EVIDENŢIEREA CARACTERULUI KILLER LA DROJDII
Drojdiile reprezintă un grup de microorganisme eucariote cu organizare unicelulară. Dintre drojdii, un model experimental pentru majoritatea studiilor biologice este S accharomyces cerevisiae.
Una dintre caracteristicile caracteristicile multor tulpini de drojdii, asociată cu un determinism genetic extracromosomal, este sinteza unor toxine glicoproteice capabile de a omorî alte tulpini înrudite (caracterul
) faţă de care tulpina producătoare este imună. Fenomenul a fost descoperit descoperit
killer
pentru prima oară în 1963 la S. cerevisiae, ulterior fiind descris şi la alte genuri şi specii de drojdii. În prezent se cunosc 11 tipuri de toxine
killer
biochimic diferite, produse de diverse
genuri de drojdii. Activitatea killer la S. cerevisiae a fost împărţită în trei tipuri: K 1 (specific tulpinilor de laborator), K 2 şi K 3 (specifice tulpinilor utilizate în procesele tehnologice de fabricare a berii şi vinului). În cazul tulpinilor de S. cerevisiae ce manifestă acest fenotip, ss-a dovedit că ele conţin în citoplasmă una sau mai multe specii moleculare de virusuri ARN dublu catenar (ARN d.c.). Aceste molecule prezintă foarte multe similarităţi cu virusurile ARN d.c. de la organismele eucariote superioare, motiv pentru care virusurile de acest tip de la S. cerevisiae constituie un model de studiu pentru descifrarea mecanismelor ce guvernează replicarea virală, transcrierea ADN-dependentă ADN-dependentă precum şi relaţiile dintre funcţiile funcţiile virale şi cele ale ale gazdei . Virusurile ARN d.c. de la drojdii includ 3 familii de genomuri ARN d.c.: L-A, L-BC L-BC şi M. Particulele M codifică pentru toxina killer şi factorul de imunitate, iar particulele L codifică pentru proteinele capsidale M şi L, polimeraze necesare replicării ambelor tipuri t ipuri de genomuri ge nomuri şi au şi rol de helper în procesele de infecţie. Particulele killer de la Saccharomyces cerevisiae sunt alcătuite din genom ARN dublu catenar încapsidat în particule de tip viral - virus like. Toxina killer este sintetizată sub forma unui precursor format din trei subunităţi: α, β, γ. Subunităţile α şi β vor forma toxina killer, killer, iar subunitatea γ va forma forma factorul de imunitate. După sinteză, precursorul toxinei este este transportat la nivelul reticulului endoplasmic unde au loc modificări postpost-translaţionale de tipul glicozilării. În cursul transportului, precursorul este fragmentat în subunităţile corespunzătoare sub acţiunea unor proteaze specifice.
Modul de acţiune al toxinei killer
1
Proteina killer recunoaşte şi se leagă la nivelul unui receptor specific localizat la suprafaţa peretelui celular al a l celulelor sensibile. La acest nivel toxina to xina este scindată proteolitic în cele ce le două subunităţi, în interiorul celulelor celulelor pătrunzând păt runzând numai subunitatea subunitatea . Efectul letal al toxinei se datorează formării unor pori ireversibili la nivelul membranei plasmatice prin care celula pierde o serie de constituenţi esenţiali. esenţiali. Semnificaţia biotehnologică a fenomenului killer
Caracterizarea taxonomică a anumitor anumitor specii sau tulpini de drojdii - biotipare;
Caracterul killer poate constitui factor de selecţie în experimentele de transfer de material
genetic, inclusiv în fuziunile de protoplaşti;
Pentru protecţia proceselor de fermentaţie pentru obţinerea vinului. vinului. Protocol de lucru
Pentru evidenţierea caracterului killer la S. cerevisiae se utilizează: -
tulpini de S. cerevisiae – X141 – X141 şi 17 /17 - standard sensibile la toxina killer; k iller;
-
tulpini de testat (potenţiale killer) de S. cerevisiae: SMR, 9714 şi X208.
Tul pinile pinile sensibile (obţinute după o cultivare pe mediu YPG lichid timp de 24 h la 300 C) se însămânţează în pânză, pe mediu K ce conţine: -
tampon citrat fosfat 0,1 M, pH 4,8;
-
glucoză 2 % ;
-
extract de drojdie 1%;
- peptonă 1%; -
agar 2%;
-
albastru de metilen, 0,03 – 0,03 – 0,07 0,07 %.
Apoi , pe aceleaşi plăci, se însămânţează în spot tulpinile potenţiale killer. Se notează pe plăci numele tulpinilor. Plăcile se incubează 48 de ore la 20 – 22 – 22 0 C (la temperaturi mai mari toxina killer de la S. cerevisiae se inactivează). Interpretarea rezultatelor:
în jurul tulpinilor killer tulpina sensibilă nu se dezvoltă; la
limita zonei de inhibiţie, se observă o zonă în care celulele tulpinii sensibile se colorează în albastru închis deoarece sunt moarte, fapt ce permite p ermite pătrunderea colorantului. colorantului.
2
Celulele vii sunt albe (incolore) deoarece metabolizează colorantul, în timp ce celulele moarte sunt albastre pentru că nu pot degrada colorantul.
Mod de lucru
1. Se utilizează diferite tulpini de S. cerevisiae, crescute în mediu YPG lichid, timp de 18 ore la 30C ; 2. Se inoculează tulpina sensibilă prin inundare, 1ml suspensie în plăci Petri cu mediu selectiv, agarizat (conţine colorant vital - albastru de metilen). Se aspiră excesul; 3. Plăcile inoculate după îndepărtarea surplusului de suspensie sunt menţinute 15 minute la temperatura camerei pentru ca suprafaţa mediului să se usuce; 4. Tulpinile considerate killer se inoculează cu ansa în striuri; striuri; 5. Plăcile inoculate sunt menţinute la temperatura camerei, deoarece toxina killer este termolabilă;
3
