TOPIK
ENZIM dan KOENZIM-1 Pendahuluan
Klasifikasi Klasifi kasi enzim Dasa Da sarr da dan n Me Meka kani nism sme e ke kerja rja en enzi zim m
I NYOMAN SUARSANA
Kineti Kin etika ka Rea Reaksi ksi Enz Enzima imatis tis
LOGO
Faktor Fak tor yan yang g mem mempen pengar garuhi uhi rea reaksi ksi enz enzimat imatis is Regula Reg ulasi si akt aktivit ivitas as enz enzim im
LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS KEDOKERAN HEWAN
Kofaktor: koenzim, apoenzim, proenzim Fungsi Fun gsi Bio Biomed medis is Enz Enzim im
1
Company Logo
PENDAHULUAN
Tujuan Tujua n pemb pembelaj elajaran aran
Mengetahui
klasifikasi, dan tata nama enzim Mengetahui mekanisme dan dasar kerja enzim Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim Mengetahui hambatan kerja enzim Mengetahui peran enzim dalam diagnosis penyakit
3
2
Company Logo
1. 2. 3. 4.
Sel sebagai sebagai reaktor kimia kimia Distribusi enzim dan struktur sel Enzim ekstrasel dan intrasel Perkembangan pengetahuan tentang enzim 5. Enzim dan penyakit
4
Company Logo
Sel sebagai reaktor kimia
Sel sebagai reaktor kimia
Sel
makhluk hidup dengan ukuran sangat kecil dipandang sebagai reaktor kimia Sel pusat metabolisme energi Dalam sel reaksi berjalan tidak secara acak, tetapi sangat terarah Dalam sel terdapat suatu mekanisme dengan berbagai subsistem yang bekerja secara KHAS (SPESIFIK) yang memungkinkan makhluk hidup menghasilkan senyawa (produk) dengan berbagai tingkat kerumitan struktur molekul
Eukariotik
Prokariotik 5
Company Logo
6
Company Logo
Distribusi enzim dan struktur sel Sel
menjalankan ratusan bahkan ribuan macam reaksi sekaligus Dengan teknik histokimia, sitokima, fraksinasi sel: diketahui distribusi dan lokasi berbagai enzim dalam sel. Mitokondria: enzim yang berhubungan dengan reaksi oksidasi-reduksi • • • • •
Lisosom: enzim yang mengkatalis reaksi hidrolisis (ribonuklease, asam foafatase)
Inti sel: enzim yang berperan dalam biosintesis asam nukleat (DNA, RNA)
Sitoplasma: enzim glikolisis, glukonegenesis, sintesis asam lemak,
Siklus Krebs Oksidasi lemak Katabolisme asam amino Fosforilasi oksidatif Transport elektron 7
Company Logo
Ribosom: enzim biosintesis protein
Retikulum endoplasma: enzim sintesis lipid, sintesis steroid
Membran plasma: enzim ATPase (sistem tranpor bergantung energi), transpor Na+, K+ 8
Company Logo
Enzim ekstrasel dan intrasel
Perkembangn Pengetahuan tentang enzim
Sel
Manusia
dipandang sebagai reaktor kimia, maka enzim berada dan bekerja menjalankan fungsinya di dalam sel Kesalah pahaman: dengan menganggap enzim terdapat dan bekerja diluar sel dan pada umumnya yang dimaksud adalah enzim plasma Keperluan diagnosis: diukur enzim plasma, serum. Enzim ekstrasel Penelitian: enzim-enzim pencernaan Yang pasti enzim ekstrasel dan intrasel: keduanya disintesis oleh sel di dalam sel 9
Company Logo
Enzim
berperan dalam proses pencernaan Réumur (1963-1727) Perancis: Spallanzani (1729-1799) Itali: • melakukan percobaan pemberian daging yang dimasukan dalam tabung kayu yang dilapisi kain • Pengambilan cairan lambung, dan dicobakan ternyata dapat melumatkan daging
William Beaumont (1785-1853) AS: • Melaporkan secara rinci proses pencernaan pada lambung manusia yang intinya sama dengan yang diamati pada burung elang • Pengamatan dilakukan pada lambung manusia penjelajah Alex is St. Mart in, yang mengalami luka terbuka pada perutnya 11
10
Company Logo
Karakteristik
• melakukan percobaan pemberian daging yang dimasukan dalam bola-bola kecil pada burung elang.
