LOD-LOQ

VIỆ VIỆN KIỂ KIỂM NGHIỆ NGHIỆM AN TOÀN VỆ VỆ SINH THỰ THỰC PHẨ PHẨM QUỐ QUỐC GIA

ĐỊNH PHƯƠ THẨ THẨM ĐỊNH PHƯƠ NG NG PHÁP TRONG PHÂN TÍCH HÓA HỌ HỌC VÀ VI SINH VẬ VẬ T

NHÀ XUẤT BẢ N KHOA HỌC VÀ K Ỹ THUẬT HÀ NỘI

Chủ Chủ biên: DS. Tr ần Cao Sơn Nhóm biên soạ soạn: DS. Tr ần Cao Sơn PGS. TS. Phạm Xuân Đà TS. Lê Thị Hồng Hảo CN. Nguyễn Thành Trung Hiệ Hiệu đính: PGS. Phạm Gia Huệ KS. Phạm Thanh Nhã

LỜ I GIỚ GIỚ I THIỆ THIỆU Cùng vớ i s ự phát triển c ủa khoa học công ngh ệ, kinh t ế - xã hộ i vi v iệc chăm sóc và b ảo vệ sức khoẻ, nâng cao ch ất lượ ng ng cuộc sống của con ngườ i ngày càng đượ c quan tâm, trong đó có vấn đề an toàn thực phẩm. B ảo đảm nguồn thực phẩm an toàn sẽ góp phần bảo vệ và cải thiện sức khoẻ, chất lượ ng ng cu ộc sống và giống nòi dân t ộc. Tuy nhiên, công tác b ảo đảm an toàn thực phẩm luôn là m ột thách thức không ch ỉ vớ i các nướ c đang phát triể n mà ngay c ả vớ i các nướ c phát triển. Sự đa dạng của các chủng lo ại thực phẩm, công ngh ệ, các chất phụ gia, các chất hỗ tr ợ ợ chế biến, các chất ô nhiễm thực phẩm luôn đượ c cải tiến, bổ sung… là thách thức đố i vớ i hệ thống qu ản lý, kiểm soát an toàn thực phẩm, đặc biệt là đối vớ i các phòng kiểm nghiệm. Do đó, việc nâng cao n ăng l ực hệ thống phòng kiểm nghiệm an toàn th ực ph p hẩm đóng vai trò đặc bi b iệt quan tr ọng trong công tác qu ản lý an toàn thực phẩm của m ỗi qu ốc gia, nhất là trong giai đoạn h ội nhậ p kinh tế toàn cầu hiện nay. Tại Vi ệt Nam, trong những n ăm gần đây công tác b ảo đảm an toàn thực phẩm đã đượ c Đảng và Nhà n ướ c đặc biệt quan tâm và đã gặt hái đượ c nhiều thành tựu đáng khích l ệ. Hệ thống pháp lu ật, qu ản lý đ ã đượ c hình thành và kiện toàn, trong đó có hệ thống kiểm nghiệm an toàn thực phẩm mà điển hình là sự ra đờ i của Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (theo Quyết định s ố 376/QĐ-TTg ngày 23/3/2009) v ớ i chức năng là đơ n vị tr ọng tài quốc gia trong ki ểm nghiệm thực phẩm. Tuy nhiên, do nhiều yếu t ố và ngu ồn lực đầu tư chưa đáp ứng, hệ thống kiểm nghiệm thực phẩm của Việt Nam còn gặ p r ất nhiều khó khăn, ngay c ả ở cấ p Trung ươ ng. ng. Bở i vì đố i vớ i hệ thống kiểm nghiệm th ực ph ẩm, không chỉ cần đầu t ư thoả đáng về cơ sở vật chất, trang thiết b ị, con ngườ i mà cần ph ải đầu tư các hệ thống qu ản lý chất lượ ng, ng, k ỹ thuật (phươ ng ng pháp) phân tích phù h ợ p. Hiện nay đa số các phòng kiểm nghiệm thực phẩm của các địa phươ ng ng sử dụng các phươ ng ng pháp thử nghiệm khác nhau, chưa đượ c chu ẩn

hoá hoặc không th ống nhất nên r ất khó đ ánh giá k ết qu ả hoặc k ết qu ả không bảo đảm độ tin cậ y ảnh hưở ng ng tr ực tiế p đến công tác qu ản lý nhà nướ c. c. Nhằm từng bướ c hướ ng ng tớ i tiêu chuẩn hoá các phòng ki ểm nghiệm và phươ ng ng pháp kiểm nghiệm thực phẩm, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực ph p hẩm qu ốc gia ban hành cu ốn tài liệu “Thẩm định phươ ng ng pháp trong phân tích hoá h ọc và vi sinh v ật” như một tài liệu tham chi ếu cho các phòng kiểm nghiệm thực phẩm. Nộ i dung cu ốn tài liệu gồm hai phần chính là th ẩm ng pháp phân tích hoá h ọc và thẩm định phươ ng ng pháp phân tích vi định phươ ng sinh vật vớ i những cách bố trí thí nghi ệm và cách tính c ụ thể có các ví d ụ thực tiễn. Ngoài ra cu ốn tài liệu cũ ng giớ i thiệu cách ướ c lượ nngg độ không bảo đảm đo và các chươ ng ng trình b ảo đảm chất lượ ng ng k ết qu ả thử nghiệm mà các phòng ki ểm nghiệm có thể thực hiện đượ c. c. Hy vọng cu ốn tài liệu nhỏ này sẽ ít nhiều h ữu ích đối vớ i bạn đọ c. Do lần đầu tiên biên so ạn nên cu ốn tài liệu sẽ không tránh kh ỏi thiếu sót, ban soạn thảo r ất mong nhận đượ c sự đóng góp của đồng nghiệ p xa gần. Xin trân tr ọng cảm ơ n. n. TM. Nhóm biên soạn

PGS.TS. Phạm Xuân Đà Viện trưở ng ng VIỆN KIỂM NGHI ỆM AN TOÀN VỆ SINH THỰ C PHẨM QUỐC GIA

LỜ I CẢ CẢM Ơ N Xin bày tỏ lòng biết ơ n sâu sắc đế n những ngườ i thầy PGS. Phạm Gia Huệ và KS. Phạm Thanh Nhã - nh ững ngườ i đã tr ực tiế p h ỗ tr ợ ợ và đóng góp ý kiến sửa chữa để hoàn thiện cuốn sách. Xin chân thành c ảm ơ n những ngườ i thầy, ngườ i bạn, đồng nghiệ p trong hội đồng khoa h ọc thông qua nội dung cu ốn sách PGS.TS. Tr ần Chươ ng ng Huyến, PGS.TS. T ạ Thị Thảo, Tr ườ ườ nngg Đại học Quốc gia Hà N ội; PGS.TS. Thái Phan Qu ỳnh Như, TS. Tr ần Việt Hùng, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ươ ng; ng; TS. Tr ần Đăng Ninh, Cục Qu ản lý chất lượ ng ng Nông lâm sản và Thủ y sản; ThS. Lê V ăn Giang, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm và KS. Nguyễn Thị Vân Lan, Viện Kiểm nghiệm an toàn v ệ sinh thực phẩm quốc gia vì nh ững ý kiến đóng góp quý báu trong quá trình biên so ạn cu ốn sách. Xin chân thành c ảm ơ n các b ạn đồ ng nghiệ p t ại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã tạo điều kiện hỗ tr ợ để ợ để xuất bản cuốn sách. Nhóm biên soạn

MỤC LỤ LỤC MỤC LỤC.................................. C................................................. ............................. ............................... ................................ .................. ... 7 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................ T................................................. ................................ .................. ... 9 Chươ ng ng I: CÁC YÊU C ẦU CHUNG............. CHUNG. ............................. ................................ .......................... ........... 10 1. Khái niệm về thẩm định phươ ng ng pháp pháp ............................... .............................................. ................. 10 2. Thẩm định phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn (method verification verification)................. )................. 11 3. Thẩm định phươ ng ng pháp không tiêu chu ẩn (method (method valida validation) tion) ........ 13 4. Thẩm định lại.......................................... i........................................................... ............................... ......................... ........... 14 Chươ ng ng II: THẨM ĐỊ NH NH PHƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC .... .... 16 1. Tính đặc hiệu/chọn lọc ............................... .............................................. ................................ ........................ ....... 19 1.1. Định ngh ĩ a ............................. .............................................. ............................... ............................. ..................... ...... 19 1.2. Cách xác định......................... nh.......................................... ............................... ............................. ..................... ...... 20 1.3. Tính đặc hiệu/chọn lọc đối vớ i phươ ng ng pháp chu ẩn ......... .............. .......... ....... 24 2. Khoảng tuyến tính và đườ ng ng chu ẩn .................................. ................................................. ................... 25 2.1. Định ngh ĩ a ............................. .............................................. ............................... ............................. ..................... ...... 25 2.2. Cách xác định kho ảng tuyến tính.................................... tính................................................ ............ 26 2.3. Xây d ựng đườ ng ng chu ẩn ............................. .............................................. ................................ ................. 26 2.4. Các lưu ý khi xây d ựng đườ ng ng chu ẩn ............................. ......................................... ............ 30 2.5. Giớ i hạn chấ p nhận của đườ ng ng chu ẩn ............................. ......................................... ............ 31 3. Giớ i hạn phát hiện................................... n.................................................... ............................... ......................... ........... 32 3.1. Định ngh ĩ a ............................. .............................................. ............................... ............................. ..................... ...... 32 3.2. Cách xác định......................... nh.......................................... ............................... ............................. ..................... ...... 32 4. Giớ i hạn định lượ nng................. g ................................ ................................ ............................... ......................... ........... 36 4.1. Định ngh ĩ a ............................. .............................................. ............................... ............................. ..................... ...... 36 4.2. Cách xác định......................... nh.......................................... ............................... ............................. ..................... ...... 37 5. Độ chính xác ( độ đúng và độ chụm)....................................... m).................................................. ........... 39 5.1. Độ chụm ............................ ............................................. ................................ ............................. ........................ .......... 40 5.2. Độ đúng (trueness) (trueness) ........................... ............................................ ............................... ......................... ........... 47 6. Độ ổn định (hay độ vững/độ chắc chắn) của phươ ng ng pháp................. pháp................. 58 6.1. Định ngh ĩ a ............................. .............................................. ............................... ............................. ..................... ...... 58

6.2. Cách xác định......................... nh.......................................... ............................... ............................. ..................... ...... 59 Chươ ng ng III: THẨM ĐỊ NH NH PHƯƠ NG PHÁP PHÁP PHÂN PHÂN TÍCH VI SINH VẬT .....6 .....600 1. Các yêu cầu chu chung ng ............................. ........................................... ............................... ................................. ................ 60 1.1. Chu ẩn bị thẩm định ............................. ............................................ ................................ ........................ ....... 60 1.2. Lựa chọn thông số thẩm định ............................. .............................................. ........................ ....... 62 2. Thẩm định phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn (method verification verification)................. )................. 63 2.1. Phươ ng ng pháp định tính tính ............................. .............................................. ................................ ................... 63 2.2. Phươ ng ng pháp định lượ nngg .......................... ........................................... ................................ ................... 67 Chươ ng ng IV: ƯỚC LƯỢ NG ĐỘ KHÔNG ĐẢM BẢO ĐO....................... O....................... 74 1. Khái niệm về độ không đảm bảo đo ............................. ............................................ ..................... ...... 74 2. Các ngu ồn gây ra độ không đảm bảo đo ................................ ............................................ ............ 74 3. Các cách đánh giá độ không đảm bảo đo ............................... ........................................... ............ 75 3.1. Cách 1: Ướ c lượ nngg độ không đảm bảo đo theo hướ ng ng dẫn của EURACHEM....................... EURACHEM........................................ ................................ ............................. ............................. ............... 75 3.2. Cách 2: Ướ c lượ nngg độ không đảm bảo đo từ dữ liệu phân tích m ẫu thực................................ c............................................... ................................ ............................... ............................. ..................... ...... 83 4. Công b ố độ không đảm b ảo đo.......................................... o......................................................... ................. 85 4.1. Cách viết độ không đảm bảo đo chu ẩn tổ ng hợ p.......... p .................... ............... ..... 86 4.2. Cách viết độ không đảm bảo đo mở r ộng......................... ng.................................... ........... 86 Chươ ng ng V: ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢ NG K ẾT QUẢ THỬ NGHIỆM........ M........ 88 1. Phép thử nghiệm lặ p lại................................... i.................................................... ................................ ................... 89 2. Phép thử nghiệm tái lậ p............... p..... ..................... ...................... .................... .................. .................... .............. ... 89 3. Phép thử nghiệm trên mẫu lưu.......................... u........................................... ................................. ................ 89 4. Phép thử nghiệm trên mẫu tr ắng........................... ng............................................ ............................. ............ 89 5. Phép thử nghiệm trên mẫu chuẩn ............................. ........................................... ......................... ........... 90 6. Phép thử nghiệm trên mẫu thêm.............. thêm ............................... ............................... ......................... ........... 90 7. Sử dụng các phươ ng ng pháp pháp khác nhau nhau ............................... .............................................. ................... 91 8. Đánh giá sự phù hợ p của hệ thống.................... ng..................................... ................................ ................. 91 9. Tham gia các ch ươ ng ng trình th ử nghiệm liên phòn phòngg ........................... ............................. 92 10. Sử dụng biểu đồ kiểm soát soát ................................ .............................................. ............................. ................. 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................... O................................................ ............................... ....................... ......... 101 PHỤ LỤC

DANH MỤ MỤC CHỮ CHỮ VIẾ VIẾT TẮ TẮT AOAC (Association of Official Analytical Chemists) ASTM (American Society for Testing of Materials) CRM (Certified reference material) DAD (Diod array detector) GC-MS (Gas chromatography mass spectrometry) HPLC (High performance liquid chromatography) HR (High resolution) ICH (International Conference on Harmonization) IP (Identification point) ISO (International Standard Organization) LC-MS (Liquid chromatography mass spectrometry) LOD (Limit of Detection) LOQ (Limit of Quantification) LR (Low resolution) MRLs (Maximum residue Limits) QC (Quality control) S/N (Signal to noise ratio) SOP (Standard Operation Procedure) TCVN USFDA (United States Food and Drug Administration) USP (United States Pharmacopoeia)

Hiệ p hội các nhà hóa phân tích chính th ức Hiệ p hội phép thử Mỹ Mẫu chu ẩn đượ c chứng nhận Detector mảng diod Sắc ký khí kh ối phổ Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Độ phân giải cao Hội đồng hòa hợ p quốc tế Điểm nhận dạng Tổ chức tiêu chu ẩn quốc tế Sắc ký lỏng khố i phổ Giớ i hạn phát hiện Giớ i hạn định lượ nngg Độ phân giải thấ p Giớ i hạn tồ n dư tối đa Kiểm tra chất lượ nngg Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu Quy trình thao tác chu ẩn Tiêu chu ẩn Việt Nam Cục Dượ c phẩm và Thực phẩm Mỹ Dượ c điển Mỹ

10

CHƯƠNG I: CÁC YÊU C ẦU CHUNG

Chươ Chương ng I: CÁC YÊU CẦ CẦU CHUNG định phươ 1. Khái niệ niệm về về thẩ thẩm định phương ng pháp Thẩm định phươ ng ng pháp là s ự khẳng định b ằng việc kiểm tra và cung cấ p bằng chứng khách quan chứng minh r ằng phươ ng ng pháp đó đáp ứng

đượ c các yêu c ầu đặt ra (fitness for the purpose). K ết quả của thẩm định phươ ng ng pháp có th ể đượ c sử dụng để đánh giá ch ất lượ ng, ng, độ tin cậ y của k ết quả phân tích. Thẩm định phươ ng ng pháp phân tích là m ột phần không

thể thiếu nếu muốn có một k ết quả phân tích đáng tin cậy. Hiện nay nhi ều thuật ngữ khác nhau đượ c sử dụng để chỉ khái niệm trên, như định tr ị phươ ng ng pháp, đánh giá phươ ng ng pháp, xác nh ận giá tr ị sử dụng c ủa phươ ng ng pháp, phê duyệt phươ ng ng pháp. T ất cả các thuật ngữ này ng pháp (method validation). đều là cách gọi khác nhau c ủa thẩm định phươ ng Phòng thử nghiệm thườ ng ng sử dụng nhiều phươ ng ng pháp khác nhau. Dựa vào ngu ồn gốc có thể phân lo ại các phươ ng ng pháp thành hai nhóm: - Các phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn: các phươ ng ng pháp thử theo tiêu chu ẩn quốc gia, quốc tế, hiệ p hội khoa học đượ c chấ p nhận r ộng rãi trên th ế giớ i như TCVN, ISO, ASTM, AOAC… - Các phươ ng ng pháp không tiêu chu ẩn hay phươ ng ng pháp nội b ộ (nonstandard/alternative/in-house method): là các ph ươ ng ng pháp do phòng th ử nghiệm tự xây d ựng, phươ ng ng pháp theo hướ ng ng dẫn của nhà sản xuất thiết b ị, phươ ng ng pháp theo các t ạ p chí, tài liệu chuyên ngành... ng pháp phân tích ph ải đượ c thẩm Theo yêu cầu của ISO 17025 , phươ ng

định hoặc thẩm định lại khi:

TH ẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP TRONG PHÂN TÍCH HÓA H ỌC VÀ VI SINH V ẬT

11

- Phươ ng ng pháp áp d ụng không ph ải là phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn (nonstandard method) - Phươ ng ng pháp do phòng th ử nghiệm tự xây dựng mớ i tr ướ ướ c khi đưa vào sử dụng thành thườ ng ng quy. - Có sự thay đổ i về đố i t ượ ng ng áp d ụng n ằm ngoài đố i t ượ ng ng áp dụng của phươ ng ng pháp đã thẩm định ho ặc phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn. - Có sự thay đổi các điều kiện thực hiện phươ ng ng pháp đã đượ c thẩm

định (ví dụ: thiết bị phân tích vớ i các đặc tính khác biệt, nền mẫu, ngườ i phân tích …).

2. Thẩ Thẩm định định phươ phương ng pháp tiêu chuẩ chuẩn (method verification) Tr ướ ng pháp phân tích c ần có các ch ứng minh ướ c khi áp dụ ng một phươ ng r ằng phươ ng ng pháp đó đáp ứng yêu cầu đặt ra, t ức là phươ ng ng pháp phải đượ c thẩm định. Yêu cầu này không ch ỉ cho các phươ ng ng pháp thử nội b ộ mà còn cần cho các ph ươ ng ng pháp tiêu chu ẩn. Việc thẩm định phươ ng ng pháp tiêu chuẩn và phươ ng ng pháp nội bộ có s ự khác nhau, do đó c ần chú ý khi lậ p k ế hoạch thẩm định. Có hai yêu cầu chủ yếu của việc thẩm định phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn: - Phải có k ết quả thẩm định c ủa phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn, và k ết qu ả này phải phù hợ p vớ i yêu cầu của phòng thử nghiệm. - Phòng thử nghiệm cần đảm b ảo có thể đạt đượ c các thông s ố đượ c mô tả trong phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn. Theo yêu c ầu củ a ISO 17025, khi các phòng th ử nghiệm áp dụng các phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn cần có hồ sơ đánh giá các điều kiện cơ bản, các nguồn lực theo yêu cầu của ph p hươ ng ng pháp thử và việc đạt đượ c k ết qu ả thử nghiệm có độ chính xác như phươ ng ng pháp yêu c ầu hoặc như mong mu ốn

12


của phòng thử nghiệm. Đối vớ i các phươ ng ng pháp thử đã ban hành mà không có d ữ liệu về độ chính xác thì phòng th ử nghiệm phải xác định d ữ liệu độ chính xác c ủa phép thử dựa trên d ữ liệu nghiên c ứu thử nghiệm. ng pháp tiêu chu ẩn cần kiểm Để xây d ựng các b ướ c thẩm định phươ ng tra: 1. Phươ ng ng pháp đã đượ c thẩm định hay chưa, thẩm định toàn b ộ hay một phần? 2. Nền mẫu có gi ống nhau hay không? 3. Khoảng làm việc của phươ ng ng pháp có phù hợ p vớ i yêu cầu của phòng thử nghiệm hay không? 4. Có cùng loại thiết bị (hãng s ản xuất, model) hay không? Ph ươ nngg pháp tiêu chuẩn có cho sử dụng các lo ại thiết bị khác không? 5. Có những lưu ý gì đặc biệt của phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn mà phòng thử nghiệm không thể đáp ứng không? Nếu một trong các yếu tố trên không phù h ợ p, thì phòng p hòng th ử nghiệm cần th ực hiện các phép th ử để đánh giá lại ph p hươ ng ng pháp. Các k ết qu q uả đánh giá này c ần phải tươ nngg ứng vớ i các k ết qu ả thẩm định của phươ ng ng pháp chuẩn, nếu không c ần phải thẩm định lại toàn bộ phươ ng ng pháp. Việc đánh giá bao gồ m: 1. Khẳng định tình tr ạng đầ y đủ thiết b ị, nhân viên, thu ốc thử, môi tr ườ ng và các điều kiện khác để thực hiện phép thử. ườ ng 2. Kiểm tra các thông s ố cơ bản nhất của phươ ng ng pháp, theo yêu c ầu cụ thể củ a từng l ĩ nh vực hóa học và vi sinh s ẽ đượ c mô tả chi tiết trong ĩ nh các chươ ng ng sau.


