PRACTICA 1 FOTOCOLORIMET FOTOCOLORIMETRÍA RÍA Y CURVA DE CAL IBRACIÓN Objetivos 1. 2. 3. 4. 5.
Analizar los principios básicos de la fotocolorimetría Determinar el espectro de absorción de un compuesto coloreado Seleccionar la longitud de onda óptima o de máxima absorción Realizar la curva de calibración para una solución de albúmina Calcular concentraciones desconocidas de muestras de proteínas
As pec tos to s Teóri Teó rico co s La fotocolorimetría es un método que sirve para hallar concentraciones de diferentes muestras y para seguir el curso de una reacción en experimentos de cinética química o enzimática. La técnica consiste en medir la intensidad de luz absorbida (A) o transmitida (T) por una solución coloreada de uno o varios compuestos. La absorción máxima ocurre a una longitud de onda ( λ) característica para cada compuesto y la intensidad de la energía absorbida a esa longitud de onda, varía proporcionalmente con la concentración del compuesto en una solución. El método parece estar restringido a las sustancias coloreadas, sin embargo también se puede extender a los compuestos incoloros, haciéndolos reaccionar con una especie que genere un producto coloreado. Ab sorc so rció ió n de d e ener gía por p or sust su stanc anc ias colo co lo readas read as Una sustancia es coloreada porque absorbe y transmite radiación electromagnética en la región visible del espectro, es decir entre 400 y 800 nm ( λ). El color que se observa es una combinación de las longitudes de onda no absorbidas, y por lo tanto, transmitidas por la sustancia.
Espectro electromagnético Cuando una molécula absorbe radiación ultravioleta (U.V) o visible, lo que fundamentalmente ocurre es que se excitan los electrones de valencia que ocupan orbitales moleculares sigma ( σ) o simples, π (dobles y triples) y η (electrones no enlazados). Al absorber un fotón de energía, el electrón puede ocupar un orbital superior denominado “orbital antienlazante, (*)” generándose una de las siguientes transiciones:
Estas transiciones requieren diferente energía y por lo tanto diferente longitud de onda. Para una radiación, su contenido energético es inversamente proporcional a su longitud de onda: E = h = hc/ Donde: E = E = cantidad de energía
= h = c = =
frecuencia de la radiación constante de Planck velocidad de la luz en el vacío longitud de onda de la radiación
Las transiciones señaladas, que son las que normalmente pueden ocurrir en los compuestos orgánicos, tienen el siguiente orden de acuerdo con su energía o longitud de onda:
Se observa que la transición que ocurre más fácilmente (menor diferencia de energía) es la η - π*, y la que mas difícilmente ocurre es la σ - σ*. Las transiciones σ - σ* son las que frecuentemente ocurren en compuestos saturados y son poco útiles para fines analíticos debido a que requieren mucha energía. Las transiciones π - π* son las características de los compuestos insaturados (alquenos, alquinos, cetonas, aldehídos, ácidos carboxílicos, aromáticos), sobre todo cuando tienen dobles enlaces conjugados. Cuando esto ocurre, la transición es más fácil (menos energía) y la longitud de onda va aumentando, hasta llegar a la región visible del espectro (400 -800 nm), que es donde absorben las sustancias coloreadas. Las transiciones η - σ* y η - π* ocurren en las moléculas que tienen pares de electrones libres y aunque son relativamente poco energéticas, su probabilidad es baja; por ello son poco útiles en el campo analítico. En los complejos e iones coloreados de los metales de transición (Co, Ni, Cu, Cr, Fe, Zn, etc.), los electrones de los orbitales “d” de baja energía se promueven a orbitales “ d” de alta energía cuando la molécula absorbe radiación visible. Estas transiciones ocurren porque las moléculas que se acomplejan al ion metálico dividen a los orbitales “d” del ion en dos grupos: de alta y baja energía. Espectro de absorci absorci ón Para saber con precisión la energía (o la λ) de la transición (o transiciones) que ha ocurrido en una molécula cuando se irradia con luz U.V. o visible, es necesario determinar para ella una gráfica que relacione la intensidad de energía que se va absorbiendo a medida que se hace un barrido por la región del espectro que nos interesa (U.V. o visible, o ambos). Esta gráfica se llama espectro de absorci absorci ón, ón , y a partir de ella se puede deducir la longitud de onda en la cual el compuesto absorbe con mayor intensidad la energía, es decir, donde ocurre la transición electrónica. El conocimiento de λ de máxima absorción facilita la detección de la sustancia ya sea para determinar su concentración o para seguirle la huella en experimentos de tipo cinético.
Energía Energía absorbida y co ncentración (ley de Beer)
La intensidad de la energía absorbida por una especie depende del número de moléculas que sufren la transición electrónica a la λ seleccionada, y ese número de moléculas depende a su vez de la concentración de la especie y de la longitud de la celda que la contiene:
A
A = absorción (intensidad de la energía absorbida) c x l donde: A = c = concentración de la muestra en mol/L l = longitud de la celda en cm.
Esta expresión se vuelve una igualdad cuando se introduce una constante de proporcionalidad “ε”: (ley de Beer-Lambert) A = x c x l (ley denomina coeficiente de extinción molar o absortividad molar, con unidades M -1cm-1. Es una constante para cada especie que absorba energía en la región U.V.-visible, y su valor indica la probabilidad de que la transición electrónica ocurra.
ε Se
Ap li cac ión ió n d e la ley l ey d e Beer-Lam Beer -Lamber bertt La aplicación más importante de esta ley es la determinación de concentraciones desconocidas de soluciones de sustancias que absorben en la región U.V.-visible. Como una primera aproximación y suponiendo concentraciones cercanas a la de una muestra patrón, la ecuación de Beer-Lambert se puede usar para calcular la concentración de una muestra problema (igual sustancia que el patrón), midiendo la absorbancia de la muestra patrón ( A A pat.) y de la muestra problema ( A ( A prob.). Si las condiciones de las dos mediciones son iguales (temperatura, sustancia, aparato), se cumple que: A/C = x l = co nstan ns tante te La expresión se puede aplicar tanto a la muestra patrón como a la muestra problema, así: A pat /Cpat = A prob /Cprob luego Cprob = Cpat x A prob /A pat Para determinaciones más precisas de concentraciones desconocidas y para minimizar al máximo las desviaciones de la ley de Beer-Lambert, se acostumbra preparar una curva de calibración, a partir de una serie de soluciones patrón, cuyas concentraciones sean próximas a las de las muestras problema. Tanto a las soluciones patrón como a las muestras problema se les mide la absorbancia; con los datos de las soluciones patrón se construye la curva de calibración (A vs. C). Las absorbancias de las muestras problema se llevan a la curva y se deducen de ahí sus concentraciones.
Cuantificación d e proteínas La cuantificación de las proteínas se puede realizar por diversos métodos con base en algunas de sus propiedades, como pueden ser los patrones de absorción de las radiaciones electromagnéticas de los grupos aromáticos, la reactividad del enlace peptídico, su contenido de nitrógeno, entre otras. En la reacción de Biuret las sustancias que contengan dos o más enlaces peptídicos, interaccionan con sales de cobre en soluciones alcalinas, formando un complejo púrpura-violeta, como muestra la siguiente figura. Dicho complejo se cuantifica espectroscópicamente utilizando como base una curva patrón de proteína (generalmente con albúmina)
H
H O
N
O 2
C +
Cu2+
CH R
N
O
C +
2 H2O
N 2+Cu
CH R
N
O C CH
N
N
R
O H
Cadena peptídica
H
Complejo color violeta
Espectrofotómetros Los espectrofotómetros permiten determinar la absorbancia de la luz en numerosas sustancias orgánicas. Estos equipos fueron diseñados para medir directamente la intensidad de luz que es absorbida y/o transmitida por un compuesto en una solución. A continuación se muestran los componentes básicos de estos equipos:
En el espectrofotómetro la luz de una fuente continua (lámpara de tungsteno para el visible y lámpara de deuterio para el ultravioleta), pasa a través de un monocromador que selecciona una banda estrecha de longitudes de onda del haz incidente. Las longitudes seleccionadas atraviesan la muestra contenida en una cubeta de vidrio o cuarzo de espesor definido (l). Finalmente, se mide la potencia radiante de la luz que sale. Materiales: • • •
Fotocolorímetro Celdas del fotocolorímetro Tubos de ensayo grandes
• •
Beaker Frasco lavador
Reactivos: • • •
Reactivo de Biuret Solución patrón de gelatina (C = 8 mg/mL) Solución salina al 0.9%
Sección Experimental
A- MANEJO DEL FOTOCOLORÍMETRO.
•
Muestras problema: caseína, suero sanguíneo, gelatina (sin sabor) o albumina
Antes de empezar a tomar lecturas en el instrumento, este debe calibrarse siguiendo las recomendaciones anotadas a continuación: a. Seleccione la longitud de onda. b. Ajustar el cero en transmitancia. c. Colocar la celda o tubo que contiene la solución blanco, la cual se prepara mezclando 2 mL de reactivo de Biuret con 2 mL de agua destilada. d. Ajustar el 100% de transmitancia. e. Retirar el tubo que contiene la solución blanco. f. Colocar el tubo que contiene la solución problema. g. Leer la absorbancia o transmitancia.
B- DETERMINAR EL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE UN COMPUESTO. a. Coloque la longitud de onda en el instrumento a 420 nm. b. Preparar dos celdas o tubos con suficiente solución (aproximadamente hasta los ¾), utilizando en una, agua destilada y en la otra una solución de albúmina coloreada con el reactivo de Biuret. c. Observe que los tubos con las soluciones no tengan burbujas, límpielos externamente con un papel o tela adecuada. d. Calibre el instrumento siguiendo las recomendaciones anteriores. e. Coloque el tubo con la solución problema y anote la absorbancia o transmitancia indicada en el instrumento. f. Repita los pasos anteriores pero aumentando la longitud de onda de 20 en 20 nm (continúe tomando lecturas hasta alcanzar una longitud de onda de 620 nm). g. Recoja los datos en la siguiente tabla: λ (nm)
Absorbancia
Absorbancia
λ (nm)
420 440 460 480 500 520
540 560 580 600 620
h. Dibuje una gráfica de absorbancia vs. longitud de onda. La curva obtenida corresponde al espectro para la estructura del complejo proteínico formado por el reactivo de Biuret. Observe que se presentará una longitud de onda en la cual habrá una mayor absorción. Esta longitud de onda debe ser una constante, la cual será tenida en cuenta para posteriores análisis de albúmina.
C. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA SOLUCIONES DE ALBÚMINA a. Rotule 9 tubos de ensayo y colóqueles las siguientes soluciones como se indica en la tabla siguiente: TUBO
BLANCO
1
2
3
4
5
6
7
8
Solución Patrón (mL)
0,1
0,3
0,5
0,7
0,9
1,2
Solución Problema Solución Salina Absorbancia Concentración
2,0
1,9
1,7
1,5
1,3
1,1
0,8
0,5
1,0
1,5
1,0
b. Agregue en cada tubo 4 mL del reactivo de Biuret, mezcle bien y deje en reposo durante 15 minutos. c. Coloque en el fotocolorímetro la longitud de onda de máxima absorbancia obtenida en la experiencia sobre el espectro de absorción (numeral B), mida la absorbancia para cada uno de los tubos y anótelas en la tabla anterior. d. Calcule la concentración de proteína en cada uno de los tubos, aplicando la fórmula de dilución (C1 x V1 = C2 x V2) y tabule los resultados de la absorbancia y concentración. e. Grafique los resultados absorbancia y concentración tabulados en d, la línea resultante corresponde a la curva de calibración. f.
Del gráfico, determine la concentración de las muestras problema.
g. Calcule las concentraciones de las muestras problema utilizando la ecuación de Beer-Lambert y compárelas con las obtenidas del gráfico.
Todos los desechos se adicionan a residuos con metales Preguntas 1. ¿Qué es una curva de calibración? ¿Qué características debe cumplir? 2. ¿Se puede construir una curva de calibración con sustancias no coloreadas? 3. ¿Cuál es el objetivo de incluir un tubo blanco en las determinaciones colorimétricas? 4.- ¿Cuál es la proteína plasmática más abundante? 5. ¿Por qué no se le puede tomar un espectro de absorción a la albúmina sola? 6. ¿Por qué razón se eligió una sola longitud de onda para hacer todas las mediciones de la curva de absorción? 7. ¿Qué significado tiene la pendiente de la gráfica?
PRACTICA 2 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Objetivos 6. 7.
Separar en una muestra de suero sanguíneo, las globulinas de las proteínas totales. Calcular la concentración de proteínas totales, globulinas y albúminas en una muestra de suero sanguíneo.
As pectos teóricos Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en las células, constituyen el 50% o más de su peso seco. Se encuentran en todas las partes de cada célula, ya que son fundamentales en todos los aspectos de la estructura y función celular. Existen muchas clases de proteínas, cada una de ellas especializada en una función biológica diferente, que van desde el transporte y almacenamiento de moléculas pequeñas hasta la organización estructural de las células y los tejidos, pasando por la contracción muscular, la respuesta inmunitaria, la coagulación de la sangre y la catálisis de cientos de reacciones metabólicas. Además la información genética es expresada en su mayor parte por las proteínas. La estructura de las proteínas, así como su relación con su función biológica y actividad constituyen problemas centrales de la bioquímica actual. Clasificación de las p roteínas a. Según su comp osici ón Las proteínas se clasifican en dos tipos importantes, de acuerdo con su composición. Las proteínas simples, como la albúmina de suero sanguíneo, nada más producen aminoácidos cuando se hidrolizan; las proteínas conjugadas, producen otros compuestos además de los aminoácidos como carbohidratos, grasas o ácidos nucleicos. La porción no aminoácido de una proteína conjugada se denomina grupo prostético. b. Según su for ma tridimensional Otra forma de clasificar las proteínas es en fibrosas o globulares, según su forma tridimensional. Las proteínas fibrosas o filamentosas, por ejemplo las de colágeno y las de queratina, consisten en cadenas de polipéptidos, arreglados lado a lado en largos filamentos. Debido a que estas proteínas son muy resistentes e insolubles en agua, en la naturaleza sirven para construir materiales estructurales como tendones, pezuñas, cuernos y músculos. Las proteínas globulares, en cambio suelen estar enrolladas en forma semiesférica y compacta. Estas proteínas son por lo general solubles en agua y se mueven dentro de las células. La mayor parte de los varios millares de enzimas conocidas son proteínas globulares. Otros ejemplos, son la insulina y la hemoglobina.
c. Según su solubi lidad Según este parámetro, las proteínas reciben algunos de los siguientes nombres: •
Albúminas, cuando son solubles en agua y en soluciones acuosas salinas diluidas.
• • • •
Globulinas, solubles en soluciones salinas diluidas pero poco solubles en agua. Se precipitan en soluciones semisaturadas de sulfato de amonio. Prolaminas, solubles en etanol entre 70 y 80% e insolubles en agua. Histonas, solubles en soluciones salinas. Glutelinas, insolubles en agua, etanol y soluciones salinas, pero solubles en soluciones ácidas y básicas diluidas.
Proteínas del suero sanguíneo La sangre es el tejido líquido que circula dentro de los vasos sanguíneos, compuesto casi en la mitad de su volumen por células como los glóbulos rojos o eritrocitos, glóbulos blancos o leucocitos, plaquetas y por el plasma, que es la porción no celular y que es el líquido que mantiene a las células en suspensión. Cuando la sangre se coagula, aparece un líquido remanente que se llama suero, y que se diferencia del plasma porque ya no contiene los factores de coagulación como la proteína fibrinógeno. Aunque el plasma sanguíneo contiene una compleja mezcla de sustancias solubilizadas, sus proteínas representan el 75% de ellas, y una concentración que oscila entre 6 y 8 g por cada 100 mL de suero. Las principales proteínas del suero sanguíneo son: •
Albúmina: con una concentración de 3 a 4.5 g por 100 mL de suero, es el mayor contribuyente a la presión osmótica intravascular. Su función principal es la de transportar ácidos grasos y medicamentos. Los ácidos grasos los llevan desde los adipocitos, donde se generan por hidrólisis de los triacilgliceroles, hasta los tejidos que los requieren para su oxidación. Globulinas: Son los anticuerpos encargados de la defensa de nuestro organismo frente a las infecciones. Es un conjunto heterogéneo de proteínas que a veces se designan como α, β y γ-globulinas y alcanzan una concentración en la sangre entre 3 y 3.5 g por 100 mL.
Métodos para aislar y p urifi cas proteínas Con el fin de preparar extractos proteínicos a partir del complejo medio celular, se han desarrollado técnicas que se fundamentan en las diferencias que presentan ellas en su tamaño, su carga, su masa, su solubilidad y su afinidad por otras moléculas. Estás técnicas son: la centrifugación, la electroforesis, la cromatografía, la diálisis, ultrafijación y diferencias en la solubilidad en diferentes medios. En esta práctica se pretende usar las técnicas de centrifugación y fotocolorimetría para separar y cuantificar la concentración de albúmina y globulinas en el suero sanguíneo, respectivamente. El empleo del reactivo de Biuret en soluciones con concentraciones diferentes de proteínas, permitirá la medida de la absorbancia para cada concentración. La determinación precisa de éstas se podrá deducir del dato de absorbancia tomado a una solución patrón de proteína (con concentración conocida) de la siguiente manera: Cprob = Cpat x A prob /A pat Donde: A pat. Y Cpat. = son la absorbancia y concentración de la soluci ón patrón, respectivamente. A prob. Y Cprob. = son la absorbancia y la concentración de la muestra problema, respectivamente. Materiales: • • •
Fotocolorímetro Celdas del fotocolorímetro Tubos de ensayo grandes
Reactivos:
• • •
Beaker Frasco lavador Centrífuga
• • •
Solución acuosa de NaCl al 0.9% Solución saturada de (NH4)2SO4 (750 gr en 1 L de agua) Solución patrón de albúmina o gelatina (0.45 gr en 100 mL de solución salina)
• •
Solución de biuret Muestra de suero sanguíneo humano
Sección Experimental A. Separación de las globul inas del suero. a. Coloque en un tubo de centrífuga 1 mL de suero sanguíneo y 4 mL de agua destilada. b. Agregue a la solución anterior 5 mL de solución saturada de sulfato de amonio, gota a gota y agitando
suave pero constantemente. c. Deje reposar durante 15 minutos la solución obtenida en b. Luego centrifugue a 2000 r.p.m, por espacio de 15 minutos. El precipitado obtenido corresponde a las globulinas. d. Separe el líquido sobrenadante de las globulinas y disuelva este precipitado en 5 mL de una solución
salina. Conserve esta solución para determinar el porcentaje de globulinas. B. Preparación de la sol ución de proteínas totales. e. Mida 1 mL de suero sanguíneo en una probeta y dilúyalo hasta completar 20 mL agregándole solución
salina. C. Medició n de la absorbancia en las sol ucion es que contienen proteínas. f.
Disponga de 4 tubos de ensayo y prepare en cada uno de ellos las soluciones, como se indica en la siguiente tabla: TUBOS
BLANCO (mL)
Solución salina Solución patrón Solución de globulinas Suero diluido 1:20 Solución de Biuret
1,0
PATRÓN (mL)
GLOBULINAS (mL)
PROTEÍNAS TOTALES (mL)
ABSORB ANCIA
1,0 1,0 1,0 4,0
4,0
4,0
4,0
g. Agite cada tubo y déjelo reposar 30 minutos. h. Lleve cada uno de los tubos al fotocolorímetro, fijado en una longitud de onda (λ ) de 540 nm. Luego de
una previa calibración con el blanco, anote los resultados de absorbancia registrados en el instrumento.
