îl constituie disponibilitatea unei cantităţi foarte limitate de material biologic sau când conţinutul de ADN al acestuia este extrem de redus. În asemenea situaţii se face uz de o altă tehnică deosebit de importantă în laboratorul de biologie moleculară – amplificarea enzimatică in vitro a acizilor nucleici. Această tehnică permite copierea fidelă de până la 105 ori a unei molecule de ADN dintr-o probă dată (1), realizându-se astfel o amplificare masivă a cantităţii disponibile de ADN . Extrem de important este faptul că simultan cu mărirea numărului de molecule ADN disponibile dintr-o probă, tehnica realizează şi o izolare a fragmentelor de ADN care au o secvenţă dată. Tehnicile de purificare ale ADN-ului total enunţate anterior permit obţinerea ADN-ului genomic total (sau plasmidial, după caz) sub forma unor fragmente de dimensiuni variabile. Amplificarea enzimatică in vitro a acizilor nucleici permite însă izolarea unui fragment ADN specific a cărui dimensiune şi secvenţă pot fi controlate de către cercetător, detaliu esenţial în procesul declonare. În esenţă, tehnica de amplificarea in vitro a acizilor nucleici foloseşte acelaşi mecanism bazat pe o ADN-polimerază ADN-dependentă întâlnit şi în cazul replicării in vivo a ADN-ului. Deşi principiul şi mecanismul amplificării in vitro au fost formulate încă din anul 1971 de Kleppe et al.(2), tehnica în sine a fost descrisă abia în anul 1986 de două echipe de cercetători, Mullis et al.(3) şi Saiki et al.(4). Atunci a primit şi numele cu care s-a consacrat: Polymerase Chain Reaction, sauprescurtat PCR, notaţie ce va fi utilizată în cele ce urmează. Metoda presupune folosirea unei polimeraze ADN-dependente şi parcurgerea unui ciclu care implică trei etape desfăşurate la temperaturi diferite: 1. denaturarea moleculelor de acizi nucleici; 2. legarea oligonucleotidelor amorsă (primer) şi 3. sinteza propriu-zisă a noilor molecule de acizi nucleici.

112


Acest ciclu a fost realizat iniţial prin utilizarea a trei băi de apă reglate la trei temperaturi diferite (94oC, 54oC respectiv 72oC) şi transferul amestecului de reacţie de pe o baie de apă pe alta. În vederea obţinerii unor cantităţi suficiente de ADN, ciclul trebuia repetat de câteva zeci de ori. Expunerea ADN-polimerazei la temperatura de 94oC determină inactivarea ei şi din acest motiv, protocolul iniţial presupunea adăugarea enzimei în amestecul de reacţie la fiecare nou ciclu pentru a înlocui enzima degradată. Întreaga procedură era astfel nu doar foarte laborioasă, ci şi extrem de costisitoare. Identificarea în anul 1988 (5) şi apoi izolarea în anul 1989 (6) a polimerazei termostabile Taq din microorganismul Thermus aquaticus, alături de introducerea termo-cicloarelor moderne cu elemente Peltier au făcut ca această tehnologie să devină aplicabilă pe scară largă, revoluţionând biologia moleculară şi nu numai. La ora actuală, majoritatea tehnicilor de investigare pe bază de acizi nucleici, fie că este vorba despre studii de metagenomică, obţinerea unei proteine recombinate, identificarea unor mutaţii, secvenţierea, clonarea sau cuantificarea expresiei unei gene au la bază diverse variante ale tehnicii de amplificare enzimatică in-vitro a ADN-ului. Simplitatea şi robusteţea deosebite ale acestei tehnici permit ca şi o persoană fără prea multe cunoştinţe de biologie moleculară să poată pune la punct o reacţie de amplificare PCR cu un minimum de efort (7). Popularitatea deosebită şi faptul că a fost aplicată într-o sumedenie de domenii variate atrag în mod paradoxal şi o serie de dezavantaje, principalul fiind multitudinea de variante şi modificări care au fost aduse acestei tehnici. Cercetătorul începător se va afla astfel în dificultate atunci când, în funcţie de rezultatul aşteptat, va trebui să aleagă o variantă sau alta. Datorită diversităţii deosebite în ceea ce priveşte dimensiunea şi secvenţa fragmentului de ADN ce se doreşte a fi amplificat, sursa de ADN folosită ca matriţă şi tipul polimerazei utilizabile, nu există la ora actuală un protocol standard care să funcţioneze în orice condiţii. Din acest motiv, în acest capitol este prezentat un protocol general de amplificare a ADN-ului alături de o serie de indicaţii legate de parametrii esenţiali ai amplificării, constituindu-se astfel ca punct de plecare în dezvoltarea unor metode adaptate specific secvenţei de amplificat.

Amplificarea enzimatică in vitro a ADN-ului

113

V.1 Amplificarea enzimatică in vitro a ADNuluisau PCR Procesul de amplificare enzimatică in vitro a ADN-ului constă în repetarea ciclică a trei etape (Figura 16).

1. Denaturare

ADN-ul este denaturant prin încălzire la 94oC

2. Legare

3. Sinteză Un ciclu PCR complet ADN-polimeraza extinde oligonucleotidele amorsă (primer) şi sintetizează noi catene de ADN

Oligonucleotidele amorsă (primer) se leagă de ADN-ul ţintă

FIGURA 16. Schema simplificată a unui ciclu PCR. Prima etapă a reacţiei PCR constă în incubarea amestecului de reacţie alcătuit din sursa de ADN-matriţă, polimeraza Taq, oligonucleotidele amorsă (primer) şi cele 4 deoxiribonucleozide-trifosfat la temperatura de 94oC timp de un minut. Parcurgerea acestei etape conduce la separarea catenelor ADN-ului dublu-catenar din amestec, adică la denaturarea ADN-ului. A doua etapă presupune incubarea amestecului de reacţie la o temperatură dictată de temperatura de topire a oligonucleotidelor amorsă (primer). În această etapă are loc legarea oligonucleotidelor amorsă (primer) de ADN-ul monocatenar obţinut în etapa anterioară, pe bază de complementaritate la nivel de secvenţă.

114


A treia etapă implică incubarea amestecului din etapa anterioară la temperatura de 72oC pentru un interval de timp variabil, cuprins între 20 secunde până la 2 minute. Enzima Taq devine activă şi adaugă nucleotide la capătul 3`-OH al oligonucleotidelor amorsă legate, extinzându-le. Nucleotidele sunt adăugate în ordinea dictată de complementaritatea cu ADN-ul matriţă. În acest mod are loc sinteza unei noi molecule de ADN dublucatenar. Una dintre catenele acestei molecule este catena originală, matriţă, iar a doua este catena nou sintetizată, care încorporează oligonucleotida amorsă (primer). Cele trei etape alcătuiesc un ciclu care este repetat în mod obişnuit de 30-35 ori, întregul proces durând în jur de 3-4 ore. În etapa de legare a primului ciclu, oligonucleotidele amorsă (primer) se leagă doar de catenele separate ale ADN-ului sursă, iar catenele nou sintetizate sunt clar definite doar la capătul 5` (cel reprezentat de oligonucleotida amorsă). Poziţia capătului 3` depinde de durata etapei de sinteză şi poate fi variabilă. După primul ciclu PCR se obţine un amestec de molecule de ADN sursă şi ADN nou sintetizat de dimensiuni variabile. În ciclurile următoare sunt utilizate ca matriţă şi catenele nou sintetizate, ceea ce face ca pe măsură ce procesul înaintează, moleculele nou sintetizate să încorporeze treptat, la ambele capete, oligonucleotidele amorsă (primer). Faptul că la fiecare ciclu nou se utilizează ca matriţă şi catenele sintetizate în etapele anterioare face ca sinteza ADN-ului pornind de la noile catene să fie un proces exponenţial, înlănţuit. Sinteza ADN-ului pornind de la catenele originale decurge însă liniar astfel încât, la sfârşitul celor 30-35 cicluri, produsul rezultat în urma amplificării (numit amplicon) va fi format predominant din catene sintetizate în ultimele cicluri (1). Acestea au capetele clar definite de cele două oligonucleotide amorsă (primer). Astfel, în cursul unei reacţii de amplificare enzimatică in vitro a ADN-ului (PCR), are loc multiplicarea exponenţială, înlănţuită a fragmentului de ADN cuprins între cele două oligonucleotide amorsă (primer) (Figura 17).


115

Ciclul 1

Ciclul 2

Ciclul 3

FIGURA 17. Reprezentarea grafică a ciclurilor succesive în reacţia de amplificare in vitro a ADN-ului.

De notat faptul că, deşi catenele ADN-ului matriţă (reprezentate cu negru) sunt copiate de-a lungul întregului proces, numărul catenelor nou sintetizate (reprezentate cu gri) creşte exponenţial, deoarece ele însele pot funcţiona ca matriţă.

116


Cele 3 etape obligatorii ale reacţiei PCR pot fi la ora actuală completautomatizate prin intermediultermocicloarelor. Acestea sunt dispozitive termice cu unul sau mai multe elemente Peltier care au capacitatea de a modifica în mod controlat, cu precizie şi viteză mare temperatura unui bloc de incubare în care este amplasat amestecul de reacţie. În mod curent, la programarea unui termociclor, pe lângă cele trei etape obligatorii pentru realizarea amplificării in vitro a ADN-ului, se adaugă trei etape suplimentare care nu se repetată: 1. denaturarea iniţială– constă în menţinere timp de 5 minute a amestecului PCR la temperatura de 95oC pentru denaturarea completă a ADN-ului matriţă sau a celulelor, atunci când acestea sunt utilizate direct ca sursă de ADN; 2. finalizarea sintezei– după realizarea celor 30-35 cicluri, menţinerea timp de 10 minute la temperatura de 72oC are rolul de a permite finalizare sintezei tuturor catenelor la care s-a început extensia; 3. menţinerea amestecului de reacţie la temperatura de 4-12oC este etapa finală, în general fără limită de timp, care are rolul de a păstra probele la o temperatură optimă până la intervenţia operatorului.

Amplificarea enzimatică in vitro a fragmentelor de ADN de până la 4 kb Principiul metodei Amplificarea enzimatică in vitro a ADN-ului sau PCR-ul este o reacţie de replicare enzimatică în lanţ a ADN-ului matriţă mediată de oligonucleotidele amorsă (primer). Reacţia are la bază: 1. proprietatea oligonucleotidelor amorsă (primer) de a se lega, la o anumită temperatură de molecula ADN matriţă, expunând astfel un capăt 3`-OH; 2. proprietatea polimerazei termostabile Taq de a încorpora nucleotide pe bază de complementaritate în direcţia 5`-3`, începând cu capătul 3`-OH al oligonucleotidelor amorsă (primer).


117

Aplicaţii: 1. izolarea unui fragment specific de ADN dintr-o probă de ADN genomic; secvenţa şi dimensiunea fragmentului izolat sunt controlate prin intermediul celor două oligonucleotide amorsă (primer) (Figura 18); 2. amplificarea specifică a unor fragmente de până la 4 kb cuprinse între cele două oligonucleotide amorsă (primer); ADN-ul de amplificat poate fi de orice provenienţă (animal, vegetal, bacterian sau viral); moleculele de ARN (ARN total, mesager, viral, de transfer sau ribozomal) pot funcţiona ca matriţă doar după ce au fost convertite în aşa numitul ADN complementar (ADNc) prin utilizarea unei revers-transcriptaze (8),(9); în general, în urma unei reacţii PCR se obţin 0,25-0,5 µg (sau 105 copii) ADN amplificat (1); 3. oligonucleotidele amorsă (primer) trebuie să fie perfect complementare cu secvenţa de amplificat doar la capătul 3`; la celălalt capăt acestea pot conţine, de exemplu, situs-uri de restricţie pentru enzime ce vor fi încorporate în secvenţa amplificată; 4. deşi în principiu reacţia poate avea loc pornind chiar de la o singură moleculă ADN matriţă, în practică, proba de amplificat trebuie să conţină minimum 105 molecule ADN cu secvenţa de amplificat, sau o cantitate de ADN genomic de ordinul microgramelor. Limitări: 1. deşi permite izolarea unui fragment specific de ADN, acest lucru nu este echivalent cu purificarea acestuia; metoda nu elimină complet ADN-ul contaminant dintr-o probă dată ci, prin multiplicarea extensivă a fragmentului de interes acesta devine predominant; pentru eliminarea completă a ADN-ului contaminant din probă este necesară utilizarea unor tehnici suplimentare (electroforeză în geluri de agaroză urmată de izolarea fragmentului de interes din gel);

118


2. deşi ADN-ul matriţă nu trebuie să fie foarte pur, procesul de amplificare se desfăşoară cu dificultate sau deloc în cazul în care acesta este puternic fragmentat. ADN genomic

Secvenţa ADN de amplificat

Oligonucleotidele amorsă (primer) se leagă de câte una din catenele de ADN şi flanchează secvenţa de amplificat

FIGURA 18. Localizarea oligonucleotidelor amorsă (primer).

Acestea trebuie să flancheze fragmentul de ADN de amplificat şi permit izolarea acestuia dintr-o probă complexă, precum ADN-ul genomic.


119

Materiale necesare: 1.

sursa de ADN ce conţine fragmentul care urmează a fi amplificat cu o concentraţie de ordinul μg ADN/μl; puritatea preparatului de ADN utilizat ca sursă nu este esenţială, putând fi utilizat cu succes fie ADN-ul purificat prin una din metodele descrise în capitolul IV– Metode şi tehnici folosite pentru izolarea şi purificarea ADN-ului, pagina 73, fie amestecul de reacţie în care s-a realizat reverstranscripţia, sau chiar o suspensie celulară; în cursul realizării amestecului pentru PCR, sursa de ADN trebuie să fie însă suficient de diluată pentru a preîntâmpina eventualul efect inhibitor al contaminanţilor; 2. setul de oligonucleotide amorsă (primer) complementare cu secvenţa de amplificat; pentru detalii privind modul de selecţie a secvenţei acestora, consultaţi subcapitolul V.2 –Criterii pentru alegerea oligonucleotidelor amorsă (primer), pagina126); în general, oligonucleotidele amorsă se livrează sub formă liofilizată; înainte de utilizare, în fiecare microeprubetă cu oligonucleotid se adaugă apă distilată sterilă astfel încât să se obţină o concentraţie finală de 10 picomoli/μl; 3. apă distilată sterilă; 4. ADN polimerază – la ora actuală, un număr foarte mare de furnizori pun la dispoziţie o gamă variată de polimeraze termorezistente (Tabel 4); selecţia uneia sau alteia trebuie să se facă ţinând cont de fidelitatea enzimei, adică de abilitatea acesteia de a insera cu precizie nucleotide pe catena ADN nou sintetizată, în strânsă complementaritate cu catena veche; deşi problema fidelităţii polimerazelor este una deosebit de complexă (10), ea a fost redusă strict la prezenţa activităţii exonucleazice 3'-5' prin care enzima are capacitatea de a corecta eventualele greşeli de inserţie; cum activitatea exonucleazică atrage după sine un randament mai mic al vitezei de amplificare, utilizarea unui anumit tip de polimeraze depinde de cantitatea de ADN necesară la sfârşitul reacţiei şi de utilizările ulterioare ale ADN-ului; în aplicaţiile comune, care nu necesită o precizie foarte mare, se utilizează frecvent enzime cu fidelitate redusă, în principal datorită costului de achiziţie mai redus; în aplicaţiile în care secvenţa fragmentului amplificat este esenţială (clonarea unei gene sau secvenţierea acesteia), se vor utiliza enzime cu fidelitate crescută (de exemplu PfuUltra);


120

TABEL 4. Principalele caracteristici ale diverselor tipuri de polimeraze ADNdependente utilizate în PCR Denumire comercială

Activitate Fidelitate Stabilitate exonucleazică termică (timp de 3'-5' înjumătăţire)

Viteză de sinteză (kb/min)

Taq DNA polymerase

Absentă

Foarte mică

40-60 minute la 95oC

3-10

Fragmentul Stoffel

Absentă

Foarte mică

21 minute la 97,5oC

8

Tth DNA polymerase

Absentă

Foarte mică

–

1,5

rTth XL

Foarte slabă

Redusă

–

–

UlTma DNA polymerase

Prezentă, dar slabă

Redusă

50 minute la 97,5oC

–

Pfu DNA polymerase

Prezentă

Mare

1140 minute la 95oC

3

Pfu DNA polymerase (Exo-form)

Absentă

Foarte mică

1140 minute la 95oC

–

Pfu DNA polymerase Deep Vent

Prezentă

Mare

1380 minute la 95oC

>5

Tli Pol (Vent)

Prezentă

Mare

402 minute la 95oC

4

o

Tbr DNA polymerase (Dynazyme)

Absentă

Mică

150 minute la 96 C

Platinum Pfx

Prezentă

Mare

720 minute la 95oC

6-18

Platinum Taq

Absentă

Mică

96 minute la 95oC

4-10

Taq Pol

Prezentă

Mare

30 minute la 75oC

–


121

Metoda generală propusă foloseşte rTaq polimeraza (GE Healthcare), o proteină recombinată de 94 kDa a cărei genă a fost izolată din Thermus aquaticus şi exprimată sub formă recombinată în E. coli. Activitatea polimerazică 5'-3' maximă este în intervalul de temperatură de 70-80°C. Enzima este foarte termostabilă, cu un timp de înjumătăţire de 35-40 minute la 95°C, adică echivalentul a 100 cicluri PCR. Producătorul livrează enzima într-o soluţie tampon cu 50% glicerol care conţine 5 U/μl. 5. soluţie tampon PCR 10X – Tris-HCl 100 mM, pH 8,3, KCl 500 mM, MgC12 15 mM, albumină serică bovină (BSA) 0,01% (w/v) (11); 1 ml soluţie tampon PCR se prepară prin amestecarea a 100 μl Tris-HCl lM, pH 8,3, 500 μl KCl 1 M, 15 μl MgC12 1 M, 10 μl BSA 1% şi 375 μl apă distilată, după care se sterilizează prin autoclavare; conţinutul acestei soluţii poate varia în funcţie de enzima utilizată, motiv pentru care fiecare producător livrează şi această soluţie; 6. soluţie stoc deoxiribonucleozide-trifosfat (dNTP) – în general, acestea se achiziţionează sub forma unui set de 4 fiole, fiecare conţinând o soluţia 100 mM a unui deoxiribonucleozid-trifosfat; 100 μl soluţie stoc se prepară prin pipetarea într-o microeprubetă a câte 10 μl soluţie 100nM din fiecare dNTP (ATP, dTTP, dGTP, dCTP) şi 60 μl apă distilată sterilă; 7. soluţie MgCl2 25 mM (facultativ) – poate fi utilizată atunci când este necesară îmbunătăţirea randamentului reacţiei; în general, creşterea concentraţiei de Mg2+ duce la scăderea specificităţii amplificării; concentraţia optimă este dependentă de concentraţia de dNTP şi oligonucleotide primer utilizată, dar şi de concentraţia ADN-ului matriţă; acesta este motivul pentru care acest parametru trebuie particularizat pentru fiecare amplificare în parte; gama de concentraţie în care se utilizează în mod curent MgCl2 este 1-10 mM concentraţie finală;randamentul reacţiei sau specificitatea amplificării pot fi de asemenea modificate prin utilizarea diverşilor aditivi, efectul fiecăruia fiind prezentat în Tabelul 5;


122

TABELUL 5. Principalii aditivi utilizaţi pentru îmbunătăţirea randamentului reacţiei de amplificare in-vitro a ADN-ului Aditiv

Mod de acţiune

Concentraţie finală în amestecul PCR la care se manifestă efecte

Etanol

–

Uşoară îmbunătăţire la 10%

Uree

Scade Tm*-ul oligonucleotidelor amorsă

Uşoară îmbunătăţire la 10%, efecte inhibitorii la 1M

DMSO

Scade Tm*-ul oligonucleotidelor amorsă

Îmbunătăţire la 10%

Formamidă

Scade Tm*-ul oligonucleotidelor amorsă; creşte specificitatea amplificării

Îmbunătăţire la 1,5-10%, efecte inhibitorii la peste 15%

SDS

Previne agregarea enzimei

Efecte inhibitorii la peste 0,01%

Glicerol

Scade Tm*-ul oligonucleotidelor amorsă şi măreşte rezistenţa la temeratură a polimerazei

Îmbunătăţire la 5-20%

Tween 20/NP40

–

Tween 20 0,05%(v/v), 0,05%(v/v)

Triton X-100 Previne agregarea polimerazei

0,01%(v/v)

Albumină Neutralizează mulţi din serică bovină compuşii ce inhibă amplificarea

10-100 μg/ml

Betaină

0,5-1 M

–

0,1NP40


123

Aditiv

Mod de acţiune

Concentraţie finală în amestecul PCR la care se manifestă efecte

PEG 6000

–

5-15%

Spermidină

Reduce reacţia nespecifică dintre polimerază şi ADN

5-15% (w/v)

Tm– temperatura de topire a oligonucleotidelor amorsă (engl. Melting temperature)

*

8. microeprubete sterile pentru PCR– microeprubete de tip Eppendorf cu pereţii subţiri, care permit schimbul rapid de căldură; în mod curent se utilizează microeprubete de 0,2 ml dar reacţia se poate realiza şi în vase cu volume mai mari (0,5 ml) sau mai mici (microplăci); 9. termociclor Biometra T Gradient sau echivalent – aparatul este esenţial pentru buna desfăşurare a reacţiei de amplificare şi de aceea la achiziţia acestuia trebuie luaţi în considerare o serie de parametri funcţionali, precum: – viteza de încălzire/răcire – în general, timpul necesar pentru ca blocul să ajungă de la 55oC la 94oC este de 30 secunde sau mai mult; cu cât timpul este mai mic, cu atât durata unei reacţii de amplificare va fi mai mică; – blocul termic pentru probe dimensionat la volumul micro-eprubetelor PCR utilizate; – capac cu încălzire – în lipsa acestuia, amestecul de reacţie condensează în interiorul eprubetei (sau microplăcii); în cazul utilizării unui termociclor fără capac încălzit, peste amestecul de reacţie se adaugă un strat de ulei mineral; – capacitate de a realiza gradient de temperatură – permite realizarea unui gradient de temperatură de-a lungul blocului termic, în aşa fel încât probele amplasate în diverse poziţii vor fi incubate la temperaturi diferite; acest lucru poate uşura foarte mult procesul de identificare a temperaturii optime de legare a oligonucleotidelor amorsă (primer); – capacitate de a programa aparatul şi de a salva programul în memoria acestuia în vederea utilizării ulterioare.


124

Mod de lucru: În mod ideal, în vederea diminuării contaminării cu ADN exogen, toate operaţiile necesare pentru realizarea reacţiei de amplificare in vitro a ADN-ului trebuie realizate într-o cameră dedicată acestui scop, folosind reactivi şi echipamente rezervate numai pentru PCR. Aceasta este de cele mai multe ori greu de realizat, dar totuşi pot fi luate câteva măsuri de prevedere pentru minimizarea contaminării. Astfel, utilizarea unor reactivi doar pentru reacţia PCR este esenţială. Rezervarea unor pipete strict pentru această operaţie şi utilizarea de vârfuri cu filtru pentru pipete sunt de asemenea două măsuri ce pot micşora nivelul de contaminare. Utilizarea mănuşilor de protecţie este obligatorie pe toată perioada manipulării reactivilor PCR. Etapele realizării unei reacţii standard de amplificare in vitro a ADN-ului sunt: 1. prepararea amestecului de reacţie (master mix) prin pipetarea într-o micro-eprubetă sterilă a reactivilor, conform indicaţiilor de mai jos; Cantitate pentru o probă

Cantitate pentru 10 probe

10 pmoli din fiecare

100 pmoli din fiecare

Tampon PCR 10X

5 μl

5 μl

stoc dNTP 10 mM

1 μl

10 μl

până la 48 μl*

până la 480 μl*

Oligonucleotide amorsă (primer)

Apă sterilă

* – volumul de apă poate varia în funcţie de volumul de enzimă sau ADN-matriţă utilizat. În general, orice reacţie de amplificare a unei probe necunoscute trebuie însoţită de un control pozitiv (în care ADN-ul matriţă este prezent) şi un control negativ (în care ADN-ul matriţă lipseşte, util pentru detecţia eventualei contaminări); mai multe detalii despre necesitatea celor două tipuri de probe control pot fi identificate în lucrarea lui Gerstein şi Aoyagi (7); 2. câte 48 μl din amestecul de reacţie se transvazează în numărul corespunzător de eprubete PCR sterilizate şi notate în prealabil;


125

3. se pipetează cu atenţie câte 1,5 μl soluţie ce conţine ADN-ul de amplificat; 4. se programează termociclorul urmând indicaţiile producătorului pentru a realiza etapele necesare amplificării, după cum urmează: Temp. (oC)

Timp (min.)

1 Denaturarea iniţială,Hot-Start*

95

5

2 Denaturare

95

1

variabilă

2

Etapă

3 Legarea oligonucleotidelor amorsă (primer) 4 Sinteză

72

Observaţii

Temperatura depinde de valoarea temperaturii de topire (Tm) specifice fiecărei pereche de oligonucleotide amorsă (primer)

variabil Timpul alocat depinde de

dimensiunea fragmentului de ADN amplificat şi de viteza de sinteză a enzimei utilizate; o bună aproximare a vitezei de sinteză este de 1 kb/min.

Etapele 2-4 se repetă de 30 de ori 5 Finalizarea sintezei

72

10

6 Finalizarea reacţiei

4

–

are rolul de a păstra probele la o temperatură optimă până la intervenţia operatorului

* –etapa de Hot-Start este necesară doar în cazul utilizării polimerazei Taq; pentru detalii consultaţi etapa 6 din protocol

5. se amplasează micro-eprubetele PCR închise în locaşele blocului termic al termociclorului şi se porneşte programul presetat în etapa anterioară; 6. la atingerea temperaturii de 95oC din etapa de denaturare iniţială, se adaugă câte 2,5 U enzimă (0,5 μl) şi se omogenizează prin pipetare susjos; această etapă, în care enzima este introdusă după ce amestecul de reacţie a ajuns la temperatura de 95oC poartă numele de Hot-Start; Necesitatea etapei de Hot-Start apare datorită faptului că, în

126


general, amestecul de reacţie se prepară pe gheaţă. Aceasta poate duce la legarea nucleotidelor amorsă (primer) în situs-uri nespecifice. Unele polimeraze (printre care şi Taq) au activitate polimerazică reziduală la temperaturi mici, fapt ce conduce la începerea amplificării din momentul adăugării enzimei în amestecul de reacţie. Prin adăugarea enzimei după atingerea unor temperaturi la care ADN-ul este denaturat se împiedică apariţia unor asemenea reacţii de amplificare nespecifice; în cazul utilizării unor enzime care nu necesită etapa de Hot-Start (de exemplu Pfu) acestea pot fi adăugate direct în amestecul de reacţie (master mix); 7. după finalizarea programului PCR, microeprubetele se scot de pe blocul termic şi pot fi păstrate pentru perioade scurte la temperatura de 4oC; randamentul reacţiei de amplificare se evaluează prin electroforeză în geluri de agaroză (pentru detalii, consultaţi capitolul VII – Separarea electroforetică a ADN-ului, pagina 147).

V.2 Criterii pentru alegerea oligonucleotidelor amorsă (primer) Întregul proces de amplificare in vitro a ADN-ului se bazează pe capacitatea oligonucleotidelor amorsă (primer) de a se lega de ADN-ul matriţă şi din acest motiv alegerea corectă a secvenţei acestora este elementul cheie ce poate face diferenţa dintre un PCR reuşit şi un eşec total. Specificitatea şi randamentul reacţiei PCR nu depind doar de un singur factor, ci sunt controlate atât de compoziţia amestecului de reacţie (conţinutul de Mg2+) cât şi de temperatura şi durata fiecărei etape a ciclului de amplificare. Aceasta uşurează procesul de selecţie a oligonucleotidelor amorsă (primer) şi face posibilă formularea unor reguli specifice de selecţie. Cunoscând secvenţa ADN-ului de amplificat şi respectând cele câteva reguli simple exemplificate mai jos, este posibilă în principiu alegerea unor oligonucleotide amorsă (primer) pentru amplificarea oricărei secvenţe ADN cu dimensiuni cuprinse între 200-400 pb. Pentru fragmente de dimensiuni mai mari, procesul de selecţie a secvenţei optime se complică şi de aceea este indicat să se utilizeze programe computerizate specifice (Tabelul 6) (12).


127

TABELUL 6. Cele mai utilizate programe computerizate accesibile on-line utile în procesul de selecţie a oligonucleotidelor amorsă (primer) Program

Adresă web

Primer3

http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi

GeneFisher2

http://bibiserv.techfak.uni–bielefeld.de/genefisher2/

Primer3Plus (13)

http://www.bioinformatics.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.cgi

Oligo Calc (14)

http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

PrimerBLAST

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/index.cgi?LINK_LOC=NcbiHomeAd

După identificarea secvenţei celor două nucleotide amorsă (primer) necesare pentru amplificarea secvenţei ADN de interes, acestea pot fi sintetizate în laborator (acolo unde există dotarea necesară) sau pot fi cumpărate direct de la distribuitorii specializaţi. În general, preţul este exprimat pe nucleotid şi depinde de puritatea necesară, oligonucleotidele fiind furnizate în stare liofilizată. Reguli generale pentru alegerea oligonucleotidelor amorsă 1. Complementaritatea şi unicitatea secvenţei oligonucleotidelor amorsă (primer). Cel mai important parametru pentru selecţia secvenţei celor două oligonucleotide amorsă (primer) este, bineînţeles, capacitatea acestora de a se lega pe bază de complementaritate de secvenţă de molecula ADN de amplificat şi de a forma un duplex stabil cu aceasta. Situs-urile de legare trebuie să flancheze regiunea ADN de amplificat, să fie specifice pentru fiecare oligonucleotidă şi, de asemenea, să fie unice (să nu se repete în molecula de ADN matriţă). Deşi probabilitatea ca o secvenţă de dimensiunea unei oligonocleotide amorsă (primer) să se repete în fragmentele de 2-3 kb amplificate în mod obişnuit prin PCR este destul de mică, odată cu creşterea dimensiunii fragmentului de amplificat, probabilitatea creşte drastic. Din acest motiv, pentru ampliconi de dimensiuni mari este indicat să se utilizeze programe precum BLAST

128


pentru verificarea unicităţii secvenţei setului de oligonucleotide amorsă (primer) alese. Complementaritatea de secvenţă cu molecula ADN-matriţă este esenţială la capătul 3'. Faptul că la capătul 5' există una până la trei baze care nu sunt complementare cu secvenţa de amplificat nu modifică randamentul reacţiei de amplificare. Acest lucru poate fi exploatat în sensul modificării specifice a secvenţei de amplificat. Prin introducerea unor situs-uri de restricţie pentru enzime în secvenţa oligonucleotidelor amorsă (primer), acestea vor fi încorporate în secvenţa amplificată. 2. Să aibă o lungimea cuprinsă între 18 şi 28 nucleotide. Cu cât lungimea unei oligonucleotide este mai mare, cu atât specificitatea reacţiei PCR este mai mare, însă legarea la ADN-ul matriţă este mai puţin eficientă şi în consecinţă cantitatea de ADN obţinută în urma reacţiei de amplificare este mai mică. 3. Să prezinte temperatura de topire cuprinsă între 52°C şi 60°C. Temperatura de topire (Tm) reprezintă temperatura la care jumătate din moleculele de oligonucleotid amorsă (primer) sunt asociate cu ADN-matriţă şi sunt o indicaţie a tăriei duplexului oligonucleotid-ADN format. Tm este un parametru care se calculează pentru fiecare oligonucleotid amorsă (primer) în parte şi este influenţat de secvenţa specifică a acestuia. Au fost descrise mai multe modalităţi de calcul ale valorii Tm, cea mai corectă folosind noţiunile de entalpie şi entropiefuncţii de stare ale unui sistem termodinamic. În mod obişnuit, o modalitate simplă care permite aproximarea rapidă a valorii Tm pentru o oligonucleotidă dată foloseşte formula:

unde G, C, A, T reprezintă numărul de G, C, A şi respectiv T din secvenţa oligonucleotidei amorsă (primer). În general, valoarea optimă pentru Tm este cuprinsă între 52°C şi 60°C şi trebuie să aibă valori apropiate pentru ambele oligonucleotide amorsă (primer) utilizate. Valoarea lui Tm este utilă pentru stabilirea temperaturii optime din etapa de legare a ciclului PCR. Aceasta trebuie să fie mai mică cu câteva grade decât cea mai mică temperatură Tm a celor două oligonucleotide amorsă (primer).


129

4. Conţinutul de GC trebuie să fie între 40% şi 60%. 5. Să formeze o aşa-zisă clemă GC. Prezenţa de până la trei nucleotide G sau C printre ultimele cinci nucleotide de la capătul 3' duce la asocierea mai puternică a oligonucleotidului amorsă cu ADN-ul matriţă, formându-se o aşa-numită clemă GC, ceea ce conduce la creşterea randamentului reacţiei de amplificare. Mai mult de trei nucleotide GC în ultimele cinci face foarte dificilă disocierea duplexului rezultat, ceea ce scade randamentul reacţiei. 6. Să nu formeze structuri secundare specifice. Prezenţa în oligonucleotidele amorsă a structurilor secundare produse prin legături inter- sau intra-moleculare între nucleotide poate duce la scăderea drastică a randamentului de amplificare sau chiar la stoparea completă a reacţiei. Cele mai importante tipuri de structuri secundare care trebuie evitate sunt: a) ace de păr, precum cel exemplificat mai jos; 5'–AGGCCTGACGGCCTAC ||||||| G 3'–ACTGCCGTCAC b) auto-dimeri – se formează prin asocierea pe bază de complementaritate a două molecule ale unui oligonucleotid de acelaşi tip; 5'–AGGCCTGACAGGCCATGC–3' |||||| |||||| 3'–CGTACCGGACAGTCCGGA–5' c) hetero-dimeri – se formează prin asocierea pe bază de complementaritate a două molecule ale celor două oligonucleotide utilizate pentru amplificare; 5'–AGGCCTGACAGGCCATGC–3' ||| |||| 3'–ACTTTCCGAGCATCACT–5'

130


7. Să nu conţină repetiţii. O repetiţie este o grupare de două nucleotide care se repetă succesiv, precum ATATATATAT. Numărul maxim de repetiţii acceptat este patru. 8. Să nu conţină mai mult de patru repetiţii ale aceleiaşi baze, de forma: GCGGGGGATGGGGGG Bibliografie 1. Theophilus, B. D. M. (2008) – Principles and Medical Applications of the Polymerase Chain Reaction, in Molecular Biomethods Handbook (Walker, J. M., Rapley, R., Eds.), p 29-39. Humana Press. 2. Kleppe, K., Ohtsuka, E., Kleppe, R., Molineux, I., Khorana, H. G. (1971) –Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases., Journal of Molecular Biology56, 341-61. 3. Mullis, K. B., Faloona, F. A., Scharf, S. J., Saiki, R. K., Horn, G. T., Erlich, H. A. (1986) –Specific enzymatic amplification of DNA sequences in vitro: The polymerase chain reaction, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.51, 263-273. 4. Saiki, R. K., Bugawan, T. L., Horn, G. T., Mullis, K. B., Erlich, H. A. (1986) –Analysis of enzymatically amplified beta-globin and HLADQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes., Nature, 324, 163-6. 5. Saiki, R., Gelfand, D., Stoffel, S., Scharf, S., Higuchi, R., Horn, G., Mullis, K., Erlich, H. (1988) –Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase, Science, 239, 487-491. 6. Lawyer, F., Stoffel, S., Saiki, R., Myambo, K., Drummond, R., Gelfand, D. (1989) –Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus, The Journal of Biological Chemistry, 264, 6427-6437. 7. Gerstein, A. S., Aoyagi, K. (2001) –PCR in Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide (Gerstein, A. S., Ed.), p 291-329. John Wiley & Sons, Inc., New York, USA.


131

8. Myers, T. W., Gelfand, D. H. (1991) –Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase., Biochemistry, 30, 7661-6. 9. Myers, T. W., Sigua, C. L. (1995) –5 - Amplification of RNA: HighTemperature Reverse Transcription and DNA Amplification with Thermus thermophilus DNA Polymerase in PCR Strategies (Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., Eds.), p 58-68. Academic Press, San Diego. 10. Kunkel, T. A. (2004) –DNA replication fidelity., The Journal of Biological Chemistry, 279, 16895-8. 11. Delidow, B. C., Lynch, J. P., Peluso, J. J., White, B. A. (1993) – Polymerase Chain Reaction in PCR Protocols (White, B. A., Ed.), p 1-29. Humana Press. 12. Rychlik, W. (1993) –Selection of Primers for Polymerase Chain Reaction in PCR Protocols (White, B. A., Ed.), p 31-40. Humana Press, New Jersey. 13. Untergasser, A., Nijveen, H., Rao, X., Bisseling, T., Geurts, R., Leunissen, J. A. M. (2007) –Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3., Nucleic Acids Research, 35, W71-4. 14. Kibbe, W. A. (2007) –OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator., Nucleic Acids Research, 35, W43-6.

VI. DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI ACIZILOR NUCLEICI ÎN SOLUŢIE Determinarea corectă a concentraţiei de acizi nucleici (ADN sau ARN) este un aspect esenţial pentru buna desfăşurare a etapelor ulterioare în cadrul unui experiment ce are în vedere manipularea acestor molecule (clonare, transformare). Alegerea şi utilizarea unei metode de dozare depinde, în principal, de necesităţile specifice ale experimentului, necesităţi exprimate de trei parametri: specificitate, sensibilitate şi prezenţa compuşilor care interferă. În scopul dozării acizilor nucleici au fost propuse două abordări majore: – dacă proba este pură (fără cantităţi semnificative de proteine, fenol sau alţi acizi nucleici) metoda ce trebuie utilizată este determinarea directă a concentraţiei prin spectroscopie UV. – dacă proba conţine cantităţi mici de ADN sau cantităţi semnificative de impurităţi, concentraţia poate fi estimată folosind metode care presupun cuplarea acizilor nucleici cu diverşi derivaţi, complecşii rezultaţi fiind evaluaţi spectrofotometric sau fluorimetric.

V.1 Determinarea concentraţiei acizilor nucleici prin spectroscopie UV-VIS Pentru determinarea concentraţiei acizilor nucleici prin spectroscopie UV-VIS se pot utiliza două metode mai importante: 1. măsurarea directă a concentraţiei acizilor nucleici prin spectrometrie UV – metodă simplă şi sigură care poate fi folosită numai pentru soluţii pure şi concentrate; 2. metoda Burton este specifică pentru ADN şi presupune liza acizilor nucleici şi determinarea conţinutului de deoxiriboză din probă; metoda are avantajul că poate fi utilizată pentru dozarea

134


directă a acizilor nucleici din lizate celulare; Watterborg şi Mathews (1) realizează o descriere amănunţită a acestei metode.

Determinarea concentraţiei acizilor nucleici prin spectroscopie UV Atât ADN-ul cât şi ARN-ul absorb în UV, având un maxim la 260 nm datorită bazelor azotate purinice şi pirimidinice. Experimentele au arătat că o valoare a absorbanţei (A) citită la spectrofotometru la lungimea de undă de 260 nm egală cu unitatea corespunde unei soluţii care conţine aproximativ 50 μg/ml ADN dublu-catenar, 40 μg/ml ADN (ARN) monocatenarsau33 μg/ml polinucleotide monocatenare (2). Prin urmare, determinarea concentraţiei acizilor nucleici s-ar putea realiza direct prin măsurarea absorbanţei soluţiilor la lungimea de undă de 260 nm şi aplicarea directă a legii Lambert-Beer. Acizii nucleici nu sunt însă singurii compuşi care absorb la această lungime de undă. Spectrul de absorbţie a principalilor contaminanţi (proteine şi fenol) arată că şi aceştia absorb la lungimea de undă de 260 nm, prezentând, de asemenea, maxime la 230 nm (fenolul şi urea) (3) şi 280 nm (proteinele). În cazul unei soluţii pure de ADN şi ARN, raportul dintre valorile înregistrate la 260 nm şi 280 nm se situează între 1,8 şi 2. Dacă acest raport este mai mic decât 1,6 valoarea reprezintă o indicaţie a contaminării cu proteine iar dacă este mai mare decât 2 înseamnă că proba este contaminată cu fenol, alcooli sau nucleotide. În oricare din cele două situaţii metoda nu va furniza rezultate precise. Deşi o simplă citire a absorbţiei la lungimea de undă de 260 nm ar putea fi utilizată pentru estimarea concentraţiei unei soluţii de ADN, această abordare este foarte sensibilă la prezenţa contaminanţilor. Din acest motiv se preferă măsurarea concentraţiei acizilor nucleici la mai multe lungimi de undă. În practică, cea mai folosită pereche de lungimi de undăeste260-280 nm care furnizează informaţii legate de contaminarea cu proteine. Absorbanţa soluţiilor la 230 nm oferă indicaţii legate de contaminarea cu fenol, iar evaluările la 325 nm indică prezenţa unor substanţe particulare.

Determinarea concentraţiei acizilor nucleici

135

Principiul metodei Metoda se bazează pe capacitatea acizilor nucleici de a absorbi radiaţii UV. Soluţia de analizat se diluează corespunzător în tampon şi se măsoară absorbanţa la 260 nm. Concentraţia de ADN se calculează în funcţie de tipul de probă, ţinând cont că valoarea 1 corespunde unei concentraţii de 50 μg/ml ADN dublu-catenar, 40 μg/ml ADN (ARN) monocatenar sau 33 μg/ml polinucleotide monocatenare. Avantaje: 1. simplitate – nu sunt necesare decât un spectroforometru UV şi cuve din cuarţ; 2. costuri reduse – practic nu se utilizează nici un material consumabil; 3. nu se utilizează reactivi toxici şi nu se generează deşeuri toxice; 4. după determinarea concentraţiei, proba se poate recupera şi utiliza. Limitări: 1. poate fi cuantificat numai ADN-ul purificat, lipsit de contaminanţi; 2. pot fi cuantificate numai soluţii concentrate, intervalul de detecţie fiind unul relativ îngust, 1-50 μg/ml; 3. valorile înregistrate pot varia mult în funcţie de condiţiile locale, în principal de pH-ul şi tăria ionică a soluţiei (4); 4. metoda nu poate face distinţie între ADN şi ARN. Materiale necesare: 1. soluţie tampon TNE 10X – Tris bază 100 mM, NaCl 1 M, EDTA 10 mM, pH 7,4: 1,21 g TRIS bază, 0,371 g EDTA şi 11,68 g NaCl se dizolvă în 75 ml apă distilată şi se corectează pH-ul la 7,4 cu HCl concentrat; se completează volumul la 100 ml cu apă distilată şi se păstrează la temperatura camerei;


136

2. soluţie tampon TNE 1X – se prepară prin diluarea a 1 ml tampon TNE 10X cu 9 ml apă distilată; 3. două cuve pentru spectrofotometru, din cuarţ, împerecheate, cu drumul optic de 1 cm; pot fi folosite cuve de diverse volume, indicate sunt cele semi-micro (800 μl), deoarece permit utilizarea unor volume mici (de până la 400 μl); 4. spectrofotometru UV. Mod de lucru: 1.

se pipetează soluţie tampon TNE 1X în cuva de spectofotometu şi se plasează în aparat;

2.

se fixează lungimea de undă la 260 nm şi se stabileşte punctul de zero al aparatului cu proba martor;

3.

soluţia de analizat se diluează în tampon TNE în aşa fel încât concentraţia finală să fie 1X (de exemplu, 100 μl TNE 10X, 500 μl probă şi 400 μl apă distilată); este foarte important ca proba de analizat să fie măsurată în aceeaşi soluţie ca şi martorul;

4.

proba de analizat în soluţie TNE 1X se introduce în cuva spectrofotometrului şi se fac măsurători succesive la 280 nm, 260 nm şi 230 nm înainte de a trece la următoarea probă. Cel mai frecvent această determinare poate fi realizată cu ajutorul programelor specializate pentru analiza acizilor nucleici cu care sunt dotate spectrofotometrele (Multi-wavelenght). Dacă aparatul nu are pre-setat un astfel de program, se modifică lungimea de undă după fiecare măsurătoare, verificându-se de fiecare dată martorul;

5.

se determină concentraţia în acizi nucleici la 260 nm şi se calculează cu una din ecuaţiile:

ADN dublucatenar: ADN dublucatenar: ADN monocatenar:


137

ADN monocatenar: ARN monocatenar: Oligonucleoti de: unde: – S este mărimea moleculei de ADN în kpb – N reprezintă numărul de resturi de adenină (A), citozină (C), guanină (G) şi timină (T) (Gallagher, 2007 (5) 7. Se estimează gradul de puritate al probei de acizi nucleici folosind raportul A260/A280 şi valorile A230 şi A325; în general, raportul A260/A280 trebuie să se situeze în intervalul 1,8-2; valori mai mici de 1,8 semnalează contaminare cu proteine, valori mai mari semnalează contaminare cu fenol sau nucleotide libere; în Tabelul 7 sunt prezentate valori obişnuite ale unei probe de ADN pure. TABEL 7.Valori ale absorbanţei unei probe de ADN înalt purificat cu concentraţia 25 μg/ml în tampon TNE 1X Lungime de undă (nm)

Absorbanţă

Observaţii

325

0,01

valori mai mari semnalează contaminare cu fenol sau uree

280

0,28

–

260

0,56

–

230

0,3

valori mai mari indică prezenţa materiei particulate (proba este tulbure)

138


V.2. Determinarea concentraţiei acizilor nucleici prin fluorimetrie Utilizarea fluorimetriei pentru măsurarea concentraţiei soluţiilor de ADN a devenit din ce în ce mai populară datorită simplităţii şi mai ales sensibilităţii foarte mari. Pentru cuantificarea soluţiilor sunt utilizaţi trei compuşi care au capacitatea de a se cupla cu moleculele de acizi nucleici: bromura de etidiu (EtBr), colorantul HOECHST 33258 şi colorantul fluorescent ultrasensibil PicoGreen. Metoda descrisă în continuare foloseşte bromura de etidiu. Principalul dezavantaj se referă la efectul cancerigen al bromurii de etidiu, ceea ce face necesară inactivarea tuturor deşeurilor rezultate. De asemenea, metoda nu decelează între ADN şi ARN. De-a lungul timpului au apărut diferite variante ale metodei cu bromură de etidiu, cele mai cunoscute fiind cele ce folosesc electroforeza în geluri de agaroză sau metoda mult simplificată bazată pe utilizarea foliei de plastic. HOECHST 33258 este un fluorocrom care are afinitate mică pentru ARN, motiv pentru care este specific pentru ADN. Compusul poate fi folosit pentru determinarea concentraţiei ADN-ului în extracte brute sau în soluţii purificate, cu o sensibilitate de 0,01-15 μg/μl (6). Legarea HOECHST 33258 de ADN este dependentă de secvenţa de ADN, manifestând afinitate pentru zonele bogate în AT. Mai multe detalii despre această metodă se pot găsi în colecţia Current Protocols - Essential Laboratory Techniques (6). PicoGreen este un alt fluorocrom care se leagă de molecula de ADN într-o manieră independentă de secvenţa de ADN. Cu ajutorul lui se pot detecta cantităţi de până la 25 pg/ml ADN dublu-catenar, ceea ce înseamnă o sensibilitate de 400 ori mai mare decât în cazul HOECHST 33258. Deşi nu există indicaţii referitoare la faptul că acest compus este toxic, el trebuie manipulat cu atenţie, nefiind încă suficient testat cu privire la gradul de toxicitate. O descriere mai în detaliu a avantajelor şi dejavantajelor utilizării colorantului picogreen, alături de metodologia de lucru, poate fi găsită în manualul de lucrări de laborator editat de Sambrook et al.(2).


139

Determinarea concentraţiei acizilor nucleici folosind bromura de etidiu Deşi bromura de etidiu este frecvent folosită pentru evidenţierea acizilor nucleici în geluri, compusul poate fi utilizat şi la determinarea concentraţiei acestor macromolecule în soluţie (5). La baza metodei de dozare stă acelaşi principiu ca şi în cazul protocolului de evidenţiere a ADN-ului pe geluri, care se referă la proprietatea bromurii de etidiu de a se cupla cu moleculele de ADN sau ARN conducând la dezvoltarea unei fluorescenţe pronunţate. Pentru cuantificarea propriu-zisă este necesară realizarea unei curbe de etalonare cu ajutorul unei soluţii de ADN de concentraţie cunoscută. Fluorescenţa probelor dezvoltate în prezenţa bromurii de etidiu este apoi măsurată cu ajutorul unui fluorimetru, la lungimi de undă de 302 nmsau 546 nm pentru excitaţie şi 590 nm pentru emisie şi vor reprezenta puncte pe curba de etalonare, Avantaje: 1. metoda poate fi utilizată pentru soluţii parţial purificate de ADN şi ARN; 2. metoda are o sensibilitate 1-5 ng, mai mare decât metoda care foloseşte spectrometria UV (7); 3. metoda nu este influenţată de secvenţa moleculei (ADN sau ARN) cum se întamplă în cazul utilizării fluorocromului HOECHST 33258 (6). Limitări: 1. metoda nu poate decela între ADN şi ARN; 2. toxicitate mare a compusului utilizat pentru dozare, generare de deşeuri toxice care trebuie atent inactivate; 3. intensitatea coloraţiei variază în funcţie de tipul de acizi nucleici: moleculele de ADN monocatenar şi ARN-ul ribozomal dau un semnal redus la jumătate faţă de ADN-ul dublucatenar, ADN-ul


140

circular leagă mai puţin EtBr decât ADN-ul liniar; comentarii detaliate privind parametrii care influenţează intensitatea semnalului în această metodă pot fi găsite în lucrarea scrisă de Le Pecq (7). Materiale necesare: 1. soluţie tampon TNE 10X – TRIS bază 100 mM, EDTA 10 mM, NaCl 1 M, pH 7,4 – 1,21 g TRIS bază, 0,371 g EDTA, 11,68 g NaCl se dizolvă în 75 ml apă distilată şi se corectează pH-ul la 7,4 cu HCl concentrat; se completează la 100 ml cu apă distilată si se păstrează la temperatura camerei; 2. soluţie stoc bromură de etidiu 1 mg/ml – 100 mg bromură de etidiu se dizolvă în 100 ml apă distilată; soluţia se păstrează la temperatura de 4oC, protejată de lumină; Bromura de etidiu (EtBr) se intercalează între catenele de ADN şi poate fi transformată de enzimele din ficat în derivaţi cu puternic efect mutagen şi posibil carcinogen (15). La concentraţii mari substanţa are efect iritant pentru ochi, piele şi tractul respirator. Manipularea soluţiilor şi obiectelor contaminate cu bromură de etidiu se realizează numai cu mănuşi de protecţie cu nitril. Soluţiile şi materialele contaminate nu trebuie amestecate cu reziduuri obişnuite deoarece necesită măsuri speciale pentru decontaminare. 3. soluţie bromură de etidiu de lucru – 10 ml soluţie tampon TNE 10X se diluează cu 89,5 ml apă distilată; soluţia obţinută se filtrează printr-un filtru cu porozitatea de de 0,45 μm şi apoi se adaugă 0,5 ml soluţie bromură de etidiu 1 mg/ml; soluţia se păstrează la temperatura de 4oC, protejată de lumină; 4. soluţie standard ADN; 5. cuve pentru fluorimetrie.