13

3. Thẩ Thẩm định định phươ phương ng pháp không tiêu chuẩ chuẩn (method validation) ng pháp không tiêu chu ẩn, việc thẩm định phải tr ải qua Đối vớ i phươ ng nhiều bướ c hơ n, n, b ắt đầu từ quá trình nghiên c ứu khảo sát phươ ng ng pháp, t ối ng pháp đến khi hoàn thi ện phươ ng ng pháp. Thẩm định phươ nngg ưu hóa phươ ng pháp là mộ t yêu cầu bắt buộc phải thực hiện đi kèm vớ i việc phát triển phươ ng ng pháp m ớ i và áp dụng các phươ ng ng pháp không tiêu chu ẩn vào thực hiện thành thườ ng ng quy. Các b ướ c tiến hành th ẩm định bao gồm: 1. Xây d ựng SOP d ự kiến (theo các tài li ệu tham kh ảo hoặc theo các nghiên cứu xây d ựng phươ ng ng pháp m ớ i) i) 2. Xây dựng đề cươ ng ng (k ế hoạch) thẩm định bao gồm: a. Xác định thờ i gian và ngườ i thực hiện b. Chất cần phân tích: tên ch ất, d ự đoán hàm lượ ng ng trong m ẫu c. Xác định đối tượ ng ng thẩm định: nền mẫu d. Xác định mụ c đ ích cần phải đạt: yêu cầu về giớ i hạn cho phép (nếu có), cần đạt LOD, LOQ, độ chính xác... bao nhiêu? e. Xác định các thông s ố cần thẩm định và kho ảng chấ p nhận f. Xác định các thí nghi ệm cần thực hiện 3. Kiểm tra các điều kiện cần cho công vi ệc thẩm định a. Các yêu cầu về trang thiết b ị b. Hóa chất, thuố c thử c. Mẫu thí nghiệm 4. Thực hiện thẩm định

14


a. Các phép thử thẩm định sơ bộ b. Thay đổi các thông s ố của phươ ng ng pháp (nếu cần) c. Thực hiện thẩm định hoàn thiện 5. Hoàn thiện SOP của phươ ng ng pháp 6. Báo cáo thẩm định: cần có các thông tin sau a. Tên ngườ i thẩm định, thờ i gian thẩm định b. Tóm tắt phươ ng ng pháp: nguyên lý, thi ết bị, hóa chất, quy trình, các lưu ý... c. Các k ết qu ả thẩm định d. Các yêu c ầu c ần đáp ứng để đưa phươ ng ng pháp vào thực hi ệ n thườ ng ng xuyên (routine): ki ểm tra tính t ươ ng ng thích của hệ thống, mẫu QC, ướ c lượ nngg độ không đảm b ảo đo của k ết quả... e. Xác định các thông s ố và thờ i gian cần thẩm định lại f. Tài liệu tham khảo (nếu có) g. K ết luận và đề xuất (nếu có) h. Ký tên, ngày c ủa ngườ i làm báo cáo i. Ký phê duyệt của ngườ i có thẩm quyền

định lạ 4. Thẩ Thẩm định lại Công việc thẩm định không ph ải ch c hỉ thực hiện m ộ t l ần khi phát tri ển phươ ng ng pháp ban đầu mà cần thực hiện trong su ốt quá trình áp d ụng. Vì đa số các điều kiện thực hi ện ph ươ ng ng pháp có sự thay đổi trong suốt quá trình


15

áp dụ ng. Ví d ụ như có sự thay đổ i hoặc mở r ộng đối tượ ng ng áp d ụng, thay đổ i

địa điểm phòng thử nghiệm, thay đổi nhân viên, thay đổ i thiết bị (áp dụng trên các thiết bị cùng lo ại khác), thay đổ i các điều kiện về tiện nghi môi tr ườ ng, thay đổi về dung môi hóa ch ất thuốc th ử, những thay đổi nhỏ khác ườ ng, (ví dụ nhiệt độ cột phân tích, pH pha động...). Trong tr ườ ng hợ p k ết qu ả ườ ng phân tích mẫu kiểm tra (QC) ho ặc k ết qu ả đánh giá sự phù hợ p của hệ thống nằm ngoài giớ i h ạn cho phép thì ph ươ ng ng pháp c ũng c ần ph ải th ẩm định lại. Phòng thử nghiệm nên phối hợ p quá trình tính độ ổn định (độ vững) vớ i quá trình thẩm định lại các phươ ng ng pháp phân tích hàng ngày (routine method). Các thông số cần thẩm định lại phụ thuộc vào m ức độ ảnh hưở ng ng c ủa các thay đổi đến các thông s ố của phươ ng ng pháp. Thông th ườ ng ng tiến hành thẩm định các thông s ố cơ bản nhất như trong tr ườ ng hợ p thẩm định các ườ ng phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn. Tuy nhiên n ếu nh ững k ết qu ả thẩm định này có s ự sai khác nhi ều so vớ i k ết qu ả thẩm định ban đầu thì cũng cần thực hiện thẩm

định lại toàn bộ. Các chươ ng ng sau sẽ giớ i thiệu chi tiết các khái niệm, các cách b ố trí thí nghiệm để thẩm định phươ ng ng pháp phân tích hóa h ọc và vi sinh, cũng nh ư các cách nhằm đảm bảo chất lượ ng ng k ết quả thử nghiệm.

16

CHƯƠNG II: TH ẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC

Chươ Chương ng II: THẨ THẨM ĐỊNH ĐỊNH PHƯƠ PHƯƠNG NG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌ HỌC Như đã nêu trong chươ ng ng I, thẩm định phươ ng ng pháp là m ột công việc r ất khó khăn, nhàm chán, và t ốn kém tuy nhiên l ại là một nội dung quan tr ọng ảnh hưở nngg đế n độ chính xác c ủa k ết qu ả phân tích. Cần cân nhắc mục ng pháp và ngu ồn lực để lựa chọn thông số thẩm đích yêu c ầu của từng phươ ng

định cho phù h ợ p. Theo các quy định của USFDA, AOAC, USP và ICH, đối vớ i các phươ ng ng pháp phân tích hóa h ọc các thông s ố cần thẩm định bao gồm: -

Tính đặc hiệu, tính chọn lọc; (Specifility/Selectivity ( Specifility/Selectivity))

-

Khoảng tuyến tính và đườ ng ng chu ẩn; (Linearity and Calibration curve)

-

Giớ i hạn phát hiện; (Limit of Detection – LOD)

-

Giớ i hạn định lượ ng; ng; (Limit of Quantitation – LOQ)

-

Độ đúng; (Trueness)

-

Độ chụm; (Precision)

-

ng pháp; (Robustness/Ruggedness) Độ vững (ổn định) của phươ ng Việc lựa ch c họn các thông s ố thẩm định tùy thu ộ c vào k ỹ thuật áp dụng

trong phươ ng ng pháp, yêu c ầu của ph p hươ ng ng pháp, điều kiện và ngu ồn l ực c ủa phòng th ử nghiệm... Từng tr ườ ng hợ p cụ thể các thông số thẩm định có thể ườ ng có sự khác nhau.

17


Mỗi phươ ng ng pháp phân tích hóa h ọc có một mục đích nhất định, từ việc xác định m ột chất ở nồng độ thấ p đến xác định độ tinh khiết của mộ t chất. Để dễ dàng cho việc lựa chọn các thông s ố thẩm định, các phươ nngg pháp có thể đượ c chia làm b ốn nhóm tùy thu ộc vào mục đích của chúng: -

Các phươ ng ng pháp phân tích định tính;

-

Các phươ ng ng pháp phân tích vi l ượ ng; ng;

-

Các phươ ng ng pháp phân tích đa lượ ng; ng;

-

Xác định giớ i hạn tạ p chất (thử độ tinh khiết). Các yêu c ầu về thông số cần thẩm định cho t ừng lo ại phươ ng ng pháp

ng pháp không tiêu chu ẩn) và bảng 2 (phươ nngg đượ c mô tả ở b ảng 1 (phươ ng pháp tiêu t iêu chu ẩn). Ngườ i thực hiện th ẩm định c ần lựa ch c họn đúng cách thẩm

định cho t ừng thông số và lậ p k ế hoạch cho t ừng nội dung. Bảng 1: Lựa chọn thông số thẩm định phươ ng ng pháp không tiêu chuẩn Các thông số thẩm định

Phân tích

Phân tích

Phân tích Xác định giớ i

định tính

vi lượ ng ng

ng đa lượ ng

hạn tạp chất

–

+

+

–

–

+

+

–

+

+

+

+

+

+

+/-

+

Độ đúng (Trueness)

Độ chụm (Precision)

Độ đặ c hiệu, chọn lọc (Specification/Selectivity) LOD

18


(Limit of detection) LOQ

–

+

+/-

–

–

+

+

–

–

+

+

–

(Limit of quantitation)

Độ tuyến tính (Linearity/range)

Độ vững (ổn định) (Ruggedness/Robustness) (+) C ần thực hiện thẩm định (-) Không cần thực hiện thẩm định

Bảng 2: Lựa chọn thông số thẩm định phươ ng ng pháp tiêu chuẩn

Các thông số đánh giá

Xác định

Phân tích

Phân tích

Phân tích

định tính

vi lượ ng ng

ng đa lượ ng

–

+

+

–

–

+

+

–

–

–

–

–

+

–

–

+

giớ i hạn t ạp chất

Độ đúng (Trueness)

Độ chụm (Precision)

Độ đặ c hiệu, chọn lọc (Specification/Selectivity) LOD (Limit of detection)

19


LOQ –

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

(Limit of quantitation)

Độ tuyến tính (Linearity/range)

Độ vững (ổn định) (Ruggedness/Robustness) (+) Cần thực hiện thẩm định (-) Không cần thực hiện thẩm định

1. Tính đặc đặc hiệ hiệu/chọ u/chọn lọ l ọc ĩ ĩa 1.1. Đị nh n h ngh a * Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện đượ c chất phân tích khi có m ặt

các tạ p ch ất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tươ ng ng t ự, tạ p chất.... Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh ng tính khi có m ặt ch ất phân tích, âm tính khi không có đượ c k ết qu ả là dươ ng mặt nó, đồng thờ i k ết qu q u ả phải là âm tính khi có m ặt các chất khác có c ấu trúc gần giống chất phân tích. Trong phép phân tích định lượ ng, ng, là khả năng xác định chính xác ch ất phân tích trong m ẫu khi b ị ảnh hưở ng ng củ a tất cả các yếu tố khác, nhằm hướ nngg đến k ết quả chính xác. Tính đặc hiệu thườ ng ng liên quan đến việc xác định chỉ mộ t chất phân tích. * Tính chọn l ọc: Là khái ni ệm r ộng h ơ n tính đặc hiệu, liên quan đến việc phân tích mộ t số hoặc nhiều chất chung m ột quy trình. N ếu chất cần xác định phân bi ệt rõ vớ i các chất khác thì phươ ng ng pháp phân tích có tính chọn lọc. Như vậ y, tính chọn lọ c có thể bao trùm c ả tính đặc hiệu. Do các phươ ng ng pháp phân tích th ườ ng ng có nhiều ch c hất cùng xu ất hiện nên khái niệm tính chọn lọc thườ ng ng mang tính khái quát h ơ n. n.

20


1.2. .2 . Cách x ác đị nh nh 1.2.1. Tr ườ ng hợ p chung ườ ng

ng pháp định tính, định Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc của phươ ng lượ ng ng cần bố trí các thí nghi ệm như sau: -

Phân tích các m ẫu tr ắng, lặ p lại t ối thiểu 6 l ần đố i vớ i từng loại n ền mẫu. M ẫu tr ắng phải không đượ c cho tín hi ệu phân tích. N ếu mẫu tr ắng có hơ n 10% d ươ ng ng tính ho ặc xuất hiện tín hiệu thì cần phải thay đổ i phươ ng ng pháp để loại tr ừ các ảnh hưở ng. ng.

-

Phân tích m ẫu thử hoặc mẫu tr ắng thêm chu ẩn ở hàm lượ ng ng gần LOQ, lặ p l ại tố i thiểu 6 lần. So sánh k ết qu ả vớ i mẫu tr ắng, phải cho tín hiệu chất cần phân tích.

-

Sử dụng phươ ng ng pháp thêm chu ẩn sau chu ẩn bị mẫu (cochromatography), cách này th ườ ng ng áp dụ ng đối vớ i các ph ươ ng ng pháp sắc ký. Sau khi chu ẩn bị mẫu (mẫu tr ắng ho ặc mẫu thực) và phân tích m ẫu trên thiết bị sắc ký thu đượ c các pic s ắc ký, ta thêm chu ẩn vào mẫu đã chiết xu ất và phân tích mẫu này. So sánh s ắc ký đồ của hai mẫu để đánh giá tính đặc hiệu/chọn lọc.

-

Phân tích m ẫu không có ch ất phân tích nh ưng có chất cấu trúc tươ nngg tự chất phân tích (n ếu có): Phải cho k ết qu ả âm tính (đối vớ i phươ nngg pháp định tính) và không đượ c ảnh hưở nngg đến k ết quả định lượ nngg của chất phân tích ( đối vớ i phươ ng ng pháp định lượ ng). ng).

Trong tr ườ ng hợ p những chỉ tiêu phân tích không th ể có mẫu tr ắng ườ ng (sample blank) để xác định tính chọn l ọc/đặc hiệu, có thể thực hiện các thí nghiệm trên các mẫu tr ắng thu ốc th ử (reagent blank), t ức là thực hi h iện phân tích các b ướ c t ươ ng ng tự như khi phân tích m ẫu nhưng không có m ẫu thử. 1.2.2. Các tr ườ ng hợ p đặc biệt ườ ng

• Sắc ký lỏng sử dụng detector DAD (m ảng diod) Tính chọn lọc trong s ắc ký lỏng có thể đạt đượ c thông qua vi ệc lựa chọn c ộ t tối ưu, điều kiện s ắc ký tối ưu, nhiệt độ cột và bướ c sóng. Ngoài


21

việc thay đổ i điều kiện s ắc ký, thì giai đoạn xử lý mẫu cũng phải t ối ưu để đạt đượ c tính chọ n lọc cao nhất. Trong sắc ký, cần xác định r ằng píc sắc ký có phải là một píc đơ n hay có lẫn các tạ p chất khác. Đối vớ i các hệ thống sắc ký có detector m ảng diod (DAD) có th ể xác định đượ c tính chọn lọc thông qua xác định độ tinh khiết (peak purity) c ủa píc, hay so sánh ph ổ của píc vớ i thư viện phổ sẵn có.

Hình 1: Xác định độ tinh khiết c ủa pic trong sắc ký lỏng HPLC-DAD

Độ tinh khiết của píc đượ c xác định b ằng cách so sánh ph ổ tại các điểm khác nhau trên pic s ắc ký. Cách ph ổ biến nhất là chọ n tại ba điểm: đỉnh píc (apex), và hai điểm về hai bên sườ n của píc (upslope và downslope). Thông th ườ ng ng chọn hai điểm tại 2/3 độ r ộng của píc về hai phía. Ngoài ra hi ện nay đa số các thiết bị đều có phần mềm tính toán độ tinh khiết của píc, có thể dựa vào 3 điểm, 5 điểm, 7 điểm hay tất cả các điểm tạo thành píc. Các thiết bị hiện đại có thể tính toán độ tinh khiết tr ực tiế p thông qua phần mềm điều khiển.

22


Hình 2: Các cách xác định độ tinh khiết của pic sắc ký HPLC-DAD

So sánh phổ của pic vớ i ph ổ chuẩn c ũng là mộ t cách phổ biến để xác

định sự tinh khiết c ủa píc. Một píc đượ c xem là không tinh khi ết khi giá tr ị phù hợ p (hệ số match) không đạt xấ p xỉ 100%. Tuy nhiên, n ếu giá tr ị này có gần 100% cũng không th ể khẳng định đượ c chắc chắn sự tinh khiết củ a píc, có thể do một trong s ố các nguyên nhân sau: -

Tạ p chất tồn tại vớ i lượ ng ng thấ p hơ n nhiều so vớ i chất phân tích do đó phổ UV-Vis không ảnh hưở ng ng nhiều đến phổ của chất phân tích.

-

Phổ của tạ p chất và chất phân tích t ươ ng ng tự nhau.

• Sắc ký khối phổ Các thiết bị sắc ký khí có gắn detector MS, th ườ ng ng so sánh ph ổ của chất phân tích vớ i phổ chuẩn có sẵn trong thư viện đi kèm ho ặc phổ của chất chuẩn tươ nngg ứng. Sử dụng các phươ ng ng pháp xác nh ận (confirmation method) là m ột cách r ất tốt để đảm b ảo tính đặc hiệu của phươ ng ng pháp. Hội đồng châu Âu quy định cách tính điểm IP ( điểm nhận d ạng – identification point) đối v ớ i

23


các phươ ng ng pháp khác nhau để khẳng định chắc chắn sự có mặt của một chất. Cách tính điểm IP đố i vớ i các k ỹ thuật khối phổ khác nhau đượ c quy

định như sau: Bảng 3: Quan hệ giữa các k ỹ thuật khối phổ và số điểm IP đạt đượ c K ỹ thuật khối ph ổ

Số điểm IP đạt đượ c vớ i 1 ion

MS phân giải thấ p (LR-MS)

1,0

LR-MS (ion mẹ)

1,0

LR-MS (ion con)

1,5

MS phân giải cao (HR-MS)

2,0

HR-MS (ion mẹ)

2,0

HR-MS (ion con)

2,5

Bảng 4: Ví dụ về số điểm IP đạt đượ c đối vớ i các k ỹ thuật khối phổ khác nhau K ỹ thuật

Số ion

Số điểm IP

GCMS (EI hoặc CI)

n

n

GCMS (EI và CI)

2 (EI) + 2 (CI)

4

GCMS (EI hoặc CI) hai dẫn xuất

2 (dc A) + 2 (dc B)

4

LC-MS

n

n

GC-MS-MS

1 ion mẹ, 2 ion con

4

LC-MS-MS

1 ion mẹ, 2 ion con

4

GC-MS-MS

2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con

5

LC-MS-MS

2 ion mẹ, mỗi ion mẹ có 1 ion con

5

LC-MS-MS-MS LC-MS-MS-MS

1 ion mẹ, 1 ion con và 2 ion cháu

5,5

24


HRMS

n

2n

GC-MS và LC-MS

2+2

4

GC-MS và HRMS

2+1

4

Các thiết bị sắc ký khí có gắn detector MS, th ườ ng ng so sánh ph ổ của chất phân tích vớ i phổ chuẩn có sẵn trong thư viện đi kèm ho ặc phổ của chất chuẩn tươ nngg ứng.

Ví dụ: Ph P hương pháp phân tích chloramphenicol b ằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần, người ta thực hiện bắn phá ion m ẹ m/z 321 và định lượng theo ion con t ạo thành là 152 và 194. Theo cách tính điểm IP thì với 1 ion mẹ và 2 ion con thu được 4 điểm IP, như vậy phương pháp có tính đặc hiệu đáp ứng được yêu cầu. Cần th ực hiện thêm các phép th ử trên mẫu tr ắng (n

độ gần LOQ (n

³

³

6) và mẫu có n ồng

6) để xác định chắc ch ắn ph ương pháp có tính đặc hi ệu

cao.

ớ ới ph ươ ươ ng ẩ n 1.3. 1. 3. T ín h đặc hi ệu/ch ọn l ọ c đố i v ng ph áp ch c h u ẩ n ng pháp chu ẩn, như đã nêu trong b ảng 2, thông Đối vớ i các phươ ng thườ ng ng không cần xác định tính đặc hiệu/chọn lọc. Tuy nhiên, c ần cân nhắc thực hiện việc xác định độ đặc hiệu trong các tr ườ ng hợ p sau: ườ ng - Nền mẫu phân tích t ại phòng thử nghiệm khác vớ i nền m ẫu v ớ i mẫu nêu trong ph ươ ng ng pháp tiêu chu ẩn. Trong tr ườ ng hợ p này c ần th t hực ườ ng hiện đầy đủ như khi thẩm định phươ ng ng pháp n ội bộ.