Todos los desechos se adicionan a residuos orgánicos con metales1
1
Los residuos de suero sanguíneo se depositan en un recipiente que contenga una solución de hipoclorito de sodio
Resultados a. Dilución del patrón: Calcule la concentración final de la solución patrón de proteínas aplicando la fórmula:
C f = C iV /V i f b. Concentración de pr oteínas totales en el s uero: Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrón con las de proteínas totales y calcule el porcentaje de estas últimas: (%) proteínas totales =
(%) sln patrón x Absorbancia (proteínas totales) Absorbancia (sln patrón)
Sin embargo, esta concentración corresponde a 1 mL de solución de suero sanguíneo, el cual fue diluido primero 20 veces y luego 5 veces de manera que el resultado final debe ser: 20 x 5 x (%) proteínas totales c. Concentración de las globul inas: Relacione los resultados de absorbancia de las soluciones patrón y de albúmina obtenida con el porcentaje de la solución patrón y calcule el porcentaje de la solución de globulinas: (%) globulinas =
(%) sln patrón x Absorbancia (sln globulinas) Absorbancia (sln patrón)
Sin embargo esta concentración corresponde a la solución de globulinas preparada según la tabla 5-1, la cual fue obtenida por dilución 1:5:5. En esta forma la solución original del suero sanguíneo debe tener una concentración 25 veces mayor, o sea: 5 x (%)
sln globulinas x
La dilución con 5 mL de solución salina
5
Debido a la dilución 1.0 + 4.0 según la tabla
d. Concentración de albúmina de suero: El porcentaje de albúmina se determina restando de las proteínas totales el resultado de las globulinas: (%) Albú min a = % Proteína Total - % Globulin as Preguntas 1. Compare los porcentajes hallados para las globulinas y la albúmina, con los reportados como normales para el suero. ¿Existen diferencias? ¿Por qué? 2. Consulte la función de las sales de sulfato de amonio y cloruro de sodio en el procedimiento de separación de globulinas.
PRACTICA 3 TIROSINASA I: Efecto del pH y la Temperatura sobre la Actividad Enzimática Objetivos 8. Extraer el enzima tirosinasa de diferentes fuentes (banano, manzana, papa). 9. Determinar la actividad de la tirosinasa utilizando como sustrato el L-DOPA. 10. Comparar los resultados de actividad de la tirosinasa a diferentes concentraciones y de diferentes fuentes. 11. Determinar el efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad enzimática. 12. Deducir el pH óptimo en el cual actúa la enzima tirosinasa. As pectos teóricos Catálisis enzimática. Las enzimas son catalizadores biológicos que aumentan las velocidades de las reacciones bioquímicas. Estas son altamente específicas, esto significa que una enzima solo actúa en determinadas moléculas, denominadas sustratos mientras dejan el resto del sistema sin afectar. Se ha calculado que una célula viva puede contener en promedio alrededor de 3000 enzimas diferentes, cada una de las cuales cataliza una reacción específica en la que un sustrato se convierte en los productos adecuados. La catálisis enzimática es homogénea porque el sustrato y la enzima están presentes en di solución acuosa. Una enzima es, básicamente una proteína, que contiene uno o más sitios activos, donde se llevan a cabo las interacciones con los sustratos; aunque se ha descubierto actividad catalítica en algunos ARN, a los cuales se les denomina ribozimas. Estos sitios, en forma estructural, son complementarios de las moléculas de un sustrato específico, como se muestra en la siguiente figura:
Pardeamiento enzimático La coloración café oscuro que se va formando en la superficie de algunas frutas y vegetales cuando se cortan, se denomina pardeamiento, y se debe a la acción de la enzima tirosinasa, que es una monofenoloxidasa, sobre el aminoácido tirosina, que en presencia de oxígeno, lo va convirtiendo secuencialmente en dopa, dopaquinona y dopacromo (café oscuro), hasta que termina en un pigmento muy oscuro llamado melanina. HO
COOH
COOH
O2
NH2
O O2
NH2 HO
HO
NH2 O Dopaquinona
DOPA
Tirosina
COOH
Tirosinasa
Tirosinasa
H N
O
O
CO2
O COOH
O O
O
N H
N
O Melanina
H
O
N Dopacromo H
En esta práctica se pretende extraer la enzima tirosinasa de varias fuentes vegetales (banano, manzana y papa), y ponerla en contacto con el sustrato L-metildopa, hasta convertirlo en el compuesto Lmetildopacromo, que es de color café oscuro; la concentración de éste se puede seguir fotocolorimétricamente a una λ de 420 nm, que es donde presenta su máxima absorbancia. O
CH3 HO
COOH
CH3
Tirosinasa
COOH O2 NH2 HO L-metildopa (incolora)
N
O
L-metildopacromo H (café oscuro)
La medida de la absorbancia a través del tiempo sirve para cuantificar la velocidad de la reacción en términos de la cantidad de L-metildopacromo que se va formando, o la de L-metildopa que va reaccionando: Ab sorb./ t = velocidad = + d [L-matildopacromo]/d t = - d [ L-metildopa]/d t Obtención del extracto enzimático Se conoce como extracto enzimático a una fracción de material animal, vegetal o microbiano, que contiene una mezcla de varias sustancias pero que se caracteriza por presentar actividad de una o varias enzimas La preparación general de un extracto enzimático se inicia con la adición al material seleccionado una solución amortiguadora, que garantice la conservación de la actividad de la enzima objeto de la extracción. Luego, se tritura en un mortero, se filtra y centrifuga para separar los residuos poco solubles. Medida de la actividad enzimática Las velocidades de varias reacciones enzimáticas se pueden usar para comparar la eficiencia de las enzimas involucradas cuando se expresan en términos de la cantidad usada de éstas. Ello significa que:
Actividad Enzimática = Velocidad de la reacción/Cantidad de enzima Si se conoce con precisión la concentración molar de la enzima usada, la expresión anterior se llamará actividad molar de la enzima:
Actividad molar = Veloc./[E] = d[S]/dt x [E] =
sustrato / enzima x
t
Donde son moles Este valor representa las moles de soluto que es capaz de transformar en producto un mol de enzima por unidad de tiempo. Esto recibe el nombre de actividad molar de la enzima. Si no se conocen las cantidades exactas de las enzimas empleadas, se puede usar como factor de comparación el volumen de los extractos enzimáticos preparados en condiciones similares; no se podrá hablar de actividad molar, sino simplemente de actividad enzimática: Ac tividad enzi mátic a =
reacción/vol. extracto enzimático
= d [ s]/d t x mL extracto = [s] sustrato /mL extracto x t De donde [s] sustrato / t se puede determinar indirectamente de la pendiente de un gráfico de Absorbancia vs tiempo, ya que la concentración de sustrato está relacionada con la absorbancia mediante la ecuación de Beer-Lambert. Variables q ue afectan la activid ad enzimática Las enzimas son macromoléculas proteínicas cuya actividad catalizadora se ve influenciada por varios factores: concentración del sustrato y de la enzima, la ausencia o presencia de cofactores, inhibidores y efectores, el aumento o disminución de la temperatura y las variaciones del pH.
Para visualizar las mejores condiciones que garanticen el óptimo funcionamiento de una enzima, se tendrá que proceder a la evaluación de su actividad catalítica, ya sea midiendo la velocidad inicial de la reacción enzimática en función de uno de los parámetros mencionados anteriormente, o determinando la presencia o ausencia de un sustrato o de un producto de la reacción, a medida que se varía uno de los parámetros. Efecto de la concentración d e la enzima sobre la velocid ad de la reacción La evaluación del efecto de la concentración de la enzima se hizo en la región de la curva hiperbólica de V i vs [S ], donde la cinética es de orden cero con respecto al sustrato. Ahí, la enzima se encuentra completamente saturada y habrá sustrato en exceso. Al adicionar más cantidad de enzima, se encontró un aumento lineal en la velocidad de reacción, proporcional a la cantidad de enzima agregada.
Efecto del pH sob re la actividad enzimática La mayoría de las enzimas poseen un pH característico al cual su actividad es máxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye. Aunque los perfiles de las curvas de actividad en función del pH de muchas enzimas son acampanados, pueden cambiar considerablemente de forma, como se muestra en la figura siguiente:
Del gráfico podemos observar que existe un pH (o un rango de pHs) en el cual la actividad de la enzima es máxima: • • • •
Para la tripsina, que hidroliza péptidos en el intestino, el pH óptimo está alrededor de 8. Para las colinesterasas, que se encuentran principalmente en la sangre y en el hígado y catalizan la hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina, trabajan en un rango de pH entre 7.5 y 10. Para la pepsina, que funciona en el estómago, el pH óptimo estará cercano a 2.5. La papaína, que es una peptidasa aislada de la papaya, trabaja bien en un rango de pH entre 5 y 9.
La relación entre el pH y la actividad de cualquier enzima depende principalmente del comportamiento ácidobase de la enzima y del sustrato. La forma de la curva de actividad-pH varía con la concentración del sustrato, ya que el valor de K M de muchas enzimas varía con el pH. Las mencionadas curvas son mucho más significativas si la enzima se mantiene saturada con el sustrato en todos los valores de pH a los que se experimenta. En muchos estudios de cinética e nzimática, el pH se mantiene constante al pH óptimo. El pH óptimo de una enzima no es necesariamente idéntico al pH de su entorno intracelular normal, el cual puede hallarse a su vez en la pendiente ascendente o descendente de su curva de pH-actividad. Este hecho sugiere que la relación pH-actividad de una enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su actividad.
Efecto de la temperatura sobre l a actividad enzimática Al igual que ocurre con la mayoría de reacciones químicas, la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa en general con la temperatura, dentro del intervalo en que la enzima es estable y permanece totalmente activa. La velocidad de muchas reacciones enzimáticas se duplica, aproximadamente, por cada 10 ºC de aumento de la temperatura. Aunque las reacciones catalizadas por las enzimas parecen, con frecuencia, poseer una temperatura óptima, como muestra la figura siguiente, el pico que se observa al representar la actividad catalítica frente a la temperatura se produce porque las enzimas, al ser proteínas, se desnaturalizan por la acción del calor y se inactivan cuando la elevación de la temperatura sobrepasa un cierto punto. La aparente temperatura óptima es, por lo tanto, la resultante de dos procesos: • •
El incremento habitual de la velocidad de reacción con la temperatura, y, El incremento en la velocidad de desnaturalización térmica de la enzima al sobrepasar una temperatura crítica.
Aunque la mayoría de enzimas se inactivan a temperaturas comprendidas entre 55 y 60 ºC, algunas de ellas son completamente estables y conservan su actividad a temperaturas muy superiores; por ejemplo, las enzimas de diversas especies de bacterias termofílicas que habitan en las termas de agua siguen siendo activas a temperaturas superiores a los 85 ºC.
Materiales: • • • • • • •
Fotocolorímetro Celdas del fotocolorímetro Tubos de ensayo grandes Mortero Silica gel Baño maría Baño de agua hirviendo
• • • • • • •
Baño de hielo Beaker Frasco lavador Centrífuga Lienzo Tubos de ensayo grande Pipeta
Reactivos: • • •
Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 4.0, 5.0, 7.2, 7.5. Solución buffer 0.1 M de borato pH= 8.0, 9.0 y 10.0 Solución de L-metildopa 0.03M en buffer pH = 7.2
• •
Fuente de tirosinasa (banano, manzana y papa) Hielo picado
Sección Experimental Nota: esta práctica está dividida en cuatro partes, se recomienda que la parte A y B la realice todo el grupo, y la C y D se distribuya en dos equipos y al final se compartan los resultados. A. Ex tracción de la enzima a. Coloque 10 g de la fruta en el mortero preenfriado y adiciónele 10 mL de buffer de fosfato 0,1M (pH=7,2). b. Adicione unos 3 gramos de silica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta sólida. c. Filtre utilizando un paño y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM. d. La solución sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo. e. Diluya la solución sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta solución como extracto diluido 10 veces. El extracto de manzana no se diluye. Rotule esta solución como extracto enzimático.
B. Medida de la actividad enzimática a. En un tubo de ensayo prepare una solución blanco mezclando: • • •
1 mL del extracto enzimático 3 mL de buffer pH = 7.2 1 mL de agua destilada.
b. Calibre el fotocolorímetro, utilizando la solución anterior, a λ = 420 nm. c. Mezcle en otro tubo de ensayo: • • •
1 mL de extracto enzimático 3 mL de buffer pH = 7.2 1 mL de solución de L-metildopa
d. Inmediatamente después de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colóquelo en el fotocolorímetro y lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero. e. Anote las absorbancias registradas en el fotocolorímetro cada 30 segundos durante 5 minutos. f.
Repita los pasos c hasta e en otros 3 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de solución de extracto enzimático de la siguiente manera: • • •
Adicione a cada tubo, respectivamente, 1.5, 2.0 y 2.5 mL de extracto. Complete cada tubo hasta 4 mL con buffer pH = 7.2 Agregue a cada tubo, a penas vaya a leer en el fotocolorímetro, 1 mL de la solución de Lmetildopa.
g. Tabule los resultados en la siguiente tabla: Tiempo (min)/Tubo 0.5 1.0
1
2 3 Absorbancia
4
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 C. Medida de la activid ad enzimática con cambio de la temperatura a. En un tubo de ensayo adicione 2.0 mL de extracto de enzima y 3.0 mL de solución de buffer pH = 7.2 b.
Introduzca el tubo en un baño maría a 37 oC durante 5 minutos
c. Cuando el tubo se haya enfriado, agréguele 1 mL de L-metildopa, agite y mida la absorbancia igual que en el caso anterior. d. Tabule los resultados en la siguiente tabla: Tiempo (min) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Absorbancia 4 oC
Absorbancia 37 oC
Absorbancia 95 oC
e. Repita el procedimiento anterior pero utilice primero un baño de hielo y después en un baño de agua hirviendo a 95 oC. Tabule sus resultados en la tabla anterior.
D. Efecto del pH sobre la actividad de enzimática: a. Marque 12 tubos de ensayo y adicione a cada uno de ellos lo que muestra la siguiente tabla:
Tubo
B1
A1
B2
A2
3
2
B3
A3
3
2
B4
A4
Buffer pH 4.0 Buffer pH 5.0 Buffer pH 8.0 Buffer pH 9.0 Buffer pH 10.0
3
2
Extracto
2
2
2
2
2
2
2
L-metildopa
-
1
-
1
-
1
-
B5
A5
3
2 3
2
2
2
2
1
-
1
b. Mida el pH resultante en cada uno de los tubos c. Incube los tubos 5 minutos en un baño a 37-40 oC. d. Adicione a los tubos A1 y B1 1 mL de L-metildopa y agite. e. Calibre el fotocolorímetro con la solución B1 a λ = 420 nm f.
Lea la absorbancia de la solución A1 y anótela
g. Repita los pasos b hasta f para los otros tubos h. Tabule los resultados en la siguiente tabla: Tiempo (min)/Tubo
A1
A2 A3 Absorbancia
A4
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Todos los desechos se adicionan a residuos orgánicos no halogenados
Resultados a. Con los resultados de las dos tablas, haga los gráficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y de ellos, calcule las pendientes de las curvas y multiplique estos valores por los factores de dilución así: • •
Tubo 1: m1 x 10/1.0 = A.E 1 Tubo 2: m2 x 10/1.5 = A.E 2
• •
Tubo 3: m3 x 10/2.0 = A.E 3 Tubo 4: m4 x 10/2.5 = A.E 4
Donde m es la pendiente de la curva y A.E es la actividad enzimática. La actividad enzimática con variación de la temperatura y del pH se calcula igual que el tubo 3. Absorvancia A2
m=
A2 - A1 t2 - t1
A1 t1
t2 tiempo
b. Analice la actividad enzimática de los tubos 1-4, ¿cual es la explicación? c. Analice la actividad enzimática del tubo 3 en la primera parte con los obtenidos con cambio de la temperatura (haga el grafico de actividad enzimática vs temperatura) ¿cuál es la explicación? d. Analice la actividad enzimática del tubo 3 en la primera parte con los obtenidos con cambio del pH (haga el grafico actividad enzimática vs pH) ¿cuál es la explicación e. Compare sus resultados con los resultados obtenidos para otra fruta Preguntas 1. Cuando se trabaja con manzana el extracto no es recomendable diluirlo ¿Por qué? 2. ¿Cuál es la función de la tirosinasa en los animales superiores? 3. De acuerdo con los resultados obtenidos en la práctica, ¿Cuál es la interpretación y explicación que se le da a la fruta o frutas que tienen una mayor concentración de tirosinasa? 4. ¿Qué se podrá recomendar (y que no se podrá recomendar), para evitar el pardeamiento de las frutas y las papas cortadas? Referencia Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical Education, 54, 4, 1977, p: 257.
PRACTICA 4 TIROSINASA II: Determin ación de la cons tante Michaelis-Menten y la velocidad máxima Objetivos 13. Determinar la actividad de la tirosinasa al variar la concentración del sustrato (L-metildopa). 14. Determinar el valor de KM para la tirosinasa mediante el método de la curva hiperbólica de Michaelis– Menten y la ecuación de los inversos o de Lineweaver–Burk. As pectos teóricos Cinética química La cinética química es el estudio de las velocidades de las reacciones químicas y de los factores que influyen en ella. La velocidad de la reacción es una medida de la rapidez con que se forman los productos a partir de los reactantes. Las reacciones químicas pueden clasificarse sobre una base cinética por el orden de reacción, entre estas tenemos: reacciones de orden cero, de primer orden, de segundo orden y de tercer orden, según como resulte influida la velocidad de la reacción por la concentración de los reaccionantes bajo un conjunto de condiciones determinado como son la temperatura y la adición de catalizadores. Las reacciones de primer orden son las que tienen lugar a una velocidad directamente proporcional a la concentración de un reaccionante. El ejemplo más sencillo es cuando la velocidad de la reacción: A
B
es directamente proporcional a la concentración de A. En este caso la velocidad de la reacción en cualquier tiempo t, viene dada por la ecuación: -d [A] / dt = k [A] en donde [A] es la concentración molar de A y - d [A] / dt es la velocidad a que disminuye la concentración de A. La constante de proporcionalidad k recibe el nombre de constante de velocidad, la cual, tiene dimensiones del recíproco del tiempo, s -1. La forma integrada de esta ecuación es: ln [A]
y
=
=
(- k ) (t) + ln [A]0
m
x
ó
log
[A0] [A]
=
k t
2.303
+ b
donde ln es el logaritmo natural, [A] 0 y [A] son las concentraciones de A a los tiempos t = 0 y t = t, respectivamente. Debe aclararse que t = 0 no corresponde al principio del experimento; puede seleccionarse cualquier tiempo para empezar a medir el cambio en la concentración de A. Por lo tanto, una gráfica de ln [A] contra t es una línea recta con una pendiente –k. Este análisis gráfico permite calcular la constante de velocidad k, como se muestra en la figura siguiente:
Para una reacción de primer orden, el tiempo de vida media viene dado por la siguiente expresión: t ½ = 0.693 / k
la anterior ecuación indica que la vida media de una reacción de primer orden es independiente de la concentración inicial del reactivo. Una reacción de segundo orden es una reacción cuya velocidad depende de la concentración de uno de los reactivos, elevada a la segunda potencia o de la concentración de dos reactivos diferentes, cada uno elevado a la primera potencia. El caso mas sencillo comprende solo una clase de molécula como reactivo: 2A
C
la ecuación de velocidad de segundo orden es:
- d [A] / dt = k [A] 2 La constante de velocidad de las reacciones de segundo orden tienen unidades de 1/ M x s. Por medio del cálculo, se puede obtener la siguiente expresión para la ecuación anterior: 1 [A]
=
1 [A]0
+
kt
por lo tanto, una gráfica de 1/[A] contra t, es una línea recta con una pendiente k:
Otro tipo de reacción de segundo orden es: A
+ B
C
donde la ley de velocidad esta dada por: - d [A] / dt , - d [B] / dt ó d [C] / dt
velocidad = k [A] [B] la reacción es de primer orden respecto de A y de primer orden respecto de B, por lo que tiene un orden global de 2. El tiempo de vida media viene dado por: t ½ = 1 / k [A] 0 Observe que la vida media de una reacción de segundo orden es inversamente proporcional a la concentración inicial del reactivo. Las mediciones de la vida media a diferentes concentraciones iniciales es una forma de distinguir entre una reacción de primer orden y una de segundo orden. Las reacciones de tercer orden, que son relativamente escasas, son aquellas cuya velocidad es proporcional al producto de tres términos de concentración. Algunas reacciones químicas son independientes de la concentración de cualquier reactivo; son llamadas reacciones de orden cero. En este caso, la velocidad depende de la concentración del catalizador o de algún otro factor distinto a la concentración de las especies moleculares que experimentan la reacción. Cinética enzimática: Ecuación de Michaelis-Menten Los principios generales de la cinética química de las reacciones químicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, pero éstas muestran también un rasgo característico, que no se observa en las reacciones no enzimáticas: la saturación con el sustrato. En la figura siguiente vemos el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción catalizada por una enzima.
