Microorganismos indicadores en alimentos
María Marcela Martínez Miranda M.Sc. Microbiología Dpto. de Ingeniería de Alimentos Universidad de Caldas
Calidad de los alimentos • Calidad higiénico sanitaria: microorganismos patógenos. • Calidad comercial: microorganismos deteriorantes
Calidad de los alimentos • Calidad higiénico sanitaria: microorganismos patógenos. • Calidad comercial: microorganismos deteriorantes
¿Porqué analizar microorganismos indicadores? 1. La detección de patógenos puede ser muy complicada, muy lenta y/o muy costosa. 2. La inves esti tiga gac ció ión n de de patógenos en alimentos no facilita un enfoque preventivo.. preventivo 3. Cali Calida dad d micr microb obiiol ológ ógic ica a en términos de microorganismos indicadores.. indicadores
Microorganismos Microorganis mos indicadores • Son organismos (o grupos) que advierten: – manejo inadecuado – presencia de microorganismos patógenos
• Su detección en el laboratorio es más sencilla, rápida y/o económica.
Criterios para definición de indicadores
Debe ser incapaz de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos.
Ser un constituyente normal de la flora intestinal de individuos sanos.
Estar presente, de forma exclusiva, en las heces de animales homeotérmicos.
Estar presente cuando los microorganismos patógenos intestinales lo están.
Criterios para definición de indicadores
Presentarse en número elevado, facilitando su aislamiento e identificación.
Su tiempo de supervivencia debe ser igual o un poco superior al de las bacterias patógenas, su resistencia a los factores ambientales debe ser igual o superior al de los patógenos de origen fecal.
Debe ser fácil de aislar y cuantificar.
No debe ser patógeno.
Información que se obtiene al analizar microorganismos indicadores en alimentos 1.
Calidad de la materia prima, problemas de almacenamiento, abuso de temperatura, vida útil (Recuento de aerobios mesófilos).
2.
Potencial contaminación fecal o posible presencia de patógenos (Escherichia coli, Coliformes fecales)
3.
Contaminación por manipulación humana (Staphylococcus aureus coagulasa positiva
4.
Contaminación post tratamiento térmico (coliformes, enterobacterias, Staphylococcus aureus coagulasa positiva, estreptococos fecales)
5.
Productos metabólicos de patógenos que indican un peligro para la salud (termonucleasa)
Control de calidad microbiológica de los alimentos Materias
primas
Procesos
de elaboración
Ambientes,
utensilios, equipos.
Manipuladores Producto
final
Grupos de alimentos y bebidas sujetos a control y vigilancia 1.
Leche y Productos Lácteos.
10. Carnes y productos cárnicos
2.
Helados y Mezclas para Helados.
11. Productos hidrobiologicos
3.
Productos Grasos.
4.
Productos deshidratados.
5.
Cereales, leguminosas y derivados
12. Huevo y oviproductos. 13. Especias,condimentos y salsas. 14. Frutas y Verduras.
6.
Azucares y mieles
15. Comidas y Platos Preparados.
7.
Productos de confitería.
16. Bebidas.
8.
Productos de panadería, pastelería y galletería
17. Estimulantes y Fruitivos.
9.
Alimentos formulados (regímenes especiales)
18. Conservas 19. Semiconservas
Métodos de análisis microbiológico • Método: cualitativo – PRESENCIA / AUSENCIA en 25 g o mL de muestra. • Salmonella sp. • Vibrio cholerae • Listeria monocytogenes
• Método: cuantitativo – Tubos múltiples: NMP/g o mL de muestra – Recuento en placa: ufc/g o mL a. Por incorporación b. Por superficie
Criterio microbiológico • Es la aceptabilidad de un alimento basado en la presencia o ausencia de un determinado numero de microorganismos por unidad de masa, volumen, área o lote. Consiste en: • Señalar el alimento al que se aplicará el criterio • Elegir los microorganismos a identificar • Establecer un plan de muestreo • Definir métodos para su detección y/o cuantificación • Establecer los límites microbiológicos • Definir el número de unidades analíticas
Los principales microorganismos indicadores en alimentos son: • Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso: – Mesófilos aerobios – Psicrófilos – Termófilos o termodúricos – Mohos y levaduras – Coliformes totales
• Indicadores de contaminación fecal: – Coliformes fecales – E. coli – Enterococos
Cl. perfringens
Otros microorganismos indicadores • Estafiloccos coagulasa positiva (Staphylococcus aureus) • Recuento de Anaerobios Mesófilos • Recuento de Anaerobios Esporulados • Recuento de Virus entéricos
Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso
Mesófilos aerobios
Mohos y levaduras
Coliformes totales
Recuento de aerobios mesófilos (RAM) Bacterias
capaces de desarrollarse a 30-37°C.