-

25

Có sự khác nhau v ề thiết bị phân tích mà s ự khác nhau này có th ể

ảnh hưở nngg đến tính chọn lọc. Có thể thực hi ện đầy đủ hoặc xác định ng nếu có thông qua xác định hiệu năng của thiết bị. ảnh hưở ng

2. Khoả Khoảng tuyế tuyến tính và đường đường chuẩ chuẩn ĩ ĩa 2.1. Đị nh n h ngh a Khoảng tuyến tính của m ột phươ ng ng pháp phân tích là kho ảng nồng độ

ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượ nngg đo đượ c và nồng độ chất phân tích. Khoảng làm việc của một phươ ng ng pháp phân tích là kho ảng nồng độ giữa gi g iớ i h ạn trên và gi ớ i h ạn d ướ i của chất phân tích (bao g ồm c ả các giớ i hạn này), tại đó đượ c chứng minh là có thể xác định đượ c b ở i phươ ng ng pháp nhất định vớ i độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính như đã nêu. n, hai khái niệm này đượ c mô tả trong hình 3 d ướ i đ ây: Để đơ n giản hơ n,

Hình 3: Khoảng tuyến tính (linear range) và khoảng làm việc (working range)

26


ảng tuy ế ế n tín h 2.2. .2 . Cách x ác đị nh n h kho ng pháp định lượ ng, ng, cần ph ải thực hiện vi ệc Đối vớ i hầu hết các phươ ng xác đị nh khoảng tuyến tính. Việc xác đị nh kho ảng tuyến tính thườ nngg đượ c khảo sát b ắt đầu t ừ giớ i hạn định lượ ng ng (đ iểm thấ p nhất) và k ết thúc là gi ớ i hạn tuyến tính (điểm cao nhất). Nói chung, để xác định kho ảng tuyến tính cần kho ảng 10 (tối thiểu là 6) nồng độ khác nhau.

Để xác định kho ảng tuyến tính c ần thực hiện đo các dung d ịch chu ẩn có n ồng độ thay đổ i và khảo sát sự phụ thuộc c ủa tín hiệu vào nồng độ. Vẽ ng cong phụ thu ộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, sau đó quan sát s ự phụ đườ ng thuộc cho đến khi không còn tuy ến tính. Kho ảng tuyến tính dài hay ng ắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó quan tr ọng nhất là b ản ch c hất của chất phân tích và k ỹ thu ật sử d ụng. Các chất khác nhau có kho ảng tuyến tính khác nhau do s ự khác nhau về tính chất lý hóa. Trong khi các k ỹ thuật sử dụng khác nhau ảnh h ưở ng ng l ớ n đến độ dài ng ắn c ủa khoảng tuyến tính. Ví dụ, k ỹ thuật HPLC nếu sử dụng detector UV-Vis ho ặc DAD có thể cho khoảng tuyến tính đến 10 6 thậm chí đế n 107, trong khi n ếu s ử dụng detector huỳnh quang hay ch ỉ số khúc xạ thì chỉ cho kho ảng tuyến tính kho ảng 104 – 105. ự ựng g đườ ng ẩ ẩn 2.3. Xây d n n g chu n Sau khi xác định kho ảng tuyến tính cần xây d ựng đườ ng ng chu ẩn và xác ng quan. Trong phân tích th ực tế, có thể xây d ựng các định hệ số hồi quy tươ ng ng chuẩn ngắn, trùm lên vùng n ồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải đườ ng lậ p đườ ng ng chuẩn toàn b ộ khoảng tuyến tính. Nồng độ trong m ẫu không đượ c vượ t ra ngoài giớ i hạn cao nhất và thấ p nhất của đườ ng ng chuẩn và t ốt nhất phải nằm ở vùng giữa đườ ng ng chuẩn. Có nhiều lo ại đườ ng ng chuẩn khác nhau tùy thu ộc vào các phươ ng ng pháp và k ỹ thuật khác nhau, sau đây là các lo ại đườ ng ng chu ẩn chủ yếu:


27

2.3.1. Đườ ng ng chuẩ n vớ i chuẩ n tinh khiế t t

Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (tối thiểu 6 nồ ng độ ). Xác định các giá tr ị đo đượ c y theo nồng độ x (lặ p lại 2 lần lấy giá tr ị trung bình). N ếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có kho ảng khảo sát đườ ng ng biểu diễn là một phươ nngg trình: y = ax + b Trong đó: a: giá tr ị độ dốc slope; b: giá tr ị hệ số chặn intercept và hệ số tươ ng ng quan: R =

∑ ( x − X )( y − Y ) ∑ (x −X ) ∑ (y − Y ) i

i

2

i

i

Nếu 0,995 < R ≤ 1: Có tươ ng ng quan tuyến tính rõ r ệt. Có thể khảo sát độ tuyến tính dựa vào tính hệ số đáp ứng ( đồ thị dướ i). i). Kho ảng tuyến tính nằm trong kho ảng đồ thị nằm ngang.

Hình 4: Các cách lậ p đườ ng ng chuẩn tuyến tính

28


2.3.2. Đườ ng ng chuẩ n trên mẫ u tr ắ ng ắ ng

Phân tích các m ẫu tr ắng thêm chu ẩn v ớ i n ồng độ khác nhau (ít nh ất 6 nồng độ), trong kho ảng tuyến tính ướ c lượ nngg ở trên, mỗi nồng độ làm 3 lần. Vẽ đườ ng ng cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo (tr ục tung y) ph ụ thuộc vào nồng ng trình hồ i quy y độ (tr ục hoành x). Tính các h ệ số hồi quy (a, b trong ph ươ ng = ax + b) và hệ số tươ ng ng quan (R) t ươ ng ng tự như trên. ng chu ẩn xây dựng trên n ền m ẫu tr ắng thườ ng ng cho độ tin cậ y cao Đườ ng hơ n khi xây d ựng vớ i chuẩn tinh khiết, do có thể loại tr ừ phần nào các ảnh hưở ng ng c ủa n ền m ẫu. Tuy nhiên, trong nhi ều tr ườ ng h ợ p khó tìm đượ c m ẫu ườ ng tr ắng phù hợ p và không đượ c có chất phân tích. Do đó, có thể sử dụng phươ ng ng pháp l ậ p đườ ng ng chu ẩn trên n ền mẫu thực như sau. 2.3.3. Đườ ng ng chuẩ n trên mẫ u thự c

Phân tích mẫu thực có cho thêm các n ồng độ chuẩn khác nhau t ươ nngg tự như trong phần làm vớ i mẫu tr ắng. Vẽ đườ ng ng cong tín hi ệu đo (tr ục tung y) phụ thuộc vào nồ ng độ chuẩn thêm (tr ục hoành x). D ạng đườ ng ng chuẩn trên nền mẫu thực thườ ng ng có d ạng như hình 5:

Hình 5: Đườ ng ng chuẩn trên nền mẫu thực


29

Khi sử d ụng đườ ng ng chuẩn trên nền m ẫu thực có thể loại tr ừ đượ c các ng của nền mẫu đến k ết qu ả phân tích. Sau khi l ậ p đượ c phươ nngg ảnh hưở ng trình đườ ng ng chuẩn y = ax + b, có th ể dễ dàng tính đượ c nồng độ : X = b/a 2.3.4. Đườ ng ng chuẩ n có sử d ụng nội chuẩ n

Một phươ ng ng pháp r ất hữu ích trong phân tích, đặc biệt trong phân tích hiện đại là sử dụng nội chu ẩn. Nộ i chu ẩn đượ c thêm vào dung d ịch chu ẩn để ng cong ph ụ đo máy, vớ i nồ ng độ phù hợ p và giống nhau (C IS). Vẽ đườ ng thuộc giữa t ỷ lệ tín hiệu chất ngoại chu ẩn chia cho nội chuẩn (tr ục tung y) phụ thuộc vào nồng độ ngoại chuẩn (tr ục hoành x). Tính các h ệ số hồi quy (a, b trong phươ ng ng trình hồi quy y = ax + b) và h ệ số tươ ng ng quan (R) t ươ nngg tự như trên.

Hình 6: Ví dụ đườ ng ng chuẩn sử dụng chất nội chuẩn

Khi phân tích m ẫu, n ội chuẩn cũng phải đượ c thêm vào (t ốt nhất là t ừ

đầu, sau khi cân, đong) để sao cho t ạo đượ c nồng độ cuối cùng b ằng nồng độ nội chuẩn trong các dung d ịch chu ẩn. Vớ i cách tiến hành như thế này có thể hạn ch ế đượ c hầu h ết các ảnh hưở ng ng trong quá trình phân tích (bao g ồm

30


từ cân mẫu, chu ẩn b ị mẫu đến phân tích trên thi ết b ị) đến k ết qu ả phân tích.

Đối vớ i các k ỹ thuật phân tích hi ện đại như khối phổ, đặc biệt là sắc ký lỏng khối phổ, việc sử dụng nộ i chuẩn là một yêu c ầu tiên quyết, nếu không muốn nói là b ắt buộc. Thông thườ ng ng trong s ắc ký lỏ ng khối phổ, các chất nội chuẩn đượ c ưu tiên lựa chọn là các chất đồ ng v ị, thông thườ ng ng như 2H (D), 13C, 15 N... Ví dụ, khi phân tích chloramphenicol thì ngoài ch ất ngoại chuẩn là chloramphenicol, s ử dụng thêm ch ất nộ i chu ẩn là chloramphenicold5; clenbuterol thì s ử dụng clenbuterol-d9, melamin thì s ử dụng melamin13 15

C N... Các chất đồng vị này có ưu điểm nổi bật là tính chất hóa lý gầ n

như tươ ng ng t ự chất phân tích do đó đại di d iện tốt cho chất phân tích trong c ả quá trình. Ngoài ra, trong m ột số tr ườ ng hợ p có th t hể chọn các ch ất nội chuẩn ườ ng khác, vớ i điều kiện là các chất này phải có một số tính chất cơ bản giống chất phân tích, và có th ể phân tích đượ c bằng phươ ng ng pháp đang thực hiện.

ự ự ng ẩ ẩ n 2.4. .4 . Cá C ác l ư u ýk hi xây xây d ng đườ ng ng chu n -

Cần đảm b ảo n ồng độ chuẩn chính xác: Đườ ng ng chu ẩn là yếu t ố sống

còn, quyết định sự đúng đắn củ a k ết quả phân tích, do đó nếu trong quá trình xây dựng đườ ng ng chu ẩn mắc những sai số lớ n s ẽ dẫn đến s ự mất chính xác của k ết quả. Điều đầu tiên để kiểm soát đượ c sự chính xác c ủa các nồng độ chuẩn khi xây d ựng đườ ng ng chu ẩn là cần đảm bảo độ chính xác của chất chuẩn (chất chu ẩn mua t ừ nhà s ản xu ất) về hàm lượ ng, ng, độ tinh khiết. Theo yêu cầu của ISO 17025, các ch ất chuẩn khi sử dụng cần có chứng nhận của nhà sản xuất và vẫn còn hạn sử dụng. Trong m ột số tr ườ ng hợ p, có thể bố trí ườ ng các thí nghiệm để đánh giá chất lượ ng ng các chất chuẩn tr ướ ướ c khi đưa vào s ử dụng.


-

31

Tín hiệu các lần đo củ a mỗ i nồng độ phải có độ lặ p lại đạt yêu c ầu:

Khi thẩm định phươ ng ng pháp, mỗi nồ ng độ cần đượ c đo vài lần (ba l ần) để kiểm tra độ lặ p của các nồng độ chuẩn. -

Loại tr ừ sai số thô nếu cần thiết: M ột s ố tr ườ ng hợ p, có th ể gặ p các ườ ng

sai số thô (ngẫu nhiên) xu ất hiện d ẫn đến vi ệc đườ ng ng chu ẩn không đáp ứng yêu cầu. Trong tr ườ ng hợ p này, có thể cân nhắc loại tr ừ các điểm này để ườ ng

đảm b ảo sự chính xác. ới h ạ n ch ấ ấ p n h ận c ủa đườ ng ẩ ẩ n 2.5. Gi ớ n g chu n -

Hệ số hồi quy tuyến tính (R): Chỉ tiêu đầu tiên của một đườ ng ng chu ẩn

ng quan h ồi quy (Coefficient of correlation). R ph ải đạt yêu cầu là hệ số tươ ng đạt theo yêu cầu sau: 0,995 ≤ R ≤ 1 Hay

0,99 ≤ R 2 ≤ 1

ng chuẩn. Sau khi Độ chệch các đ iểm nồng độ dùng xây d ựng đườ ng lậ p đườ ng ng chu ẩn xong c ần ki ểm tra bằng phươ ng ng pháp tính ng ượ c lại nồng ng chuẩn, từ đó tính các giá độ củ a các điểm chu ẩn sử dụng để xây dựng đườ ng tr ị độ chệch theo công th ức sau: -

∆i =

Ct − Cc × 100 Cc

Trong đó: ∆ i : Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây d ựng đườ ng ng chu ẩn C t : Nồng độ tính ngượ c theo đườ ng ng chu ẩn của các điểm chu ẩn C c : Nồng độ của các điểm chu ẩn Theo quy định của nhiều tổ chức c ủa M ỹ, Canada, châu Âu, giá tr ị ∆ không đượ c vượ t quá ± 15% cho t ất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấ p nhận giớ i hạn ± 20%.

32


3. Giớ Giới hạ hạn phát hiệ hiện ĩ ĩa 3.1. Đị nh n h ngh a Giớ i hạn phát hiện là nồng độ mà t ại đó giá tr ị xác định đượ c lớ n hơ n ng pháp. Đây là n ồng độ thấ p nhất c ủa ch c hất độ không đảm b ảo đo của ph ươ ng phân tích trong m ẫu có thể phát hiện đượ c nhưng chưa th t hể định lượ nngg đượ c (đối vớ i phươ ng ng pháp định lượ ng). ng). 3.2. .2 . Cách x ác đị nh nh 3.2.1. LOD c ủa phươ ng ng pháp định tính

Cần xác định đượ c nồng độ nào mà t ại đó s ẽ xác định chắc chắn sự có mặt của chất phân tích. Phân tích các m ẫu tr ắng thêm chu ẩn ở các nồng độ nhỏ khác nhau, mỗi nồng độ phân tích lặ p lại 10 lần. Xác định t ỷ lệ phần tr ăm số lần phát hiện (dươ ng ng tính) ho ặc không phát hi ện (âm tính).

Ví dụ: Bảng 5: Ví dụ cách tính LOD của phương pháp định tính Nồng độ (ppm)

Số lần thử thử

Tỷ lệ dương ương tính/âm tính

Tỷ lệ %

200

10

10/0

100

100

10

10/0

100

75

10

5/5

50

50

10

1/9

10

25

10

0/10

0


33

Trong ví d ụ trên, vớ i nồng độ dướ i 100 ppm k ết luận dươ ng ng tính không còn ch ắc ch ắn 100%, giớ i hạn phát hiện trong tr ườ ng hợ p này là 100 1 00 ườ ng ppm. 3.2.2. LOD c ủa phươ ng ng pháp định l ượ ng ượ ng

Có nhiều cách xác định LOD khác nhau tùy thu ộc vào phươ ng ng pháp áp d ụng là phươ ng ng pháp công c ụ hay không công c ụ. Các cách ti ế p cận có thể chấ p nhận đượ c bao gồ m:

Dự a trên độ lệch chuẩn Cách 1 . Làm trên m ẫu tr ắng (mẫu tr ắng có thành ph ần như mẫu thử nhưng

không có ch ất phân tích). Phân tích m ẫu 10 lần song song, tính độ lệch chu ẩn. Độ lệch chu ẩn này phải khác 0. −

LOD = x 0 + 3SD 0

Tính LOD:

Vớ i Trong đ ó:

SD0 =

∑ (x

− x0 ) n −1

2

0i

−

x 0 = trung bình củ a mẫu tr ắng

SD0 = độ lệch chu ẩn của mẫu tr ắng

Cách 2 . Làm trên m ẫu thử: Làm 10 lần song song. Nên ch ọn mẫu thử có

nồng độ thấ p (ví dụ, trong kho ảng 5 đến 7 lần LOD ướ c lượ ng). ng). −

Tính LOD: Tính giá tr ị trung bình x , và độ lệch chu ẩn SD

34


LOD = 3 x SD SD =

∑ (x

− x) n −1

2

i

−

c: tính R = x / LOD Đánh giá LOD đã tính đượ c:

• Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợ p và LOD tính đượ c là đáng tin cậy thì phải dùng dung d ịch thử đậm đặc hơ n, n, ho ặc • Nếu R < 4 thì thêm một ít chất chuẩn vào dung d ịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R thì phải dùng dung d ịch thử loãng hơ n, n, ho ặc • Nếu R > 10 thì pha loãng dung th ử đã dùng và làm l ại thí nghiệm và tính l ại R

Dự a trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) Cách này chỉ áp dụng đối vớ i các quy trình phân tích tí ch s ử dụng các công cụ có nhiễu đườ ng ng n ền. Thông thườ ng ng cách tính này áp d ụng phổ biến cho các phươ ng ng pháp s ắc ký, điện di. Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chu ẩn hoặc mẫu chuẩn) ở nồng

độ thấ p còn có thể xuất hiện tín hi ệu của chất phân tích. S ố lần phân tích l ặ p lại

³

4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhi ễu (S/N = Signal to noise

ratio), trong đó

S là chiều cao tín hi ệu c ủa chất phân tích, N là nhiễu đườ ng ng nền

Nhiễu đườ ng ng n ền đượ c tính về hai phía của đườ ng ng n ền và tốt nh n hất là tính nhi ễu lân cận hai bên c ủa píc, b ề r ộng mỗi bên tối thiểu gấ p 10 lần chiều r ộng củ a píc tại nửa chiều cao.


35

LOD đượ c chấ p nhận t ại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớ n gấ p 2-3 lần nhiễu đườ ng ng nền, thông thườ ng ng thườ ng ng lấy S/N =3

Hình 7: Xác định LOD bằng cách tính S/N

Dự a trên đườ ng ng chuẩn (tham khảo) Chỉ áp dụng đượ c cho các phươ ng ng pháp có xây d ựng đườ ng ng chu ẩn. LOD có thể đượ c xác định d ựa vào độ dốc của đườ ng ng chuẩn và độ lệch chuẩn của tín hiệu đo. LOD = Trong đó:

3,3 × SD a

SD: Độ lệch chu ẩn của tín hiệu a: Độ dốc của đườ ng ng chu ẩn

Giá tr ị a có thể d ễ dàng tính đượ c từ đườ ng ng chu ẩn, giá tr ị SD có thể đượ c tính theo nhiều cách khác nhau, bao g ồm: -

Dựa trên độ lệch chuẩn của mẫu tr ắng: Phân tích m ẫu tr ắng l ặ p lại 10 lần và tính SD t ươ nngg ứng;

-

Dựa trên độ lệch chu ẩn của mẫu thêm chu ẩn ở nồng độ nhỏ gần LOD, lặ p lại 10 lần (xem phần kiểm tra ở phía trên) và tính SD;

-

Dựa trên hệ số chặn của đườ ng ng chu ẩn, làm nhiều lần để tính SD của giá tr ị b (intercept);

36


-

Dựa trên độ lệch chu ẩn củ a kho ảng cách các giá tr ị đo thực vớ i ng chuẩn. đườ ng

4. Giớ Giới hạ hạn định định lượ l ượng ng ĩ ĩa 4.1. Đị nh n h ngh a LOQ là nồng độ tối thiểu c ủ a một ch ất có trong m ẫu th t hử mà ta có th ể ng bằng phươ ng ng pháp khảo sát và cho k ết quả có độ chụm mong định lượ ng muốn. LOQ chỉ áp dụng cho các ph ươ ng ng pháp định lượ ng. ng. Giống như LOD, có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ, phụ thuộc vào từng phươ ng ng pháp c ụ thể mà lựa chọn cho phù h ợ p. Việc xác định LOQ cần tính đến các yếu tố ảnh hưở ng ng trong m ẫu phân tích, do đó cần thực hiện trên nền mẫu thật. LOQ trong nhiểu tr ườ ng hợ p có thể là điểm th ấ p nhất của khoảng ườ ng tuyến tính. Hình 8 mô t ả mối quan hệ giữa LOD, LOQ và kho ảng tuyế n tính.

