Lipides mbnaires

UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON I  UFR CHIMIE‐BIOCHIMIE     

Licence Sciences et Technologies  mention Biochimie           

Lipides membranaires          Pr Agnès Girard‐Egrot     

 

  Equipe Génie Enzymatique, Membranes Biomimétiques et  Assemblages Supramoléculaires   ICBMS – UMR 5246  Bâtiment CPE  Tel: 04 72 44 85 32  Fax: 04 72 44 79 70  Email: agnes.egrot@univ‐lyon1.fr 

PLAN 1) INTRODUCTION .................................................................................................................................................. 2  1.1. RÔLE ET COMPOSITION DES MEMBRANES ............................................................................................. 2  1.2. VISUALISATION DES MEMBRANES .......................................................................................................... 4  2) LIPIDES MEMBRANAIRES ................................................................................................................................ 7  2.1. DIFFERENTES CLASSES DE LIPIDES MEMBRANAIRES ......................................................................... 7  2.1.1. Phosphoglycérides ..................................................................................................................................... 8  2.1.2. Glycoglycérides ......................................................................................................................................... 9  2.1.3. Sphingolipides ......................................................................................................................................... 10  2.1.4. Stérols ...................................................................................................................................................... 12  2.1.5. Acides gras .............................................................................................................................................. 13  2.2. CARACTÉRISTIQUES COMMUNES DES LIPIDES MEMBRANAIRES .................................................. 14  2.3. COMPOSITION ET CARACTÉRISATION DES LIPIDES D’UNE MEMBRANE...................................... 14  2.3.1. Analyse de la composition lipidique ........................................................................................................ 14  2.3.2. Caractérisation des chaînes hydrocarbonées .......................................................................................... 16  2.3.3. Composition lipidique des membranes biologiques ................................................................................ 17  2.4. SYSTEMES MODÈLES LIPIDIQUES .......................................................................................................... 18  2.4.1. Liposomes ................................................................................................................................................ 18  2.4.2. Monocouches lipidiques .......................................................................................................................... 21  2.4.3. Bicouches lipidiques planes..................................................................................................................... 22  3) DÉTERGENTS ..................................................................................................................................................... 24  3.1. NATURE ET PROPRIETES DES DETERGENTS ....................................................................................................... 24  3.2. SOLUBILISATION DES LIPOSOMES PAR LES DETERGENTS .................................................................................. 27  3.3. SOLUBILISATION DES MEMBRANES PAR DES DETERGENTS. ............................................................................... 29  4) POLYMORPHISME LIPIDIQUE...................................................................................................................... 30  4.1. EFFET HYDROPHOBE......................................................................................................................................... 30  4.2. ORGANISATIONS STRUCTURALES DES PRINCIPALES PHASES DU POLYMORPHISME LIPIDIQUE ........................... 33  4.3. DIAGRAMME DE PHASE .................................................................................................................................... 34  4.4. CONCEPT DE FORME ......................................................................................................................................... 36  4.5. COMPENSATION DE FORMES ............................................................................................................................. 38  4.6. CARACTERISATION DES PHASES DU POLYMORPHISME LIPIDIQUE ..................................................................... 39  4.6.1. Cryofracture ............................................................................................................................................ 39  4.6.2. Spectroscopie RMN ................................................................................................................................. 40  4.7. IMPORTANCE DES DIFFERENTES PHASES DANS LES MEMBRANES BIOLOGIQUES ................................................ 44  4.8. MECANISME DE FUSION LIPIDIQUE ................................................................................................................... 45  5) FLUIDITE MEMBRANAIRE............................................................................................................................. 46  5.1. INTRODUCTION ................................................................................................................................................. 46  5.2. DETERMINATION EXPERIMENTALE DE LA FLUIDITE .......................................................................................... 47  5.2.1. Dépolarisation de fluorescence .............................................................................................................. 47  5.2.2. Valeur de la fluidité membranaire ........................................................................................................... 50  5.3. FLUIDITE ET CONFORMATION DES CHAINES HYDROCARBONEES ....................................................................... 51  5.3.1. Conformations ordonnées et désordonnées des lipides ........................................................................... 51  5.3.2. Détection expérimentale des transitions ordre  désordre .................................................................... 52  5.3.3. Transitions conformationnelles dans les phases lipidiques ..................................................................... 55  5.3.4. Conformation des chaînes et fluidité membanaire .................................................................................. 57  5.4. ROLE DE LA FLUIDITE MEMBRANAIRE .............................................................................................................. 60  5.5. MICRODOMAINES MEMBRANAIRES ................................................................................................................... 61  ANNEXES ................................................................................................................................................................. 63  ANNEXE 1 : TECHNIQUE DE FOLCH ......................................................................................................................... 63  ANNEXE 2 : CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM) ................................................................................ 63  ANNEXE 3 : CHROMATOGRAPHIE GAZ-LIQUIDE (CGL) ........................................................................................... 63  ANNEXE 4 : NOTIONS DE SPECTROSCOPIE RMN ..................................................................................................... 64 

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La majeure partie de ce cours est tiré de « Biochimie et Biophysique des Membranes » de E. Schechter, seconde édition (Masson, Paris, 1997), noté Réf. 1; « Progress in Protein-lipid interactions. (A. Watts & J.J. H.H. M. de Pont, eds) de B. De Kruijff et al. (Elsevier 1985), noté Réf. 2 ; « Biomembranes. Molecular structure and function » R. B. Gennis (Springer-Verlag, New York, 1989), noté Réf.3. La provenance des figures est indiquée au bas de chaque légende.

1) INTRODUCTION 1.1. RÔLE ET COMPOSITION DES MEMBRANES Les membranes biologiques sont des structures omniprésentes délimitant les cellules et les organites intracellulaires (mitochondries, noyaux, chloroplastes, lysosomes, …). Le rôle premier de ces membranes est de permettre des compartimentations. La membrane cytoplasmique délimite la cellule et sépare les milieux intracellulaire et extracellulaire. Le rôle de cette membrane est de maintenir des compositions différentes entre le cytosol et le milieu externe ; de même, les membranes des organites intracellulaires permettent le maintien de compositions différentes entre le cytosol et le lumen des organites. ` La membrane cytoplasmique est composée de lipides et de protéines. La fonction de compartimentation est dévolue aux lipides membranaires. Les lipides sont des molécules amphiphiles qui possèdent une partie polaire et une partie apolaire situées dans deux régions distinctes de l’espace (Fig. 1.1).

Figure 1.1. Modèle moléculaire d'un lipide (gauche) et organisation des lipides en bicouche formant une vésicule close délimitant un intérieur aqueux (droite). D’après la Réf. 1 En milieu aqueux, l’organisation la plus stable des lipides est celle qui permet de minimiser les interactions entre les parties hydrophobes et les molécules d’eau. Les lipides s'organisent le plus souvent en bicouche, partie apolaire au centre, où l'eau n'a pas accès. La partie polaire étant en contact avec le milieu aqueux de part et d’autre de la bicouche. La structure se referme sur elle-même formant une vésicule close, qui sépare un compartiment 2

interne aqueux du milieu externe, également aqueux, ce qui est le propre de la membrane biologique. La présence de cette structure close continue empêche le libre passage des macromolécules d'un compartiment à un autre ; de plus, l'existence de la partie apolaire au centre de la bicouche bloque pratiquement toute diffusion d'ions (K+, Na+, Cl-...) et freine considérablement la diffusion de solutés organiques polaires (sucres, acides aminés, ...). Seuls quelques solutés très hydrophobes diffusent librement et rapidement à travers la bicouche ; c'est le cas des hormones stéroïdes. Bien que la compartimentation est la condition sine qua non de la vie cellulaire, il n’en demeure pas moins que la cellule ou l’organite a besoin d'échanges continuels de matière, d'énergie et d'information de part et d’autre de la membrane qui les délimite. Ces échanges sont possibles grâce à la présence de protéines, second constituant majeur des membranes. Les protéines membranaires se classent en trois grandes catégories: les protéines périphériques (protéines extrinsèques), les protéines transmembranaires (ou intégrales) et les protéines avec un pied d'ancrage (ces deux dernières correspondant aux protéines intrinsèques). Les protéines périphériques ne sont associées à la membrane que d'une manière relativement faible par des interactions électrostatiques avec les parties polaires des lipides ou les parties polaires des protéines membranaires qui émergent hors de la membrane (Fig. 1.2). Leur localisation leur permet de participer à des réactions qui s’effectuent à l’interface entre la membrane et les compartiments aqueux. (a)

(d)

(c)

(b)

Figure 1.2. Disposition possible des protéines membranaires. a: protéine périphérique; b: protéine transmembranaire dont la chaîne peptidique est localisée principalement dans la bicouche; c, d: protéines transmembranaire dont la chaîne peptidique est localisée, soit principalement d'un coté de la membrane (c) soit des deux cotés de la membrane (d). D’après la Réf. 1. Les protéines transmembranaires sont associées à la membrane d'une manière plus étroite par un ensemble d'interactions hydrophobes avec les parties apolaires des lipides. Dans certains cas, la quasi-totalité est localisée dans la bicouche lipidique; dans d'autres cas, une partie de la protéine émerge en dehors de la membrane soit d'un coté ou soit des deux cotés (Fig. 1.2). 3

Leur disposition dans la membrane leur permet de participer à des transformations et à des réactions qui s’effectuent de part et d’autre de la membrane. Elles sont impliquées dans le transport de matière (canaux ioniques, transporteurs, …) et le transfert d’information (récepteurs). Les protéines à pied d'ancrage sont des protéines associées de manière covalente à des acides gras, qui joue le rôle d'une ancre s'enfonçant dans la partie lipidique. Parmi ces protéines certaines sont solubles et le demeurent malgré leur liaison avec des acides gras, d'autres sont normalement membranaires et l'acide gras ne fait que renforcer l'interaction membrane-protéine. Ces protéines, comme les protéines intégrales, sont impliquées dans l’échange d’information. Les différents constituants (lipides, protéines) d'une membrane ne sont pas reliés entre eux par des liaisons de covalence. Les interactions entre lipides et protéines sont de nature hydrophobe au centre de la membrane, polaire aux interfaces. Elles se font et défont continuellement. De ce fait la membrane a un caractère dynamique, les lipides et les protéines étant animés de mouvements divers conférant à la membrane une certaine fluidité.

1.2. VISUALISATION DES MEMBRANES L'épaisseur d'une bicouche lipidique est au plus égale à 2 fois la plus grande longueur d'un lipide, soit environ 6 nm. L'épaisseur d'une membrane du fait de la présence de protéines peut être légèrement supérieure. En tout état de cause, elle est inférieure à 10 nm, et seules les techniques de microscopie électronique permettent de visualiser les bicouches lipidiques et les membranes. Les techniques utilisées sont les suivantes : 1) Les coupes minces Dans cette technique de microscopie électronique, on observe des coupes ultra-minces de l’échantillon biologique. L’échantillon étant placé dans le vide poussé et soumis à un faisceau intense d’électrons, il est traité avant observation au glutaraldéhyde (CHO-CH2-CH2-CHO) qui réagit avec les groupes amines des protéines, et au tétroxyde d’osmium (OsO4) qui réagit, entre autres, avec les doubles liaisons des chaînes hydrocarbonées des lipides, pour préserver sa structure initiale. Ces traitements conduisent à une fixation covalente des différents constituants membranaires (protéines et lipides) ; le tissu ainsi fixé peut subir sans dommages les traitements ultérieurs. L'échantillon est ensuite déshydraté puis plastifié par addition d'une résine. Le bloc de plastique ainsi obtenu est sectionné en coupes ultra-minces. Les coupes sont imprégnées de sels de métaux lourds (osmium, uranium, plomb) qui se déposent sur certaines parties de l'échantillon et fournissent le contraste électronique. Cette technique permet une bonne visualisation de la localisation et de la forme des différents compartiments intracellulaires délimitées par des membranes (Fig. 1.3).

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Figure 1.3. Cliché de microscopie électronique d’une cellule (hépatocyte) en couche mince faisant apparaître différents compartiments délimités par leur membrane. m.p. : membrane plasmique ; m.n. : membrane nucléaire ; mito : membranes mitochondriales. Agrandissement : 10 000 . D’après la Réf. 1. A plus fort grossissement, il est possible d’estimer l’épaisseur des membranes (de 8 à 10 nm). Les membranes présentent invariablement un aspect tri-lamellaire : deux couches sombres de 2 à 3 nm d'épaisseur séparées par une couche claire de 2 à 3 nm d'épaisseur (Fig. 1.4). Les couches sombres correspondent principalement aux parties hydrophiles des membranes (parties polaires des lipides et des protéines qui émergent) sur lesquels l’agent contrastant s’est déposé ; la couche claire correspond à la partie centrale hydrophobe de la membrane.

Figure 1.4. Vue agrandie d’une membrane cytoplasmique caractérisée par un aspect trilamellaire : 2 couches sombres (2 à 3 nm d'épaisseur) séparées par une couche claire (2 à 3 nm d'épaisseur). Agrandissement : 100 000. D’après la Réf. 1.

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2) La cryofracture est une autre technique qui permet d'éviter les traitements chimiques inhérents à l'observation des couches minces. Elle comporte 4 étapes principales (Fig. 1.5, A) : (i) est congélation ultra-rapide de l’échantillon afin de figer sa structure initiale ; (ii) fracture de l’échantillon à très basse température (<170 K) et sous vide poussé (<10-6 Torr) ; (iii) réplique immédiate de la surface de la fracture par un dépôt de vapeur de métaux lourds de 1 à 2 nm d’épaisseur et renforcement de cette réplique par une couche de carbone de 10 à 20 nm d'épaisseur ; (iv) digestion de la matière organique, lavage et observation de la réplique métallique au microscope électronique. Comme la fracture suit préférentiellement les surfaces de moindre résistance, la cryofracture permet une visualisation des parties intimes des membranes, le centre de la bicouche lipidique (Fig. 1.5, C & B).

Figure 1.5. Principe de la cryofracture en microscopie électronique (A) et clichés d’un liposome (B : agrandissement : 80 000) et d’une membrane cytoplasmique d’E. coli (C : agrandissement : 50 000). D’après la Réf. 1. En effet, à basse température, les fractures se localisent principalement au centre des bicouches lipidiques ; la fracture sépare donc les deux monocouches et expose la partie centrale de la membrane. Dans le cas des liposomes, la fracture expose les surfaces parfaitement lisses, liées à l’absence de protéines (Fig. 1.5, B). Dans le cas des membranes, la fracture ne casse pas les chaînes polypeptidiques des protéines membranaires, mais les contourne. En laissant en place les protéines dans la monocouche avec laquelle leurs interactions sont les plus fortes, les surfaces de fracture apparaissent parsemées de particules correspondant aux protéines intrinsèques associées à la membrane (Fig. 1.5, C). 6

3) La cryomicroscopie électronique est une technique qui permet la visualisation directe des membranes sans aucun prétraitement. Comme en cryofracture, l’échantillon est vitrifié par un refroidissement rapide. Toutefois, contrairement à la cryofracture, c’est la membrane ellemême qui est observée et non une réplique métallique (Fig. 1.6). Ceci est possible du fait que : (i) l’échantillon est observé à très basse température ce qui évite la déshydratation même sous le vide poussé qui règne à l’intérieur du microscope ; (ii) l’observation s’effectue à faible dose électronique, ce qui évite la dégradation du matériel biologique.

Figure 1.6. Cryomicroscopie de vésicules lipidiques. La double couche délimitant les vésicules est clairement apparente (agrandissement : 100 000). À plus fort grossissement (encart), on distingue les parties polaires de la bicouche (parties sombres) séparant la partie hydrophobe centrale (partie claire). D’après la Réf. 1.