Indica: la
calidad sanitaria de un alimento.
las
condiciones de manipulación.
las
condiciones higiénicas de la materia prima.
NOM-092-SSA1- 1994
RAM por el método de siembra a profundidad
Profundidad 10 -1 (48 h)
10 -2 A (48 h)
10 -2 B (48 h)
10 -3 A (48 h)
10 -3 B (48 h)
Un RAM elevado puede significar: 1. Excesiva contaminación de la materia prima. 2. Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración. 3. La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos. 4. La inmediata alteración del producto.
Un RAM elevado indica En
alimentos estables
– Materias primas muy contaminadas – Tratamiento no satisfactorio En
alimentos perecederos
– Materias primas muy contaminadas – Tratamiento no satisfactorio – Almacenamiento en condiciones de temperatura inadecuadas
Aplicación del RAM Alimentos
frescos, refrigerados y congelados Lácteos Alimentos
listos para consumir
El RAM NO es útil para: Alimentos
fermentados
Alimentos
esterilizados (debería hacerse un "Recuento Microscópico Directo")
Alimentos
congelados (es más útil un recuento de psicrófilos)
Mohos y levaduras Unicelulares
• • •
hongos filamentosos
Crecen más lentamente que las bacterias en los alimentos no ácidos que conservan humedad. Las levaduras crecen mas rápidamente que los mohos, pero con frecuencia junto a ellos. Mohos son aerobios estrictos.
Mohos y levaduras en alimentos Importantes en alimentos ácidos y en los de baja actividad de agua: – Frutas frescas – Jugos – Vegetales – Quesos – Cereales – Alimentos salazonados – Encurtidos – Alimentos congelados y deshidratados
Recuento de mohos y levaduras • Se desarrollan en condiciones de aerobiosis. • A temperaturas que varían entre 20 y 30⁰C. • Crecen más lentamente que las bacterias. • Los medios de cultivo deben favorecer su desarrollo pero no el de las bacterias.
Medios de cultivo para mohos Agar de Sabouraud Agar papa dextrosa Agar extracto de malta Agar Czapek-Dox Agar Micosel o micobiótico BHI + antibióticos BHI
NTC-4132
Incubación de mohos y levaduras Microorganismos
Tº de incubación
Tiempo de incubación
Levaduras
25-30 ºC
24 – 48 horas
Hongos filamentosos no patógenos
25-30 ºC
2 - 4 días
Hongos filamentos patógenos
37ºC
6 -15 días
Revisiones diarias
Recuento de mohos y levaduras Se tiene en cuenta el rango de 10 UFC – 100 UFC Se reportan indistintamente mohos y levaduras
Coliformes totales (CT)
Bacilos Gram negativos
No esporulados
Aerobios
o anaerobios facultativos
Fermentan la lactosa a 35 C con producción de ácido y gas.
Viven en el ambiente y en animales de sangra caliente
Los coliformes totales incluyen los fecales.
Géneros de coliformes totales Género
Fuente
Escherichia
Heces (humanas y animales)
Klebsiella
Heces, ambiente
Enterobacter
Heces, ambiente
Citrobacter
Ambiente
CT como indicadores de contaminación fecal • Se encuentran en el intestino del hombre y de animales, pero también en otros ambientes como: suelo, plantas, cáscara de huevo, etc. • Son útiles como indicadores de contaminación fecal por: – Su frecuencia en heces – Su fácil detección en el laboratorio – Sus características semejantes a algunos miembros patógenos de la familia Enterobacteriaceae
Aplicación del uso de CT como indicadores 1. Detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de los alimentos. 2. Evaluación de la calidad microbiológica de un producto. 3. Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas en el equipo. 4. Calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las diferentes áreas del procesamiento de alimentos.
Pruebas de determinación de CT 1.
Investigación y recuento en medio líquido •
2.
Se usa el Caldo lactosado biliado verde brillante (Brilliant Green Bile Lactose: BGBL) Investigación y recuento en medio sólido
•
Se utiliza el medio selectivo agar biliado rojo-violeta (Violet Red Bile Agar: VRBA)
Pruebas para detección y recuento de CT 1. Prueba presuntiva –
Caldo Lauril Triptosa (CLT).