Hình 8: Mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính

37


4.2. .2 . Cách x ác đị nh nh

Việc bố trí thí nghiệm để xác định LOQ thườ ng ng k ết hợ p vớ i tính LOD. Có nhiều cách khác nhau để tính LOQ như sau:

Dự a trên độ lệch chuẩn: Có hai tr ườ ng hợ p như trong phần tính LOD là thực hiện trên m ẫu ườ ng tr ắng và thực hiện trên m ẫu thử. Các công th ức tính toán nh ư sau: −

Tính trên m ẫu tr ắng:

LOQ = x 0 + 10SD 0

Tính trên m ẫu thử:

LOQ = 10 SD

Ví dụ: Để xác định gi ới h ạn phát hiện và gi ới h ạn định l ượng c ủa ph ương pháp phân tích metanol trong r ượ ượu, thực hiện phân tích m ẫu tr ắng (mẫu có hàm lượng metanol r ất thấp, gần v ới giới hạn dưới của đường chuẩn), thực hiện phân tích 10 l ần lặp lại và tính giá tr ị trung bình và độ lệch chuẩn, thu được các kết quả như sau: Phương trình đường chuẩn: y = 13,227 x + 0,004 Lần

Abs tạ tại 575nm

HL metanol (mg/l)

Trung bình (mg/l)

SD (mg/l)

1

0,021

12,85

13,61

1,75

2

0,024

15,12

3

0,022

13,61

4

0,024

15,12

38


5

0,019

11,34

6

0,025

15,88

7

0,018

10,58

8

0,024

15,12

9

0,022

13,61

10

0,021

12,85

Như vậy,

LOD = 13,61 + 3x1,75 = 18,86 mg/l LOQ = 13,61 + 10x1,75 = 31,11 mg/l

Dự a trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu: Cách này chỉ áp dụng đối vớ i các quy trình phân tích tí ch s ử dụng các công cụ có nhiễu đườ ng ng n ền. Cách tính toán hoàn toàn t ươ ng ng t ự như trong phầ n tính LOD. LOQ đượ c chấ p nh ận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớ n gấ p 10-20 lần nhiễu đườ ng ng nền, thông thườ ng ng thườ ng ng lấy S/N = 10.

Ví dụ: Xác định LOD c ủa ph ương pháp phân tích axit benzoic trong n ước giải khát bằng HPLC, ng ười ta thực hi ện phân tích các mẫu tr ắng có thêm chuẩn axit benzoic ở các nồng độ thấp d ưới gi ới hạn th ấp nh ất của đường chuẩn. Tính chi ều cao của pic sắc ký (H là tín hiệu S) và chiều cao của nhiễu đường n ền (h = 2N) v ề hai phía c ủa píc. Thu được các kết qu ả như sau:

39


Nồng độ (mg/kg)

0,01

0,02

0,05

Như vậy

Lần

Chiề Chiều cao pic (H = S)

Chiề Chiều cao nhiễ nhi ễu (h = 2N)

S/N

1

1765

1231

2,87

2

1723

1429

2,41

3

1598

1364

2,34

4

1628

1151

2,83

1

3021

1351

4,47

2

3109

1491

4,17

3

2919

1502

3,89

4

2934

1385

4,24

1

6531

1421

9,19

2

6691

1323

10,1

3

6567

1299

10,1

4

6519

1313

9,93

LOD = 0,02 mg/kg LOQ = 0,05 mg/kg

Dự a trên đườ ng ng chuẩn: Cách tính t ươ ng ng tự như trong phần LOD nhưng theo công th ức sau: LOQ =

10 × SD a

Lư u ý, ngoài vi ệc tính toán nh ư trên cần quan tâm đến độ lặ p lại tại LOQ, tùy theo m ỗi phươ ng ng pháp, giá tr ị RSD% cần phải đạt đượ c theo mộ t mức yêu c ầu nào đó. Xem thêm phần độ chụm v ề yêu cầu RSD% cho t ừng nồng độ cụ thể.

Độ chính xác (độ 5. 5. Độ (độ đúng và độ chụ chụm) Hiện nay có nhiều cách hiểu khác nhau v ề thuật ngữ độ chính xác. Tr ướ ướ c đây và đến bây giờ nhiều tài liệu có nói v ề độ đúng và độ chính xác

40


như là hai khái niệm khác nhau. Trong tài li ệu này chúng tôi s ử dụng hai thuật ngữ độ đúng và độ chụm để diễn tả độ chính xác c ủa một phươ ng ng pháp phân tích theo quan điểm mớ i nhất của tiêu chuẩn quố c tế (ISO 5725 16:1994) và tiêu chu ẩn qu q uốc gia (TCVN 6910 1-6:2005). Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá tr ị trung bình c ủa k ết qu ả thử nghiệm và giá tr ị thực hoặc giá tr ị đượ c chấ p nhận là đúng μ. Độ chụm chỉ mức độ mức độ dao t r ị giá trung bình. Hình 9 động c ủa các k ết qu ả thử nghiệm độc lậ p quanh tr mô tả sự mối quan hệ giữa độ chụm, độ đúng và độ chính xác.

Độ chính xác (accuracy) = độ chụm (precision) + độ đúng (trueness)

Hình 9: Minh họa khái niệm độ chính xác (độ chụm và độ đúng) 5.1. Độ ch ụm 5.1.1. Định ngh ĩ a

Trong nhiều tr ườ ng hợ p các phép th ử nghiệm trên những đối tượ ng ng và ườ ng vớ i những điều ki ện khác nhau thườ ng ng không cho k ết qu q uả giống nhau. Điều này do các sai s ố ngẫu nhiên c ủa mỗi quy trình gây ra, ta không th ể kiểm


41

soát đượ c hoàn toàn t ất cả các yếu tố ảnh hưở nngg đến k ết qu ả thử nghiệm. Do

đó, để kiểm soát đượ c các sai số này, phải dùng đến khái niệm độ chụm. Độ chụm chỉ phụ thuộc vào sai số ngẫu nhiên và không liên quan đến giá tr ị thực. Độ chụm là một khái niệm định tính và đượ c bi ểu th ị định lượ ng ng bằng

độ lệch chu ẩn hay hệ số biến thiên. Độ chụm càng thấ p thì độ lệch chu ẩn hay hệ số biến thiên càng lớ n. n. ng hợ p sau: Độ chụm có thể đượ c phân ra thành ba tr ườ ng -

Độ lặ p lại (repeatability)

-

pr ecision) Độ chụm trung gian (intermediate precision)

-

Độ tái lậ p (reproducibility) Sự khác nhau gi ữa các khái ni ệm độ lặ p l ại, độ chụm trung gian và độ

tái lậ p đượ c tóm tắt trong b ảng 6. Bảng 6: Sự khác nhau giữa độ lặ p lại, độ chụm trung gian và độ tái lậ p

Điều ki ện

Độ lặp l ại

Độ chụm trung gian

Độ tái lập

Nền mẫu

Khác

Khác

Khác

Nồng độ

Khác

Khác

Khác

Thiết bị

Giống

Khác

Khác

Ngườ i phân tích

Giống

Khác

Khác

Dụng cụ, hóa chất

Giống

Khác

Khác

Điều kiện môi tr ườ ng ườ ng

Giống

Khác

Khác

Phòng thử nghiệm

Giống

Giống

Khác

42


5.1.2. Cách xác định

Cách 1. Bố trí thí nghi ệm Tiến hành làm thí nghi ệm lặ p lại 10 lần (ít nhất 6 lần) trên cùng m ột mẫu (mỗi l ần bắt đầu từ cân hay đong mẫu). Mẫu phân tích có th ể là mẫu chuẩn, ho ặc m ẫu tr ắng có thêm chu ẩn, tốt nhất là làm trên m ẫu thử hay mẫu thử thêm chu ẩn. Từng phòng th ử nghiệm, có thể bố trí thí nghi ệm để tính độ lặ p lại hoặc độ chụm trung gian. Trong m ộ t số tr ườ ng hợ p tham gia so sánh vớ i các ườ ng phòng thử nghiệm khác (ví d ụ trong chươ ng ng trình thử nghiệm thành thạo, so sánh liên phòng). Nên tiến hành ở nồ ng độ khác nhau (trung bình, th ấ p, cao) trong khoảng làm việc, mỗi nồng độ làm lặ p lại 10 lần (ít nhất 6 l ần). Tính độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tươ nngg đố i RSD hay hệ số biến thiên CV theo các công thức sau: 2 x x − ( ) SD = ∑ i

n −1

RSD% = CV% =

SD × 100 x

Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn n: Số lần thí nghi ệm xi: Giá tr ị tính đượ c của lần thử nghiệm thứ “i” x : Giá tr ị trung bình c ủa các lần thử nghiệm


43

RSD%: Độ lệch chu ẩn tươ nngg đối CV%: Hệ số biến thiên

Cách 2. Tính toán trên các k ết quả phân tích mẫu thự c đã làm. Trong m ột số tr ườ ng h ợ p việc ướ c lượ nngg độ lặ p lại có thể thông qua ườ ng tính toán d ựa trên k ết quả phân tích các m ẫu thực. Do đó việc lưu giữ các k ết qu ả phân tích có vai trò r ất quan tr ọng. Dựa trên k ết qu ả phân tích làm trên m ẫu thực trong nhiều tu ần, ít nhất là 10 m ẫu, có thể là các nền mẫu khác nhau, nồng độ khác nhau nh ưng phả i có k ết quả làm lặ p 2 lần . Tr ườ ng h ợ p các mẫu có nồng độ, hàm lượ ng ng gần như nhau. Tính độ ườ ng lệch giữa hai k ết qu ả lặ p c ủa m ỗi m ẫu d i r ồi tính độ lệch trung bình d tb, sau

đó tính độ lệch chu ẩn s: d i = x i1 − x i 2 d tb = xi = X= s=

∑d

i

n

x i1 + x i 2 2

∑x

i

n

d tb 1,118

RSD % =

s × 100 X

44


Nếu các m ẫu có nồng độ xi khác nhau nhi ều thì thay cho độ lệch d i, tính độ lệch tươ nngg đố i Di, và độ lệch tươ nngg đối trung bình D tb và sau đó tính

độ lệch chu ẩn tươ nngg đối: Di =

D tb =

di xi

∑D

i

n

RSD% =

D tb × 100 1,118

5.1.3. Tiêu chí đ ánh ánh giá

Đối chiếu giá tr ị tính đượ c v ớ i giá tr ị mong mu ốn hay giá tr ị yêu cầu hoặc so vớ i RSD% lặ p lại cho trong b ảng 7 (RSD% tính đượ c không đượ c lớ n hơ n giá tr ị trong bảng ở hàm lượ ng ng chất t ươ nngg ứng). Độ chụm thay đổ i theo nồng độ chất phân tích. N ồng độ chất càng thấ p thì k ết qu ả càng dao n. động nhi ều (không ch ụm) ngh ĩ a là RSD càng lớ n. Bảng 7: Độ lặ p lại tối đa chấ p nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC) TT

Hàm lượ ng ng %

Tỷ lệ chất

Đơ n vị

RSD (%)

1.

100

1

100%

1,3

2.

10

10-1

10%

1,8

3.

1

10-2

1%

2,7

4.

0,1

10-3

0,1 %

3,7

45


5.

0,01

10-4

100 ppm

5,3

6.

0,001

10-5

10 ppm

7,3

7.

0,0001

10-6

1 ppm

11

8.

0,00001

10-7

100 ppb

15

9.

0,000001

10-8

10 ppb

21

10.

0,0000001

10-9

1 ppb

30

Ví dụ dụ: Kết quả các lần phân tích lặp lại chỉ tiêu lipit tổng số trong sữa bột: Lần

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

x i1 21,3

26,5

24,1

25,7

24,6

27,8

26,6

25,4

20,1

18,5

x i 2 21,5

25,9

24,1

25,3

24,5

27,6

26,5

25,1

20,5

18,3

x

21,4

26,2

24,1

25,5

24,55

27,7 27,7

26,55 26,55 25,25

20,3 20,3

18,4

di

0,2

0,6

0,0

0,4

0,1

0,2

0,4

0,2

0,1

0,3

Di 0,0093 0,0229 0,0000 0,0157 0,0041 0,0072 0,0038 0,0119 0,0197 0,0109

46


Lần

11

12 12

13

14 14

15

16 16

17

18

19

20

x i1

27,1

25,3

24,6

25,1

27,6

22,4

26,3

19,8

22,6

24,5

xi2

27,4

25,2

25

25,8

26,9 26,9

22,4 22,4

26,1

20,4

23,1

24,9 24,9

x

27,25 25,25

25,45 27,25

22,4

26,2

20,1

22,85

24,7

0,0

0,2

0,6

0,5

0,4

di

0,3

24,8

0,1

0,4

0,7

0,7

Di 0,0110 0,0040 0,0161 0,0275 0,0257 0,0000 0,0076 0,0299 0,0219 0,0162

D tb =

∑D

RSD% =

n

i

=

0,265 = 0,0133 ; 20

Dtb 0,0133 × 100 = × 100 = 1,19 % 1,118 1,118

Ở khoảng nồng độ này, theo AOAC RSD% tối đa chấp nhận được là 1,8%, như vậy phương pháp áp d ụng có độ chụm đạt yêu cầu.

Trong nội bộ mỗi phòng thử nghiệm ngoài việc tính toán độ lặ p lại, cần ph ải b ố trí thí nghi ệm để tính đượ c độ chụm trung gian (m ột s ố tác giả gọi là độ tái lậ p nội bộ phòng thử nghiệm) theo m ột trong các cách sau đây: -

Sử dụng các nhân viên th ử nghiệm khác nhau; Sử dụng các thiết bị vớ i một số đặc tính khác nhau, ví d ụ các hệ thống HPLC khác nhau c ủa các hãng khác nhau, ho ặc c ủa cùng m ột hãng nhưng vớ i các model khác nhau;

-

Sử dụng các dung môi hóa ch ất, thuốc thử có chất lượ ng ng khác nhau;

-

Khác nhau về nhiệt độ và độ ẩm củ a phòng thử nghiệm;


-

47

Khác nhau các đ iều kiện c ụ thể của thiết bị, ví dụ thành phần dung môi pha động, tốc độ dòng, pH c ủa pha động...

Việc tham gia thử nghiệm thành thạo, so sánh liên phòng th ử nghiệm là điều kiện r ất quan tr ọng trong đánh giá phươ ng ng pháp. Các phòng th ử nghiệm tham gia ph ải có k ết quả thử nghiệm liên phòng tr ướ ướ c khi đượ c công nhận đạt ISO 17025 và để duy trì công nhận ISO 17025. 5.2. Độ đ úng (tru (t ru en ess) ss) 5.2.1. Định ngh ĩ a

ng pháp là khái ni ệm ch ỉ mức độ gần nhau gi ữa giá Độ đúng của phươ ng tr ị trung bình c ủa k ết qu q uả thử nghiệm và giá tr ị thực hoặc giá tr ị đượ c chấ p nhận là đúng (μ).

Đối vớ i đa số mẫu phân tích, giá tr ị thực không thể biết một cách chính xác, tuy nhiên nó có th ể có một giá tr ị quy chiếu đượ c chấ p nhận là đúng (gọi chung là giá tr ị đúng). Giống như độ chụm, độ đúng là một khái niệm định tính. Độ đúng thườ nngg đượ c diễn tả bằng độ chệch (bias).

∆= Trong đó:

Δ

X tb − µ

µ

× 100

: Độ chệch (bias), %

Xtb: Giá tr ị trung bình c ủa k ết quả thử nghiệm

μ: Giá tr ị thực hoặc giá tr ị đượ c chấ p nhận là đúng 5.2.2. Cách xác định độ đ úng úng

Muố n xác đị nh độ đúng c ần phải tìm đượ c giá tr ị đúng, có nhi ều cách khác nhau để xác định độ đúng, bao g ồm vi ệc so sánh k ết quả thực nghiệm vớ i k ết qu ả thực hiện b ở i m ột phươ ng ng pháp đối chiếu ho ặc sử dụng mẫu đã

48


biết nồng độ (mẫu kiểm tra ho ặc mẫu chuẩn đượ c ch ứng nhận) và phươ nngg pháp xác định độ thu hồi (độ tìm lại).

Cách 1: So sánh vớ i phươ ng ng pháp chuẩn/đối chiếu Phân tích mẫu chu ẩn hoặc mẫu thử, thực hiện 10 lần b ằng phươ nngg pháp kh ảo sát và b ằng m ột phươ ng ng pháp đối chiếu. Phươ ng ng pháp đối chiếu tốt nhất là phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn của các tổ chức có uy tín, n ếu không phươ ng ng pháp đối chiếu là phươ ng ng pháp đ ã qua thẩm định cho k ết qu ả tin cậ y trong dải đo đ ang thực hi h iện. Tính toán các k ết quả trung bình và độ lặ p lại (hệ số biến thiên) của hai phươ ng ng pháp. ng pháp b ằng cách Đánh giá độ tươ nngg đồng về độ chụm c ủa hai phươ ng so sánh phươ ng ng sai s2 củ a hai phươ ng ng pháp đó, dùng tiêu chu ẩn F (Fisher) và so sánh hai tr ị giá trung bình b ằng tiêu chu ẩn t (Student). Vi ệc b ố trí các thí nghiệm phải đượ c thực hiện theo phươ ng ng pháp tham chi ếu một cách nghiêm ngặt và các phép đo phải đượ c tiến hành d ướ i điều kiện lặ p lại. -

ẩ ẩ n F – F i sh er) So sánh h ai ph ươ ng ng sai sai (ch u Chuẩn F dùng để so sánh độ lặ p lại của hai tậ p số liệu hoặc hai

phươ ng ng pháp khác nhau. V ớ i tậ p số liệu nhỏ, tính toán giá tr ị Ftn (F thực nghiệm) theo công th ức sau đây và so sánh vớ i giá tr ị Fc (F tra b ảng). S1 2 Ftn = 2 > 1 S2 Trong đó:

Ftn: Giá tr ị F thực nghiệm ng sai của hai phươ ng ng pháp vớ i S1 2 , S 2 2 : Các phươ ng quy ướ c S1 2 > S 2 2


49

Nếu: Ftn ≤ Fc (α, k 1, k 2): Hai phươ ng ng pháp có độ lặ p lại (độ chụm) giống nhau. Nếu: Ftn > Fc (α, k 1, k 2): Hai phươ ng ng pháp có độ lặ p lại khác nhau, trong tr ườ ng h ợ p này n ếu độ lặ p lại c ủa phươ ng ng pháp thử nghiệm khác vớ i ườ ng phươ ng ng pháp chu ẩn thì cần xem xét thêm v ề độ lặ p lại như đ ã mô t ả trong phần trên. Trong đó: Fc (α, k 1, k 2): Giá tr ị F tra b ảng (xem phụ lục 2) vớ i: i: k 1,1, k 2 : Bậc tự do (k 1 = n1 - 1; k 2 = n2 - 1) n1, n2: Số lần làm thực nghiệm của hai phươ ng ng pháp α:

Mức ý ngh ĩ a (significance level), th ườ ng ng lấ y

α

=

0,05 (tươ nngg ứng vớ i độ tin cậ y (confidence level) 95%) -

ị tr un g bình (chu ẩ ẩ n t – Student) So sán h h ai gi átr Studen t) Chuẩn t đượ c dùng để so sánh xem có s ự khác nhau gi ữa giá tr ị thực

nghiệm và giá tr ị thực hay không; phươ ng ng pháp này đượ c ứng d ụng ho ặc để so sánh k ết quả thực nghiệm v ớ i giá tr ị chuẩn trong m ẫu kiểm tra (xem thêm cách 2) ho ặc để so sánh k ết quả của phươ ng ng pháp phân tích v ớ i phươ nngg pháp đối chiếu. Tr ướ ng sai. ướ c khi so sánh hai giá tr ị trung bình cần so sánh hai phươ ng Vớ i số lần phân tích nhỏ hơ n 30, khi hai phươ ng ng sai có sự đồ ự đồng nhất, tính

độ lệch chuẩn chung và giá tr ị ttn (t thực nghiệm) theo công th ức sau đây và so sánh vớ i giá tr ị tc (t tra b ảng):

(n 1 − 1)S12 + (n 2 − 1)S 2 2 Sc = n1 + n 2 − 2 2

50


x1 − x 2

t tn =

 1 1  +   n  1 n 2 

S c 2 

k = n1 + n 2 - 2 Trong đó:

ttn: Giá tr ị t thực nghiệm tc(α, k): Giá tr ị t tra b ảng m ức ý ngh ĩ a α, b ậc t ự do k (xem phụ lục 1) n1, n2 : Số lần thí nghiệm lần lượ t của phươ ng ng pháp thử nghiệm và phươ ng ng pháp đối chiếu ng sai lần lượ t của phươ ng ng pháp th ử S1 2 , S 2 2 : Phươ ng nghiệm và phươ ng ng pháp đối chiếu ng pháp x1 , x 2 : Giá tr ị trung bình l ần lượ t của phươ ng thử nghiệm và phươ ng ng pháp đối chiếu

Nếu ttn ≤ tc(α, k) : Không có s ự khác nhau về k ết qu ả của hai phươ nngg pháp. Nếu ttn > t c(α, k) : Có s ự khác nhau về k ết qu ả của hai phươ ng ng pháp, phươ ng ng pháp thử nghiệm mắc sai số hệ thống. Trong tr ườ ng h ợ p hai phươ ng ng sai không đồng nhất (khác nhau có ý ườ ng ngh ĩ a), a), tính giá tr ị ttn và b ậc t ự do k theo các công th ức sau và so sánh nh ư trên. t tn =

x1 − x 2 S1 2 S 2 2 + n1 n 2


51

  2   2 2   S S 1 2    +   n 1 n 2      k =  −2 2 2  2 2   S1   S2     n 1    n 2      +      n 1 + 1 n 2 + 1  Ví dụ d ụ: Để đánh giá ph ương pháp m ới đề xuất để xác định hàm lượng nitơ trong mẫu thực phẩm, người ta so sánh phương pháp này v ới phương pháp tiêu chu ẩn (ph ương pháp Kjeldahl) qua thí nghi ệm sau: Phương pháp tiêu chu ẩn: n1 = 10; x1 = 10, 10,5; 5; s1 = 0,65 Phương pháp nghiên c ứu: n2 = 10; x2 = 10,9 10,9;; s2 = 0,76 Hãy đánh giá độ đúng của phương pháp đề xuất? Giả Giả i: S22 - So sánh ph ương sai: Ftn = 2 = 1, 3671 S1 Tra b ảng ta có: F (0,05; 9; 9) = 3,18 > Ftn : Hai phương sai không có sự khác nhau có ý ngh ĩ a, a, hai ph ương pháp có độ lặp lại tương đồng.. - So sánh hai giá tr ị trung bình:

(10 − 1) × 0, 65 2 + (10 − 1) × 0, 76 2 3,80 ,8025 + 5,1984 = = 0, 50 10 + 10 − 2 18 10, 5 − 10, 9 t tn = = 1, 265 1 1   0,50 ×  +   10 10 

Sc 2 =

Tra bảng có t(0,05; 18) = 2,101 > t tn , do đó không có s ự khác nhau về kết quả của hai phương pháp.

