Índice 1. Introduc Introducción ción....... .............. ............. ............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. ......................... ................................. ............... 2. Urocult Urocultivo ivo....... .............. ............. ............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. .......... .... 3. Coprocul Coprocultiv tivo.... o........... .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. ............. .................... .................. 4. Exudado Exudado faringeo faringeo....... .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. ............. ............. ............. ...... 5. Exudado Exudado vaginal vaginal y uretral. uretral........ ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. ............. ............. .............. .............. ................... ............ 6. Cultivo Cultivo de secreción secreción de heridas, heridas, exudados exudados y trasudad trasudados... os......... ............. .............. ............. ............. ................... ............ 7. He Hemocul mocultivo tivos.... s........... ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. ............. ............. .............. .............. ......... 8. Cultivo de liquido cefalorraquídeo cefalorraquídeo y otros líquidos corporales................................. corporales...................................... ..... 9. Vibrio Vibrio cholerae cholerae....... ............. ............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............... ....................... .............. 10. Bacterias Bacterias gram negativas negativas no fermentadoras........................................................... fermentadoras................................................................... ........ 11. Anaerobios...................................................... Anaerobios.......................................................................................... ............................................ ............... ............... ........... ... 12. Prueba de sensibilidad sensibilidad a los los antimicrobianos antimicrobianos................................................ ................................................................ .................. 13. Interpretación Interpretación de de pruebas pruebas bioquímica bioquímicas...................................................................... s........................................................................... ..... 14. Indicaciones Indicaciones para el proceso proceso de las las muestras.................................................... muestras........................................................... ............. ...... 15. Técnica de tinción de gram................................................................................... gram.......................................................................................... ........... 16. Técnica. De tinción de Ziehl Neelsen.................................................... Neelsen.............................................................. .................. .............. ...... 17. Preparación de soluciones soluciones y colorantes.......................................................................... colorantes.......................................................................... 18. Bibliografía................................................................................. Bibliografía.................................................................................................................... ...................................
2
Índice 1. Introduc Introducción ción....... .............. ............. ............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. ......................... ................................. ............... 2. Urocult Urocultivo ivo....... .............. ............. ............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. .......... .... 3. Coprocul Coprocultiv tivo.... o........... .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. ............. .................... .................. 4. Exudado Exudado faringeo faringeo....... .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. ............. ............. ............. ...... 5. Exudado Exudado vaginal vaginal y uretral. uretral........ ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. ............. ............. .............. .............. ................... ............ 6. Cultivo Cultivo de secreción secreción de heridas, heridas, exudados exudados y trasudad trasudados... os......... ............. .............. ............. ............. ................... ............ 7. He Hemocul mocultivo tivos.... s........... ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. ............. ............. .............. .............. ......... 8. Cultivo de liquido cefalorraquídeo cefalorraquídeo y otros líquidos corporales................................. corporales...................................... ..... 9. Vibrio Vibrio cholerae cholerae....... ............. ............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............. .............. .............. ............. ............... ....................... .............. 10. Bacterias Bacterias gram negativas negativas no fermentadoras........................................................... fermentadoras................................................................... ........ 11. Anaerobios...................................................... Anaerobios.......................................................................................... ............................................ ............... ............... ........... ... 12. Prueba de sensibilidad sensibilidad a los los antimicrobianos antimicrobianos................................................ ................................................................ .................. 13. Interpretación Interpretación de de pruebas pruebas bioquímica bioquímicas...................................................................... s........................................................................... ..... 14. Indicaciones Indicaciones para el proceso proceso de las las muestras.................................................... muestras........................................................... ............. ...... 15. Técnica de tinción de gram................................................................................... gram.......................................................................................... ........... 16. Técnica. De tinción de Ziehl Neelsen.................................................... Neelsen.............................................................. .................. .............. ...... 17. Preparación de soluciones soluciones y colorantes.......................................................................... colorantes.......................................................................... 18. Bibliografía................................................................................. Bibliografía.................................................................................................................... ...................................
2
INTRODUCCION Dada la impo Dada import rtan anci ciaa que que tien tienee la Bact Bacter erio iolo logí gíaa Médi Médica ca en el diag diagno nost stic icoo de las las enfermedades es necesario que el personal de laboratorio esté capacitado para desempeñar las técnicas adecuadas que nos van a llevar a aislar e identificar los microorganismos que se encuentran como agentes causales de una infección. Es por esto que para poder cumplir con las actividades eficazmente, el bacteriólogo y demás personal que colaboran en la realización de dichas funciones, necesitan conocer muy a fondo todas las técnicas del laboratorio de Bacteriología Medica, para ello deben contar con un manual de consulta que señale la información fundamental respecto a cada uno de los cultivos, así como las pruebas diferenciales y confirmatorias de cada micro microorg organi anism smoo aislad aisladoo de los espec especime imene ness estud estudiad iados os y de esta esta maner maneraa propor proporci ciona onarr una información útil para el diagnostico. Este manual comprende la metodología a seguir en el desarrollo de los cultivos de mayor importa importancia ncia medica, medica, como son: Urocult Urocultivo, ivo, Coproculti Coprocultivo, vo, He Hemocul mocultiv tivo, o, Cultivo Cultivo de Exudado Exudado Faríngeo, Cultivo de Exudado Vaginal, Uretral, Cultivo de Liquido Cefalorraquídeo y Cultivo de Secreción de Heridas, Exudados, Trasudados y otros Líquidos Corporales. Los datos generales de cada uno de los cultivos aquí citados aportan información suficiente del método, así como de la Flora normal y patología de cada espécimen estudiado, lo cual nos sirve de apoyo para determinar y diferenciar los agentes causales de una infección dad, así como la sensibilidad a los diferentes antimicrobianos. Comprende también control de calidad de bacteriología medica (como son medios de cultivos REACTIVOS Y EQUIPOS). Al final de este, se incluyen la preparación de colorantes, técnicas de tinción de Gram y preparación de soluciones. soluciones.
3
4
UROCULTIVO
Cultivo de orina Generalidades Las infecciones bacterianas del tracto urinario afectan a las personas de todas las edades y ambos sexos, el único medio seguro para el diagnostico especifico es la demostración de las bacterias y los métodos de cultivo adecuados. Los estudios de laboratorio y el cultivo de orina son partes necesarias de la evaluación del enfermo en busca de infecciones de vías urinarias, con mayor frecuencia en la vejiga. La orina de riñones y vejiga, suelen ser estériles, pero en la uretra suelen existir números pequeños de bacterias. En consecuencia, la orina puede contener diversos microorganismos. A pesar de lo expuesto, la bacteria suele ser resultado de la prevalencia de un tipo particular de bacterias. Por tal razón, la presencia de mas de dos especies bacterianas diferentes en una muestra de orina, sugiere fuertemente contaminación durante la obtención. Sin embargo, la negatividad de un solo cultivo no siempre excluye la presencia de infección, por que suele haberlas, como el caso de pielonefritis crónica. Aislamiento de una bacteria patógena conocida no confirma obligadamente la existencia de infección de vías urinarias, porque las muestras suelen estar contaminadas por microorganismos de uretra y genitales externos, la orina constituye un excedente medio de cultivo para los gérmenes patológicos comunes de las vías urinarias y cuando las bacterias pasan a la orina se multiplican extraordinariamente superando a veces un millón por millones como las muestras de orina, obtenidas en forma natural o por cateterismo suele contaminarse. En el momento de su recolección, la presencia de microorganismos aun las patología conocidas, no establece necesariamente el diagnostico de infección de las vías. Los resultados importantes de los cultivos de orina son posibles solo después de estudio cuantitativo. Para diferenciar entre bacterias verdaderas y contaminación se necesita conocer el número de microorganismos en 1 ml de orina, estimada por una técnica de cultivo llamada recuento de colonias, método que permite diferenciar con toda precisión entre infección y contaminación. La flora bacteriana de orina normal difiere de las muestras infectadas. Los microorganismos mencionados en primer termino son las que se encuentran con mayor frecuencia en la orina normal. Por supuesto, ellas representan contaminaciones de uretra, vagina, etc. ya que la orina de la vejiga es normalmente estéril.
Estafilococos, coagulosa-negativas. Bacilos difteroides. Bacilos coniformes. Enterococos. Lactobacilos. 5
Estreptococos alfa hemolíticos y beta hemolíticos. Levaduras saprofitas. Especies de bacillus.
La flora de la orina infectada incluye, por lo común una o varias de las siguientes bacterias.
Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter. Proteus mirabilis y otras especies de Proteus y serratea. Especies de providencia y morganella. Pseudomonas aeruginosa y otras especies de Pseudomonas. Enterococos (Streptococos fecalis). Staphylococcus, coagulosa-positiva y coagulosa-negativa (S. saprophyticus). Especies de Alcaligenes. Cándida albicans y otras levaduras. Gardnerella, vaginalis. Mycobacterium Tuberculosis y otras micobacterias. Estreptococos beta hemolítico por lo general de los grupos B y D. Neisseria gonorrea. Especies de Salmonella y Shigellas.
Materia:
Frasco estéril Benzal Diluido 1:1000, algodón. Placas con agar, Mac Conkey. Placas con agar GS. Placas con agar Biggy. Asa calibrada para inocular 0.001 ml.
Desarrollo: 1. Agitar el frasco y tomar una asada de orina con el asa calibrada y descargar en línea recta en el centro de la placa de MacConkey, gelosa sangre y Sabouraud y estriar masivamente. 2. Incubar las placas a 37ºC por 24-72 hrs., excepto la placa de Biggy que se incuba a temperatura ambiente. 3. Contar el número de colonias que desarrollan en las placas y multiplicar por 1000. 4. Si en numero de bacterias es mayor de 100,000 por ml se procede a identificar el microorganismo por los métodos usuales y realizar antibiogramas.
6
5. Finalmente informar en numero de bacterias por ml así como que microorganismos se identifico, y su comportamiento frente a los diferentes antimicrobianos.
7
UROCULTIVO MUESTRA METODO DE ASA CALIBRADA 1:100 Sembrar una asada en cada uno de los medios, estriar como se indica en el diagrama.
GELOSA SANGRE
AGAR MACCONKEY
SABOURAUD.
37AC 24-48 hrs.