telah lama mengenal enzim: dalam bentuk pengetahuan praktis empiris dan disebarkan secara tradisional Mengolah bahan makanan dengan enzim Kebiasaan membuat minuman yang diragikan Pengolahan susu menjadi: yoghurt, koumis, kefir, keju dll. Pembuatana tape, tempe
Company Logo
dan sifat kimia dari enzim Awalnya diantara peneliti enzim, menggolongkan bahan ini kedalam PROTEIN ditentang keras. Pekelharing dan Ringer (1900): • Banyak kesamaan antara enzim dan protein (protein getah lambung dengan pepsin mempunyai sifat-sifat sama) Summer
(1926)
• Kristal, sifat fisikokimia enzim urease sama dengan protein 12
Company Logo
Enzim dan Penyakit
Kunitz,Herriots, Anson dan Northrop (1931): • Berhasil mengkristalkan pepsin yang sama dengan peneliti Summer. • Enzim adalah PROTEIN, telah diterima secara luas dan tidak ada lagi pertanyaan
Emil Fischer (1894): • Sudah meneliti spesifisitas kerja enzim (meskipun sifat kimia enzim sbg protein belum diakuai). Hasil gagasanya dikenal sebagai: MODEL KUNCI DAN ANAK KUNCI (Lock and Key)
kedokteran dan kedokteran hewan: memanfaatkan pengetahuan enzim untuk tujuan DIAGNOSIS dan PENGOBATAN Wolgemuth (1908): • Enzim amilase dalam urine, meningkat jumlahnya pada radang pankreas
Kay, Kings, Bodansky dan Roberts (1920930):
LaDue, Wroblewski dan Karmen (1955):
• Enzim fosfatase alkali, penyakit hati
Michaelis dan Menten (1913) • Pengetahuan tentang kinetika reaksi enzimatik: yang dikenal dengan persamaan MichaelisMenten 13
Company Logo
KLASIFIKASI ENZIM
Kalangan
• Enzim SGOT 14
Company Logo
There are six functional classes of enzymes
Penggolongan dan tata nama enzim 1.Tata nama berdasarkan substrat ▪Jika dikatalis adalah glukosa: enzim glukase
2.Tata nama berdasarkan jenis ikatan kimia substrat ▪ Jika dikatalis ikatan peptida: enzim peptidase ▪ Jika dikatalis ikatan ester: enzim esterease ▪ Jika dikatalis ikatan nukleotida: enzim nukleotidase
3.Tata nama berdasarkan jenis reaksi ▪ Untuk mengoksidasi glukosa: enzim glukosa oksidase ▪ Enzim yang mengkatalis pemindah gugus dinamai : tranferase, contoh untuk memindahkan gugus NH2: enzim lebih khas dinamai: enzim amino transferase 15
Company Logo
16
Company Logo
Komisi
International Union of Bhiocemistry (IUB), mengklasifikasikan enzim menjadi 6 kelas, didasarkan pada reaksi biokimia yang dikatalisnya: 1. Oksidoreduktase: mengkatalis reaksi oksidasi-reduksi Yang termasuk enzim ini dengan nama trivial: -dehidrogenase -reduktase -oksidase -hidroksilase -peroksidase -oksigenase 17
2.Transferase: mengkatalis pemindahan suatu gugus yang bukan H antara substrat dengan senyawa penerima gugus, seperti: -gugus beratom C 1 -gugus aldehid dan keton -gugus asil -gugus alkil -gugus nitrogen -gugus mengandung fosfat -gugus mengandung sulfur
Company Logo
Yang termasuk enzim transferase:
18
Company Logo
3. Hidrolase: mengkatalis reaksi hidrolisis yaitu pemutusan ikatan kovalen antara karbon dengan atom lainnya dengan penambahan air.