52


Cách 2: Sử dụng vật liệu chuẩn (Reference material) Vật liệu chuẩn (còn gọi là m ẫu chuẩn) là m ẫu phân tích có hàm l ượ nngg chất phân tích đã đượ c xác định tr ướ ướ c và là đúng. Có nhi ều cấ p vật liệu chuẩn khác nhau, trong đó cao nhất là CRM (certified reference material – vật liệu chu ẩn đượ c chứng nhận) đượ c cung cấ p bở i các t ổ chức có uy tín trên thế giớ i.i. Các mẫu CRM luôn có k ết qu ả kèm theo kho ảng dao động, do đó khi phân tích mẫu CRM có thể đánh giá đượ c độ đúng dựa vào kho ảng dao

động cho phép (ví d ụ : M ẫu thịt, chỉ tiêu clenbuterol là 1 ng/g ± 0,05 ng/g; nếu k ết qu ả phân tích đượ c trong kho ảng từ 0,95-1,05 thì đạt). Nếu không có các m ẫu CRM có thể sử dụ ng các mẫu kiểm tra (QCQuality Control) đã biết nồng độ. Phòng th ử nghiệm có thể tự chuẩn b ị các loại mẫu này, ho ặc sử dụng các mẫu thực có hàm lượ nngg đã biết hoặc sử dụng các m ẫu lưu từ chươ ng ng trình so sánh liên phòng th ử nghiệm. Trong tr ườ ng hợ p khác phòng th t hử nghiệm có thể sử dụng các m ẫu thêm chu ẩn để ườ ng

đánh giá độ đúng, nội dung này s ẽ đượ c mô tả cụ thể trong cách 3 d ướ i đây. Nhiều tổ chức có uy tín nh ư USFDA, EURACHEM, ICH... quy định tính độ chệch (bias) để xác định độ đúng như sau:

∆= Trong đó:

x −µ

µ

× 100

∆ : Độ chệch (bias), % x : Giá Giá tr ị trung bình của k ết quả thử nghiệm

μ: Giá tr ị thực hoặc giá tr ị đượ c chấ p nhận là đúng


53

USFDA quy định độ chệch của các phươ ng ng pháp xác định d ư lượ nngg phải không đượ c lớ n hơ n 15% và không l ớ n hơ n 20% tại LOQ. Có thể sử dụng chuẩn t để đánh giá k ết quả như sau: Phân tích mẫu chuẩn lặ p lại 10 lần (t ối thiểu 6 lần), tính giá tr ị trung bình và độ lệch chu ẩn, từ đó tính giá tr ị ttn theo công thức sau đây và so sánh vớ i tc (p) : t tn =

Trong đó:

µ−x S2 n

ttn: Giá tr ị t thực nghiệm tc(α, k): Giá tr ị t tra b ảng v ớ i mức ý ngh ĩ a 0,05 (xem phụ lục 1) và b ậc tự do k = n - 1.

µ : Giá tr ị thực hoặc giá tr ị đượ c chấ p nhận (tham chiếu) x : Giá Giá tr ị trung bình của phươ ng ng pháp thử nghiệm ng sai của phươ ng ng pháp thử nghiệm S2 : Phươ ng n: Số lần thí nghi ệm Nếu ttn ≤ tc : Không có s ự khác nhau v ề k ết qu ả của giá tr ị trung bình so vớ i giá tr ị tham chiếu ở mức ý ngh ĩ a α, tức là phươ ng ng pháp có độ đúng

đạt yêu cầu. Nếu ttn > t c : Có sự khác nhau về k ết qu ả của phươ ng ng pháp thử nghiệm so vớ i k ết qu q u ả tham chiếu ở mức ý ngh ĩ a α, phươ ng ng pháp thử nghiệm mắc sai số hệ thống.

54


Ví dụ dụ: Phân tích mẫu QC b ằng phương pháp đang nghiên c ứu cho kết quả như sau: n = 10; x = 46,5 ng/g; SD = 4,5 ng/g Cho biết mẫu QC có kết quả đúng là: 50 ng/g.

Đánh giá độ đúng của phương pháp đang nghiên c ứu? Giả Giả i: Tính giá tr ị ttn : t tn =

50 − 46, 5 4,52 10

= 2, 46

Tra bảng: t (0,95; 9) = 2,262 < t tn, do đó kết quả mẫu QC không đạt yêu cầu.

Cách 3: Xác định độ thu hồi Các phươ ng ng pháp tính độ đúng theo cách 1 hay cách 2 đều gặ p nh ững khó khăn nhất định. Trong nhi ều tr ườ ng hợ p không thể tìm ho ặc áp d ụng ườ ng một phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn để so sánh k ết quả, cũng như không thể dễ dàng có đượ c các mẫu chuẩn hoặc mẫu chu ẩn đượ c chứng nhận phù hợ p v ớ i phươ ng ng pháp. Vi ệc xác định độ đúng do đó có thể thực hi ện thông qua xác ng pháp. định độ thu hồi (còn gọi là độ tìm lại) của phươ ng Thêm một lượ ng ng chất chu ẩn xác định vào m ẫu thử hoặc mẫu tr ắng, phân tích các m ẫu thêm chu ẩn đó, làm lặ p l ại tối thiểu b ố n lần b ằng phươ nngg pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau đây: -

Đối vớ i mẫu thử:


R % =

55

C m+ c − C m × 100 Cc

Đối vớ i mẫu tr ắng:

-

R % =

C tt ×100 Cc

Trong đó: R%: Độ thu hồi, % Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong m ẫu thêm chu ẩn Cm: Nồng độ chất phân tích trong m ẫu thử Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Ctt : Nồng độ chất phân tích trong m ẫu tr ắng thêm chu ẩn Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình c ủa độ thu hồi các lần làm lặ p lại. Thêm chất chu ẩn ở ba mức nồng độ là mức thấ p, trung bình và cao trong kho ảng nồng độ làm việc. Theo quy đị nh c ủ a h ội đồ ng châu Âu đối vớ i các chỉ tiêu an toàn (các ch ỉ tiêu thuộc nhóm độc, có quy định giớ i hạ n cho phép, ví d ụ tồn dư hormon, kháng sinh, hóa ch ất bảo vệ thực vật...) thêm chuẩn vào m ẫu tr ắng ở ba m ức nồng độ tại 0,5 lần, 1 lần và 2 l ần giớ i hạn cho phép (MRL). Hội đồ ng châu Âu cũng quy định đối vớ i các mẫu phân tích hàng ngày (routine) các ch ỉ tiêu thu ộc cùng nhóm (ví d ụ: hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ ) c ần ki ểm soát chất lượ ng ng b ằng cách phân tích m ẫu thêm chuẩn tối thiểu 10% số lượ ng ng chất, các ch ất khác cần thay phiên kiểm tra vớ i tần suất tối đa 1 năm/lần cho từng chất.

56


Ví dụ: Để xác định độ thu h ồi của phương pháp phân tích hàm l ượng SO2 trong mẫu r ượ ượu vang, th ực hiện phân tích các m ẫu r ượ ượu vang và r ượ ượu vang có cho thêm chu ẩn ở ba mức n ồng độ, m ỗi nồng độ thực hi ện phân tích bốn lần lặp lại, thu được các kết quả như sau: TT

M ẫu (ml)

Chuẩ Chuẩn thêm (mg/100 ml)

HL SO2 (mg/100ml)

1

20

0

7,72

2

20

0

7,69

3

20

0

7,76

4

20

0

7,73

5

20

5

12,4

6

20

5

12,5

7

20

5

12,6

8

20

5

12,9

9

20

10

17,6

10

20

10

17,8

11

20

10

17,8

12

20

10

17,7

13

20

25

32,4

14

20

25

32,1

15

20

25

32,9

16

20

25

31,9

TB

R (%)

7,73

0

12,6

97,5

17,7

100

32,3

98,4


- Ở nồng độ thêm 5 mg/100 ml: R % =

57

12, 6 − 7, 73 73 × 100 = 97, 5% 5


17, 7 − 7, 73 73 × 100 = 100% 10


32, 3 − 7, 73 73 4% × 100 = 98, 4% 25

5.2.3. Tiêu chí đ ánh ánh giá

Sau khi đánh giá độ thu hồi, so sánh k ết qu ả vớ i các giá tr ị cho trong bảng 8. Độ thu hồi ở các nồng độ khác nhau có k ỳ vọng khác nhau. Trong tr ườ ng h ợ p phân tích tíc h các ch ất hàm lượ ng ng vết có thể tham khảo tiêu chu ẩn ườ ng của hội đồng châu Âu (b ảng 9). Bảng 8: Độ thu hồi chấ p nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) TT

Hàm lượ ng ng [%]

Tỷ lệ chất

Đơ n vị

Độ thu hồi [%]

1.

100

1

100%

98-102

2.

≥ 10

10-1

10%

98-102

3.

≥1

10-2

1%

97-103

4.

≥ 0,1

10-3

0,1 %

95-105

5.

0,01

10-4

100 ppm

90-107

6.

0,001

10-5

10 ppm

80-110

7.

0,0001

10-6

1 ppm

80-110

8.

0,00001

10-7

100 ppb

80-110

9.

0,000001

10-8

10 ppb

60-115

10.

0,0000001

10-9

1 ppb

40-120

58


Bảng 9: Quy định về độ thu hồi của hội đồng châu Âu TT

Hàm lượ ng ng chất (μg/kg) g/kg)

Đơ n vị

Độ thu hồi [%]

1.

≤1

≤ 1 ppb

50-120%

2.

> 1 đến < 10

1-10 ppb

70-110%

10ppb

80-110%

3.

10

³

³

6. 6. Độ Độ ổn định định (hay độ vững/độ ng/ độ chắ chắc chắ chắn) củ của phươ phương ng pháp ĩ ĩa 6.1. Đị nh n h ngh a ng pháp là kh ả năng cung cấ p các k ết qu q uả có độ Độ ổn định củ a phươ ng chính xác ( độ đúng và độ chụm) chấ p nhận đượ c dướ i những điều kiện có sự thay đổi về một số điều kiện thực hiện phươ ng ng pháp. Ngườ i ta phân biệt hai khái niệm độ vững (robustness) và độ chắc chắn (rugedness) như sau: -

Độ vững: Là m ức độ lặ p l ại các k ết qu ả phân tích khi có s ự thay đổ i nhỏ một số thông số của phươ ng ng pháp (method parameters). Ví d ụ ng pháp s ắc ký lỏng có thể k ể ra các yếu tố này bao đối vớ i phươ ng gồm pH pha động, tốc độ dòng, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu, thành phần pha động, bướ c sóng phát hiện...

-

Độ chắc chắn: Là m ức độ lặ p lại các k ết qu ả phân tích khi có s ự thay đổi một số yếu t ố thuộ c về điều ki ện phân tích (test conditions). Các điều kiện này có thể là ngườ i phân tích, thiết b ị phân tích, c ột s ắc ký do các nhà cung c ấ p khác nhau, lô hóa ch ất thuốc thử, thờ i điểm thực hiện thí nghiệm... Nói chung, độ chắc chắn thườ ng ng liên quan


59

đến việc tính độ chụm trung gian hay độ tái lậ p nội bộ phòng th ử nghiệm. Trong tài li ệu này chúng tôi nói đến độ ổn định bao gồm cả hai yếu t ố ng pháp. độ vững và độ chắc chắn của phươ ng 6.2. .2 . Cách x ác đị nh nh

Cho dù có sự khác nhau về điều kiện phân tích hay khác nhau v ề thông số phươ ng ng pháp, thì c ũng c ần phải bố trí các thí nghi ệm để so sánh các k ết qu ả đạt đượ c trong các điều ki ện thay đổ i này b ằng cách so sánh hai phươ ng ng sai (chu ẩn F) và so sánh hai giá tr ị trung bình (chu ẩn t) của hai nhóm k ết qu ả A và B. Ví d ụ, giữa ngườ i A vớ i ngườ i B, giữa máy A và máy B, giữa điều kiện A và điều kiện B... Cách tiến hành so sánh gi ống nh ư trong phần xác định độ đúng khi so sánh hai ph ươ ng ng pháp đã nêu ở trên. Trong tr ườ ng hợ p có m ẫu CRM có thể bố trí các thí nghi ệm (có s ự ườ ng thay đổ i điều kiện phân tích hay các thông s ố của phươ ng ng pháp) để tính k ết quả mẫu CRM và so sánh vớ i k ết quả chuẩn để đánh giá độ ổn định của phươ ng ng pháp.

60

CHƯƠNG III: TH ẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH V ẬT

Chươ Chương ng III: THẨ THẨM ĐỊNH ĐỊNH PHƯƠ PHƯƠNG NG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬ VẬT Phươ ng ng pháp vi sinh v ật có sự khác biệt rõ r ệt vớ i các phươ ng ng pháp hóa họ c. Do đó việc th t hẩm định phươ ng ng pháp phân tích vi sinh v ật cũng có những yêu cầu và k ỹ thuật riêng. Chươ ng ng này sẽ giớ i thiệu mộ t cách sơ lượ c các khái niệm và cách ti ến hành thẩm định các thông s ố cơ bản nhất của phươ ng ng pháp phân tích vi sinh v ật thực hiện theo k ỹ thuật nuôi cấy truyề n thống.

1. Các yêu cầ cầu chung ẩ n b ị th ẩ ẩ m 1.1. Chu ẩ m đị nh nh Tr ướ p hươ ng ng pháp nào, phòng th ử nghiệm ướ c khi thẩm định b ất k ể mộ t ph phải có đầ y đủ các trang thi ết b ị, d ụng cụ và máy móc để thực hiện phươ nngg pháp đó cũng như các yêu c ầu nghiêm ng ặt về chất lượ ng ng các chỉ số k ỹ thuật của trang thiết bị và d ụng cụ (phải đượ c hiệu chu ẩn nếu cần, b ở i một

đơ n vị/phòng hiệu chu ẩn có đủ điều ki ện, thích hợ p so vớ i yêu cầu). Có thể thực hiện kiểm tra chất lượ ng ng môi tr ườ ng nuôi c ấy, thu ốc thử theo hướ nngg ườ ng dẫn tại tiêu chu ẩn ISO 11133 ph ần I và II. Thẩm định một phươ ng ng pháp c ần đượ c thực hiện bở i các kiểm nghiệm viên nắm vững kiến thức chuyên môn, k ỹ thuật thao tác t ốt và có kinh nghiệm trong phân tích vi sinh v ật.


61

ng pháp vi Chuẩn bị mẫu cho quá trình thẩ m định: Đối vớ i phươ ng sinh, việc chu ẩn bị mẫu thẩm định r ất quan tr ọ ng do các mẫu vi sinh thườ nngg có độ ổn định không cao. Quá trình lựa chọ n m ột dạng thực ph p hẩm để làm tăng tỷ lệ mẫu b ị nhiễm tự nhiên cần đượ c tính toán h ết sức cẩn thận. ng m ẫu thực phẩm, cần lựa chọn năm loại Để thẩm định trên đối tượ ng thực phẩm khác nhau thu ộc năm nhóm. Chi ti ết việc lựa chọn loại thực phẩm để thẩm định đượ c mô tả trong phụ lục 3. -

Các mẫu tự nhiên đượ c ưu tiên nhất. Đó là các sản phẩm đượ c phân tích có chứa/nhiễm vi sinh vật đích. Quá trình b ảo qu ản mẫu cần hạ n chế tố i đa sự thay đổ i c ủa vi sinh vật và tr ạng thái c ủa chúng. Cầ n phải kiểm tra mức độ ổn định hàm lượ ng ng vi sinh nhi ễm ngay tr ướ ướ c thờ i điểm sử dụng mẫu để làm thẩm định.

-

Mẫu tự nhiễm: Các dạng m ẫu lỏng ho ặc sệt có thể đượ c gây nhiễm bằng cách tr ộn vớ i các sản phẩm tươ ng ng tự có nhiễm vi sinh vật tự nhiên. Cần phải đảm bảo tính đồng nhất của mẫu sau khi tr ộn.

-

Mẫu thêm: S ử dụng các vi sinh v ật đích để gây nhiễm vào mẫu tr ắng. Hàm lượ ng ng vi sinh vật gây nhiễm c ần t ươ nngg đươ ng ng vớ i lượ nngg thườ ng ng có trong các sản phẩm tự nhiên.

-

Mẫu chuẩn: Mẫu chu ẩn, đặc biệt là các mẫu chuẩn đượ c chứng nhận, có chứa một lượ ng ng vi sinh vật đã biết và có độ ổn định cao. Mẫu chuẩn có thể đượ c sử dụ ng để làm mẫu thêm chu ẩn khi thẩm ng pháp định lượ ng. ng. Đối vớ i các phươ ng ng pháp định định các phươ ng tính, việc sử dụng thườ ng ng không cần thiết.

62


ố ố th ẩ ẩ m 1.2. L ự a ch ọn th ông s m đị n h Các phươ ng ng pháp vi sinh, gi ống như các phươ ng ng pháp hóa h ọc cũng có thể phân lo ại thành hai nhóm ph ươ ng ng pháp là các ph ươ ng ng pháp tiêu chuẩn (reference method) và các ph ươ ng ng pháp không tiêu chu ẩn hay các phươ ng ng pháp thay th ế (alternative method). Hi ện nay, các phòng th ử nghiệm ng pháp tiêu chu ẩn để thực hi ện các ở Việt Nam đa số đều s ử dụng các phươ ng chỉ tiêu vi sinh. Do đ ó, trong ph ạm vi của tài liệu này, chúng tôi ch ỉ xin giớ i thiệu việc thẩm định đối vớ i phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn, các thông s ố cần thẩm

định như sau: Bảng 10: Lựa chọn thông số thẩm định phươ ng ng pháp phân tích vi sinh vật Phươ ng ng pháp định tính

Phươ ng ng pháp định lượ ng ng

Giớ i hạn phát hiện

Giớ i hạn phát hiện

Độ đặ c hiệu, độ nhạ y

Giớ i hạn định lượ ng ng

ng, độ lệch âm Độ lệch dươ ng,

Độ lặ p lại

Độ chính xác (độ đúng)

Độ tái lậ p

Các khái ni ệm về thông số thẩm định vi sinh c ũng có những điểm khác so vớ i thẩm định hóa học, các khái ni ệm này sẽ đượ c làm rõ trong các phần sau. ng pháp không tiêu chu ẩn, quá trình th ẩm định phức Đối vớ i các phươ ng tạ p hơ n và thông thườ ng ng c ần tr ải qua hai giai đ oạn, giai đoạn I là thực hi ệ n so sánh vớ i một phươ ng ng pháp chu ẩn và giai đoạn II là so sánh liên phòng thử nghiệm. Để tìm hiểu k ỹ hơ n v ề thẩm định phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn, có thể tham khảo thêm ISO 16140:2003.