37 AC 24-48 hrs.
T. AMB. 24-48 hrs.
STAPHYLOCOCCUS STREPTOCOCCUS
ENTEROBACTERIAS PSEUDOMONAS
CANDIDAS
Tipificación de látex o coagulasa susceptibilidad
Pruebas Bioquímicas Susceptibilidad
Tubo Germinativo
8
9
COPROCULTIVO El estudio bacteriológico de las heces es útil para identificar patógenas que ocasionan trastornos gastrointestinales como fiebre tifoidea y disentería y estados de portador. El objetivo principal de realizar un coprocultivo es que este sirva como apoyo al diagnostico clínico. La flora bacteriana normal en las heces incluye patógenas. Las mas comunes en vías gastrointestinales son Shigella, Salmonella y Camphylobacter, fectus, subespecie jejuni; entre los microorganismos patógenas menos comunes están Vibrio cholerae, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus que suelen ocasionar síntomas gastrointestinales después de la proliferación excesiva de microbios oportunistas que son resultado de la destrucción de la flora normal por antibióticos Escherichia coli, bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hidrophyla y Vibrio parahemoliticus entero toxígenos. El 96 a 99 % de la flora intestinal normal comprende anaerobios que incluyen bacteroides lactobacillos anaeróbicos, Clostridium, estreptococos anaeróbicos; de 1 a 4 % restante esta integrada por aerobios que incluyen bacilos Gram-negativos (Predomina E. coli) y números pequeños de Pseudomonas y Proteus, cocos Gram (+) Enterococos y números pequeños de Lactobacilos y Cándidas. Material:
Cajas petri con medio MacConkey. Cajas petri con agar SS. Tubo con caldo tetrationato o caldo selenito. Hisopos estériles. Tubos de 13 x 100 con medio TSI Tubos de 13 x 100 con medio LIA. Tubos de 13 x 100 con medio MIO. Tubos de 13 x 100 con agar UREA. Tubos de 13 x 100 con caldo malonato. Tubos de 13 x 100 con citrato de Simona. Frasco gotero con solución salina estéril. Gradilla. Frasco con fenol al 5% o benzal. Mechero. Solución de yodo para el caldo tetrationato o selenito. Asa de platino. Antisueros polivalentes, para Salmonellas, Shigellas y Vibrio cholerae.
10
Factores que interviene en los resultados 1. La técnica inadecuada de reunión o la presencia de orina, contaminan la muestra de heces. 2. La administración de antibióticos hace que disminuya el numero de bacterias en la muestra e inhibe el desarrollo in Vitro de las bacterias. 3. El hecho de no transportar rápidamente la muestra permite la proliferación de microorganismos no patógenos, lo cual influye en los resultados del estudio. 4. La refrigeración, hay microorganismos sensibles al frió.
Sembrado de la muestra 1. Inmediatamente que la muestra llega al laboratorio se procede al sembrado. 2. En cada medio se deposita con un hisopo una pequeña porción y se produce a realizar estrías cruzadas; esterilizando en cada estría el asa de nicromo. 3. En el caldo de tretationato se le agregan 4 gotas de yodo y después se agrega, 2 gramos de muestra. 4. Todo se incuba a 36ºC ± 2ºC durante 24 Hrs. 5. Se produce la lectura siguiendo la marcha descrita.
11
COPROCULTIVO MUESTRA
Caldo de Tetrationato + 4 gotas de yodo + 2 grs. de la muestra. Inc 8-24 hrs. y resembrar
SS
SB
SIEMBRA DIRECTA
MAC CONKEY
SS INVESTIGAR COLONIA SOSPECHOSA DE: SALMONELLA E. COLI SHIGELLA. REALIZAR: BIOTIPO TIPIFICACION CON ANTIGENOS PARA DETERMINAR ESPECIES
37ºC
INVESTIGAR COLONIA SOSPECHOSA DE: E. COLI SALMONELLA SHIGELLA. REALIZAR BIOTIPO TIPIFICACION CON ANTIGENOS PARA DETERMINAR ESPECIES
12
13
CULTIVO DE EXUDADO FARINGEO El estudio de Exudado Faringeo y Nasofaringeo es importante para el diagnostico de ciertas infecciones, entre ellas están Streptococcus, la Difteria, la Tosferina; así como para establecer el foco de infección de enfermedades como: Fiebre Reumática y Glomérulonefritis Hemorrágica aguda y en la demostración de portadores de estreptococos beta hemolíticos (Pyogenes) Haemophylus influenza en niños menores de 5 años. La flora normal en vías respiratorias altas y bajas con frecuencia esta construida por: Streptococcus viridans Branhamella catarrhalis, Staphylococcus coagulasa-negativa (se puede confundir con estreptococos beta hemolíticos) bacilos difteroides, levaduras y bacteroides. Entre los patógenos se encuentran: Estreptococos beta hemolíticos del grupo A (Pyogenes) y ocasionalmente del grupo C y G Corynebacterium pertusis Haemophylus influenzae capsulado Mycabacterium, rara vez micoplasma pneumoniae Pseudomona aeruginasa, Streptococcus pneumoniae y cándida albicans.
Material:
Cajas de petri con Gelosa Sangre (Carnero). Caja de petri con Gelosa Chocolate. Cajas de petri con agar Biggy. Equipo para tinción de Gram. Hisopos estériles. Abatelenguas Medio de transporte Stuart. Pastorex Streptococcus. Disco para diferenciación de Streptococcus Pneumoniae.
Técnica de sembrado a) b) c) d)
Inocular en Gelosa Sangre de Carnero, Chocolate y aislar con estría cruzada. Colocar en la estufa a 35ºC ± 2ºC. A si también sembrar en Agar Sabouraud. Encubar a Temp. Amb. Leer las cajas de cultivo, observando el crecimiento bacteriano, a las 24 y 48 hrs. de incubación
Identificar Streptococcus Beta Hemoliticus y Streptococcu pnemoniae.
14
Utilizando prueba de látex para Streptococcus Beta Hemolítico o sensidiscos de optoquina para Streptococcus Pneumoniae., o si se prefiere se identifican en método automatizado.
Nota: En pacientes menores de 5 años sembrar en agar Chocolate, para Hasemophylus influenza de acuerdo al diagnostico del medico.
15
Exudado
fari ngeo
MUESTRA SEMBAR EN:
GELOSA SANGRE DE CARNERO 5% CHOCOLATE
37 ºC 24-48 H.
STREPTOCCUS BETA HEMOLITICUS STRPTOCOCCUS PNEUMONIAE IDENTIFICACION EN LATEX Ó METODO AUTIMATIZADO MICRO-SCAN
AGAR SABOURAUD
TEMP. AMB. 24-48 H.
CANDIDAS TUBO GERMINATIVO
GELOSA
37 ºC 48 H. EN CO2 AL 5% HAEMPPHYLUS INFLUENZA
METODO AUTOMATIZADO MICRO-SCAN
16
NOTA: SOLO PARA NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS
NOTA: SOLO PARA NIÑOS MENORES DE 5 AÑOS
17
18
EXUDADO VAGINAL Y URETRAL Algunas bacterias patógenas, levaduras y protozoarios se hallan colonizando el epitelio del aparato genital masculino y femenino. Las infecciones frecuentemente se indican en la uretra anterior del varón y en la uretra, glándulas vulvovaginales y cuello uterino de la mujer. Los microorganismos mas frecuentes aislados del aparato genital son los siguientes: Bacilos coniformes, Enterococos y otros comensales intestinales incluyendo especies de anaerobios, bacteroides y otros.
Lactobacillos. Gardnerella vaginalis Cándida Albicans, otras especies de cándida y levaduras. Saprófitas. Estreptococos Beta Hemolíticas del grupo B y D. Mycobacterias no patógenas. Neisseria gonorrhoea. Treponema pallidum. Chlamydia trachomatis. Haemophilus ducreyi. Virus del Herpes Simple. Tricomonas Vaginalis.
En un exudado cervico vaginal la flora vaginal normal varía considerablemente con la edad, el PH de las secreciones y la cantidad de glucógeno presente en el epitelio; no obstante en la mayoría de los casos dicha flora está constituida predominantemente por bacilos de Doderlain y en menor proporción bacilos entéricos gram (-), bacteroides SP, Enterococos y estafilocos coagulasanegativa. Cuando aparece un desequilibrio, frecuentemente de origen hormonal, se observa la desaparición del bacilo de Doderlain lo que ocasiona que aparezca una flora alterada proveniente el exterior que puede causar vaginitis, tales como: Tricomoniasis, Candidosis, CERVICITIS gonocócica y un grupo heterogéneo como son: gardnerella vaginalis y algunos causados por germen es anaerobios, así como son: Chlamydia tracomatis, Micoplasma H.
Equipo y material:
Guantes estériles. Hisopos estériles. Asa bacteriológica. Especulo vaginal. Tayer-Martin. 19
Placas con medios de Gelosa Sangre (Carnero). Placas con medio de Casman. Agar Sabouraud en placa. Medio de transporte Stuart. Solución salina en tubo (aprox. 1.2 a 2 ml) 2 Laminilla. Solución KOH al 10%. Tubo de transporte para Chamydia T. Tiras de PH. Enfermedades de transmisión sexual. Principal método de detección
POR MICROSCOPIA:
Tricomoniasis Sarna Pediculosis
POR CULTIVO:
Gonorrea Vaginosis Bacteriana Candidosis Cervicitis o Uretritis
BUSQUEDA DE ANTIGENOS:
Chamydiasis Micoplasma Hominis Ureaplasma Urealiticus.
Las infecciones vaginales se clasifican en 3 tipos: Vaginitis específicas: Proceso inflamatorio caudado por un germen especifico: Cándida, Chamydia T, Trichomona Vaginal, Neisseria, Microplasma Hominis y Ureaplasma U. Hay más leucocitos polimorfonucleares presentes en gran cantidad.
Vaginitis inespecíficas: Proceso inflamatorio causado por una proliferación anormal de la flora saprofita vaginal (la flora bacilar esta disminuida). Leucocitos polimorfonucleares presentes en gran cantidad.
20
Vaginosis bacteriana: Alteración de la ecología vaginal con desplazamiento de la flora lactobacilar normal por microorganismos saprofitos. No causa respuesta inflamatoria (por lo cual no hay leucocitos presentes ó si los hay estos son escasos). En este padecimiento frecuentemente encontramos una asociación entre un microorganismo aerobio con un microorganismo anaerobio, el ejemplo típico es la Gardnerella Vaginalis asociada al Mobiluncus.