2) LIPIDES MEMBRANAIRES Le rôle des lipides dans la membrane est essentiellement structural. Cependant, certains lipides possèdent des propriétés fonctionnelles importantes. Ils peuvent jouer le rôle de récepteurs ou être à l’origine de seconds messagers intracellulaires.

2.1. DIFFERENTES CLASSES DE LIPIDES MEMBRANAIRES Les lipides membranaires peuvent se classer en 4 catégories : phosphoglycérides, glycoglycérides, sphingolipides et les stérols.

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2.1.1. Phosphoglycérides La classe des phosphoglycérides englobent les diacylphosphoglycérides et les plasmalogènes. a) Les 1,2-diacylphosphoglycérides ou phospholipides forment la classe la plus abondante des lipides de la plupart des cellules. Les diacylphosphoglycérides dérivent du glycérol par estérification de ses fonctions alcools : - en positions C1 & C2 par un acide gras à longue chaîne hydrocarbonée (saturée ou non) - en position C3 par un dérivé de l’acide phosphorique. On obtient alors l’acide phosphatidique, le phosphoglycéride le plus simple. Il ne s’agit pas d’un lipide membranaire, mais d’un intermédiaire dans la biosynthèse des autres phospholipides. En effet, selon la nature du substituant rencontré sur l’acide phosphorique de l’acide phosphatidique, on définira les autres classes de phospholipides (Fig. 2.1.). Parmi les plus fréquents, on peut citer : la phosphatidyléthanolamine, la phosphatidylcholine, le phosphatidylglycérol, la phosphatidylsérine et le phosphatidylinositol. Il faut noter que ces différents phospholipides correspondent à des familles de composés. Selon la nature des deux chaînes grasses (hydrocarbonées), on peut rencontrer, pour ne citer que les plus courants, la DiPalmitoylPhosphatidylCholine ou DPPC (phosphatidylcholine estérifiée par deux chaînes grasses en C16 dérivant de l’acide palmitique), la DiStéaroylPhosphatidylCholine ou DSPC (phosphatidylcholine estérifiée par deux chaînes grasses en C18 dérivant de l’acide stéarique), ou encore, la DiPalmitoylPhosphatidylÉthanolamine ou DPPE (phosphatidyléthanolamine estérifiée par deux chaînes grasses en C16 dérivant de l’acide palmitique), … Le groupe phosphoryle des phospholipides est ionisable. Son pK est compris entre 1 et 2 : il porte une charge négative au pH physiologique. La charge globale du phospholipide dépend donc de la nature du substituant X. S’il est lui-même neutre, le phospholipide est chargé négativement (phosphatidylglycérol, phosphatidylsérine, phosphatidylinositol). Si le substituant X porte une charge positive, le phospholipide est électriquement neutre (zwitterionique). Ces phospholipides neutres sont amphotères dans la mesure où leur électroneutralité est le résultat de la compensation d’une charge négative par une charge positive.

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Figure 2.1. Structure des diacylphosphoglycérides (Phospholipides). D’après la Réf 1. b) Les plasmalogènes sont des phosphoglycérides dans lesquels une des chaînes hydrocarbonées est associée au glycérol par une liaison vinyl-éther. Ceux sont des éthers de glycérides. La liaison éther se situe le plus souvent en position C1 (Fig. 2.2.). Les plasmalogènes sont abondants dans la gaine de myéline, le réticulum sarcoplasmique cardiaque, le système nerveux périphérique et le muscle. H3C

n(H2C) H3C

C H n(H2C)

C H C O

O

H2 C

O

CH

O

C O H2

P

O

X

O-

Figure 2.2. Structure générale d’un plasmalogène.

2.1.2. Glycoglycérides Les diacylglycoglycérides (ou glycolipides), comme les diacylphosphoglycérides, dérivent du glycérol par estérification en positions C1 & C2 du glycérol par un acide gras. En revanche, en position C3, ils sont associés par une liaison glycosidique à des carbohydrates tels que le

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galactose (Fig. 2.3). Ils sont très abondants dans les membranes photosynthétiques des algues, des chloroplastes et de certaines bactéries.

Figure 2.3. Structure des diacylglycoglycérides (Glycolipides). D’après la Réf. 1.

2.1.3. Sphingolipides La classe des sphingolipides englobe les sphingophospholipides et les sphingoglycolipides (Fig. 2.4). Le constituant de base des sphingolipides est la sphingosine ou l’un de ces dérivés. Son amidification sur le NH2 par un acide gras à longue chaîne et de degré d’insaturation variables conduit à la céramide, composé de base de tous les sphingolipides (Fig. 2.4). Ceux-ci sont obtenus par addition d’un substituant sur la fonction alcool primaire de la céramide.

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Figure 2.4. Structure des sphingolipides. D’après la Réf. 1. a) Les Sphingophospholipides possèdent les mêmes types de têtes polaires que les phospholipides. À titre d’exemple, la sphingomyéline (un des constituants principals des membranes biologiques) est un sphingophospholipide substitué sur l’alcool primaire de la céramide par un groupement phosphocholine. On trouve d’autres sphingolipides substitués sur la céramide par la phosphoryléthanolamine, le phosphorylinositol, le phosphorylglycérol. b) Les Sphingoglycolipides sont des dérivés de la céramide associés à des sucres par l’intermédiaire d’une liaison glycosidique sur l’alcool primaire de la céramide. Ces sucres peuvent varier du simple monosaccharide à des oligosaccharides plus ou moins complexes ; ils constituent la classe des cérébrosides. Certains possèdent en plus des molécules d’acide sialique (acide N-acétylneuraminique) branchées sur la chaîne oligosaccharidique ; ces sphingoglycolipides anioniques constituent la classe des gangliosides (Tableau 2.1). Tous les sphingoglycolipides sont localisés principalement dans la monocouche externe de la bicouche de la membrane plasmique. Ils sont insérés dans la bicouche par leur partie hydrocarbonée et projettent leur partie saccharidique hors de la cellule. Ils sont impliqués, du fait de leur partie saccharidique, dans de nombreuses fonctions de reconnaissance (par exemple les glycosphingolipides du globule rouge sont responsables de la spécificité des groupes sanguins). Par ailleurs, certains virus utilisent la partie saccharidique comme ancrage précédent l’infection. 11

Tableau 2.1. Formules de quelques sphingoglycolipides. D’après la Réf. 1

Abréviations.

Cer :

céramide ;

Glc :

glucose ;

Gal :

galactose ;

GalNAc :

N-acétylglucosamine ;

NeuNAc : acide N-acétyl neuraminique (acide sialique).

2.1.4. Stérols Les stérols sont des molécules beaucoup plus compactes et beaucoup plus apolaires que les lipides décrits précédemment. Le cholestérol (Fig. 2.5, A) constitue environ 30 % des lipides totaux des membranes plasmiques. On le trouve également dans les membranes lysosomiales, endosomiales et Golgiennes des cellules animales. La seule partie polaire de la molécule est le groupement OH. A

B

Figure 2.5. (A) Structure de quelques stérols. (B) taille relative d’un stérol et d’un phospholipide, et leur disposition dans une membrane. D’après la Réf. 1. Le cholestérol s'insère dans la bicouche présentant son groupement OH à l'interface (Fig. 2.5, B). De part de sa taille, il n’occupe qu’une monocouche de la bicouche. Le stigmastérol se retrouve dans le monde végétal. L’ergostérol est un constituant des membranes des champignons.

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2.1.5. Acides gras Les acides gras sous forme libre sont des constituants mineurs des membranes. On les trouve associés aux lipides membranaires sous forme d’esters. Ils correspondent à la chaîne grasse, hydrophobe (partie apolaire) de ces derniers. Le nombre d’acide gras différents obtenus par hydrolyse des lipides isolés d’une membrane donnée est élevé. Généralement, on trouve un mélange d’acides gras saturés et insaturés (de 1 à 4 doubles liaisons, quelquefois 6) de longueur variant de 12 à 24 atomes de carbone (Tableau 2.2). Tableau 2.2. Nomenclature et formule de quelques acides gras.

Le point de fusion des acides gras dépend du degré d’insaturation et de la longueur de la chaîne hydrocarbonée. À longueur égale, un acide gras a un point de fusion d’autant plus bas que le degré d’insaturation de la chaîne augmente. À degré d’insaturation égale, un acide gras a un point de fusion d’autant plus bas que la chaîne est courte. Nous verrons qu’il existe un parallélisme entre le point de fusion des acides gras constitutifs des lipides membranaires et la fluidité de la membrane à température physiologique (§ V. Fluidité membranaire).

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2.2. CARACTÉRISTIQUES COMMUNES DES LIPIDES MEMBRANAIRES Tous les lipides membranaires (phosphoglycérides, glycoglycérides, sphingolipides, …) possèdent une partie apolaire hydrophobe (chaînes hydrocarbonées), et une partie polaire hydrophile (phosphoglycérol substitué, glycérol glycosylé pour les glycérides ou sphingosine phosphorylée ou glycosylée pour les sphingolipides), spatialement distinctes. Ceux sont de ce fait des molécules amphiphiles ; on dit qu’ils sont amphipathiques. Pour les glycolipides et sphingoglycolipides, la partie saccharidique confère à ces lipides un caractère d’autant plus polaire qu’elle est importante. Les lipides membranaires sont solubles dans des solvants organiques non polaires comme le chloroforme, l’hexane, le benzène. La plus part de ces lipides sont solubles dans l’éther à l’exception des sphingomyélines et de certains sphingolipides (base des méthodes de séparation des lipides membranaires, cf. & 2.3). La partie apolaire limite fortement leur solubilité dans l’eau sous formes de monomères. De part leur caractère amphipathique, où la tête polaire va interagir avec les milieux aqueux et les chaînes hydrocarbonées (nommées aussi queues hydrophobes) limiter au maximum leur contact avec l’eau, les lipides vont avoir un comportement particulier dans l’eau : ils vont former différentes structures d’agrégation dont la forme va dépendre de la taille relative des parties hydrophile et hydrophobe (balance "hydrophile-hydrophobe") et dont la cohésion va être régie par l’effet hydrophobe (§IV. Polymorphisme lipidique). Cependant, nous verrons que les phospholipides et la sphingomyéline adoptent le plus souvent une organisation en bicouche lipidique conduisant à la formation de vésicules, parties apolaires en contact à l’intérieur de la bicouche où l’eau n’a pas accès, parties polaires en contact de part et d’autre de la bicouche avec le milieux aqueux environnant. Cette structure en bicouche qu’adoptent spontanément les phospholipides est la structure de base des membranes biologiques.

2.3. COMPOSITION ET CARACTÉRISATION DES LIPIDES D’UNE MEMBRANE 2.3.1. Analyse de la composition lipidique La composition et la caractérisation des lipides d’une membrane biologique peut s’effectuer à l’aide de diverses méthodes incluant principalement des techniques de chromatographie, sur colonne (silice, alumine), sur plaque (couche mince), en phase gazeuse, liquide haute performance, après extraction des lipides en phase organique (ex : technique de Folch, Annexe 1). La figure 2.6 montre à titre d’exemple la séparation des lipides totaux de cerveau de rat par chromatographie en couche mince sur gel de silice (Annexe 2). Sur ce type de support, les lipides s’adsorbent principalement par un ensemble d’interactions électrostatiques, par l’intermédiaire de leur tête polaire (chromatographie d’adsorption). En conséquence, la migration dans le solvant d’élution sera d’autant plus importante que les interactions polaires avec le support sont faibles. Dans un solvant ou un mélange de solvants donnés, certains lipides peuvent présenter une même référence frontale (Rf) (Fig. 2.6, a). Dans ces conditions, il est nécessaire de réaliser une chromatographie à bidimensionnelle, en changeant la composition du solvant d’élution lors de la 14

seconde migration (Fig.2.6, b). (À la fin de la première chromatographie, la plaque est retournée à 90° et la seconde chromatographie est effectuée dans le second système solvant). En fin de chromatographie, la position des différents lipides est révélée en utilisant des colorants, soit non spécifiques (marquant tous les lipides), soit spécifiques d’un ou d’une classe de lipides particuliers. (La révélation la plus simple est la révélation à l’iode qui réagit sur les doubles liaisons des chaînes hydrocarbonées).

Figure 2.6. Séparation des lipides totaux de cerveau de rat par chromatographie en couche mince sur gel de silice. a : Chromatographie à une dimension. Solvant d’élution : acétate/propanol/chloroforme/méthanol/KCl (0,25%) (25 :25 :25 :10 :9). b : Chromatographie à 2 dimensions. Le solvant d ‘élution est le même qu’en a. Solvant d’élution dans la deuxième direction : chloroforme/méthanol/7N NH4OH (65 :35 :5). D’après la Réf. 1. Abréviations. PC, PS, PA, PG, PE : phosphatidyl choline, sérine, acide, glycérol, éthanolamine ; MGDG, DGDG : monogalactosyl, digaltactosyl diglycéride ; LN : lipides neutres ; n.d. : lipide non déterminé

L’identification de différents types de phosphoglycérides peut s’effectuer à l’aide de la chromatographie sur colonne de silice. La figure 2.7 présente à titre d’exemple, les temps de rétention correspondant à différents phosphoglycérides: phosphatidylglycérol (PG); phosphatidylinositol (PI); phosphatidylsérine (PS); phosphatidyléthanolamine (PE) et phosphatidylcholine (PC).

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Figure 2.7.Chromatogramme sur colonne de silice indiquant les temps de rétention (min.) correspondant aux différents phosphoglycérides: phosphatidylglycérol (PG); phosphatidylinositol (PI); phosphatidylsérine (PS); phosphatidyléthanolamine (PE) et phosphatidylcholine (PC). (Le mélange de solvants utilisé était: acétonitrile/méthanol/acide phosphorique 14,7 M, (100:10:1,8 v: v).

2.3.2. Caractérisation des chaînes hydrocarbonées La caractérisation des chaînes hydrocarbonées constituant les lipides membranaires peut se faire après hydrolyse (rupture des liaisons ester ou amide ; libération des acides gras) et analyse en chromatographie en phase gazeuse (plus précisément chromatographie gaz-liquide, CGL, Annexe 3). La figure 2.8. montre à tire d’exemple la composition en acides gras de la phosphatidylsérine de la membrane du globule rouge.

Figure 2.8. Chromatographie en phase gazeuse des acides gras de la phosphatidylsérine de la membrane du globule rouge. D’après la Réf. 1. 16

2.3.3. Composition lipidique des membranes biologiques La composition lipidique des membranes est diversifiée en terme de classe de lipides (phospholipides, glycolipides, sphingolipides, cholestérol, Tableau 2.3) et de composition des chaînes hydrocarbonées (Tableau 2.4). Tableau 2.3. Composition lipidique de différentes membranes

Abréviations. PC, PE, PI, PS, PG: phosphatidyl choline, éthanolamine, inositol, sérine, glycérol ; DPG : diphosphatidyl glycérol ; MGDG, DGDG : monogalactosyl, digaltactosyl diglycéride ; SQDG : sulfolipide. La composition est donnée en % de la quantité totale de lipides.

Tableau 2.4. Composition en acide gras de membranes de foie de rat

D’après Verkleij et al., Biochim. Biophys. Acta, 1973, 323, 178-193.

La combinaison entre différents lipides et différentes chaînes hydrocarbonées conduit à un très grand nombre d’espèces lipidiques au sein d’une même membrane. Le rôle exact de cette diversité n’est pas entièrement élucidé. Cependant, la fluidité membranaire, qui dépend notamment de la composition lipidique de la membrane, est une caractéristique commune à toutes les membranes biologiques (§V. Fluidité membranaire).