63

2. Thẩ Thẩm định định phươ phương ng pháp tiêu chuẩ chuẩn (method verification) ươ n g p h áp đị n h tín h 2.1. Ph ươ 2.1.1. Gi ớ i hạn phát hi ện

a. Định ngh ĩ a Giớ i hạn phát hiện c ủa một ph p hươ ng ng pháp là n ồng độ vi sinh vật thấ p nhất trong m ẫu có thể xác định đượ c bằng phươ ng ng pháp đó. ng pháp định tính giớ i hạn phát hi ện đượ c tính ở nồng Đối vớ i phươ ng ng tính. độ có tối thiểu 90% mẫu có k ết quả dươ ng b. Cách xác định Thực hiện theo các b ướ c sau: - Chọn loại đối tượ ng ng mẫu cần thực hiện thẩm định. - Th ử năm m ật độ vi khu ẩn cho mỗi loại vi sinh vật đích cho m ột lo ại mẫu, gồm cả chứng âm. Các m ức độ cụ thể như sau: §

Mức độ 1 (Lo) là chứng âm, chỉ cần thực hiện 1 lần.

§

Mức độ 2 là mức độ phát hiện theo lý thuyết từ [1 - 9] CFU/ 25g và mỗi mức độ gây nhiễm ký hiệu L1a, L1b, L1c vớ i (1 ≤ L1a < L1b < L1c ≤ 9) CFU/ 25g. M ức độ 2 đượ c thực hiện 5 lần cho m ỗi mẫu nhiễm.

§

Mức độ 3 (L 2) là mức trên mức phát hiện theo lý thuyết [10-50] CFU/ 25g, mức độ này chỉ cần thực hiện 1 lần.

c. Tính k ết quả LOD củ a mỗi loại thực phẩm đượ c tính như sau:

64


LOD = nồng độ vi khu ẩn nhiễm vào m ẫu mà ở đó có ít nhất 90% mẫu phân tích có k ết quả dươ ng ng tính. d. Đánh giá k ết quả LOD < 10 là đạt yêu cầu. 2.1.2.

Xác

định độ chính xác (accuracy:AC), độ đặc hiệu

(specificity:SP), độ nhạ y (sensitivity:SE), độ l ệch d ươ ng ươ ng (positive deviation:PD) và độ l ệch âm (negative deviation:ND)

a. Định ngh ĩ a -

Độ chính xác (hay độ đúng) là m ức độ giố ng nhau gi ữa k ết qu ả phân tích đượ c vớ i giá tr ị tham chiếu.

-

Độ đặc hiệu là khả năng phân bi ệt vi sinh vật đích vớ i các vi sinh vật khác.

-

Độ nhạy là t ỷ lệ của các vi sinh vật đích có thể đượ c phát hiện.

b. Cách xác định Vớ i mỗi loại đối tượ ng, ng, chu ẩn bị các mẫu khác nhau, chu ẩn bị các mẫu này thành hai nhóm, trong đó có một nhóm m ẫu âm tính và m ột nhóm mẫu đượ c gây nhiễm m ức n ồng độ khoảng bằng 10 lần LOD (không thông báo cho kiểm nghiệm viên). B ố trí các kiểm nghiệm viên phân tích độ c lậ p theo cùng một phươ ng ng pháp đang nghiên c ứu. c. Tính k ết quả Tính k ết quả theo các công th ức sau:


K ết qu ả

M ẫu chứ ng ng (+)

Mẫu chứ ng ng (-)

Mẫu có k ết quả dươ ng ng tính (+)

TP

FP

Mẫu có k ết quả âm tính (-)

FN

TN

Trong đó:

65

TP (True Positive): D ươ ng ng tính đúng (M ẫu chứng có k ết qu ả dươ ng ng tính, k ết quả phân tích cho k ết quả dươ ng ng tính) FP (False Positive): D ươ ng ng tính giả (Mẫu chứng có k ết qu ả âm tính, k ết quả phân tích cho k ết qu ả dươ ng ng tính) FN (False Negative): Âm tính gi ả (Mẫu chứng có k ết qu ả dươ ng ng tính, k ết quả phân tích cho k ết quả âm tính) TN (True Negative): Âm tính đ úng (M ẫu chứng có k ết quả âm tính, k ết quả phân tích cho k ết qu ả âm tính) n = TP + FP + FN F N + TN: T ổng số các k ết quả

ng, độ lệch âm đượ c Độ chính xác, độ đặc hiệu, độ nhạ y, độ lệch d ươ ng, tính toán theo các công th ức sau đây:

Độ chính xác

AC =

TP + TN × 100 N

Độ đặc hiệu

SP =

TN × 100 TN + FP

Độ nhạy

SE =

TP × 100 TP + FN

Độ lệch dươ nngg

PD =

FP × 100 FP + TP

66


ND =

Độ lệch âm

FN × 100 FN + TN

d. Đánh giá k ết quả Các thông s ố cần đượ c đánh giá theo các chu ẩn mực sau: •

Độ chính xác (AC) ≥ 90 %

•

Độ đặc hiệu (SP) ≥ 90 %

•

Độ nhạy (SE) ≥ 90 %

•

ng (PD) ≤ 10 % Độ lệch dươ ng

•

Độ lệch âm (ND) ≤ 10 %

Ví dụ: Bố trí các thí nghiệm để xác định độ chính xác, độ đặc hi ệu và v à độ nhạy của một phương pháp vi sinh, thu được các kết quả như sau: - Số mẫu dương tính phát hi ện dương tính: 37 (TP) - Số mẫu âm tính phát hi ện dương tính: 3 (FP) - Số mẫu dương tính phát hi ện âm tính: 2 (FN) - Số mẫu âm tính phát hi ện âm tính: 38 (TN) Ta có các k ết quả: - Tổng các kết quả: n = 80 - Độ nhạy: SE =

TP 37 × 100 = × 100 = 95 % TP + FN FN 37 + 2

- Độ đặc hiệu: SP =

TN 38 × 100 = × 100 = 93 % TN + FP FP 38 + 3


- Độ lệch dương: PD = - Độ lệch âm: ND =

67

FP 3 × 100 = × 100 = 7, 5 % FP + TP TP 3 + 37 37

FN 2 × 100 = × 100 = 5 % FN + TN TN 2 + 38 38

- Độ chính xác: AC =

TP + TN 3 7 + 38 × 100 = × 100 = 94% n 80

ươ n g p h áp đị nh ượ ng 2.2. Ph ươ nh l ượ ng 2.2.1. Gi ớ i hạn phát hi ện và giớ i hạn định l ượ ng ượ ng

a. Định ngh ĩ a -

p hươ ng ng pháp định lượ ng, ng, giớ i hạn phát hiện là nồng độ vi Đối vớ i ph sinh vật thấ p nhất mà phươ ng ng pháp đó có thể xác định đượ c nh ưng chưa định lượ nngg đượ c. c.

-

Giớ i hạn định lượ ng ng củ a phươ ng ng pháp là nồng độ vi sinh vật thấ p nhất mà phươ ng ng pháp có th ể định lượ nngg đượ c vớ i một độ chụm mong mu ốn.

b. Quy trình thực hiện Thực hiện kiểm nghiệm năm mẫu ở nồ ng độ tối thiểu - t ại m ức phát hiện là trên 0 (a minimum non zero level) ho ặc g ần 0 (near zero level) - để chắc chắn r ằng số lượ ng ng mẫu dươ ng ng tính có t ỷ lệ < 50%. Chọn 3-5 nồng độ trong kho ảng n ồng độ vi sinh vật dự kiến để phân tích (ví d ụ 10, 20, 50 CFU/25g). M ỗi nồng độ thực hiện lặ p lại 6 lần. Ướ c tính lượ ng ng vi sinh vật thấ p nhất trong mẫu có thể phát hiện 50% k ết qu ả dươ ng ng tính.

68


c. Tính k ết quả Tính giớ i hạn phát hiện và gi ớ i hạn định lượ ng ng theo công th ức sau: S0 =

LC 1,65

LOD = 3,3 × S 0 LOQ = 10 × S0 Trong đó:

LC (Critical Level): L ượ ng ng vi sinh vật thấ p nhất trong mẫu có thể phát hiện 50% k ết qu ả dươ ng ng tính. S0: Tín hiệu nền (baseline spread)

Ví dụ: Các kết quả dương tính: 0/6 tại nồng độ 10, 2/6 tại nồng độ 20 và 5/6 tại nồng độ 50 à

Ước tính mức độ dương tính xấp xỉ phát hiện 50% là LC ≈ 20 CFU/25g

Do đó, S0 = 20/1,65 ≈ 12 Giới hạn phát hi ện: LOD = 3,3 x 12 ≈ 40 (CFU/25g) Giới hạn định lượng: LOQ = 10 x 12 = 120 (CFU/25g)

2.2.2. Xác định độ chụm ( độ độ l ặ p l ại và độ tái l ậ p nộ i bộ )

a. Định ngh ĩ a Như đã nêu trong chươ ng ng 2, thẩm định phươ ng ng pháp hóa h ọc, khái niệm độ chụm đượ c sử dụng để chỉ mức độ gần nhau giữa các k ết qu ả phân tích.


69

Độ lặ p lại chỉ độ chụm đượ c thực hiện trong những điều kiện giống nhau, bở i cùng m ột kiểm nghiệm viên và trong m ột khoảng thờ i gian tươ nngg

đối ngắn. Độ tái lậ p chỉ độ chụm đượ c thực hiện bở i các kiểm nghiệm viên khác nhau (độ tái lậ p nội bộ phòng thử nghiệm hay còn gọ i là độ chụm trung gian), ho ặc các phòng th ử nghiệm khác nhau ( độ tái lậ p liên phòng th ử nghiệm). b. Quy trình thực hiện Chọn kho ảng 3-5 lo ại nền mẫu thực phẩm, mỗ i loại chọn 3-5 sản phẩm (mẫu tự nhiên ho ặc mẫu t ự nhiễm). Đối vớ i mẫu t ự nhiễm, cấy vi sinh vật vớ i nồng độ khoảng 102-103 CFU/đơ n vị. §

Xác định độ lặ p lại: Một kiểm nghiệm viên th ực hiện kiểm nghiệm các mẫu nói trên, mỗ i mẫu lặ p lại hai lần, trong một khoảng thờ i gian ngắn.

§

Xác định độ tái lậ p nội bộ phòng thử nghiệm (độ chụm trung gian): Hai ki ểm nghiệm viên, kiểm nghiệm các mẫu nói trên, lặ p lại hai lần song song; có thể thực hiện trong kho ảng thờ i gian tươ nngg đố i dài.

Các dữ liệu để xác định độ tái lậ p có thể thu đượ c từ quá trình ki ểm nghiệm mẫu thực tế, lưu lại các số liệu song song để tính toán. c. Tính k ết quả v

Độ lặ p lại: Tính độ lệch chu ẩn tươ nngg đối (RSD) theo công thức: log a i + log b i xi = 2

70


n

RSD r = Trong đó:

∑ [(log a

i

− log b i ) x i ]2

i =1

2n

ai, bi: Các k ết qu ả phân tích song song c ủa kiểm nghiệm viên. x i : K ết quả trung bình c ủa hai lần thí nghiệm song song ().

v

n: Số k ết quả phân tích song song c ủa kiểm nghiệm viên. Độ tái lậ p nội bộ phòng thử nghiệm: Có nhiều cặ p k ết quả lặ p lại (song song) c ủa hai kiểm nghiệm viên A và B. Tính độ lệch chuẩn tươ nngg đối (RSD) theo công th ức sau: xi =

log a i + log b i 2 n

RSD R = Trong đó:

∑ [(log a i =1

i

− log b i ) x i ]2 2n

ai , bi: Các k ết qu ả phân tích song song c ủa cả hai kiểm nghiệm viên A và B. x i : K ết quả trung bình c ủa hai lần phân tích song song. n: Số k ết quả phân tích song song c ủa cả hai kiểm nghiệm viên A và B.

Tr ườ ng hợ p có nhiều ki ểm nghiệm viên cùng th ực hiện cũng có thể áp ườ ng dụng công thức trên để tính độ tái lậ p. d. Đánh giá k ết quả


71

Khi trong phươ ng ng pháp chu ẩn có cung c ấ p các thông s ố về độ chụm thì k ết quả xác định độ lặ p lại SD r và độ tái lậ p SDR cần ph ải nhỏ hơ n các giá tr ị tươ nngg ứng nêu trong ph ươ ng ng pháp chu ẩn. GHI CHÚ: Nếu trong ph ươ ng ng pháp chu ẩn có nêu giớ i hạn độ lặ p l ại r hay giớ i h ạn độ tái lậ p R thì cách cá ch th t hẩm định/kiểm tra tối thiểu là: hiệu hay thươ ng ng (tùy theo quy định trong ph ươ ng ng pháp tiêu chu ẩn) giữa hai k ết quả phân tích song song ph ải nhỏ hơ n r (nếu là hai k ết qu ả lặ p l ại) hay nhỏ hơ n R (nếu là hai k ết qu ả tái lậ p). Ví dụ d ụ: K ết qu ả xác định độ lặp lại và độ tái lập của hai kiểm nghiệm viên A và B khi định lượng một lo ại vi khuẩn trên mẫu thực phẩm và các tính toán

độ lặp lại và độ tái lập như sau: Kết quả quả Mẫu KNV

Lần Lần x ai =

x bi =

1 (ai) 2 (bi) log(ai) log(bi)

Hiệ Hiệu

TB xi =

Hiệ Hiệ u/

(Hiệ (Hiệu/

Trung

Trung

xai − xbi

x ai + xbi 2

bình

bình)2

1

A

93

86 1,968 1,934

0,034

1,951 0,017415 0,000303

2

B

36

28 1,556 1,447

0,109

1,502 0,072679 0,005282

3

A

34

30 1,531 1,477

0,054

1,504 0,036135 0,001306

4

B

70

64 1,845 1,806

0,039

1,826 0,021318 0,000454

5

A

98

73 1,991 1,863

0,128

1,927 0,066365 0,004404

6

B

262 242 2,418 2,384

0,034

2,401 0,014363 0,000206

72


7

A

89

83 1,949 1,919

0,030

1,934 0,015671 0,000246

8

B

136 105 2,134 2,021

0,112

2,077 0,054083 0,002925

9

A

116 105 2,064 2,021

0,043

2,043 0,021181 0,021181 0,000449

10

B

54

49 1,732 1,690 0,042

1,711 0,024658 0,000608

11

A

168 156 2,225 2,193

12

B

86

68 1,934 1,833 0,102

1,884 0,054149 0,002932

13

A

62

56 1,792 1,748

0,044

1,770 0,024970 0,000623

14

B

35

28 1,544 1,447 0,097

1,496 0,064796 0,004199

15

A

38

28 1,580 1,447

0,133

1,513 0,087630 0,007679

16

B

71

64 1,851 1,806 0,045

1,829 0,024650 0,000608

0,032

2,209 0,014568 0,000212

Tổng KNV A

0,015222

Tổng KNV B

0,017214

Tổng A+B

0,032436

Độ lặp lại của KNV A:

RSDr(A) =

0,015222 = 0,0308 ; 2*8

Độ lặp lại của KNV B:

RSDr(B) =

0,017214 = 0,0328 ; 2*8

Độ tái lập nội bộ:

RSDR=

0,032436 = 0,045 2 × 16


73

74

CHƯƠNG IV: ƯỚC LƯỢNG ĐỘ KHÔNG ĐẢM B ẢO ĐO

Chươ Chương ng IV: ƯỚC ƯỚC LƯỢ LƯỢNG NG ĐỘ KHÔNG ĐẢ KHÔNG ĐẢM M BẢ BẢO ĐO ĐO Theo yêu c ầu của ISO 17025, độ không đảm b ảo đo là một yêu cầu cần thực hi ện cho tất cả các phươ ng ng pháp thử đượ c áp dụng. Việc ướ c lượ nngg độ không đảm b ảo đo là m ột việc khó và r ất phức tạ p, và không ph ải một phòng thí nghi ệm nào cũng có thể thực hi ện đượ c. c. Tuy nhiên, để có thể dần dần nâng cao ch ất l ượ ng ng hệ thống phòng thí nghi ệm phân tích hóa h ọc và vi sinh vật thì cần phải thực hiện công vi ệc này. Các phòng th ử nghiệm có thể phối hợ p để xác định độ không đảm bảo đo như là m ột ph ần c ủa quá trình thẩm định phươ ng ng pháp phân tích. N ội dung của chươ ng ng này sẽ mang đến những khái niệm cơ bản nhất và các cách thực hiện các phép đánh giá độ không đảm bảo đo.

1. Khái niệ niệm về về độ không đảm đảm bả bảo đo Độ không đảm bảo đo của phép đo là thông s ố gắn vớ i k ết qu ả của phép đo, thông số này đặc tr ưng cho m ức độ phân tán của các giá tr ị có thể chấ p nhận đượ c quy cho đại lượ nngg đo của phép đo. -

Độ không đảm bảo đo nói lên độ tin cậy của phép đo. Kiến thức về độ không đảm b ảo đo r ất hữu ích cho vi ệc phát triển phươ ng ng pháp, thẩm định phươ ng ng pháp, hay thay đổi bổ sung để điều chỉnh phươ ng ng pháp tố t hơ n. n.

đảm bả 2. Các nguồ nguồn gây ra độ không đảm bảo đo Trong m ột phép thử có r ất nhiều nguồn gây ra độ không đảm bảo đo: -

Mẫu thử : b ản ch ất của mẫu thử không đồng nhất, tr ạng thái vật lý, ng c ủa các yếu tố nhiệt độ và môi độ ổn định c ủa mẫu thử, ảnh h ưở ng tr ườ ng... ườ ng...


75

-

Lấy mẫu: Lấy mẫu không đại diện, không đồng nhất...

-

Điều ki ện bảo quản: Quá trình vận chuyển, b ảo quản và thờ i gian bảo qu ản mẫu có thể ảnh hưở ng ng lớ n đến k ết quả phân tích.

-

Chuẩn bị mẫu: Quá trình đồ ng nhất, cân mẫu, chiết tách...

-

Dung môi và thuốc thử : Độ tinh khiết, tạ p chất...

-

Thiết bị: Thiết bị có những sai số trong quá trình hi ệu chu ẩn hoặc chưa đượ c hiệu chu ẩn, sai số ở các kho ảng đo khác nhau...

-

ng của nhiệt độ, độ ẩm... ng: Các ảnh hưở ng Điều kiện môi trườ ng

-

Con ng ườ i: K ỹ năng, trình độ, sai số tính toán...

-

Nguồn ngẫu nhiên khác.

3. Các cách đánh giá độ không đảm đảm bả bảo đo Tài liệu này giớ i thiệu hai cách đánh giá độ không đảm bảo đo hiệ n nay đang đượ c áp dụng, đầu tiên là ướ c l ượ nngg độ không đảm bảo đo từ tất cả các yếu tố cấu thành nó (theo h ướ ng ng d ẫn c ủa EURACHEM và cách th ứ hai là ướ c lượ nngg độ không đảm b ảo đo tổ ng từ việc b ố trí thí nghiệm và xác ng pháp thống kê. Trong ph ạm vi các phòng th ử nghiệm hiện định theo phươ ng nay ở Việt Nam thì cách ti ế p cận thứ hai thuận lợ i hơ n và có tính kh ả thi cao.