21
TABLA Descarga Vaginal: Resumen de Diagnostico
Características
Normal
Vaginosis Bacteriana
Candidosis
Tricomoniasis
Tipo de Descarga Flocular Vaginal
Homogénea
Flocular
Homogénea/Espumosa
pH
<4.5
>4.5
<4.5
>4.5
Olor aminado
Ausente
Presente
Ausente
Puede estar presente o ausente
Células Indicadoras
Ausente
Presente
Ausente
Ausente
Tricomonádidos
Ausente
Ausente
Ausente
Presente
Lactobacilos > otras bacterias
Si
No
Si
Si/No
22
EXUDADO VAGINAL
Metodología Lecturas de placas si hay desarrollo se seleccionan colonias por su morfología. EN BASE A LO ANTERIOR FLORA GRAM NEGATIVA
FLORA GRAM POSITIVA
(COCOS) Solo en secreción Uretral COCOS
COCOBACILOS GRAM (-– ) (+)
STREPTOCOCOS
STAPHYLOCOCOS AURES
EXUDADO VAGINAL
Metodología Lecturas de placas si hay desarrollo se seleccionan colonias por su morfología. EN BASE A LO ANTERIOR FLORA GRAM NEGATIVA
FLORA GRAM POSITIVA
(COCOS) Solo en secreción Uretral COCOS
COCOBACILOS GRAM (-– ) (+)
STREPTOCOCOS
STAPHYLOCOCOS AURES
AISLAMIENTO DIPLOCOCOS GONOCOCO
AISLAMIENTO (CASMAN) LACTOBACILLUS GARDNERELLA VAGINALIS
AISLAMIENTO GELOSA SANGRE PRUEBA: (LATEX) DIFERENCIACIO N DE GRUPO
AISLAMIENTO (SM) PRUEBAS: COAGULASA ANTIBIOGRAMA
SABOURAUD
Colonias desarrollas a temp. amb. 24-72 hrs.
Tubo Germinativo en suero para Candida albicans
23
EXUDADO MUESTRA
VAGINAL TINCION DE GRAM
Morfología Bacteriana Polimorfonuclear
es
Células Claves
MEDIO DE TRANSPORTE
Solución Salina Observación en fresco Trichomonas Vaginalis Levaduras Mobiluncus
Thayer Martín
Gelosa Sangre
37 AC 24-48 hrs. N. Gonorrhoae Gardnerella Vaginalis
Saboraoud
24-48 37 AC
KOH al 10%
Temp. Amb. 24-48hrs
Streptococcus P. Látex Para diferenciación
Prueba de Aminas
Cándida Albicans Cándida SP Tubo germ.
24
VULVO
VAGINALES
MUESTRA
TINCION DE GRAM es
Morfología Bacteriana Polimorfonuclear Células Claves
MEDIO DE TRANSPORTE
Solución Salina de
Thayer Martín Sal y Manitol Casman Observación 37 AC 24-48
en fresco Aminas
24-48 hrs.
37 AC
Gelosa Sangre 24-48 37 AC
Saboraoud
KOH al 10%
Temp. Amb. 24-48hrs
Prueba
VULVO
VAGINALES
MUESTRA
TINCION DE GRAM
Morfología Bacteriana Polimorfonuclear
es
Células Claves
MEDIO DE TRANSPORTE
Solución Salina de
Thayer Martín Sal y Manitol Casman Observación 37 AC 24-48
en fresco Aminas Trichomonas Vaginalis
24-48 hrs.
Gelosa Sangre
Saboraoud
24-48
37 AC
KOH al 10%
Temp. Amb.
37 AC
Prueba
24-48hrs
CO2 al 5% N. Gonorrhoae
Sthaphylococcus Coagulasa
Streptococcus P. Látex
Cándida Albicans
25
Levaduras Mobiluncus germ.
Gardnerella Vaginalis
Para diferenciación
Cándida SP Tubo
Uretrales MUESTRA
TINCION DE GRAM es
Morfología Bacteriana Polimorfonuclear Células Claves
MEDIO DE TRANSPORTE
Solución Salina 10%
Thayer Martín Sal y Manitol Casman
Gelosa Sangre
Saboraoud
KOH al
Levaduras Mobiluncus germ.
Gardnerella Vaginalis
Para diferenciación
Cándida SP Tubo
Uretrales MUESTRA
TINCION DE GRAM es
Morfología Bacteriana Polimorfonuclear Células Claves
MEDIO DE TRANSPORTE
Solución Salina 10% Observación Prueba de en fresco Aminas
Thayer Martín Sal y Manitol Casman 37 AC 24-48 hrs.
Gelosa Sangre
24-48 37 AC
Saboraoud
24-48 37 AC
KOH al
Temp. Amb. 24-48hrs
26
CO2 al 5 % Trichomonas Vaginalis Levaduras Mobiluncus germ.
N. Gonorrhoae Gardnerella Vaginalis
Sthaphylococcus Coagulasa
PRUEBA
DE
Streptococcus Cándida Albicans P. Látex Para diferenciación Cándida SP Tubo
AMINAS
GOTERO OLOR AMINAS PORTA OBJETO PACIENTE
SECRECION DEL
CO2 al 5 % Trichomonas Vaginalis Levaduras Mobiluncus germ.
N. Gonorrhoae Gardnerella Vaginalis
Sthaphylococcus Coagulasa
PRUEBA
DE
Streptococcus Cándida Albicans P. Látex Para diferenciación Cándida SP Tubo
AMINAS
GOTERO OLOR AMINAS PORTA OBJETO PACIENTE
SECRECION DEL
27
CUANDO SE AGREGA UNA SOLUCION E KOH AL 10 % EN LAS SECRECIONES VAGINALES DE UNA PACIENTE CON VAGIINOSIS BACTERIANA, SE LIBERAN AMINAS CON UN OLOR FETIDO O A PESCADO
CUANDO SE AGREGA UNA SOLUCION E KOH AL 10 % EN LAS SECRECIONES VAGINALES DE UNA PACIENTE CON VAGIINOSIS BACTERIANA, SE LIBERAN AMINAS CON UN OLOR FETIDO O A PESCADO
28
Técnica de sembrado: 1. Tomar del medio de transporte la muestra y proceder al sembrado con estrías cruzadas. 2. En los medios descritos en la marcha. Los medios de Casman y Tayler Martín se incuba en CO2 al 5% a 36ºC. 3. Teñir el frotis con tinción de Gram. 4. Leer el tubo de la solución salina y el tubo de KOH al 10%. Proceder a la identificación siguiente la marcha descrita para este estudio
Pruebas del pH de las secreciones vaginales normales.
Técnica de sembrado: 1. Tomar del medio de transporte la muestra y proceder al sembrado con estrías cruzadas. 2. En los medios descritos en la marcha. Los medios de Casman y Tayler Martín se incuba en CO2 al 5% a 36ºC. 3. Teñir el frotis con tinción de Gram. 4. Leer el tubo de la solución salina y el tubo de KOH al 10%. Proceder a la identificación siguiente la marcha descrita para este estudio
Pruebas del pH de las secreciones vaginales normales.
Prueba del pH de las secreciones vaginales de una paciente con vaginosis bacteriana.
4.5
5.0
5.5
6.0 pH
6.5
7.0
7.5
Escala de pH
29
30
CULTIVO DE SECRECION DE HERIDAS
Exudados, trasudados y punta de catéter. El cultivo de secreción de una herida, Exudados, trasudados y punta de catéter, comprenden el análisis de microorganismos del liquido obtenido de una lesión, para confirmar la presencia de infecciones. Los cultivos de dicho material pueden hacerse para identificación de microorganismos aerobios (que por lo regular necesitan oxigeno para proliferar y aparecen en heridas superficiales) o anaerobios (microorganismos que necesitan porco o nulo oxigeno y aparecen en zonas con poco riesgo como incisiones postoperatorias, ulceras, tejidos gangrenados). Las indicaciones para cultivo de material de la herida incluyen fiebre e inflamación y secreción en el tejido lesionado. Los aerobios que con mayor frecuencia contaminan una herida incluyen Staphylococcus aureus, Strepto Beta Hemolítico del grupo A, E. Coli y otras enterobacterias, Pseudomonas y otros bacilos y cocobacilos no fermentados así como anaerobios.
Material y equipo:
Hisopos estériles y un tubo con medio Stuar. Aplicadores estériles de algodón o una jeringa de 10 ml y un tubo con medio especial que contenga CO2 o nitrógeno (para anaerobios). Guantes estériles. Torundas con algodón. Placas con medio Gelosa sangre (Carnero). Placas con medio Sal y Manitol. Placas con medio Mac Conkey. Placas con medio Cetrimida. Placas con medio Sabouraud. Pruebas Bioquímicas o panel automatizado.
31
EXUDADOS Y SECRECIONES MUESTRA
TINCION DE GRAM MEDIO DE TRANSPORTE STUAR
SABOURAUD SANGRE
CETRIMIDA
CANDIDA PSEUDOMONAS STREPTOCOCCUS T. GERMINATIVO BIOQUIMICA Ó METODO LATEX AUTOMATIZADO MICRO-SCAN
MACCONKEY
ENTEROBACTERIAS BIOQUIMICAS Ó METODO
SAL Y MANITOL
GELOSA
STAPHYLOCOCCUS COAGULASA ANTIBIOGRAMA
PRUEBA DE
AUTOMATIZADO MICRO-SCAN
32
CUANDO SOLICITEN CULTIVO PARA HONGOS SEMBRAR EN AGAR DEXTROSA DE SABOURAUD O/Y MICOCEL Y PONER LA MUESTRA EN KOH AL 10 % Y LEER.
EXUDADO
OTICO
MUESTRA
TINCION DE GRAM
MEDIO DE TRANSPORTE STUAR
AGAR SABOURAUD SAL Y MANITOL T- AMB
MACCONKEY
GELOSA CHOCOLATE
37ºC
37ºC
GELOSA SANGRE
37ºC
CUANDO SOLICITEN CULTIVO PARA HONGOS SEMBRAR EN AGAR DEXTROSA DE SABOURAUD O/Y MICOCEL Y PONER LA MUESTRA EN KOH AL 10 % Y LEER.
