Ismi Nurrakhmawati (1113096000019) Andri Hermawan (11 (111309600002 13096000020) 0) Amalia Rahmawati (11 (111309600002 13096000021) 1)
Liquid Chromatography Mass Spectrometer (Kromatografi Cair Spektroskopi Massa)
LC-MS •
LCMS : kombinasi kombinasi metode analisis yang lebih spesifik antara kromatografi dan spektroskopi massa
•
LC-MS LC-MS memaduk memadukan an daya daya pemisa pemisahan han HPLC untu ntuk bahan ahan berat erat molek olekul ul besa besarr denga engan n kemampuan
MS
untuk
mendeteksi
dan
mengo mengonfi nfirma rmasi sikan kan identi identitas tas molek molekul ul secar secara a selektif. Aplikasi utamanya adalah di bidang penelitian
farmasi,
analisis
lingkungan,
pengujian makanan, dan kedokteran forensik.
LC-MS •
LCMS : kombinasi kombinasi metode analisis yang lebih spesifik antara kromatografi dan spektroskopi massa
•
LC-MS LC-MS memaduk memadukan an daya daya pemisa pemisahan han HPLC untu ntuk bahan ahan berat erat molek olekul ul besa besarr denga engan n kemampuan
MS
untuk
mendeteksi
dan
mengo mengonfi nfirma rmasi sikan kan identi identitas tas molek molekul ul secar secara a selektif. Aplikasi utamanya adalah di bidang penelitian
farmasi,
analisis
lingkungan,
pengujian makanan, dan kedokteran forensik.
•
•
LC LC dengan detektor indeks bias, elektrokim elektrokimia, ia, fluoresensi fluoresensi,, dan detektor UV-Vis akan menghas hasilkan dua dimensi data; yaitu, data yang mewakili kekuatan sinyal sebagai fungsi waktu. Bila digabung digabungkan kan dengan MS, Selain kekuatan sinyal, gabungan keduanya akan meng mengha hasi silk lka an data data spe spektr ktral massa yang dapat memberikan informasi berharga tentang berat mole moleku kul, l, str struktu ukturr, iden dentita titas, s, kuantitas, dan kemurnian dari sampel.
Sejarah •
•
•
•
•
•
Goldstein (1886): Keberadaan partikel bermuatan positif Wein (1898): ion bermuatan positif dapat dibelokkan dalam medan listrik dan magnet JJ Thomson (1913): isotop Neon "Bapak spektrometri massa"
Menunjukkan
1960: GC-MS antarmuka pertama 1969: Antarmuka pertama LC-MS dikembangkan (1UL / min aliran ke sumber EI). 1970: Perangkat transportasi diterapkan untuk LC / MS
Prinsip HPLC Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam
PRINSIP MS •
•
Dalam spektrometri massa, molekul sampel dalam fase uap dibombardir dengan elektron berenergi tinggi (70 eV) yang menyebabkan lepasnya satu elektron dari kulit valensi molekul tersebut. Molekul yang kehilangan satu electron akan menjadi suatu kation radikal (M)
•
•
+ e-
(M+.)
+ 2e-
Kation radikal tersebut mengandung semua atom-atom dari molekul asal, minus satu elektron, dan disebut ion molekul /molecular ion, dan dinyatakan dengan M+. . Sebagai hasil dari tabrakan dengan elektron berenergi tinggi, ion molekul akan mempunyai energi yang tinggi dan dapat pecah menjadi fragmen yang lebih kecil (kation, radikal atau molekul netral). M+.
m1+ + m.2
atau
M+.
m1+. + m2
Prinsip LCMS •
•
•
•
LC / MS adalah teknik analisa instrumen yang menggabungkan kekuatan pemisahan HPLC, dengan kekuatan deteksi spektrometri massa Menggunakan antarmuka ( interface) yang akan menghilangkan pelarut dan menghasilkan ion fasa gas, ditransfer ke optik dari spektrometri massa. mendapatkan spektrum dan identifikasi massa molekul untuk setiap puncak dielusi dari kolom kromatografi. Spektrum massa langsung dari sampel langsung diinfus tidak akan membedakan antara, komponen penyangga, kontaminan dan komponen lain dari campuran sampel.
INSTRUMENTASI
B A GA N SISTEM HPLC-MS detektor
kolom injektor
pompa
oven
Wadah solven integrator
WA DAH FA SE GERA K
Merupakan tandon berisi fase gerak Mempunyai sistem penyaring
Fasa Gerak Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.