ảo đ o theo h ướ ướ ng ẫ ẫ n c ủa 3.1. 3. 1. Cách 1 : Ướ c l ượ ng ng độ không đảm b ng d EURACHEM 3.1.1. Bướ c 1: Xác định các đại l ượ ng đ o ượ ng

K ết qu ả đo thu đượ c cu ối cùng là giá tr ị số học c ủa đại lượ nngg đ o, giá tr ị này phụ thuộc vào giá tr ị các đại lượ nngg đầu vào và giá tr ị các đại l ượ nngg trung gian. Liệt kê các đại lượ nngg đo có ảnh hưở nngg đến k ết quả đo cuối cùng, thông thườ ng ng dựa vào quy trình thao tác chu ẩn (SOP) và công th ức tính toán ng này. để xác định các đại lượ ng

76


3.1.2. Bướ c 2: Xác định các ngu ồn gây ra độ không đảm bảo đ o

Từ các đại lượ nngg đ o cần xác định nguồn g ốc có thể gây ra độ không đảm b ảo đo của các đại lượ nngg đó. Các ngu ồn gây ra độ không đảm b ảo đo đã đượ c liệt kê trong mục 2. Cách đơ n giản là phân thành các nhóm chung và lậ p sơ đồ ng cá để xác định nguồn gây ra độ không đảm b ảo đo. ơ đồ xươ ng

Ví dụ: Xác định nguồn gây ra độ không đảm bảo đo của phép cân 0,5g NaOH Các đại lượng đo: - Khối lượng mẫu (đại lượng cuối) - Khối lượng bì (đại lượng trung gian) - Khối lượng bì + mẫu (đại lượng trung gian)


77

3.1.3. Bướ c 3: Tính các thành ph ần độ không đảm bảo đ o

Sau khi đã xác định các ngu ồ n gây ra độ không đảm b ảo đo, bướ c tiế p theo là tính độ không đảm bảo đo từ các nguồn này sau đó k ết nối các giá tr ị này lại vớ i nhau để thu đượ c độ không đảm bảo đo tổng. Không phải tất cả các ngu ồn gây ra độ không đảm bảo đo đều ảnh hưở ng ng tr ực tiế p có ý ngh ĩ a đến độ không đảm b ảo đo tổ ng hợ p mà thực t ế chỉ có một số lượ ng ng ít là có ảnh h ưở ng ng tr ực tiế p. Do đó đầu tiên c ần đánh giá sơ bộ sự đóng góp c ủa từng ngu ồn thành phần đến độ không đảm b ảo đo tổng. Thực tế, nên nhóm các thành ph ần đơ n lẻ thành các nhóm riêng bi ệt để

đơ n giản hóa việc tính toán. Các phươ ng ng pháp cơ bản để tính từng thành phần độ không đảm b ảo

đo là: -

Tính độ lệch chu ẩn c ủa các giá tr ị bằng cách tiến hành các phép đo lặ p lại: Độ không đảm bảo đo chu ẩn xuất phát từ các sai số ngẫu nhiên và đượ c tính toán từ độ lệch chu ẩn củ a phép đo lặ p lại. Yêu cầu s ố lần lặ p lại t ối thiểu phải đạt 6 lần, thông thườ ng ng 10 lần. Các dữ liệu thu đượ c trong quá trình th ẩm đị nh phươ ng ng pháp r ất có ích

để tính độ không đảm bảo đo. -

Tiến hành các phép đo trên chất chu ẩn: Khái niệm chất chuẩn có ngh ĩ a là một đặc tính nào đó của chất đượ c xác định chính xác, s ử dụng để hiệu chuẩn thiết bị hay để thẩm định phươ ng ng pháp. Chất chuẩn ph p hải có chứng nhận đượ c cung c ấ p bở i các tổ chức uy tín có

đủ năng lực thực hiện. -

Sử dụng d ữ liệu và k ết quả của các phép đo tr ướ b iệt hữu ướ c đó, đặ c bi ích là các k ết qu ả từ các chươ ng ng trình thử nghiệm liên phòng.

78


-

Từ sự suy lu ận d ựa vào kinh nghi ệm c ủa ngườ i phân tích: Có nhi ều tr ườ ng hợ p không thể tiến hành các phép th ử nghiệm lặ p lại hoặc ườ ng không có các thông tin c ần thiết để tính độ không đảm bảo đo của một thành phần nào đó, trong nh ững tr ườ ng hợ p này thì kinh nghiệm ườ ng và kiến th ức c ủa ngườ i làm phân tích c ũng là m ột yếu t ố quan tr ọng ng hợ p tính độ không đảm bảo đo b ằng các đặc biệt trong tr ườ ườ ng phươ ng ng pháp không ph ải phân tích thống kê của m ột dãy các giá tr ị quan sát (lo ại B).

a. Tính độ không đảm bảo đo chu ẩn theo lo ại A Phươ ng ng pháp này đánh giá độ không đảm b ảo đo b ằng cách ti ến hành phân tích th ống kê dãy giá tr ị, v ớ i s ố lần l ặ p lại ³6 lần (phân phố i chuẩ n). n). t hị bằng độ lệch chu ẩn ho ặc Độ không đảm b ảo đo chu ẩn có thể đượ c bi ểu th

độ lệch chu ẩn tươ nngg đối: u = SD =

2 x x ( − ) ∑ i

u % = RSD% = Trong đó:

n −1 SD x

u: Độ không đảm bảo đo SD: Độ lệch chu ẩn xi: Giá tr ị thứ i x : Giá Giá tr ị trung bình n: Số lần làm lặ p lại RSD: Độ lệch chu ẩn tươ nngg đố i


79

Trong tr ườ ng hợ p không ch ỉ rõ dạng phân b ố, độ không đảm bảo đo ườ ng

đượ c chuyển đổi từ khoảng tin cậ y x ± α: - Đối vớ i mẫu nhỏ (n < 10):

u= u=

α

vớ i mức ý ngh ĩ a 0,05 (độ tin cậy 95%)

2

α

vớ i mức ý ngh ĩ a 0,003 (độ tin c ậ y

3

99,7%) - Đối vớ i mẫu lớ n (n ³10):

u=

α Z

trong đó Z có giá tr ị: 1,96 vớ i mức ý ngh ĩ a 0,05 (độ tin cậy 95%) 2,575 vớ i mức ý ngh ĩ a 0,01 (độ tin cậy 99%)

Ví dụ: Chứng chỉ hiệu chuẩn cân cho bi ết tại lượng cân 100 mg sai s ố là ±0,2 mg với mức ý ngh ĩ a 0,05. Độ không đảm bảo đo là u = 0,4/1,96 = 0,204 (mg)

b. Tính độ không đảm bảo đo chu ẩn theo lo ại B: Đánh giá độ không ng pháp thống kê. Tùy thu ộc vào xác đảm b ảo đo không b ằng phươ ng su ất xuất hiện các giá tr ị mà chọn hàm phân b ố phù hợ p để tính toán: - Phân b ố hình chữ nhật: Khi các giá tr ị gây ra độ không đảm b ảo

đo đượ c phân b ố r ải rác trong m ột vùng mà t ại đó khả năng xu ất hiện c ủa các số liệu ở các vị trí là như nhau. Trong tr ườ ng hợ p ườ ng

80


này cần xác định kho ảng dao động (độ r ộ ng 2a, dao động ±a) và tính độ không đảm bảo đo theo công thức sau: u= Trong đó

α

α 3

là giớ i hạn thườ nngg đượ c ghi trong ch ứng nhận tiêu

chuẩn.

Ví dụ dụ: Sai số bình định mức 10 ml loại A của nhà sản xuất công bố là ± 0,2 ml

ở nhiệt độ 20 oC nhưng không công bố ở độ tin cậy bao nhiêu. Theo phân phối hình chữ nhật, độ không đảm bảo đo được tính: u =

0, 2 = 0,12 ml 3

- Phân b ố hình tam giác: Khi h ầu hết các giá tr ị gây ra độ không

ng hợ p đảm bảo đo đượ c phân b ố ở gần trung tâm. Trong tr ườ ng này cần xác định kho ảng dao động (độ r ộ ng 2a, dao động ±a) và tính độ không đảm bảo đo theo công thức sau: u= Trong đó

α

α 6

là giớ i hạn thườ nngg đượ c ghi trong ch ứng nhận tiêu

chuẩn.

Ví dụ dụ: Sai số bình định mức 10 ml loại A của nhà sản xuất công bố là ± 0,2 ml ở nhiệt độ 20 oC nh ưng không công b ố ở độ tin cậy bao nhiêu. Nh ưng các kết quả kiểm tra ở phòng thử nghiệm cho thấy giá tr ị bất thường không


81

bao gi ờ có, các giá tr ị đều t ập trung gần giá tr ị trung bình. Theo phân ph ối hình tam giác, độ không đảm bảo đo được tính:

u=

0, 2 = 0,08 ml 6

3.1.4. Bướ c 4: Tính độ không đảm bảo đ o t ổ ng hợ p và mở r ộng ổ ng

a. Đối v ớ i mô hình liên quan đến phép tính tổng hay hiệu số: y = a + b – c...

Độ không đảm bảo đo tổng hợ p đượ c tính: U TH = u a 2 + u b 2 + u c 2 + ... u a , u b , u c : Độ không đảm bảo đo của các đầu vào a, b, c

Ví dụ: Cân chính xác khoảng 0,25 g ch ất chuẩn A trên cân phân tích 4 s ố. Các số liệu như sau: - Chứng chỉ hiệu chuẩn cân công b ố độ không đảm bảo đo là ± 0,0005 g ở mức ý ngh ĩ a 0,05. - Quá trình cân l ặp lại cho độ lệch chuẩn là 0,000075 Cách tính độ không đảm bảo đo: - Độ không đảm bảo quá trình hi ệu chuẩn: u = 0,0005/1,96 = 0,000255 g = 0,255 mg - Độ không đảm bảo đo quá trình l ặp lại: u = SD = 0,000075 g = 0,075 mg - Độ không đảm bảo đo tổng: U =

(0,255)2 + (0,075)2 = 0,266 mg

82


b. Đối vớ i mô hình liên quan đến phép tính tích hay th ươ ng ng số: Vớ i dạng y = a.b.c ho ặc dạng y = (a.b)/c 2

2

2

U TH u   u   u  =   a  +  b  +  c  y  a   b   c 

Ví dụ: Cân chính xác khoảng 0,25 g chất chuẩn A, pha trong n ước c ất và

định mức đến 100ml bằng n ước cất trong bình định m ức. Độ tinh khi ết của chuẩn A là P = 99,9 ± 0,1%. Độ không đảm b ảo đo của bình định m ức là 0,1 ml. Tính U c ủa nồng độ ở mức ý ngh ĩ a 0,05. Nồng độ dung dịch được tính theo công th ức sau: C =

m ×P × 1000 = V

2,498 mg/l Có ba ngu ồn gây ra độ không đảm bảo đo của nồng độ: - Quá trình cân: u a = 0,266 mg (theo tính toán ở ví d ụ tr ướ ước) - Độ tinh khiết mẫu thử: ub =

0,001 =0,00058 3

- Thể tích: uc = 0,1 ml Vậy độ không đảm bảo đo tổng của nồng độ được tính theo dạng y = (a.b)/c: 2

2

2

 0, 266  +  0, 00058  +  0,1  × 2, 4975 = 0, 004 mg/l UTH =        250   0, 999   100 

- Độ không đảm bảo đo mở rộng: Vi ệc báo cáo độ không đảm b ảo ng cần quy về độ không đảm bảo đo mở r ộ ng. Tính độ đo cuối cùng thườ ng


83

không đảm bảo đo mở r ộng theo công th ức sau: U = k × U TH k là hệ số phủ Trong đa s ố tr ườ ng h ợ p, k đượ c cho giá tr ị bằng 2 tươ nngg ứng vớ i độ ườ ng tin c ậy 95%. Tuy nhiên trong m ột số tr ườ ng hợ p cụ thể k còn phụ thuộc vào ườ ng

độ tin cậy mong mu ốn và số bậc tự do, khi đó k đượ c tính bằng cách tra bảng t-student (theo phụ lục 1)

Như ví dụ trên đây, độ không đảm bảo đo mở r ộng U = 2 x 0,004 = 0,008 g/l Vậy, cách ghi là 2,498±0,008 mg/l ở độ tin cậy 95%.

ảo đ o t ừ ừ d ữ ữ li ệu ph ân tích m ẫ ẫ u 3.2. 3. 2. Cách 2 : Ướ c l ượ ng ng độ không đảm b u ự c th ự c Trong đa số tr ườ ng hợ p, việc tính toán độ không đả m bảo đo theo ườ ng từng bướ c như trên r ất tốn kém thờ i gian và công s ức. Vớ i mộ t phươ ng ng pháp

đã thẩm định, thì việc ch ỉ b ố trí các phép thử nghiệm và tính độ không đảm bảo đo theo phươ ng ng pháp thống kê là đủ tính khoa học và tiết kiệm. 3.2.1. Xác định độ không đảm bảo đ o trên mẫ u cùng n ồng độ

Thực hiện theo các b ướ c sau: - Phân tích m ẫu chu ẩn đã biết hàm lượ ng, ng, ho ặc phân tích m ột mẫu ng xác định; đồng nhất có hàm lượ ng - Phân tích m ẫu lặ p l ại t ối thiểu 20 lần, tính k ết qu ả các lần phân tích (các lần phân tích nên đượ c bố trí các ngày khác nhau);

84


- Tính giá tr ị trung bình, độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên của k ết qu ả phân tích; - Độ không đảm bảo đo đượ c tính theo công th ức sau: U(%) = t α,k × CV (%) Trong đó: U : Độ không đảm b ảo đo tổng (%) CV : Hệ số biến thiên của k ết qu ả đo (%) t α,k : Giá tr ị t tra bảng vớ i mức ý ngh ĩ a α = 0,05; bậc tự do k = n - 1 n

: Số lần phân tích lặ p lại

Ví dụ: Để đánh giá độ không đảm bảo đo, người ta thực hiện trên m ẫu chuẩn đo lặp lại 20 lần và thu được các giá tr ị trung bình x = 39, 5 mg m g /k / kg và độ lệch chuẩn SD=2,417 mg/kg. Tính độ không đảm bảo đo như sau: CV% =

SD × 100 =6,12 x

U(%) = t α,k × CV(%) = 1, 1,73 x 6,12 = 10,6 % U = 10,6% x 39,5 = 4,19 mg/kg Công bố U như sau: 39,5 mg/kg ± 10,6% ho ặc 39,5 ± 4,19 mg/kg

3.2.2. Xác định độ không đảm bảo đ o trên các mẫ u nồng độ khác nhau

- Thực hiện phân tích trên m ẫu thêm chu ẩn (vớ i các nồng độ khác nhau). - Phân tích m ẫu lặ p l ại t ối thiểu 20 lần, tính k ết qu ả các lần phân tích


85

(các lần phân tích nên đượ c bố trí các ngày khác nhau) t ừ đó xác định độ thu hồi của các lần phân tích. - Tính giá tr ị trung bình, độ lệch chuẩn và hệ số biến thiên củ a độ thu hồi phân tích. - Độ không đảm bảo đo đượ c tính theo công th ức sau: u R (%) = t α,k × CVR (%) Trong đó:

u R

: Độ không đảm bảo đo tổng theo thu hồi (%)

CVR : Hệ số biến thiên c ủa độ thu hồi (%) t α ,k

: giá tr ị t-student tra b ảng vớ i mức ý ngh ĩ a α = 0,05

k

: Bậc tự do (k = n - 1)

n

: Số lần thử nghiệm

Ví dụ d ụ: Để đánh giá độ không đảm bảo đo, người ta thực hiện trên các mẫu tr ắng thêm chuẩn trong kho ảng n ồng độ từ 10 đến 100 mg/kg, tính độ thu hồi và thực hiện lặp l ại 20 l ần và thu được giá tr ị độ thu hồi trung bình là 97% và độ l ệch chuẩn của độ thu hồi là 7%. Tính độ không đảm bảo đo như sau: CV% =

SD × 100 = 6,87 x

U(%) = t α,n−1 × CV(%) = 1,73 x 6,87 = 11,7 % Công bố U như sau: từ 10-100 mg/kg ± 11,7%

4. Công bố bố độ không đảm đảm bả bảo đo Phải thông báo các thông tin sau đây khi trình bày k ết qu ả đó trong các báo cáo thẩm định ho ặc khi có yêu c ầu.

86


a. K ết quả đo. b. Độ không đảm bảo đo. c. Mức độ tin c ậy đượ c sử dụng trong việc xác đị nh khoảng của độ không đảm bảo đo mở r ộng.

ảo đ o chu ẩ ẩ n t ổ ổ ng ợp 4.1. 4. 1. Cách vi ế t t độ không đảm b ng h ợ p Khi sử dụ ng hệ số phủ k = 1 thì độ không đảm bảo đo chính là độ không đảm bảo đo chu ẩn và đượ c viết như sau:

K ết quả (đơ n vị) vớ i độ không đảm bảo đo chuẩn U (đơ n vị) Chú ý: Không s ử dụng d ấu “±” khi báo cáo độ không đảm b ảo đo chuẩn vì dấu này thườ ng ng gắn vớ i độ tin cậ y cao như 95% và 99%.

ảo đ o m ở ở r ộng 4.2. 4. 2. Cách vi ế t t độ không đảm b Thông thườ ng, ng, độ không đảm bảo đo mở r ộng vớ i hệ số phủ k = 2 đượ c viết như sau:

K ết quả (đơ n vị) ± U ( đơ n vị)


87

88

CHƯƠNG V: ĐẢM B ẢO CH ẤT LƯỢNG KẾT QU Ả THỬ NGHIỆM

Chươ Chương ng V: ĐẢ V: ĐẢM M BẢ BẢO CHẤ CHẤT LƯỢ LƯỢNG NG KẾT QUẢ QUẢ THỬ THỬ NGHIỆ NGHIỆM Thẩm định phươ ng ng pháp phân tích không ph ải là tất cả để đảm b ảo chất l ượ ng ng k ết qu ả thử nghiệm. Theo yêu c ầu c ủa ISO 17025, đảm b ảo chất lượ ng ng là m ột quá trình và c ần th ườ ng ng xuyên thực hiện. Phòng thử nghiệm 1 7025 chính là quá trình đảm bảo chất lượ nngg đượ c công nhận và duy trì ISO 17025 liên tục, ngượ c lại các chươ ng ng trình đảm bảo chất lượ ng ng là một yếu tố cực k ỳ quan tr ọng giúp duy trì đượ c ISO 17025. Trong khuôn kh ổ tài liệu này chúng tôi nêu lên các ch ươ ng ng trình và cách t ổ chức việc đảm bảo chất lượ nngg tại phòng thử nghiệm. Có nhiều cách để các phòng thử nghiệm tổ chức các chươ ng ng trình đảm bảo chất lượ ng. ng. Theo quy định của ISO 17025 (m ục 5.9), phòng th ử nghiệm phải có các thủ tục kiểm soát chất l ượ nngg để kiểm tra tính hi ệu lực c ủa phép thử nghiệm đã thực hi ện. Dữ liệu k ết qu ả phải đượ c ghi chép sao cho có th ể nhận biết các khuynh h ướ ng ng diễn biến của các k ết quả và nếu có thể cần phải áp dụng k ỹ thuật thống kê để xem xét các k ết quả. Việc kiểm tra này phải đượ c lên k ế hoạch, soát xét lại. Các dữ liệu về kiểm soát chất lượ nngg phải đượ c phân tích và khi nh ững dữ liệu này nằm ngoài chu ẩn mực đã đị nh thì phải có hành động khắc phục điều này và ng ăn ngừa k ết quả sai đượ c thông báo. Chươ ng ng này giớ i thiệu các k ỹ thuật và cách tổ chức các chươ ng ng trình ng phòng thử nghiệm. đảm b ảo chất lượ ng


89

1. Phép thử thử nghiệ nghiệm lặ lặp lạ lại Cho cùng một nhân viên th ực hiện việc phân tích m ột chỉ tiêu nào đó xác định trên cùng m ột mẫu thử đồng nhất, trên cùng m ộ t thiết bị, cùng phươ ng ng pháp trong m ột kho ảng thờ i gian t ươ nngg đối ngắn và đánh giá m ức

độ lặ p lại các k ết quả kiểm tra. Trong phân tích hàng ngày, c ần th ực hiện song song t ối thiểu hai lần nhằm tránh đượ c các sai số ngẫu nhiên g ặ p phải. Đánh giá mức độ chênh lệch giữa hai lần làm vớ i giá tr ị trung bình, sự chênh lệch này phải thỏa mãn theo yêu c ầu của từng phươ ng ng pháp.

2. Phép thử thử nghiệ nghiệm tái lậ lập Các phòng th ử nghiệm nên b ố trí cho nhân viên th ực hiện các phép thử nghiệm tái lậ p, b ằng cách cho thực hiện trên các thiết b ị khác nhau ho ặc cho các nhân viên khác nhau th ực hiện cùng một phép thử nghiệm (đổi tay nhân viên).