EXUDADO
OTICO
MUESTRA
TINCION DE GRAM
MEDIO DE TRANSPORTE STUAR
AGAR SABOURAUD SAL Y MANITOL
37ºC 24-48H
MACCONKEY
GELOSA CHOCOLATE
37ºC
37ºC
24-48 H
24-48 H
T- AMB 24-48 H
GELOSA SANGRE
37ºC 24-48 H
33
C. ALBICANS ENTEROBACTERIAS HAEMOPHILUS STAPHYLOCOCCUS T. GERMINATIVO PSEUDOMONAS NEISSERIA LATEX Ó P. BIOQUIMICAS METODO ANTIBIOGRAMA METODOS AUTOMATIZADO MICRO-SCAN SCAN AUTOMATIZADO MICRO-SCAN
EXUDADO
MUESTRA
CONJUNTIVAL
TINCION DE GRAM
MEDIO DE TRANSPORTE STUAR
STRPTOCOCCUS COAGULASA IDENTIFICACAR EN MICRO-
C. ALBICANS ENTEROBACTERIAS HAEMOPHILUS STAPHYLOCOCCUS T. GERMINATIVO PSEUDOMONAS NEISSERIA LATEX Ó P. BIOQUIMICAS METODO ANTIBIOGRAMA METODOS AUTOMATIZADO MICRO-SCAN SCAN AUTOMATIZADO MICRO-SCAN
EXUDADO
STRPTOCOCCUS COAGULASA IDENTIFICACAR EN MICRO-
CONJUNTIVAL
MUESTRA
TINCION DE GRAM
MEDIO DE TRANSPORTE STUAR
AGAR SABOURAUD SAL Y MANITOL
MACCONKEY
GELOSA CHOCOLATE
GELOSA SANGRE
34
37 AC 24-48H
T- AMB 24-48 H
C. ALBICANS STAPHYLOCOCCUS T. GERMINATIVO
37 AC
37 AC
37 AC
24-48 H
24-48 H
24-48 H
ENTEROBACTERIAS
HAEMOPHILUS
STRPTOCOCCUS
PSEUDOMONAS P. BIOQUIMICAS METODOS AUTOMATIZADO MICRO-SCAN
NEISSERIA METODO AUTOMATIZADO
LATEX Ó IDENTIFICACAR MICRO-SCAN
COAGULASA ANTIBIOGRAMA EN MICRO-SCAN
37 AC 24-48H
T- AMB 24-48 H
C. ALBICANS STAPHYLOCOCCUS T. GERMINATIVO
37 AC
37 AC
37 AC
24-48 H
24-48 H
24-48 H
ENTEROBACTERIAS
HAEMOPHILUS
STRPTOCOCCUS
PSEUDOMONAS P. BIOQUIMICAS METODOS AUTOMATIZADO MICRO-SCAN
NEISSERIA METODO AUTOMATIZADO
LATEX Ó IDENTIFICACAR MICRO-SCAN
COAGULASA ANTIBIOGRAMA EN MICRO-SCAN
35
36
HEMOCULTIVO La demostración de la presencia de un microorganismo a partir de la muestra de sangres, generalmente refleja una infección activa y diseminadas en los tejidos. La presencia de bacterias en sangre puede originarse por: Bacteriemia, Septicemia o piemia. BACTERIEMIA, se denomina así a la sola presencia (o invasión) de bacterias en sangre. SEPTICEMIA, la presencia de bacterias en sangre acompañadas de escalofríos, fiebres y postración ocasionado por la presencia de bacterias en proceso activo de multiplicación y liberando toxinas agresivas y factores asociados a su patogenicidad en el torrente, sanguíneo. PIEMIA, es una septicemia que origina la infección purulenta, es producida por microorganismos piogenes y da lugar a la formación de abscesos en distintas partes del cuerpo. Por lo tanto el hemocultivo constituye un recurso muy importante para el diagnostico de infecciones sistemáticas que presentan en su evaluación una etapa de bacteremia o septicemia. En algunas enfermedades la positividad del cultivo sanguíneo depende del estudio de la enfermedad. Así en el caso de la fiebre, tifoidea, la recuperación de los agentes involucrados, solo es generalmente afectivas durante la primera semana de la enfermedad por otro lado en la brucelosis los cultivos positivos se obtienen generalmente durante la exacerbación de los síntomas y la elevación de la temperatura, ya que la recuperación durante la fase crónica no es fácil en condiciones optimas de laboratorio se deben tomar por lo menos tres muestras en 24 horas, con intervalos de 1 hora previa a la aparición de la fiebre y considerar que la muestra contiene bajo numero de bacterias y que en algunas ocasiones estas se eliminan a la sangre en forma intermitente. La sangre para el Hemocultivo, se toma en condiciones optimas colocándose un frasco de un medio de cultivo enriquecido, el cual se recomienda vaya a condicionado de sustancias neutralizantes de los antimicrobianos inhibidores de la acción completa del suero y de la fagocitosis. La dilución recomendada, al efectuar la muestra es de 1:10. Es por eso que si el frasco de cultivo contiene 20 ml. de caldo, se deberán extraer 2 ml. de sangre.
Material:
1 frasco de Hemocultivo. Jeringas estériles y agujas estériles. Ligaduras. Algodón. Frasco con tinturado yodo al 3 %. Alcohol isopropanol al 80 % (ó alcohol etílico). Equipo para tinción de Gram. Placas de Agar Sangre. 37
Placas de Gelosa Chocolate o Thayler Martín. Placa de Agar MacConkey. Placa de Sabouraud. Placa se Sal y Manitol.
Ventajas del sistema automatizado de hemocultivos y cultivos de liquidos corporales 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Disminución de cultivos falso negativo. Reducción en el tiempo. Reducción del manipuleo de las muestras ya que eliminamos el proceso de resiembras. Aumento en el porcentaje de recuperación de microorganismos en los cultivos positivos. Entrega rápida y oportuna de resultados al medico. Reducción de tiempo de trabajo, dedicado usualmente en el hemocultivo. En los medios de cultivos podemos trabajar muestras de sangre y otros fluidos corporales estériles con los mismo beneficios 8. Control de calidad adecuado. 9. Contienen factores que neutralizan el antibiótico y permiten la recuperación del microorganismo. NOTA: EL proceso para ingresar la botella al Bacter 9050; se describe en el Manual del Bactec.
38
HEMOCULTIVO Después de que el equipo automatizado nos indica la botella POSITIVA. Realizar la marcha siguiente: TINCION DE GRAM
GELOSA SANGRE SABOURAUD. 37 ºC 24-48 H STRPTOCOCCUS P. LATEX DIFENGNCIACION DE GRUPO
GELOSA CHOCOLATE 37 ºC 24-48 H CO2 al 5%
HAEMOPHILUS NEISSERIA SISTEMA AUTOMATIZADO MICRO-SCAN
MACCONKEY 37 ºC 24-48 H
ENTEROBACTERIAS PSEUDOMONAS/BNF BIOQUIMICAS Ó SISTEMA AUTOMATIZADO MICRO-SCAN
SAL Y MANITOL T. AMB 37 ºC 24-48 HRS. 24-48 H C. ALBICANS STAPHYLOCOCCUS T. GERMINAT.
COAGULASA ANTIBIOGRAMA
39
40
CULTIVO DE LÍQUIDO CEFALORRAQUIDEO El examen bacteriológico del liquido cefalorraquídeo es un paso fundamental en el diagnostico de todo caso de meningitis sospechosa. La meningitis bacteriana aguda es una infección de las meninges-membranas que recubren el sistema nervioso central, con repercusiones en el encéfalo y en la medula espinal con alteraciones más o menos características del líquido cefalorraquídeo ocasionada por diversos microorganismos Gram (-) sobre todo Hemophilus Influenzae, Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae. La Meningitis bacteriana puede se también secundaria a infecciones de otras partes del organismo y raras veces pueden recuperarse especies de Salmonella, bacilos coniformes, estafilococos o micobacterias; en la meningitis neonatal el microorganismo aislado con mas frecuencia es Escherichia Coli junto con Estreptococos betahemolíticos del grupo B y G listeria monocytogenas (que también pueden afectar a los adultos), en pacientes inmunosuprimidos podemos encontrar Criptococcus neoformans. En la meningitis bacteriana generalmente el liquido cefalorraquídeo es purulento, con un recuento de leucocitos aumentado por lo común mas de 1000/mm3, predominio de células polimorfonucleares y reducción de la concentración de glucosa en liquido medular.
41
LIQUIDOCEFALORRAQUIDEO Después de que el equipo automatizado nos indica la botella POSITIVA. Realizar la marcha siguiente: TINCION DE GRAM
GELOSA SANGRE SABOURAUD. 37 ºC 24-48 H STRPTOCOCCUS P. LATEX DIFENGNCIACION DE GRUPO
GELOSA CHOCOLATE 37 ºC 24-48 H CO2 al 5 %
HAEMOPHILUS NEISSERIA SISTEMA AUTOMATIZADO MICRO-SCAN
MACCONKEY 37 ºC 24-48 H
ENTEROBACTERIAS PSEUDOMONAS/BNF BIOQUIMICAS Ó SISTEMA AUTOMATIZADO MICRO-SCAN
SAL Y MANITOL T. AMB 37 ºC 24-48 HRS. 24-48 H C. ALBICANS STAPHYLOCOCCUS T. GERMINAT.
COAGULASA ANTIBIOGRAMA
42
43
COLERA El cólera es una infección persistente en nuestra época, y sigue siendo un problema de importancia en áreas como Asia. África y Oceanía. En su mayor parte, las epidemias importantes se han limitado a zonas con escaso saneamiento ambiental, aunque se ha elevado la probabilidad de apariciones de casos de cólera importados en países con buenos servicios sanitarios, debido a la transportación rápida, al turismo y a los viajes internacionales. El hecho de encontrarlo en naciones desarrolladas como Estados Unidos es de llamar la atención, en México, no se habían reportado casos de cólera desde el siglo pasado; sin embargo en 1983 se publico el caso de una turista Estadounidense que presento la enfermedad cuatro días después de retornar a su país procedente de un viaje por las costas del estado de Quintana Roo (Cancún). Lo anterior, enfatiza la importancia de mantener una vigilancia Epidemiológica, y más actualmente con el problema que se tiene en Perú. El cólera en su forma mas grave, es una enfermedad que consiste en una diarrea aguda, caracterizada por una perdida masiva de líquidos y electrolitos; vomito, deshidratación rápida y acidosis, lo que, a menos que no se trate, provoca un colapso cardiovascular y la muerte dentro de las 24 horas de su aparición. En realidad, tales casos son la excepción más que la regla, y los estudios epidemiológicos indican que, para cada caso grave, se presenten de 25 a 100 diferentes infecciones que varían de leves a sintomáticas. Esta enfermedad se adquiere por la ingestión de agua o alimentos contaminados con vómitos o heces de pacientes y en menor grado la transmisión ocurre de persona a persona, por contacto directo, las manos sucias y las moscas. Las manifestaciones clínicas de la enfermedad se deben a la producción de una enteroxina, la cual es una exotoxina conocida como toxina colérica; que esta compuesta de una subunidad A (con dos subunidades, A1 y A2) y cinco subunidades B; esta ultima une a la toxina con el receptor gangliosido GM1. la subunidad A1 penetra la membrana celular y activa el AMP cíclico, lo que inhibe la absorción de Nac1 e incrementa la secreción de cloro y bicarbonato, produciendo diarrea secretora que puede ser tan severa para producir un litro por hora de gasto fecal. Aunque el cuadro clínico es muy significativo, el diagnostico se hace al aislar Vibrio cholerae de las heces o vomito de los pacientes. También se pueden determinar anticuerpos antitoxinas y vibriocidas. La recolección de muestras de heces para el laboratorio, en la fase aguda puede hacerse mediante hisopado rectal, durante la convalecencia es mejor la toma de la materia fecal. Cuando la muestra no se procesa de inmediato, debe usarse un medio de transporte, en este caso, Cary-Blair donde Vibrio sobrevive hasta 3 semanas El tratamiento se basa en la restitución de líquidos, que en los casos menores graves puede hacerse por vía oral. La tetraciclina es el antibiótico de elección y se puede considerar al cloranfenicol, eritromicina y furozolidona como alternativas.