141

Mod de lucru: 1. 2 ml soluţie bromură de etidiu de lucru se pipetează în cuva fluorimetrului şi se fixează lungimile de undă pentru determinarea excitaţiei la 302 nm (cuvă din cuarţ) sau 546 nm (cuvă din sticlă) şi emisiei la 590 nm; se stabileşte zero pe aparat sau se citeşte cantitatea de lumină emisă, după caz; 2. se adaugă 2 μl soluţie ADN standard în cuva din camera fluorimetrului şi se agită fie prin pipetare, fie prin acoperirea cuvei cu parafilm şi răsturnarea ei; se citeşte şi se notează cantitatea de lumină emisă la toate probele cu soluţie standard, amestecând soluţia standard de fiecare dată cu soluţie de bromură de etidiu de lucru proaspătă; 3. probele de analizat se măsoară în aceeaşi manieră ca şi probele standard notându-se extincţia; concentraţia finală de bromură de etidiu în cuva de măsurare este suficientă pentru determinarea unei concentraţii de ADN de până la 1000 ng/ml; creşterea concentraţiei de bromură de etidiu la 10 μg/ml va mări spectrul de aplicabilitate al metodei până la 10 μg/ml ADN; în cei 2 ml soluţie bromură de etidiu de lucru se pot adăuga până la 10 μl soluţie de analizat; 4. concentraţiile probelor necunoscute se determină cu ajutorul curbei de etalonare.

Determinarea concentraţiei acizilor nucleicifolosind metoda cu folie din plastic Această metodă derivă din cea descrisă anterior, fiind însă mult mai simplă şi necesitând o dotare minimă, putând fi realizată în orice laborator care are în dotare o lampă UV sau un transiluminator. Proba de analizat este plasată pe o folie din plastic sub forma unei picături alături de o picătură de soluţie standard. Peste ambele probe se adaugă aceeaşi cantitate de bromură de etidiu şi se apreciază cantitatea de ADN sub lumină ultravioletă.


142

Avantaje: 1. simplitate deosebită; 2. nu necesită aparatură specială; 3. utilizează o cantitate minimă de reactivi şi în consecinţă reziduurile periculoase sunt relativ reduse; 4. în loc de soluţie de bromură de etidiu se poate folosi colorantul SYBR Gold (6). Limitări: 1. – nu se poate decela ADN de ARN; 2. – precizie mică, aprecierea concentraţiei făcându-se vizual. Materiale necesare: 1. 2. 3. 4.

folie din plastic transparentă pentru UV; transiluminator sau lampă UV; soluţie de ADN de concentraţie cunoscută; soluţie bromură de etidiu 2 μg/ml în tampon TE (TRIS-HCl 10 mM şi EDTA 1 mM) pH 7,6.

Mod de lucru: 1. o bucată de folie din plastic transparentă se aşează pe suprafaţa

transiluminatorului; dacă se va folosi o lampă UV, folia se aşează pe o hârtie de culoare neagră; 2. pe folia din plastic se pipetează 1-5 μl probă de analizat; 3. alături se pipetează, în ordine, volume egale dintr-o serie de soluţii cu

concentraţii cunoscute de ADN (0; 1; 2,5; 5; 10 şi 20 μg/ml); 4. în fiecare picătură se adaugă volume egale de bromură de etidiu de

concentraţie 2 μg/ml şi se agită prin pipetări repetate sus-jos;


143

5. spoturile obţinute se vizualizează sub lumină UV şi se apreciază

concentraţia probei necunoscute în funcţie de intensitatea fluorescenţei comparativ cu probele standard. Pentru acurateţe, folia astfel pregătită poate fi fotografiată şi concentraţia probei necunoscute poate fi estimată cu ajutorul unui program de densitometrare, precum programul ImageJ (8).

Determinarea cantităţii de ADN pe geluri de agaroză Electroforeza pe geluri de agaroză a ADN-ului reprezintă nu doar o metodă eficientă de separare a ADN-ului, ci şi o modalitate simplă de a cuantifica cantitatea de ADN. Probele necunoscute se încarcă într-un gel de agaroză alături de un set de probe standard, ce conţin cantităţi cunoscute de ADN. Gelul este migrat în condiţiile obişnuite pentru electroforeza în geluri de agaroză descrise în capitolul VII – Separarea electroforetică a ADN-ului, pagina 147. După separarea electroforetică, gelul este fotografiat, iar cantitatea de ADN din proba necunoscută este evaluată în funcţie de intensitatea benzilor rezultate în cazul probelor standard. Avantaje: 1. se realizează o separare netă prin electroforeză a ADN-ului de ARN, eliminându-se astfel interferenţa acestuia din urmă; 2. se pot cuantifica exact fragmentele de interes şi nu cantitatea de ADN totală ca în celelalte metode. Limitări: 1. este o metodă mai laborioasă, care necesită utilizarea electroforezei în geluri de agaroză; 2. limita de detecţie este mai mică decât a metodei cu bromură de etidiu.

144


Mod de lucru: Proba de analizat se separă pe gel de agaroză împreună cu probele standard cu concentraţii cunoscute de ADN, urmând protocolul descris în capitolul capitolul VII – Separarea electroforetică a ADN-ului, pagina 147). La finalizarea migrării propriu-zise, gelul se colorează (dacă este necesar) în vederea evidenţierii fragmentelor de ADN, urmând unul din protocoalele prezentate în subcapitolul VII.3 – Detecţia ADN-ului în geluri de agaroză, pagina168, după care se fotografiază. De pe fotografie sau prin vizualizare directă se poate aprecia, prin comparaţie cu probele standard, cantitatea de ADN din proba de interes. Pentru acurateţe fotografia obţinută poate fi utilizată pentru densitometrare cu ajutorul unei aplicaţii precum ImageJ (8), urmând paşii descrişi în cazul gelurilor de poliacrilamidă (subcapitolul X.3 – Detectia proteinelor separate prin electroforeza pe geluri de poliacrilamidă, pagina 257). Bibliografie: 1. Waterborg, J. H., Matthews, H. R. (1984) –The Burton Assay for DNA, Nucleic Acids, 2, 1-3. 2. Sambrook, J. (2001) –Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, J., Ed.) third., p. 2.13-2.19. Spring Harbor Laboratory Press. 3. Stulnig, T. M., Amberger, A. (1994) –Exposing contaminating phenol in nucleic acid preparations., BioTechniques, 16, 402-4. 4. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. (1997) –Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity., BioTechniques, 22, 474-6, 478-81. 5. Gallagher, S., Wiley, E. (Eds.). (2008) –Current Protocols Essential Laboratory Techniques. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA. 6. Ausubel, M. F., Brent, R., Kingston, E. R., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, A. J., Struhl, K. (2002) –Short Protocols in Molecular Biologyed. 5, p 10.1-10.31. John Wiley & Sons. 7. Glick, D., Le Pecq, J.-B. (1971) –Use of Ethidium Bromide for Separation and Determination of Nucleic Acids of Various


145

Conformational Forms and Measurement of Their Associated Enzymes, in Methods of Biochemical Analysis (Glick, D., Ed.), p 41-86. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA. 8. Abramoff, D. M., Magelhaes, J. P., Ram, J. S. (2004) –Image processing with ImageJ, Biophotonics International, 11, 36-42.

VII. SEPARAREA ELECTROFORETICĂ A ADN-ULUI Separarea electroforetică a moleculelor de ADN este una din metodele care au stat la baza dezvoltării foarte rapide a biologiei moleculare. Tehnica permite nu numai separarea fragmentelor de ADN, ci şi izolarea, evidenţierea şi caracterizarea acestora. Rapiditatea metodei, simplitatea aparaturii utilizate şi nu în ultimul rând rezoluţia deosebită au făcut ca electroforeza să înlocuiască tehnicile bazate pe ultracentrifugare în gradient de sucroză (zaharoză) încă din momentul descrierii primelor protocoale de separare de către Thorne (1) şi de evidenţiere a fragmentelor de ADN de către Aaij şi Borst (2) şi Sharp (3). Suporturile pentru separarea şi evidenţierea ADN-ului (agaroza sau poliacrilamida) pot fi utilizate într-un număr foarte variat de sisteme de separare care diferă prin dimensiunea porilor, amplasarea gelului, prezenţa diverşilor aditivi în gel sau tamponul de separare utilizat. Alegerea unui anumit sistem depinde, în principal, de dimensiunile fragmentelor care urmează să fie separate. Poliacrilamida este deosebit de eficientă în separarea fragmentelor de dimensiuni mici, 50 pb-500 pb (4). Rezoluţia este foarte bună, putând fi separate fragmente ce diferă în lungime doar printr-o pereche de baze (5). Din acest motiv, gelurile de poliacrilamidă au fost intens utilizate pentru reacţii de secvenţiere manuală. Acest suport prezintă dezavantajul că este mai dificil de preparat şi manipulat, iar fragmentele separate sunt mai dificil de preluat din gel. Mai multe informaţii legate de avantajele şi dezavantajele utilizării gelurilor de poliacrilamidă sunt prezentate în excelentele manuale de laborator ale lui Sambrook (4) şi Ausubel (6). Utilizarea agarozei duce la micşorarea puternică a rezoluţiei, având însă avantajul unui cost de exploatare mai mic şi a simplităţii deosebite în prepararea şi manipularea gelului. Au fost descrise, de asemenea, numeroase metode de extragere a fragmentului separat din gelurile de agaroză pentru utilizare în alte aplicaţii. Gelul de agaroză este suportul cel mai frecvent utilizat pentru separarea fragmentelor de ADN. Sistemul cel mai comun permite separarea de fragmente cu dimensiuni cuprinse între 0,5 kb-25 kb, însă diverse îmbunătăţiri au condus la mărirea domeniului de uzabilitate până la fragmente de ordinul mpb.

148


Structura agarozei şi mecanismul de migrare al ADN-ului. Agaroza este un poliglucid natural extras din alge marine, alcătuit din unităţi repetitive ale diglucidului agarobioză. Agarobioza este compusă dintr-un rest de D- galactoză şi unul de L-3,6-anhidrogalactoză legate β-1,4. Lanţurile de agaroză formeză fibre spiralate care se agregă în structuri supraspiralate cu diametrul de 20-30 nm. Sub formă de gel, agaroza formează o reţea tridimensională cu pori având diametrul cuprins între 50-200 nm (7), (8). ADN-ul este un polimer puternic încărcat negativ care sub influenţa curentului electric se va deplasa către polul pozitiv. Viteza de migrare este invers proporţională cu dimensiunea fragmentelor şi direct proporţională cu tensiunea aplicată (9). Porii gelului au un efect de sită, astfel încât moleculele mici trec mult mai rapid prin porii gelului decât moleculele mari. Aceste relaţii sunt valabile până la o valoare limită a dimensiunilor fragmentelor de ADN, dimensiune care este definită de compoziţia gelului şi de tensiunea câmpului electric aplicat (10). Atunci când se depăşeşte această valoare limită, efectul de filtrare al gelului dispare iar fragmentele de ADN se orientează în sensul minimizării rezistenţei la înaintare. Fragmentele se orientează în aşa fel încât unul dintre capete pătrunde prin pori, restul moleculei urmându-l (11). Pentru a descrie comportarea ADN-ului în timpul electroforezei în geluri de agaroză au fost dezvoltate diverse modele. Cel mai simplu model este cel în care moleculele de ADN şerpuiesc printre porii gelului (12) (Figura 19). Şi în acest caz moleculele mici vor migra mai rapid decât cele mari, deoarece creşterea dimensiunii moleculei duce la creşterea forţelor de frecare dintre moleculă şi gel. Pe lângă întârzierea cauzată de dimensiuni, moleculele mari se pot de asemenea, „înnoda” în gel, conducând la un proces suplimentar de întârziere. Moleculele mari de ADN vor migra mult mai puţin prin gel decât ne-am aştepta ţinând cont doar de dimensiunile lor, deoarece fenomenul de înnodare este atât de puternic încât elimină complet şerpuirea (4). Dimensiunea limită la care procesul de înnodare acoperă total şerpuirea este de 30 kb. Astfel, fragmente de 30 kb, 40 kb sau 120 kb vor migra perfect identic şi nu vor putea fi separate prin metodele clasice.

Electroforeza ADN

149

Direcţia de migrare

Molecule de ADN

FIGURA 19. Migrarea prin şerpuire şi înnodarea moleculelor de ADN (după Reece, 2004 (5)

Pentru a elimina acest dezavantaj al electroforezei clasice în geluri de agaroză, Schwartz şi Castor (13) au introdus electroforeza în câmp pulsatoriu (engl.Pulsed Fieled Gel Electrophoresis, PFGE) care permitea iniţial separarea unor fragmente cu dimensiuni de până la 2000 kb. Îmbunătăţirile aduse ulterior acestei tehnici au permis separarea de fragmente mai mari de 6000 kb, domeniul de aplicabilitate al electroforezei în geluri de agaroză lărgindu-se mult. Oricare ar fi tipul de electroforeză utilizat, procesul de separare şi evidenţiere a moleculelor de ADN constă în: 1. prepararea gelului şi electroforeza propriu-zisă; 2. colorarea gelului în vederea evidenţierii ADN-ului; 3. fotografierea gelului.

150


VII. 1 Electroforeza clasică în geluri de agaroză

Mecanismul de separare a fragmentelor de ADN prin electroforeza în geluri de agaroză a fost prezentat în introducerea acestui capitol. În funcţie de condiţiile specifice utilizate, se pot descrie 2 tipuri de electroforeză în geluri de agaroză: 1. electroforeza nativă, cel mai frecvent utilizată, la care ne vom referi în cele ce urmează; 2. electroforeza denaturantă, realizată la valori mari de pH, descrisă pentru prima dată de McDonell et al., 1977 (14), este utilizată pentru separarea în funcţie de dimensiunea catenelor de ADN; mai multe detalii legate de această metodă pot fi găsite în manualul de laborator al lui Sambrook et al., 2001 (4). Indiferent de tipul de electroforeză utilizat, viteza de migrare a fragmentelor de ADN depinde de o serie de factori, precum: –dimensiunea şi topologia moleculelor de ADN. Un exemplu ce demonstrează foarte bine acest lucru este comportamentul ADN-ului plasmidial bacterian ce poate migra sub 3 forme (Figura 20): 1. atunci când este puternic spiralizat, masa aparentă este redusă astfel încât ADN-ul migrează cu viteză mare la aplicarea unui curent electric; 2. dacă doar una dintre catene este clivată, molecula va adopta o conformaţie relaxată şi de aceea viteza de migrare va diminua mult; 3. dacă ambele catene sunt clivate, molecula se comportă „normal” şi migrează cu o viteză intermediară. După cum se poate observa şi în Figura 20, moleculele circulare migrează diferit de cele liniare, din acest motiv masa moleculară a plasmizilor circulari nu poate fi apreciată prin comparare cu markeri de masă alcătuiţi din fragmente liniare.

Electroforeza ADN

151

ADN liniar

Direcţia de migrare

ADN circular

ADN supraspiralizat

FIGURA 20. Influenţa topologiei moleculei de ADN asupra separării electroforetice (după Reece, 2004) (5) –concentraţia şi tipul agarozei – diverşi producători oferă tipuri variate de agaroză, cu proprietăţi diferite în ceea ce priveşte punctul de gelificare, punctul de topire, lungimea lanţurilor poliglucigdice, gradul de contaminare cu alte poliglucide sau cu proteine; există două tipuri mari de agaroză: agaroza standard şi agaroza cu temperatură de topire scăzută (engl. low-melting); o a treia clasă, care începe să fie din ce în ce mai mult utilizată prezintă proprietăţi intermediare. O prezentare mai detaliată a diverselor tipuri de agaroză este realizată de Sambrook et al., 2001 (4). În Tabelul 8 sunt prezentate domeniile de utilizare pentru fiecare tip de agaroză.


152

TABEL 8. Domenii de utilizarea ale diverselor tipuri de agaroză în funcţie de concentraţie (după Sambrook et al., 2001) (4) Concentraţie (%)

Agaroză standard

Agaroză cu temperatură de topire scăzută

0,5

700 pb -25 kb

–

0,8

500 pb - 15 kb

800 pb - 10 kb

1

250 kb - 12 kb

400 pb - 8 kb

1,2

150 pb - 6 kb

300 pb - 7 kb

1.5

80 pb - 4 kb

200 pb - 4 kb

2

–

100 pb - 3 kb

3

–

50 pb - 1 kb

–tensiunea aplicată – la valori mici ale tensiunii aplicate, viteza de migrare a ADN-ului este proporţională cu voltajul aplicat pe gel; totuşi, odată cu creşterea tensiunii aplicate, mobilitatea moleculelor de dimensiuni mari creşte diferenţiat astfel că rezoluţia gelului scade odată cu creşterea voltajului; pentru fragmentele mai mari de 2 kb este recomandată aplicarea unei tensiuni care să nu depăşească 5-8 V/cm gel. –soluţia tampon de electroforeză – în absenta ionilor conductivitatea apei este minimă motiv pentru care migrarea electroforetică a moleculelor de ADN se realizează foarte lent; odată cu creşterea tăriei ionice (prin mărirea concentraţiei de ioni dizolvaţi) conductibilitatea soluţiei creşte, în acelaşi timp crescând şi cantitatea de căldură generată; din acest motiv concentraţia soluţiilor tampon utilizate pentru electroforeză este crucială pentru buna desfăşurare a separării; cele mai folosite soluţii tampon utilizate pentru separarea electroforetică a acizilor nucleici sunt Trisacetat EDTA pH 8 (TAE), Tris-Borat EDTA (TBE) sau Tris-fosfat EDTA (TPE); TAE are capacitate mai mică de tamponare şi de aceea în cazurile unor migrări prelungite zona anodică devine puternic acidă, nefiind recomandată utilizarea acestei soluţii tampon; TBE si TPE au capacitate de tamponare mai mare, în TBE un fragment dublu-catenar liniar de ADN migrează cu pana la 10% mai repede decât în TAE.

Electroforeza ADN

153

Principiul metodei Moleculele de ADN, încărcate negativ datorită resturilor de fosfat, plasate într-un câmp electric vor migra spre electrodul pozitiv. Într-un gel de agaroză viteza de migrare a moleculelor de ADN la aplicarea unui câmp electric va depinde pe de o parte de sarcina moleculelor şi, pe de altă parte, de dimensiunea moleculelor datorită efectului de sită al gelului. În acest fel are loc separarea fragmentelor de ADN în funcţie de lungimea lor, respectiv în funcţie de masa moleculară. Avantaje: 1. permite separarea fragmentelor de acizi nucleici cu dimensiuni de până la 25 kb; 2. este utilizată pentru aprecierea maselor moleculare a fragmentelor separate, dar şi pentru cuantificarea cantităţii de ADN; 3. prezintă uşurinţă în exploatare, rapiditate şi simplitate a materialelor şi reactivilor necesari. Limitări: 1. nu poate fi utilizată pentru separarea fragmentelor mai mari de 25 kb; 2. prezintă rezoluţie mai mică decât elecroforeza în geluri de acrilamidă. Materiale necesare: 1. tampon electroforeză TBE 10X, soluţie stoc: 109,8 g Tris, 55 g acid boric, 7,5 g EDTA în 5 L apă distilată; 2. soluţie bromură de etidiu 0,5 mg/ml (facultativ, necesară doar în cazul în care se adaugă bromură de etidiu în gel)– se dizolvă 50 mg bromură de etidiu în 100 ml apă distilată; soluţia se păstrează la întuneric timp nelimitat;


154

Bromura de etidiu (EtBr) se intercalează între catenele de ADN şi poate fi transformată de enzimele din ficat în derivaţi cu puternic efect mutagen şi posibil carcinogen (15). La concentraţii mari substanţa are efect iritant pentru ochi, piele şi tractul respirator. Manipularea soluţiilor şi obiectelor contaminate cu bromură de etidiu se realizează numai cu mănuşi de protecţie cu nitril. Soluţiile şi materialele contaminate nu trebuie amestecate cu reziduuri obişnuite deoarece necesită măsuri speciale pentru decontaminare. 3. agaroză pentru electroforeză; 4. soluţie tampon concentrată pentru probe – 0,25% albastru de bromfenol, 0,25% xilen cianol FF (albastru acid 147), 30% glicerol în apă; 5. markeri de masă moleculară (New England Biolab, Biorad) – este indicat să existe 2 seturi de markeri, unul între 1-20 kb şi unul între 100-1000 pb (4); 6. baie de apă sau cuptor cu microunde; 7. sistem orizontal de elecroforeză şi sistem de turnare al gelului – diverşi producători (Biorad, Hoefer, Apelex) pun la dispoziţie o gamă largă de cuve cu dimensiuni variate; Sambrook (16) descrie o metodă de realizare în laborator a unei cuve de electroforeză, dar cuvele dedicate au avantajul unui sistem de turnare al gelului foarte simplu şi fiabil; 8. piepteni pentru formarea godeurilor; 9. sursă de curent. Mod de lucru: 1. se asamblează modulul de turnare al gelului urmând indicaţiile producătorului; 2. se prepară soluţie tampon TBE 1X prin diluarea 1:10 a soluţiei stoc, în cantitate suficientă pentru a umple cuva de electroforeză şi pentru a pregăti gelul;

Electroforeza ADN

155

3. se cântăreşte cantitatea de agaroză necesară pentru realizarea volumului de gel de concentraţie dorită; agaroza se transvazează într-un flacon Erlenmeyer şi se adaugă volumul corespunzător de soluţie tampon pentru electroforeză; volumul final nu trebuie să depăşească 50% din volumul flaconului; 4. amestecul obţinut se încălzeşte pe baie de apă sau în cuptorul cu microunde până la topirea completă a granulelor de agaroză; în cazul utilizării cuptorului cu microunde la putere maximă, pentru a prepara 50 ml gel sunt suficiente două reprize de încălzire de câte un minut şi jumătate, cu agitare după prima repriză şi la final; 5. facultativ, în funcţie de sistemul de colorare utilizat, soluţia se răceşte până la aproximativ 60oC după care se adaugă bromură de etidiu până la concentraţia 0,5 μg/ml şi se agită (pentru un volum de 50 ml gel se adaugă 50 μl soluţie bromură de etidiu); 6. soluţia caldă astfel preparată se introduce în modulul de turnat geluri al cuvei şi se inserează pieptenele; în general, cuvele achiziţionate de la producători consacraţi sunt prevăzute cu ghidaje sau picioruşe pentru aşezarea pieptenelui; dacă acestea nu există, pieptenele trebuia plasat la aproximativ 1 cm de capătul gelului în aşa fel încât să rămână o distanţă de 0,5-1 mm de la vârful dinţilor pieptenelui până la fundul modulului de turnare; 7. se lasă să se răcească soluţia timp de 30-45 minute, la temperatura camerei; dacă se utilizează agaroză cu punct de topire scăzut sau dacă gelul are o concentraţie mai mică de 0,5%, răcirea se efectuează prin introducere la frigider, la temperatura de 4oC. 8. după răcire, gelul se plasează în cuva pentru electroforeză şi se adaugă o cantitate suficientă de soluţie tampon TBE 1X pentru a acoperi complet gelul; 9. probele conţinând acizi nucleici de analizat se amestecă cu un volum corespunzător de soluţie tampon de încărcare; cantitatea maximă de ADN posibil a se încărca pe gel variază în funcţie de tipul probei; dacă proba conţine populaţii simple de molecule (1-2 dimensiuni diferite), se încarcă maximum 500 ng într-un godeu cu lungimea de 0,5 cm; dacă proba conţine un număr mare de fragmente de dimensiuni diferite, se pot încărca până la20-30 μg într-un godeu; volumul maxim care se poate încărca depinde de dimensiunea godeului; dimensiunile clasice pentru

156


godeuri (0,5 cm x 0,5 cm x 0,15 cm) permit încărcarea unui volum de maximum 37,5 μl (16); nu se recomandă încărcarea completă a godeurilor deoarece apare pericolul contaminării probelor; de asemenea, trebuie acordată o atenţie deosebită la încărcarea probelor cu ajutorul pipetelor automate, vârful acestora putând distruge uşor peretele inferior al godeului; soluţia tampon de încărcare are două roluri: glicerolul măreşte densitatea probei şi face ca soluţia de ADN să rămână pe fundul godeului iar coloranţii au rate diferite de migrare în gel şi permit supravegherea procesului; albastrul de bromfenol migrează prin gel cu o viteză aproximativ egală cu a unui fragment ADN de 300-500 pb, iar xilencianolul FF cu o viteză aproximativ egală cu a unui fragment ADN dublucatenar de 4 kb; 10. se închide capacul cuvei şi se conectează la sursa de curent în aşa fel încât probele să fie plasate spre catod (firul negru) şi să migreze către anod (firul roşu); tensiunea aplicată trebuie să fie între 1-5 V/cm gel pentru fragmente de dimensiuni mari (>5 kDa), sau de maxim 10 V/cm pentru fragmente de dimensiuni mici (500 pb) (15); 11. în timpul migrării, după ce se întrerupe alimentarea cuvei, gelul poate fi scos şi analizat pe transiluminator de câte ori este necesar, până se obţine nivelul dorit al rezoluţiei; unii producători oferă cuve de electroforeză din materiale plastice transparente pentru ultraviolet care pot fi plasate direct în lumina ultravioletă, fără a mai fi necesară scoaterea gelului din cuvă; 12. după terminarea migrării, se întrerupe alimentarea cuvei, gelul se scoate din cuvă şi se plasează pe transiluminator pentru analiză şi fotografiere. Soluţiile tampon de electroforeză pot fi utilizate de câteva ori fără efecte vizibile asupra rezoluţiei separării. În timpul migrării, bromura de etidiu migrează invers faţă de moleculele de ADN şi părăseşte gelul. Din acest motiv soluţiile tampon de migrare conţin acest compus şi în consecinţă trebuie decontaminate. Câteva metode de decontaminare a soluţiile sunt descrise de Sambrook (16).

Electroforeza ADN

157

VII. 2. Separarea ADN prin electroforeză în gel de poliacrilamidă cu gradient de agent denaturant Electroforeza ADN în gel de poliacrilamidă cu gradient denaturant (engl.Denaturing Gradient Gel Electrophoresis – DGGE) este folosită frecvent în scopul analizei compoziţiei, diversităţii şi dinamicii comunităţilor microbiene. Pornind de la izolarea ADN-ului comunitar, metoda permite generarea unui profil genetic folosit în identificarea taxonomică a populaţiilor predominante într-un mediu natural (20). Prin DGGE se pot separa produşi PCR – molecule de ADN dublu catenar cu aceeaşi lungime dar cu secvenţe diferite. Separarea se realizează în funcţie de mobilitatea diferită a moleculelor ADN determinată de comportamentul deosebit al legăturilor de hidrogen dintre perechile de baze azotate la denaturare, legăturile triple dintre guanină şi citozină fiind mai puternice decât legăturile duble dintre adenină şi timină. Denaturarea fragmentelor ADN dublu catenar se realizează în timpul electroforezei prin crearea unui gradient de concentraţie al agenţilor denaturanţi, de obicei uree şi formamidă. Pentru a împiedica denaturarea completă a moleculelor de ADN în urma căreia ar rezulta fragmente monocatenare ce pot migra în afara gelului, în timpul procesului de amplificare prin PCR se adaugă un fragment GC cu o lungime de 40 pb la fiecare fragment amplificat. Aceasta se realizează prin ataşarea fragmentului GC la capătul 5' al primer-ului utilizat pentru amplificare. Metoda oferă avantajul prelucrării simultane, într-un timp relativ scurt şi cu costuri mici a unui număr mare de probe în comparaţie cu metodele clasice de secvenţiere. Principiul metodei Separarea electroforetică a fragmentelor amplificate prin PCR se realizează în funcţie de diferenţele de mobilitate a moleculelor de ADN denaturate precum şi ale secvenţei diferite în baze azotate (guanină/citozină) a acestora. Pe măsura denaturării, viteza de migrare a moleculelor scade semnificativ comparativ cu cea a moleculelor dublu

158


catenare, nedenaturate de ADN, ceea ce permite separarea unor fragmente corespunzătoare unor populaţii bacteriene predominante. Aplicaţii: Utilizarea DGGE în domeniul ecologiei microorganismelor a fost introdusă de Gerard Muyzer şi colaboratorii (21). Aceştia au realizat pentru prima dată caracterizarea unor comunităţi microbiene complexe prin PCR-DGGE utilizând genele care codifică ARN-ul ribozomal. Aplicaţiile practice ale DGGE se bazează pe caracteristicile acestor gene referitoare la prezenţa lor în genomul tuturor organismelor cunoscute şi la faptul că sunt alcătuite din secvenţe înalt conservate (servesc pentru ataşarea primer-ilor utilizaţi) alături de secvenţe variabile (specifice anumitor tipuri de organisme, având rol în identificarea filogenetică). DGGE este utilizată pentru investigarea comunităţilor de microorganisme într-o varietate largă de aplicaţii ce includ: 1. evaluarea proceselor de bioremediere; 2. tratamentul apelor reziduale; 3. tratamentul apei potabile; 4. formarea biofilmelor; 5. coroziunea indusă de microorganisme; 6. identificarea microorganismelor contaminante în diferite produse comerciale/industriale. Limitări: Metoda prezintă limitări practice inerente. De exemplu, Muyzer şi colaboratorii (1993) sugerează ca regulă generală faptul că orice ADN ţintă care este prezent într-un procent mai mic de 1% în ADN-ul comunitar izolat nu poate fi detectat prin DGGE. În aceste cazuri pot apărea benzi discrete care nu pot fi decelate. Din acest motiv se recomandă utilizarea DGGE doar pentru identificarea organismelor sau filotipurilor predominante într-o comunitate. La acest neajuns se adaugă şi altele: co-migrarea unor molecule ADN cu secvenţe diferite, apariţia unor benzi multiple derivate dintr-un singur organism care prezintă mai mulţi operoni variabili în zona genelor pentru ARNr 16S. La aceste dezavantaje

Electroforeza ADN

159

se adaugă desigur şi cele ale tehnicii PCR pe care se bazează DGGE. Cu toate că DGGE este eficientă pentru analiza probelor cu diversitate relativ mică în organisme, există numeroase studii care demonstrează că metoda poate fi folosită cu succes şi în analiza unor comunităţi complexe de organisme cum sunt cele din diferitele tipuri de sol (20). Pentru a trece peste o parte din neajunsurile metodei se pot utiliza primeri specifici care să permită amplificarea fragmentelor ADN corespunzătoare unor populaţii care se găsesc într-un procent mai mic de 1% în comunitatea analizată (Tabel 9). TABEL 9. Primeri specifici utilizaţi pentru amplificarea PCR a fragmentelor ADN 16S în vederea realizării separării electroforetice prin DGGE Primer

Grup taxonomic

F243

Actinomic ete Actinomic ete

R513GC

Poziţia fragmentelor ADN 16S ţintă* 226-243 513-528

Secvenţă (5' → 3')

Ref. bibl.

GGATGAGCCCGCGGCCTA

(22)

GC.CGGCCGCGGCTGCTGGCACG TA GC.-ACGCGAAGAACCTTAC

(22)

F984GC

Bacteria

968-984

R1378

Bacteria

1378-1401

CGGTGTGTACAAGGCCCGGG AACG

(22)

F27

Bacteria

8-27

AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTC AG

(22)

R1492

Bacteria

1492-1513

(22)

F203α

αProteobact eria

174-203

TACGG(C/T)TACCTTGTTACG ACTT CCGCATACGCCCTACGGGGG AAAGATTTAT

F948β

βProteobact eria Archaea

931-948

CGCACAAGCGGTGGATGA

(23)

344-363

(24)

Archaea

934-915

GC.ACGGGGYGCAGCAGGCGCG A GTGCTCCCCCGCCAATTCCT

FARC34 4 GC RARC9 15

(22)

(23)

(24)


160 Primer

Grup taxonomic Fungi

Poziţia fragmentelor ADN 16S ţintă* 20-38

NS1

Secvenţă (5' → 3')

GTAGTCATATGCTTGTCTC

(25)

FR1 GC

Fungi

1665-1648

GC.-AICCATTCAATCGGTAIT

(25)

Euk1A REuk51 6 GC GC.

Eukarya Eukarya

4-20 563-548

CTGGTTGATCCTGCCAG GC.-ACCAGACTTGCCCTCC

5'CGCCCGGGGCGCGCCCCGG GCGGGGCGGGGGCACGGGG GG-3' F – oligonucleotidă amorsă (primer) forward R – oligonucleotidă amorsă (primer) reverse * – poziţie corespunzătoare în genomul bacteriei E. coli

Ref. bibl.

(26) (26) (22)

Materiale necesare: 1. acrilamidă, soluţie 40% (acrilamidă-bisacrilamidă 37,5:1): se cântăresc 194,8 g acrilamidă şi 5,2 g bis-acrilamidă şi se adaugă apă distilată până la 500 ml volum final; soluţia se păstrează la temperatura de 4oC. Acrilamida şi bisacrilamida monomere se absorb prin piele şi sunt neurotoxine deosebit de puternice, fiind de asemenea suspectate de efecte cancerigene. Cântărirea şi prepararea soluţiilor se realizează cu atenţie, manevrarea făcându-se cu mănuşi şi purtând mască de protecţie. Deşi poliacrilamida este considerată inofensivă, este indicat ca manipularea gelurilor să se realizeze tot cu mănuşi, datorită resturilor de acrilamidă nepolimerizată. 2. uree. 3. formamidă deionizată: se introduc 12,5 g răşină schimbătoare de ioni (de exemplu AG 501-X8, Bio-Rad) în 250 ml formamidă 100%; amestecul se agită timp de o oră la temperatura camerei; se filtrează

Electroforeza ADN

161

folosind hârtie de filtru obişnuită şi se păstrează la întuneric, la temperatura de 4-6oC. 4. tampon TRIS/Acid acetic/EDTA (TAE) 50X: se cântăresc 242 g TRIS bază şi se dizolvă în aproximativ 750 ml apă deionizată; se adaugă cu grijă 57,1 ml acid acetic glacial şi 100 ml soluţie 0,5 M EDTA (pH 8 corectat cu KOH); se ajustează volumul final la 1 L; pentru a prepara 5L TAE 1X, 100 ml TAE 50X se aduc la un volum final de 5 L cu apă distilată. 5. glicerol. 6. APS (persulfat de amoniu), soluţie 10% (w/v): se dizolvă 0,1 g persulfat de amoniu în 900 μl apă distilată; soluţia se păstrează la temperatura de -20oC. 7. TEMED(N,N,N,N’-tetra-metil-etilendiamină). 8. tampon încărcare 6X: se amestecă 1,5 ml glicerol, 12,5 mg albastru de bromfenol şi 5 ml apă distilată deionizată; soluţia se păstrează la temperatura de 4oC. Mod de lucru Realizarea DGGE presupune parcurgerea următoarelor etape: 1. curăţarea şi asamblarea sistemului de electroforeză; 2. prepararea soluţiilor şi turnarea gelurilor în gradient de concentraţie; 3. încărcarea probelor; 4. separarea electroforetică propriu-zisă a probelor; 5. evidenţierea fragmentelor separate prin coloraţii specifice şi fotografierea gelului. În prezent există mai multe tipuri de sisteme folosite pentru DGGE furnizate de diferiţi producători (Bio-Rad, Ingeny, CBS Scientific, Scie Plas etc.). Din acest motiv, modul de pregătire al sistemului precum şi volumul soluţiilor folosite variază în funcţie de modelul utilizat precum şi de dimensiunile gelurilor. În cele ce urmează este prezentată realizarea DDGE folosind sistemul TV400 produs de Scie Plas, UK (Figura 21).


162

pieptene

cuvă modul migrare gel

distanţier controler temperatură

suport turnare gel

FIGURA 21. Elementele componente ale sistemului pentru DGGE TV400 (Scie Plas) 1. Curăţarea şi asamblarea sistemului de electroforeză Componentele sistemului DGGE (plăcile din sticlă, cele două distanţiere, pieptenul) trebuie spălate bine cu apă înainte de utilizare. În cazul plăcilor din sticlă trebuie îndepărtată orice urmă de grăsime prin spălare cu apă şi săpun. După uscare, plăcile din sticlă se curăţă cu etanol 96% folosind un şerveţel din hârtie, în scopul îndepărtării încărcării electrostatice şi pentru a asigura omogenitatea gelului. Deşi este suficientă curăţarea plăcilor din sticlă doar pe o parte, se recomandă curăţarea ambelor feţe. Pentru manipularea plăcilor din sticlă se recomandă purtarea mănuşilor. Pentru asamblarea sistemului de electroforeză în scopul turnării gelului se procedează în felul următor: 1. se aşează plăcile din sticlă pe hârtie de filtru curată; 2. distanţierele se fixează pe părţile laterale ale plăcii din sticlă mai lungi după care se suprapune cea de-a doua placă din sticlă, mai scurtă; 3. ansamblul astfel rezultat se prinde în modulul de migrare al gelului şi se fixează cu ajutorul şuruburilor; se întoarce modulul pentru a se verifica dacă plăcile din sticlă şi distanţierele sunt

Electroforeza ADN

163

perfect aliniate; dacă este necesar se reajustează poziţia lor până la aliniere completă; 4. se aşează modulul de migrare al gelului pe suportul de turnare şi se rotesc şuruburile în sensul acelor de ceasornic până la o fixare etanşă; 5. se verifică etanşeitatea sistemului turnând 2 ml apă distilată între plăcile din sticlă; dacă nu se observă scurgere, apa poate fi îndepărtată şi se poate trece la turnarea gelurilor. 2. Prepararea soluţiilor şi turnarea gelurilor în gradient de concentraţie Gelurile utilizate pentru DGGE sunt geluri de poliacrilamidă de concentraţie constantă. Valoare specifică a concentraţiei de poliacrilamidă depinde de dimensiunile produşilor PCR ce urmează a fi separaţi prin electroforeză: 6% pentru fragmente cu o lungime de 300-1000 pb, 8% pentru fragmente de 200-400 pb şi 10% pentru produşii de 100-300 pb (20). Specific pentru gelurile DGGE este faptul că acestea conţin un gradient de concentraţie de agent denaturant dispus pe lungimea gelului. Gradientul se realizează de la 0% până la 80% agent denaturant, unde 100% agent denaturant reprezintă 7M uree şi 40% formamidă deionizată. Uneori este necesară optimizarea prealabilă a condiţiilor de gradient; în aceste situaţii se porneşte de la un gradient mai mare de concentraţie, urmând ca ulterior acesta să fie îngustat în vederea creşterii rezoluţiei. 3. Prepararea soluţiilor de acrilamidă şi agent denaturant: În vederea preparării gelului în gradient de agent denaturant este necesară prepararea a două soluţii: – o soluţie de concentraţie mică de agent denaturant (notată cu L – engl. Low); – o soluţie de concentraţie mare de agent denaturant (notată cu H – engl. High). De exemplu, dacă se utilizează un gradient de 30-60% agent denaturant, atunci este necesară prepararea unei soluţii de 30% (L) şi a unei soluţii de 60% (H) agent denaturant. Volumul fiecării soluţii depinde de dimensiunea gelului de preparat. Sistemul în format maxi descris în


164

continuare utilizează un gel cu volumul de 30 ml, ceea ce presupune prepararea a 15 ml din soluţia H şi 15 ml din soluţia L. Pentru uşurinţă se prepară soluţii stoc în eprubete de centrifugă cu capacitatea de 50 ml (Tabelul 10). Opţional, după preparare, soluţiile pot fi filtrate sau degazificate. În scopul creşterii flexibilităţii gelului se poate adăuga 1 ml glicerol la 50 ml soluţie stoc (se reduce astfel riscul ruperii gelului în timpul manipulărilor ulterioare). Soluţiile astfel preparate se pot păstra protejate de lumină la temperatura de 4oC timp de până la o lună. TABEL 10. Prepararea soluţiilor stoc necesare pregătirii gelurilor DGGE 6% poliacrilamidă Reactivi 0%

Concentraţie agent denaturant 20% 30% 40% 60%

Poliacrilamidă 40% (37,5:1) 7,5 ml 7,5 ml TAE 50X 1 ml 1 ml Uree 0g 4,2 g Formamidă 0 ml 4 ml până la până la H2O distilată 50 ml 50 ml

7,5 ml 1 ml 6,3 g 6 ml până la 50 ml

70%

7,5 ml 7,5 ml 7,5 ml 1 ml 1 ml 1 ml 8,4 g 12,6 g 14,7 g 8 ml 12 ml 14 ml până la până la până la 50 ml 50 ml 50 ml

Pentru a prepara geluri de poliacrilamidă cu concentraţii mai mari de 6% se poate creşte volumul de poliacrilamidă 40% în soluţiile stoc până la 10 ml (pentru geluri 8%), respectiv până la 12,5 ml (pentru geluri 10%). Pentru turnarea gelurilor se utilizează un mixer de gradient care are rolul de a realiza gradientul de concentraţie dorit. Acesta prezintă două compartimente legate printr-un canal prevăzut cu un robinet. Mixerul de gradient se conectează la o pompă peristaltică (Figura 22) şi se procedează în felul următor: 1. se introduce un magnet pentru agitare în compartimentul în care se va turna soluţia H;

2. se aşează mixerul de gradient pe un agitator magnetic şi se spală bine cu apă distilată; se verifică modul de funcţionare şi etanşeitatea tuburilor pornind pompa peristaltică şi evacuând apa folosită pentru spălare;

Electroforeza ADN

compartiment soluție L

165

pompă peristaltică

tub terminal

mixer de gradient

agitator magnetic FIGURA 22. Asamblarea sistemului de turnare a gelurilor în gradient de concentraţie de agent denaturant utilizate în DGGE 3. se opreşte pompa peristaltică şi se închide robinetul dintre cele două compartimente precum şi robinetul final; 4. se introduce tubul terminal între cele două plăci din sticlă; 5. se introduc 15 ml soluţie L în compartimentul din stânga (Figura 22); se deschide şi se închide robinetul dintre cele două compartimente astfel încât o cantitate foarte mică de soluţie L să treacă în celălalt compartiment; în acest fel se împiedică blocarea cu aer a canalului dintre cele două compartimente; se scoate soluţia L din compartimentul din dreapta cu o pipetă şi apoi se adaugă 15 ml soluţie H; volumul soluţiilor introduse variază în funcţie de dimensiunile plăcilor din sticlă precum şi de grosimea distanţierelor folosite; în general, se utilizează un volum final al soluţiilor H şi L care să permită turnarea gelului până la distanţa de 1 cm faţă de pieptenele inserat; 6. se porneşte agitatorul magnetic; 7. se adaugă soluţia APS 10% (40-100 μl) şi TEMED

166


(7,5-10 μl/10 ml); din acest moment începe polimerizarea soluţiei de poliacrilamidă, motiv pentru care se recomandă turnarea gelului fără întârziere; 8. se porneşte pompa peristaltică la o viteză de 10 ml/min; nivelul soluţiei H va scădea puţin, împiedicând trecerea ei în celălalt compartiment înainte de efectuarea pasului următor; 9. se deschide robinetul dintre cele două compartimente; dacă nivelul soluţiei L nu scade, canalul dintre cele două compartimente este blocat; 10. se toarnă gelul încet între cele două plăci din sticlă până la 1-2 cm sub pieptene, evitându-se pătrunderea aerului; 11. după turnarea gelului se închide pompa peristaltică, se scoate tubul dintre cele două plăci din sticlă şi se adaugă apă distilată în ambele compartimente ale mixerului de gradient; se reporneşte pompa pentru a spăla bine tot sistemul în vederea înlăturării soluţiei de poliacrilamidă ce poate polimeriza; 12. se aşteaptă timp de aproximativ o oră în vederea polimerizării complete a acrilamidei şi obţinerea gelului de poliacrilamidă; 13. se spală suprafaţa gelului cu TAE 1X după care soluţia tampon se îndepărtează cu ajutorul unei pipete; 14. se prepară aproximativ 3 ml dintr-o soluţie 0% denaturant (Tabelul 10, pagina 164) în care se adaugă 30 μl soluţie 10% APS şi 3 μl TEMED; această soluţie se toarnă, cu ajutorul unei pipete, deasupra gelului obţinut anterior; 15. se introduce cu grijă pieptenul astfel încât să se evite formarea bulelor de aer dedesubt; dacă acestea apar se scoate pieptenul şi se reia operaţia; 16. se lasă în repaus cel puţin 2 ore pentru polimerizare; 17. se prepară aproximativ 5 L TAE 1X; 4,3 L TAE 1X se introduc în cuva pentru electroforeză; folosind sistemul de încălzire a cuvei se încălzeşte soluţia tampon până la temperatura de 65oC (timp necesar – aproximativ 2 ore); 0,7 L TAE 1X se păstrează pentru mai târziu; 18. când temperatura a ajuns la 50oC, se scoate uşor pieptenele din

Electroforeza ADN

167

gel şi se transferă modulul de migrare al gelului în cuvă; la introducere pot apărea bule de aer la partea inferioară a modulului care pot influenţa procesul de migrare; acestea pot fi scoase cu ajutorul unei seringi; se umple camera interioară a modulului cu cei 0,7 L TAE 1X păstraţi; 19. se spală bine godeurile cu TAE 1X pentru a îndepărta resturile de acrilamidă nepolimerizată; în caz contrar se formează godeuri cu dimensiuni inegale;

20. se continuă încălzirea până la temperatura de 65oC; nu se recomandă introducerea modulului de migrare al gelului la temperaturi mai mari de 50oC deoarece plăcile din sticlă se pot deteriora. 4. Încărcarea probelor Pentru încărcarea probelor se poate utiliza o pipetă automată prevăzută cu vârfuri speciale sau, după caz, o seringă Hamilton. Se recomandă încărcarea probelor în godeurile centrale, evitându-se utilizarea celor din margine (în această regiune poate apare mai frecvent fenomenul de migrare inegală a probelor – aşa numitul „gel smiling”). În fiecare godeu se poate introduce un volum de 40-50 μl produs PCR împreună cu tampon de încărcare. Volumul probei de încărcat poate varia în funcţie de dimensiunile pieptenelui utilizat, de randamentul procesului de amplificare prin PCR şi de numărul probabil al produşilor obţinuţi. De exemplu, probele de sol vor genera prin amplificare un număr mai mare de produşi, prin urmare se recomandă încărcarea unor volume cât mai mari. În cazul analizei produşilor PCR ai unui singur izolat se recomandă încărcarea unor volume foarte mici (câţiva μl). Pentru a uşura încărcarea probelor se recomandă introducerea în godeuri, la început, a unor volume mici de tampon de încărcare (albastru de bromfenol). În acest fel godeurile devin mult mai vizibile şi nu interferă cu procesul de migrare. Drept standarde în timpul migrării se pot folosi amestecuri de produşi PCR generaţi din benzi excizate din alte geluri. Nu se recomandă utilizarea drept standarde a unor markeri de greutate ca cei folosiţi pentru electroforeza în gel de agaroză.


168

5. Migrarea probelor Timpul de migrare şi tensiunea electrică sunt variabile cheie ale separării electroforetice. În general, geluri de calitate superioară se obţin folosind timpi mai mari de migrare şi valori mai mici ale tensiunii electrice (16 ore la 100 volţi în comparaţie cu 3 ore la 250 volţi) (20). În cazul sistemului DGGE TV400 (Scie Plas) se menţine constantă temperatura la 60oC şi se realizează mai întâi o migrare timp de 10 minute la 20 volţi, urmată de o migrare de 5 ore la 200 volţi. La final se dezasamblează modulul de migrare, se scoate cu grijă gelul şi se poate trece la etapele de colorare şi vizualizare. Dacă la asamblare, pe suprafaţa internă a uneia din cele două plăci din sticlă, se ataşează o folie de celofan, după migrare gelul poate fi mai uşor manipulat.

VII.3 Detecţia ADN-ului în geluri de agaroză Evidenţierea ADN-ului în geluri de agaroză se bazează pe capacitatea acestuia de a intercala între baze diverse molecule colorate sau fluorescente. În cele ce urmează sunt prezentate trei modalităţi distincte de evidenţiere a ADN-ului, fiecare cu avantajele şi dezavantajele ei. Vizualizarea fragmentelor de ADN se face cu ajutorul unui transiluminator. Caracteristic gelurilor de agaroză este faptul că trebuie vizualizate imediat după terminarea separării electroforetice, deoarece în timp benzile separate difuzează şi diminuează rezoluţia. Prin urmare, este absolut necesar ca aceste geluri să fie fotografiate imediat după separare. Aceasta se poate realiza cu o cameră foto digitală obişnuită, însă calitatea fotografiilor nu este foarte bună şi timpul de expunere la lumina ultraviolet este mare. În comerţ există sisteme speciale pentru fotografierea gelurilor alcătuite dintr-un transiluminator, o incintă întunecată închisă plasată peste transiluminator şi o cameră foto. Sistemul poate fi comandat direct sau prin intermediul unui computer. Fotografia este vizualizată pe ecranul camerei, pe un monitor ataşat acesteia sau pe monitorul computerului, putând fi salvată şi printată. Principalii producători de sisteme de achiziţie a imaginilor pentru laborator (Alpha Innotech Corp., UVP, Biorad, VilberLourmat) propun soluţii tehnice diverse cu numeroase aplicaţii (fotografiere geluri agaroză, plăci TLC, geluri SDS-PAGE, fluorescenţă) la costuri variate. Pentru vizualizarea şi fotografierea gelurilor de agaroză

Electroforeza ADN

169

în condiţii optime, sistemul cel mai indicat din punct de vedere al raportului cost/performanţă cuprinde: transiluminator UV, incintă întunecată cu uşă pentru amplasarea gelului şi manipulare uşoară, cameră foto CCD dedicată cuplată la monitor şi un sistem de salvare a fotografiilor pe medii de stocare (carduri sau memorii USB).