a. amino transferase b. asil karnitin transferase c. transkarboksilase
Yang termasuk enzim ini:
d. transaldolase dan transketolase
a. esterase
e. glukokinase
b. amidase
f. piruvatkinase
c. peptidase d. fosfatase e. glikosidase 19
Company Logo
20
Company Logo
4. Liase: mengkatalis reaksi pemecahan karbon-karbon, karbon-sulfur, dan karbonnitrogen Yang termasuk enzim ini:
5. Isomerase: mengkatalis reaksi isomer, baik isomer optik, geometrik maupun isomer posisi.
a. dekarboksilase
Yang termasuk enzim ini:
b. aldolase
a. epimerase
c. sintase
b. rasemase
d. hidrase atau dehidratase
c. mutase
e. deaminase
d. isomerase
f. nukleotida siklase 21
Company Logo
22
Company Logo
DASAR DAN MEKANISME KERJA ENZIM Enzim
6. Ligase: mengkatalis pembentukan ikatan antara C-C, C-S, C-N dan C-O. Reaksi ini perlu energi ATP
Yang termasuk enzim ini:
sebagai protein katalis Dixon dan Webb, mendefinisikan enzim sebagai suatu protein bersifat katalis. Definisi ini disebabkan oleh kemampuannya untuk mengaktifkan senyawa lain secara spesifik.
a. sintetase b.karboksilase
23
Company Logo
Definisi lain: enzim adalah suatu katalisator protein yang mempercepat reaksi kimia dalam sistem biologis.
24
Company Logo
Kata
kunci definisi enzim: 1. Aktif
Interaksi yang spesifik dari enzim dengan suatu molekul tertentu dan menyebabkan pengaktifan molekul tersebut selanjutnya mengakibatkan perubahan struktur sehingga menimbulkan gagasan akan substrat.
Substrat didefinisikan sebagai senyawa yang dikenali secara spesifik oleh enzim dan selanjutnya diaktifkan sehingga mengalami perubahan kimia
2. Katalis 3. Protein 4. Spesifik Penjelasan:
Protein: semua enzim memiliki ciri dan sifat protein
Katalis: selain mempunyai kemampuan mengubah suatu senyawa, juga kemampuan membawa atau memindahkan suatu senyawa dari suatu keadaan ke keadaan lain dengan cara yang sesifik
25
Company Logo
26
Company Logo
Chymotrypsin Has A Site for Specificity Ak ti f:
mengingat demikian spesifik interaksi antara substrat dan enzim, maka bagian tersebut dinamai sebagai situs aktif (active site) atau lebih tepat lagi situs katalitik (catalytic site)
Pertanyaanya: apakah ada senyawa spesifik yang dikenali oleh enzim tetapi tidak dapat diolah lebih lanjut sehingga senyawa tersebut tidak mengalami perubahan? [INHIBITOR] Substrat atau inbitor: dapat menempati situs aktif enzim 27
Company Logo
O O N–C–C–N–C–C N–C–C –N–C–C R H R’ OC Ser
Specificity Catalytic Site Site
Active Site 28
Logo JuangCompany RH (2004) BCbasics
Specificity of Ser-Protease Family Trypsin cut at Lys, Arg
O O –C–N–C–C –N– C C y l C e t v e i t C a k c g o e p NH 3 n + d d e n g COO a r a p h C e c e D As p
Chymotrypsin
Elastase
cut at Trp, Phe, Tyr
cut at Ala, Gly
O O –C–N–C–C –N– C
Karena
enzim adalah protein maka kemampuan mengkatalis suatu reaksi erat hubungannya dengan struktur molekul protein tersebut
O O –C–N–C–C –N– CH3 Shallow and non-polar pocket
Non-polar pocket
Active Site 29
Company Logo
s c i s a b C B ) 4 0 0 2 ( H R g n a u J
1. Tempat aktif Teori Interaksi antara enzimsubstrat dikenal sebagai Lock and Key Pada teori ini, substrat yang spesifik terikat pada daerah spesifik di molekul enzim. Daerah ini disebut: TEMPAT AKTIF, yaitu suatu tempat yang terdapat dalam enzim yang secara spesifik dapat mengenali dan mengikat substrat
