CUANTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS
INTRODUCCIÓN
los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales (azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas…)
Para cuantificarse se utilizan diferentes métodos:
La cromatografía de papel,
Los volumétricos de ferricianuro (NTC 926) o de Eynon – Lane.
El gravimétrico de Allihn
Los espectrofotométricos de Somogyi-Nelson
DNS y DNS - Fenol.
Los de cromatografía HPLC.
MÉTODO DE SOMOGYI-NELSON
Se basa en la capacidad de los azúcares para reducir agentes oxidantes suaves como el Cu2+.
Se utiliza para la valoración de azucares reductores, presentes proteínas.
en
las
soluciones
que
contienen
MÉTODO SOMOGY I-NELSON Muestra (Azúcar reductor +)
Reactivo de Somogyi Cu+2 Calor
Azúcar Oxidante + CU+ (Cu2O) CU+1(red )
CU+1(oxi)
AsMo (ox) AsMo (red) Es de un fuerte color azul
Se leé la absorbancia a 500 nm. Se cuantifica con la curva estándar
REACTIVOS PARA EL MÉTODO DE SOMOGY I NELSON PARA AZÚCARES REDUCTORES
Reactivo de Somogy i NaCO3 - Carbonato de sodio NaHCO3 – Bicarbonato de Sodio KaNaC4H4O6 – Tartrato de Sodio Potasio CuSO4·5H2O –Sulfato de Cobre
Reactivo de Nelson (NH4)6Mo7O24 - Molibdato de amonio Na2HAsO7·H2O – Arsenato de Sodio H2SO4 – Ácido Sulfúrico
REACTIVO DE SOMOGYI El carbonato de sodio es un sólido blanco, bastante soluble en agua, cuyas disoluciones tienen reacción alcalina por efecto de la gran hidrólisis que experimenta: Na2CO3 + H2O→ NaHCO3 + NaOH
En solución acuosa, el CuSO4 puede reaccionar en frío con el carbonato de sodio para producir el hidrocarbonato azurita, insoluble en agua 3CuSO4 + 3Na2CO3 + H2O
∆ 3Na2SO4 + Cu3(OH)2(CO3)2 ¯↓ + CO2 ↑ El bicarbonato de sodio, sólido blancuzco soluble en agua, presenta reacción débilmente alcalina, se une con el carbonato de sodio para dar origen a una solución buffer que impide el cambio en la concentración de iones hidrógeno cuando se producen pequeñas cantidades de ácidos o bases en el medio, asegurando él mismo un pH alcalino .
REACTIVO DE NELSON El sulfato de sodio es un cuerpo sólido e incoloro, cuya máxima solubilidad se presenta a los 33 ºC, y sus disoluciones saturadas en caliente ofrecen en frío el fenómeno de la sobresaturación: en este estado, cuando por agitación u otra causa cristalizan, lo hacen con siete moléculas de agua. El molibdato de amonio en presencia de ácido sulfúrico y de arsenato de sodio da origen al ácido molibdoars énico, complejo de color amarillo: 27H+ + AsO4(-3) → 12MoO4 (-2) H3 [As (Mo3O10)4 ] + 12H2O
REACTIVO DE COBRE EN MEDIO ALCALINO Solución A: Disolver en 600ml de agua destilada •25 g de carbonato de sodio anhidro •25g de tartrato doble de sodio y potasio •20g de bicarbonato de sodio • 200g de sulfato de sodio anhidro. Aforar a 1L con agua destilada.
NOTA: Inmediatamente antes de usarlo, mezclar 24 partes de la solución A con una parte de la solución B.
Solución B: Disolver en 900ml de agua destilada: • 150g de sulfato de cobre pentahidratad •0.5ml de ácido sulfúrico concentrado Aforar a 1L, mezclar y envasar en frasco ámbar.
REACTIVO ARSENOMOLIBDICO O REACTIVO DE NELSON: Está compuesto por Molibdato de Amonio, Arsénico disódico 7 H2O, ácido Sulfúrico y agua destilada. Los iones cuprosos, formados por la acción reductora de los glúcidos, al reaccionar con el reactivo Arsenomolibdico, el Molibdeno hexavalente se reduce y toma un intenso color azul que es proporcional a la concentración inicial de azúcar reductor y que se compara en fotocolorímetro con el color que produce un patrón del mismo azúcar en iguales condiciones de trabajo. Disolver en 900ml de agua destilada: •50g de molibdato de amonio, • 42ml de ácido sulfúrico agitando •50ml de una solución de ortoarseniato disódico al 12%, Incubar a 37°C durante 24 a 48 horas.
MATERIAL Y REACTIVOS Material de laboratorio:
Material biológico:
•Tubos de ensaye •Pipetas graduadas de 5ml •Pipetas graduadas de 10ml •Baño Maria •Canicas •Mortero •Gradilla
•Espinacas secas
Reactivos: • Ácido sulfúrico 2N •Hidróxido de sodio 4N. de sacarosa •Solución
50mg/100ml
PROCEDIMIENTO: 1.-Poner a secar las hojas de espinacas días antes de la práctica, 50g aproximadamente.
2.-Pesar 1g de las hojas de espinacas secas y macerarlas en un mortero con un poco de agua.
3.-Transferir a un matraz volumétrico de 100ml y aforar con agua. Dejar reposar por 5 minutos.
5.- Preparar una gradilla con los tubos numerándolos de acuerdo a la tabla
4.- Filtrar el extracto de hojas.
Tubo No
0
1
2
3
4
5
6
7
Solución patrón
-
0.2
0.4
0.6
0.8
1
-
-
Extracto de hoja
-
-
-
-
-
-
2
2
H2SO4 2N
-
2
2
2
2
2
2
-
Colocar los tubos 5 minutos en baño de ebullición
NaOH 4N
-
1
1
1
1
1
1
-
Mezcla de soluciones Ay B
1
1
1
1
1
1
1
1
Colocar en baño a ebullición por 20 minutos tapados con canicas. Transcurrido el tiempo enfriar los tubos.
Reactivo de arsenomolibdato
-
1
1
1
1
1
1
1
Agua
8
4.8
4.6
4.4
4.2
4
3
6
Esperar 20 a 30 minutos y leer en el espectrofotómetro a 520nm ajustando a cero con el blanco.
CÁLCULOS •Trazar una gráfica con las lecturas obtenidas de
la curva estándar, colocando la absorbancia en el eje de las abscisas y la concentración de sacarosa en el eje de las ordenadas. •Interpolar en la gráfica las lecturas obtenidas de los tubos problema. •Expresar los resultados en μmoles de sacarosa/g.