Detecţia ADN-ului folosind bromura de etidiu Cea mai utilizată metodă de evidenţiere a ADN-ului pe gelurile de agaroză este cea care foloseşte colorantul bromură de etidiu (3), compus care conţine un sistem heterociclic plan care are proprietatea de a se intercala între nucleotidele ADN-ului. Principiul metodei: Intercalarea bromurii de etidiu între catenele de ADN este aproape independentă de secvenţa de nucleotide, cantitatea de colorant fiind dependentă doar de lungimea fragmentului de ADN (o moleculă de bromură de etidiu la 2,5 pb (17). Compusul se aşează perpendicular pe axul dublului helix, realizând legături de tip van der Walls cu bazele azotate de deasupra şi de dedesubtul planului sistemului heterociclic. Această poziţie fixă în zona hidrofobă dintre perechile de baze ale ADN-ului face ca bromura de etidiu legată de ADN să manifeste fluorescenţă crescută faţă de cea aflată în stare liberă în soluţie. Radiaţia UV cu lungimea de undă de 254 nm este absorbită de ADN, iar cea cu lungimea de undă de 302 nm şi 366 nm de către colorantul legat. Energia absorbită este apoi emisă sub formă de radiaţie la lungimea de undă de 590 nm, în zona roşu-portocaliu a spectrului (18). Bromura de etidiu poate fi folosită atât pentru detecţia moleculelor dublu catenare, cât şi a celor monocatenare (ADN monocatenar sau ARN). Intensitatea fluorescenţei este mai mică în cazul moleculelor monocatenare. Există două abordări diferite referitoare la tehnica de colorare cu bromură de etidiu:


170

a) introducerea bromurii de etidiu în gel sau în tamponul de migrare – oferă posibilitatea vizualizării procesului de separare în timpul electroforezei; b) imersarea gelului de agaroză într-o soluţie de bromură de etidiu. Avantaje: 1. simplitate deosebită a metodei, costuri reduse; 2. limită de detecţie bună. Limitări: – contaminare puternică cu bromură de etidiu; colorantul se va regăsi la sfârşitul experimentului în geluri, în soluţiile tampon folosite şi va contamina camerele de electroforeză şi transiluminatoarele utilizate. Materiale necesare: 1. transiluminator UV cu lungimea de undă de aproximativ 300 nm; producătorii consacraţi (UVP, Bio-Rad, Stratagene) oferă incinte speciale prevăzute cu camere foto pentru vizualizarea şi fotografierea facilă a gelului; 2. bromură de etidiu 10 mg/ml, soluţie stoc – se dizolvă 1 g bromură de etidiu în 100 ml apă distilată; soluţia se păstrează la întuneric timp nelimitat; 3. bromură de etidiu, soluţie de lucru – se dilueză soluţia stoc pentru a obţine o concentraţie de 1 μg/ml (15); 4. agitator orbital.

Electroforeza ADN

171

Mod de lucru: Pentru evidenţierea ADN-ului folosind bromura de etidiu, în condiţiile în care colorantul nu este încorporat în gel, se parcurg următoarele etape: 1. colorare – după finalizarea separării electroforetice, gelul se incubează sub agitare timp de 30 minute în 100 ml bromură de etidiu (soluţie de lucru); 2. decolorare – gelul se menţine timp de 30 minute în apă distilată, sub agitare; 3. vizualizare – gelul se amplasează pe transiluminator şi se fotografiază. Dacă bromura de etidiu a fost încorporată în gel, se poate trece direct la etapa de vizualizare şi fotografiere. Expunerea pielii şi ochilor la radiaţii ultraviolet trebuie redusă la minimum, de aceea este obligatorie purtarea ochelarilor de protecţie (protecţie completă pentru faţă), a mănuşilor şi a halatului în cazul în care se lucrează cu transiluminator deschis. De asemenea, în timpul manipulării gelului este indicat să se reducă timpul de procesare a acestuia şi să se evite atingerea altor suprafeţe cu mănuşile contaminate. Foarte frecvent sunt contaminate tastatura computerului sau butoanele sistemului de achiziţie a imaginilor. Dacă se urmăreşte izolarea unui fragment de ADN din gel, este indicat să se reducă timpul de expunere a acestuia la radiaţii UV, reducându-se riscul de apariţie a unor mutaţii.

Detecţia ADN-ului în geluri de agaroză folosind coloranţi de tip SYBR Datorită principalului inconvenient al bromurii de etidiu s-a încercat identificarea unor alternative mai puţin periculoase. Astfel, au fost testaţi o serie de coloranţi de tipul SYBR, care au capacitatea de a lega ADN-ul


172

dublu sau monocatenar, complexul format fiind fluorescent şi permiţând astfel vizualizarea ADN-ului pe geluri de agaroză sau chiar poliacrilamidă. Cei mai cunoscuţi coloranţi din această familie sunt: – SYBR Green I (SG) (comercializat de firma Invitrogen) prezintă un maximum de absorbţie în lumină albastră (λmax = 497 nm) şi emite lumină verde (λmax = 522 nm); – SYBR Green II, (comercializat de firma Invitrogen) prezintă un maximum de absorbţie la 497 nm şi emite la 513 nm; – SYBR Gold (comercializat de firma Invitrogen) prezintă un maximum de absorbţie la 495 nm şi emite la 537 nm; – YO (Oxazole Yellow); – TO (Thiazole Orange); – PG (PicoGreen). Avantaje: – principalul avantaj al coloranţilor din familia SYBR este faptul că sunt lipsiţi de efectele cancerigene; – coloranţii din familia SYBR prezintă o sensibilitate superioară bromurii de etidiu; SYBR Green I este de 25-100 ori mai sensibil decât bromura de etidiu pentru ADN dublucatenar, dar nu poate fi utilizat pentru vizualizarea ARN-ului; SYBR Green II este de 5-10 ori mai sensibil decât bromura de etidiu pentru ARN; SYBR Gold poate detecta până la 25 pg de ADN sau ARN (15). Limitări: -

cost mare de achiziţie.

Mod de lucru: Utilizarea acestor coloranţi presupune incubarea gelului după migrare în soluţii diluate (1:10000) în soluţie tampon de migrare timp de

Electroforeza ADN

173

15-40 minute. Nu este necesară decolorarea gelului. Valoarea maximă a sensibilităţii se atinge doar prin utilizarea unor filtre fotografice speciale. Pentru vizualizări uzuale pot fi utilizate transiluminatoarele obişnuite ce funcţionează la o lungime de undă de 300 nm.

Detecţia ADN-ului în geluri de agaroză folosind albastrul de metilen Deşi colorarea cu bromură de etidiu generează cantităţi mari de deşeuri periculoase, aceasta este preferată, în principal, datorită simplităţii şi rapidităţii. O metodă alternativă de colorare, mai puţin periculoasă dar mai elaborată şi din acest motiv mai puţin utilizată este metoda care utilizează albastru de metilen. Acest colorant permite vizualizarea fragmentelor de ADN direct în lumină vizibilă, eliminând astfel un alt dezavantaj al bromurii de etidiu şi anume necesitatea utilizării radiaţiilor UV. Avantaje: 1. albastrul de metilen nu este toxic; 2. gelul este vizualizat direct în spectrul vizibil evitându-se astfel pericolul arsurilor la care este expus cercetătorul sau al mutaţiilor la nivelul ADN-ului manipulat; 3. simplitate şi costuri reduse. Limitări: 1. timp mai lung de incubare; 2. sensibilitate mai mică decât bromura de etidiu (250 ng/cm bandă) (19); 3. unele tipuri de agaroză comercializate sunt incompatibile cu acest sistem datorită colorării intense a fondului.


174

Materiale necesare: 1. soluţie tampon TAE 0,1X – Tris 4 mM pH 8,3 corectat cu acid acetic, EDTA 0,1 mM; 2. soluţie albastru de metilen 0,002% în tampon TAE 0,1X; 3. agitator orbital; 4. transiluminator VIS şi/sau sistem de fotografiere. Mod de lucru: 1. datorită sensibilităţii mai reduse, în gel trebuie încărcată o cantitate de 2 – 5 ori mai mare de ADN; 2. electroforeza se desfăşoară în condiţiile obişnuite descrise anterior, până când raportul dintre nivelurile colorantului inferior şi a celui superior indică separarea completă a fragmentelor de interes; 3. după încheierea electroforezei gelul se transferă într-o cuvă de colorare conţinând cel puţin cinci volume albastru de metilen 0,002% (pentru un gel de 50 ml sunt necesari aproximativ 250 ml soluţie albastru de metilen); se incubează la temperatura camerei timp de 1-4 ore sau peste noapte la temperatura de 4oC; 4. decolorarea se realizează în soluţie tampon TAE 0,1X, prin agitare uşoară până se atinge nivelul dorit; tamponul trebuie schimbat cu unul nou după fiecare 30-60 minute; 5. gelul se plasează pe transiluminator sau pe o suprafaţă de culoare albă şi se fotografiază. Bibliografie: 1. Thorne, H. (1966) –Electrophoretic separation of polyoma virus DNA from host cell DNA, Virology, 29, 234-239. 2. Aaij, C. (1972) –The gel electrophoresis of DNA, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis, 269, 192-200.

Electroforeza ADN

175

3. Sharp, P. A., Sugden, B., Sambrook, J. (1973) –Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose--ethidium bromide electrophoresis., Biochemistry, 12, 3055-63. 4. Sambrook, J. (2001) –Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, J., Ed.) third. ed, p 2.13-2.19. Spring Harbor Laboratory Press. 5. Richard, R. J. (2004) –Analysis of Genes and Genomes, p 89-98. John Wiley&Sons. 6. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. (2003) –Current protocols in Molecular Biology (Frederick M. Ausubel Roger Brent, et. al, Ed.), p 2.5-2.7. John Wiley & Sons, Inc. 7. Norton, I. T., Goodall, D. M., Austen, K. R. J., Morris, E. R., Rees, D. A. (1986) –Dynamics of molecular organization in agarose sulphate, Biopolymers, 25, 1009-1029. 8. Hirkpareik, F. H. (1990) –Overview of agarose gel properties, Curr. Commun. Cel. Mol. Biol, .1, 9-22. 9. Calladine, C. R., Collis, C. M., Drew, H. R., Mott, M. R. (1991) –A study of electrophoretic mobility of DNA in agarose and polyacrylamide gels., Journal of Molecular Biology, 221, 981-1005. 10. Hervet, H., Bean, C. P. (1987) –Electrophoretic mobility of lambda phage HIND III and HAE III DNA fragments in agarose gels: a detailed study., Biopolymers, 26, 727-42. 11. Slater, G. W., Mayer, P., Drouin, G. (1996) –Migration of DNA through gels, Methods in Enzymology,270, 272-295. 12. Lalande, M., Noolandi, J., Turmel, C., Rousseau, J., Slater, G. W. (1987) –Pulsed-field electrophoresis: application of a computer model to the separation of large DNA molecules., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84, 8011-5. 13. Schwartz, D. C., Cantor, C. R. (1984) –Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis., Cell, 37, 67-75. 14. McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. (1977) –Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels., Journal of Molecular Biology, 110, 119-46. 15. Armstrong, J. A., Schulz, J. R. (2008) –Agarose Gel Electrophoresis in Current Protocols Essential Laboratory Techniques (Gallagher,

176


S., Wiley, E., Eds.), p 00:7.2.1-7.2.20. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA. 16. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) –Molecular Cloning - A Laboratory Manual, p 6.3-6.6. Cold Spring Harbour Laboratory Press. 17. Waring, M. J. (1965) –Complex formation between ethidium bromide and nucleic acids, Journal of Molecular Biology, 13, 269-282. 18. LePecq, J. B., Paoletti, C. (1967) –A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids. Physical-chemical characterization., Journal of Molecular Biology, 27, 87-106. 19. Ogden, R. C., Adams, D. A. (1987) Electrophoresis in agarose and acrylamide gels., Methods in Enzymology, 152, 61-87 20. Green, S.J., Leigh, M.B., Neufeld, J. D. (2009) –Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) for microbial community analysis, in Microbiology of Hydrocarbons, Oils, Lipids, and Derived Compounds (Timmis, K. N., Ed.), p 4137-4158. Springer, Heidelberg, Germany. 21. Muyzer, G., de Waal, E. C., Uitterlinden, A. G. (1993) –Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA., Appl. Envir. Microbiol., 59, 695-700. 22. Muyzer, G., Smalla, K. (1998) –Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology, Antonie van Leeuwenhoek. Springer Netherlands. 23. Gomes, N. C. M., Heuer, H., Schönfeld, J., Costa, R., MendonçaHagler, L., Smalla, K. (2001) –Bacterial diversity of the rhizosphere of maize (Zea mays) grown in tropical soil studied by temperature gradient gel electrophoresis, Plant and Soil. Springer Netherlands. 24. Casamayor, E. O., Schafer, H., Baneras, L., Pedros-Alio, C., Muyzer, G. (2000) –Identification of and Spatio-Temporal Differences between Microbial Assemblages from Two Neighboring Sulfurous Lakes: Comparison by Microscopy and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, Applied and Environmental Microbiology, 66, 499-508. 25. Vainio, E. J., Hantula, J. (2000) –Direct analysis of wood-inhabiting fungi using denaturing gradient gel electrophoresis of amplified ribosomal DNA, Mycological Research, 104, 927-936. 26. Díez, B., Pedrós-Alió, C., Marsh, T. L., Massana, R. (2001) – Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to study the diversity of marine picoeukaryotic assemblages and comparison of DGGE with other molecular techniques., Applied and Environmental Microbiology,67, 2942-2951.

VIII. PURIFICAREA PROTEINELOR PRIN CROMATOGRAFIE DE AFINITATE FAŢĂ DE METALE Încă de la începutul dezvoltării biochimiei ca ştiinţă, unul dintre domeniile fundamentale a fost izolarea şi purificarea principiilor active. Dintre acestea, proteinele şi în special enzimele s-au bucurat de un interes cu totul deosebit, purificarea lor fiind atractivă nu doar din punct de vedere teoretic, ci şi din punct de vedere practic, enzimele fiind privite ca o alternativă simplă şi extrem de eficientă a catalizei chimice. Proteinele se caracterizează printr-o variabilitate mare atât a structurii, cât şi a proprietăţilor specifice. Din acest motiv a fost imposibil până acum să se realizeze un protocol de purificare valabil fără echivoc pentru orice moleculă proteică. Cunoştinţele acumulate în domeniul purificării proteinelor au permis cel mult conturarea unor reguli şi principii generale de urmat în scopul adaptării unei metode de purificare la proprietăţile fizico-chimice ale proteinei de interes. Revoluţia produsă de tehnicile ADN-recombinat în biologia moleculară s-a resimţit în domenii extrem de variate, printre care şi cel al purificării proteinelor. Tehnicile de manipulare a ADN-ului permit acum cercetătorului să modifice secvenţa şi implicit structura proteinei de purificat pentru a-i conferi proprietăţi specifice care să faciliteze purificarea. În acest sens, una dintre cele mai utilizate tehnici este cea care se bazează pe ataşarea la unul din capetele C sau N terminale ale proteinei de interes a unei „cozi” cu afinitate pentru suporturi imobilizate. Această „coadă” are dimensiuni variate, putând fi reprezentată fie de un întreg domeniu proteic, fie doar de un fragment de câţiva aminoacizi. Proteina recombinată obţinută va prezenta aceiaşi afinitate ca şi „coada” pe care o conţine, putând fi astfel purificată prin tehnici specifice (Tabelul 11). Foarte intens utilizată pentru purificarea proteinelor este aşa numita „coadă” poli-His, reprezentată printr-o polipeptidă conţinând 6-8 reziduuri de histidină cu afinitate foarte mare pentru Ni2+ sau Co2+. Faţă de celelalte „cozi” proteice sau polipeptidice, polipeptida poli-His are marele avantaj al dimensiunilor deosebit de mici. Aceasta face ca modificările aduse structurilor secundare şi


178

terţiare ale proteinei de purificat să fie minime şi, drept urmare, modificările activităţii enzimatice native a proteinei purificate să fie extrem de reduse. Au fost semnalate şi cazuri foarte rare în care coada are un efect benefic, mărind activitatea proteinei (3). Deşi nu foarte frecvent, au fost raportate şi situaţii în care efectul este unul negativ, ducând la diminuarea activităţii biologice (4). TABEL 11. Domenii proteice şi cozi polipeptidice de fuziune utilizate frecvent în purificarea proteinelor recombinate (după Terpe, 2003 şi LaVallie, 2001) (1) (2) “Cozi” de fuziune

Metodă de purificare

Domenii proteice de fuziune MPB1

Afinitate faţă de amiloză

Glutation S-transferaza

Afinitate faţă de glutation

Proteina A

Afinitate faţă de IgG

Represorul lac

Afinitate faţă de operatorul lac

GBP2

Afinitate faţă de galactoză

Cozi polipeptidice de fuziune Poli-His

IMAC3

Poli-Asp

Cromatografie pe răşini anionice

Poli-Arg

Cromatografie pe răşini cationice

Poli-Cys

Afinitate pentru grupări tiolice

Strep-tag II

Afinitate pentru streptavidină

avidină

sau

1MBP–engl.

Maltose-Binding Proteine GBP –engl. Galatose-Binding Protein 3 IMAC –cromatografie de afinitate pentru metale imobilizate (engl. Immobilized Metal Affinity Chromatography) 2

Tehnica de purificare care se bazează pe „coada” polipeptidică poli-His a fost descrisă pentru prima dată în anul 1975 de Porath et al.(5) şi se bazează pe afinitatea pentru metalele tranziţionale pe care această coadă o conferă proteinelor recombinate. Denumirea metodei este este

Purificarea proteinelor prin IMAC

179

cromatografie de afinitate pentru metale imobilizate (engl.Immobilized Metal Affinity Chromatography –IMAC). Întreaga separare cromatografică are la bază o matrice inertă pe care sunt imobilizaţi ionii unor metale tranziţionale (Co2+, Cu2+, Zn2+ sau cel mai frecvent Ni2+). Matricea suport este confecţionată dintr-un material puternic hidrofil, inert din punct de vedere chimic şi rezistent la atacul microorganismelor. Materialele cel mai frecvent utilizate pentru suportul cromatografic sunt agaroza şi Sephadex-ul sub forma unor fragmente sferice, rigide şi uniforme cu diametrul de 5-50 μm. Pe acest suport se fixează covalent o grupare ce are proprietatea de a chelata ionul metalic. Prima grupare chelatantă descrisă a fost acidul nitrilotriacetic (NTA), grupare ce este utilizată foarte frecvent şi astăzi. NTA are 4 situsuri de coordinare şi poate astfel lega foarte puternic ionii metalelor tranziţionale. Suportul cromatografic cunoscut comercial sub denumirea de Ni-NTA se obţine prin imobilizarea ionilor Ni2+ pe NTA. Prin legarea sa de matricea inertă, ionul Ni2+ îşi ocupă patru din cele şase valenţe, celelalte două valenţele rămase libere putând interacţiona cu inelul imidazolic al resturilor de histidină de pe catena polipetidică sau de pe coada poli-His. Modul în care au loc interacţiunile specifice prin care polipeptida se fixează de ionul metalic, iar acesta de matrix, este prezentat în Figura 23. De notat este faptul că aceste interacţiuni sunt independente de structura tridimensională a proteinei recombinante, astfel încât tehnica permite purificarea proteinelor atât în formă nativă cât şi a în formă denaturată. Mecanismul prin care are loc purificarea propriu-zisă a proteinelor de fuziune cu His-tag presupune contactul extractului acelular ce conţine proteina recombinată cu Ni-NTA. În mod natural, proteinele native au afinitate relativ redusă pentru nichel şi nu se vor lega de Ni-NTA, pe când proteina cu His-tag care are afinitate puternică pentru ionii acestui metal se va lega foarte puternic. Complexul matrice-Ni-NTA-proteină recombinată este unul destul de stabil, ceea ce permite spălarea succesivă cu soluţii tampon pentru eliminarea tuturor impurităţilor de pe coloană. Prin aplicarea unei soluţii conţinând chelatanţi puternici ai Ni2+ (precum imidazolul), complexul matrice-Ni-NTA-proteină recombinată este destabilizat prin ruperea legăturilor metal-proteină recombinată, astfel încât aceasta din urmă este eluată de pe coloana cromatografică în stare pură.


180

Proteină

Ni-NTA

Matrice inertă FIGURA 23. Interacţiunile dintre partenerii complexului matrice-Ni-NTA-proteină ce stau la baza cromatografiei de afinitate pentru metale imobilizate (IMAC) Spacer

Purificarea unei proteine recombinate prin IMAC presupune parcurgerea a trei etape distincte: 1. clonarea genei care codifică proteina de interes în vectori de expresie specifici– permite nu doar modificarea secvenţei de aminoacizi a proteinei de interes în scopul introducerii cozii poli-His, ci şi expresia ei controlată în organisme gazdă specifice (cel mai frecvent E. coli); 2. identificarea condiţiilor optime de supraexpresie a proteinei recombinate în organismul gazdă şi testarea solubilităţii acesteia– supraexpresia în organisme gazdă, altele decât cel din care provine proteina de interes, permite acumularea acesteia şi obţinerea unui un randament de purificarea bun; dezavantajul este că, uneori, pot apărea probleme privind stabilitatea şi mai ales solubilitatea proteinei de interes; din acest motiv este esenţială o etapa de selecţie a condiţiilor optime de expresie; 3. expresia şi purificarea propriu-zisă – înfuncţie de solubilitatea proteinei ţintă, purificarea prin IMAC se poate realiza în condiţii native sau în condiţii denaturante; în acest ultim caz, după purificare, este necesară introducerea unei etape suplimentare de repliere a proteinei în forma sa nativă. În cele ce urmează sunt prezentate fiecare dintre aceste trei etape, fiind detaliată însă doar metoda de purificare propriu-zisă.


181

VIII.1 Strategii de clonare a genelor în vectori de expresie După Twyman, 1999 (6), procesul de clonare reprezintă, în sens larg, o tehnică ce are drept scop producerea mai multor copii dintr-un fragment ADN de interes. Această amplificare se poate realiza în două moduri, in-vitro prin sinteză chimicăenzimaticăutilizând reacţia PCR şi in-vivo utilizând sistemele enzimatice ale unor organisme gazdă specifice (7). După unii autori însă termenul de clonare implică introducerea unui fragment de ADN dintr-o sursă într-o moleculă acceptoare care provine dintr-o altă sursă cu obţinerea unei molecule ADN recombinate (8). De aceea, în mod uzual, noţiunea de clonare este mai degrabă rezervată pentru desemnarea procesului desfăşurat in-vivo în urma căruia se obţine o moleculă de ADN-recombinat, iar cea de amplificare este utilizată pentru procesul enzimatic desfăşurat in-vitro. Clonarea unui fragment de ADN (ADN genomic, ADN complementar rezultat prin revers-transcrierea ARN-ului mesager sau un fragment sintetizat chimic) este un proces care constă în parcurgerea a patru etape distincte (6): 1. construirea unui vector recombinat ce conţine fragmentul ADN de interes; 2. introducerea vectorului recombinat într-o gazdă potrivită; 3. propagarea selectivă a vectorului recombinat; 4. extracţia şi purificarea ADN-ului plasmidial. Indiferent de sursa din care provine fragmentul ADN care trebuie clonat, principiul ce guvernează obţinerea de molecule recombinate este acelaşi şi se referă la fragmentarea moleculei ADN în vederea separării regiunii de interes şi introducerea ei în molecula acceptor. Fragmentarea se poate realiza mecanic, chimic sau enzimatic. Primele două metode nu oferă un control strict asupra dimensiunilor fragmentelor obţinute, utilizarea enzimelor de restricţie fiind preferată datorită specificităţii foarte mari a acestora. Enzimele de restricţie sunt endonucleaze produse de bacterii care au capacitatea de a cliva ambele catene ale moleculei de ADN la nivelul unor secvenţe specifice de patru până la opt perechi de baze (numite situsuri de restricţie) (9). Nu numai situs-ul de clivare, dar şi modul de clivare

182


este specific şi aceasta duce la apariţia a două tipuri de capete. În situaţia în care clivarea se realizează pe ambele catene în aceeaşi poziţie dini nteriorul situs-ului de restricţie, cele două catene se vor sfârşi la acelaşi nivel, iar capătul rezultat poartă numele de capăt drept. Dacă clivarea se realizează în situs-uri diferite pe cele două catene, capetele formate vor avea cele două catene de lungimi diferite. Una dintre catene va fi mai lungă şi va expune deci nucleotide neîmperecheate spre exterior. Dacă două fragmente de ADN au la capăt o catenă mai lungă cu aceeaşi secvenţă, fragmentele se pot asocia prin formarea unor legături de hidrogen. Din acest motiv capetele poartă numele de capete coezive. Legăturile formate menţin moleculele în contact şi permit acţiunea ligazelor. Aceste enzime au capacitatea de a reface legătura fosfodiesterică şi continuitatea catenelor. În acest fel, fragmentul de interes este sudat în molecula acceptoare, obţinându-se molecula recombinată. Aceste două tipuri de enzime sunt foarte importante în procesul de clonare, procedură ce este imposibilă fără un control foarte bun al tăierii şi refacerii catenei polinuclotidice. Poate la fel de importantă este şi alegerea judicioasă a unei molecule în care să se cloneze fragmentul de interes. Cel mai frecvent pentru aceasta se utilizează vectori de clonare ce trebuie să îndeplinească cel puţin patru condiţii: 1. să nu se integreze în genomul gazdei astfel încât să poată fi uşor separat de cromozomul bacterian; 2. să se replice autonom de cromozomul bacterian într-un număr mare, facilitând astfel amplificarea moleculei pe care o poartă; 3. să permită selecţia uşoară a celulelor care conţin vectorul prin comparaţie cu cele care nu îl conţin; 4. să conţină situs-uri de restricţie care să uşureze procesul de clonare (10). O lista cu cei mai importanţi vectori plasmidiali care pot fi utilizaţi în clonarea şi expresia genelor, alături de proprietăţile specifice ale acestora, sunt prezentate în sub-capitolul III.1 – Vectori plasmidiali utilizaţi frecvent în ingineria genetică, pagina 59. Având la dispoziţie aceste elemente, cea mai simplă strategie de clonare constă din digestia vectorului şi fragmentului de interes cu aceeaşi enzimă de restricţie, ceea ce duce la obţinerea de capete coezive compatibile care pot fi ligate. Abordarea poartă numele de clonare oarbă, deoarece nu oferă un control foarte strict al orientării fragmentului în vector şi de asemenea, vectorul se poate foarte uşor re-circulariza fără a


183

prelua fragmentul de clonat. Clonarea oarbă este una dintre primele strategii de clonare dezvoltată şi foarte intens utilizată care, treptat, prin identificarea unui număr din ce în ce mai mare de enzime de restricţie a fost înlocuită de aşa-numita clonare direcţionată. Aceasta presupune utilizarea a cel puţin două enzime pentru digestia fragmentului şi vectorului (10). Prin digestia vectorului cu două enzime de restricţie diferite care generează capete incompatibile, recircularizarea vectorului este împiedicată. Deoarece fragmentul este tăiat cu aceleaşi două enzime, el va putea fi ligat în vector şi doar astfel se poate realiza recircularizarea acestuia şi obţinerea moleculei ADN recombinate. Legarea este de această dată strict coordonată prin alegerea enzimelor de restricţie. O metodă foarte frecvent utilizată pentru izolarea fragmentului ADN de clonat este amplificarea prin reacţia PCR. Pe lângă rapiditate şi simplitate, această metodă are de asemenea avantajul că permite introducerea de situs-uri de restricţie noi prin folosirea deprimeri degeneraţi.Alegerea enzimelor de restricţie şi localizarea acestor situs-uri de restricţie pe primer trebuie să se facă ţinând cont de următoarele elemente: 6. enzima să fie plasată în situs-ul de clonare multiplu al plasmidului; 7. gena de clonat trebuie sa fie amplasată în situsul multiplu de clonare în aşa fel încât să respecte cadrul de lectură specific vectorului pentru a permite expresia unei proteine recombinate; 8. să înlăture cât mai mult din situs-ul multiplu de clonare pentru ca proteina recombinată să fie cât mai puţin modificată; 9. să taie o singură dată în fragmentul de clonat, în situs-ul dorit; un program extrem de util pentru a analiza situs-urile de restricţie existente într-un fragment ADN dat şi pentru a alege judicios enzimele de restricţie este NEBCutter (11). După obţinerea moleculei recombinate, aceasta trebuie introdusă în celula gazdă. Deşi există specii care pot să accepte molecule de ADN exogen în mod natural, E. coli nu este una dintre acestea (10). De aceea, celulele de E.coli trebuie aduse într-o stare artificială de competenţă prin aplicarea unui tratament chimic. Cea mai simplă metodă a fost descoperită în anul 1970 şi constă în utilizarea clorurii de calciu (7). După realizarea transformării, celulele care conţin vectorul sunt selectate, cel mai frecvent, prin utilizarea unor proprietăţi specifice codificate de către acesta (de exemplu rezistenţa la antibiotice).


184

Principiul metodei Fragmentul ADN este clivat în mod specific cu enzime de restricţie şi ligat în vectorul de expresie pH5EX3. Amestecul de ligare este în continuare folosit pentru transformarea celulelor competente de E. coli. Celulele ce conţin vectorul recombinat sunt selectate pe baza rezistenţei dobândite pentru ampicilină. Avantaje: 1. clonarea unor fragmente cu dimensiuni de până la 5 kb; 2. daca genele clonate sunt amplasate în cadrul de citire specific al plasmidului, ele pot fi exprimate sub forma unor proteine recombinate cu coada poli-His. Limitări: – vectorul este utilizabil doar în E. coli; pentru clonare în alte organisme gazdă trebuie selectat un alt vector. Materiale necesare: 1. vector plasmidial pH6EX3 purificat – purificarea se poate realizare prin utilizarea protocolului specific descris însubcapitolul IV.1 – Izolarea ADN-ului plasmidial la pagina 75. 2. fragment ADN de clonat – acesta trebuie să conţină situs-urile de restricţie pentru enzimele de restricţie ce urmează să fie utilizate; dacă fragmentul a fost izolat prin PCR este necesară purificarea lui din amestecul de reacţie folosind una din metodele descrise în subcapitolul IV. 4 – Izolarea ADN-ului din geluri de agaroză la pagina 103 sau IV. 3 – Purificarea ADN-ului din soluţii apoase la pagina 100; 3. apă distilată sterilă;


185

4. enzime de restricţie şi tampon specific de reacţie – numeroşi distribuitori precum NEB sau Fermentas pun la dispoziţie o gamă variată de enzime de restricţie recombinate cu proprietăţi variate; ideal este ca cele două enzime de restricţie alese să folosească aceeaşi soluţie tampon de reacţie pentru a permite realizarea simultană a reacţiei de restricţie; pentru mai multe detalii, se recomandă manualul de utilizare disponibil pe site-ul producătorului; 5. albumină serică bovină 10 µg/µl; 6. celule competente de E.coli XL1Blue – pot fi obţinute în laborator folosind metoda cu CaCl2 descrisă de Sambrook (12) sau kit-ul Roti®-Transform, (Roth, Germania); există de asemenea numeroşi distribuitori (Roth, NEB) care pun la dispoziţie tulpini de E. coli înalt competente; 7. kit de ligare – rapid DNA ligation Kit (Roche) sau echivalent; 8. plăci cu mediu LB suplimentat cu ampicilină 50 mg/ml; 9. hotă sterilă cu flux de aer laminar. Mod de lucru: 1. în două microeprubete Eppendorf se prepară amestecurile de reacţie în vederea digestiei fragmentului de clonat şi a vectorului plasmidial pH5EX3, urmând indicaţiile de mai jos: Reactiv Tampon de reacţie specific, livrat cu enzima de restricţie Albumină serică bovină 10 µg/µl Soluţie ADN (fragment de clonat sau vector, după caz) Enzimă 1* Enzimă 2* Apă sterilă

Volum 2,5 µl 2,5 µl 10-20 µl 1 µl 1 µl până la 25 µl

* în cazul în care cele două enzime au condiţii optime de reacţie diferite, se realizează o digestie secvenţială; după acţiunea primei enzime, fragmentul tăiat este purificat prin electroforeză în gel de agaroză şi este supus unei noi reacţii de restricţie cu cea de-a doua enzimă.

186


2. se incubează amestecul de reacţie timp de patru ore la temperatura indicată de producător (în general, 37oC); 3. se separă fragmentul de clonat şi respectiv vectorul liniarizat din amestecul de reacţie prin electroforeză în geluri de agaroză, după care se purifică prin extragerea din gel urmând protocolul descris în subcapitolul IV. 4 – Izolarea ADN-ului din geluri de agaroză la pagina 103; 4. urmând indicaţiile producătorului trusei de reactivi pentru ligare Rapid DNA ligation Kit (Roche), se realizează ligarea fragmentului în vector; este indicat ca raportul dintre concentraţia fragmentului de clonat şi a vectorului să fie de 1:3; 5. după ligare, amestecul de reacţie poate fi utilizat direct pentru transformare; astfel, 200 µl celule preparate după indicaţiile producătorului (Roti®-Transform, Roth, Germania) se combină cu 10 µl amestec de ligare şi se incubează pe gheaţă timp de 30 minute; 6. amestecul de transformare se etalează pe plăcile cu mediu LB şi ampicilină preîncălzite la 37oC; după uscarea completă a mediului în exces, se incubează peste noapte la 37oC; prezenţa plasmidului pH6EX3 va determina rezistenţa microorganismului la antibioticul mai sus menţionat, astfel încât doar celulele care poartă plasmidul se vor dezvolta; 7. coloniile obţinute se verifică prin secvenţiere pentru a confirma prezenţa fragmentului inserat în mod corect în situsul multiplu de clonare.

VIII.2 Identificarea condiţiilor optime de supraexpresie a proteinelor recombinate De departe cel mai folosit sistem pentru supraexpresia şi obţinerea proteinelor recombinate este bacteria E. coli, datorită faptului că necesită pentru cultivare o dotare foarte simplă şi medii de cultură relativ ieftine. Supraexpresia unei proteine recombinate în E. coli este strict dependentă de vectorii plasmidiali de expresie. Gena clonată în aceşti vectori este pusă sub controlul unui promotor puternic ce permite o verificare foarte strictă a intensităţii şi momentului expresiei. Cei mai importanţi promotori utilizabili în Escherichia coli sunt lac, tacşi lacUV5 din sistemul T7 (13); mai multe detalii legate de avantajele şi dezavantajele fiecăruia pot fi găsite în lucrarea lui Makrides (1996) (14).


187

Un promotor corespunzător este absolut necesar, dar şi suficient pentru a asigura un nivel bun de expresie al unei proteine exogene. Alţi factori ce influenţează nivelul de expresie al unei proteine recombinate în E. coli sunt: 1. existenţa unui semnal de terminare a transcripţiei eficient, ce asigură o mai mare stabilitate a ARN-ului mesager; 2. procesele de proteoliză. E. coli prezintă numeroase sisteme proteazice localizate în citoplasmă, periplasmă sau asociate cu membranele externă şi internă care au rolul de a inactiva proteinele exogene (15). Utilizarea unor tulpini de E. coli modificate genetic precum BL21, alături de cultivarea la temperaturi scăzute, fuzionarea cu o proteină cunoscută ca fiind stabilă, fuzionarea cu o secvenţă ce dirijează proteina de interes spre spaţiul periplasmic unde există un număr mai mic de proteaze sunt câteva abordări care pot fi utilizate pentru a diminua neajunsurile fenomenelor de proteoliză (8). E. coli este un organism procariot şi din acest motiv utilizarea sa pentru producerea de proteine exogene prezintă o serie de dezavantaje. Celulele de E. coli nu pot procesa introni, nu pot realiza modificări post-transcripţionale complexe, precum glicozilarea, miristilarea, fosforilarea, nu pot forma un număr mare de punţi disulfidice şi nu prezintă sistemele specifice de tip chaperones necesare asamblării moleculelor multimere (14). Şansele de obţinere a unei proteine cu structură tridimensională normală, nativă atunci când este supraexprimată în E. coli cresc dacă: 1. organismul din care provine gena clonată este mai apropiat filogenetic de E. coli; 2. proteina are masă moleculară redusă, mai mică de 70 kDa; 3. nu are resturi de cisteină libere; 4. nu are mai mult de 3-4 punţi disulfidice intramoleculare; 5. nu necesită modificări posttranscripţionale pentru activitate sau solubilitate (16). În general, pentru a mări randamentul de purificare şi pentru a obţine rapid cantităţi mari de proteină pură este de dorit ca gena clonată să fie exprimată cât mai puternic. Prin utilizarea unor promotori puternici precum tac sau lac, nivelul de expresie atins este ridicat şi poate duce la destabilizarea întregului mecanism de sinteză proteică a celulei bacteriene. Ca măsură de apărare, celulele de E. coli depozitează proteina supraexprimată sub forma unor aşa numiţi corpi de incluziune. Aceştia reprezintă aglomerări masive cuprinzând, în general, o singură proteină

188


inactivă, depliată (17). Recent s-a demonstrat că, de fapt, deplierea nu este totală, ci proteina păstrează un anumit grad de organizare a structurii secundare (18). Esenţial pentru producerea proteinelor recombinate în E. coli este realizarea unui echilibru între intensitatea expresiei şi solubilitatea acestora. Acest echilibru poate fi controlat prin variaţia unor parametri de cultivare a microorganismului precum:  temperatura de cultivare – temperaturi mai joase frânează metabolismul microorganismului şi asigură nivele de expresie mai reduse; în general, se porneşte de la temperatura de 35oC şi se coboară gradual cu câte 2-3oC până la valoarea de 20oC; odată cu reducerea temperaturii perioada de incubare va trebui prelungită;  nivelul de agitare – în timpul cultivării agitarea poate să influenţeze solubilitatea proteinei supraexprimate prin nivelul de aerare al culturii care, la rândul său, influenţează viteza sintezei proteice; în general, se utilizează o viteză de rotaţie de 190 rpm care poate fi diminuată, după caz, până la 90 rpm;  nivelul de inducere a expresiei – este controlat prin concentraţia de agent inductor adăugat în mediu; pentru promotorii lac şi tac agentul inductor este un derivat artificial al lactozei, izopropil β-D-1-tiogalactopiranozid sau prescurtat IPTG (19); cel mai frecvent, concentraţia de IPTG utilizată în mediul de cultură este 1 mM, dar aceasta poate fi redusă până la 10 μM;  compoziţia mediului de cultură – adăugarea în mediul de cultură a unor agenţi care produc stres osmotic precum sorbitol sau betaină poate conduce în unele cazuri la îmbunătăţirea solubilităţii unor proteine exprimate sub formă de corpi de incluziune (20); de asemenea, s-a demonstrat că utilizarea unui mediu autoinductibil poate îmbunătăţi foarte mult nivelul de expresie şi solubilitatea unor proteine dificil de exprimat (21)(22).  tulpina de E. coli utilizată – distribuitori precum NEB, Fermentas sau Roche oferă o gamă variată de tulpini de E. coli modificate special pentru a permite expresia proteinelor exogene; astfel, tulpinaBL21 (DE3) este recunoscută ca fiind mai indicată pentru producerea de proteine recombinate decât XL1 Blue.


189

Principiul metodei: Tulpina purtând vectorul de expresie recombinat este cultivată până în faza de creştere exponenţială, după care se adaugă IPTG în mediu pentru inducerea expresiei genei clonate. După patru ore de cultivare, celulele sunt separate de mediul de cultură prin centrifugare şi lizate prin sonicare. Lizatul celular, alături de extractul proteic acelular obţinut prin centrifugare sunt apoi analizate prin SDS-PAGE pentru evaluarea nivelului de solubilitate a proteinei exprimate. Lipsa benzii corespunzătoare proteinei recombinate în extractul proteic acelular indică faptul că aceasta este insolubilă. Avantaje: 1. permite evaluarea nivelului de supraexpresie a unei proteine recombinate; 2. permite evaluarea solubilităţii unei proteine recombinate în condiţii de cultivare date. Limitări: – sistemul de detecţie descris în metoda prezentată nu este aplicabil pentru proteine al căror nivel de expresie este extrem de scăzut (proteina recombinată nu este vizibilă pe geluri SDS-PAGE); în acest caz se recomandă utilizarea unui alt sistem de detecţie – de exemplu tehnica Western-Blot (pentru detalii consultaţi capitolul XI. – Evidenţierea imunologică a proteinelor – tehnica Western-Blot, pagina 273). Materiale necesare: 1. placă Petri conţinând tulpina E. coli BL21 în care a fost introdus plasmidul pH6EX3 cu gena clonată; 2. mediu LB steril cu ampicilină 50 mg/ml, 2 flacoane Erlenmeyer


190

3. 4.

5. 6. 7. 8. 9.

de 500 ml cu câte 100 ml mediu şi o eprubetă de 50 ml cu 10 ml mediu; IPTG 1 M steril – se cântăresc 2,38 g IPTG şi se dizolvă în 10 ml apă distilată; soluţia se sterilizează prin filtrare, se împarte în volume de câte 1 ml şi se păstrează la temperatura de -20oC; soluţie tampon HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4 – pentru prepararea unui litru de soluţie tampon, într-un cilindru gradat de 1L se dizolvă în 500 ml apă distilată 9,52 g HEPES şi 29,2 g NaCl; se ajustează pH-ul la 7,4 după care se aduce la 1000 ml cu apă distilată; se păstrează la temperatura de 4oC termen nelimitat; hotă sterilă cu flux de aer laminar; incubator termostatat cu agitare, GFL Mini Incubator – 4010 sau echivalent; sonicator Sonics Vibra Cell V505 sau echivalent; centrifugă cu răcire; spectrofotometru şi cuve de spectrofotometrie.

Mod de lucru: 1. se inoculează cei 10 ml mediu LB care conţine ampicilină 50 mg/ml cu o singură colonie de E. coli de pe placa Petri; 2. eprubeta cu mediu inoculat se incubează peste noapte la 37oC sub agitare (190 rpm); 3. 1 ml din cultura bacteriană obţinută se foloseşte pentru inocularea celor două flacoane Erlenmeyer cu 100 ml mediu LB suplimentat cu ampicilină 50 mg/ml; flacoanele se incubează la 37oC şi 190 rpm până când densitatea optică a culturii la 600 nm atinge o valoare cuprinsă în intervalul 0,7-1; în general, această condiţie este îndeplinită după 2-3 ore de cultivare; 4. se induce expresia proteinei clonate prin adăugarea în unul din flacoane a 100 μl IPTG 1 M; cantitatea de IPTG poate varia, fiind unul dintre parametrii care trebuie stabiliţi pentru optimizarea expresiei; cel de-al doilea flacon rămâne neindus şi reprezintă controlul procesului de expresie;


191

5. flacoanele se incubează timp de 1-4 ore la 35oC şi 190 rpm; timpul de incubare şi temperatura şi viteza de agitare pot fi variate pentru îmbunătăţirea expresiei proteinei; 6. celulele se separă din mediul de cultură prin centrifugare la 4400xg, timp de 10 minute, la temperatura de 4oC după care se resuspendă în câte 10 ml soluţie tampon HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4; dacă celulele nu sunt procesate imediat, ele pot fi păstrate la temperatura de -20oC pentru o perioadă nedeterminată; 7. celulele se lizează prin sonicare, de două ori câte 2 minute, puls o secundă, pauză o secundă, putere 40%; 8. din lizatul celular obţinut se păstrează 100 μl şi restul se clarifică prin centrifugare la 14.000rpm, 30 min, 4oC; extractul clar obţinut reprezintă extractul proteic acelular; 9. atât lizatul celular cât şi extractul proteic acelular se analizează prin SDS-PAGE pentru cuantificarea nivelului de expresie şi solubilităţii proteinei supraexprimate; pentru detalii privind SDSPAGE şi cuantificarea gelurilor consultaţi metodele prezentate în cadrul capitolului X. – Separarea electroforetică a proteinelor, pagina 241; în general, proteina supraexprimată este uşor de identificat datorită nivelului de expresie foarte mare (Figura 24); în cazul în care nu este uşor reperabilă, se vor analiza comparativ fracţiile proteice din lizatul celular corespunzător culturii induse cu IPTG şi a celei neinduse.


192

M 1

3

2

4

M

1

2

3

4

A B

FIGURA 24. Evaluarea expresiei şi solubilităţii unor proteine recombinate în Escherichia coli.

A – proteina recombinată este puternic exprimată, dar se acumulează sub formă de corpi de incluziune; B – proteina recombinată este puternic exprimată şi este solubilă; M – marker de masă molară; 1 – lizat celular neindus cu IPTG; 2 – extract proteic acelular neindus cu IPTG; 3 – lizat celular indus cu IPTG; 4 – extract proteic acelular indus cu IPTG

VIII.3 Purificarea prin IMAC a proteinelor recombinate în condiţii native Principiul metodei Proteinele recombinate conţinând 6-8 resturi consecutive de histidină la unul din capete (C sau N terminal) sunt supra-exprimate în Escherichia coli şi purificate folosind un suport cromatografic ce conţine ioni Ni2+ imobilizaţi.


193

Avantaje: 

permite purificarea unor cantităţi de proteină de ordinul miligramelor;



permite obţinerea unui nivel de puritate foarte mare (90-95%) prin aplicarea unei singure etape de cromatografie;



proteinele purificate au structura tridimensională nativă şi funcţia intacte.

Limitări: 1. pentru a mări afinitatea cozii poli-His faţă de Ni2+, faza mobilă are un conţinut relativ mare de NaCl ceea ce poate duce la precipitarea unor proteine solubile prin fenomenul de saltingout(23); 2. eluţia se realizează cu imidazol în concentraţii relativ mari (200-500 mM) ceea ce poate duce la precipitarea proteinei izolate; de asemenea, imidazolul este un puternic inhibitor al unor enzime precum monoamin-oxidazele (24); datorită capacităţii sale de absorbţie la 280 nm, imidazolul nu permite măsurarea concentraţiei proteinelor prin spectrofotometrie UV-VIS. Materiale necesare: 1. placă Petri conţinând tulpina E. coli BL21 în care a fost introdus plasmidul pH6EX3 cu gena clonată; 2. mediu LB steril suplimentat cu ampicilină 50 mg/ml, două flacoane Erlenmayer de 5L cu 1000 ml mediu şi o eprubetă de 50 ml cu 10 ml mediu; 3. IPTG 1 M steril – se cântăresc 2,38 g IPTG şi se dizolvă în 10 ml apă distilată; soluţia se sterilizează prin filtrare, se împarte în volume de câte 1 ml şi se păstrează la temperatura de -20oC; 4. soluţie tampon HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4; pentru

194


prepararea unui litru de soluţie tampon, într-un cilindru gradat de 1L se dizolvă în 500 ml apă distilată 9,52 g HEPES şi 29,2 g NaCl; se ajustează pH-ul la 7,4 după care se aduce la 1000 ml cu apă distilată; se păstrează la 4oC timp nelimitat; 5. hotă sterilă cu flux de aer laminar; 6. incubator termostatat cu agitare GFL Mini Incubator – 4010 sau echivalent; 7. sonicator Sonics Vibra Cell V505 sau echivalent; 8. centrifugă cu răcire; 9. spectrofotometru şi cuve de spectrofotometrie; 10. suport cromatografic Ni-NTA Fast Flow sau High Performance Ni Sepharose (Amersham Biosciences); suportul se păstrează sub forma unei suspensii 50% în etanol 20%. În general, suportul cromatografic este livrat de producător gata de utilizare (culoare verde) şi poate fi reutilizat de câteva zeci de ori; înainte de reutilizare, este recomandată eliminarea completă a ionilor de nichel şi reîncărcarea cu nichel (regenerarea suportului cromatografic); unii distribuitori pun la dispoziţie coloane cromatografice pre-împachetate care pot fi utilizate fie manual, fie cuplate la sisteme FPLC de genul AKTA (Amersham Biosciences, Germania); 11. soluţii pentru regenerarea şi încărcarea suportului cromatografic cu Ni: – soluţie EDTA 0,05 mM, NaCl 0,5 M – se dizolvă 1,4 g EDTA şi 2,92 g NaCl în apă distilată şi se aduc la 100 ml într-un balon cotat; – soluţie NaCl 0,5 M – se dizolvă 2,92 g NaCl în apă distilată şi se aduc la 100 ml într-un balon cotat; – soluţie NaCl 1 M – se dizolvă 11,6 g NaCl în apă distilată şi se aduc la 100 ml într-un balon cotat; – soluţie NaOH 1 M – se dizolvă 4 g NaOH în apă distilată şi se aduc la 100 ml într-un balon cotat; – soluţie NiCl2 150 mM – se dizolvă 1,95 g NiCl2 (sau 3,5 g NiCl2 x 6H2O) în apă distilată şi se aduc la 100 ml într-un balon cotat; 10. coloniţe din plastic sau sticlă pentru cromatografie; 11. soluţie stoc imidazol 1 M în HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4 – se dizolvă 6,87 g imidazol în 50 ml HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4; se corectează pH-ul dacă este necesar şi se aduce


195

la 100 ml cu HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4; 12. soluţii pentru spălări şi eluţie imidazol 10 mM, 40 mM, 80 mM, 200 mM şi 500 mM în HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4– soluţiile pot fi preparate în prealabil, dar şi extemporaneu, urmând indicaţiile de mai jos: Concentraţie imidazol (mM)

Volum soluţie imidazol 1 M (ml)

Volum HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4. (ml)

Volum final (ml)

10

0,6

59,4

60

40

2,4

57,6

60

80

4,8

55,2

60

200

0,8

9,2

10

500

5

5

10



facultativ– pompă peristaltică sau seringi din plastic de volum mare (25-50 ml).