30
Company Logo
Lock
and Key Analogy: lock = enzyme, key = substrate. MODEL KUNCI dan ANAK KUNCI (LOCK-and KEY MODEL) KERJA ENZIM: Tempat aktif mempunyai bentuk yang rigid Hanya substrat yang spesifik yang matching dengan tempat aktif Substrat sebagai anak kunci (KEY) yang matching dengan enzim sebagai kunci (LOCK)
31
Company Logo
32
Company Logo
C h a r g e R e l a y i n
Tempat aktif suatu enzim dibentuk oleh residu asam amino yang mempunyai 2 fungsi: 1.Menarik dan mengorientasikan substrat kepada gugus spesifik pada molekul substrat yang disebut GUGUS KONTAK dengan cara yang spesifik pula
H O = C–O Asp 102
N
H –O–CH2
C C H CH2
Ser 195
Active Ser
H O = C–O–H Asp 102
N
C
N–H
C C H CH2
- O –CH
2
Ser 195
His 57
Company Logo
33
C
His 57
A c t i v e S i t e
2.Ikut membentuk ikatan sementara dengan molekul substrat, yang selanjutnya terjadi polarisasi dan terjadi regangan pada ikatan di dalam molekul substrat sehingga mudah dipecah dan menghasilkan PRODUK. asam amino yang bertindak demikian yang terletak pada tempat aktif disebut: RESIDU KATALIK
H –N
34
Company Logo
Active Site Stabilizes Transition State Gly193
Pada
Catalytic Triad Ser 195
Asp 194 Met 192
His 57
Active Site Cys191
Asp 102
Thr219 Cys220
Specificity Site
Ser 214 Trp215
Gly 216
Ser 218 Ser 217
35
Company Logo
7 9 1 . p , s e m y z n E g n i r e v o c s i D ) 1 9 9 1 ( r e t t o P & r e l s s e r D m o r f d e t p a d A
umumnya terdapat 2 mekanisme kerja enzim mempengaruhi reaksi katalisis 1.enzim meningkatkan kemungkinan molekulmolekul yang bereaksi saling bertemu dengan permukaan yang saling berorientasi. Hal ini terjadi karena enzim mempunyai afinitas yang tinggi terhadap substrat dan kemampuan mengikatnya walaupun sementara 36
Company Logo
8 5 1 . p ) e 4 ( l l e C e h t f o y g o l o i B r a l u c e l o M ) 2 0 0 2 ( l a t e s t r e b l A m o r f d e t p a d A
Reaksi
enzimatis adalah reaksi terarah yang dapat digambarkan dalam urutan sbb. 1.terjadi mendekatnya gugus-gugus aktif dari kedua belah pihak, 2.terjadi pengkiblatan yang tepat dari elektron orbit gugus-gugus aktif, 3. jika 1 dan 2 tercapai, maka substrat diregang, disusul dengan transaksi proton sehingga terbentuklah senyawa baru [PRODUK], yang dilepaskan enzim. Enzim kembali kekeadaan semula dan dapat memulai lagi pekerjaanya.
2. Pembentukan ikatan yang sementara (non kovalen) antara substrat dengan enzim menimbulkan penyebaran elektron dalam molekul substrat dan penyebaran ini menyebabkan suatu regangan pada ikatan kovalen spesifik dalam molekul substrat sehingga ikatan kovalen tersebut menjadi mudah pecah
Company Logo
37
38
Concerted Mechanism of Catalysis
Company Logo
Non-Enzyme Catalytic Mechanisms
Carboxypeptidase A Active site pocket
(270) Glu
4
C
H H O-
2
Substrate peptide chain
3
COO +
N
(248) Tyr
C
O-
ACTIVE SITE
Site for specificity
H
N
5
R
C
O1
His (196)
+ Zn
His (69)
COO Glu (72) 39
+ Arg
(145)
C-terminus
Check for C-terminal
Company Logo
s c i s a b C B ) 4 0 0 2 ( H R g n a u J