44
Es reconocido que el principal mecanismo de control para el cólera es elevar el nivel de saneamiento en la comunidad de áreas endémicas. El uso de vacunas no ha sido eficaz, ya que solo protege en un 50 % y con una duración de tres meses y no previene la diseminación del microorganismo. No queda más que enfatizar la importancia de la Vigilancia de epidemiológica, con la finalidad de conocer el papel de Vibrio Cholerae como causa de diarreas en nuestro medio. Género vibrio En los últimos años, el genero Vibrio ha cambiado de un grupo heterogéneo de organismos pobremente caracterizados a un grupo natural bien entendido. En genero Vibrio es ahora mucho mas homogéneo y esta clasificado dentro de la familia Vibrionaceae junto con otros tres géneros: Photobacterium, Aeromonas y Plesiomonas. Las especies de Vibrio causan infecciones en humanos las cuales pueden ser clasificadas como intestinales o extraintestinales, dentro de las infecciones del tracto intestinal en cinco especies se ha demostrado que causan o están asociadas con diarrea. V. Cholerae es bien conocido como causa del cólera y V. Parahemolyticus produce gastroenteritis aguda. Más recientemente, V. Fluviales, V. Hollisae y V. Mimicus han sido implicados como productores de diarrea. V. Fernissii se ha aislado de unos pocos casos de diarrea pero no hay evidencia real que el pueda causarla.
ESPECIE DE VIBRIO ASOCIADOS A INFECCIONES HUMANAS V. Alginolyticus V. Cholerae V. Damsela V. Fluvialis V. Fruncí
V. Hollisae V. Metschnikovii V. Mimicus V .Parahemolyticus V. Vulnificus
V. cholerae sero grupo 01 y no 01 A mediados de los años 30 fue reconocido que la gran mayoría de lo Vibrio aislado de casos de cólera, aglutinaban con un solo antisuero. La aglutinación con este antisuero (mas tarde llamado antisuero V. cholerae 01) fue tomado como criterio para identificar un organismo V. cholerae. 45
Aquellos organismos que no aglutinan con el mencionado antisuero, con conocidos como V. cholerae no 01. Hoy es aceptado que hay dos grupos de V. cholerae, serogrupos 01 y no 01. V. cholerae 01 es el serogrupo aislado de casos de cólera, y toxina, produce diarrea severa, de tipo agua de arroz.
a través de la acción de su
V. cholerae no 01 puede causar une enfermedad parecida al cólera, pero tiene un mayor espectro de enfermedades, incluyendo infecciones extraintestinales. Vibrio cholerae
Definición. 1. Bacilo Curvo Gran Negativo, oxidasa y catalasa positivo, con metabolismo fermentador. 2. Utiliza la sacarosa. Pertenece al Serogrupo 01. 3. No es halofilico.
Medios de cultivo. Agar TCBS (Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa). Este medio de color verde posee como indicadores de cambio de ph azul de timol y azul de bromotimol; las cepas de V. cholerae, como utilizan la sacarosa se tornan de color amarillo al igual que el área que las circunda. También puede ser empleado el agar Mac Conkey, donde crecerán con la tonalidad de una capa lactosa negativa, mayor de 1 mm De diámetro. Para aislar esta bacteria tanto de alimentos como de muestras clínicas se requiere el uso de metodología de enriquecimiento.
Identificación. Gram Catalasa Oxidasa TSI LIA MIO Citrato Urea
Bacilos Gram Negativos. Crecimiento en agar TCBS, colonias amarillas. Positiva. Positiva. A/A K/N (+); (+); (+). (+) (-) 46
DNAsa Malonato
(+) (-)
Crecimiento en caldo nutritivo con 0 % NaCl 1 % NaCl 6 % NaCl 8 % NaCl
(+) (+) d (53%) (-)
Aminoacido en base de moeller Arginia 1% Lisina 1% Ornitina 1% ONPG Prueba del collar (String test) Aglutinación con antisuero 01
(-) (+) (+) (+) (+) (+)
NOTA: ó emplear también el método automatizado Micro-Sean.
47
AISLAMIENTO DE VIBRIO CHOLERAE
MUESTRA Cari Blair Transportar al laboratorio Sembrar en Agar en
Enriquecimiento Agua Peptonada alcalina
Incubar toda la noche
Incubar 5-8 hrs. Sembrar en agar TCBS Incubar toda la noche
Colonias Sospechosas
Colonias Sospechosas. Identificación Bioquímica Antisuero V. Cholerae 01
48
49
CONOCIMIENTO DE LAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS NO FERMENTADORAS (BGN Nº F) Hasta hace poco las bacterias no fermentadoras eran consideradas como comensales de escasa importancia clínica; sin embargo, estudio recientes han demostrado que casi un 15 % de todos los aislamientos realizados en los laboratorios de Microbiología Clínica, corresponden a este grupo de bacterias, en donde Pseudomonas aeruginosa surge como un importante patógeno oportunista. El origen de este tipo de infecciones es múltiple y depende de varios factores tales como: el uso de sustancias inmunosupresoras, agentes antimicrobianos, procedimientos quirúrgicos e instrumentación mecánica. Se han observado que las infecciones nosocomiales ocurren en pacientes que han sufrido quemaduras, mas que en otra situación clínica. La infección se produce por microorganismos en la flora normal del paciente, del ambiente o de ambos. Otro tipo de pacientes también susceptibles a la infección por este grupo de bacterias, son aquellos que sufren de enfermedades neoplásicas malignas, en especial leucemia y linfomas. Existen informes en los que se señala que Pseudomonas maltophilia ha sido aislada directamente de pus obtenida de lesiones malignas y de fistulas cancerosas.
Burkholderia cepacie se han encontrado en enfermedades pulmonares de pacientes que sufren fibrosis quistica, aunque su papel en estos casos aun no han sido aclarado. El segundo genero bacteriano, aislado con mayor frecuencia es ACINETOBACTER el cual se asocia con diversas situaciones como septicemia, meningitis, endocartis, osteomielitis, neumonía, infecciones en vías genitourinarias, ojos, oídos, piel y abscesos, infecciones nosocomiales. Los demás géneros de este grupo, aunque no menos importante se aíslan con menor frecuencia, estos son: MORAXELLA, ALCALIGENES, FLAVOBACTERIUM, ACHROMOBACTER, EIKNELLA. Los géneros XANTHOMONAS Y AGROBACTERIUM han sido aislados muy rara vez de fuentes humanas y sobre todo son fitopatogenos. Como característica común, los BGNnF se pueden aislar y recuperar en medios de cultivos convencionales, como es el caso de la gelosa sangre de carnero. Para su identificación han sido propuestos un gran número de protocolos, de los cuales tres han resistido la prueba del tiempo, además han logrado aclarar de manera sustancial la caracterización y significación medica de dichos microorganismos. Estos esquemas fueron propuestos por la Dra. King ( ) y revisandos por Weaver ( ); Gilardi ( ) y Pickett. De estos, el esquemas de King Weaver fue el primero que se propuso. La diferenciación de los microorganismos se basa en cuatro características: la utilización
50
de glucosa, capacidad de desarrollo en Agar Mac Conkey, producción de citocromo oxidasa y la movilidad. En el esquema de Gilardi, se emplean las pruebas de laboratorio mas accesibles omitiendo las que implican requerimientos especiales o periodos prolongados de incubación. Entre las pruebas que planeta dicho esquema tenemos: utilización de carbohidratos, hemólisis, desarrollo de Agar Mac Conkey y Agar Salmonella Shigella (SS), crecimiento a 42 AC, susceptibilidad a Penicilina y Polimixina. El tercer protocolo, de Pickett sugiere algunas pruebas adicionales no comunes, tales como: utilización del Ácido Indolpiruvico (API) y del Ácido Fenilpiruvico.
Apéndice Nª 1 Cepa Pura
Tinción de Gram Prueba de Catalasa Prueba de Oxidasa Siembra en medios para movilidad Siembra en Mac Conkey Además siembra en los diferentes Medios que aparecen en la tabla
51
Apéndice Nº 2 Espécimen Clínico Preparación adecuada
A.- Tinción de Gram Siembra en Agar Sangre de Carnero Siembra en Agar Mac Conkey Siembra en Agar Sal y Manitol
Incubar a 35 AC
B.- Revisar morfología colonial Tinción de Gram Verificación del Crecimiento Realización de Pruebas Bioquímicas ó Método Automatizado Micro-Scan.