Mod de lucru: I. Obţinerea extractului proteic acelular:  se inoculează cei 10 ml mediu LB, 50 mg/ml ampicilină cu o singură colonie de E. coli de pe placa Petri;  eprubeta se incubează peste noapte la 37oC şi 190 rpm;  cultura bacteriană obţinută se foloseşte pentru inocularea flaconului Erlenmayer cu 1L mediu LB, (50 mg/ml ampicilină); flaconul se incubează la 37oC şi 190 rpm până când densitatea optică a culturii la 600 nm atinge o valoare cuprinsă între 0,7-1; în general această condiţie este îndeplinită după 2-3 ore de cultivare;  se induce expresia proteinei clonate prin adăugarea în unul din flacoane a 1 ml IPTG 1 M (sau cantitatea stabilită în etapa anterioară);


196  





flaconul se incubează timp de 1-4 ore la 35oC şi 190 rpm; celulele se separă din mediul de cultură prin centrifugare la 4400 x g timp de 10 minute la 4oC, după care se resuspendă în 50 ml soluţie tampon HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4; dacă celulele nu sunt procesate imediat, ele pot fi păstrate la temperatura de -20oC pentru o perioadă nedeterminată; celulele se lizează prin sonicare de două ori câte 2 minute, puls o secundă, pauză o secundă, putere 40%; adăugarea în etapa anterioară a DN-azei I sau a benzoazei (1 μg/ml) în soluţia tampon de resuspensie diminuează foarte mult vâscozitatea lizatului celular; lizatul celular obţinut se clarifică prin centrifugare la 14.000 rpm, 30 min, 4oC; supernatantul clar obţinut reprezintă extractul proteic acelular.

II. Pregătirea coloanei cromatografice Coloana cromatografică este reprezentată de o coloniţă din plastic sau sticlă în care este amplasat suportul cromatografic. În general, coloniţa are dimensiuni mult mai mari decât volumul de suport cromatografic. Spălările coloanei şi separarea cromatografică propriu-zisă se pot realiza sub influenţa câmpului gravitaţional sau, mai rapid, prin conectarea la capătul de evacuare a coloniţei a unei pompe peristaltice sau a unei seringi. Pentru pregătirea coloanei cromatografice se parcurg următoarele etape:  se pipetează în coloniţa din sticlă sau plastic un volum de 2 ml apă şi se marchează nivelul; volumul de 2 ml reprezintă volumul coloanei cromatografice (CV, engl. Column Volume). Capacitatea de legare a Ni-NTA este de 5-10 mg proteină/ ml Ni-NTA, deci un volum de 2 ml permite purificarea unei cantităţi de până la 20 mg proteină; 

după evacuarea apei, se pipetează un volum de suspensie de răşină Ni-NTA suficient pentru ca, după scurgerea etanolului 20%, răşina să se afle la nivelul marcat în etapa anterioară;



dacă răşina Ni-NTA este reutilizată, aceasta trebuie regenerată prin spălări succesive cu reactivii specificaţi în schema următoare:


197

Soluţie

Volum

EDTA 0,05 M, NaCl 0,5M*

10 x CV (20 ml)

NaCl 0,5M

2-3 x CV (4-6 ml)

NaCl 1 M**

1 x CV (2 ml)

NaOH 1 M

10 x CV (20 ml)

Etanol 70%

10 x CV(20 ml)

Apă distilată

10 x CV (20 ml)

NiCl2 150 mM

4 x CV (8 ml)

*suportul cromatografic trebuie să devină alb soluţie este menţinută în contact cu coloana timp de 15-20 minute la temperatura camerei ***suportul cromatografic trebuie să devină verde-albăstrui la finalizarea acestei etape **această

11. după regenerare sau dacă răşina este nouă, aceasta se spală cu un volum de 10 x CV (20 ml) apă distilată şi se echilibrează cu aceeaşi soluţie tampon în care au fost resuspendate celulele. III. Separarea cromatografică propriu-zisă: 1. este indicat ca toate operaţiile descrise în cele ce urmează să fie realizate la temperatura de 4oC. Dacă acest lucru nu este posibil, soluţiile utilizate pentru purificare şi cele ce conţin proteina de purificat vor fi menţinute pe gheaţă. 2. extractul proteic acelular se pipetează în coloniţa din plastic, peste răşina Ni-NTA; viteza de curgere prin coloană trebuie să fie redusă şi de aceea, dacă se utilizează o pompă peristaltică, aceasta se deconectează; 3. coloana se spală pentru eliminarea proteinelor legate nespecific urmând indicaţiile din schema următoare: Soluţie

Volum

HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4

30 x CV (60 ml)

Imidazol 10 mM în HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4

30 x CV (60 ml)


198

Imidazol 40 mM în HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4

30 x CV (60 ml)

Imidazol 80 mM în HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4*

10 x CV (20 ml)

*este indicată colectarea şi fracţionarea efluentului din această etapă deoarece unele proteine mai slab legate sunt eluate la această concentraţie de imidazol

4. eluarea proteinelor se realizează prin spălarea cu 10 x CV imidazol 200 mM şi apoi 500 mM în HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, pH 7,4; Efluentul se colectează în fracţiuni de câte 1 ml şi se analizează în vederea determinării conţinutului de proteine prin SDS-PAGE. În mod obişnuit o spălare cu imidazol 200 mM este suficientă pentru a elua majoritatea proteinelor recombinate cu coadă poli-His. Pentru a preîntâmpina precipitarea şi a facilita crio-conservarea probelor, este indicată adăugarea în eprubetele de colectare glicerol într-o concentraţie finală de aproximativ 1%. Dacă proteina purificată este instabilă la concentraţii mari de săruri, imidazolul şi NaCl din soluţia tampon pot fi eliminate prin dializă, utilizând dispozitive centrifugale de tip Centricon, sau cromatografie de filtrare prin gel. De asemenea, este indicat ca pe parcursul purificării să fie prelevate probe pentru a fi evaluate prin SDS-PAGE.

VIII.4 Purificarea prin IMAC a proteinelor recombinate în condiţii denaturante Principiul metodei Proteinele recombinate ce conţin 6-8 resturi consecutive de histidină la unul din capete (C sau N terminal) supra-exprimate în Escherichia coli sub formă de corpi de incluziune sunt separate iniţial prin centrifugare şi spălări succesive după care sunt solubilizate prin folosirea unor agenţi denaturanţi precum ureea. Chiar şi în această formă denaturată, moleculele proteice recombinate au afinitate faţă de Ni şi pot


199

fi purificate folosind un suport cromatografic ce conţine ioni Ni2+ imobilizaţi. Avantaje: 1. permite purificarea unor cantităţi mari de proteină, de ordinul zecilor de miligrame; 2. permite obţinerea unui nivel de puritate foarte ridicat (90-95%) prin aplicarea unei singure etape de cromatografie. Limitări: 1. proteinele purificate în aceste condiţii sunt denaturate, structura lor secundară este alterată şi nu mai prezintă funcţiile fiziologice normale; aceste proteine pot fi utilizate pentru obţinerea de anticorpi sau pot fi repliate in-vitro; pentru mai multe detalii despre acest proces recomandăm consultarea lucrărilor lui Li et al. (25), Surinder et Amulya (26) şi Tsumoto et al. (27). Materiale necesare: 1. materiale de le punctele 1-12 din protocolul anterior; 2. soluţie tampon de denaturare HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, guanidină-HC l6 M – pentru prepararea a 1 L, într-un cilindru gradat de 1 L se dizolvă 9,52 g HEPES, 29,2 g NaCl şi 570 g guanidină-HCl; soluţia se păstrează la temperatura camerei timp nelimitat; ca alternativă, drept agent denaturant se poate utiliza ureea de concentraţie 8 M. 3. reactivii de la punctele 13-14 din protocolul anterior se prepară în acelaşi mod, dar în soluţie HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, guanidină-HCl 6 M; 4. HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, Triton X 10%.

200


Mod de lucru: I. Solubilizarea corpilor de incluziune: Se urmează etapele 1-8 din protocolul anterior. Supernatantul din ultima etapă se aruncă, iar depozitul se spală cu în HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, Triton X 10% de trei ori. Depozitul obţinut după ultima spălare se resuspendă în soluţie tampon de denaturare HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, guanidin-HCl 6 M. Denaturarea proteinei duce la solubilizarea corpilor de incluziune. Este indicat ca procesul să se realizeze lent, sub agitare continuă timp de cel puţin patru până la 24 ore. După solubilizare, se centrifughează la 14.000rpm, 30 min. Supernatantul obţinut conţine proteina recombinată solubilizată. II. Pregătirea coloanei cromatografice şi III. Separarea cromatografică propriu-zisă se realizează identic ca şi în metodologia descrisă pentru IMAC în condiţii native, cu observaţia că soluţia tampon HEPES 40 mM, NaCl 500 mM pH 7,4 este înlocuită cu soluţia tampon HEPES 40 mM, NaCl 500 mM, guanidină-HCl 6M în absolut toţi reactivii.

VIII. 5 Determinarea maselor moleculare native utilizând cromatografia de filtrare prin gel (GF) Datorită condiţiilor denaturante folosite în SDS-PAGE, metoda de determinare a masei moleculare relative descrisă în subcapitolul Fotografierea gelurilor şi analiza imaginilor. Stabilirea masei moleculare relative, pagina 264, permite precizarea dimensiunilor unei catene de aminoacizi. Deoarece, de cele mai multe ori o catenă de aminoacizi este în mod direct asociată cu o proteină, masa moleculară relativă a devenit un parametru obligatoriu pentru caracterizarea unei asemenea molecule. Masa moleculară relativă nu surprinde însă moleculele proteice în forma lor nativă, fiziologic normală. Mai mult decât atât, unele proteine au o structură multimeră, fiind alcătuite din două sau mai multe catene identice (proteine homomere) sau diferite (proteine heteromere) de


201

aminoacizi. În cazul SDS-PAGE, aceste molecule sunt denaturate în catenele componente şi vor migra sub forma uneia (proteinele hemomere) sau a mai multor benzi (proteinele heteromere). Masa moleculară nativă este un parametru care încearcă să surprindă dimensiunile moleculelor proteice în forma lor normală, nativă, putând astfel să precizeze şi starea de oligomerizare a acestora. De-a lungul timpului a fost utilizat un număr variat de metode de măsurare a masei moleculare native, metode care au la bază ultracentrifugarea, cromatografia sau metode de spectrometrie. Cea mai simplă este însă metodă cromatografică care are la bază principiul de separare care presupuneexcluderea din gel în funcţie de dimensiuni(engl. size-exclusion). În funcţie de masă, moleculele de dimensiuni diferite vor fi reţinute diferenţiat la traversarea unui gel cu pori de dimensiuni fixe, astfel încât moleculele mari, care nu pot pătrunde prin pori, vor avea un grad mai mic de reţinere, în timp ce moleculele mici vor pătrunde prin porii gelului şi se vor ,,pierde”, fiind astfel foarte mult întârziate. Deşi discutăm despre cromatografia de excludere din gel în funcţie de masă în strânsă corelaţie cu moleculele proteice, tehnica este aplicabilă pentru o gamă largă de molecule de dimensiuni variate. Pe lângă măsurarea maselor, cromatografia de excludere din gel permite de asemenea şi desalinizarea şi fracţionarea extractelor proteice. Mai multe detalii legate de aceste aplicaţii pot fi găsite în excelenta lucrare coordonată de Wu, 1999 (28). Dacă faza mobilă este reprezentată de soluţii apoase, cromatografia de excludere din gel în funcţie de dimensiuni poartă numele de filtrare prin gel (engl. Gel Filtration, GF), aceasta fiind denumirea sub care metoda s-a consacrat în domeniul determinării maselor proteinelor. Dotarea tehnică necesară pentru GF În principiu, determinarea masei moleculare a unei proteine utilizând metoda de filtrare prin gel presupune aplicarea proteinei pe o coloană cromatografică de gel-filtrare calibrată în prealabil şi măsurarea timpului (sau volumul de fază lichidă) necesar pentru ca proteina să străbată coloana. Momentul eluării din coloană este detectat prin fracţionarea eluentului şi analiza conţinutului de proteine al fiecărei fracţii. Într-o coloană cromatografică de gel-filtrare, faza mobilă parcurge coloana sub influenţa gravitaţiei, colectarea fracţiilor făcându-se manual. Analiza conţinutului de proteine a fiecărei fracţii se realizează prin una


202

din metodele cunoscute (Bradford, Lowry sau spectrofotometrie UV-VIS). În ultimul timp se preferă însă conectarea coloanei cromatografice la un sistem dedicat ce permite un control mult mai bun al debitului fazei mobile şi oferă de asemenea un sistem de detecţie mult mai precis şi mai rapid. Cel mai simplu sistem cromatografic este alcătuit din (Figura 25): Pompă

Injector

P

I

Rezervor cu soluţie M fază mobilă

C Coloană

D

Detector

R Recorder

F Colector de fracţii FIGURA 25. Sistem cromatografic automat utilizat pentru gel-filtrare (după Hagel, 2001) (29) 1. rezervor cu soluţie reprezentând faza mobilă (M) – capacitatea minimă a rezervorului este dată de dimensiunile coloanei cromatografice, fiind necesar ca acesta să conţină suficientă fază


203

mobilă pentru a permite echilibrarea coloanei şi separarea cromatografică propriu-zisă; 2. pompă (P) – are rolul de a asigura un debit constant în timpul separării; pentru GF este suficientă o pompă peristaltică simplă, deoarece presiunile atinse în coloană sunt mici; aplicaţiile mai complexe necesită o pompă cu piston sau chiar un sistem format din două sau patru pompe cu piston; 3. injector (I) – este alcătuit dintr-o valvă şi un rezervor de capacitate cunoscută (cel mai frecvent sub forma unei spirale din tub transparent); proba de analizat se introduce în rezervor la începutul separării şi este injectată în coloană la momentul stabilit de utilizator; 4. coloana cromatografică (C) – este elementul în care se realizează propriu-zis separarea; coloanele cromatografice pentru gel-filtrare pot fi achiziţionate preîmpachetate şi gata de utilizare sau pot fi pregătite în laborator utilizând suportul cromatografic dorit; în alegerea suportului cromatografic şi coloanei trebuie să se ţină cont, în primul rând, de intervalul de dimensiuni în care se află proteina investigată (Tabelul 12). TABEL 12. Tipuri de suporturi cromatografice şi coloane ce pot fi utilizate în gel filtrare şi intervalul de dimensiuni pe care pot fi utilizate (după Hagel, 2001) (29) Interval de aplicabilitate (Da)

Producător/Distribuitor

Toyopearl HW 40S

100-10.000

Toso Haas

Superdex 30 prep grade

200-10.000

Amersham Pharmacia Biotech

Toyopearl HW 50S

500-80.000

Toso Haas

Sephacryl S-100 HR

1.000-100.000


Toyopearl HW 55S

1.000-700.000

Toso Haas


3.000-70.000


Sephacryl S-200 HR

5.000-250.000


Superose 6 prep grade

5.000-5.000.000



10.000-600.000


Sephacryl S-300 HR

10.000-1.500.000


Tip de suport cromatografic/coloană Suport cromatografic


204

Tip de suport cromatografic/coloană

Interval de aplicabilitate (Da)


Sephacryl S-400 HR

20.000-8.000.000

Amersham Pharmacia

Sephacryl S-500 HR

20.000-30.000.000


Toyopearl HW 65S

50.000-5.000.000

Toso Haas

HiLoad Superdex 30 prep grade

200-10.000


TSK SW 2000

500-60.000

Toso Haas

HiLoad Sephacryl S-100 HR

1.000-100.000


TSK SW 3000

1.000-300.000

Toso Haas

Protein-Pak 60

2.000-30.000

Waters

Superdex 75 HR 10/30

3.000-70,.000


HiLoad Superdex75 prep grade

3.000-70.000


Bio-Sil SEC 125

5.000-100.000

Bio-Rad

G2000SWXL

5.000-150.000

Toso Haas


5.000-250.000


TSK SW 4000

5.000-1.000.000

Toso Haas

Superose 6 HR 10/30

5.000-40.000.000


Protein-Pak 125

10.000-80.000

Waters

Glass GF-250

10.000-250.000

DuPont

Bio-Sil SEC 250

10.000-300.000

Bio-Rad

G3000SWXL

10.000-500.000

Toso Haas

Superdex 200 HR 10/30

10.000-600.000


HiLoad Superdex 200 prep grade

10.000-600.000



10.000-1.500.000


Coloane preîmpachetate


205

Tip de suport cromatografic/coloană

Interval de aplicabilitate (Da)


G4000SWXL

20.000-10.000.000

Toso Haas

Glass GF-450

25.000-900.000

DuPont

5.

6.

7.

detector (D) – permite monitorizarea în timp real a concentraţiei de proteine din faza mobilă la ieşirea din coloana cromatografică şi detecţia momentului în care proteina investigată este eluată; sistemele mai vechi (ex. Pharmacia LKB) au un detector care funcţionează la o singură lungime de undă (280 nm); sistemele mai noi (ex. AKTA, Amersham Biosciences) permit monitorizarea fazei mobile simultan la un număr mai mare de lungimi de undă şi pot conţine şi sisteme de detecţie suplimentare care evaluează indicatori precum conductibilitatea sau indicele de refracţie; colector de fracţii (F) – permite colectarea fracţionată automată în eprubete separate a eluentului de pe coloană; în funcţie de specificaţiile colectorului, acesta poate realiza fracţionarea în raport cu volumul (de exemplu 1 ml/eprubetă) sau timpul, în acest ultim caz volumul colectat fiind dependent de debitul fazei mobile; sistemele cromatografice moderne prezintă un grad foarte mare de automatizare, în sensul că se activează şi colectează, de exemplu, doar un anumit vârf (peak); aparat de înregistrare (recorder (R)) – are rolul de a prelua şi prezenta grafic valorile înregistrate de către detector; informaţiile sunt prezentate sub forma unui grafic numit cromatogramă, pe abscisă (axa Ox) fiind reprezentat timpul (sau volumul), iar pe ordonată (axa Oy) extincţia fazei mobile; în cazul sistemelor moderne de cromatografie, sistemul de înregistrare este înlocuit de software-ul de control al întregului sistem cromatografic; acesta permite nu doar monitorizarea, ci şi ajustarea în timp real a parametrilor separării.


206

Determinarea maselor moleculare native utilizând cromatografia de filtrare prin gel Principiul metodei Proteina de analizat este aplicată la un debit constant pe o coloană cromatografică de gel filtrare calibrată în prealabil. Timpul de retenţie (sau volumul de retenţie) necesar pentru ca proteina să străbată coloana este măsurat şi comparat cu valorile obţinute pentru o serie de proteine standard ale căror mase native sunt cunoscute. Avantaje: 1. permite stabilirea maselor moleculare native ale proteinelor; 2. dacă există informaţii legate de masa moleculară relativă, metoda poate fi utilizată pentru stabilirea gradului de oligomerizare a proteinelor multimere; 3. poate fi utilizată şi ca etapă finală în purificarea unei proteine. Limitări: 

necesită cantităţi relativ mari de proteină; cantitatea minimă de proteină care trebuie aplicată pe coloană depinde de tipul de coloană şi de sistemul de detecţie utilizat.

Materiale necesare: 1. soluţie tampon HEPES 40 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4 – pentru prepararea unui litru de soluţie tampon, într-un balon cotat de 1000 ml se dizolvă în 500 ml apă distilată 9,52 g HEPES şi 5,84 g NaCl; se ajustează pH-ul la 7,4 după care soluţia se aduce la 1000 ml cu apă distilată; pentru prelungirea duratei de viaţă a coloanei cromatografice


207

este foarte important ca soluţia să se filtreze printr-un filtru de 22 μm şi să fie degazificată; soluţia se păstrează la 4oC timp nelimitat; 2. coloană HiLoadSuperdex 200 PrepGrade 16/20 (Amersham, Elveţia) sau echivalent; volumul coloanei menţionate este de 128,8 ml (CV); 3. sistem cromatografic FPLC LKB Pharmacia sau echivalent echipat cu injector cu rezervor de 0,5 ml, sistem de detecţie UV-VIS (280 nm) şi sistem de înregistrare (recorder); 4. 1 ml soluţie conţinând proteina de analizat la o concentraţie de 3 mg/ml. Mod de lucru: 1. este indicat ca toate operaţiile descrise în cele ce urmează să fie realizate la temperatura de 4oC; din acest motiv sistemul cromatografic se amplasează într-o cameră termostatată la 4oC sau într-o vitrină frigorifică; dacă nu este posibil, rezervorul cu faza mobilă va fi menţinut pe gheaţă; 2. se conectează coloana cromatografică la sistemul cromatografic, urmând indicaţiile producătorului; pentru mărirea duratei de viaţă a coloanei este indicat ca racordarea să se realizeze cu atenţie, în aşa fel încât să nu pătrundă bule de aer în coloană; 3. se spală coloană cu 2 x CV apă distilată la un debit de 2 ml/ min; 4. se programează sistemul cromatografic pentru o aplicaţie care să conţină etapele din schema care urmează: Etapă

Lungime

Debit(ml/min)

Echilibrare coloană

1 CV

2

Injectare probă pe coloană

600 μl

1

Eluţie izocratică

1 CV

1

5. se injectează cu atenţie 1 ml probă (concentraţie 3 mg/ml) în rezervorul injectorului;

208


6. se porneşte aplicaţia dezvoltată anterior; dacă sistemul este complet automatizat, injectarea probei se va realiza automat fără a fi necesară intervenţia utilizatorului; în cazul sistemelor mai vechi, injecţia se realizează manual prin operarea valvei de injecţie în momentul finalizării etapei de echilibrare; 7. după finalizarea separării cromatografice se identifică de pe cromatogramă timpul (sau volumul) de retenţie al proteinei investigate care va fi utilizat pentru calcularea masei moleculare native utilizând curba de calibrare (pentru detalii consultaţi subcapitolul Calibrarea coloanei de GF şi calcularea maselor molare, pagina 200); 8. coloana cromatografică se spală cu 2 x CV apă distilată; Pentru perioade scurte, de ordinul zilelor, coloana poate fi păstrată în apă distilată la temperatura de 4oC; pentru perioade mai îndelungi de depozitare, este indicată spălarea şi echilibrarea coloanei cu etanol 20%.

Calibrarea coloanei de GF şi calcularea maselor molare Înainte de utilizare, coloana şi sistemul cromatografic trebuie calibrate folosind un set de proteine standard. Unii distribuitor pun la dispoziţie seturi de proteine standard utilizabile pentru anumite intervale de masă. Calibrarea propriu-zisă se realizează prin injectarea a 600 μl soluţie conţinând 3 mg/ml din fiecare proteină standard în coloana cromatografică şi realizarea unei curbe de etalonare. Deşi unii autori indică utilizarea directă a volumului de eluţie pentru realizarea curbei de etalonare (30), cel mai frecvent se foloseşte unu parametru derivat, Kav (fracţia din faza staţionară care este disponibilă pentru difuzia speciei date) (31), calculat după formula:


209

unde: Ve– volumul de eluţie Vo – volumul liber Vt – volumul fazei imobile Valorile parametrului derivat Kav se reprezintă într-un sistem de axe semilogaritmic. Pe axa OY (normală) este plasat parametrul Kav şi pe axa OX (logaritmică) masele moleculare ale proteinelor standard utilizate (32). În Tabelul 13 şi Figura 26 sunt prezentate o serie de rezultate tipice obţinute într-o separare cromatografică folosind coloana HiLoadSuperdex 200 PrepGrade 16/20 conectată la un sistem cromatografic AKTA Explorer şi proteinele standard din trusa de calibrare pentru GF produsă de Amersham Biosciences, Elveţia. TABELUL 13. Rezultate tipice obţinute la calibrarea coloanei de GF folosind diverse standarde proteice Proteină standard Blue-Dextran Feritină Catalază Aldolază Albumină Ovalbumină Ribonuclează *

Masă moleculară Volum de eluţie (kDa) (ml) – 44,8500 440 46,1690 232 48,3200 158 54,5600 67 64,7000 43 80,4980 17.4 96,2200

Kav Vo* 0,0173325 0,0455979 0,1275953 0,2608410 0,4684363 0,6750329

Blue-dextran-ul are masa moleculară de 200000 kDa şi a fost utilizat pentru determinarea volumului liber Vo


210

1000

y =314.44e-4.4433x

kDa

100

10

1

0

0,2

Kav

0,4

0,6

0,8

FIGURA 26. Curbă de etalonare tipică obţinută pentru coloana HiLoadSuperdex 200 PrepGrade 16/20 conectată la un sistem cromatografic AKTA Explorer folosind valorile din Tabelul 13. Bibliografie 1. Terpe, K. (2003) –Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems., Applied microbiology and biotechnology, 60, 523-33. 2. LaVallie, E. R. (2001) –Production of recombinant proteins in Escherichia coliinCurrent Protocols in Protein Science(John E. Coligan Ed.), Wiley, 3. Janknecht, R., de Martynoff, G., Lou, J., Hipskind, R. A., Nordheim, A., Stunnenberg, H. G. (1991) –Rapid and efficient purification of native histidine-tagged protein expressed by recombinant vaccinia virus., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 88, 8972-6. 4. Knapp, J. E., Carroll, D., Lawson, J. E., Ernst, S. R., Reed, L. J., Hackert, M. L. (2000) –Expression, purification, and structural analysis of the trimeric form of the catalytic domain of the Escherichia coli dihydrolipoamide succinyltransferase., Protein Science, 9, 37-48.


211

5. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. (1975) –Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation, Nature, 258, 598-599. 6. Twyman, R. (1999) –Advanced Molecular Biology: A Concise Reference, p 499. BIOS Scientific Publishers. 7. Griffiths, A. J., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. (2000) –An Introduction to Genetic Analysis, p 250-375. W. H. Freeman. 8. Reece, R. J. (2004) –Analysis of Genes and Genomes, p 490. Wiley. 9. Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C. A., Krieger, M., Scott, M. P., Zipursky, L., Darnell, J. (2003) –Molecular Cell Biology, p 361-380. W. H. Freeman. 10. Twyman, R. (1998) –Advanced molecular biology: a concise reference. Bios Scientific Publishers, Oxford UK. 11. Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. (2003) –NEBcutter: a program to cleave DNA with restriction enzymes, Nucleic Acids Research, 31, 3688-3691. 12. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) –Molecular Cloning - A Laboratory Manual, p 1.21-1.53. Cold Spring Harbour Laboratory Press. 13. de Boer, H. A., Comstock, L. J., Vasser, M. (1983) –The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 80, 21-5. 14. Makrides, S. C. (1996) –Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli., Microbiological reviews, 60, 512-38. 15. Gottesman, S. (1996) –Proteases and their targets in Escherichia coli., Annual review of genetics, 30, 465-506. 16. Higgins, S. J., Hames B.D. (1999) –Protein Expression: A Practical Approach (Practical Approach Series), p 304. Oxford University Press, USA. 17. Creighton, T. E. (1999) –Encyclopedia of Molecular Biology (Wiley Biotechnology Encyclopedias), p 2878. Wiley-Interscience. 18. Khan, R. H., Rao, K. B., Eshwari, A. N., Totey, S. M., Panda, A. K. – Solubilization of recombinant ovine growth hormone with retention of native-like secondary structure and its refolding from the inclusion bodies of Escherichia coli., Biotechnology progress, 14, 722-8.

212


19. Hansen, L. H., Knudsen, S., Sorensen, S. J. (1998) –The Effect of the lacY Gene on the Induction of IPTG Inducible Promoters, Studied in Escherichia coli and Pseudomonas fluorescens, Current Microbiology, 36, 341-347. 20. Blackwell, J. R., Horgan, R. (1991) –A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form, FEBS Letters, 295, 10-12. 21. Studier, F. W. (2005) –Protein production by auto-induction in high density shaking cultures., Protein expression and purification, 41, 207-34. 22. Mihasan, M., Ungureanu, E., Artenie, V. (2007) –Optimum parameters for overexpression of recombinant protein from tac promotors on autoinducible medium, Romanian Biotechnological Lettters, 12, 3473-3482 . 23. Miller, S. A., Dykes, D. D., Polesky, H. F. (1988) –A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells., Nucleic acids research, 16, 1215. 24. Ozaita, A., Olmos, G., Boronat, M. A., Lizcano, J. M., Unzeta, M., García-Sevilla, J. A. (1997) –Inhibition of monoamine oxidase A and B activities by imidazol(ine)/guanidine drugs, nature of the interaction and distinction from I2-imidazoline receptors in rat liver., British Journal of Pharmacology, 121, 901-12. 25. Li, M., Su, Z.-G., Janson, J.C. (2004) –In vitro protein refolding by chromatographic procedures., Protein expression and purification, 33, 1-10. 26. Singh, S. M., Panda, A. K. (2005) –Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins., Journal of bioscience and bioengineering, 99, 303-10. 27. Tsumoto, K., Ejima, D., Kumagai, I., Arakawa, T. (2003) –Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies, Protein Expression and Purification, 28, 1-8. 28. Williams, A., Hagel, L. (1999) –Column Handbook for Size Exclusion Chromatography in Column Handbook for Size Exclusion Chromatography (Chi-san, W., Ed.), p 27-74. Elsevier. 29. Hagel, L. (2001) –Gel-filtration chromatography., Current protocols in protein science, John E. Coligan et al.Chapter 8, Unit 8.3. 30. Scopes, R. (2000) –Protein Separation in Encyclopedia of Separation Science - Level II: Methods and Instrumentation (Wilson, I., Ed.), p 405-410. Academic Press.


213

31. Ranadive S.A., Pipkin J.D., Varia S.A., N. H.C., Barry E.P., Porubcan M., Unger S.E., McCormick T.J. (1995) –Formation, isolation and identification of oligomers of aztreonam, European Journal of Pharmaceutical Sciences. Elsevier 3, 11. 32. Dondos, A. (2006) –Applicability of the modified universal calibration of gel permeation chromatography on proteins., Journal ofchromatography, 1127, 183-6.

IX. DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI PROTEINELOR Gradul de reuşită al oricărui experiment ce implică lucrul cu moleculele proteice depinde, de cele mai multe ori, de specificitatea şi sensibilitatea metodelor utilizate pentru cuantificarea proteinelor (1). Până la momentul actual au fost descrise numeroase metode de măsurare a concentraţiei proteinelor dintr-o soluţie, metode ce utilizează proprietatea acestora de a absorbi în domeniul UV, de a participa la reacţii de culoare sau de a încorpora diferiţi compuşi radioactivi. Alegerea metodei de utilizat depinde, în general, de proprietăţile moleculei proteice de interes şi de compoziţia soluţiei tampon în care se află aceasta. Proteina de interes sau compoziţia probei sunt parametri importanţi, deoarece o proteină bogată în arginină, spre exemplu, va reacţiona foarte puternic cu reactivul Bradford, ceea ce va duce la obţinerea unei concentraţii mari în mod eronat. Pentru aceste proteine este indicată metoda Lowry sau BCA. De asemenea, o proteină bogată în cisteină va conduce la rezultate anormal de mari prin folosirea metodei cu BCA, metodele Bradford sau Lowry putând fi utilizate fără nici o problemă. Compoziţia soluţiei tampon în care se află proba de analizat poate avea o influenţă foarte mare asupra rezultatelor, prin interferenţele pe care le introduce. De exemplu, metoda Lowry, deşi are o sensibilitate foarte bună, nu permite utilizarea unor compuşi comuni precum EDTA (acid diaminotetracetic). Metoda cu BCA este susceptibilă la interferenţe din partea agenţilor reducători, iar reactivul Bradford dă reacţie de culoare cu o listă lungă de detergenţi. O prezentare destul de explicită a compuşilor care interferă cu metodele comune de dozare a proteinelor este realizată de Coligan (1). Alegerea metodei optime de dozare a proteinelor trebuie, de asemenea, să ţină cont de: volumul de probă disponibil, domeniul de concentraţie preconizat, specificitatea dorită şi uşurinţa în realizarea măsurătorilor (aparatură disponibilă, timp necesar).


216

IX.1 Determinarea concentraţiei proteinelor prin spectroscopie UV Această metodă de determinare a concentraţiei proteice se bazează pe proprietatea proteinelor de a absorbi în domeniul UV, cu două maxime distincte, unul la 200 nm şi celălalt la 280 nm. Maximumul de absorbţie la 200 nm se datorează legăturilor peptidice. Moleculele proteice conţin un număr mare de legături de acest tip şi în consecinţă absorb foarte puternic la această lungime de undă. Din păcate însă, orice alt compus care conţine legături de tipul C=N, C=O, C=C absoarbe în acest domeniu, ceea ce face dificilă utilizarea lungimii de undă de 200 nm pentru cuantificarea proteinelor. Metoda este însă aplicabilă cu anumite constrângeri în cazul proteinelor care absorb slab la 280 nm şi poartă numele de metoda Scopes (2). Maximul de la 280 nm se datorează resturilor de aminoacizi aromatici (triptofan, fenilalanină, tirozină, histidină) prezenţi în structura primară a moleculelor proteice. Proteinele cu număr mic de aminoacizi aromatici (cum este cazul gelatinei) vor absorbi puţin la această lungime de undă, iar proteinele cu număr mare de resturi de aminoacizi aromatici vor absorbi deosebit de puternic. De asemenea, absorbţia la 280 nm depinde de structura terţiară şi cuaternară a proteinelor (3). Deşi există această mare variabilitate a cantităţii de radiaţie UV absorbită de diversele tipuri de molecule proteice, 280 nm este lungimea de undă cel mai frecvent utilizată pentru cuantificarea directă a proteinelor deoarece există relativ puţine substanţe care absorb în acest domeniu. Principiul metodei Metoda constă în măsurarea absorbanţei în UV a soluţiei proteice şi exprimarea directă a concentraţiei conform legii Lambert-Beer.

unde:

, A – absorbanţa soluţiei; l – lungimea drumului parcurs de lumină; c – concentraţia soluţiei; ε – coeficientul de absorbţie molară a proteinei de interes.

Determinarea concentraţiei proteinelor

217

Coeficientul de absorbţie molară este un parametru specific proteinei de interes. Pentru evaluarea exactă a concentraţiei unei soluţii proteice este necesar ca acest parametru să fie cunoscut. El poate fi calculat atunci când numărul de aminoacizi aromatici şi legături disulfidice din molecula proteică este cunoscut. Estimarea se realizează după formula descrisă de Pace (4): , unde: ε280– coeficientul de extinctie molară la 280 nm (mol-1cm-1) nTrp – numărul de resturi de triptofan; nTyr – numărul de resturi de tirozină; nS–S – numărul de legături disulfurice. Metoda poate fi de asemenea utilizată pentru estimarea conţinutului proteic al unui extract brut (un amestec de proteine). În acest caz se foloseşte un coeficient de absorbţie mediu, estimat de către Pace (4), conform căruia o soluţie de concentraţie 1% are o valoare a absorbanţei la 280 nm egală cu 13. Avantaje: 1. simplitate deosebită (metoda nu necesită incubare, şi nici reactivi speciali); 2. proba proteică nu este denaturată şi poate fi recuperată; 3. dependenţa dintre absorbanţă şi concentraţie este liniară; 4. utilizabilă pe un interval larg de concentraţii: 20-3000 μg/ml. Limitări: 1. metoda nu poate fi utilizată când proteinele de interes conţin grupări prostetice care absorb între 200 şi 300 nm;


218

2. moleculele de acizi nucleici absorb puternic în domeniul 200-300 nm şi de aceea extractele brute (ce conţin şi ADN şi ARN) vor absorbi deosebit de puternic la 280 nm; 3. dacă nu este cunoscut coeficientul de absorbţie molară, metoda oferă doar o estimare a conţinutului proteic şi nu permite stabilirea exactă a concentraţiei. Materiale necesare: 1. cuve din quartz cu drumul optic de 1 cm; 2. spectrofotometru cu lampă UV. Mod de lucru: 1. se porneşte spectrofotometrul şi se menţine astfel timp de 15-30 minute; 2. se fixează lungimea de undă la 280 nm şi se face 0 cu controlul reactivilor (apă distilată sau soluţie tampon în care se află proteina); 3. cuva se usucă după care se introduce proba proteică şi se măsoară absorbanţa; valorile înregistrate trebuie să se situeze între 0,2 şi 1,0; dacă acest interval este depăşit, este necesară prepararea unei alte soluţii proteice prin concentrare sau diluare; 4. se calculează concentraţia proteică folosind una din formulele corespunzătoare, după caz: a. dacă sunt cunoscute coeficientul de absorbţie molară şi masa moleculară:

unde: c – concentraţia proteică în mg/ml A280– absorbanţa la 280 nm determinată anterior; M – masa moleculară a proteinei de interes (Da); ε280 – coeficientul de absorbţie molară (mol-1cm-1);


219

b. dacă coeficientul de absorbţie nu este cunoscut, se poate realiza o apreciere a conţinutului proteic utilizând formula: (1) unde: c – concentraţia proteică în mg/ml A280 – absorbanţa la 280 nm determinată anterior; Aceasta este o estimare ce are la bază un coeficient de absorbţie mediu şi nu reprezintă concentraţia reală a proteinei sau extractului proteic. c. dacă apar interferenţe datorită conţinutului ridicat de acizi nucleici, acestea pot fi eliminate prin măsurarea densităţii optice la 260 nm, calculul concentraţiei realizându-se după formula:

unde: c – concentraţia proteică în mg/ml A280,260 – absorbanţa la 280 nm sau respectiv 260 nm;

IX.2 Metode colorimetrice de determinare a concentraţiei proteinelor În cazul acestor metode nu se măsoară direct concentraţia proteinelor, ci intensitatea culorii rezultate prin reacţia grupelor funcţionale proteice cu diverşi reactivi.

Metoda Lowry Această metodă a fost una dintre cele mai utilizate tehnici de dozare a proteinelor, lucru demonstrat de faptul că lucrarea originală publicată de Lowry et al.în 1951 (5) este cea mai citată lucrare din istoria biochimiei.


220

Principiul metodei Metoda are la bază două reacţii distincte. Pe de o parte, în condiţii alcaline, ionii Cu2+ reacţionează cu legăturile dipeptidice din componenţa proteinelor şi formează Cu+ în aşa numită reacţie a biuretului (6). Pe de altă parte, resturile de triptofan, tirozină şi cisteină, împreună cu ionii Cu+ participă la a doua reacţie în care reactivul Folin-Ciocâlteau (fosfomolibdat şi fosfotungstenat) este convertit la un compus de culoare albastră, care absoarbe în domeniul 500-750 nm. Intensitatea culorii la 660 nm este direct proporţională cu cantitatea de proteină. Avantaje: 1. 2.

interval de linearitate 1-100 μg proteină; posibilitate de a măsura la diverse lungimi de undă (între 500-750 nm) pentru a se elimina posibilele interferenţe; 3. existenţa unui număr mare de variante derivate de la această metodă, variante care au ca scop mărirea spectrului de concentraţii (7), scăderea numărului de substanţe ce interferă cu această determinare (8)sau precipitarea iniţială a proteinelor pentru eliminarea contaminanţilor (9).

Limitări: 1. foarte mulţi dintre reactivii comuni utilizaţi pentru prepararea soluţiilor tampon interferă cu dezvoltarea culorii (agenţi reducători, agenţi chelatanţi ai cuprului (EDTA), detergenţi, carbohidraţi, glicerol, tricină, TRIS, compuşi cu potasiu, derivaţi sulfhidril, majoritatea fenolilor, acid uric, xantină, guanină, ionii de Mg2+ şi Ca2+); 2. intensitatea culorii depinde şi de numărul de resturi de tirozină, triptofan şi cisteină din proteina de interes; 3. este o metodă relativ complicată, datorită reactivilor care trebuie preparaţi extemporaneu.


221

Materiale necesare: 1. soluţie Na2CO3 2 % în soluţie de NaOH 0,1N; 2. soluţie CuSO4 x 5H2O 1 %; 3. tartrat de sodiu sau potasiu 2 %; 4. soluţie de lucru – se prepară extemporaneu prin amestecarea a 50 ml reactiv 1 cu 0,5 ml reactiv 2 şi 0,5 ml reactiv 3; 5. reactiv Folin-Ciocâlteu–poate fi achiziţionat sub formă de soluţie de concentraţie 2 N (Sigma-Aldrich) sau poate fi preparat în laborator; pentru aceasta, se dizolvă, într-un balon cu fundul rotund prevăzut cu refrigerent ascendent, 20 g Na2WO4 x 2H2O (wolframat de sodiu) şi 5 g Na2MoO4(molibdat de sodiu) în 140 ml apă distilată; se adaugă 1 ml H3PO4 85 % şi 20 ml HCl concentrat şi se fierbe moderat amestecul, sub reflux, timp de aproximativ 10 ore; după acest interval de timp se opreşte fierberea, se adaugă 30 g Li2SO4 şi câteva picături de Br2, după care amestecul se mai fierbe timp de aproximativ 15 minute fără refrigerent, pentru a se elimina excesul de brom; după răcire, se aduce volumul reactivului la 200 ml cu apă distilată şi se filtrează; reactivul trebuie să aibă culoarea galben (10); înainte de utilizare, reactivul se diluează cu apă distilată; 6. reactiv Folin-Ciocâlteu diluat – se prepară prin diluarea unui ml reactiv concentrat cu 2 ml apă distilată; 7. soluţie standard de albumină serică bovină (BSA) 0,1 mg/ml – se cântăresc la balanţa analitică 10 mg BSA şi se transferă cantitativ într-un balon cotat de 100 ml; se dizolvă proteina standard în 50 ml apă distilată, după care se aduce la semn; dizolvarea se realizează cu atenţie, pentru a preîntâmpina formarea spumei (aceasta conţine proteină denaturată şi modifică concentraţia finală a soluţiei standard) Mod de lucru: Un volum de până la 1 ml probă conţinând 10-100 µg proteină se amestecă cu 5 ml soluţie de lucru. Dacă volumul de probă este mai mic de 1 ml se completează cu apă distilată până la 6 ml, după care se incubează timp de 10 minute la temperatura camerei. Amestecul obţinut se tratează cu 0,5 ml reactiv Folin-Ciocâlteu diluat, se agită foarte bine amestecul,


222

după care se lasă în repaus timp de 30 minute. Se citeşte extincţia probei la 660 nm faţă de controlul reactivilor (1 ml apă distilată, 5 ml soluţie de lucru, 0,5 ml reactiv Folin-Ciocâlteu diluat). Pentru construirea curbei de etalonare, se realizează diluţii ale soluţiei standard BSA (Tabelul 14), după care se dozează concentraţia proteinelor, ca şi în cazul probei, după metoda descrisă anterior. Extincţiile obţinute se folosesc pentru trasarea curbei de etalonare cu ajutorul căreia se vor determina concentraţiile probelor de analizat (necunoscute). TABEL 14. Construirea curbei de etalonare pentru dozarea proteinelor prin metoda Lowry BSA (μg)

Soluţie standard BSA 0,1 mg/ml (ml)

Apă distilată (ml)

0

0,0

1,0

10

0,1

0,9

20

0,2

0,8

30

0,4

0,6

40

0,6

0,4

60

0,8

0,2

80

1,0

0,0

O metodă alternativă, derivată din cea descrisă anterior este metoda prezentată de Stoscheck(3). Aceasta utilizează reactivul FolinCiocâlteu mult mai diluat, are sensibilitate mai mare şi este mai puţin influenţată de compuşi care interferă cu metoda clasică. Materiale necesare: 1.

reactiv cupric – se dizolvă 20 g Na2CO3 în 260 ml apă distilată, 0,4 g CuSO4 x 5H2O în 20 ml apă distilată şi 0,2 g tartrat dublu de sodiu şi potasiu în 20 ml apă distilată; soluţiile obţinute se amestecă şi se obţin 300 ml reactiv cupric;


2. 3. 4.

5. 6.

223

dodecil sulfat de sodiu (SDS) 1 % – se dizolvă 10 g SDS în 100 ml apă distilată; soluţie NaOH 1 M – se dizolvă 4 g NaOH în apă distilată şi se aduce soluţia la 100 ml, într-un balon cotat; reactiv Lowry – se prepară extemporaneu, prin amestecarea a 3 părţi reactiv cupric cu o parte SDS 1 % şi o parte NaOH 1 M; reactivul este stabil timp de 2-3 săptămâni, dar poate apărea un precipitat alb care dispare prin încălzire la temperatura de 37oC; dacă precipitatul format este de culoare neagră, reactivul nu mai poate fi utilizat; reactiv Folin-Ciocâlteu 0,2 N – se prepară reactivul Folin-Ciocâlteu după metoda descrisă anterior şi se diluează în proporţie de 1/10; soluţie standard de albumină serică bovină (BSA) 0,5 mg/ml – se cântăresc la balanţa analitică 50 mg BSA şi se transferă cantitativ într-un balon cotat de 10 ml; se dizolvă proteina standard, cu atenţie pentru a se preîntâmpina formarea spumei, în 50 ml apă distilată, după care se aduce la semn.

Mod de lucru: 1. se amestecă400 μl reactiv Lowry cu cel mult 400 μl probă; 2. se completează volumul până la 800 μl cu apă distilată; 3. amestecul se incubează la temperatura camerei timp de cel puţin 10 min; 4. se adaugă 200 μl reactiv Folin-Ciocâlteu diluat şi se agită energic. Agitarea este necesară deoarece reactivul se descompune repede. Operaţiunea este considerată corectă atunci când nu se mai observă gradient de culoare în interiorul microeprubetei; 5. amestecul se incubează la temperatura camerei timp de 30 minute. Culoarea rezultată este relativ stabilă pentru perioade de ordinul orelor, astfel încât, în cazul mai multor probe acestea pot fi spectrofotometrate la distanţe de până în 10 minute una de cealaltă. Cuantificarea probelor se realizează la un spectrofotometru VIS utilizând cuve din sticlă sau plastic la lungimea de undă de 660 nm faţă de un control al reactivilor (400 μl reactiv Lowry, 400 μl apă distilată, 200 μl reactiv Folin-Ciocâlteu diluat). Dacă absorbanţa la 660 nm este prea mare, se poate utiliza şi lungimea de undă 500 nm.


224

Concentraţia proteinelor se calculează în raport cu o curbă de etalonare. Pentru realizarea acesteia, în microeprubete Eppendorf se pipetează soluţie standard BSA 0,5 mg/ml şi apă distilată, conform Tabelului 15, după care se procedează identic ca în cazul probei de analizat. Extincţiile obţinute se folosesc pentru trasarea curbei de etalonare cu ajutorul căreia, prin interpolare, se determină concentraţiile probelor de analizat (necunoscute). TABEL 15. Construirea curbei de etalonare pentru dozarea proteinelor prin metoda alternativă Lowry BSA (μg)

Soluţie standard BSA 0,05 mg/ml (μl)

Apă distilată (μl)

0

0

400

10

20

380

20

40

360

30

60

340

40

80

320

60

120

280

80

160

240

100

200

200

Metoda Bradford Introdusă de Bradford în 1976 (11), metoda se bazează, în principiu, pe legarea directă a colorantului Briliant Blue G250 de resturile de aminoacizi bazici şi aromatici (12). Metoda a devenit deosebit de populară datorită simplităţii, sensibilităţii şi rapidităţii, fiind folosită în special pentru cuantificarea concentraţiei proteinelor din extracte brute sau în vederea electroforezei.


225

Principiul metodei Metoda se bazează pe proprietatea colorantului Brilliant Blue G250 de a-şi modifica spectrul de absorbţie în urma interacţiunii cu resturile de arginină, triptofan, tirozină şi fenilalanină din moleculele proteice. În forma liberă, colorantul are un maximum de absorbţie la 470 nm (maro). dar prin interacţiunea cu proteinele are loc o schimbare a maximumului de absorbţie la 595 nm (albastru), intensitatea culorii fiind direct proporţională cu concentraţia proteică. Avantaje: 1. sensibilitate bună – sensibilitatea variază între 1-20 μg proteină (micrometoda descrisă de Coligan et al. 2007 (1) sau 20-140 μg (macrometoda descrisă de Rosenberg (12)); metoda descrisă în cele ce urmează are o sensibilitate intermediară; 2. simplitate, rapiditate – se utilizează un singur reactiv care este stabil mult timp; 3. număr mai mic de compuşi care interferă, comparativ cu metoda Lowry. Limitări: 1. lipsa de linearitate dintre intensitatea culorii şi cantitatea de proteină, care fac necesară acordarea unei atenţii deosebite în realizarea curbelor de etalonare; 2. colorantul format este deosebit de aderent de suprafeţe şi de aceea este greu de îndepărtat; 3. detergenţii frecvent utilizaţi (Triton, Tween) dau reacţii de culoare cu reactivul Bradford astfel încât prezenţa lor în soluţiile tampon interferă cu măsurătoarea; 4. albumina serică bovină are o reacţie de două ori mai puternică decât media cu reactivul Bradford (3), de aceea nu este indicată utilizarea sa pentru construirea curbelor etalon; unii autori recomandă utilizarea lizozimului sau imunoglobulinei G.