Secara umum proses katalis bukan enzim dapat dikelompokan ke dalam Katalisis oleh asam-basa ( Acid-base catalysis). Katalisis kovalen (Covalent catalysis) Katalisis ion logam (Metal ion catalysis) Katalisis elektrostatis (Electrostatic catalysis)
40
Company Logo
Acid-Base Catalysis
Katalisis asam-basa: asam-basa mempunyai kemampuan katalisis dengan memberi elektron (asam) dan menerima elektron (basa) Katalisis logam-elektrostatis: katalisis seringkali melibatkan logam bekerja sama membentuk ikatan elektrostatis Katalisis kovalen:katalisis mellaui pembentukan ikatan kovalen sementara antara substrat dengan melekul katalis (ada gugus cenderung memberikan elektron ke gugud lain) 41
Company Logo
7 6 1 . p ) e 4 ( l l e C e h t f o y g o l o i B r a l u c e l o M ) 2 0 0 2 ( l a t e s t r e b l A m o r f d e t p a d A
Specific
Acid-base Catalysis
Induced to transition state
N H
O = C H N H
-δ O
+
N H
O = C H
N +δ C H H
H
Acid catalysis
+
H
N H
C H
O
Base catalysis
Fast
O = C H
Both
C H
O
H
H
H
Slow
O = C H
N C H O H H H
H
O - O C
O - O C
Fast
Very Fast
42
Company Logo
KINETIKA REAKSI ENZIM Dalam
mengkatalis suatu reaksi, diasumsikan enzim berikatan lebih dulu dengan susbtrat. Akibat ikatan ini terbentuklah apa yang dinamai: KOMPLEKS ENZIM-SUBSTRAT. Reaksi ini dapat terdiri dari beberapa fase: Pembentukan kompleks substrat (ES), dimana E=enzim, S=substrat Modifikasi dari substrat membentuk produk (P), yang masih terikat enzim (EP) Pelepasan produk dari molekul enzim 43
Company Logo
Ketiga fase tersebut dapat ditulis dengan persamaan reaksi:
E+S
k 1 =
k 1 k 2
[ES] [E] [S]
k
ES (v 3) E + P o
k 3 = 44
[E] [P] [ES] Company Logo
2 5 2 . p ) e 3 ( y r t s i m e h c o i B f o s e l p i c n i r P r e g n i n h e L ) 0 0 0 2 ( x o C & n o s l e N m o r f d e t p a d
A
Enzyme Kinetics Student A
S c o r e
☺ ☺ 0
1
Student B Student C
2
3
E n z y m e a c t i v i t y
4
0
Exam Chapters
1
2
3
4
Substrate concentration
Meningkatnya konsentrasi enzim, perubahan aktivitas enzim
I n c r e a s e S u b s t r a t e C o n c e n t r a t i o n
0
Essential of Enzyme Kinetics
3
4
5
6
7
8
S + E
80
↓ P 60 r o d u 40 c t
P
20 0 0
2
4
6
8
Substrate (μmole) 46
( i n a f i x e d p e r i o d o f t i m e )
Logo JuangCompany RH (2004) BCbasics
Constant ES Concentration at Steady State
Steady State Theory
ES
2
Logo JuangCompany RH (2004) BCbasics
45
E +S
1
E +P
S
P
C o n c e n t r a t i o n
ES E
Reaction Time 47
Logo JuangCompany RH (2004) BCbasics
48
Logo JuangCompany RH (2004) BCbasics
An Example for Enzyme Kinetics (Invertase)
A Real Example for Enzyme Kinetics
→ Km
vo
vo
1/2 -1 Km
s c i s a b C B ) 4 0 0 2 (
1 Vmax
Double reciprocal 1/S
H R g n a u J
Km Direct plot S
Company Logo
49
Double reciprocal
1/S 4 2 1 0.5
1/v 2.08 1.56 1.35 1.16
(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per μmole (2) Reaction time was 10 min
Vmax
1
Velocity
Absorbance v (μmole/min) 0.25 0.21 → 0.42 0.50 0.36 → 0.72 1.0 0.40 → 0.80 2.0 0.46 → 0.92 [S]
1 2 3 4
4) (x, y) plot get hyperbolic curve, estimate → Vmax 5) When y = 1/2 Vmax calculate x ([S])
Substrate Product
a t a D no
→E 2) Add substrate in various concentrations → S (x 軸) 2) 3) Measure Product in fixed Time (P/t) → vo (y 軸) 1) Use predefined amount of Enzyme
t 1.0 o l p t v c e r 0.5 i D