A una concentración baja de sustrato, la velocidad inicial de la reacción o es casi proporcional a la concentración del sustrato y la reacción, por tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la concentración de sustrato aumenta, la velocidad inicial de la reacción disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a la concentración de sustrato; en esta zona el orden de reacción es mixto. Con un aumento posterior de la concentración del sustrato, la velocidad de la reacción llega a ser esencialmente independiente de la concentración de sustrato y se aproxima asintóticamente a una velocidad constante. En este intervalo de concentraciones de sustrato la reacción es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato, y se dice que la enzima se halla saturada con su sustrato. Todas las enzimas muestran el efecto de saturación pero varían ampliamente con respecto a la concentración de sustrato que se necesita para que se manifieste. El efecto de saturación condujo a algunos investigadores a formular la hipótesis de que la enzima y el sustrato reaccionan reversiblemente para formar un complejo, como etapa esencial en la reacción catalizada. L. Michaelis y M. L. Menten desarrollaron una teoría general acerca de la acción y cinética de las enzimas. Esta
teoría que es fundamental para el análisis cualitativo de todos los aspectos de la cinética de las enzimas y de la inhibición, se ha desarrollado para el caso sencillo de una reacción en la que sólo hay un sustrato.
La teoría de Michaelis-Menten supone que la enzima E se combina en primer lugar con el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES; a continuación este último se divide en una segunda etapa, para formar la enzima libre y el producto P: E +
S ES
k +1 k -1 k +2
ES E + P
k -2
La ecuación de Michaelis-Menten es la ecuación de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas que sólo actúan sobre un sustrato, y se formula como sigue: v o = V m a x [ S ] K M + [ S ]
De donde:
o =
velocidad inicial V max = velocidad máxima [S ] = concentración del sustrato K M = constante de Michaelis-Menten
De la ecuación de Michaelis-Menten se deriva una relación numérica en el caso especial en que la velocidad inicial de la reacción sea exactamente la mitad de la velocidad máxima; es decir, cuando 0 = ½ V max (ver figura anterior) K M = [S ].
La constante de Michaelis-Menten de una enzima constituye una característica útil e importante, que es fundamental no sólo para la descripción matemática de la cinética enzimática, sino también para la determinación cuantitativa de la actividad enzimática en los tejidos y el análisis de algunos mecanismos de regulación enzimática. Transformaciones de la ecuación de Michaelis-Menten La ecuación de Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente en otras formas que son más útiles para la expresión de los datos experimentales. Una de las transformaciones más corrientes se obtiene tomando los recíprocos de ambos miembros de l a ecuación de Michaelis-Menten: 1 1 = K M + 1 V m áx V v 0 m áx [ S ]
La ecuación anterior es la ecuación de Lineweaver-Burk. Cuando 1/ 0 se representa frente a 1/ [S], se obtiene una línea recta. La pendiente de la recta es K M/ V máx , y la intersección sobre el eje 1/ 0 es 1/V máx ; la intersección sobre el eje 1/ [S ] es -1/ K M, como muestra la figura siguiente:
Tal representación doble recíproca tiene la ventaja de que permite una determinación mucho más exacta del valor de V máx , ya que en la representación sencilla de 0 frente a [S] sólo se obtiene su valor aproximado. Otra transformación útil de la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene al multiplicar esta por Vmáx, y de un posterior reagrupamiento se obtiene la siguiente ecuación: v 0 = - K M
v 0 [ S ]
+ V m áx
La representación de 0 frente a 0/ [ S ], llamada representación de Eadie-Hofstee, da los valores de V máx y de K M de una forma sencilla, como muestra la figura siguiente:
Efecto de la concentración d el sustrato so bre la actividad anzimática Esta relación para un sustrato, fue estudiada por los señores Michaelis y Menten, quienes al medir la velocidad inicial (V ii ) en numerosos experimentos donde se mantenía constante la concentración de la enzima y se iba aumentando la concentración del sustrato, encontraron que: •
A bajas concentraciones del sustrato, sustrato, la velocidad de la reacción dependía proporcionalmente proporcionalmente de este, siguiendo una cinética de primer orden: V ii = = K [S] ; lo que significa que como aún la cantidad de enzima presente no ha sido totalmente saturada por el sustrato, a medida que éste aumenta, la enzima actúa sobre él, y la velocidad de la reacción se va incrementado.
•
A altas concentraciones del sustrato, sustrato, la velocidad de la reacción era independiente de su concentración, siguiendo una cinética de orden 0: V ii = V M M. Ello indica que en condiciones de altas concentración del sustrato, la enzima se halla saturada por éste, y la reacción ya ha llegado a su máxima velocidad ( V M M). Al adicionar más sustrato, la velocidad no aumenta porque no hay enzima enzima disponible para ello.
Gráficamente, la relación hallada entre la velocidad de la reacción y la concentración del sustrato fue de tipo hiperbólico, como describiendo una transición desde la cinética de primer orden hasta la cinética de orden cero:
Materiales:
• • • • •
Fotocolorímetro Celdas del fotocolorímetro Tubos de ensayo grandes Mortero Silica gel
• • • •
Beaker Frasco lavador Centrífuga Lienzo
Reactivos: • • •
Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 7.2 Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 6.0 Solución de L-metildopa 0.03M en buffer pH = 6.0
• •
Fuente de tirosinasa (banano, manzana y papa) Hielo picado
Sección experimental A. Ex tracc tr acc ión ió n d e la enzim en zima a f.
Coloque 10 gramos de banano en el mortero preenfriado y adiciónele 10 mL de buffer de fosfato 0,1M (pH=7,2).
g. Adicione unos 3 gramos de silica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta sólida. h. Filtre utilizando un paño y centrifugue centrifugue el filtrado filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM. i.
La solución sobrenadante se decanta decanta y se coloca en un vaso con hielo.
j.
Diluya la solución sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta solución como extracto diluido 10 veces.
B. Medida de la actividad enzimática a. Prepare una solución blanco mezclando: • • •
1.0 mL del extracto enzimático 3.0 mL de buffer pH = 6.0 1 mL de agua destilada.
b. Calibre el fotocolorímetro, utilizando la solución anterior, anterior, a λ = 420 nm. c. Mezcle en otro tubo de ensayo: • • •
1.0 mL de extracto de enzima 3.5 mL de buffer pH = 6.0 0.5 mL de solución de L-metildopa
d. Inmediatamente después de agregar el sustrato sustrato (L-metildopa), agite, colóquelo en el fotocolorímetro y lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero. e. Anote las absorbancias absorbancias registradas en el fotocolorímetro fotocolorímetro cada 30 segundos durante 5 minutos. f.
Repita los pasos h hasta j j en otros 5 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de sustrato de la siguiente manera: •
Adicione a cada tubo 1.0 mL de extracto enzimático.
• •
Agregue a cada tubo, respectivamente, a penas vaya a leer en el fotocolorímetro, fotocolorímetro, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 y 3.0 mL de la solución de L-metildopa. Complete cada tubo hasta 5 mL con buffer pH = 6.0
g. Tabule los resultados en la siguiente tabla: (min)/ tubo t (min)/
1
2
3 4 Absorbancia
5
6
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Todos los desechos se adicionan a residuos organicos no halogenados Resultados b. Con los resultados obtenidos, haga los gráficos correspondientes correspondientes de Absorbancia vs tiempo y de ellos, calcule las pendientes de las curvas y considere este valor como la velocidad inicial (V ii ), [ S]. para cada concentración de sustrato [S c. Calcule la nueva concentración de sustrato aplicando la fórmula general de dilución: v 1 [ S ] i [ S ] f = v 2
Donde: [S [S]f = concentración final del sustrato [S]i = concentración inicial del sustrato (0.03M) v 22 = volumen final de la solución (5 mL) v 1 = volumen adicionado de sustrato d. Con los datos obtenidos en los numerales a y b llene la siguiente tabla: Tubo 1 2 3 4 5 6
[S ]f
V ii
1/[S ]
1/V ii
e. Haga una gráfica de V ii vs [S [S] y de 1/V ii vs 1/ [S [S] y de estas determine los valores de K M M y V max max . f.
Compare los valores obtenidos por ambos métodos y determine cual es el más apropiado, explique.
Referencia Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical Education, 54, 4, 1977, p: 257.
PRACTICA 5 TIROSINASA III: Efecto de un inhib idor sobre l a constante Michaelis-Menten y la velocidad máxima Objetivos 15. Determinar la actividad de la tirosinasa al variar la concentración del sustrato (L-metildopa) en presencia de NaCN como inhibidor. 16. Determinar el valor de KM para la tirosinasa mediante el método de la curva hiperbólica de Michaelis– Menten y la ecuación de los inversos o de Lineweaver–Burk en presencia de un inhibidor. 17. Determinar el tipo del inhibidor y su constante. As pectos teóricos Inhibició n de las enzimas Las enzimas catalizan todos los procesos celulares, por lo que no es sorprendente que los inhibidores enzimáticos se encuentren entre los agentes farmacéuticos más importantes. Por ejemplo, la aspirina (ácido acetilsalicílico) inhibe la enzima que cataliza el primer paso de la síntesis de prostaglandinas. El estudio de los inhibidores enzimáticos ha proporcionado información sobre mecanismos enzimáticos y ha ayudado a definir algunas rutas metabólicas. Hay dos amplias clases de inhibidores enzimáticos: reversibles e irreversibles. Un tipo de inhibición reversible común es la que se denomina competitiva, como muestra la siguiente figura:
Un inhibidor competitivo compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima pero la reacción no tiene lugar cuando se ha fijado el inhibidor (I). Mientras el inhibidor ocupa el sitio activo impide la fijación del sustrato. Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen al sustrato y q ue se combinan con la enzima formando el complejo EI. Debido a que el inhibidor se una de manera reversible a la enzima, se puede cambiar el sentido de la competición a favor del sustrato añadiendo más de éste. Cuando hay suficiente sustrato se minimiza la probabilidad de que se fije una molécula de inhibidor por lo que la reacción muestra una V máx normal. No obstante, la [S] a la cual V o = ½ V máx , la K M, aumenta en presencia del inhibidor. Este efecto sobre la V máx es diagnóstico de inhibición competitiva, y se pone de manifiesto fácilmente en una gráfica de Lineweaver–Burk. La constante de equilibrio para la fijación del inhibidor, K I , puede obtenerse a partir de la misma gráfica.
La inhibición competitiva se utiliza en terapéutica para pacientes que han ingerido metanol, un componente del los licores adulterados y disolvente que se utiliza como anticongelante. El metanol se convierte en formaldehído por acción de la enzima alcohol deshidrogenada. El formaldehído lesiona muchos tejidos, siendo la ceguera un resultado frecuente debido a que los ojos son especialmente sensibles al mismo. El etanol compite de manera efectiva con el metanol como sustrato de la alcohol deshidrogenada. La terapia para el envenenamiento por metanol es la infusión intravenosa de etanol, la cual hace que la formación de formaldehído sea suficientemente lenta para que la mayor parte del metanol se pueda excretar inocuamente por la orina. Otros dos tipos de inhibición reversible, la no competitiva y la acompetitiva, que a menudo se definen aplicados a enzimas con un solo sustrato pero que en la práctica sólo se observan con enzimas que actúan con dos o más sustratos. Un inhibidor no competitivo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato, como se muestra en la siguiente figura:
La fijación del inhibidor no bloquea la fijación del sustrato (y viceversa). La enzima se inactiva cuando está fijado el inhibidor tanto si el sustrato está presente como si no lo está. El inhibidor disminuye de manera efectiva la concentración de la enzima activa por lo que decrece la V máx . Frecuentemente el efecto sobre K M es nulo En la inhibición no competitiva, representaciones similares de los datos de velocidad dan la familia de líneas que se muestran en la figura siguiente, que tienen una intersección común en el eje de 1/ [ S]. Esto indica que el sustrato no es alterada por el inhibidor no competitivo mientras que V máx disminuye. K M para
En la inhibición acompetitiva el inhibidor no se combina con la enzima libre ni afecta su reacción con el sustrato normal; sin embargo, el inhibidor se combina con el complejo ES para formar un complejo inactivo enzimasustrato-inhibidor, el cual no experimenta su transformación posterior en el producto habitual de la reacción:
Lo característico de la inhibición acompetitiva es que la pendiente de las rectas permanece constante al aumentar la concentración del inhibidor, pero la V max decrece.
Los inhibidores irreversibles son los que se combinan con un grupo de la enzima que es esencial para su actividad o lo destruyen. Es frecuente la formación de un enlace covalente entre un inhibidor irreversible y una enzima. En la siguiente tabla se resumen los efectos de los inhibidores sobre las representaciones de Lineweaver-Burk, 1/V 0 frente a 1/ [ S ].
Materiales: • • • • •
Fotocolorímetro Celdas del fotocolorímetro Tubos de ensayo grandes Mortero Sílica gel
• • • •
Beaker Frasco lavador Centrífuga Lienzo
Sustancias: • • •
Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 7.2 Solución buffer de fosfato 0.1M, pH = 6.0 Solución de L-metildopa 0.03M en buffer pH = 6.0
• • •
Fuente de tirosinasa (banano, manzana y papa) Hielo picado Solución de NaCN 0.1M
Sección experimental Extracción d e la enzima k. Coloque 10 gramos de banano en el mortero preenfriado y adiciónele 10 mL de buffer de fosfato 0,1M (pH=7,2). l.
Adicione unos 3 gramos de sílica gel a la mezcla anterior y triture hasta que no haya fruta sólida.
m. Filtre utilizando un paño y centrifugue el filtrado durante 5 minutos a 1500 RPM. n. La solución sobrenadante se decanta y se coloca en un vaso con hielo. o. Diluya la solución sobrenadante con buffer pH = 7.2, hasta completar 50 mL. Considere esta solución como extracto diluido 10 veces.
Medida d e la activi dad enzimática p. Prepare una solución blanco mezclando:
1.0 mL del extracto enzimático 3.3 mL de buffer pH = 6.0 4 gotas (0.2 mL) de solución de NaCN 0.5 mL de agua destilada.
• • • •
q. Calibre el fotocolorímetro, utilizando la solución anterior, a λ = 420 nm. r.
Mezcle en otro tubo de ensayo: • • • •
1.0 mL de extracto de enzima 4 gotas de solución de NaCN 3.3 mL de buffer pH = 6.0 0.5 mL de solución de L-metildopa
s. Inmediatamente después de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colóquelo en el fotocolorímetro y lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo cero. t.
Anote las absorbancias registradas en el fotocolorímetro cada 30 segundos durante 5 minutos.
u. Repita los pasos h hasta j en otros 5 tubos de ensayo, pero variando la cantidad de sustrato de la siguiente manera: • • • •
Adicione a cada tubo 1.0 mL de extracto enzimático. 4 gotas de solución de NaCN Agregue a cada tubo, respectivamente, a penas vaya a leer en el fotocolorímetro, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 y 3.0 mL de la solución de L-metildopa. Complete cada tubo hasta 5 mL con buffer pH = 6.0
v. Tabule los resultados en la siguiente tabla:
t (min)/ tubo
1
2
3 4 Absorbancia
5
6
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
Todos los desechos se adicionan a residuos orgánicos no halogenados
Resultados g. Con los resultados obtenidos, haga los gráficos correspondientes de Absorbancia vs tiempo y de ellos, calcule las pendientes de las curvas y considere este valor como la velocidad inicial (V i), para cada concentración de sustrato [S].
h. Calcule la nueva concentración de sustrato aplicando la fórmula general de dilución: [ S ] f = v 1 [ S ] i v 2
Donde: [S]f = concentración final del sustrato [S]i = concentración inicial del sustrato (0.03M) v 2 = volumen final de la solución (5 mL) v 1 = volumen adicionado de sustrato i.
Con los datos obtenidos en los numerales a y b llene la siguiente tabla: Tubo 1 2 3 4 5 6
j.
[S ]f
V i
1/[S ]
1/V i
Haga una gráfica de V i vs [S] y de 1/V i vs 1/[S] y de estas determine los valores de K M y V max .
k. Compare los valores obtenidos por ambos métodos y con los obtenidos en ausencia de inhibidor (sesión anterior); determine el tipo de inhibidor. l.
Calcule el valor de KI dependiendo del tipo de inhibidor, utilizando las ecuaciones correspondientes (ver gráficos y tabla en la parte teórica).
Referencia Friedman, M., Daron, H., Tyrosinase: An introductory experiment with enzymes, Journal of Chemical Education, 54, 4, 1977, p: 257.