3. Phép thử thử nghiệ nghiệm trên mẫ mẫu lư lưu Có thể bố trí để nhân viên thực hiện các phép th ử nghiệm trên m ẫu lưu, tuy nhiên để đánh giá đượ c k ết qu ả cần đảm b ảo độ ổn định c ủa mẫu theo thờ i gian và trong điều kiện b ảo qu ản của phòng; đồ ng thờ i ch ỉ nên áp dụng đố i vớ i các chất đượ c bi ết là tươ nngg đối b ền vững trong điều ki ện nhất

định nào đó. 4. Phép thử thử nghiệ nghiệm trên mẫ mẫu tr ắng Mẫu tr ắng là mẫu tươ ng ng t ự như mẫu thử nhưng không có chất phân tích. Việc thực hi ện phép thử trên mẫu tr ắng là yêu c ầu cần thiết đối vớ i đa

90


số phươ ng ng pháp. Trong m ột số tr ườ ng hợ p khi không th ể có đượ c mẫu tr ắng ườ ng thì có thể thực hi ện mẫu tr ắng thuốc thử, t ức là thực hi ện tươ ng ng tự như mẫu nhưng không có giai đoạn cân m ẫu. ng pháp phân tích vi l ượ ng ng và phân tích hàm l ượ nngg Đối vớ i các phươ ng vết, việc sử dụng các mẫu tr ắng đóng vai trò r ất quan tr ọ ng để loại tr ừ nhiễm chéo trong quá trình phân tích. Trong m ột lô mẫu phân tích (ch ạ y máy) cần chạ y mẫu tr ắng sau một kho ảng nhất định (ví d ụ sau mỗi 10 m ẫu) ng quá m ẫu còn sót lại trong hệ thố ng. Số lượ ng ng các mẫu để kiểm tra lượ ng tr ắng cần phải chiếm ít nhất 5% tổng số mẫu phân tích.

5. Phép thử thử nghiệ nghiệm trên mẫ mẫu chuẩ chuẩn Mẫu chuẩn đượ c chứng nhận (CRM) hoặc m ẫu chuẩn thứ cấ p là bằng chứng quan tr ọng để khẳng định k ết qu ả phân tích. Vi ệc có c ó đượ c các mẫu chuẩn đượ c chứng nhận thườ ng ng r ất khó khăn do kinh phí, khi đó có thể cân nhắc sử dụ ng các m ẫu chu ẩn th ứ cấ p như là mẫu kiểm tra. Các m ẫu này có thể là mẫu thu đượ c từ các chươ ng ng trình so sánh liên phòng th ử nghiệm, mẫu đượ c chuẩn lại từ các mẫu CRM hoặc các mẫu chu ẩn do phòng th ử nghiệm tự tạo.

6. Phép thử thử nghiệ nghiệm trên mẫ mẫu thêm Trong tr ườ ng hợ p không có các m ẫu chu ẩn, thì sử dụ ng mẫu thêm ườ ng chuẩn là m ột cách phổ biến và c ần thiết. B ở i vì chu ẩn thêm vào m ẫu và b ản thân chất phân tích có s ự tươ ng ng tác khác nhau v ớ i nền mẫu nên m ẫu thêm cần đượ c thực hiện sao cho sự khác biệt này là nh ỏ nhất. Chuẩn c ần đượ c thêm ngay t ừ đầu, sau giai đoạn cân đong và đảm bảo thờ i gian để đồng nhất vớ i n ền m ẫu. Ví d ụ như, đố i vớ i các phép phân tích d ư lượ ng ng trên các nề n


91

mẫu sinh học th ườ ng ng thêm chu ẩn vào ngày hôm tr ướ ướ c khi phân tích, có th ể

để qua đêm để đồng nhất. 7. Sử Sử dụng các phươ phương ng pháp khác nhau Phòng thử nghiệm có thể sử dụng nhiều phươ ng ng pháp khác nhau để kiểm tra một chỉ tiêu nào đó. T ốt nhất là so sánh k ết quả của ph p hươ ng ng pháp thực hiện vớ i một phươ ng ng pháp tiêu chu ẩn.

Đánh 8. 8. Đ ánh giá sự sự phù hợ hợp củ của hệ hệ thố thống Thông thườ ng ng các ph ươ ng ng pháp phân tích s ắc ký hay quang ph ổ cần có sự đánh giá để đảm b ảo hệ thống phù h ợ p để phân tích. Đánh giá sự phù hợ p của hệ thống là các phép th ử để chứng minh r ằng h ệ thống hoạt động

đúng theo m ục đích sử dụng. Cần đánh giá hàng ngày tùy thu ộc vào độ ổn ng mẫu phân tích hàng ngày. định của hệ thống ho ặc số lượ ng Phép thử đánh giá sự phù hợ p c ủa hệ thống c ủa các phươ ng ng pháp sắc ký đượ c quy định theo nhi ều tổ chức (USP, USFDA) như sau: -

Độ chụm của thờ i gian lưu, diện tích píc sắc ký: Tiêm tr ực tiế p dung dịch chu ẩn nhiều lần lặ p l ại vào hệ thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tươ nngg đối (RSD). Số lần b ơ m tối thiểu 5 lần phải cho RSD nhỏ hơ n 2%. Nếu RSD lớ n hơ n 2% cần sử dụng 6 điểm;

-

Độ phân giải giữa hai chất;

-

Hệ số kéo đuôi;

-

Các thông số khác: như độ trôi đườ ng ng nền, nhiễu đườ ng ng nền (khi giớ i hạn phát hiện đóng vai trò quan tr ọng trong ph ươ ng ng pháp).

92


9. Tham gia các chươ chương ng trình thử thử nghiệ nghiệm liên phòng Tham gia các ch ươ ng ng trình thử nghiệm liên phòng là m ột yêu c ầu bắt buộc n ếu phòng thử nghiệm muốn đượ c công nhận ISO 17025. Hàng n ăm, phòng th ử nghiệm cần lậ p k ế hoạch tham gia các ch ươ ng ng trình thử nghiệm liên phòng, xem đây là cách t ốt nhất để đ ánh giá năng l ực bản thân phòng thử nghiệm c ủa mình. Hiện nay đã có nhiều t ổ chức ở Việt Nam và trên thế giớ i cung cấ p các chươ ng ng trình thử nghiệm liên phòng, các phòng th ử nghiệm cần tìm kiếm các chươ ng ng trình phù hợ p vớ i phạm vi của phòng mình để tham gia.

Hình 10: So sánh liên phòng thử nghiệm kiểu mẫu

Tr ừ một số tr ườ ng hợ p đặc biệt, thông thườ ng ng dựa vào các k ết qu ả thu ườ ng ng trình thử nghiệm liên phòng, phòng th ử nghiệm c ần có đượ c t ừ các chươ ng hướ ng ng xử lý và khắc phục: - N ếu |Z| ³3: Có số lạc. Phòng thử nghiệm c ần tìm hi ểu nguyên nhân gây sai lệch và có hành động khắc phục phù hợ p, thông thườ ng ng k ết qu ả khắc phục cần đượ c gửi cho đơ n vị tổ chức.


93

- Nếu 2 < |Z |< 3: Nghi ng ờ . Phòng th ử nghiệm không b ắt buộc ph p hải thực hiện hành động khắc phục, tuy nhiên phòng c ần tìm hiểu các nguyên nhân và có hành độ ng phòng ng ừa. - Nếu |Z| ≤ 2: Không có s ố lạc.

10. Sử Sử dụng biể biểu đồ ki kiểểm soát Biểu đồ kiểm soát (Control Chart) là m ột trong những công cụ thống kê r ất hữu ích giúp cho quá trình th ực hiện các chươ ng ng trình đảm b ảo chất lượ ng. ng. Có nhiều d ạng biểu đồ kiểm soát khác nhau, trong đó d ạng thườ nngg

đượ c s ử dụng trong phòng th ử nghiệm là biểu đồ trung bình. Bi ểu đồ kiểm soát loại này đượ c xây d ựng từ giá tr ị trung bình và độ lệch chuẩn củ a m ẫu kiểm tra (QC), bao g ồm giá tr ị trung tâm và các giá tr ị giớ i hạn cảnh báo trên (UWL – Upper Warning Limit), gi ớ i hạn cảnh báo d ướ i (LWL – Lower Warning Limit), giớ i hạn hành độ ng trên (UAL – Upper Action Limit) và giớ i hạn hành động d ướ i (LAL – Lower Action Limit). Thông th ườ ng ng các giớ i hạn này tươ nngg ứng vớ i quy tắc ± 2SD và ± 3SD (SD là độ lệch chu ẩn).

Hình 11: Mô hình biểu đồ kiểm soát dạng trung bình

94


Trong quá trình phân tích, tùy theo giá tr ị và xu hướ ng ng c ủa m ẫu QC mà có biện pháp khắc phụ c. Cần ngừng thực hiện phân tích, ki ểm tra các k ết quả của các mẫu thực phân tích kèm theo và có hành độ ng phù hợ p nếu x ảy ra một trong các tr ườ ng hợ p sau: ườ ng - Có b ất k ỳ một mẫu QC vượ t ra ngoài kho ảng hành động (LAL – UAL) - Có nhiều hơ n hai trong ba m ẫu liên tục vượ t ra ngoài kho ảng c ảnh báo (LWL – UWL) - Các giá tr ị mẫu QC có xu hướ ng ng nằm về một phía của giá tr ị thực hoặc giá tr ị đượ c chấ p nhận là đúng (trong tr ườ ng hợ p biết nồng độ mẫu ườ ng QC): Theo ISO 8258, n ếu có lớ n hơ n 9 điểm nằm về một phía thì không chấ p nhận. - Hàm lượ ng ng mẫu QC có xu hướ ng ng tăng ho ặc giảm theo thờ i gian phân tích: Theo ISO 8285, n ếu có 6 điểm liên tục của mẫu QC tăng ho ặc giảm (vẫn nằm trong giớ i hạn) thì cần dừng lại và kiểm tra lại k ết qu ả. Tất c ả các ho ạt động nói trên đều là các ch ươ ng ng trình nh ất định nhằm ng k ết qu q uả thử nghiệm. Để hướ ng ng t ớ i đảm b ảo chất lượ nngg đảm b ảo chất l ượ ng toàn diện, thì áp dụng và thực hi ện đúng theo các yêu c ầu c ủa ISO 17025 là cách tốt nhất.

95


Phụ Phụ lục 1: Bảng phân ph ối chuẩn Student với các mức ý ngh ĩ a từ 0,10 đến 0,001 Bậc tự do 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

0,10 6,314 2,920 2,353 2,132 2,015 1,943 1,895 1,860 1,833 1,812 1,796 1,782 1,771 1,761 1,753 1,746 1,740 1,734 1,729 1,725 1,721 1,717 1,714 1,711 1,708 1,706 1,703 1,701 1,699 1,697 1,645

0,05 12,71 4,303 3,182 2,776 2,571 2,447 2,365 2,306 2,262 2,228 2,201 2,179 2,160 2,145 2,131 2,120 2,110 2,101 2,093 2,086 2,080 2,074 2,069 2,064 2,060 2,056 2,052 2,048 2,045 2,042 1,960

α 0,01 31,82 6,965 4,541 3,747 3,365 3,143 2,998 2,896 2,821 2,764 2,718 2,681 2,650 2,624 2,602 2,583 2,567 2,552 2,539 2,528 2,518 2,508 2,500 2,492 2,485 2,479 2,473 2,467 2,462 2,457 2,326

0,005 63,66 9,925 5,841 4,604 4,032 3,707 3,499 3,355 3,250 3,169 3,106 3,055 3,012 2,977 2,947 2,921 2,898 2,878 2,861 2,845 2,831 2,819 2,807 2,797 2,787 2,779 2,771 2,763 2,756 2,750 2,576

0,001 318,3 22,33 10,21 7,173 5,893 5,208 4,785 4,501 4,297 4,144 4,025 3,930 3,852 3,787 3,733 3,686 3,646 3,610 3,579 3,552 3,527 3,505 3,485 3,467 3,450 3,435 3,421 3,408 3,396 3,385 3,090

Phụ Phụ lục 2: Bảng phân phố phối chuẩ chuẩn Fisher vớ với k1, k2 là các bậ bậc tự tự d o, α là mứ mức ý ngh ĩ ngh ĩ a k 1 k 2

α

Phụ Phụ lục 2 (tiế (tiếp theo)

k 2

α

k 1

Phụ Phụ lục 2 (tiế (tiếp theo)

k 2

k 1

α

97

Phụ Phụ lục 3: Lựa chọ đối tượ định phươ chọn đối tượng ng mẫ mẫu để thẩ thẩm định phương ng pháp vi sinh Sản Yersi- Cl. L. E. coli Staph. S.aureus Campy- Salmo- Bacillus Men VK Tổng Coliforms E. phẩ phẩm nia Perfr- monocy- O157 aureus entero- lobacter nella cereus mốc Lactic khuẩ khuẩn coli spp. ingens togenes &VTEC toxins spp. spp. lạc Tươi sống Chế biến Đông lạnh Lên men Ướp Khác

X

Tươi sống Chế biến Đông l nh

X

X X

X Món ăn, nước sốt

X

X

X

X

X

X Patê

Sản phẩ phẩm thị thịt X X

X

X

X

X X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X X

X

Sản phẩ phẩm thị thịt gia cầ cầm X X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

Phụ Phụ lục 3: Lựa chọ đối tượ định phươ chọn đối tượng ng mẫ mẫu để thẩ thẩm định phương ng pháp vi sinh Sản Yersi- Cl. L. E. coli Staph. S.aureus Campy- Salmo- Bacillus Men VK Tổng Coliforms E. phẩ phẩm nia Perfr- monocy- O157 aureus entero- lobacter nella cereus mốc Lactic khuẩ khuẩn coli spp. ingens togenes &VTEC toxins spp. spp. lạc Tươi sống Chế biến Đông lạnh Lên men Ướp Khác

X

Tươi sống Chế biến Đông lạnh Khác

X

Tươi sống Chế biến Đông

X

X X

X Món ăn, nước sốt

lạnh Hun khói Khác Tươi X sống Chế biến Đông lạnh Khô Lên men Ướp Nước ép Độ ẩm thấp Khác

Sản phẩ phẩm thị thịt X X

X X

X

X

X

X

X Patê

X

X

X X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

Cá và thủ thủy ssảản X X

X

X

X

X

X Sản phẩ phẩm từ từ rau quả quả X X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X X X X

X

X

X

X

Sản phẩ phẩm thị thịt gia cầ cầm X X

X

X

X

X

X

X

lạnh Hun khói Khác

X

Tươi X sống Chế biến Đông lạnh Khô Lên men Ướp Nước ép Độ ẩm thấp Khác

X

X

X Sản phẩ phẩm từ từ rau quả quả X X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X X X X

X

X

X

X

X

99

Phụ Phụ lục 3 (tiế (tiếp) Sản phẩ phẩm

Yersi- Cl. L. E. coli Staph. S.aureus Campy- Salmo- Bacillus Men VK T ổng Coliforms E. nia Perfr- monocy- O157 aureus entero- lobacter nella cereus mốc Lactic khuẩ khuẩn coli spp. ingens togenes &VTEC toxins spp. spp. lạc

Tươi sống Chế biến Đông lạnh Lên men Khô Khác

X

X

X

X

X X

X X

X X X

Ngũ Ngũ cốc và sả sản phẩ phẩm X X X X X X

X X X

X

X Tr ứng sữa

Sản phẩ phẩm khác X X

X X X

X X X

X

X

X X

X X

X X

Sản phẩ phẩm chocola và bánh mỳ mỳ X X

Độ ẩm thấp Khô Khác Bia Nước sốt Gia vị Mayonnaise

X X X

X X

X

X

X

X X X

Phụ Phụ lục 3 (tiế (tiếp) Sản phẩ phẩm

Yersi- Cl. L. E. coli Staph. S.aureus Campy- Salmo- Bacillus Men VK T ổng Coliforms E. nia Perfr- monocy- O157 aureus entero- lobacter nella cereus mốc Lactic khuẩ khuẩn coli spp. ingens togenes &VTEC toxins spp. spp. lạc

Tươi sống Chế biến Đông lạnh Lên men Khô Khác

X

X

X

X

X X

X X

X X X

Ngũ Ngũ cốc và sả sản phẩ phẩm X X X X X X

X X X

X X X

X

X

X

X X

X X

Tr ứng sữa

Sản phẩ phẩm khác X

X X X X

X

Sản phẩ phẩm chocola và bánh mỳ mỳ X X

Độ ẩm thấp Khô Khác Bia Nước sốt Gia vị Mayonnaise Mỳ Tr ứng Gạo Thức ăn chăn nuôi

X X X

X X

X X

X

X

X

X X

X

X

TÀI LIỆ LIỆU THAM KHẢ KHẢO 1. Ludwig Huber (2007), Validation and Qualification in Analytical Informa Healthcare, London. Laboratories, Informa 2. TCVN ISO/IEC 17025:2005, Yêu cầu chung v ề năng l ự ự c của phòng th ử nghiệm và hiệu chu ẩ n. n.

3. AOAC International (2007), How to meet ISO 17025 requirements for method verification, USA.

X X X

TÀI LIỆ LIỆU THAM KHẢ KHẢO 1. Ludwig Huber (2007), Validation and Qualification in Analytical Informa Healthcare, London. Laboratories, Informa 2. TCVN ISO/IEC 17025:2005, Yêu cầu chung v ề năng l ự ự c của phòng th ử nghiệm và hiệu chu ẩ n. n.

3. AOAC International (2007), How to meet ISO 17025 requirements for method verification, USA.

4. Văn phòng công nhận chất lượ ng ng (2010), Yêu cầu bổ sung để công nhận các phòng th ử nghiệm l ĩ n ĩnh h vự c Hóa (AGL3).

5. Hewlett Packard (HP) (1993), Peak purity analysis in HPLC and CE using diode-array technology, Germany.

6. ICH (1996), Validation of Analytical Procedures: Text and methodology, ICH Hamonised Tripartite Guideline.

7. Eurachem (1998), The fitness for purpose of Analytical methods – A laboratory guide for method validation and related topics , Eurachem

guide. 8. Centre d’expertise en analyse environnementale du Québec (2009), Protocole pour la validation d’une méthode d’analyse en chimie (DR

12 VMC), Canada. 9. Elison S. L. R. & al. (2000), Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, 2 edition, Eurachem/Citac Guide.

101

10. Standards Council of Canada (2009), PALCAN Interpretation and Guidance on the Estimation of Uncertainty of Measurement in Testing (APLAC TC 005) , Canada.

11. Tạ Thị Thảo, Thố ng ng kê trong hóa phân tích , Giáo trình Tr ườ ườ nngg Đại học Khoa học Tự nhiên. 12. National Public Health Service for Wales (2005), Uncertainty of Measurement in Testing .

13. European Communities (2002), The performance of Analytical Methods and interpretation of results, (2002-657-EC)

14. SANCO (2007), 3131, Method validation validation and quality control procedure for pesticide residues analysis in food and feed feed , SANCO 2007/3131.

15. Singapore Accreditation Council (2002), Method Validation for Microbiological methods, Guidance Note.

16. ISO 16140 (2003), Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods.

VIỆ VIỆN KIỂ KIỂM NGHIỆ NGHIỆM AN TOÀN VỆ V Ệ SINH THỰ THỰC PHẨ PHẨM QUỐ QUỐC GIA

THẨ THẨM ĐỊNH ĐỊNH PHƯƠ PHƯƠ NG NG PHÁP TRONG PHÂN TÍCH HÓA HỌ HỌC VÀ VI SINH VẬ V ẬT Chịu trách nhiệm xuất bản: Biên tậ p: Trình bày bìa:

TS. Phạm Văn Diễn Nguyễn Kim Dung Tr ịnh Thị Thùy Dươ nngg

NHÀ XUẤT BẢ N KHOA HỌC VÀ K Ỹ THUẬT 70-TR Ầ N HƯ NG ĐẠO - HÀ NỘI In 1000 cuố n khổ 16x24cm t ại Số đăng ký KHXB s ố 215-2010/CXB/54.1-17/KHK 215-2010/CXB/54.1-17/KHKT, T, ngày 05/3/2010. Quyết định XB số 182/QĐXB-NXBKHKTngày 13 tháng 8 n ăm 2010. In xong và nộ p lưu chiểu tháng 8 năm 2010.

103

LOD-LOQ

Recommend Documents