Persyaratan fasa gerak HPLC: o Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis. o Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi. o Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. o Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun. o Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise). o Sesuai dengan detector.
POMPA Merupakan sistem agar fase gerak mengalir. Kinerja pompa yang diinginkan : Tekanan
yang dihasilkan tinggi
Fluktuasi
tekanan rendah
Kecepatan
aliran fase gerak tepat
INJEKTOR: Alat untuk pemasukan sampel ke dalam sistem HPLC
Pump
Pump
Column Column
[INJECT]
[LOAD]
Sistem sample loop injektor
posisi load pompa
Posisi inject
kolom pompa
sample loop
kolom
OVEN KOLOM – instrumen pemanas Syarat : 1. Keseragaman temperatur yang baik 2. Kestabilan temperatur yang baik 3. Ketepatan kontrol temperatur yang baik
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok : Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. •
•
DETEKTOR HPLC Yang umum dipak dipakai ai Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS) Detektor Photodiode Array (PDA) Detektor Fluorescence (RF) Detektor tor Kondu Konduktivi ktivitas tas (CDD) Detek Dete tekt ktor or Re Refr frak akti tive ve In Inde deks ks (R (RID ID)) De Detektor tor Elek Elektro trokimia kimia (ECD) Detek LCMS Detektor spektrometer massa
Detektor Spektroskopi Massa
Sumber Ion •
•
•
Siste Sistem m LC/MS LC/MS terdah terdahulu ulu menggu menggunak nakan an antarm antarmuka uka yang yang tidak baik memisahkan molekul fase gerak dari molekul analit (langsung masuk cairan, thermospray) Pengenalan teknik atmospheric pressure ionization (API) sangat memperluas jumlah senyawa yang dapat berhasil dianalisis dianalisis dengan LC / MS. Dalam ionisasi tekanan atmosfer (API) , mole moleku kull anal analit it diio diioni nisa sasi si terl terleb ebih ih dahu dahulu lu pada pada teka tekana nan n atmo atmosf sfer er,, ion ion anal analit it kemu kemudi dian an dipi dipisa sahk hkan an dari dari mole moleku kull netral.
IONISASI SPEKTROMETRI MASSA Berdasarkan pola ionisasinya, spektrometer massa dibagi menjadi 1. EI-MS: Elektron Impact - Mass Spectrometer 2. CI-MS:Chemical Ionization-Mass Spektrometer 3. FAB-MS :Fast Atom Bombardment - Mass Spectrometer 4. FD-MS : Field Desorption - Mass Spectrometer No 1. disebut hard ionization, No. 2, 3, 4 disebut soft ionization
EI-MS: Elektron Impact - Mass Spectrometer •
•
Pola ionisasi sampel dengan berkas elektron berenergi tinggi (electron bombardment). Karena energinya tinggi, maka fragmentasi banyak dan kelimpahan M +. relatif kecil. Intensitas puncak ion molekul kecil, bahkan sering tidak nampak, sehingga kadang menyulitkan interpretasi spektra.
EI Interface
Electron impact ionization
CI-MS:Chemical IonizationMass Spektro-meter •
•
•
Pola ionisasinya menggunakan gas (mis: metan, isobutan atau ammonia) yang diionkan. Energi ionisasi lebih kecil dibanding EI-MS, sehingga fragmentasinya lebih kecil dan kelimpahan relatif M +. tinggi. Dalam spectra CI, informasi mengenai BM molekul sample diperoleh dari protonasi molekul sample, dan harga m/z yang diperoleh adalah satu unit lebih besar dibanding BM yang sesungguhnya.
•
R + e ---> R+. + 2e
•
R+. + RH ---> RH+ + R.
•
RH+ + S ---> SH+ + R (R = reagent, S = sample, e = electron, . = radical electron , H = hydrogen)
chemical ionization
FAB-MS :Fast Atom Bombardment - Mass Spectrometer Pola ionisasinya menggunakan 'fast atoms', misalnya He, Ne, Ar. Biasanya sample dilarutkan dulu dalam suatu matrix, misalnya gliserol kemudian dibombardment dengan fast atom mis Ne
Particle beam interface
FD-MS : Field Desorption Mass Spectro-meter •
•
•
Pola ionisasinya menggunakan medan magnet. sample diletakkan pada filament dan dipanaskan secara gradual menggunakan medan listrik (electric field). Sample ionise by electron tunneling. Ions are M+ and [M+Na]+
Analisa Massa Ada banyak analisa massa yang dapat digunakan dalam LC / MS. •
Quadrupole
•
Time-of-flight
•
Ion trap
•
Fourier transform-ion cyclotron resonance
Detectors 3 tipe detektor yang digunakan untuk analisis •
Electron multipliers,
•
Dynolyte photomultiplier,
•
Microchannel plates.