PRACTICA 6 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE PROTEÍNAS Objetivo Determinar la actividad de las proteasas al hidrolizar una solución de proteínas As pectos teóricos Las proteínas son hidrolizadas en presencia de enzimas proteolíticas o proteasas, las cuales actúan sobre los enlaces peptídicos. Esta hidrólisis puede ocurrir en diferentes sitios de la proteína; cuando ocurre en las posiciones terminales, las proteasas se denominan exopeptidasas (aminopeptidasas o carboxipeptidasas) y endopeptidasas cuando la hidrólisis se realiza en las posiciones internas, como se muestra la siguiente figura: R 1
O
R 3
O
H N
H N
H2N
OH
N H O
R 5
N H
R 2
O
R 4
O
Endopeptidasas Carboxipeptidasa
Aminopeptidasa
H2O/Proteasas
OH
OH + H2N
OH + H2N R 4
O
R 2
O
OH
+ H2N
OH + H2N
H2N
R 5
O
R 3
O
R 1
O
Las endopeptidasas son específicas a la clase de aminoácido implicado en el enlace peptídico. Entre las endopeptidasas más comunes se destacan: la tripsina, la pepsina, la quimiotripsina y la termolisina (ver figura). Escisión Específica de Cadenas Polipeptídicas H
H
N
C
C
R1
O
Am in oác id o 1
Método Tripsina Quimotripsina Pepsina Termolisina Bromuro de cianógeno
H
R2
N
C
C
H
O
Am in oác id o 2
Enlaces Péptidi cos escindido s Aminoácido 1 = lisina o arginina Aminoácido 1 = fenilalanina, triptófano o tirosina Aminoácido 1 = fenilalanina, triptófano, tirosina y otros Aminoácido 2 = leucina, isoleucina o valina Aminoácido 1 = metionina
La tripsina es una enzima digestiva secretada por el páncreas al intestino delgado, en forma de su precursor, el tripsinógeno. La tripsina es muy específica, sólo cataliza la hidrólisis de aquellos enlaces peptídicos en que la
función carbonilo es aportada por el resto de lisina o por el de arginina, con independencia de la longitud o la secuencia de aminoácidos de la cadena. La termolisina, que es una proteasa bacteriana termoestable, puede hidrolizar enlaces peptídicos en los que la función amino es aportada por los aminoácidos no polares, leucina, isoleucina y valina. Es especialmente útil para la hidrólisis parcial de polipéptidos que no contienen arginina o lisina y son, por lo tanto, resistentes al ataque por la tripsina. La cuantificación de los aminoácidos liberados se realiza neutralizando previamente los grupos alfa amino libres por adición de formaldehído, como se indica en la siguiente figura: H H2 N
CH
C
R
O
OH
+ H
C
H
HOH2C
HN
O
CH
C
R
O
OH
C
H
O
CH2OH HOH2C
N
CH
C
R
O
CH
C
R
O
OH
N,N-dimetilol
N-monometilol
H2 C
N
OH
N-metileno
Los grupos carboxilo se valoran cuantitativamente utilizando NaOH 0.05N Materiales: • • •
Erlenmeyers Bureta Baño maría
• •
Soporte universal Pinza y nuez
Reactivos: • • •
Solución de proteína (gelatina 5%) Solución de pancreatina al 0.5% en buffer de borato pH = 8.4 Solución de NaOH 0.05N
• •
Fenolftaleína al 1% Solución concentrada formaldehído
de
Sección Experimental a. Mida 25 mL de solución de proteína y colóquelos en un erlenmeyer de 125 mL. Adicione 5 mL de la solución de pancreatina (tomar este tiempo como tiempo cero, t0) y ponga la mezcla en un baño maría a 37ºC. b. Transfiera 5 mL de la mezcla anterior a un erlenmeyer y caliente hasta ebullición. Esperar 2 minutos y enfriarla. c. Adicione 7.5 mL de solución de formaldehído y 3 gotas de fenolftaleína. d. Titule esta solución con NaOH 0.05N hasta obtener un color rosa pálido permanente. Anote el volumen utilizado. e. A partir del tiempo cero contar 15, 30, 45 y 60 minutos y medir en cada intervalo 5 mL de la mezcla original y repetir el procedimiento descrito en los numerales (b), (c) y (d).
Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos
Dispóngalos por el desague
Resultados y preguntas a. Grafique los equivalente-gramo de NaOH utilizados vs tiempo. La pendiente de esta gráfica corresponde a la actividad en equivalentes de aminoácidos hidrolizados por minuto y por mL de solución proteica. b. Compare el resultado obtenido con el dato reportado (400u, donde 1u es aquella cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1µmol d e sustrato/minute, en condiciones estándar 25 oC y pH optimo. c. ¿Cuál(es) es (son) la (s) proteasa (s) contenidas en la pancreatina? ¿Cuales enlaces peptídicos son hidrolizados? d. ¿Qué otros enlaces peptídicos puede hidrolizar la pepsina fuera de aquellos que contienen los aminoácidos de Phe, Trp y Tyr ?
PRÁCTICA 7 ACCIÓN CA TALITICA DE LA LIPASA PANCREÁTICA Objetivos 18. Determinar la actividad enzimática de la lipasa pancreática al catalizar por hidrólisis una muestra de triacilglicérido. 19. Analizar el efecto activador del ion calcio (Ca2+), sobre la lipasa. As pectos teóricos La lipasa es una enzima específica para los ésteres en la posición α del glicerol y prefiere ácidos grasos de cadena larga con más de 10 átomos de carbono. La acción catalítica de la lipasa pancreática tiene lugar en la interfase agua-lípido de las partículas emulsionadas ó micelas. La presencia de los ácidos biliares que si bien constituyen a la formación de las micelas, presentan una fuerte inhibición sobre la enzima, la cual es superada por la adición de una proteína que forma un complejo estabilizador con la lipasa. Esta proteína es denominada colipasa. La hidrólisis de los triacilglicéridos por acción de la lipasa, se presenta a continuación: O HO O O R 2
C
CH2 O
O
O
C
R 1
+
O
R 1 + 2 H2O
O
CH CH2
C
C
Lipasa
R 2
C
CH2 O
OH
CH CH2
R 3
OH
+
O HO
C
R 3
Los factores que afectan la velocidad de hidrólisis son: a. El pH: Generalmente las lipasas actúan a pH alcalino. b. La temperatura: La temperatura de acción más efectiva está entre los 30 y 40ºC. c. Activadores: El ion calcio (Ca2+) aumenta la estabilidad de la lipasa y produce sales de calcio, las cuales precipitan e impulsan la reacción en sentido directo. Los cloruros (Cl -) y los bromuros (Br -) también actúan como activadores. d. Inhibidores: Algunos aniones entre ellos el nitrato (NO3-), el fluoruro (F -) y agentes oxidantes como el agua oxigenada (H2O2) actúan como inhibidores de la lipasa. Materiales: • • •
Tubos de ensayo Bureta Erlenmeyers
• • •
Soporte universal Pinza y nuez Baño maría
Sustancias: • • •
2
Buffer de borato (pH = 8.4) Aceite vegetal Solución enzimática (utilizando 2 pastillas de creoflat)2
Solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0.02N • Solución de CaCl2 10% • Fenolftaleína •
La solución enzimática se prepara macerando 2 pastillas de pancreoflat, que no contengan sales biliares, en 50 mL de buffer a pH = 8.4 y conserve la solución en baño Maria a 37ºC
Sección Experimental a. Solución blanco: adicione a un tubo de ensayo grande los siguientes componentes: • • •
10 mL de agua 5 gotas de aceite 5 mL de solución enzimática
Caliente el tubo de ensayo por 1 minuto en agua a ebullición, deje enfriar, transvase el contenido a un erlenmeyer, adicione 3 gotas de fenolftaleína y titule con NaOH 0.02N hasta obtener un color rosado pálido. b. Disponga de 6 tubos de ensayo y prepare en cada uno las siguientes soluciones como se indican en la tabla siguiente: Tubo 1 2 3 4 5 6
Aceite (gotas) 5 5 5 5 5 5
Sln. CaCl 2 (mL)
H2O (mL)
0.5 0.5 0.5
10 10 10 9.5 9.5 9.5
Fenolft aleína (gotas) 3 3 3 3 3 3
c. Adicione, gota a gota, NaOH 0.02N a cada uno de los tubos hasta obtener un color rosado pálido igual al blanco. d. Coloque los tubos en un baño de agua a 37ºC y adicione 5 mL de solución enzimática a cada uno. Anote el tiempo de inicio de la reacción. e. Transcurridos los primeros 15 minutos, caliente los tubos 1 y 4 en agua hirviendo durante un minuto. Dejelos enfriar, trasváselos a un erlenmeyer, adicione 3 gotas de fenolftaleína a cada uno y titule con NaOH 0.02N. Anote los mL de NaOH utilizados. f.
Transcurridos 30 minutos, efectúe con los tubos 2 y 5, el mismo procedimiento anterior.
g. Transcurridos 45 minutos, efectúa con los tubos 3 y 6, el mismo procedimiento descrito en (e).
Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos dispóngalos por el desagüe
Resultados
m. Con los resultados obtenidos calcule los equivalentes-gramo de NaOH consumidos de la siguiente manera: Eq-gNaOH = 0.02 ( V – V b) Donde: V = volumen gastado de NaOH en cada titulación Vb = volumen gastado de NaOH en la titulación del blanco n. Tabule los resultados obtenidos en el numeral anterior y el tiempo registrado en la tabla siguiente: Tubo 1 2 3 4 5 6
Eq-g NaOH
Tiempo (min) 15 30 45 15 30 45
o. Haga una gráfica de Eq-gNaOH vs tiempo para los tubos sin ion calcio, Ca 2+ (tubos: 1, 2 y 3) y para los tubos con ion calcio (tubos: 4, 5 y 6). p. Calcule la actividad (la pendiente de la curva) en Eq-g/min de ácidos graso hidrolizados. q. Compare las actividades sin ion calcio, con ion calcio y con el dato reportado*. * Actividad enzimática de la proteasa: 400u, donde 1u es aquella cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1µmol de sustrato/minute, en condiciones estándar 25 oC y pH óptimo.
PRÁCTICA 8 GLICÓLISIS ANAEROBIA (FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA) Objetivos 20. Determinar las diferentes velocidades en la fermentación de mono, di y polisacáridos. 21. Determinar el efecto de la concentración en el proceso de fermentación. 22. Comprobar la inhibición de la ruta metabólica ocasionada por el NaF. As pectos teóricos El metabolismo: Es el conjunto de reacciones y procesos físico-químicos que ocurren en una célula. Estos procesos complejos interrelacionados son la base de la vida a nivel molecular, y permiten las diversas actividades de las células: crecer , reproducirse, mantener sus estructuras, responder a estímulos, etc. El metabolismo se divide en dos procesos conjugados: catabolismo y anabolismo. Las reacciones catabólicas liberan energía; un ejemplo es la glucólisis, un proceso de degradación de compuestos como la glucosa, cuya reacción resulta en la liberación de la energía retenida en sus enlaces químicos. Las reacciones anabólicas, en cambio, utilizan esta energía liberada para recomponer enlaces químicos y construir componentes de las células como lo son las proteínas y los ácidos nucleicos. El catabolismo y el anabolismo son procesos acoplados que hacen al metabolismo en conjunto, puesto que cada uno depende del otro La glucolisis: Es la vía metabólica encargada de oxidar la glucosa y así obtener energía para la célula. Ésta consiste de 10 reacciones enzimáticas que convierten a la glucosa en dos moléculas de piruvato, la cual es capaz de seguir otras vías metabólicas y así continuar entregando energía al organismo. En la glucólisis, se metaboliza la glucosa en la parte fluida del citoplasma en dos moléculas de piruvato y se generan dos moléculas netas de ATP de ganancia. Durante este proceso, se activa la molécula de glucosa por adición de fosfatos provenientes de dos moléculas de ATP para formar bisfostato de fructosa. Este compuesto se descompone, mediante una serie de reacciones, en dos moléculas de piruvato. Estas reacciones producen cuatro moléculas de ATP y dos transportadores de electrones, N ADH. Debido a que se consumieron dos ATP en las etapas de activación, el rendimiento neto de la glucólisis es de dos ATP y dos NADH. La glucólisis, además de proporcionar un pequeño rendimiento de ATP, consume NAD+ para producir NADH. Una vez, que la provisión de NAD+ de la célula se ha consumido, la glucólisis se detiene. La reacción global de la glucólisis es: Glucosa + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi
+ 2 Piruvato + 2NADH + 2ATP + 2H + 2H 2 O
Los productos de esta reacción, mostrados arriba, son utilizados por la célula en muchas funciones: •
El ATP ( Adenosín trifosfato) es la fuente de energía universal de la célula.
•
NADH y H+, otorgan la capacidad de reducir otros compuestos pertenecientes a otras vías metabólicas, o bien para sintetizar ATP.
•
El piruvato es la molécula que seguirá oxidandose en el ciclo de Krebs, como parte de la respiración aeróbica, donde dará origen a más moléculas NADH, que podrán pasar a sintetizar ATP en la mitocondria
La glucólisis se divide en dos partes principales y diez reacciones enzimáticas, las que se describen a continuación. 1. La primera reacción de la glucólisis es la fosforilación de la glucosa, para activarla (aumentar su energía) y así poder utilizarla en otros procesos cuando sea necesario. Esta activación ocurre por la transferencia de un grupo fosfato del ATP, una reacción catalizada por la enzima hexoquinasa, la cual puede fosforilar (añadir un grupo fosfato) a moléculas similares a la glucosa, como la fructosa y manosa. CH2OH C
O
CH2OP OH
D3P Glucoquinasa O
ATP
Mg 2+
HO HO OH Glucosa
Pi
OH
OP
ADP
1
HO
OP O
HO HO
Fosfohexosa isomerasa
OH Glucosa 6P
ATP
O OH
2 OH
PO
OP Mg2+
ADP
O
Fosfotriosa 5 isomerasa
4 OH
OH HO Fructosa 6P
Pi
Fosfofructoquinasa
COH
Ald olas a
OH
3
CHOH HO
Fructosa 1-6P CH2OP GA3P NAD Glicesraldehido 3P-deshidrogenasa
6 Pi
NADH.H COOH C
ATP
ADP
Enolasa
O
COP Piruvatoquinasa
CH3 ACIDO PIRUVICO
COO-
COOH
10
CHOP 9
CH2 PEP
Fosfoglicerato mutasa 8
CH2OH 2PGlicerato
COO-
ATP Mg 2+
ADP
CHOH CH2OP 3PGlicerato
COOP CHOH
Fosfogliceratoquinasa 7
CH2OP 1-3PGlicerato
2. En esta reacción, la glucosa-6-fosfato se isomeriza a fructosa-6-fosfato, mediante la enzima fosfohexosa isomerasa. La isomerización ocurre en una reacción de 4 pasos, que implica la apertura del anillo y un traspaso de protones. 3. Fosforilación de la fructosa 6-fosfato en el carbono 1, con gasto de un ATP, a través de la enzima fosfofructoquinasa-1 (PFK1). También este fosfato tendrá una baja energía de hidrólisis. Por el mismo motivo que en la primera reacción, el proceso es irreversible. El nuevo producto se denominará fructosa-1,6-Bisfosfato. 4. La enzima aldolasa (Fructosa-1,6-bifosfato aldolasa), mediante una condensación aldólica reversible, rompe la fructosa-1,6-bifosfato en dos moléculas de tres carbonos (triosas): dihidroxiacetona fosfato y Gliceraldehído3-fosfato. 5. Puesto que sólo el gliceraldehído-3-fosfato puede seguir los pasos restantes de la glucólisis, la otra molécula generada por la reacción anterior (dihidroxiacetona-fosfato) es isomerizada (convertida) en gliceraldehído-3fosfato. Ésta reacción posee una energía libre en condiciones estandar positiva, lo cual implicaría un proceso no favorecido, sin embargo al igual que para la reacción 4, considerando las concentraciones intracelulares reales del reactante y el producto, se encuentra que la Energía Libre total es negativa, por lo que la dirección favorecida es hacia la formación de G3P. 6. Se utiliza un fosfato inorgánico y una molécula de NAD+ para producir 1,3-bifosfoglicerato y una molécula de NADH + H+. Esta reacción la cataliza la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa o GAP-deshidrogenasa. Llama la atención que el fosfato se ha introducido sin utilizar ATP, sino aprovechando la energía producida por la reacción redox. Ahora, el fosfato que se ha introducido tiene una alta energía por lo que se podrá transferir al ATP. Esto se conoce como fosforilación a nivel de sustrato. 7. Se desfosforiliza el 1,3-bifosfoglicerato gracias a la fosfoglicerato quinasa, formándose una molécula de ATP por cada una de 1,3-BPG y dando lugar al 3-fosfoglicerato.
8. Se isomeriza el 3-fosfoglicerato procedente de la reacción anterior dando 2-fosfoglicerato, la enzima que cataliza esta reacción es la fosfoglicerato mutasa. Lo único que pasa aquí es el cambio de posición del fosfato del C3 al C2. Son energías similares y por tanto reversibles, con una variación de energía libre cercana a cero. 9. La enzima enolasa propicia la formación de un doble enlace en el 2-fosfoglicerato, eliminando una molécula de agua formada por el hidrógeno del C2 y el OH del C3. El resultado es el fosfoenolpiruvato. 10. Desfosforilación del fosfoenolpiruvato, obteniéndose piruvato y ATP. Reacción irreversible mediada por la Piruvato quinasa. Destino del piruvato El piruvato formado en la glucólisis puede tomar tres rutas catabólicas alternativas como se muestra en la siguiente figura:
En condiciones anaeróbicas el piruvato se convierte a dos moléculas de lactato (fermentación láctica que se realiza en el músculo), y en condiciones aeróbicas el piruvato se convierte a dos moléculas de acetil-CoA que luego ingresa al ciclo del ácido cítrico (realizado en la mitocondria) y se degrada a CO 2 y H2O. Siguiendo esta vía, donde el aceptor final es el oxígeno, se obtendrán 30 ó 32 ATP, los cuales serán usados por la célula como fuente de energía para las funciones normales de la célula, como la proliferación, el crecimiento y metabolismo. Por otro lado, el piruvato bajo condiciones anaeróbicas se convierte en etanol y dos moléculas de dióxido de carbono, ruta conocida como fermentación alcohólica. Fermentación alcohól ica: glucólisis anaerobia Es un proceso biológico de fermentación en plena ausencia de oxígeno, originado por la actividad de algunos microorganismos, como las levaduras, que procesan los carbohidratos para obtener como productos finales: etanol, dióxido de carbono y dos moléculas de ATP que consumen los propios microorganismos en su metabolismo celular energético anaeróbico. El proceso se muestra en la siguiente figura: OH
Alc oho l deshidrogenasa
Piruvato descarboxilasa H
O
O
+
H
HO HO
Glucolisis -
OH OH Glucosa
O
O CH3
O
CO2 CH3
Ac etald ehid o
NADH + H+
NAD+ CH3CH2OH Etanol
Piruvato
Después de la formación del piruvato en la glucolisis, este se descarboxila (pierde CO 2), convirtiéndose en acetaldehído por acción del enzima piruvato descarboxilasa. El proceso se complementa con la reacción que genera el etanol y el agente oxidante (NAD +), requerido por la levadura para continuar haciendo glucólisis y disponer de ATP. Esta reacción es promovida por la enzima etanol deshidrogenada, distribuida en todos los organismos. Desde el punto de vista energético, las fermentaciones son muy poco rentables si se comparan con la respiración aerobia, ya que a partir de una molécula de glucosa sólo se obtienen 2 moléculas de ATP, mientras que en la respiración se producen 38. Esto se debe a la oxidación del NADH, que en lugar de penetrar en la cadena respiratoria, cede sus electrones a compuestos orgánicos con poco poder oxidante.