226

Materiale necesare: 1. etanol 96 %; 2. H3PO489 %; 3. reactiv Bradford – poate fi achiziţionat gata preparat de la furnizori consacraţi precum Sigma, Biorad sau Roth; pentru prepararea în laborator, 10 mg colorant Brilliant Blue G-250 se dizolvă în 10 ml etanol 96 % şi 9,8 ml acid fosforic 89 % şi se completează cu apă distilată până la 100 ml; Soluţia obţinută se păstrează la frigider în sticlă de culoare brună, fiind stabilă câteva săptămâni; 4. NaOH 1 M (opţional) – se dizolvă 4 g NaOH în apă distilată şi se aduce la semn într-un balon cotat de 100 ml; 5. soluţie standard BSA 0,05 mg/ml – se cântăresc la balanţa analitică 5 mg albumină serică bovină şi se transferă cantitativ într-un balon cotat de 100 ml; se dizolvă proteina standard în 50 ml apă distilată, după care se aduce la semn; dizolvarea se realizează cu atenţie, pentru a preîntâmpina formarea spumei. Mod de lucru: 1. proba, în cantitate de maximum 500 μl (400 μl în cazul utilizării soluţiei de NaOH), se pipetează într-o eprubetă curată şi uscată; 2. dacă este necesar, peste probă se pipetează 100 μl NaOH 1 M; soluţia are rolul de a preîntâmpina formarea de precipitat prin reacţia dintre reactivul Bradford şi extractul proteic şi de a solubiliza proteinele membranare; 3. peste probă se pipetează cantitatea corespunzătoare de apă distilată, până la un volum final de 500 μl; 4. se adaugă 1,5 ml reactiv Bradford şi se agită imediat; 5. după 5 minute, se citeşte absorbanţa la 595 nm faţă de controlul reactivilor (în care proba este înlocuită cu acelaşi volum de tampon de lucru); culoarea este stabilă, dar este recomandat ca citirea extincţiilor să se realizeze nu mai târziu de 30 minute de la introducerea reactivului Bradford în soluţia proteică;


227

6. cantitatea de proteină se calculează utilizând o curbă de etalonare; pentru realizarea acesteia, în eprubete curate şi uscate se pipetează soluţie standard BSA 0,05 mg/ml şi apă distilată urmând indicaţiile din Tabelul 16) după care se adaugă câte 1,5 ml reactiv Bradford; eprubetele se agită energic şi se incubează la temperatura camerei timp de 5 minute; se citeşte extincţia şi se trasează curba de etalonare.

TABEL 16. Construirea curbei de etalonare pentru dozarea proteinelor prin metoda Bradford BSA (μg)



0,0

0

500

2,5

50

450

5,0

100

400

7,5

150

350

10,0

200

300

12,5

250

250

15,0

300

200

20,0

400

100

Micrometoda Bradford de dozare a concentraţiei proteinelor Alături de metoda descrisă mai sus, pentru determinarea concentraţiei proteinelor utilizând Brilliant Blue G-250 se poate utiliza şi o metoda alternativă ce are avantajul unui volum de reacţie mic (dozarea poate fi efectuată în microeprubete Eppendorf) în detrimentul însă al unui interval de linearitate mai redus (2-20 μg).


228

Materiale necesare: 1. 2. 3. 4. 5.

reactiv Bradford (reactivul 3, Metoda Bradford, pagina 226); NaOH 1 M; microeprubete Eppendorf de 1,5 ml; cuve cu volum redus pentru spectrofotometru; soluţie standard BSA 0,05 mg/ml (reactivul 5, Metoda Bradford, pagina 226).

Mod de lucru: 1. într-o microeprubetă Eppendorf se pipetează maximum 700 μl probă cu un conţinut de 2-20 μg proteină; dacă proba are un volum mai mic, se completează cu apă distilată până la 700 μl; 2. peste probă se introduc 100 μl NaOH 1 M; adăugarea soluţiei NaOH este facultativă, ea având rolul de a preîntâmpina formarea de precipitat şi solubilizarea proteinelor membranare; 3. în amestecul de reacţie se adaugă 200 μl reactiv Bradford; 4. se agită energic microeprubeta, se menţine la temperatura camerei timp de 5 minute după care se citeşte extincţia la 595 nm faţă de un control al reactivilor (proba este înlocuită de tamponul de lucru); 5. cantitatea de proteină se calculează în raport cu o curbă de etalonare pentru realizarea căreia se pipetează în microeprubete curate şi uscate volume de soluţie standard BSA 0,05 mg/ml şi apă distilată înscrise în Tabelul 17; în fiecare microeprubetă se introduc, în continuare, 200 μl reactiv Bradford şi 100 μl soluţie NaOH; amestecul se agită energic şi se incubează la temperatura camerei timp de 5 minute; se citesc extincţiile şi se trasează curba de etalonare, de pe care se vor exprima prin interpolare concentraţiile probelor necunoscute.


229

TABEL 17. Construirea curbei de etalonare pentru dozarea proteinelor prin micrometoda Bradford BSA (μg)



0,0

0

700

2,5

50

650

5,0

100

600

7,5

150

550

10,0

200

500

12,5

250

450

15,0

300

400

20,0

400

300

Metoda cu acid bicinchoninic (BCA) Aceasta metodă tinde să înlocuiască metodele Lowry şi Bradford datorită numărului foarte mic de substanţe care interferă, simplităţii şi sensibilităţii mari. A fost descrisă pentru prima dată de Smith et. al., 1985 (13) şi are la bază reacţia biuretului la fel ca şi metoda Lowry. Reactivul Folin-Ciocâlteau utilizat în metoda Lowry este înlocuit cu o soluţie puternic bazică de acid bicinchoninic. Acesta din urmă are proprietatea de achelata2 ioni de Cu+(14), conducând la formarea unui complex colorat (purpuriu) cu maximum de absorbţie la 562 nm. Multă vreme s-a considerat că mecanismul care stă la baza acestei reacţii este asemănător celui pe care se bazează metoda Lowry. Ulterior sa stabilit că de fapt au loc două reacţii distincte în care sunt implicaţi ioni Cu2+ (15). Prima reacţie are loc la temperaturi scăzute şi implică resturile de cisteină, cistină, triptofan şi tirozină din molecula proteică, care transformă Cu2+ în Cu+. În a doua reacţie, ce se desfăşoară la temperaturi mari, sunt implicate legăturile dipeptidice care realizează aceeaşi reacţie de reducere a Cu2+. Cantitatea de Cu2+ redusă este proporţională cu cantitatea de proteină din soluţia de analizat. Dacă intensitatea primei


230

reacţii este dependentă de conţinutul în aminoacizi ai proteinei, cea de-a doua reacţie depinde doar de dimensiunile moleculelor proteice. Desfăşurarea reacţiei de dozare la temperaturi mari (37oC sau 60oC) are avantajul unei sensibilităţi mărite şi de asemenea reduce variaţia răspunsului colorantului la compoziţia în aminoacizi a proteinei. Principiul metodei În mediu alcalin şi la temperaturi înalte, ionii de Cu2+ sunt reduşi de legăturile peptice şi grupele funcţionale (resturile de cisteină, cistină, triptofan şi tirozină) din structura proteinelor la Cu+. Ionii Cu+ sunt complexaţi de către acidul bicinchoninic rezultând un chelat puternic colorat în purpuriu, cu maximumul de absorbţie la 562 nm. Intensitatea culorii este direct proporţională cu concentraţia proteinei. Avantaje: 1. sensibilitate foarte bună, comparabilă cu cea a metodei Lowry; 2. linearitate bună (1-100 μg); 3. simplitate deosebită deoarece este necesară manipularea unuia sau a doi reactivi; 4. reactivii sunt stabili în timp; 5. compatibilitate foarte bună cu compuşii utilizaţi în mod frecvent pentru prepararea tampoanelor de extracţie; Rosenberg (12)oferă o bună descriere a compuşilor şi concentraţiilor în care aceştia sunt compatibili cu metoda BCA; 6. deoarece în dezvoltarea culorii sunt implicate majoritar legăturile peptidice, conţinutul de aminoacizi al proteinei are o importanţă mai mică, metoda fiind astfel mai puţin influenţată de secvenţa proteinei de analizat. Limitări: -

agenţi de chelatare ai ionului Cu+ (EDTA, EGTA) sau agenţii


231

reducători (DTT, beta-mercaptoetanol) interferă în dezvoltarea culorii.

Micrometoda BCA de dozare a proteinelor Materiale necesare: 1. soluţie bicinchoninat de sodiu –într-un balon cotat de 100 ml se dizolvă 8 g Na2CO3 x H2O şi 1,6 g tartrat de sodiu în 70 ml apă distilată; se ajustează pH-ul la 11,25 cu NaOH 10M după care se aduce la semn cu apă distilată; soluţia este stabilă până la un an la temperatura camerei; 2. soluţie 4% BCA – se dizolvă 4 g BCA în 100 ml apă distilată; soluţia este stabilă până la un an la temperatura camerei; 3. soluţie 0,4% CuSO4 – se dizolvă 0,4 g CuSO4 x 5H2O în 10 ml apă distilată; soluţia este stabilă până la un an la temperatura camerei; 4. soluţie de lucru (se prepară extemporaneu) – se amestecă reactivii 1, 2, 3 în proporţie de 25:25:1 (v/v/v); 5. soluţie standard BSA 0,05 mg/ml (vezi metoda Bradford, reactiv 5); 6. baie de apă sau termostat la temperatura de 60oC. Mod de lucru: 1. proba de analizat, conţinând 2-20 μg proteine într-un volum de maximum 500 μl, se pipetează în microeprubete Eppendorf; dacă volumul probei este mai mic de 500 μl se completează până la acest volum cu apă distilată; 2. peste probă se introduc 500 μl soluţie de lucru, se agită energic şi se incubează timp de 15 minute la temperatura de 60oC; 3. microeprubetele se răcesc într-o baie de apă până la temperatura camerei (nu se va folosi gheaţă sau apă foarte rece); 4. după agitare se citeşte absorbanţa la 562 nm; 5. cantitatea de proteină se calculează utilizând o curbă de etalonare; pentru realizarea acesteia, se pipetează, în eprubete curate şi uscate, volumele de soluţie standard BSA 0,05 mg/ml şi apă distilată prezentate în Tabelul 18; în continuare se procedează urmând etapele 2-4; valorile


232

extincţiilor se utilizează pentru trasarea curbei de etalonare cu ajutorul căreia se calculează concentraţiile probelor necunoscute. TABEL 18. Construirea curbei de etalonare pentru dozarea proteinelor prin micrometoda BCA BSA (μg)



0.0

0

500

2,5

50

450

5,0

100

400

7,5

150

350

10,0

200

300

12,5

250

250

15,0

300

200

20,0

400

100

Macrometoda BCA de dozare a proteinelor Materiale necesare: 1. soluţie bicinchoninat de sodiu – 1 g bicinchoninat de sodiu, 2 g Na2CO3 x H2O, 0,16 g tartrat de sodiu, 0,4 g NaOH, 0,95 g NaHCO3 se introduc în 70 ml apă distilată; se ajustează pH-ul la 11,25 cu NaOH 10M şi se aduce la 100 ml; reactivul este stabil timp de un an la temperatura camerei; 2. soluţie 0,4% CuSO4 – se cântăresc 0,4 g CuSO4 şi se dizolvă în 99,6 ml apă distilată; reactivul este stabil timp de un an la temperatura camerei;


233

3. soluţie de lucru – se amestecă reactivii 1 şi 2 în proporţie de 50:1 (v/v); reactivul se prepară extemporaneu; 4. soluţie standard BSA 1 mg/ml – se cântăresc la balanţa analitică 100 mg BSA şi se transferă cantitativ într-un balon cotat de 100 ml; se dizolvă proteina standard în 50 ml apă distilată, după care se aduce la semn; dizolvarea se realizează cu atenţie, pentru a se preîntâmpina formarea spumei. Mod de lucru: 1. probele, conţinând până la 100 μg proteină într-un volum de maximum 100 μl se pipetează în microeprubete Eppendorf; dacă volumul probei este mai mic de 100 μl se completează cu apă până la acest volum; 2. se adaugă 2 ml reactiv de lucru şi se agită energic; 3. probele se incubează timp de 15 minute la temperatura de 60oC, după care se răcesc la temperatura camerei într-o baie de apă; 4. probele se citesc la 562 nm faţă de un control al reactivilor (proba proteică este înlocuită cu tampon de extracţie); 5. cantitatea de proteină se calculează cu ajutorul unei curbe de etalonare; pentru realizarea acesteia, în microeprubete curate şi uscate se pipetează volume de soluţie standard BSA 1 mg/ml şi apă distilată precizate în Tabelul 19; în continuare se procedează urmând etapele 2-4; cu valorile extincţiilor se trasează curba de etalonare cu ajutorul căreia se calculează concentraţiile probelor necunoscute.


234

TABEL 19. Construirea curbei de etalonare pentru dozarea proteinelor prin macrometoda BCA

BSA (μg)

Soluţie standard BSA 1 mg/ml (μl)


0

0

100

10

10

90

20

20

80

30

30

70

40

40

60

60

60

40

80

80

20

100

100

0

IX.3 Realizarea curbelor de etalonare şi prelucrarea datelor

Indiferent de metoda de dozare utilizată, pentru cuantificarea concentraţiei proteinelor este necesară utilizarea curbelor de etalonare. Din acest motiv, este absolut necesară precizarea unor detalii legate de realizarea acestora. Curbele de etalonare se realizează cu ajutorul unor proteine standard. Răspunsul unui standard este diferit de la o metodă de cuantificare la alta şi de asemenea răspunsul diverselor proteine standard este diferit în cadrul aceleiaşi metode. De exemplu,10 pg gelatină vor determina numai 69% din absorbanţa produsă de aceeaşi cantitate de albumină serică bovină (BSA) prin utilizarea metodei Lowry (3). Din aceste motive, pentru a obţine rezultate comparabile este absolut necesară precizarea metodei şi a standardului utilizat pentru cuantificare. Albumina serică bovină (BSA) este proteina cel mai frecvent


235

utilizată ca standard, în special datorită uşurinţei în utilizare şi costului mic. BSA are unele dezavantaje, principalul fiind acela că aderă de alte molecule, ceea ce face dificilă obţinerea repetată, cu o mare fidelitate, a unor preparate înalt purificate (1). Diveşi producători pun la dispoziţie şi alte molecule proteice care pot fi utilizate drept standard, cum ar fi imunoglobulina G. Un alt aspect care trebuie avut în vedere la realizarea curbelor de etalonare esteobservaţia conform căreiaconcentraţia proteinei poate varia linear sau non-liniar cu absorbanţa. Determinarea concentraţiei proteinelor prin măsurarea absorbţiei la 280 nm este o metodă mai puţin sensibilă, dar liniară pe un domeniu larg, pe când metoda Bradford este sensibilă, dar neliniară, necesitând construirea unor curbe de etalonare pe intervale înguste (1). Realizarea propriu-zisă a curbelor de etalonare În general, pentru realizarea unei curbe de etalonare se aleg cinci sau şase concentraţii din interiorul domeniului de uzabilitate a metodei. Prin diluarea reactivului standard se obţin soluţii de anumite concentraţii care se prelucrează conform cu metoda utilizată în vederea obţinerii unor valori de extincţie. Se recomandă minimum trei determinări pentru fiecare concentraţie din domeniul utilizat pentru trasarea curbei de etalonare. Curba de etalonare se poate realiza automat prin utilizarea funcţiilor grafice din cadrul programelor de calcul tabelar precum Excel, OpenOffice sau Mathlab. În cazul metodelor Lowry şi BCA care au un răspuns relativ liniar (se respectă legea Lambert-Beer adică punctele din sistemul de coordonate extincţie – concentraţie se înscriu pe o dreaptă), datele se reprezintă pe un grafic de tip scatter, se trasează dreapta de regresie şi se calculează ecuaţia dreptei şi coeficientul de regresie. În cazul metodei Bradford, răspunsul intensităţii colorantului la concentraţia proteinei este unul neliniar. Curba de regresie nu mai este o dreaptă, ci descrie o funcţie polinomială. Pentru simplificarea procedurii de obţinere a ecuaţiei care exprimă dependenţa concentraţiei proteinei de extincţie, unii autori sugerează reprezentarea datelor pe un grafic tip scatter şi inversarea coordonatelor; astfel pe axa OY se vor înscrie datele referitoare la cantitatea de BSA în micrograme, iar pe axa OX extincţiile. Această reprezentare elimină necesitatea prelucrării ecuaţiei curbei de calibrare şi permite utilizarea


236

directă a aceseia pentru exprimarea concentraţiei proteice în proba necunoscută. Avantajul este evident în cazul metodei Bradford, unde curba de calibrare este descrisă de o funcţie polinomială. Pentru exemplificare, vom considera un set de date reale obţinute folosind micrometa Bradford cu BSA drept standard (Tabelul 20). Cu ajutorul acestor date, reprezentând pe axa OX concentraţia de proteine şi pe axa OY absorbanţa se obţine o curbă de regresie descrisă de următoarea funcţie (Figura27, A):

unde: x – cantitatea de proteină; y – extincţia. Se poate observa că pentru a determina concentraţia în proteine a unei probe necunscute este necesară rezolvarea unei ecuaţii de gradul doi. Dacă valorile se înscriu pe acelaşi tip de grafic doar că se inversează axele de coordonate în aşa fel încât pe axa OY se vor afla concentraţiile de proteine şi pe axa OX extincţiile corespunzătoare, curba de calibrare polinomială are forma din Figura 27, B şi este descrisă de ecuaţia:

unde: y – concentraţia de proteine; x – extincţia. În această reprezentare exprimarea concentraţiei unei probe necunoscute se poate realiza direct prin utilizarea formulei, fără a fi necesară prelucrarea ei.


237

TABEL 20. Valori ale extincţiilor utilizate pentru construirea unei curbe de etalonare folosind micrometoda Bradford cu etalon BSA 0,05 mg/ml (pentru fiecare concentraţie au fost efectuate trei determinări) BSA (μg)



Extincţie 0,001

0

0

500

0,001 0,003 0,100

2

40

460

0,095 0,129 0,204

4

80

420

0,182 0,183 0,256

6

120

380

0,227 0,234 0,290

8

160

340

0,281 0,290

10

0,336

200

300

0,315 0,335 0,374

12 14

240

260

0,358 0,359 0,399

280

220

0,379 0,390 0,435

18

360

140

0,436 0,431 0,467

20

400

100

0,464 0,476

238


A. Reprezentare clasică, concentraţia BSA pe axa OX

B. Reprezentarea sugerată de Coligan (1), concentraţia BSA pe axa OY FIGURA 27. Exemple de curbe de calibrare folosind metoda Braford şi BSA 0,05 mg/ml drept soluţie standard (datele utilizate pentru generarea curbelor sunt prezentate în Tabelul 18) Exprimarea concentraţiei proteice din probe necunoscute Pentru exprimarea concentraţiei proteice necunoscute de pe curba de calibrare se utilizează metoda interpolării. Pentru aceasta este absolut necesar ca extincţia probei necunoscute să fie plasată în intervalul dintre extincţia maximă şi minimă de pe curba de etalonare. Este de asemenea


239

recomandat să nu se utilizeze extremele curbelor, în aşa fel încât de o parte şi de alta a valorii extincţiei înregistrată pentru proba necunoscută să existe cel puţin două concentraţii pentru care s-a determinat extincţia cu ajutorul standardului. O greşeală frecventă este aceea de a extrapola rezultatele, respectiv exprimarea concentraţiei unei probe necunoscute cu extincţia mai mare sau mai mică decât valoare maximă, respectiv minimă utilizată pentru realizarea curbei de etalonare. Această abordare poate duce la rezultate eronate în special în cazul metodei Bradford, unde răspunsul este neliniar. Pe lângă obligativitatea ca probele să aibă extincţii cuprinse în intervalul descris de curba de etalonare, este indicată de asemenea realizarea de diluţii seriate ale probei necunoscute. Acestea trebuie să urmeze comportamentul descris de curba de etalonare. În caz contrar, comportarea indică prezenţa unor compuşi care interferă ceea ce înseamnă că metoda aleasă şi soluţiile utilizate pentru determinarea concentraţiei proteinelor trebuie revizuite. Un alt aspect, de cele mai multe ori neglijat, este necesitatea realizării curbei de etalonare la fiecare determinare (sau cel puţin la prepararea reactivilor de culoare). Operaţia este obligatorie în cazul metodelor Lowry şi BCA şi recomandată în cazul metodei Bradford. Bibliografie: 1. Coligan J. E et. al.. (2007) –Current Protocols in Protein Science (J.E., C., Ed.), p 3.0.1–3.0.2, 3.1.5, 3.1.8,. John Wiley & Sons Inc. 2. Scopes, R. (1974) –Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm, Analytical Biochemistry, 59, 277–282. 3. Stoscheck, C. M. (1990) –Quantitation of protein, Methods in Enzymology, 182, 50–68. 4. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. (1995) –How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein., Protein science, 4, 2411–23. 5. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. (1951) – Protein measurement with the Folin phenol reagent., The Journal Of Biological Chemistry, 193, 265–75.

240


6. Gornall, A. G., Bardawill, C. J., David, M. M. (1949) –Determination of serum proteins by means of the biuret reaction., The Journal of biological chemistry177, 751–66. 7. Hartree, E. F. (1972) –Determination of protein: a modification of the Lowry method that gives a linear photometric response., Analytical biochemistry, 48, 422–7. 8. Dulley, J. R., Grieve, P. A. (1975) –A simple technique for eliminating interference by detergents in the Lowry method of protein determination., Analytical biochemistry, 64, 136–41. 9. Bensadoun, A., Weinstein, D. (1976) –Assay of proteins in the presence of interfering materials, Analytical Biochemistry, 70, 241–250. 10. Artenie, V., Tanase, E. (1981) –Practicum de Biochimie Generala. Editura Univ. Al. I. Cuza Iasi. 11. Bradford, M. (1976) –A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding., Analytical biochemistry, 72, 248–54. 12. Rosenberg, I. M. (2004) –Protein Analysis and Purification: Benchtop Techniques (Rosenberg, I. M., Ed.), p 128–136. Birkhauser Boston. 13. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. (1985) –Measurement of protein using bicinchoninic acid., Analytical biochemistry, 150, 76–85. 14. Dennison, C. (1999) –A Guide to Protein Isolation (Dennison, C., Ed.). Springer. 15. Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. (1988) – Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation., Analytical biochemistry, 175, 231–7.

X. SEPARAREA ELECTROFORETICĂ A PROTEINELOR Electroforeza este o metodă de separare care se bazează, în principiu, pe capacitatea particulelor coloidale sau moleculelor încărcate electric de a migra, sub influenţa unui câmp electric generat de doi electrozi, în direcţia electrodului purtător al sarcinii opuse. Viteza de migrare depinde în principal de dimensiunea sarcinii electrice şi din acest motiv moleculele cu sarcini diferite vor avea o mobilitate electroforetică diferită, separându-se în fracţii. În principiu, această metodă poate fi aplicată tuturor macromoleculelor încărcate electric, separarea realizându-se fie în soluţii apoase libere, fie pe medii cu rol stabilizator (plăci cu silicagel, filme, geluri) (1). În general electroforeza este folosită pentru separarea proteinelor, peptidelor, glucidelor şi acizilor nucleici. Utilitatea acestei metode de separare se referă, în special, la caracterizarea din punct de vedere calitativ a unui amestec şi aprecierea purităţii unui compus. Dacă se ţine cont de o serie de precauţiuni, tehnica poate fi utilizată şi în scopul unor separări cantitative şi preparative. Domeniul în care electroforeza îşi găseşte cea mai mare aplicabilitate este studiul proteinelor, domeniu denumit proteomică (termen ce desemnează ansamblul de tehnici şi metode folosite pentru studiul expresiei, localizării, structurilor, funcţiilor şi interacţiunii proteinelor, introdus pentru prima dată de Wasinger în anul 1995) (1). Una dintre primele metode de separare electroforetică a fost pusă la punct de Arne Tiselius în anul 1937 (1). Metoda se referă la separarea fracţiilor proteice în interiorul unui tub de forma literei U plin cu electrolit, fracţiile proteice fiind identificate densitometric. Datorită sensibilităţii reduse a acestei tehnici, s-a preferat dezvoltarea metodelor care folosesc medii stabilizatoare. Electroforeza pe hârtie, utilizată de acelaşi Tiselius în anul 1951 pentru separarea proteinelor din ser (2), a fost urmată de apariţia unor medii suport din ce în ce mai complexe: acetat de celuloză (Kohn, 1957) (3), amidon (Smithies, 1955) (4), plăci de silica-gel pentru analiza poliglucidelor (Scherz, 1990) (5), agaroză şi poliacrilamidă. O prezentare mai detaliată a avantajelor, dezavantajelor şi aplicaţiilor acestor medii suport este realizată de către Dennison, 1999 (6).

242


De-a lungul timpului au fost adoptate două soluţii tehnice pentru realizarea separării electroforetice. Un prim sistem este reprezentat de electroforeza orizontală, tehnică folosită atunci când se utilizează suporturi inerte faţă de oxigen (hârtie, plăci de silicagel, amidon, agaroză). Această soluţie are avantajul simplităţii şi robusteţii aparaturii utilizate, ea devenind standard pentru electroforeza pe geluri de agaroză. Al doilea sistem este electroforeza în sistem vertical, tehnică utilizată cu suporturi care trebuie ferite de oxigen, precum poliacrilamida. În acest caz, suportul este turnat între două plăci din sticlă etanşeizate lateral, comunicarea cu electrozii realizându-se prin părţile inferioară şi superioară. Această soluţie tehnică este mai complexă deoarece ridică probleme de etanşeizare a compartimentelor electrozilor dar, cu toate acestea, a devenit standard pentru electroforeza în geluri de poliacrilamidă. Amidonul, agaroza şi poliacrilamida nu sunt doar medii suport ci, datorită structurii şi organizării lor sub formă de gel, pot avea un rol activ în procesul de separare. În cazul în care concentraţia gelului este atât de mică încât nu interferă cu migrarea, este vorba despre un gel permisiv, separarea moleculelor realizându-se în funcţie de încărcarea electrică a acestora. Prezentarea aplicaţiilor practice a acestor tipuri de geluri este realizată de către Westermeier (1). Când concentraţia gelului este atât de mare încât influenţează migrarea printr-un efect de filtrare a moleculelor în funcţie de dimensiunea lor (efect de filtrare moleculară), ne referim la geluri restrictive. În acest caz migrarea se realizează în funcţie atât de sarcina electrică a moleculelor cât şi de dimensiunile lor. La ora actuală gelurile restrictive cel mai frecvent utilizate în laboratoarele de cercetare sunt gelurile de agaroză pentru separarea acizilor nucleici (pentru detalii consultaţi capitolul VII – Separarea electroforetică a ADN-ului, pagina 147) şi cele de poliacrilamidă pentru separarea proteinelor. În funcţie de scopul separării şi de condiţiile de migrare, moleculele proteice pot fi separate fie în stare nativă (prin realizarea aşa numitei electroforeze native (engl. Native-PAGE), fie în stare denaturată. Denaturarea proteinelor în catene polipeptidice componente se realizează, cel mai frecvent, prin tratamente cu dodecilsulfat de sodiu (SDS), caz în care electroforeză în condiţii denaturante se notează SDS-PAGE. Oricare ar fi sistemul utilizat, după realizarea separării propriu-zise, moleculele proteice trebuie evidenţiate pe gel prin tehnici specifice de colorare. Separarea electroforetică a proteinelor se realizează, prin urmare, în două etape distincte:

Electroforeza proteinelor

243

1. separarea propriu-zisă (electroforeză nativă sau denaturantă, în funcţie de scopul urmărit); 2. evidenţierea fracţiunilor proteice de interes prin colorare, autoradiografie sau tehnici imunologice.

X.1 Electroforeza nativă a proteinelor în sistem discontinuu Metoda are la bază sistemul de tampon discontinuu propus de Ornstein, 1964 (7) şi Davis, 1964 (8). Iniţial, autorii au utilizat pentru realizarea gelului tuburi în care proteinele se separă sub formă de discuri, motiv pentru care metoda mai poartă numele şi de disc-electroforeză. Discontinuitatea se referă la 4 parametri (1): 1.

porozitatea gelului – gelul conţine două zone de concentraţii diferite, una în zona superioară de concentraţie mică (pori de dimensiuni mari, gel de concentrare) şi una în zona inferioară de concentraţie mare (pori de dimensiuni mici, gel de separare);

2.

pH-ul gelului – gelul de concentrare are pH-ul 6,8 iar cel de migrare are pH-ul 8,8;

3.

tăria ionică a soluţiilor tampon din interiorul gelului – gelul de concentrare conţine 0,125 mol/l TRIS-HCl, iar gelul de separare 0,375 mol/l TRIS-HCl;

4.

natura ionilor din gel şi din tamponul de electrod; gelul conţine ioni Cl- iar tamponul de migrare glicină.

Principiul metodei Separare proteinelor în sistemul discontinuu are loc în două etape, corespunzătoare celor două geluri: 1. Etapa de concentrare a fracţiilor proteice sau etapa de izotachoforeză (1) Probele reprezentate de soluţia proteică sunt plasate în gelul de concentrare, al cărui pH este de 6,8. La această valoare a pH-ului, glicina (punctul izoelectric, pI=6,7) este practic lipsită de sarcină electrică, iar

244


clorul este încărcat negativ. La aplicarea curentului electric, glicina va avea o mobilitate redusă (datorită lipsei sarcinii) iar clorul va avea mobilitate maximă. Proteinele cu punctul izoelectric (pI) diferit de 6,8, cu grade diferite de încărcare vor avea mobilităţi intermediare, plasându-se între frontul glicinei şi cel al clorului, realizând legătura între aceste două fronturi. Apare astfel o zonă în care moleculele proteice se grupează, se concentrează şi se ordonează în funcţie de sarcină. În această zonă apar grupe de proteine ce diferă una de cealaltă prin sarcină, aceste grupe fiind însă strâns legate una de cealaltă şi formând aşa-numitul „tren de ioni” (1). Între grupele de proteine nu pot apărea goluri, deoarece aceste goluri ar duce la întreruperea circuitului electric. Ca urmare a acestui fapt, în etapele târzii ale procesului toate moleculele migrează cu aceeaşi viteză, de unde şi denumirea de izotachoforeză (izo – egal, tacho – viteză). Când acest tren al ionilor ajunge în zona de contact dintre gelul de concentrare şi cel de migrare, rezistenţa datorată porilor mici ai gelului de migrare creşte, ceea ce duce la concentrarea proteinelor sub forma unei singure benzi foarte fine. 2. Etapa de separare a fracţiilor proteice. În gelul de separare, la pH 8,8, glicina este încărcată negativ şi, datorită masei moleculare mici, continuă să migreze împreună cu frontul clorului cu o viteză relativ mare, depăşind frontul proteic întârziat la intrarea în acest gel. Proteinele se desprind din trenul ionilor şi se separă în funcţie de masa moleculară şi sarcina electrică. Avantaje: Acest tip de separare electroforetică este util în experimentele în care se doreşte păstrarea intactă a structurii tridimensionale a proteinelor precum: 1. separarea de enzime în scopuri preparative; 2. identificarea de izoenzime.


245

Limitări: O atenţie deosebită în cazul acestui tip de separare trebuie acordată punctului izoelectric al proteinelor de interes. În sistemul discontinuu descris nu pot fi separate proteine al căror pI este mai mare de 6,8 (la pH-ul gelului de concentrare aceste proteine sunt încărcate pozitiv şi migrează spre anod) (1). În general, pentru o bună separare, sistemul tampon folosit trebuie să fie cu două unităţi de pH mai bazic decât pI-ul proteinelor de separat. O prezentare detaliată a unor alternative de sisteme tampon de migrare şi aplicaţiile lor este realizată de Chrambach şi Jovin, 1983 (9). Acest tip de electroforeză nu poate fi utilizată pentru aprecierea maselor moleculare relative ale proteinelor, deoarece migrarea se realizează şi în funcţie de sarcinile acestora. Pentru a înlătura acest dezavantaj Niepmann (2006) (10) descrie o metodă de separare electroforetică care utilizează colorantul Serva Blue G. Acesta ecranează sarcinile native ale proteinelor şi conferă acestora sarcini negative. Autorul utilizează această metodă pentru a aprecia gradul de oligomerizare a proteinelor însă precizează că modul de migrare al moleculelor proteice pe gelurile de poliacrilamidă depinde şi de forma acestora. Materiale necesare: 1. soluţie stoc de acrilamidă – se prepară prin dizolvarea a 29 g acrilamidă şi 1 g N-N'-metilen-bisacrilamidă (puritate pentru electroforeză) în 100 ml apă distilată; se verifică pH-ul soluţiei care trebuie să fie mai mic de 7 şi se păstrează în sticle brune, la întuneric, la temperatura de 4oC; este indicat, de asemenea, ca soluţia să fie degazificată sub vid, în vederea eliminării oxigenului solvit; soluţiile preparate în laborator au o durată de viaţă limitată, deoarece acrilamida şi bisacrilamida se dezaminează şi formează acizii corespunzători, procesul fiind catalizat de lumină şi alcalii; Prezenţa acidului acrilic în soluţia de acrilamidă duce la diminuarea rezoluţiei şi apariţia unor benzi difuze. Soluţia de acrilamidă preparată în laborator se poate folosi timp de câteva luni, după care trebuie refăcută (11); soluţia stoc de acrilamidă

246


poate fi achiziţionată gata preparată de la producători precum Biorad, Amersham-Biosciences, Roth; aceste soluţii reduc pericolul contaminării cu poliacrilamidă şi au o mai mare stabilitate în timp datorită aditivilor pe care îi conţin (un an flaconul nedesfăcut, 6 luni flaconul desfăcut) (12). Acrilamida şi bisacrilamida monomere se absorb prin piele şi sunt neurotoxine deosebit de puternice, fiind de asemenea suspectate de efecte cancerigene. Cântărirea şi prepararea soluţiilor se realizează cu atenţie, manevrarea făcându-se cu mănuşi şi purtând mască de protecţie. Deşi poliacrilamida este considerată inofensivă, este indicat ca manipularea gelurilor să se realizeze tot cu mănuşi datorită resturilor de acrilamidă nepolimerizată. 2. tampon TRIS 1,5M, pH 8,8 – se dizolvă 18,166 g Tris-bază în 80 ml apă distilată şi se ajustează pH-ul la 8,8 cu HCl, după care se completează la 100 ml cu apă distilată; 3. tampon TRIS 1 M, pH 6,8 – se dizolvă 12,114 g Tris-bază în 80 ml apă distilată şi se ajustează pH-ul la 6,8 cu HCl, după care se completează la 100 ml cu apă distilată; nu este recomandată utilizarea TRIS-HCl sau Trisma datorită conţinutului mare de săruri ceea ce conduce la obţinerea unor benzi difuze (11); soluţia se păstrează în sticle bine închise, la temperatura camerei; 4. TEMED – N,N,N',N'- tetrametiletilendiamină; 5. persulfat de amoniu 10% (APS) – se prepară prin dizolvarea a 0,1 g persulfat de amoniu în 1 ml apă distilată; soluţia se poate păstra la temperatura de 4oC timp de o săptămână; persulfatul de amoniu se descompune lent în soluţie, motiv pentru care se recomandă utilizarea soluţiei proaspăt preparate; 6. tampon de electroforeză TRIS-glicină (25 mM Tris-base, 250 mM glicină) – se prepară prin dizolvarea a 3,02 g TRIS-bazặ, 18,8 g glicină în 1000 ml apă distilată; în cazul utilizării frecvente se pot


247

prepara soluţii de până la zece ori mai concentrate, efectuându-se diluarea în momentul folosirii; 7. soluţie tampon pentru probe 4X – Tris-HCl 200 mM (pH 6,8), albastru de bromfenol 0,4%, glicerol 40%; soluţia se poate prepara din soluţia Tris 1 M pH 6,8; pentru prepararea a 10 ml soluţie tampon pentru probe se dizolvă 0,04 g albastru de bromfenol în 4 ml apă distilată, se adaugă 2 ml tampon Tris 1 M pH 6,8 (pentru gelul de concentrare) şi 4 ml glicerol; soluţia se poate păstra la temperatura camerei sau la frigider. Mod de lucru A. Turnarea gelului de poliacrilamidă presupune parcurgerea mai multor etape. 1. asamblarea plăcilor din sticlă în vederea turnării gelului de poliacrilamidă se realizează urmând indicaţiile producătorului cuvei de electroforeză (Biorad, Apelex etc.). Este necesar să se cunoască volumul de gel necesar şi dacă acesta nu este indicat de producătorul cuvei poate fi determinat prin măsurarea cantităţii de apă dintre plăcile din sticlă montate în vederea turnării gelului. Într-un pahar Erlenmeyer curat se prepară volumul necesar de gel de migrare urmând indicaţiile din Tabelul 19, exceptând soluţia de SDS 10%. Concentraţia gelului depinde de proba de analizat; în general, o concentraţie de 10-12% este un bun început pentru analiza unei probe necunoscute. Componentele trebuie adăugate în ordinea înscrisă în Tabelul 21 (pagina 250) pentru a împiedica polimerizarea accidentală a acrilamidei. Conţinutul flaconului se agită după care se trece la etapa următoare. 2. acrilamida se toarnă cu atenţie în spaţiul dintre cele 2 plăci din sticlă. Nivelul de umplere se stabileşte în aşa fel încât pieptenul să poată fi introdus, iar de la capătul acestuia să rămână un spaţiu de 1 cm pentru gelul de concentrare. Peste soluţia de acrilamidă proaspăt turnată se adaugă cu grijă etanol, care are rolul de a elimina eventualele bule de aer care se pot forma la suprafaţa soluţiei de acrilamidă, de a asigura formarea unei margini superioare drepte şi de a nu permite difuzia

248


oxigenului în soluţia de acrilamidă (oxigenul inhibă procesul de polimerizare); 3. după polimerizare (procesul durează aproximativ 30 minute sau mai mult dacă APS-ul nu este are calitatea corespunzătoare), se elimină etanolul din partea superioară a gelului, se spală cu apă distilată spaţiul dintre plăcile de sticlă şi se îndepărtează apa în exces cu hârtie de filtru. 4.într-un pahar Erlenmeyer se prepară volumul necesar de gel de concentrare urmând indicaţiile din Tabelul 22 (pagina 252), exceptând soluţia de SDS. Componentele se amestecă şi se trece la punctul 5; etapa de mogenizare a componentelor nu trebuie să dureze foarte mult timp, deoarece polimerizarea gelului de concentrare are loc mult mai repede decât în cazul gelului de separare. 5. soluţia se toarnă cu atenţie peste gelul de separare şi imediat se inserează pieptenii; aceştia trebuie introduşi în aşa fel încât să nu apară bule de aer; polimerizarea este completă după aproximativ 30 minute. Gelurile pot fi utilizate imediat după expirarea acestui interval. Înainte de utilizare se scoate pieptenul, se spală godeurile pentru probe cu apă distilată şi se elimină apa în exces. Plăcile din sticlă între care se află gelul se asamblează în cuva de electroforeză urmând indicaţiile producătorului iar cuva se umple cu soluţie tampon de migrare. B. Pregătirea probelor Cantitatea de proteine ce pot fi separate pe un gel depinde de dimensiunile acestuia. Ca punct de reper, pe un gel în format mini, cu dimensiunile de 8 x 10 cm şi grosimea de 0,1 cm se pot separa amestecuri de proteine de până la 25-30 μg şi proteine purificate până la 5 μg. Într-o microeprubetă Eppendorf se repartizează 5 μL tampon pentru probe 4X în care se adaugă soluţia de analizat conţinută într-un volum X (de maximum 15 μl). Se completează cu apă distilată pănâ la 20 μl şi apoi, cu o seringă Hamilton, se încarcă probele în godeurile din gel. C. Separarea electroforetică propriu-zisă Cuva de electroforeză se conectează la o sursă de curent şi se setează intensitatea curentului ca parametru constant. Valorile variază în funcţie de dimensiunile gelului utilizat. Pentru un gel în format mini, se aplică 10 mA/gel până când frontul colorantului atinge limita de separare


249

dintre cele două geluri, după care se aplică 15 mA/gel până când frontul colorantului atinge limita inferioară a gelului. După finalizarea migrării, plăcile din sticlă se scot din cuvă, se aşează pe o foaie de hârtie de filtru şi se desfac cu atenţie, în vederea recuperării gelului. Acestuia i se marchează colţul din dreapta jos în vederea orientării ulterioare. Gelul este apoi plasat într-un vas pentru colorare. Pericolul ruperii gelului la mutarea lui de pe placa de sticlă în vasul de colorare este mult diminuat dacă operaţia se realizează prin antrenarea gelului cu un jet de apă dintr-o pisetă.

10%

8%

6%

1,0 1,3 0,05 0,05 0,004 2,3 1,3 1,3 0,05 0,05 0,003 1,9

Acrilamidă 30%

Tris 1,5M pH 8,8

SDS 10%*

APS 10%

TEMED

Apă distilată

Acrilamidă 30%

Tris 1,5M pH 8,8

SDS 10%*

APS 10%

TEMED

Apă distilată 3,3 2,5

Tris 1,5M, pH 8,8 1,3

4,0

0,006

0,1

0,1

2,5

2,7

4,6

0,008

0,1

0,1

2,5

2,0

5,3

3,8

5,0

5,9

0,009

0,15

0,15

3,8

4,0

6,9

0,012

0,15

0,15

3,8

3,0

7,9

10 ml 15 ml

1,7

Acrilamidă 30%

2,6

5 ml

5,0

6,7

7,9

0,012

0,2

0,2

5,0

5,3

9,3

0,016

0,2

0,2

5,0

4,0

10,6

20 ml

6,3

8,3

9,9

0,015

0,25

0,25

6,3

6,7

11,5

0,020

0,25

0,25

6,3

5,0

13,2

25 ml

7,5

10,0

11,9

0,018

0,3

0,3

7,5

8,0

13,9

0,024

0,3

0,3

7,5

6,0

15,9

10,0

13,3

15,9

0,024

0,4

0,4

10,0

10,7

18,5

0,032

0,4

0,4

10,0

8,0

21,2

30 ml 40 ml

12,5

16,7

19,8

0,03

0,5

0,5

12,5

13,3

23,2

0,04

0,5

0,5

12,5

10,0

26,5

50 ml

Volumul fiecărei componente (ml) pentru obţinerea volumului final de:

Apă distilată

Concentraţia finală Componentă a gelului

TABEL 21. Componentele necesare preparării gelului de separare utilizat în electroforeza nativă sau în SDS -PAGE (după Sambrook et al.1989 ) (11)

250 Biologie moleculară. Metode experimentale

0,05 0,002 1,6 2,0 1,3 0,05 0,05 0,002 1,1 2,5 1,3 0,05 0,05 0,002

APS 10%

TEMED

Apă distilată

Acrilamidă 30%

Tris 1,5M pH 8,8

SDS 10%*

APS 10%

TEMED

Apă distilată

Acrilamidă 30%

Tris 1,5M pH 8,8

SDS 10%*

APS 10%

TEMED

0,004

0,1

0,1

2,5

5,0

2,3

0,004

0,1

0,1

2,5

4,0

3,3

0,004

0,1

0,1

0,006

0,15

0,15

3,8

7,5

3,4

0,006

0,15

0,15

3,8

6,0

4,9

0,006

0,15

0,15

10 ml 15 ml

0,008

0,2

0,2

5,0

10,0

4,6

0,008

0,2

0,2

5,0

8,0

6,6

0,008

0,2

0,2

20 ml

0,01

0,25

0,25

6,3

12,5

5,7

0,01

0,25

0,25

6,3

10,0

8,2

0,01

0,25

0,25

25 ml

*–componentă care trebuie eliminată dacă se are în vederea realizarea unei electroforeze native

15%

12%

0,05

5 ml

0,012

0,3

0,3

7,5

15,0

6,9

0,012

0,3

0,3

7,5

12,0

9,9

0,012

0,3

0,3

0,016

0,4

0,4

10

20,0

9,2

0,016

0,4

0,4

10,0

16,0

13,2

0,016

0,4

0,4

30 ml 40 ml

0,02

0,5

0,5

12,5

25,0

11,5

0,02

0,5

0,5

20,0

20,0

16,5

0,02

0,5

0,5

50 ml


SDS 10%*

Concentraţia finală Componentă a gelului

Electroforeza proteinelor 251

0,17

0,13

0,01

0,01

0,001

Acrilamidă 30%

Tris 1 M pH 6,8

SDS 10%*

APS 10%

TEMED

0,002

0,02

0,02

0,25

0,33

1,4

2 ml

0,003

0,03

0,03

0,38

0,5

2,1

3 ml

0,004

0,04

0,04

0,5

0,67

2,7

4 ml

0,005

0,05

0,05

0,63

0,83

3,4

5 ml

*–componentă care trebuie eliminată dacă se are în vederea realizarea unei electroforeze native

0,68

1 ml

0,006

0,06

0,06

0,75

1,0

4,1

6 ml

0,008

0,08

0,08

1,0

1,3

5,5

8 ml


Apă distilată

Componentă

0,01

0,1

0,1

1,25

1,7

6,8

10 ml

TABEL 22. Componentele necesare preparării gelului de concentrare utilizat în electroforeza nativă sau în SDS-PAGE (după Sambrook et al.1989) (11)



253

X.2 Electroforeza proteinelor în condiţii denaturante (SDS-PAGE) Metoda de separare electroforetică în condiţii denaturante propusă este una derivată de la sistemul de separare discontinuu al lui Ornstein şi Davis (7) discutat anterior. A fost introdusă pentru prima dată de Laemmli (13), diferenţa între acest sistem şi cel nativ constând în faptul că proteinele sunt supuse denaturării prin acţiunea dodecil-sulfatului de sodiu (SDS), β-mercaptoetanolului şi temperaturii. SDS-ul este un detergent încărcat negativ care are proprietatea de a se lega de catenele polipeptidice într-un raport de 1,4 g detergent / 1 g proteină (11). Acest sistem de separare mai este cunoscut şi sub numele de Glicină-SDSPAGE. Principiul metodei Separarea în acest caz se realizează după aceleaşi principii ce guvernează şi electroforeza nativă. Diferenţele apar datorită faptului că, sub acţiunea temperaturii, SDS-ului şi β-mercaptoetanolului, structura tridimensională a moleculelor proteice este alterată. Astfel, proteinele sunt transformate în catenele liniare de aminoacizi. Suplimentar, SDS-ul se fixeazîn pe catenele polipetidice într-o cantitate proporţională cu lungimea lor şi acranează sarcinile datorate încărcării aminoacizilor. Toate proteinele vor fi, prin urmare, încărcate negativ, dimensiunea sarcinii fiind direct proporţională cu cantitatea de SDS fixată, adică cu lungimea catenei. În această situaţie separarea se realizează în funcţie de un singur parametru şi anume de dimensiunea catenelor polipeptice. Avantaje: Metoda este utilizată în scopuri analitice calitative (în vederea aprecierii gradului de puritate a unui preparat), dar şi cantitative (cu o bună standardizare). Aplicaţia cea mai cunoscută este însă aprecierea


254

maselor moleculare ale proteinelor. În acest caz trebuie făcute următoarele precizări: 1. pentru aprecierea masei moleculare este necesar ca amestecul de proteine marker (cu mase moleculare cunoscute) să fie supus electroforezei simultan cu proba de analizat; 2. separarea proteinelor în funcţie de masa moleculară nu este una liniară, de aceea se pot aprecia corect masele moleculare doar pentru proteinele din zona centrală a gelului; 3. masa moleculară relativă a proteinelor poate varia în funcţie de starea de reducere a legăturilor disulfidice; prezenţa legăturilor disulfidice nereduse duce la scăderea masei moleculare relative cu 2-4 kDa (14), iar prezenţa legăturilor incomplet reduse duce la apariţia a două benzi apropiate ca masă; analiza comparativă a aceleiaşi proteine tratate şi netratate cu agenţi reducători poate oferi informaţii legate de prezenţa punţilor disulfidice. Limitări: Folosind acest sistem de separare, glicoproteinele migrează foarte încet. Această comportare se datorează faptului că partea glucidică din structura glicoproteinelor leagă foarte slab SDS-ul. Pentru îmbunătăţirea vitezei de separare se poate folosi sistemul tampon propus de Poduslo (1981), care foloseşte Tris-borat-EDTA ca tampon de migrare (15). Sistemul de separare al lui Laemmli (Glicină-SDS-PAGE) permite separarea proteinelor cu masă moleculară mai mare de 15 kDa. Pentru proteinele cu masele moleculare mai mici decât această limită este indicată utilizarea sistemului Tricină-SDS-PAGE descris de Schagger (2006) (14). Acest sistem nu oferă informaţii legate de gradul de oligomerizare a proteinelor şi nu permite aprecierea masei moleculare native, pentru rezolvarea acestor aspecte fiind necesară utilizarea altor tehnici precum cromatografia de filtrare prin gel (pentru detalii, consultaţi subcapitolul VIII– 5 Determinarea maselor moleculare native utilizând cromatografia de filtrare prin gel (GF), pagina200).


255

Materiale necesare: Se utilizează aceleaşi materiale folosite în cazul electroforezei în condiţii native, la care se adaugă: 1. tampon de electroforeză Tris-Glicină-SDS (Tris-bază, 25 mM glicină 250 mM, SDS 0,1%) – se prepară prin dizolvarea a 3,02 g Tris-bază, 18,8 g glicină, 10 ml SDS 10% în 1000 ml apă distilată; în cazul utilizării frecvente se pot prepara soluţii de până la 10X mai concentrate, acestea necesitând diluare înainte de folosire; 2. soluţie 10% SDS; aceasta se prepară prin dizolvarea a 10 g SDS în 90 ml apă distilată; pentru dizolvare completă poate fi necesară încălzirea; soluţia se păstrează la temperatura camerei;

SDS-ul se prezintă sub forma unei pulberi fine, uşor antrenată de curenţii de aer. Inhalată, pulberea produce iritarea mucoasei nazale, din acest motiv cântărirea şi manipularea acestui compus trebuie să se realizeze numai purtând masca de protecţie.

3. soluţie tampon pentru probe 4X – TRIS-HCl 200 mM (pH 6,8), albastru de bromfenol 0,4%, glicerol 40%, SDS 8%– pentru prepararea a 10 ml soluţie tampon se dizolva 0,04 g albastru de bromfenol şi 0,8 g SDS în 4 ml apă distilată, se adaugă 2 ml tampon TRIS-HCl 1 M pH 6,8 (pentru gelul de concentrare) şi 4 ml glicerol; soluţia se poate păstra la temperatura camerei sau la frigider; 4. soluţie stoc ditiotreitol (DTT) 1 M – se dizolvă 0,154 g DTT în 1 ml apă distilată; soluţia se păstrază la congelator; în calitate de agent reducător se poate utiliza şi beta-mercaptoetanol în aceeaşi concentraţie.