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2.4. SYSTEMES MODÈLES LIPIDIQUES Les lipides constituent l'élément structural des membranes. Des renseignements de nature structurale sont obtenus par la caractérisation de systèmes constitués uniquement de lipides : ce sont des systèmes modèles lipidiques. De plus, ces systèmes se prêtent à de nombreuses autres applications. Trois systèmes sont présentés ici : les liposomes, les monocouches et les bicouches planes (les deux dernières sont très utilisées pour aborder les études d’interaction entre lipides et protéines).

2.4.1. Liposomes Les liposomes sont certainement les systèmes modèles lipidiques les plus utilisés. Ils trouvent des applications dans les domaines de la biochimie-biophysique, de la pharmacologiemédecine, de la thérapie génique et de la cosmétologie. Ce sont des vésicules dont la surface est constituée d'une bicouche lipidique et qui renferment un volume de solvant aqueux dans lequel elles ont été préparées. Les plus petites vésicules ont un diamètre théorique de l’ordre de 25 nm et les plus grandes peuvent atteindre 2500 nm, et peuvent égaler les dimensions des cellules vivantes (ex : hématies = 5μm ; bactéries ~ 1 μm). a) Les liposomes multilamellaires (MLV, Multi Lamellar Vesicles) sont obtenus en évaporant une solution de lipides dans un solvant organique, puis à les remettre en suspension dans un solvant aqueux par simple agitation. Ce sont des structures en bicouches lipidiques, closes, concentriques, séparées les unes des autres par des couches d'eau (Fig. 2.9). Ces liposomes ont des tailles très hétérogènes (100-1000 nm) et possèdent un volume aqueux interne relativement faible par rapport à la quantité de lipides. b) Les liposomes unilamellaires de petite taille (SUV, Small Unilamellar Vesicles) sont obtenus par traitement physique des liposomes multilamellaires. Il suffit de soumettre ces derniers à des ultrasons ou à des pressions élevées, pour obtenir des vésicules de taille homogène, constituées d'une seule bicouche lipidique, contenant à l’intérieur du milieu aqueux (Fig. 2.9). Ces vésicules ont un diamètre faible (de l’ordre de 25 nm), ce qui peut présenter des inconvénients : (i) La courbure importante impose des contraintes d'association des lipides. La surface de la monocouche externe (et donc le nombre de lipides dans cette monocouche) est significativement supérieure à la surface de la monocouche interne ; (ii) le volume interne de phase aqueuse est petit. De plus, l’utilisation de sondes à ultrasons peut entraîner la libération de particules métalliques qui peuvent dégrader certains lipides. L’extrusion d’une suspension liposomale sur des membranes de polycarbonate de diamètre déterminé est une façon d’obtenir des SUV de tailles plus ou moins grandes, tout en évitant les inconvénients des ultrasons. En filtrant successivement une suspension de liposomes de phosphoglycérides (uni ou multilamellaires) sur des membranes ayant des pores de 30 nm de diamètre, il est possible d’obtenir des SUV de 47 à 52 nm. Sur des membranes présentant des pores de 100 nm de diamètre, on peut former des liposomes de 69 à 80 nm diamètre.

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Figure 2.9. Liposomes multilamellaires et unilamellaires de petites tailles (D’après la Réf. 1) c) Les liposomes unilamellaires de grande taille (LUV, Large Unilamellar Vesicles) peuvent être obtenus de diverses manières. Nous présentons ici la technique la plus classique de formation de vésicules par inversion de phase (Fig. 2.10). (i) Le lipide est dissous dans l'éther où il est soluble sous forme de monomères (Fig. 2.10, a). (ii) Par ajout d’une solution aqueuse tamponnée non miscible à l'éther, on obtient la séparation de deux phases, les lipides étant dissous dans la phase éther et formant une monocouche à l'interface éther/eau (partie polaire en contact avec l'eau ; partie apolaire en contact avec l'éther, Fig. 2.10, b). Le mélange est alors soumis à ultrasons de sorte à obtenir une émulsion opalescente. (iii) L'éther est évaporé doucement sous vide partiel ; les lipides s'organisent afin d’optimaliser les interactions entre leur partie apolaire et l’éther dont la quantité diminue. Un gel transitoire se forme (Fig. 2.10, c puis d). L'évaporation est poursuivie jusqu’à ce que le gel se liquéfie (élimination totale de l'éther); à ce stade, les vésicules en phase inverse (chaîne hydrocarbonée à l’extérieur) s’ouvrent (d’où le terme inversion de phase) et des liposomes unilamellaires de grande taille se forment (Fig. 2.10, e). Le diamètre varie entre 0,2 µm et 1 µm. Des populations de taille homogène sont obtenues par simple filtration (sur gel, par exemple).

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Éther

Milieux aqueux (tampon)

Milieux aqueux (tampon)

Éther

Milieux aqueux (tampon)

Figure 2.10. Formation de liposomes unilamellaires de grande taille par inversion de phase. D’après la Réf. 1. d) Le champ d’applications des liposomes est varié. Comme ces vésicules délimitent un compartiment aqueux interne, il est possible d’aborder les études concernant la perméabilité passive d’une bicouche purement lipidique aux divers ions et solutés (mesure de la quantité de solutés emprisonnée dans le volume interne après diffusion). La tâche est facilitée si le volume interne est relativement important (LUV) et si l’ion ou le soluté est radioactif. Les liposomes sont également utilisés pour caractériser la diffusion des lipides au sein de la bicouche, la fusion avec d'autres lipides, les interactions entre protéines solubles (extrinsèques) et les membranes, etc... De plus, il est possible de préparer des protéoliposomes dans lesquels une protéine membranaire, préalablement purifiée, a été re-insérée. Ces protéoliposomes permettent d’aborder l’étude fonctionnelle d’une protéine membranaire purifiée dans son contexte lipidique ; ils constituent un modèle simplifié de membranes biologiques. Les liposomes trouvent des applications en pharmacologie et médecine en tant que transporteurs de médicaments qui doivent franchir la région hydrophobe des membranes biologiques. Un médicament soluble dans l’eau sera encapsulé dans le volume intra-liposomal de liposomes unilamellaires de grande taille ; un médicament hydrophobe sera dissous dans la phase lipidique de liposomes multilamellaires. Dans les deux cas, le principe actif peut être véhiculé dans l’organisme par simple injection. Au cours de la circulation, les liposomes fusionnent avec les membranes cellulaires ou, ce qui est plus courant, sont endocytés par des cellules ; le principe actif est alors délivré dans la cellule. Cependant, les liposomes sont rapidement éliminés de la circulation par les cellules phagocytaires du système réticulum endothélial et s'accumulent dans le foie ou la rate qui en sont les cibles privilégiées, mais ce qui limite leur utilisation pour traiter d’autres organes cibles. Les développements actuels tendent à augmenter le temps de survie des liposomes dans la circulation en modifiant leur composition lipidique pour échapper à la phagocytose. Les liposomes à temps de vie prolongée ont trouvé des applications dans certaine chimiothérapie anti-cancéreuse. (L’efficacité thérapeutique de la doxorubicine, très efficace contre certains cancers du sein, est fortement augmentée par injection 20

sous-forme de liposomes ; sa cardiotoxicité étant limitée. De plus, l’addition de récepteur reconnus spécifiquement par certaines cellules (notamment cancéreuses) permettrait de cibler l’organe à traiter. Enfin, dans la mesure où il est possible d’encapsuler un gène ou un plasmide à l’intérieur du liposome, ces vecteurs sont également utilisés en thérapie génique. Les liposomes sont également employés dans le domaine de la cosmétologie. De nombreuses substances utilisées en cosmétologie (crèmes hydratantes, antioxydants, extraits de thymus, collagène...) sont en général appliquées localement sous forme d'émulsion huileuse ou de solution alcoolique. Or, le contact à long terme d’huile ou d’alcool avec la peau peut nuire à son bon état. L’encapsulation du principe actif dans des liposomes permet de contourner cet inconvénient. Il n'est pas exclu, mais cela reste à prouver, que les liposomes soient capables de fusionner localement avec les cellules de la peau, libérant leur contenu à l'intérieur des cellules et augmentant de ce fait leur efficacité.

2.4.2. Monocouches lipidiques Si l’on dépose sur la surface d’une solution aqueuse une goutte d’une solution d’un lipide dissous dans un solvant organique, il se forme au cours de l’évaporation du solvant une monocouche de lipides à l’interface air/eau. Le film monomoléculaire de lipides occupe toute la surface disponible. La partie polaire hydrophile des lipides entre en interaction avec l’eau, la partie apolaire hydrocarbonée reste en contact avec l’air (Fig. 2.11). Un dispositif adéquat (balance de Wilhelmy) permet de déterminer la pression superficielle qui reflète l’encombrement des molécules à l’interface.

Mesure de la pression superficielle (π)

 Figure 2.11. Monocouche lipidique à l’interface air/eau Le système des monocouches se prête bien à l’étude des interactions lipides/protéines. Une protéine ou un peptide peut être injecté dans la phase aqueuse. Son insertion dans la monocouche, indication d’une interaction, s’accompagne d’une augmentation de pression superficielle si la surface est maintenue constante (Fig. 2.12, a) ou, d’une augmentation de surface si la pression superficielle est maintenue constante (Fig. 2.12, b). L’avantage principal de la technique des monocouches lipidiques est de pouvoir étudier l’interaction de protéines ou de peptides solubles extrinsèques avec une couche lipidique monomoléculaire, correspondant à un demi-feuillet membranaire. Cette topographie permet de simuler, dans des conditions proches de la réalité des situations biologiques, ce qui se passe quand une molécule hydrosoluble du milieu

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extra-(intra-) cellulaire (peptides, protéines cytosolubles, hormones) arrive à la surface de la cellule ou de l’organelle.

a

b

π

Aire 

Figure 2.12. Étude de l’interaction d’une protéine ou d’un peptide à l’aide des monocouches de phospholipides. L’insertion d’une protéine ou d’un peptide dans la monocouche s’accompagne, soit d’une augmentation de la pression superficielle (a: surface constante), soit d’une augmentation superficielle (b : pression constante). Cette technique permet également d’étudier l’interaction de protéine membranaire ou à pied d’ancrage avec des phospholipides membranaires. Cependant, dans ce type d’étude, ce modèle membranaire a des limites : il n’est pas compatible avec la nature bicouche de la membrane biologique qui peut être indispensable à l’insertion des protéines intrinsèques.

2.4.3. Bicouches lipidiques planes Les bicouches lipidiques planes peuvent être obtenues à travers un orifice séparant deux compartiments aqueux. Deux techniques permettent d’y arriver (Fig. 2.13). La première approche (Fig. 2.13, a) permet d’obtenir une bicouche lipidique (appelée « black lipid films »). Un pinceau est plongé dans une solution contenant des lipides dissous dans un solvant organique non miscible à l'eau (par exemple, du décane). Un coup de pinceau est appliqué sur l'orifice circulaire (diamètre de 1 mm environ) d’une paroi séparant deux compartiments aqueux. Il se forme un film lipidique dont l'épaisseur diminue spontanément en fonction du temps, l'excès de lipide formant un manchon aux bords de l'orifice. L'amincissement se poursuit jusqu'à la formation d'une couche lipidique. Les parties polaires étant en contact avec le milieu aqueux, les chaînes hydrocarbonées étant situées à l'intérieur de la bicouche. Cependant, la bicouche ainsi

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formée contient toujours le solvant hydrophobe, donnant lieu à de légers défauts de structure de la membrane. La seconde approche consiste à former une bicouche lipidique plane à partir de deux monocouches formées par évaporation du solvant (Fig. 2.13, b). Les monocouches sont préformées sur les surfaces de deux solutions séparées par une paroi verticale possédant un orifice circulaire au dessus du niveau des solutions (1). Le niveau des solutions est ensuite élevé au delà de l’orifice (2). Cette technique permet d’obtenir des bicouches asymétriques, si la composition lipidique des deux monocouches initiales est différente.

a)

Manchons

0,5 à 1 mm

b) 2)

1)

Élévation du niveau d’eau

0,5 à 1 mm

Figure 2.13. Bicouches lipidiques planes. Une paroi sépare deux compartiments aqueux. Un orifice de 1 mm de diamètre environ permet la formation de la bicouche lipidique plane. (a) méthode « coup de pinceau » ; (b) méthode « élévation du niveau d’eau » D’après la Réf. 1. Ce système, avec ces deux compartiments aqueux auxquels on a facilement accès et dans lesquels on peut plonger des électrodes, se prête admirablement bien à l'étude de la perméabilité ionique de la bicouche. Il est possible de mesurer facilement des courants et/ou des différences de potentiel de part et d'autre de la bicouche. La conductance de la bicouche en présence d'ions inorganiques dans les compartiments est très faible. Elle reflète la faible perméabilité d'une bicouche lipidique aux ions. Mais par ailleurs, il est possible d'insérer dans la bicouche lipidique des protéines, en particulier des canaux ioniques. Ceci peut se faire en fusionnant à la bicouche préformée des vésicules contenant des protéines. Les caractéristiques de conductance des canaux (sélectivité des ions, agents inhibiteurs, conductance, …) peuvent alors être déterminées au moyen de ce modèle de bicouche lipidique plane.

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3) DÉTERGENTS Les détergents sont comme les lipides, des molécules amphiphiles qui servent notamment à l’extraction et à la purification des protéines membranaires intrinsèques. En effet, les interactions entre les protéines intrinsèques et les autres constituants de la membrane sont de nature hydrophobe. Ces interactions sont indispensables pour le maintien des structures protéiques natives. En leur absence, les protéines extraites en milieux aqueux ont tendance à s’agréger, à se dénaturer et à précipiter de manière irréversible. Les détergents, de part leur nature amphiphile, permettent d’extraire les protéines membranaires, en re-créant autour d’elles, un environnement hydrophobe semblable à celui présent dans la membrane. Comme pour les lipides membranaires, le caractère amphipathique des détergents leur confèrent un comportement particulier dans l’eau : ils sont capables de former des structures d’agrégation. C’est dans ce contexte, que nous étudions ici les propriétés des détergents avant d’aborder le polymorphisme lipidique (§ IV).

3.1. Nature et propriétés des détergents Les détergents, au même titre que les lipides, possèdent une partie hydrophobe (aromatique ou aliphatique sous la forme d’une seule chaîne hydrocarbonée) et une partie polaire, spatialement distinctes. La caractéristique principale d'un détergent, qui les distingue des lipides membranaires, est de former des micelles, alors que dans les mêmes conditions, les lipides membranaires forment des vésicules. Dans ces micelles, les parties polaires des molécules de détergent tapissent la surface en contact avec le milieu aqueux; les parties hydrophobes sont situés à l'intérieur, formant un milieu où l'eau n'a pas accès (Fig. 3.1, a). Le nombre de molécules de détergent par micelle dépend de la nature du détergent (entre quelques molécules à plus d'une centaine). (a)

(b)

Figure 3.1. Micelle de détergent : concentration monomérique et micellaire de détergent en fonction de la concentration totale en détergent. D’après la Réf. 1. Quelle que soit sa concentration, le détergent est en équilibre entre sa forme monomère et sa forme micellaire constituée de l’association de n molécules : n.Monomère

(Monomère)n 24

Du fait de la valeur élevée de n, on peut montrer qu’en dessous d’un certaine concentration en détergent, la concentration de micelles est négligeable et tout le détergent se trouve sous forme de monomères ; en revanche, au-dessus de cette concentration, la concentration sous forme de monomères reste pratiquement constante et l'excès de détergent forme des micelles (Fig. 3.1, b). Cette concentration critique, qui varie d’un détergent à un autre et qui dépend des conditions expérimentales, est appelée concentration micellaire critique (CMC). Sa valeur est généralement comprise entre 10-2 et 10-6 M. Les lipides membranaires possèdent une partie hydrophobe qui est plus importante que celle des détergents, ce qui leur confère un comportement différent. Tout d’abord, ils ne sont solubles sous forme de monomères qu'à des concentrations extrêmement faibles (10-10 à 10-12 M) ; d'autre part, au delà de ces concentrations, ils ne forment pas des micelles mais des vésicules, les lipides s’organisent en bicouche séparant un intérieur d’un extérieur aqueux (Fig. 1.1). Ce sont ces différences entre lipides et détergents qui vont permettre l’extraction par les détergents des protéines membranaires de leur environnement lipidique. (Une protéine membranaire solubilisée en présence de détergents, se purifie par la suite comme une protéine soluble). Nous verrons au paragraphe suivant (IV. Polymorphisme lipidique), qu’il est possible de prédire, la forme lamellaire ou micellaire que peuvent prendre les molécules amphiphiles.