La fermentación alcohólica tiene como finalidad biológica proporcionar energía anaeróbica a los microorganismos unicelulares (levaduras) en ausencia de oxígeno para ello disocian las moléculas de glucosa y obtienen la energía necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2 como desechos consecuencia de la fermentación. Las levaduras y bacterias causantes de este fenómeno son microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y contribuyen en gran medida al sabor de los productos fermentados. El etanol resultante se emplea en la elaboración de algunas bebidas alcohólicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar también etanol mediante la fermentación a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible. Es necesario anotar que se denomina glucólisis al proceso que lleva desde la glucosa al piruvato, sin embargo, en algunas reacciones intermedias de este proceso es posibl e el ingreso de otros monosacáridos diferentes a la glucosa, como fructosa, manosa o galactosa, casos en los cuales se habla de glicólisis. En la práctica de laboratorio se pretende observar y cuantificar la velocidad a la cual cierto tipo de levadura es capaz de fermentar diferentes sustratos (mono, di y polisacáridos), midiendo la cantidad de CO 2 que se va generando en el tiempo: reacción =
d(cant. CO 2 )/dt
Materiales: • • • • •
Tubos de ensayo Beaker Baño maría Regla Tapones
• • •
Agujas de jeringa Manguera con 0.35 cm de diámetro y 3m de largo Solución coloreada (azul de metileno o violeta de genciana)
Sustancias: • • • •
Levadura fresca al 5%3 Glucosa 1% y 10% Fructosa al 10% Sacarosa al 10%
• • •
Almidón 1 % NaF 0.1M Agua destilada
Sección Experimental f.
Adicione a un tubo de ensayo 5mL de suspensión de levadura y 2mL de solución de glucosa al 10%.
g. Tape el tubo de ensayo con un tapón de caucho, agite y atraviese el tapón con una aguja de jeringa desechable. h. Tome una manguera para fermentación, adiciónele 1mL de solución coloreada, colóquela a presión en la boca de la aguja y fíjela a la mesa de trabajo con cinta. Tanto el tapón como la manguera deben quedar bien herméticos de tal forma que no hayan fugas. Procure que la manguera quede lo mas lineal posible.
3
i.
Ponga el sistema en un beaker que contenga agua entre 37-40ºC. Tenga cuidado que la manguera no quede en contacto con alguna superficie caliente y la solución coloreada no esté a más de 50 cm del tubo.
j.
Marque la manguera donde se encuentra la solución coloreada.
Esta solución se prepara en un buffer de acetato pH = 5.5
k. A penas comience a moverse la solución coloreada cuente dos minutos y vuelva a marcar la posición donde se encuentra esta solución. l.
Siga marcando cada dos minutos durante doce minutos.
m. Desconecte la manguera y mida con una regla la distancia recorrida por la solución coloreada cada dos minutos. n. Repita los pasos (a) hasta (h) con: glucosa al 1%, fructosa al 10%, sacarosa al 10% y almidón al 1%. o. Adicione a un tubo de ensayo 5mL de suspensión de levadura, 2mL de solución de glucosa al 10% y 1mL de agua destilada. p. Repita los pasos (b) hasta (h) q. Por último, coloque en un tubo de ensayo 5mL de suspensión de levadura, 2mL de solución de glucosa al 10% y 1mL de la solución de NaF y repita los pasos ( b) hasta (h). r.
Anote los datos en la siguiente tabla:
Carbohidrato Tiempo (min) 2 4 6 8 10
Glucosa 1%
Glucosa 10%
Glucosa 10% con NaF Longi tud (cm)
Fructosa 10%
Sacarosa 10%
Al midón 1%
Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos Dispóngalos por el desague Resultados e. Con los datos obtenidos en el numeral anterior calcule la velocidad de la reacción para cada carbohidrato y complete la tabla. Carbohidrato Glucosa 1% Glucosa 10% Glucosa 10% con NaF Fructosa 10% Sacarosa 10% Almidón 1%
reacción
Nota: el volumen de CO2 producido se calcula con la fórmula del volumen de un cilindro: V = π r2 h, donde: r , es el radio de la manguera (0.17cm) y h es el promedio de las longitudes medidas (haga esta operación con los valores que sean más homogéneos)
a. Escriba la reacción neta balanceada de la fermentación de cada uno de los carbohidratos. b. Según las ecuaciones del numeral anterior, ¿Dónde ocurriría la mayor producción de CO2? ¿Está ello de acuerdo con los datos obtenidos experimentalmente?
c. Según la experiencia cual es el orden de los carbohidratos según la rapidez en la fermentación? ¿Cómo se podría justificar? d. ¿Cómo interpretaría el efecto del fluoruro de sodio (NaF) sobre la fermentación?.
Preguntas e. ¿En que consiste la fermentación láctica y glicérica? ¿En que diferencian de la fermentación etanólica? f.
El arsenato (AsO42-) es químicamente similar al fosfato inorgánico (PO 42-) y algunas enzimas que utilizan fosfato inorgánico pueden utilizar también el arsenato. La producción de ATP en la glucolisis es inhibida por el arsenato. Identifique las enzimas que pueden ser afectadas.
g.
Además de ATP, se forman otros dos productos importantes en la glicolisis. ¿Cuáles son?
h. Enumere algunos inhibidores de la glicólisis
PRACTICA 9 DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SUERO SANGUÍNEO Objetivos 1. Cuantificar el contenido de glucosa en suero sanguíneo 2. Comparar el resultado obtenido con los datos reportados y determinar el estado de salud del paciente As pectos Teórico s Metabolismo de los glúc idos. La digestión de los polisacáridos se inicia en la boca, en donde la amilasa de la saliva hidroliza el almidón para dar dextrinas y maltosa. En el estómago, la amilasa de la saliva se inactiva por el pH. En el intestino, a pH más alcalino, actúan las enzimas procedentes del páncreas como la amilasa pancreática. Finalmente, enzimas de la mucosa intestinal concluyen la degradación (disacaridasas). Posteriormente los monosacáridos, principalmente la glucosa, son absorbidos a través de la pared intestinal hacia el torrente sanguíneo y llevados al hígado por medio de la circulación portal. La glucosa es la principal fuente de energía en los seres vivos. Por tal razón es un metabolito fundamental en los procesos biológicos. La glucosa tras su degradación por la vía glucolítica se obtiene una gran cantidad de energía en forma de ATP. Alteraciones en el metabolismo de la glucosa conducen a estados de hipoglucemia o hiperglucemia (diabetes) que producen unos trastornos clínicos que en algunos casos pueden resultar fatales. La determinación del contenido de glucosa en el suero fisiológico es una prueba indicativa del estado de salud del individuo y resulta necesaria en los casos de alteraciones metabólicas u hormonales (deficiencia en insulina, glucagón, etc). Al teraci ones del metab olis mo gl ucídico, la diab etes Aunque las patologías relacionadas con alteraciones del metabolismo glucídico son muy diversas, vamos a centrarnos en los trastornos en la regulación del nivel de la glucosa en sangre. Cuando la homeostasis de la glucosa se rompe por disfunción de cualquier elemento que la mantiene, sobrevienen los síndromes hiper o hipoglucémicos que, como su nombre indican, conllevan el aumento (>120 mg/dL en ayunas) o la disminución (<45-50mg/dL) de la glucemia, respectivamente. Diabetes mellitus La diabetes mellitus es la causa más frecuente y grave de hiperglucemia. Es una metabolopatía crónica que aparece como consecuencia de la deficiencia absoluta o relativa de insulina. En estas condiciones, la entrada de glucosa en las células está disminuida y en consecuencia los niveles en sangre se mantienen elevados (hiperglucemia). Esta deficiencia da lugar a una serie de complicaciones a largo plazo, lo que origina una gran morbilidad y mortalidad.
Causas de la diabetes mellitus La glucosa es un azúcar que proviene de los alimentos que comemos, circula por la sangre y es utilizada por el organismo para obtener la energía necesaria para desarrollar cualquier tipo de trabajo. La causa de la diabetes es una anomalía en la producción o el funcionamiento de la insulina por el páncreas. La insulina es una hormona que fabrica el páncreas, cuya misión es facilitar el paso de los azúcares de la sangre a las células. Cuando no hay insulina como en los diabéticos jóvenes (Tipo 1), o no funciona correctamente, como ocurre en los adultos (Tipo 2), el azúcar no pasa de la sangre a los órganos y el funcionamiento es deficiente. Al tiempo, el azúcar se acumula en la sangre en cantidades superiores a las normales, apareciendo hiperglucemia. Cuando la glucosa en sangre es superior a 180 mg, el organismo no puede retenerla, por lo que la elimina por la orina: Glucosuria. En un paciente mal controlado o no tratado aparecerá hiperglucemia y glucosuria.
Clasificación: Actualmente la diabetes se clasifica en: a. Diabetes tipo I (déficit total de insulina). b. Diabetes tipo II (resistencia a la insulina o defecto secretor con resistencia a la insulina, los enfermos al principio no requieren la administración de insulina). c. Diabetes secundaria (enfermedades pancreáticas, tumores endocrinos, entre otros). d. Diabetes gestacional (se detecta durante el embarazo).
¿Cómo se detecta la Diabetes? El estudio de diabetes se realiza mediante la medición de la glucosa en sangre y en ayunas (glucemia basal) y se recomienda en las siguientes circunstancias: • En todos los individuos mayores de 45 años, y repetir cada 3 años mientras sea normal. • En población más joven cuando existan factores de riesgo. • Cuando aparezcan síntomas o signos qu e sugieran diabetes: - Poliuria (orinar mucho). - Polifagia (aumento del apetito). - Polidipsia (beber mucho por sed). - Pérdida de peso. - Retinopatía. - Proteinuria. - Infecciones urinarias de repetición. - Infecciones cutáneas de repetición,... • Cuando el nivel de glucosa plasmática en ayunas está entre 110 y 125, hay que repetir la glucemia y si persiste, realizar un test de Tolerancia Oral (75g de glucosa disuelta en 300ml de agua que se ha de tomar en 3-5 minutos). • Pacientes con antecedentes de Hipertensión arterial o trastornos del colesterol. Determinación de glucosa: para el diagnóstico de la diabetes es necesario determinar la glucemia, pero ¿cómo se cuantifica el nivel de glucosa en una muestra?, Los métodos para determinar la concentración de glucosa se clasifican en dos grandes grupos: a) Métodos basados en el poder reductor de los hidratos de carbono (reacción de Benedict, método de la otoluidina) b) Métodos enzimáticos: son los más utilizados, utilizan enzimas como reactivos (ej. glucosa oxidasa, hexoquinasa) a fin de aumentar la especificidad. Los dos métodos que vamos a citar se pueden utilizar para determinar la glucosa en muestras de suero, orina y líquido cefalorraquídeo. b.1.) Método de la hexoquinasa: Es el método de referencia y consiste en dos reacciones acoplad as: Glucosa
+
ATP
G-6-PO4 + NADP+
Hexoqui nasa, Mg++
G-6-PD
G-6-PO 4
+
ADP
NADPH + H+ 6-fosfogluconato +
En la primera reacción (específica), catalizada por la enzima hexoquinasa, se fosforila la glucosa formándose glucosa 6-fosfato. La glucosa 6-fosfato, en una reacción posterior (reacción indicadora), se transforma en 6fosfogluconato produciéndose NADPH (1 mol por cada molécula de glucosa). La producción de NADPH origina un aumento de absorbancia a 340nm. El incremento de absorbancia a esta longitud de onda será directamente proporcional a la concentración de glucosa. b.2.) Método de la glucosa oxidasa: Al igual que el anterior consiste en dos reacciones acopladas:
Glucosa + O2 + H2O H2O2 + cromógeno reducido
glucosa oxidasa peroxidasa
ácido glucónico + H2O2 cromógeno oxidado + H2O
En la primera reacción (reacción específica), catalizada por la enzima glucosa oxidasa (GOD), se oxida la glucosa y se genera H 2O2. En la segunda reacción (reacción indicadora), la enzima peroxidasa (POD) cataliza la descomposición del H2O2 lo que provoca oxidación de un cromógeno que pasa de su forma reducida (incolora) a su forma oxidada (coloreada). La aparición del cromógeno oxidado se evalúa mediante un espectrofotómetro y será directamente proporcional a la concentración de glucosa en la muestra. La 4-
aminoantipirina / fenol es uno de los cromógenos más utilizados, es oxidado por el agua oxigenada en un compuesto de color rojo que absorbe entre 492 y 550 nm, con un pico de máxima absorbancia a 500 nm. Glucosa + 1/2 O2 + H2O
glucosa oxidasa
2 H2O2 + 4-Aminoantipirina + Fenol
Ácido g lucó nico + H2O2
peroxidasa
Quinonaimina + 4 H2O
Este método (GOD/POD) presenta como desventaja que muchos compuestos presentes en el suero u orina (bilirrubina, ácido ascórbico y ácido úrico) pueden ser oxidados por el H 2O2 producido en la reacción catalizada por la enzima GOD y por tanto interfieren en el resultado (se da un resultado superior al real). También se puede cuantificar la concentración de glucosa de la muestra utilizando sólo la primera reacción y evaluando la cantidad de oxígeno consumido mediante un electrodo de oxígeno. La cantidad de glucosa en la muestra es directamente proporcional a la cantidad de oxígeno consumido.
Aspectos prácticos a considerar cuando se analiza la glucemia: 1. Centrifugar la sangre lo antes posible: los eritrocitos y leucocitos consumen glucosa, por tanto, si el contacto con las células es prolongado se pueden dar resultados falsamente bajos (a temperatura ambiente puede incluso desaparecer al cabo de 6h). Actualmente, existen tubos con separador de suero que funciona como una interfase entre las células y el suero después de la centrifugación, haciendo que no sea necesario separar el suero en otro tubo. 2. Si no se van a analizar inmediatamente, se puede refrigerar la muestra o añadir un conservante ej. Fluoruro sódico. 3. La concentración de glucosa en suero refrigerado es estable durante 3 días. Materiales, Equipo s y Sustancias Sustancias Suero sanguíneo Reactivos para determinar glucosa:
Materiales y Equipos Tubos de ensayo Micropipetas
A. Reactivo: Fosfatos 100 mmol/L, fenol 5 mmol/L, glucosa oxidasa > 10 U/mL, peroxidasa > 1U/mL, 4-aminoantipirina 0,4 mmol/L, pH 7,5 S. Patrón de Glucosa/Urea/Creatinina: Glucosa 100 mg/dL (5,55 mmol/L), urea 50 mg/dL, creatinina 2 mg/dL. Patrón primario acuoso.
Espectrofotómetro Conservación de los reactivos: Conservar a 2-8ºC. El Reactivo y el Patrón son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se conserven bien cerrados y se evite la contaminación durante su uso. Indicaciones de deterioro: − Reactivo: Presencia de partículas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,150 a 500 nm (cubeta de 1 cm). − Patrón: Presencia de partículas o turbidez. Muestras Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar. El suero o plasma deben separarse de los elementos celulares lo antes posible para evitar la glucolisis. La adición de fluoruro sódico a la muestra de sangre previene la glucolisis. La glucosa en suero o plasma es estable 5 días a 2-8ºC. Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren. Características metrol ógicas − Límite de detección: 0,23 mg/dL = 0,0126 mmol/L − Límite de linealidad: 500 mg/dL = 27,5 mmol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra 1/4 con agua destilada y repetir la medición. − Sensibilidad: 4 mAdL/mg = 0,22 mA L/mmol
−
Interferencias: la hemoglobina (> 3 g/L), la lipemia (trigliceridos >1,25 g/L) y la bilirrubina (10 mg/dL) interfieren.. Otros medicamentos y sustancias pueden interferir.
Sección Experimental 1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente. 2. Pipetear en tubos de ensayo: Patrón Muestra Reactivo
Tubo 1 (blanco) 1.0 mL
Tubo 2 10 µL 1.0 mL
Tubo 3
10 µL 1.0 mL
Nota: para la conservación y economía del reactivo se recomienda preparar solo un tubo b lanco por grupo. 3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25ºC) o durante 5 minutos a 37ºC. 4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al menos 2 horas. Cálculos: La concentración de glucosa en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general:
C Muestra =
A
Muestra
A
Patrón
x C Patrón
Valores de referencia:
Neonato, prematuro Neonato, a término Niños, adultos
25-80 mg/dL = 1,39-4,44 mmol/L 30-90 mg/dL = 1,67-5,00 mmol/L 70-105 mg/dL = 3,89-5,83 mmol/L
Residuos Todos se depositan en residuos orgánicos no halogenados Pregunta ¿En qué consiste el método de valoración reflectométrica y el método de sensores por capilaridad para la determinación de glucosa en sangre? Referencias 1. http://www.biosystems.es/Methods/11503c.pdf 2. http://www.bganalizadores.com.ar/resultado.html?linea=4 3. http://www.insp.mx/Portal/Cuidados_salud/diabetes-INSP.pdf
PRACTICA 10 PERFIL LIPÍDICO Objetivos 1. Determinación de la concentración de colesterol total, HDL-colesterol y triglicéridos. 2. Cálculo de LDL-colesterol, mediante la fórmula de Friedewald. 3. Dar interpretación diagnóstica del resultado. As pectos Teórico s Dentro de los lípidos, los triglicéridos y el colesterol y sus ésteres, constituyen dos grupos muy importantes. Los primeros por su alto contenido energético y el segundo por su papel estructural en la formación de membranas celulares animales en donde constituyen hasta el 25%. Existen varias técnicas experimentales para extraer y cuantificar lípidos. Uno de los métodos, utilizado actualmente a nivel clínico y de investigación, para valorar el colesterol y los triglecéridos en el plasma y/o suero sanguíneos es el enzimático calorimétrico. Colesterol Total
El colesterol es un esteroide de alto peso molecular que contiene una estructura ciclopentanofenantreno. El colesterol de la dieta se absorbe parcialmente y también se sintetiza en el hígado y otros tejidos. El colesterol se encuentra en las membranas celulares en forma libre, en algunas células capaces de almacenarlo, eterificado reversiblemente en ácidos grasos y en las lipoproteínas circulantes en el plasma sanguíneo, las cuales lo transportan eterificado en el centro de la célula y libre en su capa externa. El colesterol es necesario para que las células eucarióticas formen nuevas membranas y es el precursor biosintetico de sales biliares, hormonas esteroidales y vitamina D. Las concentraciones elevadas de colesterol se asocian con un riesgo progresivamente creciente de ateroesclerosis y enfermedad de las arterias coronarias. La cuantificación de colesterol en el plasma y/o suero sanguíneos por el método enzimático calorimétrico, se fundamenta en una hidrólisis de los ésteres del colesterol catalizada por la colesterol éster hidrolasa, este colesterol junto con el colesterol libre presente en el plasma o suero sanguíneo es oxidado por la colesterol oxidasa a ∆4-colestenona (cetona) y peróxido de hidrógeno, el cual en presencia de la peroxidasa, oxida al sistema cromógeno 4-aminoantipirina/fenol a un compuesto de color rojo que absorbe entre 492 y 550 nm con un pico de máxima absorbancia a 500 nm.
Colesterol-HDL Las HDL participan en la captación del colesterol de los tejidos y en su transporte hacia el hígado donde se elimina en forma de ácidos biliares. Existe una correlación positiva entre concentraciones bajas de HDLcolesterol en plasma y la incidencia de aterosclerosis, base del infarto de miocardio y accidentes cerebrovasculares. Existen diversos estados patológicos o influencias ambientales asociados con niveles reducidos de HDL: enfermedades hepatocelulares agudas o crónicas, hiperalimentación intravenosa, malnutrición severa, diabetes, anemia crónica, alteraciones mieloproliferativas, enfermedad de Tangier, analfalipoproteinemia, estrés agudo, algunos medicamentos y el tabaco. El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio. El colesterol de las proteínas de baja densidad (LDL), las de muy baja densidad (VLDL) y los quilomicrones es hidrolizado por la colesterol oxidasa mediante una reacción enzimática acelerada no formadora de color. El detergente presente en el reactivo B solubiliza el colesterol de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) de la muestra. El colesterol de HDL se cuantifica espectrofotométricamente mediante las reacciones acopladas descritas a continuación.