Keuntungan Keuntungan utama yang dimiliki MS adalah penggunaan tandem MSMS. Detektor dapat diprogram untuk memilih ion tertentu pada fragmen. Proses ini pada dasarnya adalah teknik seleksi, namun sebenarnya lebih kompleks. Kuantitas yang diukur adalah jumlah molekul fragmen dipilih oleh operator. Selama tidak ada gangguan atau penindasan ion, pemisahan LC bisa sangat cepat. Hal ini biasa saat sekarang untuk memiliki waktu analisis 1 menit atau kurang oleh-MS deteksi MS, dibandingkan dengan lebih dari 10 menit dengan deteksi UV.
Aplikasi
Farmakokinetika LC-MS sangat umum digunakan dalam studi farmakokinetik tentang obat-obatan dan dengan demikian merupakan teknik yang paling sering digunakan di bidang bioanalysis . Studi ini memberikan informasi tentang seberapa cepat obat akan dibersihkan dari aliran darah hati, dan organ tubuh. MS digunakan untuk hal tersebut karena sensitivitas tinggi dan spesifisitas yang luar biasa dibandingkan dengan UV (selama analit dapat sesuai terionisasi), dan waktu analisis yang singkat.
Proteomika LC-MS juga digunakan dalam studi proteomik mana lagi komponen dari campuran kompleks harus dapat dideteksi dan diidentifikasi dalam beberapa cara. LC-MS bottom-up proteomik untuk pendekatan proteomik umumnya melibatkan pencernaan protease dan denaturasi (biasanya tripsin sebagai sebuah protease, urea untuk denaturasi struktur tersier dan iodoacetamide untuk topi residu sistein) diikuti oleh LC-MS dengan massa peptida sidik jari atau LC-MS/MS (tandem MS) untuk menurunkan urutan peptida individu. LC-MS/MS paling umum digunakan untuk analisis sampel massa proteomic peptida kompleks mana mungkin tumpang tindih bahkan dengan spektrometer massa resolusi tinggi. Contoh cairan serum biologis yang kompleks seperti manusia dapat dijalankan dalam sistem LC-MS/MS modern dan menghasilkan lebih dari 1000 protein yang diidentifikasi, asalkan sampel pertama kali dipisahkan pada gel SDS-PAGE atau HPLC-SCX.
Perkembangan Obat LC-MS sering digunakan dalam pengembangan obat pada berbagai tahapan termasuk Pemetaan Peptida, Pemetaan Penyandi Glikoprotein, Produk Dereplication Alam, Pemutaran Bioaffinity, Dalam Vivo Drug Screening, Stabilitas Pemutaran metabolic, Identifikasi metabolit, Identifikasi Pengotor, Identifikasi Degradant, Kuantitatif Bioanalysis , dan Kualitas Kontrol.
OLEH: KHALED.
M. ALAKHALI
ABSTRAK Sederhana, sensitif dan selektif kromatografi cair dengan spektrometri massa digunakan untuk penentuan simvastatin dalam plasma manusia telah dikembangkan, setelah simvastatin diekstraksi oleh etil asetat dan heksan (90: 10%, v / v) menggunakan lovastatin sebagai internal standar. Zat terlarut dipisahkan pada kolom C 18 dengan fase gerak yang terdiri dari campuran asetonitril dan air (75: 25%, v / v) 500 μL / min. Ion produk adisi telah terdeteksi oleh pemantauan reaksi yang dipilih dalam mode ion positif (m / z: 436 dan m / z: 422 untuk simvastatin dan lovastatin masing-masing). Kurva kalibrasi linier 0,5-20 ng / mL. Seluruh waktu run untuk analisis hanya 5 menit. Batas bawah kuantisasi 0.5ng / mL telah dicapai. Presisi dan akurasi untuk pengujian yang ditentukan dalam satu hari dan variasi antar-hari pada tiga konsentrasi 3, 6 dan 12 ng / mL. Intraday koefisien variasi yang ditemukan menjadi kurang dari 10% dan akurasi yang antara 97,50% dan 109,50%. Antarhari koefisien variasi yang ditemukan kurang dari 10% dan akurasi yang ditemukan antara 98,30% dan 106,60%. kromatografi cair dengan metode spektrometri massa untuk penentuan simvastatin dalam plasma manusia menawarkan beberapa aspek yang unik. Pemisahan ini sederhana dan cepat. Volume sampel plasma yang digunakan dalam uji ini hanya 200 μL.