256

Mod de lucru A. Turnarea gelului de poliacrilamidă Operaţia se realizează identic ca în cazul electroforezei în condiţii native, cu observaţia că în compoziţia gelurilor intră şi SDS-ul, urmând indicaţiile din Tabelul 21 (pagina 250) şi Tabelul 22 (pagina252). Concentraţia gelului de separare se alege în funcţie de dimensiunea proteinei de interes, urmând indicaţiile din Tabelul 23. De precizat că rezoluţia în limitele superioară şi inferioară este redusă. Tabel 23. Dependenţa dintre concentraţia gelului de separare şi masele proteinelor posibil a fi separate (după Ausubel, 2002) (16) Concentraţie gel de separare (%)

Limite mase proteine (kDa)

6

60 -200

8

30-95

10

16-70

12

12-60

15

12-45

B. Pregătirea probelor Cantitatea de proteine ce pot fi separate pe un gel depinde de dimensiunile acestuia. Ca punct de reper, pe un gel în format mini, cu dimensiunile de 8 x 10 cm şi grosimea de 0,1 cm se pot separa amestecuri de proteine cu un conţinut de până la 25-30 μg şi proteine purificate cu un conţinut de până la 5 μg. Într-o microeprubetă Eppendorf se repartizează 5 μl tampon pentru probe 4X în care se adaugă soluţia de analizat conţinută într-un volum X (de maximum 15 μl). Se completează amestecul cu 2 μl soluţie DTT 1 M şi apă distilată până la volumul final de 20 μl, după care se încălzeşte la 95oC timp de 5 minute. După răcire probele se încarcă cu o seringă Hamilton, în godeurile din gel.


257

C. Separarea electroforetică propriu-zisă Se procedează identic că şi în cazul separării în condiţii nedenaturante. Gelurile se scot dintre plăcile din sticlă, se clătesc cu apă distilată şi se prelucrează în vederea detecţiei proteinelor separate după una din metodele descrise în continuare.

X.3 Detecţia proteinelor separate prin electroforeza pe geluri de poliacrilamidă Proteinele separate prin electroforeză (nativă sau denaturantă) pot fi detectate folosind două metode distincte: A. colorarea gelurilor de poliacrilamidă, B. electro-transferul lor pe membrane şi identificarea proteinelor utilizând tehnici imunologice (pentru detalii consultaţi capitolul XI– Evidentierea imunologică a proteinelor – Tehnica Western-Blot, pagina 273).

Colorarea gelurilor de poliacrilamidă în vederea evidenţierii proteinelor Pentru evidenţierea proteinelor separate pe gelurile de poliacrilamidă au fost descrise numeroase protocoale ce pot fi împărţite în doua categorii mari: 1. coloraţii specifice cu care sunt evidenţiate doar anumite fracţiuni din toate proteinele separate; aceste coloraţii se folosesc în special pentru evidenţierea unor enzime; metode specifice, adaptate pentru diferite tipuri de enzime sunt prezentatate de Manchenko (2002) (17); 2. coloraţii nespecifice care realizează colorarea uniformă a tuturor proteinelor separate. Diversele metode de colorare diferă între ele prin nivelul de sensibilitate şi prin complexitatea procedurii, aceste două elemente fiind esenţiale în alegerea protocolului de colorare de urmat (Tabel 24). Avantajele şi dezavantajele fiecărei metode, precum şi alte metode de colorare ce nu sunt menţionate în lucrarea curentă sunt prezentate de Westermeier et al. (2008) (18).


258

TABEL 24. Metode de colorare a gelurilor de poliacrilamidă în vederea evidenţierii fracţiunilor proteice (după Gerstein 2001,(12) cu modificări) Metodă de colorare Coomassie brilliant blue R-250

Sensibilitate 0,3-1 μg/bandă

Observaţii Simplă, tradiţională, cu sensibilitate redusă. Recomandată pentru gelurile SDS-PAGE, dar poate fi folosită şi pentru gelurile native (în acest caz proteinele se colorează mai slab şi sensibilitatea scade)

Coomassie brilliant blue G-250 (coloidal)

100 ng/bandă

Recomandată pentru toate tipurile de geluri, sensibilitate bună dar necesită un timp mai îndelungat de colorare.

Coloraţie cu argint

10 ng/bandă

Sensibilitate foarte bună, dificil de realizat, necesită o calitate deosebit de bună a reactivilor utilizaţi

Coloraţie cuprică

10-100 ng/bandă

Rapidă şi uşor de realizat, nu poate fi aplicată decât pentru gelurile cu SDS.

Coloraţie cu Zn

10-100 ng/bandă

Rapidă şi uşor de realizat, nu poate fi aplicată decât pentru gelurile cu SDS.

1-8 ng/bandă

Rapidă şi uşor de realizat, aplicabilă tuturor tipurilor de geluri, necesită sistem de achiziţie a imaginilor în UV

Coloranţi luminescenti SYPRO .

tip


259

Colorarea cu Comassie Brilliant Blue R-250 Principiul metodei: Colorarea cu Comassie Brilliant Blue R-250 este cea mai utilizată metodă de evidenţiere a proteinelor pe gelurile de poliacrilamidă datorită simplităţii sale. Proteinele sunt simultan fixate şi colorate utilizând o soluţie metanolică de Comasssie Briliant Blue R-250 (colorant textil cunoscut sub numele comercial de Acid Blue 38 (11). Colorantul are proprietatea de a se lega specific de moleculele proteice, astfel încât acestea vor apărea colorate în albastru pe un fond transparent. Colorantul se leagă de toate proteinele colorându-le uniform. Materiale necesare: 1. soluţie pentru colorare – se prepară prin dizolvarea a 0,25 g Comassie Brilliant Blue R250 în 100 ml amestec metanol:acid acetic:apă distilată 45:10:45 (v/v). colorantul se dizolvă în metanol după care se adaugă apa şi acidul acetic; Metanolul este deosebit de toxic pentru organismul uman. Ingestia, inhalarea sau absorbţia cutanată a unei cantităţi de metanol (> 20 mg%) determină simptome primare precum depresia sistemului nervos central, cefalee, vertij, greaţă, pierderea echilibrului, confuzie, scăderea acuităţii vizuale etc., iar după aproximativ zece ore apar distrugerea nervului optic şi acidoza. Doza letală este de 1-2 ml metanol pur/kg corp.Pentru a se evita intoxicarea cu metanol se recomandă manipularea cu grijă a acestuia, utilizând echipamente de protecţie (halat, mănuşi, mască de protecţie). 2. soluţie pentru decolorare – metanol:acid acetic: apă 45:10:45 (v/v); 3. soluţie pentru fixare – acid acetic 10%; 4. agitator orbital de laborator;


260

5. vas de colorare cu capac, din material plastic sau sticlă. Mod de lucru Dupa separarea electroforetică, gelul de poliacrilamidă este clătit, dacă este cazul, cu apă distilată pentru îndepărtarea SDS-ului, după care este plasat într-un vas cu aproximativ 5 volume de soluţie pentru colorare (sau o cantitate suficientă pentru a acoperi complet gelul). Se incubează sub agitare timp de aproximativ două ore, după care se îndepărteazăcolorantul. Gelul se clăteşte cu apă distilată pentru îndepărtarea excesului de colorant, după care se imersează în soluţia de decolorare unde se menţine timp de 4-8 ore. În acest timp, soluţia de decolorare se schimbă de 3-4 ori, după ce devine puternic colorată. Decolorarea este considerată finalizată când fundalul devine transparent. Uneori, după decolorare, benzile pot fi uşor difuze, iar fundalul uşor colorat. Menţinerea gelului în soluţia de fixare timp de 10-20 ore conduce la rezolvarea acestor probleme. Timpii de incubare variază în limite destul de largi în funcţie de dimensiunea gelului, valorile menţionate fiind valabile pentru un gel de format mini. Odată decolorarea finalizată, gelul poate fi supus analizei prin fotografiere, scanare, densitometrare(pentru detalii consultaţi subcapitolul Fotografierea gelurilor şi analiza imaginilor. Stabilirea masei moleculare relative, pagina 264) sau poate fi păstrat în soluţia de fixare pentru perioade mari de timp. O modalitate mai simplă de păstrare a gelurilor este uscarea lor, folosind dispozitive specifice. Prin uscare rezoluţia gelului scade, motiv pentru care este indicat ca gelul sa fie mai întâi fotografiat şi apoi uscat. Viteza de decolorare poate fi mărită prin: a. folosirea unei soluţii de metanol 30% şi acid acetic 10%; menţinerea prelungită a gelurilor în această soluţie duce la scăderea intensităţii benzilor corespunzătoare fracţiilor proteice; b. încălzirea soluţiei de decolorare la temperaturi mai mari de o 45 C; operaţia trebuie să se realizeze însă cu atenţie deosebită datorită prezenţei metanolului inflamabil şi toxic. Un protocol alternativ de decolorare, care elimină necesitatea utilizării metanolului, foloseşte pentru colorare o soluţie de Comassie


261

Brillant Blue R-250 0,25% în isopropanol:acid acetic:apă 25:10:65 (v/v) iar pentru decolorare etanol:acid acetic:apă 10:10:80 (v/v).

Colorarea cu argint a gelurilor de poliacrilamidă Metodele care folosesc argintul pentru evidenţierea proteinelor pe geluri de poliacrilamidă descrise în literatură pot fi împărţite în două categorii: metode care folosesc argint amoniacal şi metode care utilizează nitratul de argint (11). Sunt preferate metodele din ultima categorie, deoarece soluţiile de nitrat de argint sunt mai uşor de preparat şi nu generează subproduşi potenţial explozivi. Metoda de colorare prezentată mai jos a fost descrisă de Sammons et al. (1981)(19) şi modificată de Schoenle et al. (1984) (20). Metode alternative de colorare utilizând argintul sunt descrise şi de Ausubel et al. (2004) (16). Principiul metodei Metoda se bazează pe reducerea diferenţiată a ionilor de argint legaţi de catenele laterale ale aminoacizilor. Gelul este impregnat cu ioni de argint, care sunt supuşi apoi unei reacţii de reducere sub influenţa unei aldehide. Reacţia este iniţiată de molecule proteice care se vor colora, în timp ce gelul va rămâne incolor. Avantaje: -

sensibilitatea neegalată de nici o altă modalitate de evidenţiere a proteinelor

-

poate fi utilizată atât pentru geluri obţinute prin electroforeză în condiţii denaturante, cât şi pentru cele obţinute prin electroforeză în condiţii native, prin izoelectrofocusare sau electroforeză bidimensională.


262

Limitări: -

-

sensibilitatea deosebită atrage după sine o serie de dezavantaje care se referă în special la uşurinţa cu care o serie de factori interferă cu procesul de colorare. Respectarea timpilor de incubare, calitatea reactivilor şi curăţenia ustensilelor utilizate sunt esenţiale pentru obţinerea unor rezultate reproductibile. colorarea proteinelor nu este uniformă, ci depinde de compoziţia în aminoacizi a proteinelor luate în studiu. Legarea Ag de moleculele proteice şi prin urmare colorarea sunt dependente de prezenţa diverselor grupe funcţionale (carbonil, sulfhidril) de pe catena polipeptidică.

Materiale necesare 1. soluţie de fixare – etanol:acid acetic: apă 30:10:60 (v/v); 2. etanol 30% în apă deionizată (sau bidistilată); 3. soluţie stoc AgNO3 20% în apă deionizată (sau bidistilată); se păstrează la temperatura camerei, în vase de culoare brună, bine închise; înainte de utilizare se prepară o soluţie 0,1% prin diluare cu apă deionizată (sau bidistilată); 4. soluţie carbonat de sodiu 2,5%, formaldehidă 0,02% – se prepară extemporaneu prin dizolvarea a 2,5 g carbonat de sodiu şi 0,054 ml formaldehidă 37% în 97,48 ml apă deionizată (sau bidistilată); Vaporii de formaldehidă sunt toxici, motiv pentru care soluţia trebuie pregătită sub nişă. 5. soluţie de stopare – acid acetic 1% în apă deionizată (sau bidistilată) 6. agitator orbital de laborator; 7. vas pentru colorare; Eventual, după caz sunt sunt necesare de asemenea şi:


263

8. soluţie A – se prepară prin dizolvarea a 37 g NaCl şi 37 g CuSO4 în 850 ml apă deionizată (sau bidistilată); se adaugă NH4OH concentrat până se formează un precipitat albastru care apoi se dizolvă; 9. soluţie B – se dizolvă 436 g Na2S2O3 în 900 ml apă deionizată (sau bidistilată); se aduce soluţia la 1000 ml cu apă deionizată (sau bidistilată). Mod de lucru: 1. după terminarea electroforezei (marcată de momentul în care frontul colorantului părăseşte gelul) se desprinde gelul dintre plăcile din sticlă şi se menţine în cel puţin cinci volume soluţie de fixare timp de 4-12 ore sub uşoară agitare; datorită sensibilităţii deosebite a metodei este absolut necesar ca toate etapele de manipulare a gelului să se realizeze doar cu mănuşi. 2. se îndepărtează soluţia de fixare, apoi gelul este spălat de două ori în cel puţin 5 volume etanol 30% timp de 30 minute sub agitare: 3. se spală gelul din nou de două ori în cel puţin zece volume apă deionizată (sau bidistilată) timp de 10 minute, la temperatura camerei, sub agitare; în această etapă de rehidratre gelul se va umfla uşor. 4. se iniţiazăcolorarea propriu-zisăprin incubarea gelului timp de 30 minute în cel puţin cinci volume soluţie 0,1% AgNO3 preparată extemporaneu din soluţia stoc. 5. soluţia de AgNO3 se aruncă şi se spală fiecare faţă a gelului timp de 20 minute cu ajutorul unei pisete cu apă deionizată (sau bidistilată); nu trebuie permisă uscarea nici uneia dintre feţele gelului, deoarece aceasta va duce la apariţia de artefacte. 6. în vederea dezvoltării culorii, gelul se incubează în soluţie proaspăt preparată de carbonat de sodiu 2,5% şi formaldehidă 0,02%, la temperatura camerei, sub uşoară agitare; în general, benzile vor deveni vizibile în doar câteva minute; reacţia se întrerupe în momentul în care benzile prezintă intensitatea dorită; această etapă nu trebuie prelungită foarte mult timp pentru a se preveni colorarea gelului; reacţia se opreşte prin spălarea gelului cu acid acetic 1% timp de câteva minute; gelul este apoi spălat de câteva ori cu apă deionizată timp de câte 10 minute; 7. dacă pe suprafaţa gelului apare un film strălucitor de argint,

264


acesta poate fi îndepărtat prin spălare cu o soluţie reducătoare preparată prin combinarea unor volume egale din soluţiile A şi B şi diluarea amestecului cu trei volume de apă deionizată. După colorare, gelul poate fi imediat fotografiat şi păstrat prin uscare.

X.4 Fotografierea gelurilor şi analiza imaginilor. Stabilirea masei moleculare relative Gelul rezultat, conţinând fracţiunile separate, poate fi analizat prin vizualizare directă. Realizarea de operaţii mai complicate, precum cuantificarea benzilor, aprecierea maselor moleculare relative sunt dificil de efectuat şi sunt susceptibile de erori doar prin simpla observare cu ochiul liber. Din aceste motive este preferată utilizarea unor metode standard, care elimină erorile introduse de subiectivismul operatorului. O astfel de metodă constă în fotografierea gelurilor şi analiza lor cu ajutorul programelor specializate. Această abordare oferă şi avantajul că imaginea gelului poate fi păstrată pe termen nelimitat şi reprodusă ori de câte ori este nevoie. Achiziţia imaginilor gelurilor de poliacrilamidă sau de agaroză, indiferent de coloraţia utilizată (vizibil sau cu fluorescenţă), se poate realiza fie prin utilizarea unor camere video, fie prin utilizarea unor scanere. Camerele video CCD (engl.Charge-Coupled Device) sunt în general plasate în interiorul unei incinte obscure şi permit fotografierea gelurilor de dimensiuni mici. Ele prezintă avantajul că pot achiziţiona semnalul luminos o perioadă mai îndelungată de timp, oferind astfel o sensibilitate mai mare. Camerele cu sensibilitate foare mare au, în general, senzorul de lumină răcit în mod activ. În comerţ există numeroase soluţii de achiziţie a imaginilor oferite de producători precum Bio-RaD (sistemele GelDoc) UVP (sistemele GelDoc IT, BioDoc IT) sau Vilber-Lourmat (sistemele Bio-Vision). Scanerele (fie că este vorba de scanere speciale pentru aplicaţii de laborator sau de scanere obişnuite de birou) trebuie să fie rezistente la umezeală şi să poată scana în transmitanţă. Scanerele de birou nu pot fi utilizate pentru geluri fluorescente (gelurile de agaroză colorate cu bromură de etidiu). Amersham Biosciences comercializează o gamă foarte


265

variată de scanere, cu aplicaţii multiple. După ce se realizează achiziţia imaginilor, acestea pot fi prelucrate şi analizate folosind diverse pachete software. În general, producătorul sistemului de achiziţie a imaginilor pune la dispoziţie aceste programe de analiză (VisionWorks LS, UVP; Photo-Capt, Vilber-Lourmat; Quantity One 1-D, Bio-RAD). Există, de asemenea, soluţii independente de sistemul de achiziţie precum ImageQuant TL propus de Amersham Biosciences. Preţurile de achiziţie sunt destul de ridicate, însă oferă o foarte mare uşurinţă de utilizare. O soluţie mai puţin costisitoare, dar care cere mult mai multe cunoştinţe şi experienţă din partea operatorului este ImageJ (21). Programul, dezvoltat de National Institute of Health (NIH), USA, foloseşte tehnologia Java, fiind astfel independent de sistemul de operare. Gama de operaţii pe care o poate realiza este uşor de mărit prin dezvoltarea de plug-in-uri. Acestea, ca şi aplicaţia în sine, sunt disponibile gratuit pe site-ul web oficial: http://rsbweb.nih.gov/ij/. Avantaje: Programul ImageJ poate fi utilizat pentru aprecierea masei moleculare relative, Rf-ului, stabilirea concentraţiei unei probe necunoscute folosind fotografia unui gel (indiferent dacă este vorba ADN sau proteine) sau fotografia unei plăci de cromatografie în strat subţire. Limitări: Aplicaţia ImageJ nu este foarte uşor de utilizat, presupunând realizarea şi respectarea unor suite de acţiuni foarte stricte. Din aceste motive, procesarea de geluri complexe, cu un număr mare de fracţiuni durează foarte mult timp. Programele specializate, menţionate anterior, au avantajul că realizează toate aceste etape automat. Densitometrarea gelurilor nu este cea mai indicată metodă pentru determinarea concentraţiei unei proteine dintr-un amestec. Operaţia se poate realiza, dar este necesară utilizarea şi raportarea foarte precis la un set bine stabilit de proteine etalon. Astfel, pentru a obţine valori absolute (mg proteină) este necesar ca fiecare gel să conţină probe standard cu

266


concentraţii cunoscute. Cele mai indicate sunt standardele care conţin chiar proteina de interes, în lipsa acesteia putându-se utiliza şi proteine purificate comune (de exemplu albumina serică bovină, BSA). Gama de concentraţii a standardelor trebuie să fie aleasă în aşa fel încât proba necunoscută să aibă o concentraţie intermediară. În acest caz, cantităţile obţinute vor fi exprimate ca mg BSA. Mod de lucru: În continuare sunt prezentate etapele necesare aprecierii masei moleculare şi concentraţiei unei probe pe un gel SDS-PAGE. Trebuie menţionat că aceste etape sunt identice şi în cazul cuantificării unui gel ADN sau a unei plăci cromatografice. Aprecierea concentraţiei unei probe necunoscute se realizează parcurgând următorii paşi: 1. se separară electroforetic proba de interes simultan cu standardele şi amestecul de proteine cu mase moleculare cunoscute, urmând protocolul descris anterior; După separare, gelul este colorat şi fotografiat în format .tif sau .jpeg (Figura 28);

FIGURA 28. Imaginea unui gel SDS-PAGE cu godeurile marcate în aplicaţia ImageJ 1 – marker de masă moleculară, 2 – probă de concentraţie necunoscută, 3,4,5 – standarde conţinând 9; 2,5; 0,5 μg proteină


267

2. se lansează aplicaţia imageJ şi din meniul File se selectează comanda Open; se indică calea către fotografia de interes; 3.se selectează Rectangular Selection şi se marchează primul godeu; Dreptunghiul ce selectează godeul trebuie să fie suficient de mare astfel încât să poată fi mai apoi mutat pe fiecare lane în parte; dimensiunea lui nu poate fi modificată după selecţia primului godeu Se apasă Ctrl+1 (sau se accesează Analyze – Gels – Select first lane) ceea ce va duce la marcarea şi numerotarea primului godeu; dreptunghiul de selecţie este apoi mutat pe următorul godeu, şi se apasă Ctrl+2 (Analyze – Gels – Select next lane); se procedează astfel cu toate godeurile de interes, după care se apasă Ctrl + 3 (Analyze – Gels – Plot lanes); se va deschide o nouă fereastră care va conţine densitograma gelului, fiecare godeu fiind reprezentat pe orizontală; Fracţiunile separate se transformă în peak-uri a căror arie este dependentă de concentraţia proteinei corespunzătoare; în acest punctimaginea de pe ecranul monitorului este asemănătoare cu cea prezentată în Figura 29.


268

A

B

C FIGURA 29. Interfaţa de utilizare a programului ImageJ.

A – fereastra principală cu bara de instrumente; B – fereastra pentru marcarea godeurilor: C – fereastra cu densitograma gelului

4. se selectează Straight line selection şi prin trasarea de linii se stabileşte linia de bază pentru fiecare peak; pentru etapa următoare este absolut necesar ca fiecare peak să delimiteze un perimetru închis; 5. se selectează Wand (tracing) tool şi se face click pe fiecare peak corespunzător unei fracţiuni care trebuie cuantificată; va apărea o nouă fereastră, în care sunt prezentate ariile peak-urilor măsurate; aceste arii vor fi utilizate pentru aprecierea cantităţii de proteine, prin trasarea unei curbe de etalonare; operaţia se poate realiza direct pe hârtie milimetrică sau folosind programe specializate (Ex. Microsoft Excel); Un exemplu de arii şi curbă de etalonare (realizată cu standardele 3; 4; 5) este prezentat în Figura 30.


269

A

B

FIGURA 30. Rezultate tipice obţinute prin densitometrarea unui gel SDS-PAGE (A) şi trasarea curbei de etalonare (B). Utilizând dreapta de etalonare obţinută din ariile probelor 3, 4 şi 5 se poate calcula cantitatea de proteină din proba necunoscută (proba 2, mg proteină = (5513,820 - 27.94)/688.59 = 7,96 mg. Pentru aprecierea masei moleculare relative este necesară migrarea în paralel a unor proteine cu masă moleculară cunoscută (în cazul gelului din Figura 28, godeul 1, Sigma Wide Range Protein Markers). Etapele care trebuie parcurse sunt identice cu cele folosite pentru aprecierea concentraţiei până la punctul 3, după care se procedează astfel: 1. se închide fereastra conţinând densitograma şi se răspunde da la întrebarea dacă se doreşte salvarea imaginii; din meniul File se selectează comanda Open şi se indică calea către imaginea salvată; 2. se selectează Straight line selections şi cu ajutorul cursorului, ţinând tasta Shift apăsată se trasează o linie orizontală de la capătul din stânga al densitogramei până la vârful peak-ului de interes; 3. se apasă Ctrl+M (sau se accesează meniul Analyze – Measure) pentru a măsura distanţa marcată; se va deschide o fereastră care ne arată rezultatul măsurătorii (lungimea porţiunii marcate şi unghiul); Valoarea unghiului trebuie să fie zero la toate măsurătorile; 4. etapele 7 şi 8 se repetă pentru toate fracţiunile (peak-urile) standard şi pentru probă; se măsoară de asemenea distanţa de la capătul din stânga al desitogramei până la peak-ul corespunzător frontului colorantului (sau până la capătul din dreapta, dacă colorantul nu este vizibil); rezultatele obţinute pot fi salvate în format .cvs şi importate în Microsoft Excel; se împarte distanţa obţinută pentru fiecare peak la distanţa corespunzătoare


270

colorantului pentru a obţine valoarea mobilităţii relative a fracţiei respective (Rf) (22); se construieşte o curbă de calibrare prin plasarea pe un sistem de coordonate a valorilor Rf şi a valorilor logaritmului maselor moleculare ale proteinelor standard; de pe dreapta obţinută, prin extrapolare, se poate determina masa moleculară a probei necunoscute. Bibliografie 1. Westermeier, R. (2005) –Electrophoresis in Practice: A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations (Westermeier, R., Ed.). Wiley-VCH. 2. Kunkel, H. G., Tiselius, A. (1951) –Electrophoresis of proteins on filter paper., The Journal of General Physiology, 35, 89-118. 3. Kohn, J. (1957) –An Immuno-electrophoretic Technique, Nature, 180, 986-987. 4. Smithies, O. (1955) –Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults., The Biochemical Journal, l61, 629-41. 5. Scherz, H. (1990) –Thin-layer electrophoretic separation of monosaccharides, oligosaccharides and related compounds on reverse phase silica gel., Electrophoresis, 11, 18-22. 6. Dennison, C. (1999) –A Guide to Protein Isolation, p 122-133. Springer. 7. Ornstein, L. (1964) –Disc electrophoresis I. Background and theory, Annals of the New York Academy of Sciences, 121, 321-49. 8. Davis, B. J. (1964) –Disc electrophoresis II. Method and application to human serum proteins., Annals of the New York Academy of Sciences, 121, 404-27. 9. Chrambach, A., Jovin, T. M. (1983) –Selected buffer systems for moving boundary electrophoresis on gels at various pH values, presented in a simplified manner, Electrophoresis, 4, 190-204. 10. Niepmann, M., Zheng, J. (2006) –Discontinuous native protein gel electrophoresis., Electrophoresis, 27, 3949-51. 11. Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) –Molecular Cloning - A Laboratory Manual, p. 18.47-18.58. Cold Spring Harbour Laboratory Press.


271

12. Gerstein, A. S. (2001) –Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide (Gerstein, A. S., Ed.), p 331-373. Wiley-Liss. 13. Laemmli, U. K. (1970) –Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685. 14. Schägger, H. (2006) –Tricine-SDS-PAGE., Nature protocols, 1, 16-22. 15. Poduslo, J. F. (1981) –Glycoprotein molecular-weight estimation using sodium dodecyl sulfate-pore gradient electrophoresis: comparison of tris-glycine and tris-borate-EDTA buffer systems., Analytical Biochemistry,114, 131-9. 16. Ausubel, M. F., Brent, R., Kingston, E. R., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, A. J., Struhl, K. (2002) –Short Protocols in Molecular Biology, p 10.1-10.31. John Wiley & Sons. 17. Manchenko, G. P. (2002) –Handbook of Detection of Enzymes on Electrophoretic Gels, Second Edition. CRC Press. 18. Westermeier, R., Naven, T., Hamppker, H. R. (2008) –Proteomics in Practice: A Guide to Successful Experimental Design (Westermeier, R., Ed.), p 19-27. Wiley-VCH. 19. Sammons, D. W., Adams, L. D., Nishizawa, E. E. (1981)– Ultrasensitive silver-based color staining of polypeptides in polyacrylamide gels, Electrophoresis2, 135-141. 20. Schoenle, E. J., Adams, L. D., Sammons, D. W. (1984) –Insulininduced rapid decrease of a major protein in fat cell plasma membranes., The Journal of Biological Chemistry, 259, 12112-6. 21. Abramoff, D. M., Magelhaes, J. P., Ram, J. S. (2004) –Image processing with ImageJ, Biophotonics International, 11, 36-42. 22. Garfin, D. (1990) –One-dimensional gel electrophoresis, Methods in Enzymology, 182, 425-441.

XI. EVIDENŢIEREA IMUNOLOGICĂ A PROTEINELOR – TEHNICA WESTERN-BLOT Tehnicile imunologice şi-au găsit un număr foarte mare de utilizări în proteomică, având aplicaţii diverse, de la identificarea proteinelor cu ajutorul anticorpilor până la purificarea proteinelor prin imunoprecipitare sau cromatografie de imunoafinitate (1). În cele ce urmează sunt prezentate tehnicile ce stau la baza metodei cunoscute sub numele general de Western-blot, metodă ce are ca scop evidenţierea şi identificarea specifică a moleculelor proteice transferate pe membrane: producerea anticorpilor policlonali şi imunobloting-ul.

XI.1 Obţinerea anticorpilor policlonali. Tehnici de imunizare Anticorpii sunt proteine serice care apar în organism ca răspuns la pătrunderea antigenelor şi au capacitatea de a reacţiona specific atât „in vivo” cât şi „in vitro” cu antigenele care le-au indus apariţia. Anticorpii policlonali sunt molecule de imunoglobuline (Ig) produse de diferite tipuri de limfocite B ca urmare a stimulării cu un antigen specific ce prezintă mai mulţi epitopi diferiţi. Spre deosebire de anticorpii monoclonali produşi de un singur tip de limfocit B faţă de un singur epitop specific, cei policlonali reprezintă un amestec de anticorpi, fiecare fiind determinat şi capabil să reacţioneze specific cu un anumit epitop din structura antigenului. În mod obişnuit anticorpii apar în serul sanguin al indivizilor sau pacienţilor care au intrat în contact cu antigenele; cu toate acestea, anticorpii pot fi obţinuţi şi în laborator prin imunizarea unor animale cu antigene purificate sau parţial purificate (2). Cele mai utilizate antigene în acest sens sunt proteinele sau peptidele, dar se pot folosi şi glucide, acizi nucleici, celule sau ţesuturi. Obţinerea anticorpilor policlonali depinde în mare măsură de

274


calitatea, cantitatea şi puritatea antigenului, precum şi de specificitatea şi sensibilitatea reacţiei (2). În cazul utilizării ca antigen a proteinelor, acestea trebuie să fie pure, putând fi folosite atât formele denaturate cât şi cele native. De asemenea trebuie să se ţină cont de faptul că eventualii contaminanţi care se pot administra împreună cu antigenul pot declanşa o reacţie imună mult mai puternică, ceea ce duce la sinteza unor anticorpi cu o specificitate mai mare pentru contaminant decât pentru proteina de interes. Anticorpii policlonali pot fi obţinuţi prin metode mai simple şi într-un timp mai scurt în comparaţie cu cei monoclonali. Metodele de obţinere necesită echipamente relativ ieftine şi disponibile în orice laborator de biologie moleculară. În plus, anticorpii policlonali obţinuţi prin imunizarea animalelor de laborator oferă şi avantajul utilizării directe într-o serie de tehnici ca imunoprecipitarea, imunobloting-ul sau ELISA (engl. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays). Alegerea animalelor ce urmează a fi imunizate trebuie să ţină cont de câteva criterii: 1. specificitatea anticorpilor ce urmează a fi obţinuţi: de ex. pentru obţinerea anticorpilor cu o înaltă specificitate se preferă utilizarea unor animale transgenice; 2. relaţia dintre specia donor a antigenului şi cea a producătorului de anticorpi: cu cât distanţa filogenetică între cele două organisme este mai mare cu atât potenţialul de producere al anticorpilor este mai ridicat. 3. cantitatea anticorpilor necesară: în funcţie de cantitatea de ser dorită pot fi imunizaţi şoareci şi şobolani de laborator, hamsteri sau iepuri; de pildă imunizarea iepurilor permite obţinerea unui volum de 25 ml ser la fiecare sângerare fără a pune în pericol viaţa acestuia; pentru experimente la scară mai mică sau pentru obţinerea unor anticorpi cu o specificitate ridicată se pot utiliza şi linii inbred de şoareci; utilizarea şoarecilor are şi un alt avantaj: datorită taliei mai mici, volumul suspensiei de antigen necesară pentru imunizare este de asemenea mai mic; în cazul şoarecilor la o singură sângerare se pot obţine 0,5 ml ser, dar prin sângerări succesive se poate ajunge până la un volum de aproximativ 5 ml (2). 4. este extrem de important ca pentru imunizarea animalelor în scopul obţinerii de anticorpi să se aleagă metoda potrivită în funcţie de natura antigenului ce va fi folosit (3).

Western-blot

275

Obţinerea anticorpilor policlonali folosind adjuvantul Freund Adjuvantul Freund reprezintă o emulsie a soluţiei care conţine antigenul în ulei mineral de parafină. Amestecul adjuvant-antigen se administrează prin injectare având rolul de a intensifica răspunsul imun specific faţă de antigenul respectiv (4). În prezenţa adjuvantului Freund, proteina-antigen de interes este injectată intramuscular, intradermic sau subcutanat unui animal de laborator în scopul declanşării unui răspuns imun şi al sintezei anticorpilor specifici. Dacă în compoziţie se adaugă celule inactivate şi deshidratate de micobacterii (de obicei Mycobacterium tuberculosis), se obţine adjuvantul Freund complet. Efectul stimulator al adjuvantului Freund este foarte intens pentru dozele mici de antigen, fiind foarte eficient în asociaţie cu antigenele proteice, stimulând sinteza IgG. Consecutiv primei imunizări, se practică imunizări ulterioare la 4-8 săptămâni, continuându-se la intervale de 2-3 săptămâni (1). La intervale regulate se practică sângerarea animalului în scopul obţinerii serurilor imune. Materiale necesare 1. 2.

animale de imunizat: iepuri, şobolani, şoareci sau hamsteri; adjuvantul Freund complet;

3. 4. 5. 6.

Adjuvantul Freund complet este un agent inflamator extrem de puternic, în special în situaţia în care este injectat intradermic sau pătrunde în ochi; poate cauza descuamarea profundă a pielii sau pierderea vederii; injectarea poate determina o reacţie pozitivă la testul pentru tuberculoză şi poate duce la reacţii granulomatoase; se recomandă utilizarea mănuşilor şi a ochelarilor de protecţie atunci când se manipulează acest reactiv. proteina-antigen de interes purificată; adjuvantul Freund incomplet; tuburi centrifugă de 50 ml; seringi de 3 ml cu ace sterile.

276


Modul de lucru 1. înainte de prima imunizare se practică sângerarea animalului şi se colectează sânge în tuburi de centrifugă de 50 ml; pentru obţinerea serului sanguin pre-imun se procedează după cum urmează: – se lasă tuburile de centrifugă ce conţin sângele recoltat 4 ore la temperatura camerei până la coagulare, apoi se păstrează peste noapte la 4oC. – se deprind cu atenţie cheagurile de pe pereţii tubului de centrifugă şi se îndepărtează cu ajutorul unui aplicator de lemn; – se transferă serul într-un tub de centrifugă curat; – se centrifughează 10 minute la 4000 rpm şi 4oC şi se păstrează supernatantul; – se stochează serul în alicote la -20oC (unele seruri îşi pierd activitatea prin cicluri succesive congelare-decongelare; altele sunt instabile la 4oC). Serul preimun este utilizat ca un control pentru a avea certitudinea că anticorpii detectaţi la sângerările ulterioare se datorează imunizării şi nu unui contact anterior al animalului cu antigenul (element extrem de important în special dacă proteina de imunizat provine de la bacterii potenţial patogene). 2. se agită adjuvantul Freund complet pentru dispersia celulelor inactivate de Mycobacterium tuberculosis; se adaugă 2 ml din adjuvantul Freund complet în 2 ml soluţie ce conţine 0,25-0,5 mg proteină-antigen; aceste volume sunt suficiente pentru imunizarea a 4 iepuri sau 80 de şoareci (1); 3. amestecul adjuvant Freund complet – proteină este introdus într-o seringă de 3 ml, înlăturându-se excesul de aer; cu ajutorul unui conector se leagă această seringă de o altă seringă sterilă de volum asemănător; dispozitivul obţinut se utilizează pentru omogenizarea amestecului adjuvant Freund complet – proteină care este forţat să treacă dintr-o seringă în alta în mod repetat; când amestecul este omogen şi alb se deconectează dispozitivul şi se verifică stabilitatea emulsiei obţinute prin depunerea unei picături la suprafaţa apei, dintr-un pahar Berzelius: o emulsie bună va rămâne la suprafaţa apei sub forma unei picături; dacă picătura dispersează pe suprafaţa apei se repetă operaţiunea de

Western-blot

277

omogenizare până la formarea unei emulsii stabile. Emulsionarea se poate realiza şi prin vortex-area puternică a amestecului. 4. se transferă toată emulsia adjuvant-proteină într-o seringă prevăzută cu ac steril şi se îndepărtează excesul de aer; 5. se injectează animalul de experienţă cu emulsia adjuvant-proteină intramuscular, intradermic sau subcutanat în locuri diferite; 6. se produce sângerarea animalului la 10-14 zile după prima imunizare în scopul obţinerii serului imun; acest ser se caracterizează printr-un titru scăzut şi o afinitate redusă a anticorpilor. 7. pentru imunizările ulterioare se prepară din nou proteina-antigen de interes repetând paşii 2-4; dacă la prima imunizare s-a utilizat adjuvantul Freund complet, pentru toate imunizările ulterioare se va utiliza numai adjuvant Freund incomplet; 8. se practică o nouă imunizare la 4-8 săptămâni de la prima imunizare; după 7-14 zile se produce sângerarea animalului şi se recoltează sângele în vederea obţinerii serului imun; în unele cazuri se poate realiza a doua imunizare la 2 săptămâni după prima, însă ideal ar fi ca distanţa în timp să fie de cel puţin 19 zile (1); 9. ulterior se pot realiza alte imunizări la intervale de 2-3 săptămâni; după 10-14 zile de la fiecare imunizare se recoltează sângele şi se prepară serul imun; după a treia imunizare se obţine primul ser cu un titru ridicat al anticorpilor; dacă titrul anticorpilor specifici este mai mic de 1 mg/ml, se recomandă imunizări ulterioare. Trebuie avut în vedere faptul că imunizările repetate prin injectare intradermică pot produce ulceraţii ale pielii; din acest motiv se recomandă ca prima imunizare intradermică să fie urmată de imunizări ulterioare prin injectare intramusculară (1). Evoluţia răspunsului imun este similară la iepuri, şobolani, şoareci şi hamsteri. În cazul majorităţii antigenelor solubile de natură proteică sinteza anticorpilor specifici debutează după 5-7 zile de la prima imunizare. Titrul anticorpilor continuă să crească până în ziua a 12-a după care începe să scadă. În cazul răspunsului imun secundar generat de imunizările ulterioare, vârful producţiei de anticorpi se înregistrează la 7-14 zile de la injectarea antigenului, când se realizează şi sângerarea animalului. Datorită existenţei limfocitelor B cu memorie se poate obţine

278


un răspuns specific până la 6 luni sau un an de la ultima imunizare. Afinitatea şi gradul de specificitate al anticorpilor creşte odată cu numărul de imunizări efectuate. Serurile imune obţinute pot fi utilizate direct pentru analizele ulterioare – Western blot.

XI.2 Imunobloting-ul Tehnicile de imunobloting sau Western bloting-ul se utilizează în scopul identificării unor proteine recunoscute specific de anticorpi monoclonali sau policlonali. Termenul de Western bloting a fost folosit pentru prima dată de Burnette (5) cu referire la metoda imobilizării proteinelor pe membrane dezvoltată de Towbin şi colab (6). În scopul identificării, proteinele sunt separate electroforetic folosind SDS-PAGE (pentru detalii consultaţi capitolul X– Separarea electroforetică a proteinelor, pagina 241), după care sunt transferate pe membrane de nitroceluloză, nailon sau difluorură de poliviniliden. Proteinele transferate se leagă de suprafaţa membranei utilizate, furnizând suprafaţa de reacţie cu reactivii de imunodetecţie. Imuno-detecţia propriu-zisă constă în tratarea membranei cu un anticorp primar care se leagă specific de proteina de interes. Situsurile de legare rămase libere sunt apoi blocate prin imersarea membranei într-o soluţie ce conţine un agent de blocare (o proteină sau un detergent inert din punct de vedere imunologic). Membrana este spălată şi apoi tratată cu un anticorp secundar anti-IgG ce se va lega de anticorpul primar. Anticorpul secundar este modificat în mod specific, în sensul că este cuplat cu o enzimă ce poate genera în prezenţa unui substrat cromogen, produs colorat ce marchează prezenţa proteinei de interes. O variantă mai simplă de imunobloting este reprezentată de dot blot. În acest caz proteinele de interes nu mai sunt separate electroforetic, ci sunt depuse direct pe membrană sub forma unui spot. Dot blot-ul este o tehnică preliminară folosită pentru identificarea antigenului într-o probă.

Western-blot

279

Electro-transferul proteinelor pe membrane în sistem semi-uscat O metodă eficientă de transfer a majorităţii proteinelor din gelul de poliacrilamidă pe membrane diverse este reprezentată de blot-ul semiuscat. În acest caz, gelul de poliacrilamidă este plasat orizontal, peste membrană, între foi de hârtie de filtru saturate cu soluţie tampon (Figura 31). Electrozii sunt puşi în contact direct cu foile de hârtie de filtru, foarte aproape unul de celălalt. Prin aplicarea unui curent de la o sursă de curent standard precum cea utilizată pentru electroforeză, proteinele încarcate negativ vor migra rapid din pe gelul de poliacrilamidă pe membrana(7). Catod

Hârtie de filtru îmbibată în soluție tampon Gel Membrană de nitroceluloză Hârtie de filtru îmbibată în soluție tampon

Placă anod

Anod FIGURA 31. Schema sistemului de electrotransfer semi-uscat al proteinelor pe membrane

280


Principiul metodei Identificarea unei proteine prin imunobloting se bazează pe reacţia specifică antigen-anticorp. Proteinele separate electroforetic sunt transferate de pe geluri pe membrane datorită proprietăţii lor de a migra în câmpurile electrice în funcţie de încărcarea lor. Ulterior membranele sunt incubate în prezenţa unui anticorp primar care se leagă specific de proteina de interes. Anticorpul primar oferă situsuri de recunoaştere pentru un anticorp secundar care este cuplat cu o enzimă ce permite vizualizarea uşoară printr-o reacţie cromogenă. Avantaje: Tehnicile de imunobloting se utilizează în principal pentru studiul expresiei, purificării şi modificărilor proteinelor având numeroase aplicaţii în cercetare şi diagnosticul clinic (8). Deşi iniţial a fost folosit doar pentru identificarea unor proteine din amestecuri migrate electroforetic, ulterior imunobloting-ul a fost combinat cu electroforeza bidimensională şi spectrometria de masă permiţând studiul isoformelor cu reactivitate încrucişată ale aceleaşi proteine rezultate prin modificări posttranslaţionale sau clivaje proteolitice (9). Aplicaţiile în diagnosticul de laborator se bazează pe identificarea unor antigene de natură proteică asociate cu diferiţi patogeni, alergeni sau tumori, folosind ca sursă de anticorpi primari serul pacientului. Limitări: Metoda se bazează pe reacţia specifică dintre un anticorp şi proteina corespunzătoare. Deoarece pe parcursul electroforezei proteinele suferă un proces de denaturare, recunoaşterea acestora de către anticorpii specifici poate avea de suferit. Din acest motiv eficienţa unui anumit anticorp de a se lega specific de proteina corespunzătoare trebuie determinată mai întâi empiric. Frecvent anticorpii diponibili comercial sunt caracterizaţi de producători din punctul de vedere al eficienţei lor în diferite aplicaţii (Western blot, imunoprecipitare).

Western-blot

281

Materiale necesare: 1. gel SDS-PAGE pe care a fost separat amestecul proteic 2. membrană de transfer din nitroceluloză (0,45 μm); se manipulează doar cu mănuşi. 3. tampon transfer: 25 mM TRIS-HCl, 150 mM glicină, 0,02% SDS, 20% (v/v) metanol; nu se ajustează pH-ul, acesta fiind 8,2-8,4; 4. hârtie Watmann Modul de lucru: Separarea electroforetică Prima etapă constă în separarea amestecului de proteine folosind electroforeza SDS-PAGE, ceea ce permite o ordonare a proteinelor în funcţie de masele moleculare (Pentru detalii privind realizarea acestei etape consultaţi capitolul X – Separarea electroforetică a proteinelor, pagina 241). Electro-transferul proteinei de interes pe membrane de nitroceluloză 1. se aşează 4 foi de hârtie de filtru saturate cu soluţie tampon de transfer peste placa anod; 2. peste acestea se aşează membrana de nitroceluloză echilibrată în prealabil 5 minute în soluţie tampon de transfer; se îndepărtează bulele de aer cu ajutorul unei eprubete care se rulează peste ansamblul format din hârtia de filtru şi membrana de nitroceluloză; 3. se aşează gelul de poliacrilamidă peste membrană; se rulează cu grijă eprubeta peste gel pentru îndepărtarea eventualelor bule de aer şi asigurarea un contact intim între aceasta şi membrană; 4. se adaugă 4 foi de hârtie de filtru saturate cu soluţie tampon de transfer peste gel şi se îndepărtează bulele de aer; deasupra se amplasează placa catod, iar întreg ansamblul format se strânge cu ajutorul unor şuruburi; 5. se conectează aparatul la o sursă de electroforeză şi se realizează electro-transferul timp de o oră la 250 mA;


282

Imunodetecţia proteinelor transferate pe membrane de nitroceluloză Materiale necesare 1. soluţie Ponceau S: 0.2% (w/v) Ponceau S în 10% (w/v) acid acetic; 2. tampon TBS: 20 mM TRIS-HCl, 500 mM NaCl, pH 7,5; 3. tampon TTBS: tampon TBS, 0,5 ml Tween 20/L; 4. tampon blocare (10X): 500 mM TRIS-HCl, 1,5M NaCl, pH 7,5; la prepararea soluţie 1X se adaugă Tween 20 – 0,5%; 5. tampon carbonat: 0,1 M NaHCO3, 1 mM MgCl2, pH 9,8; 6. anticorp primar – se poate utiliza direct serul imun obţinut prin sângerarea animalului imunizat cu proteina de interes; 7. anticorp secundar cuplat cu fosfatază alcalină; 8. tampon pentru developare: 20 ml tampon carbonat, 60 μl clorură de nitroblue tetrazoliu, soluţie 1,5% 5-bromo-indolil-fosfat (substrat pentru fosfataza alcalină); Mod de lucru: 1. după realizarea electrotransferului se desface aparatul, se scoate membrana şi se spală cu apă distilată; 2. se colorează membrana de nitroceluloză pentru 5 minute cu soluţie Ponceau S; după evidenţierea benzilor se notează cu un creion poziţia marker-ilor de masă moleculară folosiţi la electroforeza SDS-PAGE; 3. se decolorează membrana 5 minute cu apă distilată; 4. se introduce membrana în soluţie tampon de blocare şi se păstrează pentru 30 minute; 5. se introduce membrana 5 minute în soluţie tampon TBS; 6. se incubează membrana la temperatura camerei pentru 2 ore în soluţie tampon TBS în prezenţa serului imun care conţine

Western-blot

283

anticorpul primar, specific pentru proteina de interes (20 ml TBS + 10 μl ser imun); 7. după incubare se spală membrana în soluţie tampon TTBS pentru 30 minute; 8. se incubează membrana la temperatura camerei pentru o oră în soluţie tampon TBS în prezenţa anticorpului secundar cuplat cu fosfataza alcalină (20 ml TBS + 10 μl soluţie anticorp secundar); 9. se spală membrana în soluţie tampon TBS 10 minute; 10. se spală membrana în soluţie tampon TTBS 10 minute; 11. se menţine 10 minute în soluţie tampon carbonat; 12. se developează membrana în soluţie tampon de developare agitând uşor timp de 2-3 minute; 13. imediat după apariţia benzilor se spală cu apă distilată şi se usucă membrana între două foi de hârtie de filtru. Bibliografie 1.

2.

3. 4. 5.

Smith, J., A. (2003) –Immunology - Introduction in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. A., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Eds.), p 11.0.1-11.0.3. John Wiley & Sons. Cooper, H. E., Paterson, Y. (2003) –Preparation of Polyclonal Antisera in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. A., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Eds.), p 11.12.1--11.12.9. John Wiley & Sons. Burns, R. (2005) –Immunization Strategies for Antibody Production in Immunochemical Protocols (Burns, R., Ed.), p 317. Humana Press Inc., Totowa, New Jersey. Mihaescu, G. (2001) –Imunologie si imunochimie, p 456. Editura Universitatii din Bucuresti. Burnette, W. N. (1981) –“Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with

284

6.

7.

8. 9.


antibody and radioiodinated protein A, Analytical Biochemistry, 112, 195-203. Towbin, H. (1979) –Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications, Proceedings of the National Academy of Sciences, 76, 4350-4354. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrel, J. G. R. (2003) – Immunoblotting and Immunodetection in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. A., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K., Eds.), p 10.8.1--10.8.24. John Wiley & Sons, Inc. Negritto, M. C., Manthey, G. M. (2008) –Overview of Blotting in Current Protocols Essential Laboratory Techniques (Gallagher, S. R., Wiley, E. A., Eds.), p 806. John Wiley & Sons. Magi, B., Liberatori, S. (2005) –Immunoblotting Techniques in Immunochemical Protocols (Burns, R., Ed.) Third Edit., p 227-265. Humana Press Inc., Totowa, New Jersey.

XII. METODE COMPUTAŢIONALE DE STUDIU A PROTEINELOR Dezvoltarea metodelor moderne de investigare a proprietăţilor acizilor nucleici, precum PCR, clonarea şi secvenţierea au condus la acumularea unor cantităţi uriaşe de informaţii sub formă de secvenţe de nucleotide şi, bineînţeles, la dezvoltarea unor metode şi tehnici specifice de analiză şi prelucrare a acestora. Dacă până acum singura modalitate de identificare a secvenţei de aminoacizi a unei proteine era degradarea Edman, la momentul actual stabilirea structurii primare a unei proteine din secvenţa de nucleotide a genei ce o codifică a devenit o operaţie simplă, accesibilă oricărui cercetător. Mai mult, se poate spune chiar că asistăm la o adevărată revoluţie în domeniul metodelor de studiu a proteinelor (1), revoluţie ce permite deducerea atât a structurii cât şi a funcţiei unei proteine din secvenţa genei codificatoare. Toate metodele care manipulează sau analizează secvenţe de aminoacizi sau nucleotide folosesc puterea de calcul a computerului. Prin analogie cu denumirile in-vivo şi in-vitro şi datorită faptului că principala componentă a computerului implicată în calcule este procesorul confecţionat din siliciu, această clasă de metode computaţionale a primit denumirea generică de metode in-silico. Pe parcursul acestui capitol vom prezenta un set de metode care permit stabilirea nu doar a structurii primare şi secundare a unei proteine de interes, ci şi obţinerea de informaţii valoroase legate de funcţia acesteia plecând doar de la secvenţa de nucleotide a genei ce o codifică. În momentul în care secvenţa unei proteine a fost stabilită, fie prin secvenţierea proteinei izolate, fie prin secvenţierea genei codificatoare şi realizarea translării in-silico, se încearcă identificarea de secvenţe similare din alte organisme folosind programul BLAST. În acest fel obţinem informaţii care pot indica dacă gena/proteina vizată este suficient de interesantă din punct de vedere ştiinţific şi dacă merită continuarea experimentelor. Dacă de exemplu, secvenţa identificată este similară cu o secvenţă a unei proteine cunoscute care denotă clar o contaminare, studiul poate fi oprit din stadiul incipient, economisind astfel timp, energie şi resurse.