Les détergents utilisés dans le domaine de la biochimie des protéines membranaires peuvent se classer en 4 catégories : a) Détergents ioniques (à l'exception des sels biliaires) (SDS)

(CTAB)

Les détergents ioniques (SDS, CTAB) ont un caractère très polaire qui leur est conféré par leur charge nette. Ils ont donc une CMC élevée. Ils solubilisent d'une manière très efficace la grande majorité des protéines membranaires. Leur inconvénient est de les dénaturer, le plus souvent d'une manière irréversible. De ce fait, ils ne sont utilisés que lorsque l'on cherche à déterminer des paramètres indépendants de la structure de la protéine (masse moléculaire, séquence, etc...). En effet, les détergents ioniques, comme le dodécylsulfate de sodium (SDS), se fixent initialement, sur les résidus chargés positivement (lysines, arginines, histidines de toutes les protéines (solubles ou membranaires), par l’intermédiaire de sa charge négative. Cette première fixation entraîne une modification de la conformation de la protéine avec démasquage de régions hydrophobes, initialement enfouies à l'intérieur de la protéine. De nouvelles molécules de détergent viennent s'y fixer, cette fois ci par leur partie hydrophobe. Il y a alors un effet coopératif, la fixation entraînant l’apparition de nouvelles régions hydrophobes sur lesquelles viennent se fixer de nouvelles molécules et ainsi de suite jusqu’à dénaturation complète de la protéine. En fin de compte, la protéine dénaturée est entièrement recouverte de molécules de SDS, ce qui lui donne une forme allongée. Pour les protéines solubles, la quantité de SDS fixée par unité de poids de protéine est en général indépendante de la nature de cette dernière (environ 1 molécule de SDS pour deux résidus d'acides aminés). La quantité de SDS qui 25

se fixe sur les protéines membranaires est en général plus élevée du fait de leur caractère hydrophobe. Quoiqu’il en soit, toutes les protéines solubilisées par le SDS ont une charge négative dépendante de leur masse moléculaire, ce qui permet de les séparer sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE). b) Détergents non ioniques

Les détergents non ioniques sont beaucoup plus doux et permettent souvent de solubiliser les protéines sans trop perturber leur structure native. La dénaturation ou le maintien de la structure native, de même que la solubilisation ou la non-solubilisation, dépendent de la nature de la protéine et du détergent. Les polyoxyéthylènealcools (nom commercial : Brij, Triton, Tween, …) sont moins solubles sous forme de monomères que les détergents ioniques et possèdent de ce fait une CMC plus faible. Ceci constitue un inconvénient pour certaines expériences de reconstitution correspondant à l’opération inverse à la solubilisation (formation de vésicules protéolipidiques à partir de micelles de lipide/détergent et protéine/détergent par élimination du détergent sous forme de monomères). La partie saccharidique des alkylglucosides (octyl-glucoside, dodécyl-maltoside) confère à ces détergents non-ioniques une bonne solubilité. Ils présentent de ce fait une CMC élevée plus favorable aux expériences de reconstitution.

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c) Détergents zwitterioniques

Les lysophospholipides, comme la lysophosphatidylcholine, correspond à un phospholipide auquel une chaîne grasse a été retirée (coupure de la liaison ester par les phospholipases A1 (coupure en C1) ou A2 (coupure en C2)). Les détergents zwitterioniques, bien que souvent dénaturants, ont trouvé des applications ponctuelles dans certains cas. d) Sels biliaires

Les sels biliaires, cholate et déoxycholate de sodium, sont des détergents atypiques. Il n'existe pas, comme pour les autres détergents, une séparation nette dans l'espace des parties polaire et hydrophobe. Le cycle pentaphénantrène possède une face polaire et une face apolaire. Les micelles sont constituées de l’association d’un nombre réduit de molécules (une dizaine), les faces apolaires étant en contact au sein de la structure. Du fait de leur CMC élevée, ces détergents sont souvent utilisés lorsque l’on envisage, après la solubilisation des expériences de reconstitution.

3.2. Solubilisation des liposomes par les détergents L’organisation de base des lipides est la bicouche lipidique (vésicule lipidique), l’organisation de base des détergents, la micelle. L’addition de détergent à une suspension lipidique entraîne un passage de l’organisation en bicouche à l’organisation micellaire (Fig. 3.2,a).

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Aux faibles concentrations de détergent (en dessous de la CMC), les molécules de détergents s’incorporent dans la bicouche lipidique de la vésicule en perturbant sa structure sans la détruire. Au delà d’une certaine saturation, l’organisation en bicouche n’est plus stable et il se forme des micelles mixtes lipides/détergents pouvant contenir jusqu’à 0,3 mole de phospholipide par mole de détergent. Nous verrons au paragraphe suivant, §IV polymorphisme lipidique, que cette transformation, qui a lieu le plus souvent à une concentration en détergent proche de sa CMC, est liée à la forme même des molécules de lipides (concept de forme). À ce stade, coexiste un mélange de vésicules saturées en détergent et de micelles de détergent saturées en phospholipide.

Figure 3.2. Solubilisation graduelle des liposomes par addition de détergent. (a) modèle de la solubilisation ; (b) Variation de la turbidité au cours de la solubilisation. D’après la Réf. 1.

28

L’addition supplémentaire de détergent déplace l’équilibre vésicule micelle vers la formation de micelles jusqu’à disparition des vésicules. Une vésicule de 1µm de diamètre contient environ 50.10-6 molécules de lipide (la surface occupée par un lipide est de l’ordre de 0,5 nm2). Lors de la micellisation complète, une vésicule se transforme en environ 106 micelles saturées. Au delà, l’addition de détergent ne fait qu’augmenter le nombre de micelles en diminuant la concentration de lipides dans les micelles de détergents. La transition vésicule vers micelle se détecte facilement par une diminution de la turbidité de la suspension (Fig. 3.2,b). Cette diminution est due à la différence de taille entre vésicules (>100 nm) et micelles (~10 nm).

3.3. Solubilisation des membranes par des détergents. Le principe d’incorporation du détergent dans les membranes biologiques est identique à celui de l’incorporation dans la vésicule lipidique reconstituée. À de faibles concentrations, le détergent s’incorpore dans la bicouche membranaire sans perturber son organisation lamellaire et au voisinage de la CMC, la solubilisation de la membrane s’accompagne d’une diminution de la turbidité liée à l’apparition de micelles. Cependant, dans le cas de la membrane biologique, plusieurs types de micelles sont formées ; les micelles mixtes contenant du lipide et du détergent, et des micelles contenant des lipides, du détergent et les différentes protéines membranaires (Fig. 3.3).

Figure 3.3. Solubilisation des membranes par un détergent non-dénaturant. D’après la Réf. 1. Lors de la solubilisation, les molécules de détergents prennent partiellement la place des lipides membranaires et l’on retrouve chaque molécule protéique isolée au sein d’une micelle protéine/lipide/détergent. Dans ces micelles, les parties hydrophobes du détergent sont en interaction avec les parties hydrophobes de la protéine, empêchant ainsi leur contact avec l’eau 29

et donc leur dénaturation. Par addition supplémentaire de détergent, on accomplit une délipidation progressive de ces micelles trinaires pour obtenir finalement un mélange de micelles lipide/détergent et de micelles protéine/détergent. Ces deux types de micelles peuvent être séparés grâce à leurs propriétés de charge et de densité différentes. Les micelles protéine/détergent contenant des protéines de nature différente peuvent être purifiées par les techniques couramment utilisées pour les protéines solubles (électrophorèse, chromatographies,…).

4) POLYMORPHISME LIPIDIQUE De part leur caractère amphiphile, où la tête polaire peut interagir avec l’eau et la queue hydrophobe va limiter sont contact avec l’eau, les lipides vont former des structures d’agrégation dont la cohésion va être régie par l’effet hydrophobe. Extraits de leur contexte membranaire, et remis en suspension dans l’eau à très forte concentration, les lipides peuvent adopter des organisations structurales très variées : c’est le polymorphisme lipidique. La forme des agrégats va dépendre de la balance amphiphile, c’est-à-dire de taille relative des parties hydrophile et hydrophobe de la molécule (balance "hydrophile-hydrophobe"). Bien que certaines de ces organisations ne soient pas toujours physiologiques, l’étude des différentes phases adoptées in vitro par les lipides membranaires permettent de tirer quelques conclusions quant à la propension qu'ont ces derniers à adopter des organisations autres que lamellaires dans les membranes biologiques. Comme nous le verrons un peu plus loin, la pertinence de ces organisations est illustrée notamment dans la fusion membranaire.

4.1. Effet hydrophobe L’effet hydrophobe peut se définir de la façon suivante : « lorsqu’on met une chaîne carbonée assez longue dans l'eau, elle tend à réduire sa zone de contact avec l'eau ». En fait nous allons apprendre que c’est le milieu aqueux, dans lequel sont immergées les chaînes hydrocarbonées, qui les oblige à se ressembler et à s’agréger. En effet, lorsque une molécule isolée de lipides amphipathiques est immergée dans l'eau, sa tête polaire hydrophile va interagir favorablement avec le solvant et devenir hautement solvatée (tendance à la dissolution) ; la rupture du réseau de liaisons hydrogène entre les molécules d’eau au voisinage de la tête polaire est compensée par le fait que ces entités polaires ou chargés peuvent créer de nouvelles interactions avec les molécules d’eau. Le changement net d’enthalpie (∆H) pour solubiliser la tête polaire est en général faible. À l'inverse, les chaînes hydrocarbonées qui sont elles totalement hydrophobes, sont incapables de créer des interactions avec les molécules d’eau : - les chaînes hydrophobes vont donc non seulement rompre le réseau structurée des molécules d’eau liées par des ponts hydrogène (ce qui va demander un apport d’énergie aboutissant à une légère augmentation de l’enthalpie libre de réaction : H positif), - mais elles vont également obliger les molécules d'eau aux alentours à s'organiser et à former une cage autour d’elles (Fig. 4.1). Dans ce réseau figé, les molécules d’eaux vont alors jouir que d’un faible degré de liberté de 30

translation et à cause de cela, elles se trouvent dans un état hautement ordonné de basse entropie : la présence des chaînes hydrocarbonées dans l’eau entraîne donc une diminution de l’entropie du solvant (et S devient négatif). Au final, la variation d’énergie libre nécessaire pour dissoudre une chaîne hydrocarbonée dans l’eau n’est donc pas favorable : G = H -TS où H à une valeur positive, S une valeur négative, donc G est positif.

Lorsque plusieurs molécules de lipides amphiphiles sont présentes dans l'eau, les chaînes hydrophobes vont avoir tendance à se rassembler pour limiter le nombre de molécules d'eau immobilisées dans les cages autour des chaînes hydrocarbonées; ainsi beaucoup de molécules d'eau pourront regagner le solvant, ce qui augmentera leur entropie de translation. C’est en fait cette élévation de l’entropie des molécules d’eau qui est la force principale de l’agrégation des chaînes hydrocarbonées, et non pas une quelconque affinité des chaînes entre elles. L’élévation de l’entropie du solvant accompagnant la formation de l’agrégat est plus élevée (donc plus favorable) que la diminution d’entropie accompagnant l’assemblage des chaînes hydrocarbonées dans l’agrégat (ce qui correspond pour les chaînes hydrocarbonées à une meilleure ordonnance moléculaire, c’est-à-dire une diminution de l'entropie ce qui n'est pas favorable). Les chaînes hydrophobes s'associent donc entre elles pour présenter vers le solvant la surface hydrophobe la plus faible possible et les régions polaires adoptent une disposition qui leur permet d’accroître au maximum leurs interactions avec le solvant aqueux. C’est la force de formation de l’agrégat. À l’intérieur de l’agrégat, les chaînes hydrocarbonées vont pouvoir interagir entre elles par des interactions de van der Waals. L’ensemble des forces qui maintiennent entre elle les régions non polaires des molécules est appelé interactions hydrophobes. Il faut noter que la force de ces interactions n’est pas due à une quelconque attraction des chaînes apolaires entre elles, mais c’est le résultat d’une organisation atteignant sa stabilité thermodynamique optimale, réduisant au minimum la diminution d’entropie liée à l’arrangement des molécules d’eau autour des zones hydrophobes des molécules amphiphiles. Ces interactions hydrophobes sont en fait les forces de cohésion des agrégats lipidiques. Bien que ces interactions soient en soi de faibles énergies, leur nombre important au sein de l’agrégat permet de maintenir la cohésion des différentes phases adoptées par les lipides membranaires.

31

Figure 4.1. Effet hydrophobe. (a) chaîne alkyle entourée par une molécule d’eau très organisée ; (b) agrégation de plusieurs chaînes hydrocarbonées et libération de molécules d’eau. L’énergie récupérée en libérant les molécules d’eau immobilisées stabilise l’agrégat. D’après Lehninger, Nelson & Cox, « Principes de Biochimie » seconde édition (Médecine-Sciences 1994, Flammarion).

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4.2. Organisations structurales des principales phases du polymorphisme lipidique Le polymorphisme lipidique représentent la capacité qu’ont les lipides membranaires, une fois isolés de leur contexte membranaire à former des organisations structurales très variées quand ils sont remis en suspension dans l’eau à des concentrations élevées (rapport lipide/eau en poids de l’ordre de 50/50). Ces organisations structurales vont dépendre de la nature du lipide, et pour un lipide donné, des conditions expérimentales (température, concentration, pH, force ionique, pression, etc...). Les figures 4.2 (A) et 4.3 présentent respectivement les principales organisations (ou phases) adoptées par les lipides membranaires et les lysophospholipides (détergent). A) Phase Lamellaire (L)

Phase Hexagonale type HII

eau bicouche

4 à 6  nm

B)

Figure 4.2. A. Organisations structurales des lipides membranaires. B. Passage d’une organisation lamellaire à une organisation hexagonale par diminution de la quantité d’eau du système. D’après la Réf. 1.