MEDIO OF PARA PRUEBA DE OXIDACION-FERMENTACION (HUGH Y LEIFSON)
52
Microorganismos sacarolíticos degradan la glucosa fermentaría u oxidativamente. Los subproductos de la fermentación son “ácidos mixtos” relativamente fuertes, que se pueden detectar en un medio de fermentación convencional (TSI, KIA). En un cambio, los ácidos formados por la degradación oxidativa de la glucosa son sumamente débiles y para su detección se requiere un medio de oxidación-fermentación mas sensibles, como el descrito por Hugo y Leifson (medio OF). El medio OF, cuando es suplementado con un carbohidrato apropiado, es usado para la determinación del metabolismo o fermentativo de carbohidratos por bacilos gram-negativos como un medio de diferenciación entre especies. El medio OF desarrollado por Hugo y Leifson en 1953, quienes describieron la significancia taxonómica del metabolismo fermentativo vs. oxidativo de carbohidratos por bacterias gram-negativas. Ellos mostraron que cuando un organismo es inoculado en dos tubos de medio OF conteniendo un carbohidrato y el medio en uno de los tubos es cubierto con petrolato fundido antes de la incubación, los patrones de metabolismo son de significado diferencial. Los organismos oxidativos producen una reacción ácida únicamente en el tubo abierto con poco o ningún crecimiento y sin formación de ácido en el tubo cubierto. Los organismos fermentados producen una reacción ácida en ambos tipos de tubos. Los cambios en los tubos cubiertos se deben a una verdadera fermentación, mientras cambios en los tubos abiertos son debidos a la utilización oxidativa del carbohidrato presente. Si el carbohidrato no es utilizado por ningún método, no hay producción de ácido en ningún tubo. El medio OF de Hugo y Leifson difiere de los medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente: a) La concentración de proteína (peptonas) has sido disminuida del 1 % al 0.2 %. b) La concentración de carbohidratos esta aumentada del 0.5 % al 1%. c) La concentración de agar esta disminuida del 1.5 % al 0.25 % por lo cual su consistencia es semisólida. La menor relación proteinita-carbohidrato reduce la formación de aminas alcalinas que pueden neutralizar las cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. La concentración relativamente mayor de carbohidratos sirva para aumentar potencialmente la producción de ácido. La consistencia semisólida permite que los ácidos formados en la superficie difundan por todo el medio, facilitando la visualización del viraje del indicador del pH. Este medio es también adecuado para determinar la movilidad.
Medio OF de Hugo y Leifson Peptona Glucosa
2.00 g 10.00 g. 53
Azul de bromitimol Agar Cloruro de sodio Fosfato dipotásico Agua destilada
0.03 g. 2.50 g. 5.00 g. 0.30 g. 1000 ml.
El medio se obtiene comercialmente. Seguir las indicaciones del fabricante para su preparación.
Procedimiento: Inocular dos tubos para cada uno de los carbohidratos usados con el organismo a probar. Los tubos deberán ser picados hasta aproximadamente ¼ de pulgada del fondo usando una aguja de inoculación y un inoculo ligero. Cubrir un tubo de cada par con una capa de 1 cm. de aceite mineral estéril o parafina fundida, dejando el otro tubo abierto al aire. Incubar ambos tubos a 35ºC + 2ºC en una atmósfera aeróbica por 48 horas no dar como negativo hasta después de 4 días de incubación
Interpretacion:
Tubo abierto
Tubo cubierto
Tubo de metabolismo
Ácido (amarillo) Ácido (amarillo) Alcalino (verde)
Alcalino (verde) Ácido (amarillo) Alcalino (verde)
Oxidativo Fermentativo No sacarolítico
Ver también si el organismo es móvil o no por el crecimiento únicamente a lo largo de la línea de incubación (inmóvil) o en todo el medio (móvil).
Controles: Fermentadores de glucosa: Oxidador de glucosa: No Sacarolítico:
Escherichia coli. Pseudomonas aeruginosa. Moraxella spp.
Caracteristicas de: Branhamella catarihalis Es un habitante de la nasofaringe 10-97 % •
Diplococos..................Gram (-) 54
• • • •
Oxidasa.......................(+) Inmóvil Catalasa......................(+) Basal Of = inerte
Infecciones causadas por B: Catarrhalis • • • • •
Otitis Meningitis Bacteremía Septicemia Neumonía Caracteristicas de algunas pseudomonas
Productoras de Pigmento
Oxidasa (-)
Ps aeruginosa Ps fluorescens Ps putida. Ps Maltophilia Ps cepacia Ps mellei
Pigmentos producidos por Pseudomonas •
A- Pioverdina:
Amarillo Verdoso/Café
•
B- Piocianina:
Azul
A + B = Color Verde Brillante •
Piorubina:
Rojo
Piomelanina: Café Identificacion de Pseudomonas aeruginosa •
• • • •
Morfología y olor Beta-hemólisis Productora de piocianinas Crece a 42ºC 55
56
HACER FROTIS, PURIFICAR, IDENTIFICAR TABLA Nº1 IDENTIFICAR PRESUNTIVA DE LAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS NO FERMENTADORAS
E. CORRO- ACINETODENS BACTER
ALCALIGENENES
FLAVOBACTERIU M BGN CORTOS
-
B. MEDIANOS GN +
ACHROMO BACTER BGN MEDIANOS
MORFOLOGIA
CBGN
CBGN
OXIDASA
+
+
CATALASA
-
+
+
METABOLISM O BASAL OF
I
0 (I)
MOVILIDAD
-
CEC. MC. C.
-
MORAXEL LA
PSEUDOM ONAS. BGN CURVOS
V (88)
BGN CORTOS CBGN +
+
+
V (88)
-
+
I (NO OXID)
0
0
I (NO SAC)
0
-
+
+
-
-
+
+
+
+
-
+ (ESCASO) +
57
ESQUEMA DE KING WEAVER PARA LA IDENTIFICACION DE BGNnF GENERO
METABOLISM MOVILIDAD O
OXIDASA
DESARROLLO EN Mc. C
Pseudomonas
Oxidativo
Positiva
Positiva
Positivo
Acinetobacter
Oxidativo Inerte Oxidativo
Negativa
Negativa
Positivo
Variable
Positiva
Escaso o Negativo
Oxidativo e Inerte
Negativa
Positiva
Escaso o Negativo
Oxidativo
Positiva
Negativa o Positiva
Negativo
Flavobacteriu m Moraxella
Xanthomonas
ESQUEMA DE KING WEAVER PARA LA IDENTIFICACION DE BGNnF GENERO
METABOLISM MOVILIDAD O
OXIDASA
DESARROLLO EN Mc. C
Pseudomonas
Oxidativo
Positiva
Positiva
Positivo
Acinetobacter
Oxidativo Inerte Oxidativo
Negativa
Negativa
Positivo
Variable
Positiva
Escaso o Negativo
Oxidativo e Inerte
Negativa
Positiva
Escaso o Negativo
Xanthomonas
Oxidativo
Positiva
Negativo
Alcaligenes
Oxidativo e Inerte
Positiva
Negativa o Positiva Positiva
Flavobacteriu m Moraxella
Negativo
58
59
METODOLOGIA PARA AISLAMIENTOS DE ANAEROBIOS
Examen directo de la muestra: TINCION DE GRAM. El examen microscópico directo de la muestra proporciona información valiosa sobre el tipo de célula presentes así como la morfología y afinidad tintoral de los microorganismos presentes a su vez es un excelente control de cantidad por que si los morfotipos observados no se recuperan en los cultivos aeróbicos o anaeróbicos, el procedimiento puede ser defectuoso por alguna de las siguientes causas: a) b) c) d) e)
Colección y/o manejo inadecuado de la muestra. Medios de aislamiento primario mal elegidos o deficientes. Defectos en el sistema anaeróbico utilizados. Subcultivos incorrectos. Poco entrenamiento del personal para lograr la identificación.
Con los datos obtenidos del examen microscópico directo y la coloración del Gram, deberá proporcionarse un informe preliminar el mismo día tomando en cuenta las siguientes ideas o ejemplos que se describen a continuación: Tomando en consideración que únicamente se reportara la morfología sin adelantar la posibilidad de algún genero o especie como certeza: hasta que no se haya confirmado con el cultivo.
Procedimiento de inoculación. 1. Use siempre pipetas Pasteur estériles con algodón en la boquilla. 2. Los medios líquidos deberán hervirse 10 minutos y enfriarse inmediatamente antes de utilizarse. 3. La pipeta Pasteur debe introducirse hasta el fondo y sin formar burbujas sacarla lentamente dejando el inoculo en todo lo largo del tubo. 4. Los medios sólidos (que se habrán incubado por 6 a 24 horas en anaerobiosis para lograr mejor reducción). Se inoculan dejando una gota con la pipeta Pasteur en la superficie del agar y luego se estrían con asa de platino o de acero inoxidable. 5. Si se reciben hisopos deben agitarse primero en 0.5 ml de caldo Tioglicolato estéril y luego inocular con pipeta Pasteur como se indico. 6. Antes de descartar las pipetas prepare laminillas para la tinción de Gram y de esporas. 7. Inmediatamente terminada la inoculación de los medios introducir caja y tubos en ambiente anaeróbicos. 8. Si se reciben otros productos no habrá la misma jarra. El contacto con el oxigeno en las primeras 24 horas de crecimiento puede matar algunos géneros de anaerobios obligados.
60
Cultivo: 1. Para el aislamiento primario se sugiere como mínimo los medios de cultivo siguientes:
Gelosa Sangre de Carnero incubada en aire. Gelosa Chocolate incubada en atmósfera de CO2. Agar MacConkey incubada en presencia de oxigeno. Gelosa Sangre anaeróbica incubada en anaerobiosis. (CDC). Tioglicolato enriquecido incubado en anaerobiosis. Tioglicolato incubado en presencia de oxígeno.
2. Para la Resiembra a partir del: Tioglicolato no enriquecido después de haberse incubado en aire por espacio de 24 horas sembrar en:
Gelosa Sangre de Carnero
Tioglicolato enriquecido incubado en anaerobiosis después de 48 horas sembrar en:
Gelosa Sangre anaeróbica (CDC).
Finalmente resembrar en:
Gelosa Chocolate. a) Bacilos Gram Positivos grandes, gruesos en un fondo necrótico con pocos o ningún leucocito, en un paciente con sospecha de Gangrena gaseosa; muy probablemente se trate de un Clostridium perfringens (será muy raro observar esporas en frotis directo o cultivo primario en este microorganismo). b) Bacilos Gram Negativos pálidos, irregularmente teñidos, pleomorficos o con tinción polar en una muestra del genero Bacteroides, una Enterobacteria o un No Fermentador de glucosa. c) Bacilos Gram Negativos pálidos, filamentos, muy delgados, con puntos finos. Posiblemente Fusobacterium nucleatum. d) Grupos o Cadenas de Cocos Gram Positivos en un exudado obtenido de una herida intrabdominal con presencia de numerosos neutrofilos; posiblemente Streptococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus ó Peptocococcus. e) Bacilos Filamentosos muy aglomerados como gránulos de azufre en una lesión cervicofacial: posiblemente Actinomyces.