286


Metode mai sofisticate de analiză pot fi utilizate ulterior pentru a calcula structura secundară şi terţiară a proteinei de interes utilizând tehnici de modelare in-silico. Deşi aceste metode nu sunt încă foarte precise, rata lor de succes nu este deloc de neglijat (60-80%), iar informaţiile obţinute sunt utilizabile pentru a formula ipoteze sau pentru a schiţa un anumit plan de realizare a experimentelor (1). Scopul final al oricărei investigaţii este acela de a preciza rolul proteinei de interes şi de a înţelege relaţia dintre structura acesteia şi funcţia pe care o realizează, obiective care pot fi realizate prin experimente de docking in-silico. Pentru exemplificarea metodelor şi programelor care pot fi folosite, vom utiliza secvenţa de nucleotide a unei gene amplasate pe megaplasmidul pAO1 din Arthrobacter nicotinovorans (2). Secvenţa întregului plasmid este disponibilă în GenBank cu ID-ul AJ507836.1. Gena selectată este orf388, care începeîn poziţia 39724, se termină în poziţia 40893, are ID-ul CAD47898.1 şi codifică o xiloz-dehidrogenază.

XII.1 Fişiere FASTA şi operaţii simple cu secvenţe Secvenţa de nucleotide a genei de interes (sau a unui fragment din aceasta) poate fi obţinută fie experimental, prin secvenţierea ADN-ului, fie prin descărcarea acesteia dintr-o bază de date specializată (precum GeneBank (3); pentru detalii consultaţi subcapitolul XII.2– Baze de date cu informaţii despre proteine, pagina290). În ambele cazuri, aşa-numita secvenţă este reprezentată de un fişier care conţine succesiunea specifică de nucleotide alături de, eventual, alte informaţii. Există numeroase tipuri de fişiere cu secvenţe de nucleotide sau aminoacizi, însă fişierele tip FASTA tind să devină un standard datorită simplităţii lor deosebite. Un fişier FASTA(Figura 32) poate conţine o secvenţă de aminoacizi sau de nucleotide şi este de fapt un simplu fişier text. Primul rând de text, marcat cu “>“conţine o serie de informaţii cu caracter opţional, precum numărul de ordine în GeneBank, specia sau denumirea genei (proteinei). Următoarele rânduri conţin secvenţa propriu-zisă, în care nucleotidele/aminoacizii sunt reprezentaţi folosind codul standard IUPAC cu o singură literă (pentru detalii, consultaţi Tabelul A6 ce conţine codul pentru nucleotide şi Tabelul A7 ce conţine codul pentru aminoacizi, aflate în anexă). Un fişier de tip FASTA poate conţine mai multe secvenţe care sunt despărţite una de cealaltă printr-un rând care începe cu semnul “>“.

Metode computaţionale

287

FIGURA 32. Structura fişierului FASTA conţinând secvenţa megaplasmidului pAO1 (GI. 25169022) După obţinerea secvenţei de nucleotide a genei de interes în format FASTA, aceasta poate fi folosită direct pentru a obţine o serie de informaţii legate de secvenţa proteinei codificate, masa moleculară sau punctul izoelectric. Există numeroase programe care pot conduce la obţinerea acestor informaţii. Cel mai simplu de utilizat este programul Sequence Manipulation Suite (SMS) care reprezintă o suită de programe scrise în Java ce permit generarea, formatarea şi analiza secvenţelor de ADN şi proteine de dimensiuni mici. SMS poate fi accesat din browser-ul web la adresa http://www.bioinformatics.org/sms2/index.html sau poate fi rulat local, fiind compatibil cu orice sistem de operare. Folosirea acestei suite de programe se rezumă la deschiderea paginii mai sus menţionate în browser-ul web. În partea dreaptă a paginii accesate (Figura 33) se regăsesc listate toate funcţiile disponibile. Accesarea oricărei funcţii va conduce la deschiderea unei căsuţe în care se scrie sau se copiază secvenţa de interes în format FASTA. În Tabelul 25 sunt prezentate cele mai utilizate operaţii pe care le poate realiza SMS.


288

B

A FIGURA 33. Utilizarea SMS pentru a realiza translarea secvenţei de nucleotide a genei orf388 în secvenţă de aminoacizi A – funcţii selectabile în SMS conform Tabelului 27, B – căsuţă text în care a fost inserată secvenţa genei orf388 în format FASTA

TABELUL 25. Principalele operaţii cu secvenţe care pot fi realizate cu suita de programe SMS Denumire operaţie*

Descriere

Convertire între diverse formate Combine FASTA

– permite combinarea a două sau a mai multe secvenţe în format FASTA şi obţinerea unei singure secvenţe


Denumire operaţie*

289

Descriere

EMBL to FASTA

– permite convertirea unei secvenţe din formatul EMBL în formatul FASTA; funcţia este utilă în situaţia în care se doreşte eliminarea rapidă a informaţiilor care nu au legătură cu secvenţa de ADN dintr-un fişier EMBL

Filter DNA

– elimină caracterele care nu corespund codului standard IUPAC pentru ADN-ul dintr-o secvenţă (inclusiv spaţii, numere, etc)

Filter Protein

– elimină caracterele ce nu corespund cu codul standard IUPAC de o literă pentru aminoacizi dintr-o secvenţă (inclusiv spaţii, numere etc.)

GenBank to FASTA

– permite convertirea unei secvenţe din formatul GenBank în formatul FASTA; funcţia este utilă în situaţia în care se doreşte eliminarea rapidă a informaţiilor care nu au legătură cu secvenţa de ADN dintr-un fişier GenBank

One to Three

– permite convertirea unei secvenţe de aminoacizi din codul standard IUPAC de o literă în cel de trei litere

Analiza secvenţelor Codon Plot

– analizează frecvenţa de utilizare a codonilor dintr-o secvenţă de ADN şi generează un grafic cu aceste frecvenţe

Codon Usage

– analizează frecvenţa de utilizare a codonilor dintr-o secvenţă de ADN şi poate fi utilizat pentru a identifica preferinţa pentru un anumit codon sinonim

DNA Molecular Weight

– calculează masa moleculară a uneia sau a mai multor secvenţe de ADN

DNA Stats

– calculează frecvenţa fiecărei nucleotide într-o secvenţă dată, rezultatele fiind exprimate în procente


290

Denumire operaţie*

Descriere

PCR Primer Stats

– analizează şi calculează proprietăţile specifice ale unui set indicat de primeri, inclusiv temperatura de topire şi procentul de GC

PCR Products

– realizează amplificarea virtuală prin PCR a unei secvenţe date folosind un set de primeri indicat de utilizator

Protein Isoelectric Point

– calculează valoarea teoretică a punctului izoelectric pentru o secvenţă dată

Protein Molecular Weight

– calculează valoarea teoretică a masei moleculare pentru una sau mai multe secvenţe de aminoacizi

Protein Stats

– calculează frecvenţa fiecărui aminoacid într-o secvenţă dată, rezultatele fiind exprimate în procente

Translate

– realizează translaţia şi transcripţia virtuală a unei secvenţe de ADN date, utilizatorul având posibilitatea de a alege cadrul de citire specific

Reverse Translate

– realizează procesul invers faţă de Translate, acceptând o secvenţă de aminoacizi şi generând secvenţa ADN corespunzătoare

* corespunzătoare cu denumirea din suita de programe SMS

XII.2 Baze de date cu informaţii despre proteine În această eră a informaticii şi internetului, bazele de date accesibile on-line conţin informaţii variate precum secvenţe, structuri sau articole ştiinţifice, devenind un instrument esenţial pentru cercetătorii care activează în domeniul biologiei moderne în general şi al biologiei moleculare în particular. În proteomică, cantitatea uriaşă de informaţii


291

generate zilnic legate de rolul, structura şi secvenţa macromoleculelor proteice nu poate fi organizată decât cu ajutorul bazelor de date computerizate. Interogarea bazelor de date trebuie să constituie prima etapă din orice studiu, deoarece altfel de informaţii cunoscute despre subiectul studiat ar putea fi trecute cu vederea, unele experimente ar putea fi repetate inutil sau chiar realizate eronat. Deşi bazele de date referitoare la proteine sunt destul de bine cunoscute, exploatarea lor este se realizează sub nivelul optim. Din acest motiv, în subcapitolul de faţă sunt prezentate o selecţie a bazelor de date disponibile on-line, încercând să aducem în atenţie aspecte elementare legate de explorarea lor în vederea dezvoltării abilităţilor utilizatorilor de a folosi aceste resurse informatice. O listă cu principalele baze de date existente şi adresele la care pot fi accesate este prezentată în Tabelul 26.

Baze de date cu secvenţe proteice Proiectul de secvenţiere a întregului genom uman a fost urmat de o adevărată avalanşă de proiecte care vizează secvenţierea genomului şi a altor specii de eucariote şi procariote. Acestea au generat şi continuă să genereze un număr enorm de secvenţe de ADN care codifică sute de mii de proteine. Au apărut numeroase baze de date care au ca scop organizarea acestor secvenţe, fiecare cu specificul ei. Înainte de a prezenta câteva baze de date, trebuie precizat faptul că una din problemele cu care se confruntă acestea este redundanţa datelor. Deoarece secvenţele pot fi înregistrate în baza de date de către o multitudine de utilizatori, frecvent apar mai multe intrări pentru aceeaşi secvenţă (aceeaşi proteină de la autori diferiţi sau aceeaşi proteină izolată de la specii diferite). TABEL 26. Principalele baze de date cu informaţii despre proteine, adresa web şi dimensiunea acestora Bază de date

Site web

Dimensiune *

Baze de date cu secvenţe INSDC

http://www.insdc.org/

DDBJ

http://www.ddbj.nig.ac.jp

135.440.924 secvenţe Aceste baze de date sunt


292

Bază de date

Site web

Dimensiune *

EMBL Nucleotide Sequence Database

http://www.ebi.ac.uk/embl/

sincronizate zilnic între ele şi conţin aceleaşi secvenţe.

GenBank

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank/

European Nucleotide Archive (ENA)

http://www.ebi.ac.uk/ena/

KEGG

http://www.genome.jp/kegg/

7.913.359 secvenţe

nr

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov

17.919.084 secvenţe

UniProtKB/ http://www.uniprot.org/ Swiss-Prot

535.698 secvenţe

UniProtKB/ http://www.uniprot.org/ TrEMBL

21.552.793 secvenţe

Baze de date cu structuri

RCSB PDB http://www.rcsb.org PDBe

http://www.ebi.ac.uk/pdbe/

PDBj

http://www.pdbj.org/

BMRB

http://www.bmrb.wisc.edu/

80.850 secvenţe Aceste baze de date sunt sincronizate între ele alcătuind wwPDB; conţin aceleaşi intrări

Alte tipuri de informaţii funcţionale

BRENDA

http://www.brendaenzymes.org/

ReLiBase

http://relibase.ccdc.cam.ac.uk Conţine

* în Aprilie 2012.

Conţine strict informaţii cinetice şi referinţe bibliografice despre enzime informaţii despre complecşi proteine-liganzi


293

Această redundanţă nu este de dorit, interferând cu procesul de interogare a bazei de date şi diminuând calitatea rezultatului obţinut. O bază de date este cu atât mai bună cu cât are redundanţa mai mică. UniProtKB/SwissProt (4) este o bază de date accesibilă on-line care se evidenţiază prin faptul că toate secvenţele conţinute sunt foarte atent notate, iar nivelul de redundanţă este minim. Adăugarea unei noi secvenţe în SwissProt este un proces care implică prelucrarea manuală a datelor corespunzătoare secvenţei respective, ceea ce face ca procesul să fie de durată şi în consecinţă, SwissProt să nu fie foarte la zi. Pentru a remedia această problemă a fost dezvoltat un supliment la această bază de date şi astfel a apărut UniProtKB/TrEMBL (4) care conţine toate secvenţele de nucleotide din EMBL(5) translate în secvenţe de aminoacizi. O altă bază de date cu secvenţe proteice este Protein Identification Resource sau prescurtat PIR (6) care îşi propune să asigure o colecţie completă de secvenţe caracterizată în special prin non-redundanţă. Acest obiectiv se realizează prin gruparea secvenţelor identice sau foarte similare într-o singură intrare în baza de date. Fiecare intrare din PIR conţine alături de secvenţa de aminoacizi şi notaţii legate de denumire, funcţie precum şi referinţe bibliografice. Baza de date nr se doreşte a fi o bază de date non-redundantă completă, cuprinzând intrări din GenBank (3), SwissProt, PIR, Protein Research Foundation (PRF) şi Protein data Bank (PDB). În nr sunt aşadar un număr foarte mare de secvenţe dar, numai secvenţele perfect identice sunt grupate într-o singură intrare în baza de date, din acest motiv nivelul de redundanţă fiind mai mic.

294


Baze de date cu structuri proteice Structura tridimensională a proteinelor oferă informaţii esenţiale nu doar în direcţia identificării funcţiei şi mecanismeleor de acţiunea proteinelor, ci şi în direcţia identificării de noi substante biologic active, medicamente etc. Aceeaşi tendinţă din lumea ştiinţifică ce a condus la secvenţierea completă a genomului uman a pătruns şi în lumea biologiei structurale, existând din ce în ce mai multe voci care susţin necesitatea stabilirii structurii tuturor proteinelor dintr-o celulă. Deşi acest obiectiv este încă practic nerealizabil datorită unor probleme de ordin tehnic, noile metode de cristalizare şi identificare a structurii 3D a proteinelor au dus la acumularea unei cantităţi din ce în ce mai mari de date. Baza de date de referinţă în domeniul structurii proteinelor este fără doar şi poate World Wide Protein Data Bank (wwPDB) (7). Alcătuită prin comasarea a trei baze de date principale (RCSB PDB din USA, PDBe din Europa şi PDBj din Japonia), wwPDB conţine la ora actuală nu mai puţin de 80.000de structuri proteice. Fiecare proteină are în wwPDB un cod unic de identificare (PDB ID) alcătuit din 4 caractere, primul fiind întotdeauna un număr (ex. 1cau sau 256b). Informaţiile legate de structura unei proteine sunt organizate sub forma unor fişiere, cel mai frecvent în format PDB (8) (un alt format acceptat este şi mmCIF) (9). Un fişier PDB conţine trei secţiuni distincte, cu: 1. informaţii despre proteina respectivă – numele proteinei, data când a fost depusă în PDB, autorul, sursa; 2. coordonatele 3D propriu-zise ale atomilor; 3. legăturile dintre atomi. Cele trei secţiuni conţin toate informaţiile ce permit utilizatorului ca, folosind programe specializate precum RasMol (10), Chime sau PyMol, să poată vizualiza şi interacţiona cu structura tridimensională a proteinei respective. Un exemplu de reprezentare grafică a unei molecule proteice împreună cu interfaţa grafică specifică a programului PyMol este prezentat în Figura 34.


295

FIGURA 34. Fisierul 2DHB.pdb pentru hemoglobină vizualizat cu ajutorul aplicaţiei PyMol.

XII. 3 Identificarea funcţiei proteinelor necunoscute cu ajutorul programului BLAST Este acceptat faptul că toate proteinele au evoluat din alte proteine (11) prin mutaţia aleatoare a aminoacizilor din secvenţa primară. Analiza frecvenţei cu care un aminoacid dintr-o proteină este înlocuit cu altul a demonstrat însă că procesul nu este întotdeauna aleator şi că, în funcţie de poziţie şi rol, aminoacizii au grade diferite de conservare în structurile proteice. Astfel, cei mai înalt conservaţi sunt aminoacizii din situsul catalitic, urmaţi, în ordine descrescătoare, de aminoacizii implicaţi în realizarea structurilor secundare şi terţiare, cei mai puţin conservaţi fiind aminoacizii de la suprafaţa proteinei. Secvenţele de aminoacizi ale proteinelor nu au caracter randomic, ci prezintă mai degrabă un anumit

296


grad de similaritate (1) ceea ce permite compararea lor. Gradul de similaritate a două proteine la nivel de secvenţă este dictat, pe de o parte, de distanţa evolutivă şi, pe de altă parte, de structurile lor tridimensionale şi de funcţiile specifice pe care cele doua proteine le îndeplinesc. Aceste observaţii au permis dezvoltarea unor metode computaţionale complexe de investigare şi analiză a secvenţelor de aminoacizi ale proteinelor necunoscute. Programul de căutare şi cuantificare a similarităţii dintre două secvenţe BLAST (engl.Basic Local Aligment Search Tool, (12) face parte din această categorie. Dezvoltat în anul 1991, programul compară o secvenţă de interes cu o bibliotecă de secvenţe dintr-o bază de date. Prin identificarea în baza de date a secvenţelor cunoscute care prezintă un înalt grad de similaritate cu secvenţa de interes, poate fi precizată funcţia acesteia din urmă. Înainte de a începe prezentarea metodologiei de realizare a unei investigaţii BLAST, este absolut necesar să definim câţiva termeni utilizaţi frecvent. Alinierea a două sau mai multe secvenţe este una dintre cele mai simple operaţii de analiză a secvenţelor. Într-o aliniere a două secvenţe, fiecare aminoacid (nucleotid) din secvenţa A este comparat cu aminoacidul (nucleotidul) corespunzător din secvenţa B. O corespondenţă între doi aminoacizi (nucleotide) din aceeaşi poziţie pe cele două secvenţe poartă numele de identitate, iar o neconcordanţă se numeşte substituţie. Alinierea locală este utilizată pentru a identifica subregiunile similare dintre două secvenţe fiind utilă pentru compararea de secvenţe de dimensiuni diferite, puţin înrudite. Alinierea globală compară două secvenţe pe toată lungimea lor fiind utilizată, în special, pentru a compara secvenţe de dimensiuni similare, foarte apropiate evolutiv. Aceste tipuri de alinieri nu surprind însă zonele mici de identitate (13). Foarte frecvent, termenii de similar şi omolog sunt utilizaţi greşit când se face referire la compararea a două proteine. Similaritatea la nivel de secvenţă (structură) se referă la două secvenţe care prezintă asemănări una în raport cu cealaltă datorită unui număr mai mare sau mai mic de aminoacizi identici. Similaritatea are diverse grade exprimate, în general, sub formă de procente de identitate. Omologia se referă la faptul că două secvenţe (structuri) similare se aseamănă una cu cealaltă datorită evoluţiei dintr-un strămoş comun. Nu există grade pentru măsurarea nivelului de omologie.


297

Principiul metodei ProgramulBLAST identifică, dintr-o bază de date, secvenţele similare cu o secvenţă ţintă. Aceste secvenţe poartă numele de secvenţe “subiect” iar identificarea lor se bazează pe aşa numitele alinieri locale. După identificarea tuturor secvenţelor „subiect” din baza de date, programul BLAST cuantifică nivelul de similaritate dintre acestea şi secvenţa ţintă realizând un clasament. O aliniere locală constă dintr-o pereche de secvenţe de aceeaşi dimensiune între care există potrivire perfectă. Cu ajutorul unui algoritm special (Smith-Waterman modificat) (14) programul BLAST identifică rapid porţiunile din secvenţa ţintă şi secvenţa „subiect”, realizează alinierile locale şi pornind de aici „suprapune” cele două secvenţe de dimensiuni diferite. În acest fel, secvenţele comparate vor fi alcătuite din zone perfect aliniate şi zone nealiniate (aşa numitele GAP’s) care formează bucle între o aliniere locală şi următoarea aliniere locală. Pentru a cuantifica gradul de similaritate dintre două secvenţe, programul calculează un punctaj care are la bază diverse tipuri de matrici de substituţie. Cel mai frecvent utilizate sunt matrici de tip PAM (15) sau de tip BLOSUM62 (16)(Figura 35), ambele tipuri fiind construite ţinându-se cont de observaţiile experimentale legate de frecvenţa cu care un aminoacid este înlocuit de un alt aminoacid. În general, matricele PAM sunt utilizate pentru compararea unor secvenţe apropiate evolutiv, în timp ce matricele de tip BLOSUM au o utilizare mai generală. Evenimentele mutaţionale pot duce nu doar la schimbarea unui aminoacid din secvenţă, dar şi la inserarea sau deleţia unuia sau mai multor aminoacizi. În acest caz două fragmente adiacente de pe o secvenţă se întâlnesc şi pe cealaltă, între ele interpunându-se o altă secvenţă în care o bază nu are corespondent pe cealaltă, această secvenţă reprezentând o pereche aminoacid-nimic. O asemenea potrivire aminoacid-nimic poartă numele de GAP. Punctajul pentru GAP este negativ. Deoarece se pot insera sau şterge unul sau mai mulţi aminoacizi, nu interesează foarte mult dimensiunea spaţiului (GAP), ci doar existenţa lui.


298

FIGURA 35. Exemplu de matrice BLOSUM.

Cu litere mari sunt reprezentaţi aminoacizii. Cel mai mare punctaj au identităţile, iar funcţie de frecvenţa de substituţie (observată practic în laborator) primesc un anumit punctaj şi substituţiile. Se poate observa şi existenţa unor punctaje negative, alocate pentru substituţiile cel mai puţin întâlnite.

Utilizând sistemul descris mai sus, programul alocă fiecărei secvenţe comparate un scor. BLAST calculează mai multe tipuri de punctaje. Aşa numitul punctaj brut (engl. Raw score) notat cu S, este calculat prin însumarea punctelor pentru fiecare pereche aminoacidaminoacid, amionacid-nimic şi penalizărilor pentru GAP. Calcularea punctajului brut este schematizată în Figura 36. Aliniere locală

Substituţie

GAP

S = Σ(identităţi, substituţii) - Σ(penalizări GAP) FIGURA 36. Calcularea punctajului brut pentru o aliniere dintre două secvenţe. Scorul brut nu permite însă compararea a două alinieri, el fiind echivalentul unei unităţi de lungime care nu are specificată unitatea de măsură. Din aceste motive, se preferă utilizarea unui alt tip de punctaj şi anume scorul în biţi notat cu S’. Acesta se calculează prin normalizarea lui S în funcţie de diverse variabile statistice care depind, la rândul lor, de


299

tipul de matrice utilizat. Cu cât punctajul S’ obţinut este mai mare cu atât asemănarea dintre cele două secvenţe este mai mare (17). Principalul pericol cu care se confruntă o asemenea comparaţie este ca, în cazul bazelor de date de dimensiuni mari, să apară alinieri datorită şansei şi nu datorită unei legături reale. Din acest motiv, alături de cele aceste două scoruri S şi S', programul BLAST oferă şi o serie de date statistice legate de gradul de semnificaţie a acestor alinieri. O “comparaţie” se caracterizează astfel şi printr-un parametru statistic, notat E, care se defineşte ca număr de potriviri care apar doar datorită şansei într-o bază de date de o anumită dimensiune. Cu cât valorile lui E sunt mai mici, cu atât rezultatele sunt considerate ca având un înalt grad de semnificaţie (alinierea fiind deci statistic semnificativă). Avantaje: 1. permite predicţia funcţiei unei proteine pornind doar de la secvenţa completă, fără alte informaţii suplimentare; 2. simplitate deosebită, nu necesită cunoştinţe aprofundate de bioinformatică, toate operaţiile efectuându-se în fereastra browser-ului web; 3. server-ul BLAST este accesibil gratuit; 4. aplicaţia BLAST poate fi descărcată şi utilizată independent, pe o bază de date specificată de utilizator; aplicaţia nu are interfaţă grafică şi poate fi descărcată sub forma unor executabile compatibile cu Windows, MacOS X şi diverse variante de Linux; detalii suplimentare privind utilizarea avansată a BLAST pot fi accesate la adresa http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1762/. Limitări: 1. rezultatul furnizat de BLAST este strict dependent de baza de date utilizată; cu cât baza de date este mai mare cu atât rezultatele sunt mai precise; în prezent, baze de date precum GenBank sau UniProtKB/SwissProt acumulează secvenţe noi cu o rată foarte mare, cel mai frecvent prin încărcarea automată a secvenţelor rezultate din proiectele de secvenţiere completă a genomului


300

diverselor specii; secvenţele încărcate automat nu sunt însă complet caracterizate din punct de vedere funcţional; din acest motiv rezultatul unei interogări BLAST este foarte precis când se utilizează o bază de date mare dar, în acelaşi timp, total neconcludent dacă nici una din secvenţele identificate nu are funcţie descrisă experimental; în asemenea cazuri se preferă utilizarea unor baze de date mai mici precum The Protein Data Bank (PDB (18) care conţin doar secvenţe cu funcţii cunoscute; 2. corectitudinea şi încrederea în predicţia funcţiei unei proteine necunoscute realizată prin BLAST depinde foarte mult de secvenţa ţintă în sine, mai precis de nivelul de identitate dintre secvenţa de interes şi secvenţa ţintă pe baza căreia se face predicţia; astfel, un nivel de identitate mai mare de 25% implică funcţii similare, un nivel cuprins între 18-25% poate indica funcţii similare, iar un nivel mai mic de 18% nu permite formularea nici unei concluzii; de altfel, intervalul de identitate de 15-25% poartă numele de “zonă de crepuscul”(19), în care rezultatele fals pozitive sunt foarte frecvente şi legătura secvenţă-funcţie este slab conturată; 3. rezultatele obţinute au caracter de predicţii şi, înainte de a stabili clar rolul unei proteine, trebuie să fie obligatoriu sprijinite de dovezi experimentale. Resurse necesare: 1. secvenţa de interes în format FASTA; dacă este disponibilă secvenţa de nucleotide a genei care codifică proteine de interes, aceasta poate fi transformată în secvenţă de aminoacizi folosind suita de programe SMS (pentru detalii consultaţ subcapitolul XII.1– Fişiere FASTA şi operaţii simple cu secvenţe, pagina 286); 2. computer dotat cu conexiune Internet şi browser compatibil; opţional poate fi necesar, un editor text (WordPad, Gedit) pentru modificarea/ajustarea secvenţei proteice.


301

Mod de lucru: 1. se copie secvenţa proteinei de interes în format FASTA; pentru exemplificare vom investiga rolul proteinei necunoscute ORF388depe megaplasmidul pAO1 din Arthrobacter nicotinovorans (2);secvenţa de aminoacizi a fost obţinută din secvenţa de nucleotide a genei codificatoare folosind suita de programe SMS (pentru detalii consultaţpitolul XII.1 Fişiere FASTA şi operaţii simple cu secvenţe, pagina 286) sau informaţia poate fi descărcată direct din GenBank, indicativul CAD47898.1; secvenţa de aminoacizi a fost editată şi a fost formatată pentru a respecta standardul FASTA (Figura 37);

FIGURA 37. Secvenţa de aminoacizi a ORF388 în format FASTA 2. se deschide navigatorul web şi se accesează serverul BLAST oferit de National Center for Biotechnology Information (NCBI), (20) la adresa http://blast.ncbi.nlm.nih.gov; în pagina care se deschide, de sub titlul „Basic BLAST”, se selectează „protein blast”pentru a compara o secvenţă de aminoacizi cu o altă secvenţă de aminoacizi; pagina permite şi selecţia unor tipuri de BLAST, specilalizate (cum ar fi de exemplu, BLAST cu secvenţe provenind doar de la o anumită specie); 3. pe pagina care se deschide, în căsuţa text de sub „Enter Query Sequence” (Figura 38) se copie sau se scrie secvenţa de aminoacizi a proteinei de interes în format FASTA; opţional se poate preciza şi un nume specific pentru investigaţia dorită; Această pagină permite, de asemenea, stabilirea unor parametri care au drept scop limitarea spaţiului de căutare, după cum urmează:

302


„Query subrange”– se utilizează pentru a reduce secvenţa investigată doar la un anumit fragment precizat prin poziţia de început şi de sfârşit; „Or, upload file” – permite încărcarea unui fişier text în format FASTA; în acest caz nu mai este necesară precizarea secvenţei în căsuţa text; „Database” – permite selecţia bazei de date unde se va realiza investigarea; funcţia este utilă pentru a restrânge investigarea în diverse direcţii; cea mai mare bază de date utilizabilă este „non-redundant protein sequences (nr)”; cea mai mică este „Protein Data Bank proteins (pdb)” care are avantajul de a fi alcătuită doar din proteine cu structură determinată experimental şi funcţie cunoscută; „Algorithm” – permite selectarea diverşilor algoritmi de identificare şi aliniere a secvenţelor similare; de asemenea, tot în această pagină, apăsând semnul „+” din faţa textului „Algorithm parameters”, se pot modifica o serie de parametri ai algoritmului de căutare, precum: „Max target sequences” – numărul maxim de secvenţe subiect ce va fi luat în calcul; „Expect” – vor fi afişate doar rezultatele care au o valoare a lui E mai mică decât cea specificată; „Matrix” – tipul de matrice care va fi utilizat pentru calcularea punctajului similarităţii (BLOSUM62, PAM70 etc.) „Gap Costs” – schema de punctaj corespunzătoare prezenţei unui GAP.


303

A

B

C D FIGURA 38. Pagina NCBI de accesare şi stabilire a parametrilor unei investigaţii BLAST. A – căsuţa text în care a fost inserată secvenţa de aminoacizi a proteinei ORF388 în format FASTA; B – zona cu parametrii utilizaţi pentru restrângerea spaţiului de căutare; C – buton pentru lansarea investigării; D – zona cu parametrii algoritmului de căutare

Mai multe informaţii legate de utilitatea fiecărui tip de matrice pot fi găsite în cartea publicată de membrii NCBI exclusiv on-line (21) şi accesibilă la adresa: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21101/ 4. apăsarea butonului BLAST din josul paginii va conduce la înregistrarea cererii pe server şi alocarea unui număr unic de identificare (RID), după care se trece la pagina de aşteptare a rezultatelor; în funcţie de gradul de solicitare a serverelor NCBI şi de parametrii de căutare, timpul de aşteptare variază de la câteva secunde la câteva minute; după finalizare, pagina de afişare a rezultatelor apare automat şi cuprinde (Figura 39):

304


a. date privitoare la investigaţia realizată (ID-ul investigării, descrierea din fişierul FASTA, baza de date utilizată, versiunea programului utilizat şi referinţa bibliografică de utilizat în eventualitatea în care rezultatele sunt publicate); b. domeniile înalt conservate identificate (Figura 39, B); c. rezultatul propriu-zis prezentat grafic; secvenţa ţintă este reprezentată de bara roşie numerotată din partea de sus a figurii, iar secvenţele similare identificate în baza de date sunt reprezentate prin linii de culori diferite de dedesubt; rezultatele sunt ordonate în funcţie de gradul de similaritate, acesta fiind indicat atât de culoarea liniei (codul de culori este prezentat deasupra secvenţei ţintă), cât şi de poziţia acesteia; la trecerea mouse-ului peste una din linii vor fi afişate datele de identificare ale secvenţei respective (Figura 39, C); d. rezultatele investigaţiei prezentate sub forma unui tabel ce cuprinde: numărul de identificare a secvenţei, descrierea, scorul normalizat (S'), gradul de suprapunere în procente, valoarea lui E şi procentul maxim de identitate (Figura 39, D).


305

A

B

C

D

E FIGURA 39. Pagină cu rezultate ale unei interogări BLAST.

A – informaţii privind interogarea realizată; B – domeniile înalt conservate identificate; C – prezentarea grafică de ansamblu a rezultatelor; D – tabel cu secvenţele identificate; E – exemplu de aliniere între secvenţa de interes şi o secvenţă subiect identificată prin BLAST.

306

e.


alinierea fiecărei secvenţe identificate cu secvenţa ţintă. Fiecare aliniere este însoţită de o serie de informaţii ce caracterizează alinierea respectivă – scorul nomalizat S' şi scorul brut S, valoarea lui E, numărul de aminoacizi identici şi procentele, numărul de substituţii şi procentul, şi numărul de GAPs (Figura 39, E).

Mai multe detalii privind utilitatea fiecărui parametru al unei investigaţii BLAST pot fi găsite în cartea publicată de membrii NCBI exclusiv on-line (21) şi accesibilă la adresa: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21101/ În cazul interogării folosind secvenţa genei ORF388, pe primul loc ca similaritate este CAD47898.1 – putative oxidoreductase [Arthrobacter nicotinovorans], adică chiar secvenţa de interes. Acest rezultat era de aşteptat dacă ţinem cont de faptul că această secvenţă provine din baza de date în care se face interogarea. Începând cu poziţiile următoare din tabelul cu rezultatele investigaţiei (Figura 39, D) sunt listate celelalte secvenţe similare cu ORF388. Pentru a obţine informaţii suplimentare privind rolul acestora, se accesează legătura din numărul de identificare a fiecărei secvenţe (coloana numită “Accesion” din tabel). Aceasta va duce la deschiderea unei pagini suplimentare corespunzătoare intrării respective din baza de date generală NCBI. Analiza în detaliu a tuturor secvenţelor din tabel indică faptul că ORF388 codifică probabil o enzimă cu funcţie oxido-reductazică. Utilitatea acestei concluzii este însă foarte redusă deoarece nu este sprijinită şi de date experimentale, nici una din proteinele identificate neavând funcţie cunoscută (Figura 40, A şi B din). Pentru a identifica proteine cu funcţie demonstrată practic, adică o situaţie similară cu cea prezentată în figura 40, C), este necesară o nouă investigaţie BLAST, folosind de această dată PDB ca bază de căutare. Proteina cu funcţie demonstrată experimental cea mai asemănătoare cu ORF388 a fost identificată ca fiind 1,5-anhidro-Dfructoz-reductaza NADP+ dependentă din Sinorhizobium morelense (Score = 65.1 bits (157), Expect = 1e-11). Rolul dedus computaţional pentru ORF388 este de a funcţiona ca o reductază NADP+ dependentă acţionând asupra glucidelor, în bună concordanţă cu rolul demonstrat experimental (xiloz-dehidrogenază NADP+ dependentă, Mihasan et al., 2012, în curs de publicare).


307

A

B

308


C FIGURA 40. Evaluarea utilităţii rezultatelor BLAST pe baza referinţelor bibliografice. A – secvenţa YP_002488236.1, nepublicată în reviste de specialitate; B – secvenţa YP_002541450, publicată într-un articol ce raportează secvenţierea genomului a trei specii de Agrobacterium; C – secvenţa 2GLX_A publicată într-un articol care descrie structura terţiară a ,5-anhidro-D-fructoz-reductaza NADP+ dependentă din Sinorhizobium morelense.

XII.4 Modelarea computaţională a structurii tridimensionale a proteinelor Cunoaşterea structurii tridimensionale (3D) a moleculelor proteice poate asigura informaţii extrem de preţioase legate de funcţia şi evoluţia acestor molecule. Deşi la ora actuală sunt cunoscute secvenţele de aminoacizi a peste 108 milioane proteine (22), doar 80.000 dintre acestea au structura tridimensională determinată experimental (23). Acest decalaj apare datorită complexităţii deosebite a metodelor experimentale de stabilire a structurii tridimensionale a proteinelor, precum cristalografia cu raze X sau tehnicile de rezonanţă magnetică nucleară (NMR).


309

Ipoteza termodinamică a lui Anfinsen (1973) postulează că împachetarea lanţului de aminoacizi ai unei proteine în structura tridimensională caracteristică este un proces guvernat strict de reguli fizice, depinzând aşadar doar de secvenţa de aminocizi (24). Acest lucru ar permite, cel puţin teoretic, stabilirea structurii tridimensionale a unei proteine pornind doar de la secvenţa sa de aminoacizi. Ideea de a calcula, pornind de la secvenţa de aminoacizi, structura tridimensională a unei proteine a fascinat lumea ştiinţifică încă din momentul lansării sale în anii '70, fiind considerată un adevărat Sfânt Graal al biologiei moleculare (25). Studiul principiilor care guvernează împachetarea proteinelor în forma lor nativă se poate realiza folosind două abordări distincte: 1. folosind strict legile fizicii cuantice; 2. prin prisma teoriei evoluţiei. Din aceste motive, metodele computaţionale de modelare a structurii tridimensionale au fost împărţite în două clase mari: modelarea pe bază de omologie şi metode ab-initio (26). Diferenţierea clară dintre aceste două clase de metode a început să fie din ce în ce mai puţin netă odată cu apariţia unui al treilea tip de metode, bazate pe recunoaşterea structurilor secundare (engl. fold-recognition). Nici una dintre cele trei clase de metode nu s-a impus pe plan ştiinţific în detrimentul alteia, experimentatorul fiind nevoit să aleagă între o metodă sau alta în funcţie de secvenţa de interes şi de rezultatul preconizat. Din aceste motive, în cele ce urmează sunt prezentate pe scurt avantajele, dezavantajele şi aplicaţiile fiecărui tip de metodă computaţională de modelare a structurii proteinelor. Modelarea pe bază de omologie sau modelarea comparativă (MC) a structurii proteinelor este o clasă de metode care se bazează pe observaţia conform căreia catenele de aminoacizi cu secvenţe similare adoptă structuri similare (19). MC este facilitată şi de faptul că în cadrul aceleiaşi familii de proteine structura 3D este mult mai bine conservată din punct de vedere evolutiv decât secvenţa de aminoacizi (27). Aceasta face ca structurile 3D a unui număr mare de membri ai aceleiaşi familii de proteine să poată fi uşor modelate dacă structura unui singur membru a fost determinată experimental. Modelarea structurii unei proteine ţintă necunoscute folosind MC este un proces care cuprinde cinci etape distincte: 1. identificarea proteinelor înrudite din punct de vedere evolutiv cu proteina de interes şi care au structura tridimensională determinată

310


experimental; acestea vor fi folosite ca şablon pentru calcularea structurii proteinei de interes; 2. alinierea pe bază de omologie a secvenţei proteinei ţintă cu secvenţa proteinelor şablon în scopul identificării zonelor cu structură înalt conservată; 3. modelarea zonelor cu structură înalt conservată pe secvenţa ţintă; 4. calcularea poziţiei spaţiale a lanţurilor laterale ale aminoacizilor şi a zonelor mai puţin conservate; 5. îmbunatăţirea şi evaluarea modelului tridimensional obţinut (28). Acurateţea acestui tip de metode depinde în mod direct de similaritatea la nivel de secvenţă dintre proteina ţintă şi cea şablon. Când identitatea dintre cele două secvenţe este mai mare de 40%, mai mult de 90% dintre atomii catenei de aminoacizi pot fi modelaţi cu o eroare medie de aproximativ 1 Å (29). Modelele realizate sunt de calitate foarte bună, concurând în acurateţe cu structurile determinate experimental prin cristalografie cu raze X la rezoluţie mică (30). Când identitatea dintre secvenţa ţintă şi cea şablon se situează în intervalul 30-40%, obţinerea de alinieri corecte devine dificilă iar calitatea modelului obţinut scade. 80% dintre atomii catenei de aminoacizi pot fi modelaţi cu o eroare medie de aproximativ 3,5 Å, restul cu erori mult mai mari (29). Când identitatea dintre secvenţe este mai mică de 30%, identificarea de structuri omoloage devine problematică. Chiar dacă se identifică posibile structuri şablon şi se pot genera modele ale structurii tridimensionale a proteinei ţintă, utilitatea lor este îndoielnică, de unde şi denumirea de “zona de crepuscul” a alinierilor secvenţelor proteice (19). Din punct de vedere al utilizatorului, dificultatea MC rezidă aşadar din identificarea şablonului optim pe care să se construiască structura tridimensională a proteinei de interes şi aceasta deoarece probabilitatea de a identifica o proteină cu structură cunoscută similară cu o secvenţă randomică variază în intervalul 30-65%(29). Procentul este în continuă creştere deoarece proiecte precum Protein Structure Initiative promit să determine în următoarea decadă nici mai mult nici mai puţin de 16.000 proteine (31), număr care va acoperi în proporţie de 90% din numărul total de tipuri de proteine estimat (32). Metodele bazate pe identificarea computaţională a structurilor secundare au ca punct de plecare observaţia că secvenţe similare implică


311

şi structuri similare. Afirmaţia inversă nu este însă valabilă, existând proteine similare ca structură dar care nu au nici cea mai mică similaritate de secvenţă (33). Aceasta înseamnă că numărul de structuri secundare întâlnite în structura proteinelor este mult mai redus decât numărul de secvenţe existente (28) ceea ce permite realizarea unor biblioteci cu structuri proteice model complete. Metodele sunt bazate pe identificarea porţiunilor din secvenţa de interes care au similarităţi la nivel de secvenţă cu structurile model după care se asamblează aceste fragmente în structura tridimensională finală. Principalul dezavantaj al acestui tip de metode este faptul că necesită o putere de calcul foarte mare. La ora actuală banca de date pentru proteine (PDB) conţine suficient de multe structuri proteice pentru a permite utilizarea cu succes a acestor metode pentru proteine de până la 100 aminoacizi (34). Metodele ab-initiopleacă strict de la premisa că structura tridimensională a unei proteine corespunde unui nivel energetic minim şi încearcă să identifice acest minim prin evaluarea tuturor conformaţiilor posibile ale respectivului lanţ de aminoacizi. Deşi aceste metode necesită o putere de calcul enormă şi nu au încă un nivel de acurateţe foarte mare (26), ele reprezintă un subiect foarte fierbinte. În cazul unor proteine noi care nu prezintă similaritate cu nici o alta proteină, nici una din metodele de mai sus nu poate fi folosită, metodele ab-initio fiind singura alternativă.

Programe, servere şi metaservere Din punct de vedere computaţional, instrumentele disponibile în domeniul predicţiei structurii tridimensionale a proteinelor pot fi clasificate în programe independente, servere sau metaservere. Programele independente au fost intens utilizate încă de la începutul dezvoltării acestui domeniu, însă au dezavantajul că utilizarea lor eficientă necesită în primul rând accesul la computere cu putere mare de calcul şi în al doilea rând cunoştinţe temeinice de informatică (limbaje de programare, scripturi, linie de comandă etc.), ceea ce reduce mult aplicabilitatea lor. Pe de altă parte serverele web elimină aceste dezavantaje, ele oferind utilizatorului o interfaţă simplă în care acesta introduce un minimum de informaţie necesar pentru generarea unei

312


structuri (de exemplu secvenţa de aminoacizi). Dezavantajul acestor instrumente este legat de faptul că un server foloseşte o anumită metodă de modelare a structurii tridimensionale a proteinelor. Două servere diferite, bazate pe două metode diferite vor produce rezultate diferite pentru aceeaşi secvenţă de aminoacizi. Din aceste motive au apărut aşa numitele metaservere care generează structura unei proteine plecând de la secvenţa sa de aminoacizi, folosind un ansamblu de metode distincte. În Tabelul 27 sunt listate cele mai importante programe, servere şi metaservere care pot fi accesate gratuit pentru a genera modele de structuri proteice 3D, împreună cu metoda de modelare utilizată. Alegerea tipului de metodă ce poate fi folosită pentru o secvenţă dată se face ţinând cont de similaritatea acesteia cu proteine cunoscute. Dacă proteina de interes are cel puţin 40% similaritate la nivel de secvenţă cu o proteină cunoscută, sunt indicate metodele bazate pe MC. Pentru procente mai mici sunt indicate metodele bazate pe identificarea computaţională a structurilor secundare, iar pentru cazul în care proteina de interes nu prezintă similaritate cu nici o proteină de interes, sunt de preferat metodele ab-initio. Diverse detalii legate de avantajele şi dezavantajele programelor de modelare a structurii 3D a proteinelor disponibile pot fi găsite în lucrarea publicată în 2011 de Mihăşan M. (35).

Comentarii

(51)

(52)

(53)

– –

www.biocomp.chem.uw.edu.pl/servi ces.php

http://foldx.crg.es/

www.salilab.org/modeller/

http://swift.cmbi.ru.nl/whatif http://biskit.pasteur.fr/

Program comercial, poate fi utilizat gratuit timp de 15 zile, necesită înregistrarea pe site-ul producătorului, disponibil si ca server

Program în linie de comandă, dar sunt disponibile o interfaţă şi un server Sisteme de operare: Windows, Mac, Linux

Program comercial

O colecţie de scripturi în python Sisteme de operare: Linux, Windows

Fold-X

Modeller

What If

Biskit

Ref. bibl.

Foloseşte MC dar şi metode ab-initio; face parte din Selvita Protein Modeling Platform Sistem de operare: Linux

Adresă web

CABS

MC

Programe independente

Nume

TABEL 27. Instrumente utilizate frecvent pentru modelarea structurii tridimensionale a proteinelor

Metode computaţionale 313

Comentarii

Adresă web

Server complet automat, structura tridimensională a modelului este construită cu ajutorul programului MODELLER

Poate genera modele pentru secvenţe de până la 500 aminoacizi

Server complet automat, poate fi accesat şi din cadrul programului DeepView (Swiss PdbViewer)

ESyPred3D

Geno3D

Swiss-Modell

(41)

(42) (43)

http://www.fundp.ac.be/sciences/bio logie/urbm/bioinfo/esypred/ http://geno3d-pbil.ibcp.fr http://swissmodel.expasy.org/

3D-PSSM

Din anul 2004 acest server nu a mai fost

http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~3dpss

(44)

(40)

(39)

Ref. bibl.

www.bmm.icnet.uk/~3djigsaw/

http://supfam.org/SUPERFAMILY/

Metode bazate pe identificarea computaţională a structurilor secundare

Server complet automat care poate fi folosit şi în mod intereactiv

3D-JIGSAW

CM

Servere

SUPERFAMILY

Metode bazate pe identificarea computaţională a structurilor secundare

Nume


Succesorul serverului 3D-PSSM

Phyre

(48)

(49) (50)

http://www.cs.bgu.ac.il/~dfischer/pr edictprotein/submit_meta.html

http://meta.bioinfo.pl/submit_wizar d.pl http://robetta.bakerlab.org/

Secvenţa de interes este trimisă la doisprezece servere, printre care două bazate pe identificarea computaţională a structurilor secundare şi două pe CM

Foloseşte până la zece servere diferite, printre care 3D-PSSM şi ESyPred3D

MC şi ab initio, dar poate utiliza şi dateNMR

3D-JURY

Robetta

Meta-PP

(47)

Necesită înregistrare pe site

GeneSilico

(45)

http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/

http://zhanglab.ccmb.med.umich.ed u/LOMETS/

(46)

(45)

Ref. bibl.

http://modbase.compbio.ucsf.edu/m odloop/

http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/

m/index2.html

Adresă web

www.genesilico.pl/meta2/

Generează modele 3D folosind opt programe diferite

Lomets

Metaservere

Modelarea automată a buclelor din structurile proteice, bazat pe MODELLER

Succesorul serverului 3D-PSSM

modificat/dezvoltat.

Comentarii

ModLoop

Ab-initio

Phyre

Nume


316


Aplicaţii ale metodelor de modelare a structurilor tridimensionale a proteinelor În general, prin utilizarea unui server, meta-server sau program independent se obţine un model al structurii 3D a proteinei de interes sub forma unui fişier PBD. Utilitatea acestui model depinde foarte mult de calitatea sa şi aplicaţia în care va fi utilizat. În general, metodele CM conduc la obţinerea unor modele de calitate foarte bună, similare cu cele obţinute prin difracţie cu raze X. În cazul modelelor care au 50% similaritate la nivel de secvenţă cu şabloanele în baza cărora au fost realizate, calitatea este foarte bună şi au un număr foarte mare de aplicaţii, precum docking-ul, proiectarea şi îmbunătăţirea liganzilor (36), crearea de mutaţii la nivel de secvenţă (37) şi identificarea aminoacizilor din situsurile active ale enzimelor (38). Modele de rezoluţie medie generate prin CM sau prin metode bazate pe identificarea computaţională a structurilor secundare au fost utilizate cu succes pentru identificare localizării spaţiale a aminoacizilor importanţi din punct de vedere funcţional (aminoacizi din situsul catalitic, aminoacizi implicaţi în legarea unui modulator). Modelele de rezoluţie mică obţinute prin metodele ab-initio sunt utile pentru stabilirea topologiei unei proteine

XII.5 Modelarea computaţională a complecşilor liganzi-proteine Moleculele proteice sunt implicate într-o multitudine de procese esenţiale pentru funcţionarea celulei vii, începând cu cataliza enzimatică şi terminând cu reglarea expresiei genelor (54). Majoritatea acestor funcţii se bazează pe proprietatea proteinelor de a interacţiona cu liganzi de dimensiuni variate (de la substrate enzimatice, cofactori, efectori până la alte proteine, ADN sau ARN). Cunoaşterea mecanismelor moleculare pe baza cărora se realizează complexul proteină-ligand sunt deosebit de importante în domenii precum selecţia de noi ţinte terapeutice, proiectarea raţională de medicamente noi sau ingineria enzimatică. Acumularea de cunoştinţe legate de activitatea biologică, structura proteinelor şi fenomenele de alosterie permit la ora actuală deducerea computerizată a


317

conformaţiei unui complex de tip proteină-complex pornind de la structura celor două componente (proteină şi ligand), procesul fiind numit andocare moleculară (engl. molecular docking). Deşi necesare iniţial în special în domeniul farmaceutic (55), pentru identificarea de noi medicamente, programele folosite la andocarea moleculară au început să fie utilizate de un număr din ce în ce mai mare de cercetători, în special pentru a selecta potenţiale substraturi enzimatice sau pentru a valida date experimentale.