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Figure 4.3. Organisation hexagonale de type HI adoptée par les lysophospholipides (détergent). D’après la Réf. 1. Dans l’organisation lamellaire (notée L), les bicouches lipidiques sont séparées par des couches d’eau dont l’épaisseur va dépendre des conditions d’hydratation (Fig. 4.2, A). Ce type de phase est généralement obtenu quand des phospholipides, comme les phosphatidylcholines, ou des sphingolipides, comme les sphingomyélines, sont remis en suspension à de fortes concentrations (> à 50% en lipides). Dans ces conditions, les vésicules formées de bicouches lipidiques (telles que nous les avons présentées Fig. 1.1), s’aplatissent à cause de la diminution de la quantité d’eau dans le mélange, et les lipides, tout en gardant une organisation en bicouche, sont localisés au sein de lamelles que l’on peut considérer comme planes et de surface infinie par rapport à leur épaisseur. Ces lamelles, en grand nombre, sont parallèles et séparées par des couches d’eau dont l’épaisseur, bien définie, dépend de la quantité d’eau dans le système. Lorsque la concentration en lipides augmente, l’épaisseur de la couche d’eau diminue, les lamelles se rapprochent et les contacts entre les bicouches deviennent plus étroits. Il arrive que les monocouches externes en contact de deux bicouches distinctes s’enroulent l’une autour de l’autre en emprisonnant l’eau les séparant ; il s’agit une phase mixte intermédiaire (Fig. 4.2, B). Si la concentration en lipides augmente encore, on obtient des cylindres remplis d’eau dont la surface est tapissée par les têtes polaires des lipides ; les chaînes hydrocarbonées sont rejetées vers l’extérieur (formation de micelle inverse). Ces cylindres s’ordonnent suivant une symétrie hexagonale. Il s’agit d’une organisation hexagonale désignée HII (Fig. 4.2, A & Bc). L’organisation de type HI (ou micelle directe) est généralement adoptée par les lipides ne présentant qu’une seule chaîne hydrocarbonée, tels que les lysophospholipides et les détergents (Fig. 4.3). Comme dans la phase HII, les lipides tapissent la surface de cylindres ordonnés suivant une symétrie hexagonale. Toute fois, contrairement à la phase HII, les chaînes hydrocarbonées sont localisées à l’intérieur des cylindres, les têtes polaires à l’extérieur en contact avec l’eau.

4.3. Diagramme de phase L’organisation d’un lipide donné au sein du mélange lipide/eau dépend des conditions expérimentales, en particulier de la température et de la concentration lipidique. La recherche des domaines d’existence des différentes organisations en fonction de la température et de la 34

concentration conduit à un diagramme de phase. La figure 4.4 présente un diagramme de phase simplifié d’un mélange phospholipide/eau. Les domaines L/Lß et HII correspondent respectivement aux domaines d’existence des organisations lamellaires et hexagonale HII. (Nous verrons au paragraphe suivant (V. Fluidité membranaire) que les phases L et Lß sont des phases lamellaires dans lesquelles la conformation des chaînes hydrocarbonées est en fonction de la température ; pour l’analyse du diagramme de phase, nous ne ferons pas pour l’instant, la différence entre ces deux types de phases et nous parlerons simplement de phases lamellaires). Il est à noter que d’autres organisations existent dans d’autres domaines de concentration et de température. Nous ne les détaillerons pas ici. L’analyse du diagramme simplifié (Fig. 4.4) indique que le passage de la phase lamellaire L vers la phase hexagonale HII est favorisée par une diminution de la concentration en eau (ou une augmentation de la concentration lipidique), cette transition nécessitant un contact étroit entre bicouches. De même, pour une concentration lipidique relativement élevée, lorsque le contact entre lamelles lipidiques est suffisamment étroit (concentration en eau suffisamment faible), la transition de la phase lamellaire Lß vers la phase hexagonale HII peut être induite par une élévation de la température. La transition phase lamellaire vers phase hexagonale implique de franchir une barrière énergétique ; l’énergie nécessaire pouvant être fournie par l’agitation thermique.

Figure 4.4. Diagramme de phase simplifié d’un mélange phospholipide/eau. Les parties grisées représentent les domaines d’existence des différents organisations lipidiques (phases). Lß et Lß correspondent à des organisations où les chaînes hydrocarbonées sont ordonnées (cf. § 5.3.1. conformation des chaînes en fonction de la température). Un mélange de phase existe dans les régions entre ces domaines. D’après Gulik-Krzywicki et al., J. Mol. Biol., 1967, 27, 303-322.

Les domaines de température et de concentration en eau dans lesquels s’effectue la transition phase lamellaire vers phase hexagonale dépendent de la nature du lipide. Plus le lipide à une propension à adopter une organisation de type HII, plus la température de transition est basse et plus la concentration en eau à laquelle la transition a lieu peut être élevée. 35

4.4. Concept de forme Comme nous venons de le voir, un lipide donné peut former différentes phases dans des conditions physico-chimiques différentes, mais dans les conditions physiologiques, les lipides membranaires adoptent une organisation particulière. Le tableau 4.1 présente l’organisation préférentielle adoptée par différents lipides membranaires à température physiologique. Nous pouvons noter en particulier que les monogalactosyldiglycérides, lipides abondants des membranes photosynthétiques et que les phosphatidyléthanolamines, lipides abondant dans de nombreuses membranes, adoptent une organisation de type HII. Tableau 4.1. Organisation de différents lipides (37°C)

Un concept de forme a été avancé pour tenter d’expliquer l’origine des différentes organisations lipidiques : celles-ci dépendraient des volumes respectifs (encombrement spatial) des parties polaire et hydrophobe du lipide. À volume égal, le lipide s'inscrit dans un cylindre et l'organisation correspondante est de type lamellaire L (formation de bicouche lipidique) (Fig. 4.5, a) ; si le volume de la partie polaire est inférieur à celui de la partie apolaire, le lipide prend la forme d'un cône et l'organisation correspondante est la phase hexagonale de type HII (micelle inversée) (Fig. 4.5, b) ; enfin, si le volume de la partie polaire est supérieur à celui de la partie apolaire, le lipide présente une forme de cône inversé et l'organisation correspondante est de type HI (micelle directe).

36

a

b

c

d

Figure 4.5. Organisation lipidique et concept de forme. Si le lipide s’inscrit dans un cylindre, l’organisation est lamellaire (a) ; si le lipide s’inscrit dans un cône, l’organisation est celle de la micelle inversée (b) ; si le lipide s’inscrit dans un cône inversé, l’organisation est micellaire (c). Par compensation de formes, un mélange de lipides adopte une organisation lamellaire (d). D’après la Réf. 1. Si la différence de formes entre la lysophosphatidylcholine (organisation HI) et la phosphatidylcholine (organisation L) est évidente puisqu’il manque une seule chaîne hydrocarbonée à la première, elle n’est pas apparente de prime abord entre phosphatidylcholine (organisation L) et phosphatidyléthanolamine (organisation HII) qui toutes deux correspondent à des phospholipides. La différence de forme s'explique par l’hydratation différente de leur tête polaire. En effet, la phosphatidylcholine est hydratée par une vingtaine de molécules d'eau ; le lipide s’inscrit dans un cylindre si l’on considère la taille de la tête polaire hydratée. La partie polaire de la phosphatidyléthanolamine n'est hydratée que par 5 molécules d'eau ; ce lipide a donc une forme de cône. L'organisation adoptée par un lipide donné dépend de conditions telles que la température, la concentration en eau, le degré d’insaturation des chaînes hydrocarbonées, la présence de cholestérol. Le concept de forme permet d’expliquer les variations de l’organisation adoptée par un lipide donné en fonction des conditions expérimentales. Ainsi, une augmentation de température, en augmentant le mouvement des chaînes, ou une déshydratation, en diminuant le volume de la partie polaire, favorise une organisation de type HII (Tableau 4.1). De même, cette organisation est favorisée par une insaturation des chaînes ou par la présence de cholestérol (augmentation du désordre des chaînes). La figure 4.6 résume le concept de forme et les différentes phases adoptées. MOLÉCULES AMPHIPHILES FORMES PHASES

37

Figure 4.6. Relation entre la forme structurale du lipide et son organisation dans une phase lipide/eau. D'après la Réf. 2.

4.5. Compensation de formes Dans un système constitué d'un mélange de lipides différents et d'eau, il peut y avoir compensation de forme. Ceci se répercute sur l'organisation finale. C’est ainsi que si la lysophosphatidylcholine (lysoPC) adopte préférentiellement la phase micellaire de type HI (micelle directe) et la phosphatidyléthanolamine (PE), une organisation micellaire de type HII (micelle inverse), un mélange de ces 2 lipides adopte, par compensation de forme, une organisation lamellaire (Fig. 4.5,d & Fig. 4.7).

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Figure 4.7. Organisation lamellaire obtenue par compensation de forme de différents lipides. D'après la Réf. 2. Le mélange de nombreuses espèces lipidiques de forme structurale différente dans les membranes biologiques est à l’origine, par compensation de forme, de son organisation de type lamellaire en bicouche.

4.6. Caractérisation des phases du polymorphisme lipidique Deux techniques principales permettent de caractériser les différentes phases du polymorphisme lipidique (en dehors de la diffraction des rayons X que nous n’étudierons pas ici). Il s’agit de la spectroscopie RMN et de la microscopie électronique (cryofracture).

4.6.1. Cryofracture Le principe de la cryofracture a déjà été évoqué au § 1.2.2. L’allure des surfaces de cryofracture visualisées en microscopie électronique diffère grandement en fonction de l’organisation lipidique. Dans une organisation lamellaire, la fracture passant au milieu de la bicouche conduit à des surfaces parfaitement lisses, dénuées de toutes aspérités (Fig. 1.5). Le passage de la fracture d’une bicouche à l’autre fait apparaître une image en escalier (Fig. 4.8, A). Dans une organisation hexagonale, la fracture passant entre les cylindres fait apparaître des ondulations caractéristiques (Fig. 4.8, B).

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Figure 4.8. Cryofracture de phospholipides dans des organisations lamellaire (A) et hexagonale (B). Les schémas représentent la propagation de la fracture dans l’échantillon. Dans les deux cas, la fracture se propage dans la partie hydrophobe de la structure entre les chaînes hydrocarbonées des lipides (surface de moindre résistance). D’après la Réf. 1. L’organisation lamellaire est caractérisée par un empilement de surfaces uniformément lisses dont le pas correspond à l’épaisseur d’une bicouche lipidique. L’organisation hexagonale HII est caractérisée par des surfaces présentant des ondulations dont la période correspond exactement à la distance séparant les cylindres aqueux formant le réseau hexagonal.

4.6.2. Spectroscopie RMN La spectroscopie RMN (Résonance Magnétique Nucléaire, cf. Annexe 3) permet de distinguer les organisations micellaire, lamellaire ou hexagonale. La RMN du 31P présente l’avantage de visualiser un seul noyau dans le phospholipide et l’interprétation des spectres s’en trouve simplifiée. Le 31P est un isotope non radioactif, contrairement au 32P qui est radioactif. L’allure du spectre RMN du 31P dépend de son environnement électronique. Dans les micelles ou les petites vésicules, l’environnement des molécules est isotrope (les noyaux voient toujours le même environnement, quelque soit leur orientation). Le spectre RMN du 31P correspond alors à un spectre de raie (Fig. 4.9).

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Figure 4.9. Spectre RMN du 31P de phospholipides sous forme de micelles (a), de petites vésicules (SUV après sonication) (b), de micelles inverses au sein de l’épaisseur de la membrane (c) ou d'une phase cubique (d). Cette phase correspond entre autre à l’une des organisations lipidiques qui n’ont pas été détaillées dans l’analyse du diagramme de phase (Fig. 4.4). D'après K. Larsson et al., Chem. Phys. Lipids, 1980, 27, 321-328.

La vitesse de réorientation des agrégats entraînant les molécules est un paramètre important qui peut influencer la forme des raies observées sur le spectre RMN du 31P. Quand la vitesse de réorientation de l’agrégat, et donc des molécules, est suffisamment grande, le spectre RMN du 31P présente une seule raie comme celle présentée sur le spectre figure 4.9 (environnement isotrope). En revanche, lorsque la vitesse de réorientation des molécules est relativement lente (ce qui est le cas pour les vésicules de plus grandes tailles), le spectre RMN du 31 P présente une raie suivie d'un épaulement, correspondant au déplacement chimique (Fig. 4.10). Le rayon des vésicules détermine en quelque sorte la vitesse de réorientation des molécules. Plus le rayon des vésicules est grand, plus la vitesse de réorientation est faible. Dans 41

ces conditions, les molécules ne sont plus dans un environnement isotrope, mais anisotrope, c'est-à-dire que tous les noyaux ne voient pas le même environnement en fonction de leur orientation.

Figure 4.10. Simulation du spectre RMN du 31P d'une vésicule de phospholipide en fonction de son rayon. D'après E. E. Burnell et al., Biochim. Biophys. Acta, 1980, 603, 63-69.  De même, comme la distribution spatiale des phospholipides est différente dans le cas de la phase lamellaire et dans le cas de la phase hexagonale (anisotropie différente du déplacement chimique), le spectre RMN du 31P du phospholipide est totalement différent (Fig. 4.11). Il est important de noter que le positionnement de l’épaulement lié au déplacement chimique sur le spectre RMN du 31P n’est pas le même pour une phase lamellaire et pour une phase 42

hexagonale ; de plus, la largueur de cet épaulement change selon la phase: il est de 15 à 30 ppm pour les phospholipides en phase hexagonale (HII) et de 30 à 55 ppm les phospholipides organisés en phase lamellaire (L). Ces deux différences permettent de distinguer la phase lamellaire et de la phase hexagonale d’un phospholipide au moyen de la spectroscopie RMN du 31P et d’identifier ces deux types de phase. Les agrégats de petites dimensions (petites vésicules (SUV), micelles directes, petites micelles inverses de détergents (« inverted micellar ») qui présentent une rotation extrêmement rapide, donne un spectre de raie (pic isotropique), comme nous l’avons vu précédemment.

Figure 4.11. Spectres RMN du 31P et clichés de cryofracture correspondant aux différentes phases du polymorphisme lipidique. La phase lamellaire a été formée avec de la phosphatidylcholine du jaune d’œuf ; la phase hexagonale a été obtenue à l’aide de phosphatidyléthanolamine. La phase lamellaire et la phase hexagonale présentent des spectres et des clichés de microscopie électronique (cf. Fig. 4.8), totalement différents caractéristiques de chacune de ces deux phases. Le spectre RMN du 31P en forme de raie, caractéristique d’un milieu isotrope (pic isotropique), est liée à la rotation extrêmement rapide des petits agrégats. Les clichés 1 et 2 sont des clichés de petites vésicules (SUV) ou de petites micelles inverses. Les phases cubique et rhombique correspondent à des organisations lipidiques qui n’ont pas été détaillées lors de l’analyse du diagramme de phase (Fig. 4.4). D'après la Réf. 3.

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4.7. Importance des différentes phases dans les membranes biologiques Il est possible d’établir des équivalences entre l’organisation des systèmes reconstitués lipide/eau et l’organisation au sein des membranes biologiques, même si toutefois les différentes phases observées in vitro sont obtenues dans les conditions parfois lointaines de celles des membranes biologiques (concentration élevée en lipides, faible teneur en eau). L’équivalent de l’organisation lamellaire des mélanges lipides/eau est clairement la bicouche lipidique de la membrane biologique : les lipides qui tendent à adopter une organisation lamellaire stabilisent la bicouche. L'équivalent de l’organisation HI est une micelle classique : les lipides qui adoptent ce type d’organisation sont les détergents (ex : lysophosphatidyléthanolamine). L’équivalent de l’organisation HII est plus difficile à concevoir. Il pourrait s’agir d'une micelle inversée au sein de l’épaisseur de la membrane dont les lipides par ailleurs adoptent une organisation de bicouche : les lipides qui tendent à adopter une organisation de type HII déstabiliseraient la bicouche lipidique (Fig. 4.13).