61
FLUJO DE TRABAJO PARA IDENTIFICACION DE ANAEROBIOS MUESTRA ADECUADA
FROTIS
SEMBRAR GELOSA SANGRE Incubar 37 AC 24 hrs. Con oxigeno IDENTIFICAR
GELOSA CHOCOLATE
CALDO TIOGLICOLATO
GELOSA SANGRE ANAEROBICA
Incubar 37 AC 24 hrs. Incubar 37 AC 48 hrs. Incubar 37 AC 48 hrs. Con dióxido de En anaerobiosis En anaerobiosis carbono IDENTIFICAR RESEMBRAR A GELOSA SANGRE ANAEROBICA CDC Incubar 37 AC 48 hrs. En anaerobiosis
SEMBRAR CADA COLONIA A CUADRITOS GELOSA SANGRE
GELOSA CHOCOLATE
GELOSA SANGRE ANAEROBICA Incubar 37 AC 48 hrs. Incubar 37 AC 48 hrs. Incubar 37 AC 48 hrs. Con oxigeno En dióxido de carbono En anaerobiosis CONTINUAR SOLO CON LOS CUADROS QUE CRECEN EN ANAEROBIOSIS HACER UN FROTIS, PURIFICAR E IDENTIFICAR. 62
PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS (TECNICA DE BAUER-KIRBY)
1) Seleccionar de 4 a 5 colonias bien aisladas del mismo tipo morfológico de un cultivo de agar en placa. 2) Transferir las colonias a un tubo con 4-5 ml de solución salina estéril y ajustar al tubo 0.5 de nefelómetro de Mcfarland. 3) La turbidez puede ajustarse con solución salina. 4) En un lapso menor de 15 minutos después de ajustada la turbiedad del inoculo humedecer un hisopo estéril en la suspensión, rotando varias veces el mismo en las paredes del tubo para quitar el exceso del liquido. 5) Inocular la superficie seca de una placa de agar Mueller-Hinton, rotándola en ángulos de 60º y frotando el hiposo. 6) En un lapso de 3 a 5 minutos, pero no mas de 15 minutos después de incubar la placa, se ponen los discos impregnados con los antibióticos apropiados. 7) Incubar la placa de manera invertida durante 16-18 horas a 35ºC. 8) Examinar la placa y medir los diámetros de las zonas de inhibición, incluyendo el
PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS (TECNICA DE BAUER-KIRBY)
1) Seleccionar de 4 a 5 colonias bien aisladas del mismo tipo morfológico de un cultivo de agar en placa. 2) Transferir las colonias a un tubo con 4-5 ml de solución salina estéril y ajustar al tubo 0.5 de nefelómetro de Mcfarland. 3) La turbidez puede ajustarse con solución salina. 4) En un lapso menor de 15 minutos después de ajustada la turbiedad del inoculo humedecer un hisopo estéril en la suspensión, rotando varias veces el mismo en las paredes del tubo para quitar el exceso del liquido. 5) Inocular la superficie seca de una placa de agar Mueller-Hinton, rotándola en ángulos de 60º y frotando el hiposo. 6) En un lapso de 3 a 5 minutos, pero no mas de 15 minutos después de incubar la placa, se ponen los discos impregnados con los antibióticos apropiados. 7) Incubar la placa de manera invertida durante 16-18 horas a 35ºC. 8) Examinar la placa y medir los diámetros de las zonas de inhibición, incluyendo el diámetro del disco. 9) Interpretar los tamaños de las zonas de inhibición de acuerdo a las tablas respectivas, y reportar al organismo como susceptibles, modernamente susceptible, intermedio y resistente.
63
64
INTERPRETACION DE PRUEBAS PRUEBAS BIOQUIMICAS
Agar Triple Azúcar Hierro (TSI). En este medio, se observa fermentación de lactosa, glucosa y sacarosa producción de ácido sulfhídrico y gas.
OBSERVACION Amarillo todo el medio
INTERPRETACION Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa Roja la superficie del medio. Fermentación de lactosa negativa, utilización de peptonas. Precipitado negro en el medio Producción de ácido sulfhídrico. Desplazamiento del medio o formación Producción de gas a partir de glucosa. de burbujas burbujas Color Reacción Abreviatura
Amarillo Ácido A
Rojo Alcalina K
Medio mio (movilidad, indol, ornitina) En este medio se observa la movilidad, la producción de indol y la descarboxilación de la ornitina.
OBSERVACIONES Si se observa crecimiento a lo largo de la picadura. picadura. Cuando difunde el crecimiento fuera de la picadura picadura y se observa observa turbio turbio el el medio. Anil An illo lo Ro Rojo jo al agre agrega garr el reac reacti tivo vo de Ehrlich ó kovacs. Anillo Amarillo al agregar el reactivo de Ehrlich. Medio color violeta Medio color Amarillo
INTERPRETACION Movilidad Negativa Movilidad Positiva Indol Positivo Indol Negativo. Descarboxilación de la Ornitina Positiva. Descarboxilación de la Ornitina Negativa.
Caldo de malonato
65
Ver la utilización del malonato como fuente de carbono.
OBSERVAION Color Azul Color Verde/Amarillo
INTERPRETACION Positivo Negativo
Agar citrato de Simmons. En este medio se va la utilización del citrato como fuente de carbono.
OBSERVACION Color Verde Color Azul
INTERPRETACION Resultado Negativo Resultado Positivo.
Agar urea de Christensen Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea, por acción de la enzima ureasa.
OBSERVACION Color Rosa Color Amarillo
INTERPRETACION Ureasa Positiva. Ureasa Negativo.
Agar de hierro y lisina (LIA) Se utiliza este medio para observar descarboxilación o desaminación de lisina.
OBSERVACIONES Morado todo el medio. Amar Amaril illo lo en el fond fondoo del del medi medioo y morado la superficie. Roja la superficie y amarillo el fondo del medio. Precipitado negro en el medio.
INTERPRETACION Descorboxilación de la lisina positiva. Descarboxilación y desaminación de la lisina negativa. Desaminación de lisina positiva. Producción de ácido sulfhídrico.
Color Reacción
Morado Alcalina
Morado claro Neutra
Amarillo Ácida
Abreviatura
K
N
A
Rojo Desaminación oxidativa. R
Prueba de la catalasa Comprobar la presencia de la enzima catalasa. 66
OBSERVACION Formación de burbujas Sin formación de
INERPRETACION Positiva Negativa.
Prueba de la oxidasa. Determinar la presencia de las enzimas oxidasas.
OBSERVACION
INTERPRETACION
La colonia toma un color rosado, después marrón y finalmente negro. No se produce produce cambio de color en las colonias, o solo adquieren un color rosado pálido por el el reactivo. reactivo.
Positiva. Negativa. Negativa.
Agar DNAasa (medio con azul de toluidina). Demostración la presencia de desoxirribonucleasa. desoxirri bonucleasa.
OBSERVACION Halos Rojo-Rosado Sin cambio de color
INTERPRETACION Positiva. Negativa
67
68
INDICACIONES PARA EL PROCESO DE LAS MUESTRAS.
Todas las muestras deberán ser procesadas en el laboratorio en cuanto sea posible. Sin embargo, si ocurriera algún retraso, el microbiológico debe estar familiarizado con el hecho de que muestras pueden ser refrigeradas y cuales no. La única muestra que puede ser refrigerada sin comprometer los resultados es la orina. Los especimenes que no deben refrigerarse son: sangre, heces (para aislamiento de Shigella) liquido cefalorraquídeo y otros líquidos corporales; muestras para anaerobios y exudado cervical y/o uretral (para aislamiento de gonococcus).
Microorganismos sensibles a alteraciones en un medio ambiente. ORGAMISMO
TIPO DE MUESTRA
COMENTARIO
N. Meningitidis
Liquido Cefalorraquídeo
Sensible al frió: procesar inmediatamente.
N. Gonorrhoeae
Genital
Requiere 5-10 % de CO 2 sensible al frió.
Shigella sp
Heces/ hisopado rectal
Sensible a cambios de temperatura y pH: procesar inmediatamente.
ORGANISMO
TIPO DE MUESTRA
COMENTARIO
H. Influenzae
Sangre, líquido cefalorraquídeo, secreción óptica y ocular.
Sensible al oxigeno
Anaerobios.
Heridas, exudados, sangre, tejidos.
Sensible al frió y O2
S. Pneumoniae,
Respiratoria.
Sensible al frio; procesar antes de 2 h.
* Todos los especimenes que contienen microorganismos sensibles al frió, deberán conservarse a temperatura ambiente o 35ºC.
69
70
CONTROL DE CALIDAD EN EL AREA DE BACTERIOLOGÍA.
1. Al inicio del día se checa la temperatura del refrigerador y de la estufa incubadora, registrando dichas temperaturas en la hoja de control. 2.Cada que se preparan Medio de Cultivos: Antes: • •
Se verifica que no estén hidratados. Después de pesar, hidratar y hervir antes de esterilizar se les ajusta el pH con el potenciómetro (peachimetro), la mayoría de ellos deberán tener un pH de 7 y solo cuando se trate de Agua Peptonada y TCBS para aislamiento de Vibrio se ajustara a un pH de 8.4 ± 2.
3. Una vez que se preparan los medios de cultivo y bioquímicas se someten a prueba de esterilidad escogiendo al azar un 5 % de cada lote que se preparo, poniéndose a incubar a 37ºC por espacio de 48 horas, finalmente se revisaran las placas y los tubos para verificar su esterilidad. 4. A los medios de cultivo que serán utilizados se les realizara prueba de selectividad, utilizando cepas conocidas. Actualmente contamos con las cepas siguientes: Vibrio CH 01, Salmonella C2, Shigella Boydii, E. Coli, Klebsiella Pneumoniae, Pseudomona aeruginosa, Morganella Morganni, Staphylococcus Aureus, Cándida Albicans, Criptococcus Neoformans, Bacillus Cereus, Haemophylus Influenzae, Listeria Monocytogenes. 5. Cada que se abre un nuevo lote de reactivo y colorantes, estos son sometidos a prueba de funcionalidad con cepas conocidas. 6. Antes de usar el potenciómetro, este se calibra con soluciones reguladoras, una de pH 4 y otra de pH 7. 7. Al equipo automatizado para hemocultivo se le realiza control de calidad diariamente antes de ser utilizado. 8. Cada semana se hace evaluación de la funcionalidad de las autoclaves del área de Bacteriología con el uso de ampolletas Sterikon. 9. Todos estos resultados son registrados en las libretas correspondientes para este fin.