Triglicéridos Los triglicéridos son ésteres de glicerol y ácidos grasos que provienen de la dieta o son sintetizados principalmente en el hígado. Los triglicéridos se transportan en el plasma en las lipoproteínas y son utilizados por el tejido adiposo, músculo y otros. Su principal función es suministrar energía a la célula. Las concentraciones elevadas de triglicéridos en suero pueden ser debidas a alteraciones hepatobiliares, diabetes mellitus, nefrosis, hipotiroidismo, alcoholismo, hiperlipoproteinemia familiar IV y V entre otras. Los triglicéridos presentes en la muestra son hidrolizados por la lipasa para liberar ácidos grasos y glicerol, este último es fosforilado por ATP en presencia de glicerol quinasa. El glicerol resultante es oxidado por GPO a dihidroxiacetona fosfato y peróxido de hidrogeno, el cual en presencia de la peroxidasa, oxida al sistema cromógeno 4-aminoantipirina/4-clorofenol a un compuesto de color rojo que absorbe entre 492 y 550 nm con un pico de máxima absorbancia a 500 nm.
Colesterol-LDL Las LDL son las principales lipoproteinas que transportan colesterol hepático hacia los tejidos. Existe una correlación positiva entre concentraciones elevadas de LDL-colesterol en plasma y la incidencia de aterosclerosis, base del infarto de miocardio y accidentes cerebrovasculares. Existen diversos estados patológicos o influencias ambientales asociados con niveles elevados de LDL: nefrosis, diabetes, obesidad, algunos medicamentos y el tabaco. El diagnóstico clínico no debe realizarse teniendo en cuenta el resultado de un único ensayo, sino que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio. Si los triglicéridos son menor de 400 mg/dl, la concentración de colesterol LDL (LDL-C) se calcula de la concentración de colesterol total (COL-T), la concentración de HDL colesterol (HDL-C) y la concentración de los triglicéridos (TG) de acuerdo a la formula de Friedewald: LDL-C = COL-T – HDL-C – (TG/5) (mg/dl) ó LDL-C = COL-T – HDL-C – (TG/2,2) (mmol /l)
La ecuación anterior se obtiene después hacer el siguiente análisis: Colesterol total = Colesterol de VLDL + Colesterol LDL + Colesterol HDL
Por lo tanto: Colesterol LDL = Colesterol total - Colesterol de VLDL- Colesterol HDL
De aquí, el colesterol total y el HDL-colesterol fueron medidos anteriormente, y el Colesterol de VLDL se estima que es igual a la cantidad de Triglicéridos dividido por 5.
Valores de Referencia: Hasta 100 mg/dL (2,59 mmol/L) 100-129 mg/dL (2,59-3,34 mmol/L) 130-159 mg/dL (3,37-4,12 mmol/L) 160-189 mg/dL (4,14-4,90 mmol/L) >190 mg/dL (>4,92 mmol/L)
Optimo Casi optimo Moderado Elevado Muy elevado
Materiales, Equipo s y Sustancias Sustancias Suero sanguíneo Reactivo para determinar colesterol: 10 x 50 mL. Pipes 35 mmol/L, colato sódico 0,5 mmol/L, fenol 28 mmol/L, colesterol esterasa > 0,2 U/mL, colesterol oxidasa > 0,1 U/mL, peroxidasa > 0,8 U/mL, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L, pH 7,0.
Materiales y Equipos Tubos de ensayo Pipetas y micropipetas
Patrón de Colesterol. Colesterol 200 mg/dL (5,18 mmol/L) Reactivo para determinar triglic éridos: Pipes 45 mmol/L, 4 - clorofenol 6 mmol/L, cloruro magnésico 5 mmol/L,lipasa > 100 U/mL, glicerol quinasa > 1,5 U/mL, glicerol-3-fosfato oxidasa > 4 U/mL,peroxidasa > 0,8 U/mL, 4-aminoantipirina 0,75 mmol/L, ATP 0,9 mmol/L, pH 7,0.
Espectrofotómetro
Patrón de Triglicéridos: Glicerol equivalente a trioleina 200 mg/dL (2,26 mmol/L). Reactivos para determinar colesterol-HDL: A. Reactivo: 2 x 50 mL. Fosfotungstato 0,4 mmol/L, cloruro de magnesio 20 mmol/L. B. Reactivo: 2 x 50 mL. Fosfatos 35 mmol/L, colesterol esterasa > 0,2 U/mL, colesterol oxidasa > 0,1 U/mL, peroxidasa > 1 U/mL, 4-aminoantipirina 0,5 mmol/L, colato sódico 0,5 mmol/L, diclorofenol-sulfonato 4 mmol/L, pH 7,0. S. Patrón de Colesterol HDL: 1 x 5 mL. Colesterol 15 mg/dL. Patrón primario acuoso.
Baño de agua a 37 oC
Aguas desionizada
Conservación de los reactivos: Conservar a 2-8ºC. El Reactivo es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se conserve bien cerrado y se evite la contaminación durante su uso. Indicaciones de deterioro: Presencia de partículas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,200 a 500 nm (colesterol total y trigliceridos). Características Generales de la Prueba
1. Colesterol Total a. Metrología
Límite de detección: 0,9 mg/dL = 0,023 mmol/L − Límite de linealidad: 1000 mg/dL = 26 mmol/L − Interferencias: La hemoglobina (>5 g/L) y la bilirrubina (>10 mg/dL) interfieren. La lipemia (triglicéridos 10 g/L) no interfiere. −
b. Limitaciones
Una muestra con una concentración de colesterol que excede el límite de linealidad debe diluirse con solución salina a 0.9% y volverse a analizar incorporando el factor de dilución en el cálculo del resultado. Muestras muy ictéricas, hemolíticas o lipémicas requieren del uso de un blanco de muestra que puede prepararse agregando 25 µL de la muestra a 2.5 mL de agua desionizada. c. Tipo de Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar. El colesterol en suero o plasma es estable 7 días a 2-8ºC. Pueden utilizarse como anticoagulantes la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro.
2. Triglicéridos a. Metrología
Límite de detección: 1,6 mg/dL = 0,018 mmol/L Límite de linealidad: 600 mg/dL = 6,78 mmol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra 1/4 con agua destilada y repetir la medición. − Sensibilidad analítica: 1,2 mAdL/mg = 112 mA L/mmol − Interferencias: La hemoglobina (10 g/L) no interfiere. La bilirrubina (2,5 mg/dL) interfiere. − −
b. Tipo de Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar. Los triglicéridos en suero o plasma son estables 5 días a 2-8ºC. Los anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no interfieren.
3. Colesterol-HDL a. Metrología
Límite de detección: 3,0 mg/dL = 0,078 mmol/L − Límite de linealidad: 150 mg/dL = 3,9 mmol/L. − Interferencias: La lipemia (triglicéridos 10 g/L) no interfieren. La hemolisis (hemoglobina > 5g/L) y la bilirrubina (> 10 mg/dL) pueden interferir. −
b. Tipo de Muestras
Suero o plasma recogidos mediante procedimientos estándar. El Colesterol HDL en suero o plasma es estable 7 días a 2-8ºC. Como anticoagulante puede utilizarse EDTA, litio o heparina sódica. Sección Experimental
A. Determinación de Colesterol Total 1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente. 2. Pipetear en tubos de ensayo: Patrón de Colesterol Muestra Reactivo
Tubo 1 (blanco) -
Tubo 2 (patrón) 10 µL
Tubo 3 (Muestra) -
1.0 mL
1.0 mL
10 µL 1.0 mL
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16-25ºC) o durante 5 minutos a 37ºC. 4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al menos 2 horas.
Cálculo: La concentración de colesterol en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general: C Muestra =
Valores de referencia:
A
Muestra
A
Patrón
x C Patrón
Hasta 200 mg/dL (5,2 mmol/L) 200-239 mg/dL (5,2-6,21 mmol/L) >240 mg/dL (>6,24 mmol/L)
Óptimo Moderado Elevado
B. Determinación de Colesterol-HDL Precipitación 1. Pipetear en un tubo de centrífuga Muestra Reactivo A
0.2 mL 0.5 mL
2. Agitar bien y dejar durante 10 minutos a temperatura ambiente. 3. Centrifugar durante 10 minutos a 5.000 r.p.m. 4. Recoger con cuidado el sobrenadante. El sobrenadante debe ser completamente claro. En caso de persistir la turbidez o de no obtener una buena sedimentación del precipitado, adicionar otros 0,5 mL de Reactivo A, mezclar bien y centrifugar de nuevo. Multiplicar el resultado obtenido por 1,7 para corregir la dilución efectuada.
Colorimetría 5. Atemperar el Reactivo B a temperatura ambiente. 6. Pipetear en tubos de ensayo:
Patrón Colesterol HDL Sobrenadante muestra Reactivo (B)
Blanco 1.0 mL
Patrón 50 µL 1.0 mL
Muestra 50 µL 1.0 mL
7. Agitar bien e incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente (16-25ºC) o durante 10 minutos a 37ºC. 8. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al menos 30 minutos.
Cálculo: La concentración de colesterol HDL se calcula a partir de la siguiente fórmula general:
C Muestra =
A Muestra A Patrón
x CPatrón x 3.5 (Factor de dilu ción)
Valores de Referencia Las concentraciones de colesterol de HDL varían considerablemente con la edad y el sexo. El siguiente valor discriminante ha sido recomendado para identificar individuos con elevado riesgo de enfermedad coronaria. Hasta 35 mg/dL (0.91 mmol/L)
Riesgo elevado
> 60 mg/dL (1,56 mmol/L)
Riesgo bajo
C. Determinación de Triglicéridos 1. Atemperar el Reactivo a temperatura ambiente. 2. Pipetear en tubos de ensayo: Patrón de Triglicéridos Muestra Reactivo
Tubo 1 (blanco) -
Tubo 2 (patrón) 10 µL
Tubo 3 (Muestra) -
1.0 mL
1.0 mL
10 µL 1.0 mL
3. Agitar bien e incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente (16-25ºC) o durante 5 minutos a 37ºC. 4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y de la Muestra a 500 nm frente al Blanco. El color es estable durante al menos 2 horas.
Cálculo: La concentración de triglicéridos en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general: C Muestra =
A
Muestra
A
Patrón
x C Patrón
Valores de referencia: Hasta 150 mg/dL (1,7 mmol/L) 150-199 mg/dL (1,70-2,25 mmol/L) 200-499 mg/dL (2,26-5,64 mmol/L) >500 mg/dL (>5,65 mmol/L)
Bajo Dudoso Alto Muy alto
Residuos Todos se depositan en residuos orgánicos no halogenados Consulta Consultar sobre las familias de enzimas a las que pertenecen las enzimas empleadas en esta sesión.
Preguntas 1. ¿A qué clase de compuestos pertenecen triglicéridos y el colesterol? 2. ¿Cuál es el rol funcional de las diversas lipoproteínas? 3. ¿Cuál es el rol de las lipoproteínas en el proceso aterogénico? 4. ¿Qué es el colesterol HDL, LDL y VLDL?
5. Mencione algunas fuentes endógenas de colesterol Referencias 1. http://www.biosystems.es/Methods/ 2. http://www.labomed.com.ve 3. http://www.mediben.com/Nutsem2.htm
PRACTICA 11 DETERMINACION DE B ILIRRUBINAS EN SUERO SANGUÍNEO Objetivos 1. Cuantificar el contenido de bilirrubinas en suero sanguíneo 2. Dar interpretación diagnóstica del resultado. As pectos Teórico s La bilirrubina es un pigmento amarillo rojizo biliar que se encuentra normalmente en el suero como resultado de la destrucción de los eritrocitos. Es un producto de la degradación de la hemoglobina por el sistema reticuloendotelial y existe en dos formas. La bilirrubina no conjugada (indirecta) es transportada hacia el hígado donde es fijada a la albúmina donde luego es conjugada (directa) con ácido glucurónico, se excreta en la bilis pasando por el duodeno para ser eliminada. Las concentraciones de bilirrubina en la sangre pueden aumentar debido a varios motivos como son: sobreproducción de la misma, disminución de la absorción por parte del hígado, disminución de la conjugación, disminución de la secreción del hígado o bloqueo de las vías biliares. En caso de aumento de producción, disminución de absorción del hígado o disminución de la conjugación, la bilirrubina no conjugada, denominada bilirrubina indirecta, estará básicamente elevada. En casos de disminución de secreción del hígado u obstrucción de las vías biliares, la bilirrubina conjugada o bilirrubina directa, estará básicamente elevada. Existen una serie de enfermedades heredadas o adquiridas que afectan a la producción, captación, metabolismo y excreción de bilirrubina, resultando en una hiperbilirrubinemia. Se observa hiperbilirrubinemia no conjugada en recién nacidos (icterícia fisiológica), en un aumento de la destrucción de eritrocitos (anemia hemolítica, hematoma extenso), en eritropoyesis defectuosa así como en algunas enfermedades genéticas poco frecuentes (síndrome de Gilbert, síndrome de Crigler-Najjar). La hiperbilirrubinemia conjudada se asocia a una disminución en la excreción de bilis debida a enfermedades hepáticas (hepatitis o cirrosis) o bien a una colestasis intra o extrahepática. La ictericia es una manifestación clínica de la hiperbilirrubinemia, que consiste en una deposición de los pigmentos biliares en la piel, originando coloración amarillenta de la piel y mucosas. Los métodos tradicionales para la determinación de la bilirrubina se basan en la reacción de ésta con el reactivo diazo para formar el compuesto colorido azo-bilirrubina. La bilirrubina directa presente en la muestra reacciona con el ácido sulfanílico diazoado formando azobilirrubina, un complejo coloreado que puede determinarse espectrofotométricamente. La reacción diazo puede acelerarse mediante la adición de varios compuestos químicos, tales como etanol, cafeína o DMSO. Para la determinación de la bilirrubina total se adiciona un tensoactivo como agentes solubilizantes, como es el caso de la cetrimida, la cual solubiliza la bilirrubina indirecta permitiendo su reacción junto con la fracción directa. Los términos “directa” y “total” se refieren a las características de reacción en presencia o ausencia de solubilizantes (aceleradores). La bilirrubina “directa” e “indirecta” equivale sólo de forma aproximada a las fracciones conjugada y no conjugada. Bilirrubina Total + Sal de 2,4-diclorof enil diazonio
Tensoactivo
Azob il ir ru bi na
Materiales, Equipo s y Sustancias Sustancias Suero sanguíneo BILIRRUBINA (TOTAL) AT. Reactivo. Acido sulfanílico 29 mmol/L, ácido clorhídrico 0,2 mol/L, cetrimida 50 mmol/L.
Materiales y Equipos Tubos de ensayo Pipetas y micropipetas
BT. Reactivo. Nitrito sódico 11,6 mmol/L.
Espectrofotómetro
BILIRRUBINA (DIRECTA): AD. Reactivo. Acido sulfanílico 35 mmol/L, ácido clorhídrico 0,24 mol/L. BD. Reactivo. Nitrito sódico 3,5 mmol/L.