0 0
1
2
[S]
l a 2.0 c o r 1/v p i c e 1.0 r e l b u o 0 D -4
1.0 s c i s a b C B ) 4 0 0 2 (
-3.8
-2
0
2
4
1/[S] Company Logo
50
H R g n a u J
Enzyme Kinetics Enzymes S
E
k1
S
E
k2
V max [S]
k cat
K m + [S]
Turn over number
Significance
V [S] vo= max Km +[S]
zero order 1st order Observe vo change under various [S], resulted plots yield Vmax and K m
E3 E2 E1
5
15
4
-K m, Vmax
n 10 i m / l o 5 m µ , v 0
n
0.5Vmax
3 m o m µ2 , v
Vmax
Activity Unit
Maximum velocity
1 μmole min Specific Activity
-30
-10 10 [S], mM
30
0
50
0
10
20 30 [S], mM
40
Eric Niederhoffer
51
SIU-SOM
Company Logo
50
&
k 3 [Et]
1
-5 -10 -50
v=
P
k-1
20
Direct plot
k cat / K m
unit mg
Activity
K m
Affinity with substrate
Double reciprocal
Competitive
I n h i b i Non-competitive t i o Bi-substrate reaction also n
follows M-M equation, but one of the substrate should be saturated when esti mate the other 52
Uncompetitive
Logo JuangCompany RH (2004) BCbasics
Km: Affinity with Substrate
Significance of Enzyme Kinetics
Obtain
Vmax and Km
v0 = Vmax × K
= k 3 [Et] × K
vo =
Vmax [S]
vo =
Km + [S]
Vmax [S]
If vo =
Km + [S]
Vmax
When using different substrate
zero order
E3 E2 E1
1st order [S] = Low → High
e n z y P m r e o p c o r o t n i c o e n n a l t r t a o t i o n
[S] = Fixed concentration
Vmax
2 3
CHO H-C-OH HO-C-H
Allose CHO
Mannose Substrate
S1 S2 S3
Km
HO-C-H
H-C-OH
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
5
H-C-OH
H-C-OH
H-C-OH
6
H2-C-OH
H2-C-OH
H2-C-OH
8,000 55
Company Logo
54
H R g n a u J
E+S
k 1 k 2
k
ES (v 3) E + P o
, turn over number (t.o.n) When substrate excess, k 3 = k cat
H-C-OH
8
Km = [S]
Affinity changes
s c i s a b C B ) 4 0 0 2 (
CHO
H-C-OH
4
Km =
Km + [S]
Turn Over Number, k cat
Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP Glucose
Vmax [S]
Km + [S] = 2 [S]
Km: Hexokinase Example
number 1
2
S3
1/2
Logo JuangCompany RH (2004) BCbasics
53
2
S2 S1
=
Vmax
5
μ M Logo JuangCompany RH (2004) BCbasics
When [substrate] is low
vo =
Vmax [S] Km + [S]
Start from M-M eq.
Second order
(IV)
=
k 3 [E][S]
Km + [S]
=
Omit the [substrate] 56
k 3
Km
[E][S]
Substrate specificity Logo JuangCompany RH (2004) BCbasics
Turn Over Numbers of Enzymes
Chymotrypsin Has Distinct kcat / Km to Different Substrates O R O = – = H3C–C –N–C –C–O–CH3
k cat (s-1)
Enzymes
Substrate
Catalase
H2O2
Carbonic anhydrase
HCO3-
400,000
Acetylcholine
140,000
Acetylcholinesterase
– –
40,000,000
β-Lactamase
Benzylpenicillin
Fumarase
Fumarate
H H
2,000 800
RecA protein (ATPase) ATP
kcat / Km
R= Glycine
–H
1.3 ╳ 10-1
Norvaline
–CH2 –CH2 –CH3
3.6 ╳ 102
Norleucine
–CH2 –CH2 –CH2 –CH3
3.0 ╳ 103
0.4 Phenylalanine –CH2 –
The number of product transformed from substrate by one enzyme molecule in one second
1.0 ╳ 105 (M-1 s-1)
Company Logo Adapted from Nelson &57 Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263
Company Logo 58 Adapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379
Enzyme Activity Unit
S
t
P μmole
vo = [P] / min
] P [ t c u d o r P
Slope tan
[email protected]
LOGO
Unit =
μmole/min
0
10
20
30
40
Reaction time (min)
Specific Activity Units Activity = Protein (mg) 59
x
y y = tan x Company Logo
s c i s a b C B ) 4 0 0 2 ( H R g n a u J
60