TINCIONES
71
En general las bacterias y otros microorganismos son transparentes, lo que dificulta su estudio cuando los exámenes se realizan en fresco, por esta razón cuando se quieren conocer los detalles morfológicos es necesario recurrir a tinciones. Aunque existen múltiples tipos de tinciones vamos a referirnos aquí a los 2 métodos de coloración especiales mas comúnmente empleados. La tinción de Gram y la tinción de Ziehl–Neelsen.
Tinción de Gram: Fundamento Es una tinción diferencial depende de la naturaleza y composición química de la pared bacteriana. Las bacterias Gram negativas son más permeables al alcohol debido a su alto contenido de lípidos. Cuando la bacteria se tiñe con el complejo colorante básico – mordiente, este queda atrapado en las bacterias Gram Positivas y no puede ser arrastrado por el decolorante a causa de la naturaleza físico-química de su pared por el contrario en las Gram Negativas es arrastrado por su alto contenido lipídico.
Etapas de la tinción de Gram Resultados PASOS
METODO
GRAM ( + )
GRAM ( – )
Colorante Básico Mordiente Decoloración Contraste
Cristal Violeta Lugol Alcohol Cetona Safranina
Se tiñe de violeta Permanece Violeta Permanece Violeta Permanece Violeta
Se tiñe de violeta Permanece Violeta Se decolora Se tiñe de rosa.
Método: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Se realiza un extendido y dejar secar al aire posteriormente se fija con calor. Cubrir el frotis con cristal violeta y dejar durante 10 segundos. Escurrir y lavar con agua destilada. Cubrir la preparación con Lugol 10 segundos. Lavar nuevamente con agua destilada y decolorar con alcohol-cetona. Cubrir la preparación con safranina durante 10 segundos y lavar y dejar secar. Examinar con aceite de inmersión en objetivo de 100x
TINCION DE ZIEHL–NEELSEN:
72
Fundamento: El fundamento de esta técnica diferencial, se basa en la propiedad del ácido alcohol resistencia de algunas bacterias. Estos microorganismos se consideran Gram Positivos, pero se colorean difícil e irregularmente, de ahí que se emplea este tipo de tinción. Esta consigue por el calor la Fucsina penetre profundamente y puede resistir la acción de colorante de una solución de ácido- alcohol, apareciendo los bacilos de color rojo sobre un fondo azul. Se considera que la ácido-resistencia es debido al alto contenido lipídico de estas bacterias, fundamentalmente fosfolípidos, ceras y ácidos mucónicos por que esta muy ligado a los lípidos ya que es mas solubles en ellos que en el decolorante (alcohol-ácido).
Etapas de la tinción de Ziehl–Neelsen. Resultados PASOS Colorante básico Mordiente Decolorante Contraste
METODO Fucsina Calor Alcohol-ácido Azul de metileno
ACIDO-ACOHOL RESISTENTES Se tiñe de rojo Permanece rojo Permanece rojo Permanece rojo
NO ACIDOSALCOHOL RESISTENTES Se tiñe de rojo Permanece rojo Se decolora Se tiñe de azul
Método: 1. 2. 3. 4.
Realizar un frotis de 1 -2 cm. Dejar secar al aire. Fijar el frotis con calor. Cubrir el frotis con fucsina durante 5 min, calentar hasta emitir vapores, evitando que hierva y lavar con agua. 5. Decolorar con alcohol ácido durante 2 min. hasta que ya no haya restos de fucsina. 6. Lavar con agua y cubrir el frotis con azul de metileno 2 minutos. 7. Lavar y dejar secar al aire.
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES y COLORANTES
73
Medio de caty-blair Tioglicolato de Sodio Fosfato de Sodio Dibásico Na2HPO4 Cloruro de Sodio Agar Agua Destilada
1.5 g. 1.1 g. 5.0 g. 5.0 g. 991.0 ml.
PREPARACION: Disolver los ingredientes en el agua mientras se calienta en el baño María hirviendo, hasta que la solución se aclare (no se deje hervir el medio). Una vez enfriada la preparación a 50ºC, añadir 9 ml de solución de cloruro de calcio al 1% recién preparada y ajustar el pH a 8.4 (con 10 ml de hidróxido de sodio). Es importante distribuir cantidades de 7 ml en tubos limpios y esterilizados de 9 ml con tapón de rosca, dejando un pequeño espacio de aires en la parte superior y con los tapones sin enroscar.
Esterilizar a vapor fluente en una olla de presión durante 15 minutos y enroscar los tapones después de esterilizar y enfriar. Registrar la fecha del lote, rotular y almacenar en lugar oscuro y seco. Este medio de transporte puede utilizarse durante 18 meses o mas siempre que se mantenga en condiciones apropiadas de almacenamiento, periodo durante el cual no se tiene que observar ninguna perdida de volumen ni contaminación o alteración de color.
AGAR TCBS
74
(Agar tiosulfato, citrato biliares y sacarosa) El agar TCBS es altamente selectivo para el aislamiento de V. Cholerae y V. Parahemolyticus, así como también para otros vibrios. La inhibición de bacterias Gram positivas es llevado a cabo por la incorporación de oxgall, el cual es una sustancia que contiene una mezcla de sales biliares, y colato de sodio, una sal biliar nuera. El Tiosulfato de Sodio sirve como fuente de azufre y en combinación con citrato ferió, detecta la producción de ácido sulfhídrico. La sacarosa se incluye como un carbohidrato fermentable por el metabolismo de vibrios. El azul de bromotimol son indicaciones de cambios de pH.
Formula por litro de agua Extracto de Levadura Digerido pancreático de caseína Digerido peptico de tejido animal Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Oxgall, deshidratado Colato de sodio Sacarosa Cloruro de sodio Citrato férrico Azul de timol Azul de bromotimol Agar
5.0 g. 5.0 g. 5.0 g. 10.0 g. 10.0 g. 5.0 g. 3.0 g. 20.0 g. 10.0 g. 1.0 g. 0.04 g. 0.04 g. 14.0 g.
pH final 8.6 ± 0.2.
Preparación 1. Suspender 88 g del medio en polvo en 1 litro de agua destilada. 2. Calentar, agitando frecuentemente y dejar hervir por 1 minuto. 3. Enfriar a 45-50ºC y vaciar en placas de petri. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. NOTA: Así como se preparan estos medios de cultivos, se realizan los otros medios, siguiendo las indicaciones de la etiqueta de cada uno.
GRAM MODIFICADO, POR HUCKER
75
Cristal violeta (Sol. Concentrada):
Cristal Violeta………………................................................…20 g. Alcohol etílico absoluto…………………………………..…….100 ml.
Solución conc. de oxalato:
Oxalato de amonio………………………………………………..1 ml. H2O destilada………………………………………………….100 ml.
Solución de trabajo: Diluir el cristal violeta 1:10 con agua destilada y mezclar con 4 volúmenes de la solución de oxalato. Guardar en frasco con tapón esmerilado. Solución de Yodo (Lugol):
Yodo………………………………………………………….……..1 g. Yoduro de potasio……………………………………………..……2 g.
Disolver completamente en 5 ml de agua destilada y agregar:
H2O destilada………………………………………………….240 ml. Biocarbonato de sodio al 5 % en solución acuosa ………..…..60 ml.
Mezcla bien y conservado en frasco ámbar con tapón esmerillado. Alcohol – Acetona para decolorar:
Alcohol etílico absoluto………………………………………...250 ml. Acetona……………….………………………………………..250 ml.
Mezclar y conservar en frasco con tapón esmerilado. Solución de Safranina concentrada:
Safranina 0…………………………………………………….….2.5 g. Alcohol etílico absoluto………………………………………...100 ml.
Solución de trabajo: diluir la safranina 1:5 o 1:10 con tapón esmerilado.
76
CUANTIFICACION DEL ESTRIADO DE LAS PLACAS EN MUESTRAS RESPIRATORIAS. Colonias en el área estriada 1º
2º
3º
+
10
++
10
5
+++
10
5
5
++++
10
5
5
Método:
Fijar el frotis con calor. Cubrir el frotis con cristal violeta y dejar durante 10 segundos. Escurrir el colorante y lavar el resto con lugol. Cubrir la preparación con lugol y dejar 10 segundos. Lavar con agua de la llave. Decolorar con alcohol-acetona o alcohol etílico durante 10 o 20 segundos. Cubrir la preparación con safranina durante 10 segundos, lavar y dejar secar al aire. Examinar con aceite de inmersión.
Shaeffer-fulton para tinción de esporas (4). Verde de malaquita al 5 % en agua. Safranina al 0.5% en agua destilada.
Método:
Cubrir la preparación con verde de malaquita y calentar a emisión de vapor durante 1 minuto. Lavar con agua de la llave. Cubrir la preparación con safranina durante 15 minutos. Lavar con agua y dejar secar al aire. Esporas de color verde y soma celular rojo.
77
Solución de KOH al 10 % KOH…………………………….10 GRS. H2O…………………………...100 ML.
Tinción de Ziehl-Neelsen. 1. 2. 3. 4.
Realizar un frotis de 1 -2 cm. Dejar secar al aire. Fijar el frotis con calor. Cubrir el frotis con fucsina durante 5 min, calentar hasta emitir vapores, evitando que hierva y lavar con agua. 5. decolorar con alcohol ácido durante 2 min. hasta que ya no haya restos de fucsina. 6. Lavar con agua y cubrir el frotis con azul de metileno 2 minutos. 7. Lavar y dejar secar al aire.
LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Cuando hay sospecha de meningitis se recomienda el análisis químico, citológico y cultivo.
Centrifugar el espécimen a 250 rpm durante 15 minutos. Extraer el sobrenadante con una pipeta Pasteur estéril frente a un mechero pasar a otro tubo. Del sedimento se realizara el cultivo como se indica en la marcha de LCR y hacer una tinción de Gram.
NOTA: Si el paciente se encuentra bajo tratamiento de antibióticos es recomendable inocular la muestra de LCR, así como otros líquidos corporales, en un frasco de hemocultivo del sistema automatizado, estos frascos contienen factores que neutralizan el antibiótico y permiten la recuperación del microorganismo. Una vez inoculada la muestra en el frasco se siguen los procedimientos del sistema automatizado, en el manual del equipo BACTEC-9050.
78