Baño de agua a 37 oC
Conservación Conservar a 15-30ºC. Los Reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, siempre que se conserven bien cerrados y se evite la contaminación durante su uso. Indicaciones de deterioro: Presencia de partículas, turbidez, absorbancia del blanco superior a 0,05 a 540 nm (cubeta de 1 cm). Características Metrológ icas − Límite de detección (bilirrubina total): 0,03 mg/dL = 0,51 µmol/L − Límite de detección (bilirrubina directa): 0,02 mg/dL = 0,34 µmol/L − Límite de linealidad: 15 mg/dL = 257 µmol/L. Cuando se obtengan valores superiores, diluir la muestra 1/3 con agua destilada y repetir la medición. − Interferencias: La hemólisis no interfiere (hemoglobina 10 g/L). La lipemia (trigliceridos > 15 g/L) Muestras Suero recogido mediante procedimientos estándar. La bilirrubina en suero es estable 2 días a 2-8ºC si se protege de la luz. Sección Experimental A. BILIRRUB INA TOTAL 1. Pipetear en tubos de ensayo: Muestra Reactivo (AT) Reactivo (BT)
Tubo 1 (blanco muestra) 100 µL 1.0 mL -
Tubo 2 (Muestra) 100 µL 1.0 mL 250 µL
2. Agitar bien y dejar reaccionar durante 2 minutos a temperatura ambiente. 3. Leer la absorbancia ( A 1) de la Muestra frente al blanco de la muestra a 540 nm. B. BILIRRUBINA DIRECTA 1. Pipetear en tubos de ensayo: Muestra Reactivo (AD) Reactivo (BD)
Tubo 3 (blanco muestra) 100 µL 1.0 mL -
Tubo 4 (Muestra) 100 µL 1.0 mL 250 µL
2. Agitar bien y dejar reaccionar durante 5 minutos a 37ºC. 3. Leer la absorbancia ( A 2) de la Muestra frente al blanco de la muestra a 540 nm. Cálculos La concentración de bilirrubina en la muestra se calcula a partir de la siguiente fórmula general: Bilirrubina total = A1 x 12,5 mg/dL, este valor es el producto de la división 2,5/0,2 donde 2,5 es la concentración
y 0,2 es la observancia del patrón. Bilirrubina directa :
A2 x 7,74 mg/dL, este valor es el producto de la división 2,5/0,2 donde 2,5 es la concentración y 0,2 es la observancia del patrón. Si se desea expresar la concentración de bilirrubina total o directa en µmol/L se puede utilizar la siguiente ecuación: Concentración masa (mg/dL) x 17,1 = concentración sustancia (µmol/L) Valores de referencia en adul tos Total Directa
Hasta 1,1 mg/dL (18,8 µmol/L) Hasta 0.25 mg/dL (4,3 µmol/L)
Significado Clínico La bilirrubina se origina por la degradación de la hemoglobina. Es transportada del bazo al hígado y se excreta en la bilis. La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma. Causas más probables de la hiperbilirrubinemia: Bilirrubina Total (T): Aumento de la hemólisis, alteraciones genéticas, anemia neonatal, alteraciones eritropoyéticas, presencia de drogas. Bilirrubina Directa (D): Colestasis hepática, alteraciones genéticas y alteraciones hepáticas. Residuos Todos se depositan en residuos orgánicos no halogenados Referencias 1. http://www.biosystems-sa.com/Methods/11515c.pdf 2. http://www.spinreact.com.mx/pdf/1001044.pdf 3. http://www.pkids.org/Spa_phrliv.pdf 4. http://www.thermo.com/eThermo/CMA/PDFs/Various/File_28459.pdf
PRACTICA 12 ANALISIS CUA LITATIVO DE ORINA Objetivos 1. Realizar un análisis cualitativo, mediante pruebas químicas, de algunos componentes de la orina, como son: la urea, la creatinina, los cuerpos cetónicos, los sulfatos, la glucosa y los cloruros. 2. Comprobar en la orina algunos de los componentes mencionados mediante el uso de tiras reactivas As pectos Teórico s
Tiras reactivas para urianálisis: Las tiras reactivas para urianálisis son tirillas de plástico firme en la cual se encuentran sujetos algunos diferentes reactivos. Dependiendo del producto que se esté usando, las tirillas reactivas proveen pruebas para la glucosa, bilirrubina, cuerpos cetónicos (Ácido acetoacetico), gravedad específica, sangre, pH, proteínas, urobilinógenos, nitrito y leucocitos en orina. El resultado de la prueba podrá suministrar información de acuerdo con el estado del metabolismo del carbohidrato, del hígado, de la función hepática, del balance ácido-base y bacteriurea. Cada tirilla es estable y lista para usarse después de removida del bote. La tirilla reactiva en su totalidad es desechable. Los resultados son obtenidos por comparación directa entre la tirilla de prueba con los bloques de color impresos en la etiqueta del bote. No se requieren cálculos o instrumentos de laboratorio. Orina: La orina es un líquido acuoso transparente y amarillento, de olor característico, excretado por los riñones y eliminado al exterior por el aparato urinario. Después de la producción de orina por los riñones, ésta recorre los uréteres hasta la vejiga urinaria donde se almacena y después es expulsada al exterior del cuerpo a través de la uretra, mediante la micción. Análisis Físico de Orina Olor : La orina normal recién emitida no huele, salvo si se han ingerido determinados alimentos (espárragos). En las infecciones por microorganismos que degradan la urea la orina huele amoníaco. En los enfermos con cetoacidosis huele a acetona. Un olor dulzón desagradable sugiere inflamación o focos supurativos urinarios. Hay errores congénitos del metabolismo en los que adquiere un olor peculiar (fenilcetonuria, enfermedad del jarabe de arce, malabsorción de metionina) con el ejemplo característico del olor a pies sudados de la acidemia isovalérica. As pecto (color y turbid ez): La orina normal tiene color amarillo. La intensidad es inversamente proporcional a la concentración de solutos. La orina muy diluida es muy pálida y si está concentrada adquiere un color amarillo intenso, debido a la mayor concentración de pigmentos excretados por el riñón, como la riboflavina. El color de la orina varía en numerosas situaciones fisiológicas y patológicas: CAUSAS ENDÓGENAS COLOR DE LA ORINA
FACTORES EXÓGENOS
Bilirrubina (conjugada) Amarillo intenso Hemoglobina y mioglobina Rojo-parduzco Hematuria Rojo turbio Porfirinas y sus Rojo precursores Melanógenos Pardo negruzca Ácido homogentísico Pardo negruzca Quiluria Blanquecina (láctea) Piuria Blanquecina (turbia)
Antocianinas (remolacha) Antraquinonas (laxantes) Rifampicina Azul de metileno
Roja Anaranjada (pH alcalino) Anaranjada Verde
L-dopa
Pardusca
Densidad: La densidad urinaria indica la capacidad de concentración/dilución del riñón. En los adultos sanos varía entre 1,002 y 1,035 g/ml. En situaciones de deshidratación extrema puede alcanzar 1,040 g/ml. La densidad urinaria es un parámetro muy variable en condiciones fisiológicas, y por lo tanto de poco valor diagnóstico, por lo que sólo hay que tenerla en cuenta si es discordante con la situación clínica que se sospeche:
— Debe ser mayor de 1,025 en situaciones de baja perfusión renal con función tubular conservada: deshidratación, diabetes mellitus mal controlada, insuficiencia cardiaca. — Debe ser menor de 1,010 en enfermos con diabetes insípida, polidipsia o bajo tratamiento diurético. — Es constante (alrededor de 1,010) en enfermos en la fase isostenúrica de la insuficiencia renal crónica. Hay diversos métodos para medir la densidad urinaria, como el clásico densitómetro de vidrio. Actualmente las tiras reactivas proporcionan una lectura aproximada. Esta prueba se basa en un intercambio iónico entre los polielectrolitos del área de prueba y los iones en la muestra, lo que resulta en un cambio de color de un indicador acido-base. Este color va de azul-verde en muestras con baja fuerza iónica hasta marrón-amarillo en orinas concentradas. Altas concentraciones de acido ascórbico (>700 mg/l) pueden simular una densidad especifica alta. Un medio acido (pH<6.5) da una densidad específica baja falsa.
La densidad medida utilizando tiras reactivas puede variar ligeramente del valor determinado por otros métodos, visto que no serán registrados aumentos de densidad causados por concentraciones de glucosa >1.000 mg/dL (> 56 mmmol/L). Excreción elevada de proteína puede llevar a resultados más altos. Orinas muy alcalinas pueden causar lecturas bajas.
Análisis Químico de Orina pH urinario: el pH es el inverso del logaritmo de la concentración de iones hidrógeno. Valores bajos indican acidez y valores altos alcalinidad. La orina ácida se asocia con cálculos de xantina, cistina, ácido úrico y oxalato de calcio; en tanto que la orina alcalina se asocia con cálculos de carbonato de calcio, fosfato de calcio y fosfato de magnesio. En adultos sanos oscila entre 4,5 y 8,0 aunque normalmente es ligeramente ácido. Esta acidez se atribuye a la presencia de fosfato ácido y ácidos orgánicos libres. Disminuye en situaciones de acidosis fisiológica (ayuno) y patológica (salvo en las acidosis tubulares), así como si se sigue una dieta rica en proteínas o si hay deshidratación o proliferación en la orina de bacterias productoras de ácido. Aumenta después de las comidas, en situaciones de alcalosis y si hay colonización por gérmenes que degradan la urea, como Proteus (olor amoniacal), dieta vegetariana o vómitos pertinaces. La prueba con la tira reactiva se basa en el método de doble indicación de pH. En donde el azul de bromotimol y el rojo de metilo dan colores distintivos sobre los rangos del pH de 5-9 el rango de los colores desde el rojoanaranjado hasta el amarillo y el amarillo-verde hasta el azul-verde. El valor del pH en orina reciente de un paciente sano varía entre 5 y 6. La escala cromática distingue claramente valores entre pH 5 y pH 9. El valor pH siempre se debe determinar en orina recién recolectada, evitando, de esa manera, el aumento indeseado a valores pH > 9, causado por la descomposición bacteriana. Proteínas: la albumina urinaria es una mezcla de seroalbumina y seroglobulinas. La albuminuria se atribuye a una lesión renal (nefrosis) o la inflamación del órgano (nefritis). En condiciones normales el contenido en proteínas de la orina no rebasa los 150 mg/24 horas en el adulto. La tira reactiva es altamente sensible para albúmina, pero no para globulinas o hemoglobina. La sensibilidad mínima de la tira reactiva es de 10 mg de proteína/dL de orina. Los campos de referencia corresponden a las siguientes concentraciones de albúmina: negativo, 30, 100 y 500 mg/dL o 0,3, 1,0 y 5,0 g/L. Resultados falsopositivos son posibles en orinas alcalinas (pH>9), tras la infusión con polivinilpirrolidina (sustituto sanguíneo), tras la ingestión de medicamentos conteniendo quinina y también por residuos de desinfectantes en el recipiente de colecta. La coloración de la proteína se puede enmascarar por la p resencia de colorantes médicos (azul de metileno) o pigmentos de remolacha El significado patológico de la proteinuria depende de su cuantía, de las características de las proteínas excretadas y de las circunstancias en que se produce. Por lo tanto, ante una proteinuria positiva, es necesario cuantificarla y expresarla en cantidad eliminada en 24 horas y además realizar un estudio electroforético que permita conocer la proporción de las distintas proteínas. En términos cuantitativos, la proteinuria se clasifica en
4 categorías: microalbuminuria, proteinuria leve (de 150 mg a 1 g/24 horas), moderada (de 1 a 3,5 g/24 horas) y grave o nefrótica (más de 3,5 g/24 horas). Glucosa: La presencia glucosa en orina es anormal y se denomina Glucosuria. Esta se da por estado de hiperglucemia, en donde los niveles plasmáticos de glucosa sobrepasan los 170 mg/dl. La hiperglucemia indica un mal control de la diabetes mellitus o un estado transitorio de resistencia a la insulina. Las tiras reactivas son muy específicas, basadas en el método de la glucosa-oxidasa, que ha desplazado a métodos clásicos, como el de Benedict, que no es específico para glucosa (otros azucares reductores como la fructosa y la galactosa también dan prueba positiva). Esta prueba está basada en un principio de una reacción secuencial doble de una enzima. Una enzima; la glucosa oxidasa, cataliza la formación de ácido glucónico y el peróxido de hidrógeno de la oxidación de la glucosa. Una segunda enzima, peroxidasa, cataliza la reacción de peróxido de hidrógeno de potasio iodado a cromógeno oxidado. Concentraciones patológicas de glucosa se indican por un cambio de coloración de verde a verde azulada. Áreas reactivas amarillas o verdosas se deben considerar como resultado negativo o normal. Todas las áreas que presentan un verde más intenso que el campo de referencia negativo indican un resultado positivo. Los campos de referencia corresponden a los siguientes rangos de concentración de glucosa: neg. (amarillo), neg. o normal (verdoso), 50, 150, 500 y 1000 mg/dL o neg. (amarillo), neg. o normal (verdoso), 2,8, 8,3, 27,8 y 55,5 mmol/L. Gran cantidad de ácido ascórbico presente en la orina tras la ingestión de vitamina C (p. ej., tabletas de vitamina, antibióticos o jugos de fruta) puede llevar a resultados bajos o falsamente negativos. Adicionalmente, un efecto inhibidor se produce por ácido gentísico. Reacciones falso-positivas también pueden ser causados por residuos de peróxido presente en detergentes domésticos. Cuerpos cetónicos: Derivan del metabolismo lipídico y son tres: ácido acetoacético, acetona y ácido 3hidroxibutírico. La cetonuria (presencia de cuerpos cetónicos en orina) se da en situaciones de ayuno prolongado y se ve facilitada por la existencia de vómitos, especialmente en niños pequeños. En la deficiencia insulínica se produce un incremento del metabolismo de los ácidos grasos, con formación final de cuerpos cetónicos que se eliminan por la orina. La cetonuria en un diabético indica un control metabólico muy deficiente y es anuncio de una grave complicación, el coma cetoacidótico. Los cuerpos cetónicos, acetona y acetoacetato, se detectan mediante tiras reactivas impregnadas con nitroprusiato sódico en medio alcalino dando un rango de colores que van desde el beige o rosa tenue para un resultado “negativo” hasta uno rosa y rosa-púrpura para una lectura “positiva”. La toma de aspirina o de LDOPA a dosis altas puede inducir falsos positivos. Un resultado negativo del examen es normal. Los resultados de la presencia de acetona en la orina generalmente aparecen como pequeña, moderada o grande con sus valores correspondientes: Pequeña: < 20 mg/dL, Moderada: 30-40 mg/dL, Grande: > 80 mg/dL
Creatinina: La creatinina (Cr) procede del metabolismo de la creatina del músculo esquelético. La eliminación urinaria de creatinina es bastante constante, de 0,8 a 1,8 g/24 horas, y disminuye en la insuficiencia renal, mientras que aumenta en situaciones de rabdomiolisi s o ingesta proteica excesiva. En solución básica la creatinina reacciona con acido pícrico dando un complejo de color rojo, el cual se utiliza para su determinación colorimétrica.
Urea: La urea es el principal metabolito de las proteínas, se filtra con facilidad por el glomérulo y se reabsorbe en un 40-50 % en el túbulo, aunque este porcentaje varía en función del grado de hidratación y de la diuresis. La excreción urinaria de urea oscila entre límites muy amplios: 6-20 g/día en adultos, 13-15 g/día en niños y 2-3 g/día en lactantes. Aumenta en estados de hipercatabolismo proteico y en dietas ricas en proteínas y disminuye en la insuficiencia hepática (por reducción de la síntesis) y en la insuficiencia renal.
Cloruros: Aparte de la urea, son los cloruros las sustancias más abundantes en la orina. El más importante es el de sodio y todos ellos derivan principalmente de los alimentos; por lo tanto, su expulsión fluctua según lo ingerido. Durante el ayuno puede desaparecer su expulsión, permitiendo asi que se mantenga durante algún tiempo su concentración normal en la sangre. Su determinación puede realizarse mediante el precipitado blanco de cloruro de plata que se forma cuando se trata la mezcla que contiene cloruros con una solución de nitrato de plata. La excreción diaria oscila normalmente entre 80 y 180 mEq/24 horas. Sus oscilaciones en condiciones patológicas suelen ir paralelas a las del sodio. El cual, en la insuficiencia renal “prerrenal”, por disminución del flujo sanguíneo renal, así como en el síndrome hepatorrenal, el riñón reabsorbe ávidamente el sodio y su concentración en orina suele ser inferior a 10 mEq/l. En la insuficiencia renal intrínseca el túbulo pierde su capacidad de reabsorción de sodio y la concentración supera los 20 mEq/l. Bilirrubina y urobilinógeno: Son los principales pigmentos biliares que pueden aparecer en la orina. La bilirrubina es el producto final del metabolismo del hemo y el urobilinógeno es su principal producto de degradación por las bacterias de la flora intestinal. Por lo tanto, si no hay paso de bilirrubina al intestino, no se producirá urobilinógeno. Una pequeña parte del urobilinógeno se reabsorbe y es eliminado por la orina en forma de urobilina. La excreción máxima de urobilina por orina es de 5 mg/24 horas en el adulto sano. La determinación de bilirrubina y urobilina en orina se realiza mediante tiras reactivas, que integran el acoplamiento de la bilirrubina con sales diazotadas estabilizadas en medio fuertemente acido. Normalmente la bilirrubina no se detecta en la orina. Cantidades muy escasas son indicador suficiente de una enfermedad del hígado. La reacción no se afecta por el pH urinario. Resultados falsos bajos o negativos se observan con altas concentraciones de acido ascórbico. La luz solar directa promueve la oxidación de la bilirrubina y produce por eso falsos bajos o negativos. Concentraciones de urobilinogeno superiores a 100 µmol/l producen u n cambio en el color de la zona reactiva de la bilirrubina el cual vira a color naranja (realizar la lectura al cabo de los 2 minutos de haber escurrido la orina). Falsos positivos se observan con la presencia de metabolitos de drogas que desarrollan color en pH acido, como por ejemplo las fenazopiridinas. La sensibilidad mínima de la tira reactiva es de 0,5 a 1mg de bilirrubina/dL de orina. Los campos de referencia corresponden a los siguientes valores: 0 (negativo), 1 (+), 2 (++), 4 (+++) mg/dL o 0 (negativo), 17 (+), 35 (++), 70 (+++) mmol/L. NITRITO: La presencia de nitritos en orina es signo de colonización o infección bacteriana. La mayoría de los gérmenes Gram negativos que suelen colonizar la orina reducen los nitratos a nitritos, y en esta propiedad se basa la detección por tiras reactivas. El Test es específico para nitritos y no reacciona con los demás componentes de la orina. Un resultado negativo no indica la ausencia de bacterionuria, ya que los organismos que no contienen reductasa para convertir el nitrato en nitrito no son detectados. El test presenta una sensibilidad de 13-22 umol/L y tiene como interferencias la elevada densidad específica de la orina y el ácido ascórbico (1,40 mmol/L), los cuales pueden reducir la sensibilidad del método. Cualquier coloración rosa indica una infección bacteriana del tracto urinario. La intensidad del color representará la concentración del nitrito, pero no proporciona información con respecto a la extensión de la infección. Un resultado negativo no excluye la hipótesis de una infección del tracto urinario, si ésta es causada por una bacteria que no reducen los nitratos ( Enterococcus spp., S. saprophyticus, Acinetobacter y Candida spp.). Resultados falso- negativos se pueden provocar por altas dosis de ácido ascórbico, por terapia con antibióticos, o por una concentración muy baja de nitrito como resultado de una dieta pobre en nitrato o fuerte dilución (diuresis). En muestras de pacientes femeninas, el flujo vaginal puede causar resultados falso-positivos. A fin de evitar reacciones falso-positivas, antes de la co lecta, se deben debidamente lavar lo s órganos genitales. Esta prueba depende en la conversión de nitrato en nitrito mediante la acciòn de bacteria gram negativaen la orina. En un medio àcido el nitrito en la orina reacciona con àcido p-arsanìlico para formar un compuesto diazònico. El compuesto diazonio forma un par con 1N-(1-naptil)-etilenediamine para producir un color rosado. En el cuadro siguiente se resumen las enfermedades asociadas a la presencia de algunas sustancias en la orina:
Consideraciones sobre las tiras reactivas
a. Reactivos (Basados en pesos secos al momento de la impregnación) Reactivo
Tiempo de Lectura
Aci do Asc órbi co
30 Segundos
Glucosa
30 Segundos
Bilirrubina
30 Segundos
Cuerpos Cetònicos
40 Segundos
Gravedad Especìfica
45 Segundos
Sangre
60 Segundos
Composición 0,3% w/w 2,6-diclorofenolindofenol 99,7% w/w buffer e ingredientes no reactivos 1,5% w/w glucosa oxidasa; 0,5% w/w peroxidasa; 10% w/w yoduro de potasio 75% w/w buffer; 13% w/w ingredientes no reactivos.
Descripción Detecta Acido Ascórbico tan bajo como 5-10 mg/dl (0,28-0,56 mmol/l) Detecta glucosa tan bajo como 50100 mg/dl (2,5-5 mmol/l), Los resultados Pueden ser leìdos a los 10 segundos cualitativamente y en treinta segundos para resultados semi-cuantitativos.
0,5% w/w 2,4-dicloroanilina sal diazònica; 99,5% w/w buffer e ingredientes no reactivos.
Detecta bilirrubina desde 0,4-0,8 mg/dl (6,8-13,6 µmol/l).
5% w/w Nitroprusiato de sodio, 95% w/w buffer
Detecta àcido acetoacètico desde 2,5-5 mg/dl (0,25-0,5 mmol/l).
2,5% w/w indicador Azul de bromotimol 17,5% w/w buffer e ingredientes no reactivos; 55% (Eter metil Vinìlico /Anhídrido maleico); 25% Hidròxido de sodio.
Determina la gravedad Especìfica entre 1,000-1,030. Los resultados correlativos con los valores obtenidos por el mètodo del Index refractario entre ±0,005.
4% w/w 3,3’ ,5,5’–Tetrametilbenzidina (TMB); 6% w/w Hidroperòxido de Cumena; 90% w/w buffer e ingredientes no reactivos.
Detecta Hemoglobina libre desde 0,015-0,062 mg/dl o 5-10 Ery/µl en especimenes de orina con, contenido de Acido Ascórbico de <50 mg/dl.
0,5% w/w Rojo de metilo sal sòdica, 5%
Permite la diferenciación cuantitativa
pH
60 Segundos
w/w Azul de bromotimol; 94,5% w/w de Ingredientes no reactivos.
de valores de pH entre el Rango de 5-9.
Proteínas
60 Segundos
0,3% w/w Azul de tetrabromofenol; 99,7% w/w buffer e ingredientes no reactivos
Detecta albúmina desde 7,5-20 mg/dl (0,075-0,2 g/l).
Urobilinògeno
60 Segundos
2,5% w/w p-dietilaminobenzaldehido; 97,5% w/w buffer e ingredientes no reactivos.
Detecta el Urobilinògeno desde 0,2-1,0 mg/dl (3,5-17 µmol/l).
Nitritos
60 Segundos
4,5% w/w p-Acido Arsanìlico; 95,5% w/w ingredientes no reactivos.