–
Caldo Mc. Conkey.
–
Caldo lactosado bilis verde brillante.
2. Prueba confirmativa: –
Medio EC.
–
Medio bilis lactosa (BLVB)
Procedimiento día 1 Sembrar de cada dilución por triplicado o quintuplicado 1
2
3
4
5
10-1
1 ml
10-1 1 ml
1
2
3
4
5
10-2 10-2
1 ml 1
Muestra
2
3
4
5
10-3 Realizar diluciones hasta 10-3
10-3
Procedimiento día 2 1.
Realizar pases con alíquotas de 1ml de cada los 5 tubos por dilución a tubos con medio EC y campanas Durham.
2.
Dejar incubando de 24 a 48 hrs a 35°C.
o t a f l u S l i r u a L o d l a C
C E o d l a C
10-1
10-1
2
1
1
10-1
4
3
2
10-1
3
4
10-1
5
5
Investigación y recuento en medio sólido Coliformes
totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas por 24 h a 35 ºC
UFC/g
(o/mL) de muestra.
Coliformes fecales (CF)
Origen intestinal
Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
Bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, no esporulados.
Fermentadores de lactosa a 44.5 °C con producción de gas.
Principalmente Escherichia coli (90%)
Determinación de CF
Su determinación se hace a partir de la segunda etapa (confirmativa) del método de NMP, cultivando en caldo lactosado con incubación a 44.5 °C.
Escherichia coli
(coliformes termotolerantes)
• Capacidad para producir indol a partir de triptófano • Producción de la enzima βglucuronidasa. • Es el índice de contaminación fecal más adecuado. • Hay grandes cantidades de Escherichia coli en las heces humanas y animales.
Determinación de E. coli • Métodos basados en: – Producción de ácido y gas a partir de la lactosa. – Producción de la enzima βglucuronidasa.
• Los procedimientos incluyen: – Filtración con una membrana que después se incuba en medios selectivos a 44 –45 °C. – «número más probable»
Estreptococos fecales Enterococcus • Se encuentran en las heces de los humanos y animales de sangre caliente. • Animales de producción: vaca, cerdo, oveja, caballo, gallina y pato. • Son importantes en situaciones donde se sabe que hay contaminación fecal y no se detectan coliformes.
Uso de Enterococcus como indicadores en alimentos • Aunque se encuentran en cantidades menores que E. coli, son mas resistentes. • Se consideran indicadores en alimentos procesados, como lácteos y cárnicos, en los cuales E. coli no puede sobrevivir .
Especies de Enterococcus Grupo
Especies Enterococcus faecalis
Grupo 1
Enterococcus faecium Enterococcus durans
Hábitat están normalmente presentes en las heces de humanos y animales
Streptococcus bovis Grupo 2
Streptococcus equinus Enterococcus avium
no se encuentran comúnmente en las heces humanas
La
positividad de la prueba en el caldo EVA se ve cuando se presenta turbidez y sedimento de color rojo a rojizo. De
los tubos positivos hay que realizar el aislamiento en agar Barnes.
Luego
realizar la identificación de las colonias a través de coloración Gram y otras como catalasa, crecimiento a 45 ºC, crecimiento en NaCl 6.5%, resistencia bilis 40%, crecimiento a pH 9.6 y otros de ser necesarios.
Clostridium sulfito • Bacterias Grampositivas, esporuladas, anerobias, reductoras de sulfitos. • Se utilizan como indicadores de contaminación fecal antigua. • Clostridium perfringens es de origen fecal y también se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza.
reductores
Recuento de esporas de Clostridium sulfito reductores Se pesan 10g o ml y se homogenizan con 90ml de peptona 0.1%
Se realizan diluciones seriadas en 9ml peptona 0.1%
Choque térmico para formación de esporas
Se ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10 minutos para hacer luego el choque térmico y activar las esporas. Para finalizar el choque térmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo.
Siembra en fondo en agar SPS
Se siembra 1ml en fondo de la dilución que ha sido sometida a choque térmico y se agrega el medio SPS caliente.
Incubación en anaerobiosis Se llevan a incubar las cajas en cámara de anaerobiosis por 72 horas a 37°C, con sobre generador de anaerobiosis e indicador atmosférico.