Figure 4.13. Equivalence entre organisation et structure membranaire. Les lipides de forme cylindrique conduisent à une vésicule, ceux de forme de cône inversé conduisent à une micelle tandis que ceux qui ont la forme de cône produisent des "micelles inversées" au sein d'une bicouche. Il est difficile de mettre en évidence directement une organisation de type HII dans une membrane biologique. Il est possible dans certaines conditions de voir apparaître sur le spectre RMN du 31P, un spectre caractéristique de lipides possédant un mouvement plus isotrope qui pourrait s’expliquer par l’existence de micelles inversées. En cryofracture, on peut observer, dans certaines conditions, des surfaces de fracture de particules de nature lipidique qui pourraient correspondre à des micelles inversées (Fig. 4.14).

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Figure 4.14. Cliché de cryofracture de vésicules constituées d’un mélange de phosphatidyléthanolamine et de cardiolipide (rapport molaire : 4/1) en présence de calcium (a). Modèle hypothétique décrivant la présence de micelles inverses dans la membrane de la vésicule (b). D’après la Réf. 3.

4.8. Mécanisme de fusion lipidique Une membrane biologique est constituée d’un mélange de nombreuses espèces lipidiques de formes différentes. Par compensation de forme, l’organisation globale de la membrane est de type lamellaire. Il est tout à fait concevable qu’il puisse exister localement et de manière transitoire une organisation différente (micelle inversée) lors de la fusion de deux membranes. La pertinence d’organisations autres que lamellaires dans les phénomènes de fusion de liposomes est illustrée figure 4.15.

Figure 4.15. Deux mécanismes possibles de fusion lipidique. Dans les 2 cas, on passe par un intermédiaire qui s’apparente à une organisation de type HII. D’après la Réf. 1. 45

Pour qu’une fusion puisse avoir lieu, il est nécessaire qu’un contact s’établisse entre les deux monocouches externes de deux liposomes distincts. On obtient dans la région de contact l’équivalent de deux lamelles lipidiques séparées par une couche d’eau (Fig. 4.15, a). L’enroulement des deux monocouches externes conduit à la formation d’une micelle inversée (Fig. 4. 15, b). La rupture coordonnée des deux monocouches internes en contact avec la micelle conduit à un pore aqueux reliant les liposomes initiaux, appelé pore de fusion (Fig. 4. 15, c). La dilatation de ce pore conduit à la fusion complète des deux liposomes (Fig. 4. 15, d). D’autres mécanismes de fusion ont été proposés. Celui de la figure 4. 15 (b’) fait intervenir une tige. Dans ce cas, le contact des monocouches externes conduit à l’initiation de deux micelles inversées, mais la formation de ces micelles n’est pas complète ; ce premier contact forçant le second contact entre les deux monocouches internes. La rupture ultérieure de ces deux monocouches internes en contact conduit au pore de fusion puis à la fusion complète. Dans les deux mécanismes présentés, entre le contact initial et la fusion, il existe une organisation intermédiaire rappelant la phase HII. L’efficacité de fusion dépend de la force de contact entre les deux bicouches, de la nature des lipides dans la région du point de contact et de la barrière énergétique qu’il faut franchir pour quitter l’organisation lamellaire. Dans le cas des fusions membranaires, le contact initial est induit par la présence de récepteurs, d’où la spécificité de fusion. La nature des lipides dans la zone de contact peut ne pas refléter la composition moyenne membranaire (existence de microdomaines dans la membrane fluide, cf. § VI). En effet, les lipides sont animés d’une diffusion latérale importante et il arrive que la zone de contact soit enrichie en lipides ayant tendance à adopter une organisation hexagonale favorisant la fusion. Par ailleurs, des conditions particulières peuvent exister au niveau des sites de contact comme une concentration élevée en calcium qui en rapprochant les lipides acides, favorisent la fusion. Enfin, certaines protéines membranaires peuvent au niveau du site de contact, favoriser la déstabilisation de la bicouche en abaissant la barrière énergétique qu’il faut franchir pour quitter l’organisation lamellaire et jouer ainsi un rôle de catalyseur dans la fusion membranaire.

5) Fluidité membranaire 5.1. Introduction Les différents constituants d’une membrane biologique, s’ils sont confinés dans un espace défini par la membrane, n’en sont pas moins animés de mouvements divers. Les lipides tournent autour de leur axe perpendiculairement au plan de la membrane ; les chaînes hydrocarbonées des lipides sont flexibles et sont animées d’un mouvement de balancier plus ou moins prononcé. Ces mouvements à courte échelle confèrent à la membrane une certaine fluidité. Du fait de cette fluidité, les protéines peuvent être animées de rotation sur elles mêmes. Mais surtout, la fluidité permet des mouvements à plus longue échelle des lipides et des protéines dans le plan de la membrane : il s'agit de la diffusion latérale. La diffusion transversale des lipides (flip-flop, Fig. 5.1) est en général beaucoup plus lente. Ces différents mouvements sont schématisés selon la figure 5.2.

46

Figure 5.1. Diffusion transversale des lipides. D’après la Réf.1.

Figure 5.2. Les divers mouvements des constituants membranaires. Rotation des lipides (1), mouvement de balancier des chaînes hydrocarbonées (2), rotation des protéines (3), diffusion latérale des lipides (4), diffusion latérale des protéines (5). D'après la Réf. 1 Dans un milieu isotrope, homogène, la fluidité (ou la viscosité qui est son inverse) est une propriété générale du milieu qui exprime la résistance au déplacement dans toutes les directions. Une membrane est un milieu anisotrope, hétérogène. La résistance au déplacement n’est pas la même dans toutes les directions. Qui plus est, dans une direction donnée, elle n’est pas la même en différents endroits de la membrane. Dans ces conditions, la définition de la fluidité membranaire n’est pas simple.

5.2. Détermination expérimentale de la fluidité Les techniques qui permettent de déterminer la fluidité membranaire, mais également la diffusion des lipides et des protéines, sont le plus souvent de nature spectroscopique, fluorescence et résonance paramagnétique électronique. Cette dernière méthode ne sera pas traitée ici.

5.2.1. Dépolarisation de fluorescence La dépolarisation de fluorescence permet de déterminer la vitesse de rotation sur ellemême d’une molécule dissoute dans un milieu donné. Celle-ci est d’autant plus élevée que le milieu est fluide. 47

Les sondes fluorescentes utilisées pour caractériser la fluidité membranaire sont des petites molécules hydrophobes qui peuvent s’incorporer dans la partie hydrophobe centrale de la membrane, sans établir d’interactions spécifiques avec les constituants membranaires. Il s’agit le plus souvent du diphénylhexatriène (DPH) ou de la N-phénylnaphtylamine (NPN) (Fig. 5.3).

Figure 5.3. Sondes fluorescentes et leur libre rotation dans la membrane. D'après la Réf. 1. Le principe de la dépolarisation de fluorescence, qui permet de déterminer la vitesse de rotation d’une sonde fluorescente dissoute dans une membrane, est présenté figure 5.4.

Figure 5.4. Principe de la dépolarisation de fluorescence. L’excitation d’une molécule s’accompagne de l’absorption d’un photon de longueur d’onde donnée. La molécule passe de l’état fondamental (de plus faible énergie) à l’état excité (d’énergie plus élevée). La transition s’effectue en quelques ps. La molécule peut revenir à l’état fondamental en émettant un photon. C’est le phénomène de fluorescence. La vitesse de retour est dictée par le temps de vie de l’état excité, en général de l’ordre de la ns. La probabilité 48

d’adsorption est directionnelle : une lumière polarisée dans une direction donnée excite préférentiellement les molécules qui ont leur moment dipolaire d’absorption dans cette même direction. L’excitation par une lumière polarisée permet donc d’effectuer une photosélection. Lors du retour à l’état fondamental, la lumière émise sera préférentiellement polarisée dans une direction parallèle au moment dipolaire de la molécule au moment de l’émission. En conséquence, si durant le temps de vie de l’état excité la molécule a peu bougé, la direction de polarisation de la lumière émise sera la même que celle de la lumière d’excitation ; à l’inverse, si la molécule a tourné sur elle-même de manière aléatoire, une composante de lumière émise polarisée perpendiculairement à la direction de polarisation initiale sera observée. La dépolarisation de fluorescence est d’autant plus importante que la molécule tourne sur elle-même durant le temps de vie de l’état excité, et donc que le milieu est fluide. La détermination de cette polarisation se fait en plaçant dans le faisceau émis un analyseur, et en mesurant l’intensité de la lumière polarisée parallèlement (I//) et perpendiculairement (I) à la direction de polarisation du faisceau d’excitation. À partir de l’intensité de la lumière émise polarisée parallèlement (I//) et perpendiculairement (I) à la direction de polarisation du faisceau d’excitation, on peut calculer l’anisotropie de fluorescence r : I// - I r= I// + 2 I En absence de mouvement (milieu rigide), I// est maximum et I est minimum. On montre que r a une valeur maximale de 0,4. Si le mouvement est très rapide par rapport au temps de vie de l’état excité, la lumière émise est entièrement dépolarisée, I// est égale à I et r est égal à 0. Ces mesures de fluorescence en la lumière polarisée permettent de mesurer les mouvements du fluorophore. En effet, la rotation d’une molécule sur elle-même est caractérisée par son coefficient de diffusion de rotation DR. Plus DR est élevé, plus la molécule tourne rapidement sur elle-même et plus le milieu est fluide. La rotation d’une molécule est souvent exprimée en termes de temps de corrélation de rotation (c) ou de temps de relaxation (). Ces temps sont inversement proportionnels à DR. Ils sont reliés au temps nécessaire pour homogénéiser une population de molécules qui a une orientation bien définie au temps t = 0 : c = 1/ 6DR ;  = 1/2DR Des études de dynamiques de l’anisotropie de fluorescence permettent d’atteindre directement le temps de corrélation de rotation de la molécule (c). Expérimentalement, on excite la molécule fluorescente à l’aide d’un éclair de lumière polarisée et l’on mesure la variation de l’intensité I// et I en fonction du temps (Fig. 5.5). Le temps de corrélation est relié à la variation de l’anisotropie de fluorescence par la relation :

rt = r + (r0 - r).e-t/c

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où r0 et r correspondent respectivement à l’anisotropie initiale et à l’anisotropie finale. Cette dernière n’est pas forcément nulle si le degré de mouvement de la molécule est limité dans la membrane.

Figure 5.5. Déclin de l’anisotropie de fluorescence. L’éclair de lumière polarisée a lieu au temps t = 0. Sa durée est de l’ordre de quelques ns. D’après la Réf. 1. La dépolarisation de fluorescence permet de mettre en évidence des mouvements se faisant à l’échelle du temps de vie de l’état excité (de l’ordre de la ns). Si le temps de corrélation de rotation d’une molécule est très supérieur à ce temps de vie, la molécule apparaîtra comme totalement immobile ; si le temps de corrélation de rotation d’une molécule est très inférieur, la molécule apparaîtra comme totalement mobile.

5.2.2. Valeur de la fluidité membranaire Les caractéristiques spectroscopiques d’une sonde dans une membrane (anisotropie de fluorescence) ont été comparées à celles de la sonde dans des milieux isotropes de viscosité bien définie (mélange glycérol/eau dans des proportions variables, par exemple). Ainsi, on a pu montrer que dans les conditions physiologiques, la viscosité d’une membrane est de l’ordre de 0,1 N.s.m2. Cette viscosité est 100 fois plus élevée que celle de l’eau, qui est de l’ordre de 10-3 N.s.m2. (Une membrane est donc cent fois moins fluide que l’eau). Une viscosité de l’ordre de 0,1 N.s.m2 correspond en fait à un mélange qui ne coule pratiquement pas ; ce n’est pas un solide, on peut y « plonger son doigt ». Une membrane de cette viscosité maintient son intégrité en conservant la mobilité latérale de ces constituants (lipides et protéines). Comme toute viscosité, celle d’une membrane dépend de la température. In vitro, la fluidité d’une membrane isolée augmente avec la température. In vivo, il existe pour les espèces présentant une température corporelle ou une température d’acclimatation différente, un phénomène d’adaptation désignée homéovisqueuse, qui permet le maintien d’une viscosité plus ou moins constante, quelle que soit la température. Cette adaptation passe par une modification de la composition lipidique, principalement de la composition des chaînes hydrocarbonées des lipides. Les chaînes présentent en fonction de la température des conformations différentes qui expliquent cette adaptation. Il faut tout de même noter ici que toutes les membranes biologiques ne présentent pas rigoureusement la même fluidité. Des fluidités différentes peuvent être 50

rencontrées en fonction de la composition lipidique et des transitions « ordre-désordre » associées à la conformation des chaînes hydrocarbonées des lipides membranaires.

5.3. Fluidité et conformation des chaînes hydrocarbonées Au sein d’une chaîne hydrocarbonée, il existe une libre rotation autour des liaisons C-C. La conformation la plus stable est la conformation trans (t). Dans une situation où les conformations autour de toutes les liaisons sont de type trans, la chaîne est étirée au maximum (Fig. 5.8, a) ; on a une conformation "tout-trans".

Figure 5.8. Les différentes conformations d'une chaîne hydrocarbonée. D'après la Réf. 1. Le passage d’une conformation "tout-trans" (t) à une conformation gauche (g) autour d’une liaison C-C nécessite de l’énergie (quelques kJ). L’agitation thermique peut suffire à y pouvoir. Une séquence de conformations ...ttgtgtt... entraîne, au-delà de la conformation gauche, un changement de direction de la chaîne (Fig. 5.8, b). Dans une bicouche lipidique, ceci rend plus difficile un parallélisme des chaînes. Une double liaison en configuration cis conduit également à un changement de direction (Fig. 5.8, c). Ce n’est pas le cas d’une double liaison en configuration trans (Fig. 5.8, d).

5.3.1. Conformations ordonnées et désordonnées des lipides À une température suffisamment basse, dans les conditions où l’agitation thermique est faible, toutes les chaînes des lipides membranaires ont une conformation "tout-trans". Dans une organisation en bicouche lipidique, les chaînes sont parallèles les unes aux autres, en contact étroit et étirées au maximum. On dit que les chaînes sont en conformation ordonnée et on utilise le terme "gel cristalline" pour décrire l’état de cette phase lamellaire (Fig. 5.9, conformation ß).

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Figure 5.9. Conformations ß (ordonnée) et  (désordonnée) des chaînes hydrocarbonées des lipides dans une bicouche. D'après la Réf. 1. Une élévation de la température entraîne une mobilité accrue autour des liaisons C-C (pour les chaînes saturées ou insaturées). La probabilité d’une isomérisation trans  gauche augmente avec la température, et au-delà d’une température donnée, une transition coopérative est observée ; les chaînes passent d’une conformation ordonnée (conformation ß) à une conformation désordonnée (Fig. 5.9, conformation ). On parle alors de la transition de phase Gel cristalline (ou Lß)  Liquide cristalline (ou L. En conformation , les chaînes oscillent autour d’une orientation moyenne perpendiculaire au plan de la membrane. Les chaînes ne sont plus étirées au maximum ; en conséquence, par rapport à une situation où la conformation est de type ß, l’épaisseur de la bicouche diminue. Le contact entre chaînes est moins étroit et les lipides sont plus séparés les uns des autres. Au cours de la transition, il y a une expansion latérale des lipides dans la membrane et la surface occupée à l’interface est plus importante.