Detecta el nitrito de sodio desde 0,05-0,1 mg/dl, en orina con una gravedad Especìfica baja y con menos de 30 mg/dl de Acido Ascórbico.
Leucocitos .
120 Segundos
0,5% del derivado del ester del Acido amino pirrol; 0,4% w/w sal diazònica; 32% w/w buffer; 67,1% w/w Ingredientes no reactivos.
Detecta leucocitos tan bajo como 1025 glóbulos blancos Leu/µl en orinas clínicas
b. Advertencias y precauciones: Las tiras reactivas para orina son para uso in vitro. No toque las áreas de prueba de las tirillas de orina. c. Almacenaje: Almacene a temperatura ambiente e ntre 15°-30°c (59°-59°F) y fuerza de la luz directa del sol. No las utilize después de la fecha de expiración. d. Procedimiento recomendado para su menejo: Todas las tirillas no usadas deberán permanecer en el bote. Él transferirlas a otro contenedor podrá causar el deterioro de las tirillas y volverse no reactivas. No tire el secante del bote. No abra el contenedor hasta que esté listo para usarse. Los botes abiertos deberán ser usados dentro de los 3 siguientes meses después de abiertos. e. Recolección de la muestra y preparación: Recolecte la muestra de orina en un contenedor limpio y realice la prueba lo más pronto posible. No centrifugue. No se recomienda el uso de conservadores para orina. Si la prueba no se puede llevarse a cabo dentro de una hora después de la recolección, refrigere la muestra inmediatamente. Permita que la muestra refrigerada tome la temperatura ambiente antes de realizar la prueba.
Sustancias y Materiales Sustancias Orina Solucion fenol-nitroprusiato de sodio: 4,7g fenol y 6mg de nitroprusiato de sodio en 100ml de agua desionizada ( 250ml) Nitroprusiato de sodio 0.1M Hipoclorito de sodio alcalino: disolver 2g de NaOH en 100ml de agua desionizada y agregar 7,5ml de hipoclorito de sodio comercial al 5%. Guardar en frasco ambar. Nitrato de plata 1% Acido pícrico 1% Hidróxido de sodio 1M Reactivo de Benedict Acido acético 10% Reactivo de Biuret
Sección Experimental
Materiales Tubos de ensayo Un baño de agua a 40ºC y otro de agua hirviendo Tiras reactivas para el análisis de orina
A. Pruebas Químicas 1. pH: Tome una tira de papel indicador, sumérjala en la orina y determine el valor del pH 2. Urea: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 10 gotas de la solución fenol-nitroprusiato y 10 gotas de hipoclorito alcalino. Coloque el tubo en un baño de agua a 40 ºC durante 5 minutos y anote los resultados. La aparición de una coloración azul-violeta es positivo para urea. 3. Creatini na: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 4 gotas de la solución de ácido pícrico y 4 gotas de hidróxido de sodio 1M. La aparición de una coloración naranja que se torna rojiza es prueba positiva para creatinina. 3. Cuerpos cetónicos: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 10 gotas de la solución de nitroprusiato y 10 gotas de hidróxido de sodio 1M. Anote la aparición de algún color. Coloque el tubo en un baño de agua hirviendo y observe si hay algún cambio. En caliente adicione 5 gotas de ácido acético al 10%. Observe y anote los resultados. La formación de un complejo verde-azul es prueba positiva para acetona. 4. Clorur os: Adicione 1.0 mL de orina en un tubo de ensayo y añadale 1 gota de nitrato de plata. La formación de un precipitado blanco es prueba positiva para cloruros. 6. Glucosa y otros azucares reductores: añada 1.0 mL de orina a un tubo de ensayo, adiciónele 2 mL de solución de Benedict y caliente la solución en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos. Enfríe el tubo a temperatura ambiente. Si la solución permanece transparente y azul, significa que no hay glucosa (o cualquier otro azúcar reductor). Si la solución es verde, la muestra de orina contiene aproximadamente 0.25% de glucosa; si es amarilla, 1% de glucosa; si es naranja, más del 1% de glucosa; y si es rojo ladrillo, más del 2% de glucosa. 7. Albúmina: Coloque 1.0 mL de orina en tubo de ensayo, adicione 10 gotas de hidróxido de sodio al 25 % y 10 gotas del reactivo biuret. Observe y anote los resultados. La aparición de una coloración violeta es prueba positiva para proteínas. B. Prueba con Tiras Reactivas Notas de la prueba 1. Se recomienda usar solo orina fresca, bien homogenizada y sin centrifugar. Se recomienda usar la primera orina de la mañana por que se concentra durante la noche. 3. La recolección de la muestra debe realizarse en frascos limpios y libre de desinfectactes o detergentes. 4. No tocar las zonas reactivas de las tiras. 5. Inmediatamente después de retirar el número de tiras necesarias, tapar correctamente el envase. 6. Retire el bote solamente de las tirillas necesarias para usarse inmediatamente y tape nuevamente el bote bien cerrado. Procedimiento 1. Sumerja completamente la tira reactiva en la muestra de orina por dos segundos. 2. Mientras es retirada, toque la tirilla por un lado con el borde del bote para retirar el exceso de orina. 3. Coloque la tira sobre una toalla de papel absorbente para eliminar el exceso de orina y evitar que se corra (contaminación de los cuadros reactivos adyacentes). 4. Compare cada área de reacción a su bloque de color correspondiente en la tabla y lea a los tiempos específicos. La lectura apropiada a tiempo es crítica para obtener resultados óptimos 5. Obtenga los resultados directos por medio de la comparación directa de colores
NOTA: Todas las áreas de los reactivos a excepción de los leucocitos deberán ser leídas entre 1-2 minutos para visión de orina positiva de orina negativa. Los cambios en el color después de 2 min no son para valores de diagnóstico.
Bibliografía 1. http://www.mn-net.com 2. http://es.wikipedia.org/wiki/Orina 3. http://www.hsa.es/org/dmedica/centrales/bioquimica/docs/boletin/Sistematico_de_Orina.pdf 4. http://protgtstore.com/pdf/PruebaUrianalisisACON.pdf 5. http://www.spinreact.com.mx/pdf/52010.pdf 6. ftp://ftp.mn-net.com/espanol/Flyer_Catalogs/Medi-Test/Br_Medi-TestES.pdf 7. Holum, John r, Practicas de química general, química orgánica y bioquímica, México, Limusa Wiley, 1972, p: 143.
PRACTICA 13 TITULACIÓN DE AMINOÁCIDOS Objetivos 1. Realizar la titulación de un aminoácido y hacer su correspondiente curva de titulación 2. Determinar a partir de la curva de titulación los valores de pKa y el punto isoeléctrico 3. Determinar las posiciones de las formas iónicas de los aminoácidos al variar el pH. As pectos Teórico s Generalidades Las proteínas son biomoléculas grandes que se encuentran en todo organismo viviente. Existen muchos tipos y tienen funciones biológicas diferentes. La queratina de la piel y las uñas, la fibroina de la seda, las telas de la araña y la mayor parte de las enzimas que catalizan las reacciones biológicas dentro de las células son proteínas. Las proteínas están constituidas de muchas unidades de aminoácidos enlazados en una cadena larga (figura 1). Estructura general de una proteína H H2N
H
O
H
R 3
O
C
N
C
C
C
C
N
C
R 1
O
H
R 2
OH
H n
Aminoácido N-terminal
Aminoácido C-terminal
Enlaces amídicos
Figura 1. Estructura de una proteína Los aminoácidos, como su nombre lo indica, son compuestos orgánicos bifuncionales. Contienen un grupo amino básico y un grupo carboxilo ácido (figura 2): H
R C H2N
O C OH
Figura 2. Estructura general de un aminoácido La hidrólisis ácida, básica o enzimática de las proteínas de todos los seres vivos produce veinte α-Laminoácidos, los cuales se muestran en la siguiente tabla:
Tabla única. Aminoácidos presentes en las proteínas Nombre Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina Serina Treonina Cisteina Metionina Acido aspartico Asparagina Acido glutámico Glutamina Arginina Lisina Histidina Fenilalanina Tirosina Triptófano Prolina
Símbolo Gly Ala Val Leu Ile Ser Thr Cys Met Asp Asn Glu Gln Arg Lys His Phe Tyr Trp Pro
pK1 (α-COOH) 2.4 2.4 2.2 2.3 2.3 2.2 2.1 1.9 2.1 2.0 2.1 2.1 2.2 1.8 2.2 1.8 2.2 2.2 2.4 2.0
pK2 (α-NH3+) 9.8 9.9 9.7 9.7 9.8 9.2 9.1 10.8 9.3 9.9 8.8 9.5 9.1 9.0 9.2 9.3 9.2 9.1 9.4 10.6
pK3 ~ 13 ~ 13 8.3 3.9 4.1 12.5 10.8 6.0 10.1 -
Definición de ácidos y bases Un ácido y una base se pueden definir según los modelos de Lewis y Brönsted, los cuales se explican a continuación:
En el modelo de Lewis, un ácido es una molécula que es capaz de aceptar pares de electrones y una base es aquella molécula que tiene la capacidad de donar pares de electrones. En la siguiente ecuación se puede observar que el enlace, entre el nitrógeno y el aluminio, es formado por el par libre de electrones provenientes del amoniaco. +
H3N
AlCl 3
Base Lewis
H3N-AlHCl3 Complejo ácido-base Lewis
Ácido Lewis
En la definición de Brönsted, las sustancias que tienen la capacidad de donar protones son clasificados como ácidos Brönsted y las sustancias que sirven como aceptores de protones se clasifican como bases Brönsted. En la siguiente ecuación se ejemplifica un caso general de la reacción ácido-base cuyo equilibrio está determinado por la fuerza ácida y básica relativa de los reactivos y donde las concentraciones de equilibrio pueden ser calculadas a través de la constante de equilibrio, K. En esta ecuación, igualmente, se define lo que se conoce como ácido y base conjugados. HA Ácido
+
K
B
BH
+
A
Base Ácido conjugado conjugada de HA de B
Base
Fuerza ácida
Ácidos Carboxílicos: La fuerza ácida es la capacidad que tiene una sustancia de donar protones. Esta se determina por medio de la constante de acidez o constante de ionización ácida, la cual está definida de la siguiente manera: RCOOH + H2O
RCOO- + H3O+
Ka =
[H 3O+][RCOO--] [RCOOH]
Como los valores de Ka son pequeños, es más conveniente manejar la acidez en términos del pK a, el cual está definido igual que el pH como:
pK a = - Log K a
Mientras más bajo sea el valor del pK a para una sustancia más ácida será esta. Aminas: Las aminas son el resultado del reemplazo de uno ó varios átomos de hidrógeno por grupos alquílicos o arílicos en la molécula de amoniaco. Son las bases orgánicas más fuertes encontradas en los organismos vivientes, aunque su fuerza básica es moderada comparada con las bases inorgánicas; al igual que en el amoniaco, es el par libre de electrones sobre el nitrógeno el que tiene la habilidad para enlazarse al protón. N
R
R2 R1
dond e R, R1 y R 2 son grupos alquílicos ó arílicos
Ami na
RNH2
+
Kb
H 2O
+
RNH3
Amina
OH
Sal de amonio
La fuerza básica relativa de una base se determina en términos del valor del pK a de su ácido conjugado. Entre más grande sea el valor del pK a del el ácido conjugado, más básica es la amina: +
RNH 3
Ka
H2 O
+
H 3O
RNH 2
[H +][RNH2]
K a =
[RNH3+]
Estructuras de los aminoácidos Como los aminoácidos contienen un grupo ácido y un grupo básico, presentan una reacción ácido-base y se encuentran principalmente en la forma de un ion bipolar o zwitterión (figura 3):
R
H
O
C
C
OH
H
O
C
C
R
O-
NH3+
NH2
Forma ionizada (zwitterión)
Figur a 3. Formación del ion dipolar de un aminoácido Los iones dipolo de los aminoácidos son sales internas y por ello tienen muchas de las propiedades físicas asociadas con las sales. Son solubles en agua e insolubles en solventes poco o no polares y son sustancias cristalinas de punto de fusión alto. Además, los aminoácidos son anfóteros: pueden reaccionar como ácidos o bases, dependiendo del pH. En solución acuosa ácida, un ion dipolo de un aminoácido se comporta como una base que acepta un protón para formar un catión; en solución acuosa básica, es un ácido que pierde un protón y da lugar a un anión (figura 4). H
R
H
R +
C
H3O
O
+
H 3N
C
O
+
C
H3N
O_
OH
H
R
H2O
+
C
H
R -
C +
H3N
O C O_
OH
C H2N
O
+
H2O
C O_
Figura 4. Comportamiento anfótero de un aminoácido
Note que es el carboxilato, -COO -, no el grupo amino, el que actúa como sitio básico y acepta un protón en solución ácida. De modo similar, es el catión amonio, -NH 3+, y no el grupo carboxilo, el que funciona como el sitio acídico y dona un protón en solución básica. Puntos isoeléctricos En solución ácida, un aminoácido se protona y se encuentra principalmente como un catión. En solución básica, se desprotona y se presenta como anión. Así, debe haber un pH intermedio al cual el aminoácido este equilibrado entre las formas aniónica y catiónica y se encuentre como el ion dipolo neutro. Este pH se llama punto isoeléctrico pI del aminoácido (figura 5).
C
+H N 3
O C
I
H
R
H
R
OH
pH bajo (protonado)
OHH3O+
+H
C 3N
O C
II
OHH3O+
O_
pH
H
R C H2N
O C
III
O_
pH alto (desprotonado)
Punto isoeléctrico (ion dipolo neutro)
Figura 5. Punto isoeléctrico del aminoácido El punto isoeléctrico de un aminoácido depende de su estructura. Los 15 aminoácidos con cadena lateral neutras o algo ácidas tienen puntos isoeléctricos cercanos a la neutralidad, en el intervalo de pH de 5.0 a 6.0, los dos aminoácidos con cadenas laterales más ácidas, presentan puntos isoeléctricos a un pH menor y los tres aminoácidos con cadena lateral básica tienen puntos isoeléctricos a un pH más elevado. Los puntos isoeléctricos de los 13 aminoácidos sin cadena lateral acida o básica son el promedio de las dos constantes de disociación, pKa1 y pKa2. La alanina, por ejemplo, tiene p Ka1 = 2.34 y pKa2 = 9.69, de modo que el pI de la alanina es (2.34 + 9.69)/2 ó 6.01. Para los cuatro aminoácidos con una cadena lateral muy acida, el pI es el promedio de los dos valores más bajos de p Ka, por último, para los tres aminoácidos con una cadena lateral básica, el pI es el promedio de los dos valores más altos de p Ka. Titulación de un aminoácido La titulación es un procedimiento analítico que consiste en agregar a una solución del aminoácido cantidades sucesivas de un agente titulante (acido o base) registrando simultáneamente los valores de pH que se generan. Los datos obtenidos se grafican, ubicando los volúmenes del titulante en la abscisa (eje x) y los valores de pH en la ordenada (eje y), de la unión de estos puntos se obtiene una gráfica denominada curva de titulación, a partir de la cual se pueden determinar los valores de pKa y el punto isoeléctrico de los aminoácidos. La siguiente figura muestra los cálculos y el grafico de titulación para determinar el p I de la alanina.
Figura 6. Curva de titulación y cálculo de pI para la alanina
La forma de la curva de titulación presenta dos regiones planas amortiguadas y una inflexión con una vertical muy pronunciada; las regiones planas indican la mínima variación del pH a medida que se agrega la base, ello muestra la presencia de dos sistemas amortiguadores, el primero formado por las especies I y II, y el segundo por las especies II y III. La máxima capacidad de ellos se obtiene a la mitad de cada semititulación, cuando la concentración de las especies I y II, y II y III, son iguales; para el primer sistema el punto medio muestra un pH = 2.3, y ese será el pKa del equilibrio entre las especies I y II, en otro sistema el punto medio ocurre a un pH = 9.7, y será por lo tanto el pKa del equilibrio entre las formas II y III. La región vertical de la curva indica una variación brusca del pH con mínimas adiciones de NaOH, denotando la finalización de la primera semititulación y la no presencia de sistemas amortiguadores; igual situación ocurre al inicio y final de toda la titulación, donde la presencia mayoritaria de una sola especie provoca esas variaciones bruscas en el pH. Lo práctico de este hecho es que sirve para mostrar el punto final de la titulación y para determinar con cierta aproximación el punto isoeléctrico del aminoácido, entendido como el pH correspondiente al punto medio de la parte más vertical de la curva de titulación, que en este caso seria 6.0. Las curvas de titulación de los aminoácidos con grupos en su cadena lateral que se ionizan, tales como la histidina, la lisina y el acido glutamico, son más complejas, puesto que son una combinación de la curva correspondiente a la disociación del grupo de la cadena lateral y las curvas de valoración de los grupos α-amino y α-carboxilo. A continuación se muestran las curvas de titulación para la lisina y acido glutámico respectivamente (figura 7). H3N(CH2)4CHCO 2H NH3
OHH3O
Forma dicatiónica
+
H3N(CH2)4CHCO2NH3
OH+
H3O
NH2
Forma monocatiónica
pKa 1 = 2.2
H3N(CH2)4CHCO2-
OH-
H2N(CH2)4CHCO2-
H3O+
NH2 Forma aniónica
Ion dipolar pKa 3 = 10.5
pK a2 = 9.0
A
HO2CCH2CH2CHCO2H NH3
B
OH+
H3O
HO2CCH2CH2CHCO2NH3
OH+
H3O
-O2CCH2CH2CHCO2NH3
Forma monocatiónica
Ion dipolar
Forma aniónica
pK a2 = 2.19
pK a3 = 4.25
pK a1 = 9.67
OH+
H3O
-O2CCH2CH2CHCO2NH2 Forma dianiónica
Figura 7. Curva de titulación y cálculo de pI para A). lisina y B). ácido glutámico Materiales, Equipos y Sustancias Sustancias Materiales y Equipos Solución de aminoácidos (glicina, alanina, Beakers tirosina) 0.1M en HCl 0.05M Solución de NaOH 0.1M Bureta de 25 mL Agua destilada pH-metro Sección Experimental 1. Calibre el pH-metro. Siga las instrucciones del profesor para calibrar y limpiar pH-metro. 2. Adicione 10 mL de la solución de aminoácido suministrada por el profesor, a un erlenmeyer y sumerja el electrodo indicador de pH; anote el valor. 3. Con un poco de NaOH 0.1M enjuague una bureta, bote el residuo y proceda a llenarla con la misma solución. 4. Adicione 0.5 mL de NaOH 0.1M a la solución de aminoácido, agite, mida y anote el pH. 5. Continúe agregando de a 0.5 mL de NaOH 0.1M hasta que el pH sea cercano a 12. No olvide medir y anotar el pH después de cada adición de titulante. 6. Consulte con el monitor donde depositar el NaOH sobrante; proceda luego a enjuagar la bureta con abundante agua.
Informe • • •
Haga una gráfica de pH vs mL de NaOH De la curva anterior deduzca y justifique, para el aminoácido que está titulando, los valores de pKa1, pKa2, y pI. Compárelos con los reportados en la literatura. Escriba la reacción que sufre la forma dipolar del aminoácido a medida que se adiciona la base.
Residuos Todos se depositan en residuos para neutralizar Referencias 1. Hormaza, Angelina, Manual de laboratorio de biorganica, Medellin : Universidad Nacional de Colombia,