Problematica andocării moleculare Termenul de andocare moleculară in-silico desemnează schemele computerizate care încearcă să deducă structura unui complex format din două sau mai multe molecule constituente, un receptor şi un ligand (56). Receptorul este reprezentat cel mai frecvent de o proteină, în timp ce ligandul este fie o proteină, fie o moleculă de acid nucleic sau o moleculă de dimensiuni mici (potenţial medicament, substrat, inhibitor etc.). Coordonatele atomice ale ligandului şi receptorului pot proveni din: 1. structura nativă obţinută prin cristalografie cu raze X sau NMR; 2. structura pseudo-nativă (structura unui complex obţinută prin cristalografie cu raze X sau rezonanţă magnetică nucleară (NMR) din care unul dintre componente a fost eliminat); 3. structură modelată computaţional (57). Problema pe care andocarea moleculară trebuie să o rezolve este: dacă se cunosc structurile tridimensionale a două molecule, care este structura corectă a complexului rezultat din interacţiunea dintre cele două molecule. Rezolvarea acestei probleme este dificilă, în special, datorită faptului că pentru a explora toate gradele de libertate pe care le are ligandul este necesară o putere de calculfoarte mare. De exemplu, considerând o moleculă cu doar două legături care se pot roti şi care trebuie amplasată într-un situs catalitic sub forma unui cub de 103 Å3, timpul necesar pentru a evalua din punct de vedere energetic toate cela 6 x 1014 conformaţii este de aproximativ 20.000 ani (58). Este lesne de înţeles că în practică o asemenea abordare sistematică nu poate fi folosită şi de aceea sunt utilizaţi diverşi algoritmi matematici şi diferite aproximări pentru a reduce numărul de conformaţii care trebuie analizate

318


transformând procesul într-unul fezabil din punct de vedere computaţional (56). Programele care realizează andocarea moleculară conţin două componente distincte (59): 1. o metodă pentru generarea şi explorarea tuturor conformaţiilor posibile proteină-ligand; 2. o metodă de evaluare şi ordonare a acestor conformaţii în funcţie de energia de legare. Deoarece au fost publicate numeroase lucrări care tratează în detaliu metodele şi tehnicile de andocare moleculară (59),(60),(61),(62), în cele ce urmează ne vom concentra asupra evaluării programelor disponibile din punct de vedere al utilizatorului nespecialist în bioinformatică, comentând aspecte precum uşurinţa utilizării, puterea de calcul necesară şi evaluarea rezultatelor. Tipuri de andocare moleculară. Primul program de andocare moleculară a fost DOCK, dezvoltat de cercetători de la UCSF (63). Programulfolosea o reprezentare foarte simplistă a structurii ligandului şi receptorului, similară cu modelul “lacăt şi cheie” din enzimologie, complexul optim fiind identificat pe baza complementarităţii de formă dintre ligand şi receptor. Această abordare presupune că atât ligandul cât şi receptorul au structuri imobile, metoda primind numele de andocare cu corpuri rigide. Procesul de formare a complecşilor macromoleculari biologic activi este însă mult mai corect descris de teoria conformaţiei optime induse care se referă la faptul că ligandul se leagă de receptor într-o conformaţie mai puţin favorabilă, induce o serie de modificări structurale ce conduc la atingerea nivelului energetic minim (64) şi contribuie astfel la obţinerea unui complex stabil. Această observaţie este sprijinită de constatarea că în structurile complecşilor proteină-ligand determinate prin difracţie cu raze X 70 – 100% dintre atomii liganzilor sunt îngropaţi în interiorul proteinei, comportare ce nu ar fi posibilă decât dacă receptorul ar fi flexibil. Mai mult decât atât, 85% dintre proteinele depuse în PDB conţin unul până la trei reziduuri flexibile(65). Majoritatea programelor de andocare moleculară (Tabelul 28) iau încalcul nu numai cele şase grade de libertate în spaţiu ale moleculelor,ci şi flexibilitatea liganzilor şi lanţurilor de aminoacizi din structura receptorilor proteici, realizând ceea ce se numeşte andocare flexibilă. Andocarea moleculară a unui ligand flexibil într-un receptor rigid este o funcţie standard în majoritatea


319

programelor de andocare existente la ora actuală. Introducerea flexibilităţii la nivelul receptorului mai pune încă probleme, în special datorită puterii de calcul necesare deşi, există câteva implementări utilizabile. Astfel, cea mai simplă abordare este cea numită andocarea relaxată,în care se permite un anumit grad de suprapunere a atomilor ligandului peste atomii receptorului prin relaxarea modului de calcul a forţelor van der Walls. Metoda este foarte eficientă din punct de vedere computaţional, dar nu permite modelarea modificărilor conformaţionale mai ample, cum ar fi, de exemplu, mişcarea unui aminoacid în situsul catalitic al unei enzime (66). Modelarea flexibilităţii catenelor lateraleeste o altă metodă care utilizează un algoritm de calcul ce ţine cont de diversele conformaţii ale catenelor laterale ale aminoacizilor. O a treia metodă ce permite atât modelarea flexibilităţii catenelor laterale cât şi un anumit grad de mobilitate spaţială a catenei proteice are la bază relaxarea moleculară (61). Andocarea moleculară în general şi cea în care se ţine cont de mobilitate spaţială a catenei proteice în special este o aplicaţie dependentă de un număr mare de variable, necesitând prin urmare o putere de calcul foarte mare şi timpi lungi de aşteptare pentru obţinerea unui rezultat. Pentru a grăbi procesul, foarte frecvent, sunt utilizate informaţii suplimentare, cel mai adesea obţinute prin diverse abordări experimentale. Prin indicarea exactă a situsului de legare a ligandului în structura receptorului (cum ar fide exemplu o sferă cu raza de 20 Å în jurul unui reziduu cunoscut ca fiind implicat în cataliză) se realizează ceea ce se numeşte o andocare direcţionată (67). Când nu se cunosc informaţii legate de receptor sau ligand este utilizată o metodă brută, care evaluează extensiv toate posibilele conformaţii ale complexului, metodă numită andocare nedirecţionată.

(88)

Aplicaţie comercială, disponibilă pentru Linux şi Windows; face parte din pachetul LeadIT; interfaţă grafică foarte bună; poate să ţină cont şi de prezenţa metalelor în structura receptorului Program gratuit, doar în linie de comandă, disponibil pentru Unix, Linux, Windows şi OSX; pentru pregătirea ligandului şi a receptorului, precum şi pentru vizualizarea rezultatelor este indicat programul UCSF Chimera Programul poate utiliza simultan până la şase molecule diferite într-o rundă de experimente de andocare moleculară; gratuit, dar trebuie trimis

http://www.biosolveit.de/Flex X/

CR, FL

CR, FL, AN, http://dock.compbio.ucsf.edu/ DOCK_6/index.htm AD

Poate utiliza http://www.nmr.chem.uu.nl/ha ddock/ şi date

FlexX

Dock 6

HADDock

(89)

(63)

(87)

Aplicaţie comercială, disponibilă pentru Linux şi Windows

CR, FL, AN https://www.schrodinger.com/

Glide products/14/5/

(86)

Ref. bibl.

Gratuit, doar în linie de comandă, disponil pentru Linux, OSX, Windows, Solaris; o interfaţă grafică foarte bună este pusă la dizpoziţie de către autori, AutoDockTools (ADT)

Observaţii

CR, FL, FR, http://autodock.scripps.edu/ AD, AN

Pagină web

AutoDock 4

Programe

Program/Server Tipuri de andocare*

TABEL 28. Instrumente utilizate frecvent pentru experimente de andocare in-silico


(73)

Program comercial cu o bună interfaţă grafică, disponibil pentru Linux, Windows şi OSX; conţine un algoritm de detecţie automată a cavităţilor din interiorul receptorului permiţând astfel identificarea potenţialelor situs-uri active Program doar în linie de comandă, disponibil pentru Linux (numai Red Hat) OSX, Solaris; poate andoca atât proteine, cât şi ADN şi ARN; permite

http://www.molegro.com/mvd -product.php

http://www.sdsc.edu/CCMS/D OT/

Molegro Virtual FL, FR, AD Docker

DOT

CR, PP

(74)

(72)

Program oferit gratuit pentru cercetătorii din mediul academic; dezvoltat în special pentru a realiza andocarea moleculelor de ADN; disponibil pentru Windows, Linux şi OSX având o interfaţă grafică bine pusă la punct; fişierele pdb pot fi utilizate direct ca input

CR, AN

http://hex.loria.fr/

HEX Protein docking

(91)

Program comercial disponibil pentru Windows, Linux, SGI, OSX

FL, FR, AN, http://www.molsoft.com/dock ing.html PP

ICM

(90)

Program comercial disponibil pentru Linux şi Windows

oducts/life_sciences/gold/

CR, FL, AD http://www.ccdc.cam.ac.uk/pr

Ref. bibl.

GOLD

Observaţii autorului un acord de utilizare; nu are interfaţă grafică; programul este disponibil sub forma unei colecţii de scripturi

Pagină web

experimental e pentru a mări acurateţea



Pagină web

ZDOCK Server CR, LD, PP

http://zdock.bu.edu/

Dezvoltat în special pentru andocare proteinăproteină, poate utiliza direct fişiere .pdb

Program comercial, conţine un algoritm de detecţie automată a cavităţilor din interiorul receptorului permiţând astfel identificarea potenţialelor situs-uri active

http://simbiodasys.ca

FL, AN

eHiTs

Servere

(78)

Program comercial cu interfaţă grafică bazată pe utilizarea unui browser web, ceea ce permite folosirea în orice sistem de operare

http://fitted.ca/

FL, FR

Fitted

(80)

(79)

(77)

Gratuit pentru cercetătorii din mediul academic, disponibil pentru Windows şi Linux

http://gemdock.life.nctu.edu.t w/dock/

FL, FR

(76)

GEMDOCK

disponibil

Programul are o interfaţă grafică, pentru SGI şi Linux

http://dockvision.com/

(75)

Ref. bibl.

FL, AD

Program open-source doar în linie de comandă, disponibil pentru Linux, OSX şi Windows; pentru pregătirea fişierelor necesare andocării şi pentru vizualizarea rezultatelor se poate utiliza AutoDockTools (ADT)

pregătirea automată a fişierelor necesare pornind de la fişiere .pdb

Observaţii

DockVison

AutoDock Vina CR, FL, FR, http://vina.scripps.edu/ AD, AN



Foloseşte programele DOCK 3 şi PocketPickker pentru andocare şi baza de date ZINC pentru selecţia liganzilor

* CR – andocare cu corpuri rigide, FL – andocare cu liganzi flexibili, FR – andocare cu receptor flexibl, AN – andocare nedirecţionată, AD – andocare direcţionată, PP – andocare proteină–proteină

CR, FL, AN http://blaster.docking.org/

DockBlaster

(84)

Serverul foloseşte direct structurile în format pdb

http://hexserver.loria.fr

CR

Hex Server

(83)

Bazat pe programul RosettaDock

http://rosettadock.graylab.jhu. edu

CR, FL, PP

RosettaDock Server

Conceput exclusiv pentru andocarea proteinăproteină

http://vakser.bioinformatics.k u.edu/resources/gramm/gram mx

LB, BD, PP

GRAMM-X

(85)

(82)

(81)

Fişierele input pot fi în coordonate 3D în format .pdb sau direct codurile acestor fişiere

http://cluspro.bu.edu

Ref. bibl.

ClusPro Server CR, PP

Observaţii

Pagină web



324


Evaluarea rezultatelor obţinute prin andocare moleculară computerizată Rezultatul final al experimentelor de andocare moleculară computerizată nu este o structură unică a complexului ligand-receptor, ci o colecţie de posibile orientări ale ligandului în situsul de legare al receptorului. În general, succesul unui asemenea experiment se măsoară cu ajutorul abaterii de la rădăcina pătrată medie (engl. Root-Mean-Square Deviation, RMSD) dintre orientarea ligandului observată experimental şi cea dedusă computaţional. Orientări cu RMSD < 2Ĺ sunt considerate foarte bune, iar cele cu RMSD în intervalul 2-3Ĺ sunt considerate un succes parţial (68). Valoarea RMSD este utilizabilă doar în cazul în care structura tridimensională a complexului investigat a fost elucidată experimental. În majoritatea cazurilor, acest lucru nu este posibil şi de aceea o serie de autori implementează în programele lor funcţii specifice de evaluare a rezultatelor. O metodă complet automată care să permită selecţia corectă a celei mai bune orientări a ligandului în situsul de legare a receptorului nu există încă, acest rol fiind îndeplinit de către utilizator.

Aplicaţii ale andocării moleculare Experimentele in-silico de andocare moleculară au o gamă largă de utilizări, începând cu studiul interacţiunilor proteină-proteină şi terminând cu ingineria enzimatică. Deşi legile fizicii care descriu interacţiunile la nivel molecular sunt aceleaşi, fiecare aplicaţie a andocării moleculare are un set specific de algoritmi de calcul, special conceput pentru a mări viteza de calcul şi corectitudinea rezultatelor. Pe baza tipului de ligand utilizat se pot distinge câteva tipuri diferite de aplicaţii ale andocării moleculare, fiecare cu propriile avantaje şi dezavantaje. 1. Andocarea proteine-molecule mici. Scopul acesteiaplicaţii este de a identifica situsul de legare şi/sau modul de legare al unei molecule de dimensiuni mici într-o moleculă proteică. Ligandul este reprezentat prin coordonatele tridimensionale ale întregii molecule, coordonate obţinute în general dintr-o bază specifică de date precum ZINC (69) sau PubChem


325

(70). Acest tip de andocare a fost utilizat cu succes pentru a elucida mecanismul inhibiţiei monoamin-oxidazei umane de către 1,4-naftochinonă sau pentru validarea datelor experimentale legate de proprietăţile cinetice ale unei ω-amidaze din Arthrobacter nicotinovorans pAO1 (71). O limitare importantă a experimentelor de andocare ce folosesc liganzi de dimensiuni mici este structura receptorului. Rezoluţia la nivel atomic se obţine la mai puţin de 1,2 Å, dar majoritatea structurilor modelelor 3D din PDB au o rezoluţie între 1,5 şi 2,5 Å. Ca regulă generală, se consideră că un model 3D al unei proteine la o rezoluţie de cel puţin 2,2 Å permite obţinerea de rezultate acceptabile în majoritatea aplicaţiilor, cu observaţia că amplasarea atomilor de hidrogen nu poate fi precizată în acest caz. O altă limitare a acestei aplicaţii este faptul că majoritatea programelor de andocare nu iau în calcul şi rolul jucat de diverşi cofactori, inhibitori sau ioni metalici. 2. Identificarea de noi liganzi este utilă în special în industria farmaceutică pentru a identifica noi medicamente sau generarea unui farmacofor. Pentru aceasta, se pleacă de la o colecţie de liganzi de dimensiuni mici despre care se ştie că se leagă de un receptor proteic dat. Metoda presupune că legarea lor se datorează unui set comun de proprietăţi geometrice şi chimice. Astfel, liganzii sunt trataţi ca fragmente şi sunt andocaţi în situsul de legare al receptorului. Prin combinarea lor şi ligarea diverselor grupe de atomi se obţine o nouă moleculă care se va lega de receptor mai puternic decât oricare dintre liganzii de la care s-a pornit. Principalul punct slab al acestei aplicaţii este faptul că în mod paradoxal reduce diversitatea structurală disponibilă cercetătorului. Dacă un compus se leagă într-un situs de legare dat, este de aşteptat ca toate moleculele cu structură analoagă să se comporte la fel. Când se ordonează potenţialii liganzi în funcţie de energia de legare, liganzii similari vor fi plasaţi în apropiere, cercetătorul ignorând involuntar liganzii structural diferiţi, dar cu şanse să se lege de proteina dată. 3. Andocarea proteină-proteină încearcă să simuleze mecanismele de recunoaştere moleculară. Dimensiunile mari ale celor doi parteneri (ligandul şi receptorul sunt două proteine diferite) alături de faptul că legile care guvernează interacţiunile moleculare la acest nivel nu sunt foarte bine cunoscute face ca această aplicaţie să fie una dintre cele mai dificile sarcini, atât din punct de vedere computaţional cât şi metodologic.


326

Bibliografie: 1. Xu, D. (2009) –Computational methods for protein sequence comparison and search., Current protocols in protein science, Chapter 2, Unit2.1. 2. Igloi, G. L., Brandsch, R. (2003) –Sequence of the 165-kilobase catabolic plasmid pAO1 from Arthrobacter nicotinovorans and identification of a pAO1-dependent nicotine uptake system, J Bacteriol, 185, 1976-1986. 3. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. (2011) –GenBank, Nucleic Acids Research, 39, D32-7. 4. Bairoch, A., Apweiler, R. (1999) –The SWISS-PROT protein sequence data bank and its supplement TrEMBL in 1999., Nucleic Acids Research, 27, 49-54. 5. Rodriguez-Tome, P., Stoehr, P. J., Graham, N. C., Flores, T. P. (1996) – The European Bioinformatics Institute (EBI) databases, Nucleic Acids Research, 24, 6-12. 6. Barker, W. C., George, D. G., Mewes, H. W., Tsugita, A. –(1992) The PIR-International Protein Sequence Database., Nucleic Acids Research, 20 Suppl, 2023-6. 7. Berman, H. M., Kleywegt, G. J., Nakamura, H., Markley, J. L. –(2012) The Protein Data Bank at 40: Reflecting on the Past to Prepare for the Future, Structure, 20, 391-396. 8. Bernstein, F. C., Koetzle, T. F., Williams, G. J., Meyer, E. F., Brice, M. D., Rodgers, J. R., Kennard, O., Shimanouchi, T., Tasumi, M. (1977) –The Protein Data Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures., Journal of Molecular Biology, 112, 535–42. 9. Bourne, P. E., Berman, H. M., McMahon, B., Watenpaugh, K. D., Westbrook, J. D., Fitzgerald, P. M. D. (1997) –Macromolecular Crystallography Part B, Methods in Enzymology, 277, 571-590. 10. Sayle, R. A., and Milner-White, E. J. (1995) –RASMOL: biomolecular graphics for all., Trends in biochemical sciences, 20, 374. 11. Doolittle, R. F. (1981) –Similar amino acid sequences: chance or common ancestry?, Science, 214, 149-59.


327

12. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. (1990) –Basic local alignment search tool, Journal of Molecular Biology, 215, 403-10. 13. Pizzi, E., Attimonelli, M., Liuni, S., Frontali, C., Saccone, C. (1992) – A simple method for global sequence comparison., Nucleic Acids Research, 20, 131-6. 14. Smith, T. F., Waterman, M. S. (1981) –Identification of common molecular subsequences., Journal of Molecular Biology, 147, 1957. 15. Dayhoff, M., Schwartz, R., Orcutt, B. (1978) –A model of evolutionary change in proteins, Atlas of protein sequence and structure, 5, 345-352. 16. Henikoff, S., Henikoff, J. G. (1992) –Amino acid substitution matrices from protein blocks., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 89, 10915-9. 17. McGinnis, S., Madden, T. L. (2004) –BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools., Nucleic Acids Research, 32, W20-5. 18. Berman, H., Westbrook, J., Feng, Y., Gilliand, G., Bhat, T., Weissig, H., Shindyalov, I., Bourne, P. (2000) –The Protein Data Bank, Nucleic Acids Res, 28, 235-242. 19. Rost, B. (1999) –Twilight zone of protein sequence alignments., Protein engineering, 12, 85-94. 20. Sayers, E. W., Barrett, T., Benson, D. A., Bolton, E., Bryant, S. H., Canese, K., Chetvernin, V., Church, D. M., Dicuccio, M., Federhen, S., Feolo, M., Geer, L. Y., Helmberg, W., Kapustin, Y., Landsman, D., Lipman, D. J., Lu, Z., Madden, T. L., Madej, T., Maglott, D. R., Marchler-Bauer, A., Miller, V., Mizrachi, I., Ostell, J., Panchenko, A., Pruitt, K. D., Schuler, G. D., Sequeira, E., Sherry, S. T., Shumway, M., Sirotkin, K., Slotta, D., Souvorov, A., Starchenko, G., Tatusova, T. A., Wagner, L., Wang, Y., John Wilbur, W., Yaschenko, E., Ye, J. (2010) –Database resources of the National Center for Biotechnology Information., Nucleic acids Research, 38, D5-16. 21. Madden, T. (2002) –The BLAST Sequence Analysis Tool in The NCBI Handbook (McEntyre, J., Ostell, J., Eds.). National Center for Biotechnology Information (US). 22. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. (2010) –GenBank, Nucleic Acids Research, 38, D46-51.

328


23. Dutta, S., Burkhardt, K., Young, J., Swaminathan, G. J., Matsuura, T., Henrick, K., Nakamura, H., Berman, H. M. (2009) –Data deposition and annotation at the worldwide protein data bank., Molecular Biotechnology, 42, 1-13. 24. Anfinsen, C. B. (1973) –Principles that govern the folding of protein chains., Science, 181, 223-30. 25. Kolata, G. (1986)–Trying to crack the second half of the genetic code., Science, 233, 1037-9. 26. Fiser, A. (2004) –Protein structure modeling in the proteomics era., Expert review of proteomics, 1, 97-110. 27. Lesk, A. (1980) –How different amino acid sequences determine similar protein structures: The structure and evolutionary dynamics of the globins, Journal of Molecular Biology, 136, 225-230. 28. Floudas, C. A. (2007) –Computational methods in protein structure prediction., Biotechnology and Bioengineering, 97, 207-13. 29. Xiang, Z. (2006) –Advances in homology protein structure modeling., Current Protein & Peptide Science, 7, 217-27. 30. Kopp, J., Schwede, T. (2004) –Automated protein structure homology modeling: a progress report., Pharmacogenomics, 5, 405-16. 31. Zhang, Y. (2009) –Protein structure prediction: when is it useful?, Current Opinion In Structural Biology, 19, 145-55. 32. Vitkup, D., Melamud, E., Moult, J., Sander, C. (2001) –Completeness in structural genomics., Nature structural biology, 8, 559-66. 33. Floudas, C. A., Fung, H. K., McAllister, S. R., Mönnigmann, M., Rajgaria, R. (2006)–Advances in protein structure prediction and de novo protein design: A review, Chemical Engineering Science, 61, 966-988. 34. Zhang, Y., Skolnick, J. (2005) –The protein structure prediction problem could be solved using the current PDB library., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102, 1029-34. 35. Mihăşan, M. (2010) –Basic protein structure prediction for the biologist: A review, Archives of Biological Sciences, 62, 857-871. 36. Ring, C. S. (1993) –Structure-Based Inhibitor Design by Using Protein Models for the Development of Antiparasitic Agents, Proceedings of the National Academy of Sciences, 90, 3583-3587. 37. Vernal, J., Fiser, A., Sali, A., Müller, M., Cazzulo, J. J., Nowicki, C. (2002) –Probing the specificity of a trypanosomal aromatic alpha-


329

hydroxy acid dehydrogenase by site-directed mutagenesis., Biochemical and biophysical research communications, 293, 633-9. 38. Sheng, Y., Sali, A., Herzog, H., Lahnstein, J., Krilis, S. A. (1996) – Site-directed mutagenesis of recombinant human beta 2glycoprotein I identifies a cluster of lysine residues that are critical for phospholipid binding and anti-cardiolipin antibody activity., Journal of Immunology, 157, 3744-51. 39. Wilson, D., Pethica, R., Zhou, Y., Talbot, C., Vogel, C., Madera, M., Chothia, C., Gough, J. (2009) –SUPERFAMILY--sophisticated comparative genomics, data mining, visualization and phylogeny., Nucleic Acids Research, 37, D380-6. 40. Bates, P. A., Kelley, L. A., MacCallum, R. M., Sternberg, M. J. (2001) –Enhancement of protein modeling by human intervention in applying the automatic programs 3D-JIGSAW and 3D-PSSM., Proteins, 5, 39-46. 41. Lambert, C., Leonard, N., De Bolle, X., Depiereux, E. (2002) – ESyPred3D: Prediction of proteins 3D structures, Bioinformatics, 18, 1250-1256. 42. Combet, C., Jambon, M., Deleage, G., Geourjon, C. (2002) –Geno3D: automatic comparative molecular modelling of protein, Bioinformatics, 18, 213-214. 43. Arnold, K., Bordoli, L., Kopp, J., Schwede, T. (2006)– The SWISSMODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling., Bioinformatics, 22, 195-201. 44. Kelley, L. A., MacCallum, R. M., Sternberg, M. J. (2000) –Enhanced genome annotation using structural profiles in the program 3DPSSM., Journal Of Molecular Biology, 299, 499-520. 45. Kelley, L. A., Sternberg, M. J. E. (2009) –Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server., Nature protocols, 4, 363-71. 46. Fiser, A., Sali, A. (2003) –ModLoop: automated modeling of loops in protein structures., Bioinformatics, 19, 2500-1. 47. Kurowski, M. A., Bujnicki, J. M. (2003) –GeneSilico protein structure prediction meta-server., Nucleic Acids Research, 31, 3305-7. 48. Eyrich, V. A., Rost, B. (2003) –META-PP: single interface to crucial prediction servers., Nucleic Acids Research, 31, 3308-10. 49. Ginalski, K., Elofsson, A., Fischer, D., Rychlewski, L. (2003)– 3DJury: a simple approach to improve protein structure predictions, Bioinformatics, 19, 1015-1018.

330


50. Chivian, D., Kim, D. E., Malmström, L., Bradley, P., Robertson, T., Murphy, P., Strauss, C. E. M., Bonneau, R., Rohl, C. A., Baker, D. (2003) –Automated prediction of CASP-5 structures using the Robetta server., Proteins, 53, 524-33. 51. Kolinski, A. (2004) –Protein modeling and structure prediction with a reduced representation, Acta Biochimica Polonica, 51, 349-371. 52. Schymkowitz, J., Borg, J., Stricher, F., Nys, R., Rousseau, F., Serrano, L. (2005) –The FoldX web server: an online force field., Nucleic Acids Research, 33, W382-8. 53. Fiser, A., Sali, A. (2003) –Modeller: generation and refinement of homology-based protein structure models., Methods in enzymology, 374, 461-91. 54. Ritchie, D. W. (2008) –Recent progress and future directions in protein-protein docking., Current Protein & Peptide Science, 9, 1-15. 55. B-Rao, C., Subramanian, J., Sharma, S. D. (2009) –Managing protein flexibility in docking and its applications., Drug Discovery Today, 14, 394-400. 56. Sousa, S. F., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. (2006) –Protein-ligand docking: current status and future challenges., Proteins, 65, 15-26. 57. Halperin, I., Ma, B., Wolfson, H., Nussinov, R. (2002) –Principles of docking: An overview of search algorithms and a guide to scoring functions., Proteins, 47, 409-43. 58. Plewczynski, D., Łaźniewski, M., Augustyniak, R., Ginalski, K. (2011) –Can we trust docking results? Evaluation of seven commonly used programs on PDBbind database., Journal Of Computational Chemistry, 32, 742-55. 59. Huang, N., Shoichet, B. K., Irwin, J. J. (2006) – Benchmarking sets for molecular docking., Journal Of Medicinal Chemistry, 49, 6789-801. 60. Huang, S.-Y., Zou, X. (2010) – Advances and challenges in proteinligand docking., International Journal of Molecular Sciences, 11, 3016-34. 61. Huang, S.-Y., Grinter, S. Z., Zou, X. (2010) –Scoring functions and their evaluation methods for protein-ligand docking: recent advances and future directions., Physical Chemistry Chemical Physics: PCCP,12, 12899-908. 62. Dias, R., de Azevedo, W. F. (2008) – Molecular docking algorithms., Current Drug Targets, 9, 1040-7.


331

63. Kuntz, I. D., Blaney, J. M., Oatley, S. J., Langridge, R., Ferrin, T. E. (1982)–A geometric approach to macromolecule-ligand interactions., Journal Of Molecular Biology, 161, 269-88. 64. Wang, Q., Pang, Y.P. (2007) –Preference of Small Molecules for Local Minimum Conformations when Binding to Proteins, PLoS ONE, 2, e820. 65. Najmanovich, R., Kuttner, J., Sobolev, V., Edelman, M. (2000) – Sidechain flexibility in proteins upon ligand binding., Proteins, 39, 261-8. 66. Ferrari, A. M., Wei, B. Q., Costantino, L., Shoichet, B. K. (2004) – Soft docking and multiple receptor conformations in virtual screening., Journal of Medicinal Chemistry, 47, 5076-84. 67. Fitzjohn, P. W., Bates, P. A. (2003) – Guided docking: first step to locate potential binding sites., Proteins, 52, 28-32. 68. Cole, J. C., Murray, C. W., Nissink, J. W. M., Taylor, R. D., Taylor, R. (2005) –Comparing protein-ligand docking programs is difficult., Proteins, 60, 325-32. 69. Irwin, J. J., Shoichet, B. K. (2005) – ZINC--a free database of commercially available compounds for virtual screening., Journal of Chemical Information and Modeling, 45, 177-82. 70. Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. (2009) – PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules., Nucleic Acids Research, 37, W623-33. 71. Cobzaru, C., Ganas, P., Mihasan, M., Schleberger, P., Brandsch, R. (2011) –Homologous gene clusters of nicotine catabolism, including a new ω-amidase for α-ketoglutaramate, in species of three genera of Gram-positive bacteria., Research In Microbiology, 162, 285-91. 72. Ritchie, D. W., Ritchie, D. W., Kemp, G. J. L. (1999) – Protein Docking Using Spherical Polar Fourier Correlations, Proteins, 39, 178-194. 73. Thomsen, R., Christensen, M. H. (2006) – MolDock: a new technique for high-accuracy molecular docking., Journal Of Medicinal Chemistry,49, 3315-21. 74. Mandell, J. G., Roberts, V. A., Pique, M. E., Kotlovyi, V., Mitchell, J. C., Nelson, E., Tsigelny, I., Ten Eyck, L. F. (2001) – Protein docking using continuum electrostatics and geometric fit, Protein Engineering Design and Selection, 14, 105-113.

332


75. Trott, O., Olson, A. J. (2010) – AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading., Journal of Computational Chemistry, 31, 455-61. 76. Hart, T. N., Read, R. J. (1992) – A multiple-start Monte Carlo docking method, Proteins: Structure, Function, and Genetics, 13, 206-222. 77. Yang, J.M., Chen, C.C. (2004) –GEMDOCK: a generic evolutionary method for molecular docking., Proteins, 55, 288-304. 78. Corbeil, C. R., Englebienne, P., Moitessier, N. (2007) – Docking Ligands into Flexible and Solvated Macromolecules. 1. Development and Validation of FITTED 1.0, Journal of Chemical Information and Modeling,47, 435-449. 79. Zsoldos, Z., Reid, D., Simon, A., Sadjad, B. S., Johnson, A. P. (2006) – eHiTS: an innovative approach to the docking and scoring function problems., Current Protein Peptide Science, 7, 421-435. 80. Chen, R., Li, L., Weng, Z. (2003) – ZDOCK: An initial-stage proteindocking algorithm, Proteins: Structure, Function, and Genetics, 52, 80-87. 81. Comeau, S. R., Gatchell, D. W., Vajda, S., Camacho, C. J. (2003) – ClusPro: an automated docking and discrimination method for the prediction of protein complexes, Bioinformatics, 20, 45-50. 82. Tovchigrechko, A., Vakser, I. A. (2006) –GRAMM-X public web server for protein-protein docking., Nucleic Acids Research, 34, W310-4. 83. Lyskov, S., Gray, J. J. (2008) – The RosettaDock server for local protein-protein docking., Nucleic Acids Research, 36, W233-8. 84. Macindoe, G., Mavridis, L., Venkatraman, V., Devignes, M.D., Ritchie, D. W. (2010) – HexServer: an FFT-based protein docking server powered by graphics processors, Nucleic Acids Research, 38, W445-W449. 85. Irwin, J. J., Shoichet, B. K., Mysinger, M. M., Huang, N., Colizzi, F., Wassam, P., Cao, Y. (2009) – Automated docking screens: a feasibility study., Journal of Medicinal Chemistry,52, 5712-20. 86. Morris, G. M., Goodsell, D. S., Halliday, R. S., Huey, R., Hart, W. E., Belew, R. K., Olson, A. J. (1998) – Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function, Journal of Computational Chemistry, 19, 1639-1662. 87. Friesner, R. A., Murphy, R. B., Repasky, M. P., Frye, L. L., Greenwood, J. R., Halgren, T. A., Sanschagrin, P. C., Mainz, D. T.


333

(2006) – Extra precision glide: docking and scoring incorporating a model of hydrophobic enclosure for protein-ligand complexes., Journal of Medicinal Chemistry, 49, 6177-96. 88. Rarey, M., Kramer, B., Lengauer, T., Klebe, G. (1996) – A fast flexible docking method using an incremental construction algorithm, Journal of Molecular Biology, 261, 470-489. 89. de Vries, S. J., van Dijk, A. D. J., Krzeminski, M., van Dijk, M., Thureau, A., Hsu, V., Wassenaar, T., Bonvin, A. (2007) – HADDOCK versus HADDOCK: new features and performance of HADDOCK2.0 on the CAPRI targets., Proteins, 69, 726-33. 90. Verdonk, M. L., Cole, J. C., Hartshorn, M. J., Murray, C. W., Taylor, R. D. (2003) – Improved protein-ligand docking using GOLD., Proteins, 52, 609-23. 91. Abagyan, R., Totrov, M. (1994) – Biased Probability Monte Carlo Conformational Searches and Electrostatic Calculations for Peptides and Proteins, Journal of Molecular Biology, 235, 9831002.

ANEXĂ

TABEL A1. Multipli şi submultipli ai unităţilor de măsură Prefix

Factor de multiplicare

Abreviere

Atto

10-18

a

Femto

10-15

f

Pico

10-12

p

Nano Micro

-9

n

-6

μ

-3

10 10

Mili

10

m

Centi

10-2

c

Deci

10-1

d

Deca

10

da

Hecto Kilo

2

h

3

k

4

10 10

Myria

10

my

Mega

106

M

Giga

109

G

Tera Peta Exa

12

T

15

P

18

E

10 10 10


336

TABEL A2. Tabel de conversie a celor mai utilizate unităţi de volum Pentru a converti:

în:

se multiplică cu:

Centimetri cubi (cm3)

Microlitri (μl)

103

Mililitri (ml)

1

Litri (l)

10-3

Galoane (US)

2.641 x 10-4

Metri cubi (m3)

10-6

Picioare cubice (cubic feet, 3,531 x 10-5 ft3)

Litri (L)

Inchi cubici (cubic inches (in.3)

6,102 x 10-2

Microlitri (μl)

106

Mililitri (ml)

103

Galoane (US)

0,2642 3

Centimetri cubi (cm )

103

Metri cubi (m3)

10-3

Picioare cubice (engl.cubic 3,531 x 10-2 feet, ft3)

Mililitri (ml) Microlitri (μl)

Inchi cubici (engl.cubic inches (in.3)

61.02

Litri (l)

10-3

Microlitri (μl)

103

Mililitri (ml)

10-3

Litri (l)

10-6

Anexă

337

TABEL A3. Tabel de conversie a celor mai utilizate unităţi de măsură Pentru a converti din:

în:

se multiplică cu:

Concentraţia Miligrame per litru (mg/l) Părţi pe milion (ppm)

1

Distanţa Centimetri (cm)

Inchi (in)

Milimetri (mm)

Angstromi (Å)

Picioare (engl.feet, ft)

3,281 x 10-2

Inchi (in.)

0,39

Metri (m)

10-2

Milimetri (mm)

10

Yarzi (yd)

1,094 x 10-2

Centimetri (cm)

2,54


8,333 x 10-2

Metri (m)

2,540 x 10-2

Milimetri (mm)

25,4

Yarzi (yd)

2,778 x 10-2

Centimetri (cm)

0,1


3,281 x 10-3

Inchi (in.)

3,937 x 10-2

Metri (m)

10-3

Nanometri (nm)

0,1

Metri (m)

10-10

Picometri (pm)

100

Amperi pe inci pătraţi (A/in2)

6,45

Amperi pe metru patrat (A/m2)

104

Curentul şi sarcina electrică Amperi pe centimetru pătrat (A/cm2)


338

Pentru a converti din:

în:

se multiplică cu:

Amperi pe inci pătraţi (A/in2)

Amperi pe centimetru pătrat (A/cm2)

0,16

Amperi pe metru patrat (A/m2)

1,55 x 103

Coulombi (C)

3,6 x 103

Faraday (F)

3,731 x 10-2

Coulombi(C)

Faraday (F)

1,036 x 10-5

Coulombi pe centimetru pătrat (C/cm2)

Coulombi pe inci pătrat 64,52 (C/in2)

Amperi oră (A-hr)

Coulombi pe metru patrat (C/m2) Coulombi pe inci pătrat (C/in2)

Faraday (F)

104

Coulombs pe centimetru 0,16 pătrat (C/cm2) Coulombs pe metru patrat (C/m2)

1,55 x 103

Amperi-oră (A-hr)

26.,8

Coulombs (C)

9,649 x 10-4

Bari

1,01

Presiunea Atmosfere (atm)

Milimetri coloana de Hg 760 (mmHg) sau torri Bari (bar)

Milimetri coloana de Hg (mmHg) sau torri

Atmosfere (atm)

0,99

Kilograme pe metru pătrat (kg/m2)

1,020 x 104

psi

14,5

Atmosfere (atm)

1,316 x 10-3

Kilograme pe metru pătrat (kg/m2)

136

Anexă

339

Pentru a converti din:

în:

se multiplică cu:

Pascali (P)

Newtoni pe metru pătrat 1 (N/m2)

Rezistenţa electrică Ohmi (Ω)

Megaohmi (MΩ)

106

Microhmi (μΩ)

10-6

Ore (hr)

24

Minute (min)

1,44 x 103

Secunde (sec)

8,64 x 104

Grade Celsius (oC)

K-273,13

Grade Fahrenheit (oF)

[(K − 273,13) × 9⁄5] + 32

Grade Kelvin (oK)

O

Grade Fahrenheit (oF)

1,8 x oC + 32

Grade Celsius (oC)

(F -32)/1,8

Picioare pe minut (ft/min)

1,2

Picioare pe secundă (ft/sec)

3,281 x 10-2

Timp Zile

Temperatura Grade Kelvin (K)

Grade Celsius (oC) Grade Fahrenheit (oF)

C + 273,13

Viteza Centimetri pe secundă (cm/s)

Kilometri pe oră (km/hr) 3,6 x 10-2 Metri pe minut (m/min) 0,6 Mile pe ora (miles/hr)

2,237 x 10-2

Mile pe minut (miles/min)

3,728 x 10-4


340

TABEL A4. Date generale privind concentraţia aproximativă a diverşilor constituenţi intracelulari după Ausubel et al., 2002 (1) Macromolecule (proteine, acizi nucleici, poliglucide)

22% (w/w)

Molecule mici Apă

70% (w/w)

Monoglucide

3% (w/w)

Lipide

2% (w/w)

Aminoacizi liberi

0,4% (w/w)

Nucleotide

0,4% (w/w)

Ioni anorganici

1% (w/w)

Na+

5-15 mM

K+

140 mM

Mg2+ Ca Cl

2+

-

pH

30 mM 1-2 mM 4 mM 7,4

Anexă

341

TABEL A5. Factori de conversie utilizaţi frecvent în studiul proteinelor şi acizilor nucleici Masa molară medie a unei perechi de baze = 649 Da 1 kb de ADN codifica 333 amino-acizi, adică ≈ 36.000 Da 1 fragment de 1 kB este echivalentul a 6,5 x 105 Da ADN dublu catenar, 3,3 x 105 Da ADN mono catenar sau 3,4 x 105 Da ARN monocatenar 1 μg/ml ADN conţine 3,08 μM fosfat 1 μg/ml ADN cu dimensiunea de 1 kb conţine 3,08 nM capete 5′ 1μmol pBR322 (4363 bp) este echivalent a 2,83 g Masa molară medie a unui aminoacid = 110 Da 10 kDa dintr-o proteină conţine ≈ 91 aminoacizi şi este codificată de ≈ 273 nucleotide


342

TABEL A6. Modul de notare prescurtată a nucleotidelor Prescurtare

Nucleotidă

A

Adenină

C

Citozină

G

Guanină

T

Timină

U

Uracil

M

Adenină sau Citozină

R

Adenină sau Guanină

S

Citozină sau Guanină

Y

Citozină sau Timină

K

Guanină sau Timină

V

Adenină, Citozină sau Guanină (oricare, exceptând Timina)

H

Adenină, Citozină sau Timină (oricare, exceptând Guanina)

D

Adenină, Guanină sau Timină (oricare, exceptând Citozina)

B

Citozină, Guanină sau Timină (oricare, exceptând Adenina)

N

Oricare din cele cinci nucleotide

Prescurtarea cu trei litere

Ala

Arg

Asn

Asp

Cys

Glu

Gln

Gly

His

Ile

Leu

Lys

Met

Aminoacid

Alanină

Arginină

Asparagină

Acid aspartic

Cisteină

Glutamat

Glutamină

Glicină

Histidină

Isoleucină

Leucină

Lizină

Metionină

M

K

L

I

H

G

Q

E

C

D

N

R

A

149.2

146.2

131.2

131.2

155.2

75.1

146.2

147.1

121.2

133.1

132.1

174.2

89.1

Prescurtarea cu o Masă litera molară (g/mol)

TABEL A7. Principalele proprietăţi fizico-chimice ale aminoacizilor

185

200

170

175

195

75

180

190

135

150

160

225

115

Aria suprafeţei accesibilea

1.02

-0.67

1.22

1.25

-0.64

-0.67

-0.91

-1.22

0.17

-1.31

-0.92

-0.59

-0.4

94

56

40

96

66

49

93

102

20

106

134

65

100

HidroMutabilitate b fobicitate relativă c

Anexă 343

Pro

Ser

Thr

Trp

Tyr

Val

Prolină

Serină

Treonină

Triptofan

Tirozină

Valină

V

Y

W

T

S

P

F

117.1

181.2

204.2

119.1

105.1

115.1

165.2

Prescurtarea cu o Masă litera molară (g/mol)

155

230

255

140

115

145

210

Aria suprafeţei accesibilea

0.91

1.67

0.5

-0.28

-0.55

-0.49

1.92

74

41

18

97

120

56

41

HidroMutabilitate fobicitateb relativă c

b

Aria suprafeţei accesibile este exprimată în Å şi este calculată pentru fiecare aminoacid ca parte a unui schelet polipeptidic (2) Hidrofobicitatea este exprimată în unităţi arbitrare folosind scala OMH descrisa de Sweet şi Eisenberg (1983) (3) c Mutabilitatea relativă este exprimată înunităţi arbitrare(alanina fiind aleasă ca referinţă) şi reprezintă probabilitatea ca un aminoacid să sufere o mutaţie într-un timp dat (4)

2

Phe

Fenilalanină

a

Prescurtarea cu trei litere

Aminoacid


A N/A A C D C A

D D D D D D D D

Benzen

Cloroform

Diclorbenzen

Hexan

Nitrobenzen

Fenol

Toluen

Dicloretan A A A A A

A D N/A B D

Alcool amilic

Alcool benzilic

Alcool izopropilc

Etanol

Metanol

Alcooli

N/A

D

Acrilonitril A

A

D

Acetal

Acetonă

Slovenţi organici

ABS

A

B

C

A

A

D

D

B

D

B

D

D

D

A

D

CPVC

A

B

A

D

B

C

C

D

C

D

N/A

C

C

A

B

LDPE

B

B

A

N/A

B

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

PC

A

A

A

A

A

A

A

D

A

A

A

A

A

A

A

PEEK

A

A

A

A

B

D

C

B

B

B

C

C

D

A

A

PP

TABEL A8. Compatibilitate chimică a diverselor tipuri de materiale plastice utilizate în laborator:

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

PTFE

A

C

A

D

A

D

D

D

D

B

D

D

C

B

D

PVC

A

N/A

N/A

A

D

A

A

A

A

A

A

A

A

A

D

PVDF

Anexă 345

B A D C D N/A N/A D D D

D D D C A B N/A N/A C D D

Aqua Regia (HCl 80%, HNO3 20%)

Acid citric

Acid formic

HF până la 75%

HCl 37%

H2SO4 10-75%

H2SO4 98%

Acid tricloracetic, TCA

HNO3 până la 50%

HNO3

H3PO4 mai concentrat de 40%) D A A

D B A

Amoniac

Mg(OH)2

KOH

Baze

D

D

D

Acetal

Acid acetic glacial

Acizi

ABS

A

A

A

A

D

B

N/A

C

A

A

C

A

B

C

B

CPVC

A

A

B

B

C

B

A

C

A

B

C

D

D

B

A

LDPE

D

A

D

A

C

B

D

N/A

B

D

D

A

A

D

B

PC

A

A

A

A

D

D

N/A

D

D

A

D

C

A

D

A

PEEK

A

A

A

A

D

B

A

A

A

C

C

A

A

B

B

PP

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

PTFE

A

A

A

B

B

B

B

D

A

B

C

A

B

C

D

PVC

A

A

A

B

A

A

B

A

A

A

A

A

A

A

C

PVDF


A A D D A A D

B B A D B B A

Detergenţi

Formaldehidă

H2O2

Iod

AgNO3

Uree

NaOCl până la 20%

A

A

A

D

A

A

A

D

A

CPVC

A

A

A

A

C

B

D

C

D

LDPE

C

D

A

N/A

A

A

A

C

D

PC

B

A

A

C

A

A

A

A

A

PEEK

A

A

A

C

B

C

A

A

A

PP

A

A

A

A

A

A

A

A

A

PTFE

A

D

A

A

A

A

A

D

A

PVC

A

A

A

A

A

A

A

D

A

PVDF

A = compatibilitate excelentă, B = compatibilitate bună, efecte mici – o uşoară decolorare sau coroziune, C = compatibilitate relativ bună, efecte mai pronunţate, nu se recomandă pentru utilizarea continuă; pot apărea fenomene de înmuiere sau umflare, D = efecte severe, nu se recomandă utilizarea, N/A = nu există informaţii despre compatibilitate

A

D

D

A

Acetaldehidă

Altele

NaOH până la 80%

Acetal

ABS

Anexă 347

348


FIGURA A1. Nomogramă pentru conversia forţei centrifuge (g) în viteză de rotaţie (rpm). Pentru a identifica pe nomogramă o valoare necunoscută se trasează o dreaptă descrisă de două puncte de pe celelalte două coloane. Valoarea dorită se citeşte la intersecţia dreptei cu coloana de interes. Pentru centrifugări la viteze mai mari se foloseşte nomograma din figura A2. Pentru valori precise, se utilizează ecuaţia prezentată în subcapitolul dedicat centrifugarii, pagina 15.

Anexă

349

FIGURA A2. Nomogramă pentru conversia forţei centrifuge (g) în viteză de rotaţie (rpm). Pentru a identifica o valoare necunoscută folosind nomograma reprezentată în figura se trasează o dreaptă descrisă de două puncte de pe celelalte două coloane. Valoarea dorită se citeşte la intersecţia dreptei cu coloana de interes. Pentru valori precise, se utilizează ecuaţia prezentată în în subcapitolul dedicat centrifugarii, pagina 15


350

A

B

FIGURA A3. Harta situs-urilor de restricţie a plasmidului pUC19c A. organizarea generală a plasmidului (mcs – situs multiplu de clonare; lacZ – fragmentul N–terminal al genei ce codifică β–galactozidaza din calea metabolică a lactozei; Ori – originea de replicare provenind din plasmidul pMB1; bla(AmpR) – conferă rezistenţă la ampicilină) B. Secvenţa în zona MCS

Anexă

351

A

B

FIGURA A4. Harta situs-urilor de restricţie a plasmidului pBluescript II SK – A. organizarea generală a plasmidului (mcs – situs multiplu de clonare; f1 ori – originea de replicare provenind din fag; lacZ – fragmentul N–terminal al genei ce codifică β– galactozidaza din calea de metabolică a lactozei; Plac – promotorul sub controlul căruia este pusă gena clonată; pUC ori – originea de replicare provenind de la plasmidul pUC; bla(ApmR) – gena ce conferă rezistenţă la ampicilină) B. Secvenţa în zona MCS.

.

352


A

B

FIGURA A5. Harta situs-urilor de restricţie a plasmidelor pET–21a;

A. organizarea generală a plasmidului (mcs – situs multiplu de clonare; f1 ori – originea de replicare provenind din fag lacZ – fragmentul N–terminal al genei ce codifică β–galactozidaza din calea metabolică a lactozei; face posibilă selecţia alb/albastră prin complementare alfa pe plăci cu Xgal; ori – originea de replicare provenind de la plasmidul pUC; lacI – represorul din operonul lac cu rol în controlul expresiei genei clonate; bla(ApmR) – gena ce conferă rezistenţă la ampicilină) B. Secvenţa în zona MCS.

Anexă

353

A

B

FIGURA A6. Harta situs-urilor de restricţie a plasmidului pMAL-c5X A. organizarea generală a plasmidului (mcs – situs multiplu de clonare; bla(ApmR) – gena ce conferă rezistenţă la ampicilină; ori – originea de replicare provenind de la plasmidul pBlueScript; lacIq – represorul din operonul lac cu rol în controlul expresiei genei clonate; P tac – promotorul sub controlul căruia este pusă gena clonată; malE– maltose binding protein, proteina cu afinitate pentru maltoză din E.coli, rrnBT1T2 – zona de semnalizare a sfârşitului transcripţiei B. Secvenţa în zona MCS.

354


Bibliografie: 1. Ausubel, M. F., Brent, R., Kingston, E. R., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, A. J., Struhl, K. (2002) – Short Protocols in Molecular Biology, p. A2-1,. John Wiley & Sons Inc. 2. Chothia, C. (1976) –The nature of the accessible and buried surfaces in proteins, Journal of Molecular Biology, 105, 1-12. 3. Sweet, R. M., Eisenberg, D. (1983) – Correlation of sequence hydrophobicities measures similarity in three-dimensional protein structure, Journal of Molecular Biology, 171, 479-88. 4. Dayhoff, M., Schwartz, R., Orcutt, B. (1978) –A model of evolutionary change in proteins, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, 345352.

mihasan_final_cu_coperti.pdf

Recommend Documents