5.3.2. Détection expérimentale des transitions ordre  désordre Plusieurs techniques permettent de déterminer la conformation des chaînes, le pourcentage des chaînes au sein d’une membrane ayant une conformation  ou ß à une température donnée et le domaine de température de la transition. La transition de l’état gel cristallin vers la phase liquide cristalline peut être détectée à l’aide de différentes techniques comme la calorimétrie différentielle (qui fait appel à l’absorption de la chaleur qui accompagne la "fusion" des chaînes de l’état ordonné à l’état désordonné) ou encore la spectroscopie InfraRouge (la liste n'est pas exhaustive). a) La calorimétrie différentielle (ou DSC pour « Differential Scanning Calorimetry ») consiste à faire varier de manière constante, la température d’un échantillon lipidique (membrane isolée ou phase lamellaire) et d’un témoin. Le témoin a une capacité calorifique voisine de celle de l’échantillon, mais ne subit pas de transition de phase dans le domaine de température exploré. Un régulateur permet de maintenir une différence de température nulle entre l’échantillon et le témoin. Le paramètre qui est détecté expérimentalement est la différence de puissance de chauffe (ou de refroidissement) à fournir à l’échantillon et au témoin pour les maintenir à la même température. Cette différence est nulle tant qu’aucun phénomène thermique 52

n’a lieu dans l’échantillon. Lors de la transition, l’énergie thermique est absorbée par la "fusion" des chaînes (passage d’une conformation  ordonnée à une conformation ß désordonnée) et la puissance de chauffe à fournir à l’échantillon est différente de celle à fournir au témoin qui ne subit pas de transition. En fin de transition, la différence de puissance de chauffe est à nouveau nulle. Pour obtenir le profil de calorimétrie différentielle, on reporte la capacité différentielle (en kcal.mol-1.K-1) en fonction de la température de chauffe. La transition de la phase gel cristalline (Lß) vers la phase liquide cristalline (L) est alors caractérisée par un pic d’absorption dont la localisation en x indique la température de transition, notée Tm (Fig. 5.10). La surface totale du pic donne la valeur de l’enthalpie (∆H) de transition (plus de détails seront donnés en TD).

Figure 5.10. Profil type de calorimétrie différentielle La figure 5.11 (A) présente les profils de calorimétrie différentielle de trois phospholipides présentant une même longueur de chaînes. Alors que l’acide dimyristoylphosphatique (DMPA) et le dimyristoylphosphatyléthanolamine (DMPE) présentent un seul pic en calorimétrie différentielle correspondant à la transition principale Lß  L (Fig. 5.11, B), un second pic, précédant la transition principale, apparaît sur le profil obtenu avec la dimyristoylphosphatylcholine (DMPC). Cet événement, appelé "pré-transition", est associé à une transition de la phase gel cristalline où les chaînes hydrocarbonées sont inclinées par rapport au plan de la bicouche (notée Lß’) vers la phase cristalline nommée « Ripple Phase » et notée Pß’ (Fig. 5.11, B). Dans le cas des phosphatidylcholines, la dimension de la tête polaire est supérieure à celui de l’encombrement de deux chaînes hydrocarbonées en contact étroit et étirée au maximum. De ce fait, la conformation la plus stable des chaînes hydrocarbonées dans la phase gel cristalline est 53

obtenue lorsque les chaînes sont inclinées par rapport au plan de la bicouche (conformation ß’). Lors de la transition Lß’  L, il y a alors passage par la phase intermédiaire Pß’ dans laquelle les chaînes hydrocarbonées se redressent, ce qui entraîne une distorsion de la bicouche et l’apparition de la pré-transition sur le profil de calorimétrie différentielle ; la transition principale correspond alors à la transition de phase Pß’  L. L’existence d’une pré-transition est une caractéristique commune à toutes les phosphatidylcholines, quels que soient la longueur et le degré d’insaturation des chaînes hydrocarbonées. Elle est liée à l’encombrement élevé de la tête polaire.

Pré-transition

Figure 5.11. Profils de calorimétrie différentielle de trois phospholipides, DMPA, DMPE et DMPC (A) et représentation schématique de l’organisation moléculaire des phosphatidylcholines et phosphatidyléthanolamines pendant la transition (B). D’après la Réf. 3.

b) La spectroscopie infrarouge (IR) permet également de suivre le changement de conformation impliquant les chaînes hydrocarbonées. Les modes de vibrations étudiés sont ceux des groupements méthyles -CH3 (2956 cm-1 pour le mode de vibration antisymétrique aCH3 et 2873 cm-1 pour le mode de vibration symétrique sCH3) et ceux des groupements méthylène CH2-. (2920 cm-1 pour le mode antisymétrique aCH2 et 2851 cm-1 pour le mode symétrique 54

sCH2). La figure 5.13 présente les spectres infrarouges de la dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) à différentes températures.

Figure 5.13. Spectres IR de la DPPC entre 10°C et 50°C. La température principale de transition de la dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) est de 41,5°C. D’après R. Mendelsohn et H. H. Mantsch « FTIR studies of lipid-protein interactions », dans Progress in Protein-lipid interactions 2 (Elsevier Science, 1986, Eds Watts/De Pont, pp 103-145). L’augmentation de la température produit une augmentation de la largeur des bandes et une diminution de leur intensité relative. La largeur de la bande donne une indication sur le degré d’ordre : une plus grande largeur de raie indique un désordre plus grand (soit une plus grande mobilité des chaînes). D’autre part, un déplacement de la position du maximum d’absorption de la bande infrarouge vers les plus grands nombres d’onde (relativement faible mais mesurable) indique une conversion des chaînes hydrocarbonées de la conformation "touttrans" à une conformation gauche (transition de type Lß’ vers L). Comme la proportion de groupements -CH2- est plus importante que celle des groupements -CH3, ce sont les groupements CH2 qui sont utilisés pour suivre la transition de phase de la chaîne hydrocarbonée.

5.3.3. Transitions conformationnelles dans les phases lipidiques Le passage de la conformation  à la conformation ß (ou vice-versa) correspond à une transition conformationnelle des chaînes hydrocarbonées. Dans le cas d’une suspension d’un lipide pur en solution aqueuse, celle-ci dépend de la nature de la tête polaire et pour un lipide donné, de la nature des chaînes hydrocarbonées. En fait, il existe un parallélisme entre la température de fusion des acides gras constituant les chaînes hydrocarbonées des lipides et la température de transition de phases des lipides (Tableau 5.1). Comme nous l’avons vu, le passage de l’état ordonné ß à l’état désordonné s’accompagne d’une expansion latérale des lipides. D’une manière générale, tout ce qui s’oppose à cette expansion s’oppose à la transition de phase ordre  désordre. Cette transition se fera donc à une température d’autant plus élevée que les interactions entre lipides sont fortes : - les interactions hydrophobes qui s’opposent à l’expansion augmentent avec la longueur des chaînes : en conséquence, les températures de transition de phase des lipides sont d’autant plus élevées que les chaînes hydrocarbonées sont 55

-

-

longues (Fig. 5.15). Plus les chaînes hydrocarbonées sont longues, plus la température de transition de phase s’élève (plus il faut d’énergie pour rompre les liaisons de van der Waals permettant la transition ordre  désordre des chaînes hydrocarbonées) ; les insaturations en cis défavorisent les interactions entre chaînes voisines (changement de direction de la chaîne) : en conséquence, les températures de transition de phase des lipides diminuent fortement avec le nombre d’insaturation en cis ; les insaturations en trans, qui introduisent peu de changement dans la direction de la chaîne, ont moins d’effet sur les températures de transition ; les dimensions de la tête polaire a un effet sur l’inclinaison des chaînes hydrocarbonées en phase gel cristalline (cas des PC, cf. § 5.3.2. sur la calorimétrie différentielle). L’inclinaison des chaînes diminue les forces d’interactions hydrophobes entre les chaînes : en conséquence, les températures de transition de phase des lipides diminuent avec l’augmentation de la tête polaire. C’est la raison pour laquelle la température de transition de la phosphatidylcholine (conformation ß’ à basse température) est inférieure à celle de la phosphatidyléthanolamine (conformation ß à basse température). À titre d’exemple, la température de transition principale de la DPPC est de 41,5°C, celle de la DPPE de 63,9°C.

Figure 5.15. Profils de calorimétrie différentielle de différentes phosphatidylcholines, DMPC, DPPC et DSPC. La température de transition de phase de ces phosphatidylcholines suit l’ordre croissant suivant : DMPC (di C14 : deux chaînes hydrocarbonées de 14 atomes de carbone) < DPPC (di C16) < DSPC (di C18). D'après JK. M. W. Keough et P. J. Davis, Biochemistry, 1979, 18, 1453-1459.

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Le tableau 5.1 présente les températures de transition de quelques phospholipides, en relation avec le point de fusion des acides gras constituant les chaînes hydrocarbonées, ainsi que l’effet des différents paramètres mentionnés ci-dessus. Tableau 5.1. Température de transition ordre  désordre de différents phospholipides

Dans le cas d’un mélange de lipides, la transition de l’état ordonné à l’état désordonné peut s’effectuer de manière plus complexe et s’étend sur un domaine de température plus important, compris entre les températures de transition des lipides purs du mélange.

5.3.4. Conformation des chaînes et fluidité membranaire La fluidité membranaire dépend fortement de la conformation des chaînes. Lorsque cellesci sont ordonnées, les interactions entre elles sont fortes, les mouvements sont limités et la fluidité est faible. Le passage à l’état désordonné s’accompagne d’une augmentation importante de la fluidité. Dans les conditions physiologiques, la conformation des chaînes des lipides membranaires est généralement désordonnée (phase L). Ce n’est qu’aux températures inférieures aux températures physiologiques que les chaînes adoptent une conformation ordonnée (phase Lß’). Malgré cela, si nous avons pris la peine de développer les notions de transitions de phase, c’est que la présence possible de lipides en phase Lß’ à des températures inférieures à la température physiologique peut influencer sur la fluidité de la membrane à la température physiologique. Plus la température physiologique est éloignée du domaine de la température de la transition conformationnelle, plus la membrane aura une fluidité (Tm < T physiologique) ou une rigidité (Tm> T physiologique) importante à la température physiologique. Le domaine de température de la transition conformationnelle dépend de la nature des lipides, principalement de la nature des chaînes hydrocarbonées : ce domaine est situé à des températures d’autant plus basses que les chaînes sont insaturées et/ou courtes. En conséquence, la fluidité de la membrane est 57

contrôlée par la composition des chaînes hydrocarbonées : plus celles-ci sont insaturées et/ou courtes, plus la membrane est fluide à la température physiologique. Parmi les constituants membranaires, seuls les phospholipides et les sphingolipides participent aux transitions conformationnelles. Le cholestérol et les protéines non seulement ne participent pas à ces transitions, mais les perturbent. La nature de ces perturbations peut être analysée, soit par addition de cholestérol ou de protéines membranaires à des systèmes lipidiques modèles, soit par comparaison des transitions conformationnelles d’une membrane donnée à celle de l’extrait lipidique (phospholipide + sphingolipide) isolé de cette membrane. a) Effet du cholestérol. Selon les membranes, le cholestérol peut constituer jusqu’à 50% des lipides totaux. Nous avons vu figure 2.5, comment le cholestérol s’insère dans les membranes : son groupement OH en interaction avec les parties polaires des lipides membranaires, le noyau tétracyclique rigide en interaction avec leurs chaînes hydrocarbonées et sa courte chaîne hydrocarbonée, très flexible et toujours désordonnée, située vers le centre de la bicouche. L’interaction entre le noyau tétracyclique et les chaînes hydrocarbonées des lipides avoisinants empêche la cristallisation de ces lipides (c’est-à-dire la formation d’une structure "tout-trans" compatible avec une conformation ordonnée des chaînes). Au cours de la transition conformationnelle de la phase L vers la phase Lß (ou Lß’) (abaissement de température), le cholestérol demeure en interaction avec les lipides avoisinants. De ce fait, la présence du cholestérol diminue la quantité de lipides qui participent aux transitions conformationnelles et le nombre de lipides ayant des chaînes ordonnées aux températures inférieures à celle de la transition conformationnelle est plus faible. Cette diminution est d’autant plus importante que la quantité de cholestérol est grande. Les transitions disparaissent pour des concentrations de cholestérol comprises entre 30 et 50% des lipides totaux (concentrations physiologiques) (Fig. 5.16).

Figure 5.16. Profils de calorimétrie différentielle de différents mélanges dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) et cholestérol. C : % en poids de cholestérol dans le mélange. La transition ordre  désordre des chaînes hydrocarbonées du lipide (transition de 58

phase Lß’  L) disparaît au fur et à mesure de l’augmentation du pourcentage de cholestérol dans le mélange. D’après S. Mabrey et J.M. Sturtevant, Proc. Natl. Acad. Sci., 1976, 73, 38623866. En conséquence, aux basses températures, la fluidité membranaire est plus grande en présence qu’en absence de cholestérol. Aux fortes températures, la situation est différente. Le cholestérol interagit fortement avec les lipides avoisinants par l’intermédiaire du noyau tétracyclique rigide et leur mouvement est faible ; en conséquence, la fluidité membranaire diminue. Le cholestérol tamponne donc les variations de fluidité en fonction de la température : augmentation de la fluidité aux basses températures, diminution (rigidification) aux fortes températures. Le cholestérol, aux concentrations physiologiques (25%), a donc un effet dual : il condense les phases fluides et désorganise les phases rigides (rôle dans la formation des microdomaines, cf. § 5.5). b) Effet des protéines. Les protéines intrinsèques interagissent avec les lipides avoisinants et de ce fait, empêchent leur participation aux transitions conformationnelles. Quelle que soit la température, les chaînes de ces lipides demeurent désordonnées. La quantité totale de lipides ayant des chaînes ordonnées aux températures inférieures à celle de la transition conformationnelle, est plus faible pour les membranes isolées que pour les systèmes lipidiques reconstitués. Un exemple de perturbation apportée par la présence d’une protéine incorporée dans un système lipidique reconstitué (phase lamellaire) est donnée figure 5.17.

Figure 5.17. Effet de la température sur la position du maximum d’absorption de la bande IR correspondant à un mode vibration du groupement -CH2-. du dimyristoyl-phosphatidylcholine (DMPC) en présence ou non de glycophorine. Triangles noirs : DMPC seul ; carré blanc : rapport molaire DMPC/glycophorine égal à 200/1 ; croix : rapport molaire 100/1 ; triangle blanc : rapport molaire 50/1. D’après R. Mendelsohn et H. H. Mantsch « FTIR studies of lipid59

protein interactions », dans Progress in Protein-lipid interactions 2 (Elsevier Science, 1986, Eds Watts/De Pont, pp 103-145). L’incorporation de la protéine dans un modèle de membrane reconstituée modifie la transition de phase du DMPC. L'effet de la protéine sur le DMPC consiste à favoriser l’apparition de la phase L à de plus basses températures et à accroître la conformation désordonnée des chaînes hydrocarbonées. Cet effet dépend du rapport molaire DMPC / glycophorine. Plus la quantité de protéines est importante, plus son effet sur la transition conformationnelle est important. L’effet de cette protéine sur la transition de phase du phospholipide illustre d'une manière générale l’effet des polypeptides et des protéines sur la conformation des chaînes hydrocarbonées. L’incorporation des polypeptides et des protéines accroît souvent le désordre des chaînes hydrocarbonées. Notons que ces interactions entre lipides et protéines peuvent également affecter la conformation de la protéine ou d’une partie de la protéine.

5.4. Rôle de la fluidité membranaire Un fonctionnement cellulaire correct nécessite une fluidité membranaire optimale. Ceci explique la nécessité d’une adaptation homéovisqueuse : des perturbations externes (température, régime alimentaire) qui affecteraient la fluidité membranaire sont compensées de sorte à maintenir une fluidité constante. De nombreuses réactions font intervenir des protéines ou des complexes enzymatiques indépendants. On peut mentionner à titre d’exemple, les chaînes membranaires de transporteurs d’électrons où la vitesse de la réaction est contrôlée par la vitesse de diffusion de ces complexes protéiques dans les membranes, elle-même contrôlée par la fluidité membranaire. De plus, l’efficacité de fonctionnement de nombreuses enzymes ou transporteurs membranaires dépend de la fluidité de leur environnement. En particulier, ces activités chutent brutalement lorsque les chaînes hydrocarbonées adoptent une conformation ordonnée (phase Lß’) s’accompagnant d’une diminution brutale de la fluidité. La figure 5.18 illustre à titre d’exemple l’effet de la transition de phase Lß’  L sur la vitesse de réaction d’un transport actif de -galactoside.

Figure 5.18. Représentation d'Arrhenius d'un transport actif d'un -galactoside. D’après E. Shechter et al., Eur. J. Biochem., 1974, 49, 61-76.

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La vitesse de réaction du transport actif d’un -galactoside à travers la membrane cytoplasmique d’E. Coli est déterminée en fonction de la température. La pente de la représentation logarithmique de la vitesse de transport en fonction de l’inverse de la température permet de déterminer l’énergie d’activation du transport. Deux énergies d’activation peuvent être déterminées de part et d’autre de la transition conformationnelle qui a lieu vers 20°C. Ces différences d’énergie d’activation reflètent deux régimes de fonctionnement différents du transport actif de -galactoside en fonction de l’état conformationnelle des chaînes hydrocarbonées, c’est-à-dire de la fluidité membranaire.

5.5. Microdomaines membranaires Nous avons déjà signalé que toutes les membranes biologiques ne présentent pas rigoureusement la même fluidité. De plus, il a été montré depuis une dizaine d’années, que des complexes lipidiques membranaires, enrichis en cholestérol et sphingolipides (principalement glycosphingolipide et sphingomyéline) peuvent ne pas être solubilisés par certains détergents (Triton, par exemple) et que ces fragments membranaires, aussi appelés DRM (pour « Detergent Resistent Membrane ») flottent en surface d’un gradient de densité après centrifugation. Ces complexes membranaires, également appelés « radeaux lipidiques » (ou « rafts » en anglais), correspondent à des microdomaines appauvris en phospholipides insaturés et certaines protéines transmembranaires, mais enrichis en cholestérol, sphingolipides et certaines protéines à ancre lipidique. Les interactions fortes qui existeraient entre les parties saccharidiques des glycolipides permettraient l’agrégation latérale des lipides dans le feuillet exoplasmique de la bicouche des microdomaines (Fig. 5.19) ; l’espace créé entre les chaînes hydrocarbonées par les interactions entre les parties polaires volumineuses des glycolipides impliqués serait alors comblé par du cholestérol. Ces microdomaines enrichis en sphingolipides et cholestérol présentent une structure cristalline ordonnée particulière nommée "Liquide ordonnée, Lo" (pour « Liquid ordered »). Cette phase Liquide ordonnée est une phase intermédiaire entre la phase gel cristalline Lß et la phase liquide cristalline (L). En effet, la phase Lo est caractérisée par une conformation ordonnée des chaînes, similaire à celle de la phase Lß (peu de configurations gauche), et par une rotation axiale et une mobilité latérale des lipides similaires à celles de la phase L (diffusion latérale des lipides). Ces microdomaines semblent impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires, comme l’endocytose, la transduction de signaux biologiques ou encore l’adressage moléculaire (tri et transport spécifique de lipides et de protéines à des localisations précises de la membrane plasmique). La mise en évidence de ces microdomaines permet de compléter le modèle de la mosaïque fluide proposé par Singer et Nicolson en 1972 pour décrire les structures de la membrane plasmique. Il serait maintenant plus juste d’imager la membrane plasmique comme une mosaïque fluide dans laquelle flottent des radeaux membranaires, permettant de véhiculer en un endroit précis de la membrane, les protéines et les lipides nécessaires à certaines fonctions cellulaires.

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Figure 5.19. Modèle d’organisation des microdomaines (ou radeaux) membranaires. Les radeaux en rouge, figure 5.21, ségréguent des autres régions de la membrane en bleu, enrichies dans le feuillet exoplasmique en phosphatidylcholine insaturés. a) Les radeaux contiennent des protéines attachées au feuillet exoplasmique de la bicouche par leur ancre GlycosylPhosphatidylInositol (GPI), des protéines liées au feuillet cytoplasmique par leurs chaînes acyles (ex : protéine YES de la famille des Src-kinase) ou des protéines transmembranaires comme les hémaglutinines (HA). b) la bicouche lipidique du radeau est asymétrique, avec les sphingomyélines et les glycosphingolipides en rouges, enrichis dans le feuillet exoplasmique et les glycérophospholipides (comme les phosphatidylsérines ou les phosphatidyléthanolamines en vert) dans le feuillet cytoplasmique. Le cholestérol en gris est présent des deux côtés et remplit l’espace sous les têtes polaires des sphingolipides. D’après Simons & Ikonen, Nature, 1997, 387, 569-572.

En espérant que ce cours vous aura intéressé et familiarisé avec ces constituants parfois mal considérés, que sont les lipides membranaires, je vous souhaite une bonne révision … 62

ANNEXES Annexe 1 : Technique de Folch La technique de Folch est l’une des techniques couramment utilisées pour extraire les lipides à partir des tissus. Un volume de suspension tissulaire ou membranaire est mélangé à 20 volumes d’un mélange chloroforme/méthanol (2 :1). Le résidu non solubilisé (protéines dénaturées) est éliminé par filtration ou centrifugation. L’addition de 0,2 volumes d’eau à l’extrait lipidique conduit à un système biphasique. La phase supérieure de composition chloroforme/méthanol/eau dans des rapports 3/48/47 comprend les lipides les plus hydrophiles (glycosphingolipides acides, glycosphingolipides neutres ayant une longue chaîne polysaccharidique). La phase inférieure, principalement chloroformique (composition chloroforme/méthanol/eau : 86/14/1), comprend les lipides les moins hydrophiles (phospholipides, stérols, sphingophospholipides, glycosphingolipides à courte chaîne polysaccharidique), mais aussi les lipides non membranaires comme les mono, di, triglycérides et les acides gras.

Annexe 2 : Chromatographie sur couche mince (CCM) Une chromatographie sur couche mince est généralement effectuée sur un gel de silice de faible épaisseur déposé sur une plaque d’aluminium. Le mélange de lipides dissous dans un solvant organique est déposé à l’extrémité inférieure de la plaque (chromatographie ascendante). Les lipides s’adsorbent sur le gel par interactions électrostatiques par l’intermédiaire de leur partie polaire. L’extrémité inférieure de la plaque est plongée dans un solvant d’élution qui migre le long de la plaque par capillarité, entraînant les différents lipides, et ce d’autant plus que les interactions polaires avec le gel sont faibles. Les lipides sont donc séparés suivant le caractère plus ou moins polaire de leur partie hydrophile. Dans un solvant ou mélange de solvants donnés, la mobilité de chaque lipide peut-être définie par la valeur de Rf, rapport entre la distance parcourue par le lipide et la distance parcourue par le front du solvant. Deux lipides ayant des valeurs de Rf différentes seront séparés au cours de la chromatographie. Cependant, aucun solvant ou mélange de solvants d’élution ne permet de séparer tous les lipides les uns des autres. Il est le plus souvent nécessaire d’effectuer plusieurs chromatographies successives en utilisant divers mélanges de solvants. Deux chromatographies successives peuvent être réalisées sur la même plaque et combinées en une seule chromatographie bidimensionnelle. À la fin de la première chromatographie, la plaque est retournée de 90° et la seconde chromatographie est effectuée dans le second système de solvant.

Annexe 3 : Chromatographie gaz-liquide (CGL) Dans la chromatographie gaz-liquide, la phase stationnaire est maintenue fixée sur un support inerte à l’intérieur de la colonne. La phase mobile est un gaz (Hélium, Hydrogène, Azote, …) qui circule de manière régulière dans la colonne le long de la phase liquide. L’ensemble est porté à température élevée (200 à 300° à l’intérieur du four). Les acides gras sont tout d’abord transformés en esters méthyliques volatils et solubilisés dans un solvant de faible point d’ébullition (hexane, chloroforme, …). Ils sont alors injectés dans la colonne et les esters 63

d’acide gras sont retenus plus ou moins longtemps en fonction de leur affinité relative entre la phase gazeuse et la phase liquide. L’affinité dépend de la longueur et du degré d’instauration des chaînes. Les différents composants séparés par la colonne sont détectés à la sortie par ionisation. L’intensité du courant détectée est proportionnelle à la quantité d’acide gras.

Annexe 4 : Notions de Spectroscopie RMN La spectroscopie RMN est basée sur le phénomène de spin (de l’anglais, « tourner très rapidement sur soi-même »). Tout comme les électrons, les noyaux de certains atomes peuvent avoir un spin. La rotation sur elle-même de particules chargées (comme le proton ou l’électron) engendre un courant électrique et un moment magnétique (Fig. A4.1) Ce mouvement circulaire (moment cinétique intrinsèque) est appelé spin. Bien que le neutron ne porte pas de charge, il a également un spin.

Figure A4.1. Un noyau avec un moment angulaire I différent de zéro se comporte comme un petit barreau magnétique. La force et le champ magnétique produit par ce mouvement de spin est exprimé par le moment magnétique µ. Pour obtenir une Résonance Magnétique Nucléaire, il est nécessaire d’utiliser des noyaux dont le spin nucléaire total est différent de 0. Il est établi que les noyaux possédant une masse atomique (N) impaire ont un spin, tandis que ceux possédant une masse atomique paire n’ont : - soit pas de spin si la charge nucléaire (Z) est paire ; - soit ont un spin si la charge nucléaire (Z) est impaire. (Ceci vient du fait que les protons (ou les neutrons), comme les électrons, s’associent en pairs de spin opposé et le spin résultant est nul. Pour obtenir un spin non nul, il est donc nécessaire d’avoir dans le noyau un proton ou un neutron non apparié. C’est la même chose pour les électrons). La spectroscopie de résonance magnétique nucléaire concerne le spin du noyau, tandis que la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) concerne le spin de l’électron). À titre d’exemple, les noyaux suivants ont un spin nucléaire total qui vaut 1/2 : 1H; 13C, 31P, etc... et peuvent être utilisés en RMN. Pour obtenir un spectre RMN, il faut placer l’échantillon de spin non nul dans un champ magnétique externe (B0). Dans ces conditions, les spins des noyaux (c’est-à-dire les moments 64

magnétiques nucléaires induits) vont s’orienter comme « des petits aimants ». Pour les noyaux de spin nucléaire total égal à 1/2, les moments magnétiques ne peuvent prendre que deux orientations par rapport au champ magnétique externe, soit parallèle, soit anti-parallèle (Fig. A4.2). Les deux orientations sont caractérisées par les états de spin +1/2 et -1/2. Ces deux états de spin n’ont pas la même énergie, en présence du champ magnétique externe. L’écart entre ces deux états est d’autant plus important que le champ magnétique externe est élevé (Fig. A4.3).

Figure A4.2. a) En absence de champ magnétique externe, les spins nucléaires sont orientés de manière aléatoire les uns des autres. b) Quand un champ magnétique externe B0 est appliqué au système nucléaire, les moments magnétiques µ s’orientent selon deux orientations possibles, soit parallèle, soit anti-parallèle à la direction du champ magnétique externe.

Figure A4.3. Les noyaux qui ont un spin parallèle à la direction du champ magnétique externe B0 possèdent un état énergétique plus bas que ceux qui ont un spin antiparallèle. La différence d’énergie entre les deux états de spin est directement proportionnelle à la force du champ magnétique externe : h =  (h/2π)   B0.

L’état parallèle, où le moment magnétique possède la même direction que le champ magnétique externe est légèrement plus stable (et donc de plus basse énergie) que l’état

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antiparallèle. Du fait de la plus grande stabilité de l’état parallèle, un léger excès de spins se trouve dans cette configuration (Fig. A4.3). La transition entre deux états de spin du noyau est caractéristique du noyau et dépend de son environnement électronique. Comme dans toutes spectroscopies, si l’énergie d’une radiation électromagnétique coïncide avec la différence d’énergie entre les deux états de spin (en l’occurrence : S = +1/2 ou S =- 1/2), le noyau peut basculer de l’état de spin parallèle vers l’état de spin anti-parallèle et absorber la radiation électromagnétique. Dans le cas contraire, il n’y a pas d’absorption de la radiation électromagnétique. Ainsi, chaque noyau peut absorber une radiation électromagnétique de fréquence  bien caractéristique (appelée fréquence de Larmor ou fréquence de résonance) qui peut donner lieu à des informations sur l’environnement du noyau et de là, sur la structure de la molécule étudiée. Pour qu’il y ait absorption, il faut que :

∆E = h =  (h/2π)   B0. La fréquence de résonance est proportionnelle au champ magnétique B0 et au facteur  (appelé rapport gyromagnétique) qui est une caractéristique de chaque isotope.

Dans un spectromètre RMN, c’est la fréquence 0 que l’on fixe (dans le domaine des radiofréquences) et c’est l’intensité du champ magnétique que l’on fait varier, en ajoutant une composante parallèle ∆B0 au champ magnétique B0. La résonance est obtenue quand :

∆E = h0 =  (h/2π)   (B0 + ∆B0) Maintenant, si le champ magnétique observé par un noyau était seulement dépendant du champ magnétique externe, tous les noyaux d’une même molécule entreraient en résonance aux mêmes combinaisons de B0 et de radiofréquence et l’on n’observerait qu’un seul pic sur le spectre, ce qui ne présenterait aucun intérêt. Heureusement (!!!), les noyaux ne sont pas isolés et sont entourés d’autres atomes. Le champ magnétique B0 va induire d’autres champs magnétiques, appelés champs induits, au niveau des liaisons interatomiques. L’effet le plus souvent observé est celui des nuages électroniques qui entourent les noyaux. Les déplacements des électrons peuvent produire des petites boucles de courant produisant un champ magnétique local qui aura soit la même direction, soit une direction opposée par rapport à B0. De ce fait, le vrai champ observé par un noyau donné est la combinaison du champ externe et des champs induits :

Bvrai = B0 + Binduits En conséquence, des noyaux placés dans des environnements structuraux différents ne perçoivent pas les mêmes champs vrais, ils ne rentrent donc pas en résonance à la même fréquence ; on ne les observe donc pas à la même fréquence sur le spectre.

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Le spectre RMN est exprimé en ppm (partie par million). Ceci est dû au fait que l’intensité de la radiofréquence peut-être différente d’un appareil à un autre. Donc pour faire basculer un noyau donné, il faudra des valeurs différentes de B0 en fonction de la fréquence utilisée. Par exemple, pour un même proton, si la radiofréquence est de 60MHz, on observe un pic à 300Hz. Par contre, si la radiofréquence est de 120 MHz, le pic sera observé à 600Hz. Pour résoudre ce problème, on utilise le rapport  :

Position du pic en Hz = Radiofréquence en MHz Ainsi, si l’on reprend l’exemple précédent,  = 300/60 = 600/120 = 5 ppm (partie par million de la fréquence utilisée).

Le spectre est donc représenté de droite à gauche sur une échelle de 0 à plusieurs dizaines de ppm (cf. Fig. 4.9 ; 4.10 ; 4.11). Les signaux apparaissent à des valeurs données en ppm que l’on appelle déplacement chimique. Le déplacement chimique est le terme qui regroupe les effets de l’environnement atomique ou moléculaire sur la fréquence de Larmor du noyau considéré.

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