KATA KUNCI: kromatografi cair; spektrometri massa; simvastatin; plasma manusia
PENDAHULUAN
APA ITU SIMVASTATIN ?
Simvastatin adalah salah satu obat statin utama menghambat 3-hidroksi-3methyl-glutaryl-koenzim A (HMG-CoA) reduktase yang mengkatalisis konversi HMG-CoA ke mevolanate, yang merupakan awal langkah membatasi laju kolesterol biosintesis dalam tubuh. Agen ini sangat efektif dalam mengurangi kolesterol total dan tingkat lipoprotein densitas rendah. Obat ini sangat efektif mengurangi agen kolesterol, yang umumnya digunakan untuk pengobatan hiperkolesterolemia
Penentuan kuantitatif simvastatin telah dilaporkan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dengan detektor ultra violet (UV). HPLC dengan detektor fluoresence, kromatografi gas spektrometri massa (GC/MS) dan kromatografi cair spektrometri massa (LC-MS).
Metode
HPLC-UV tiak cukup peka untuk menentukan kadar obat dalam plasma dosis terapi Metode HPLC-fluorescene, sampel perlu derivat kompleks sebelum dianalisis. Meskipun GC-MS merupakan metode yang sensitif dan cukup selektif untuk menganalisis simvastatin pada tingkat tapeutik, namun metode ini memerlukan tahap ekstraksi dan pembersihan yang rumit Metode ini menjelaskan metode LC-MS yang sederhana, sensitif dan cepat untuk kuantifikasi simvastin dalam plasma manusia pada kisaran konsentrasi 0,5 hingga 20 ng/mL
METODE PENELITIAN
ALAT DAN BAHAN
Simvastatin dengan berat molekul 418,57 dan lovastatin standar internal dengan molekul Berat 404,54 yang disediakan oleh Ranbaxy (Sungai Petani, Malaysia)
Asetonitril (IKelas HPLC) diperoleh dari Merck Darmstadt Jerman
Heksana (kelas analitis) diperoleh dari Merck Darmstadt Jerman
Etil asetat dan asam format (kelas analitis) yang diperoleh dari Fisher Perusahaan ilmiah internasional UK
Air dimurnikan dan deionisasi menggunakan Milli-Q sistem filtrasi pertukaran ion. Air disaring melalui WCN 0.45 um filter Whatman Ltd, UK
KONDISI KROMATOGRAFI Kromatografi dan sistem deteksi massa dilakukan dengan menggunakan Finnigan LCQ-DUO sistem, yang terdiri dari pompa quartenary, ponsel fase unit vakum degassing, dioda UV-Vis detektor array, detektor spektrometri massa dan autosampler. Sistem ini dikontrol menggunakan software Excalibur (Finnigan) yang berjalan di bawah sistem operasi Windows NT.
Kolom C18 5μm (3,9, id x 50 mm, 5 m) di suhu kamar
Fase Gerak asam format dan asetonitril (75: 25%, v / v)
Sistem LC dioperasikan pada 500mL/menit
KONDISI KROMATOGRAFI
Fase Gerak diperkenalkan ke sumber ionisasi electrospray dengan:
Aliran Gas: 30 mL/menit Tekanan: 40 ± 10 psi Suhu: 250oC Tegangan Kapiler: 4000V Volume Injeksi: 20 uL tidak lebih dari 20% dari total sampel yang tersedia untuk injeksi pengembangan metode, penentuan ion dilakukan untuk simvastatin dan internal lovastatin standar dalam modus positif dengan rentang massa dipilih antara 200-500, dengan menyuntikkan konsentrasi yang berbeda campuran kedua senyawa dengan fase gerak ke spektrometri
PERSIAPAN LARUTAN STOK DAN KALIBRASI STANDAR
Larutan stok simvastatin disiapkan dalam asetonitril (1mg / mL) dan diencerkan dengan asetonitril dan air 80: 20%.
Larutan stok lovastatin disiapkan dalam asetonitril dan air 80: 20% (1mg / mL) dan diencerkan dengan asetonitril dan air 80: 20%
Stok disimpan pada suhu 20oC dan dibuang satu bulan setelah dibuat
Dibuat standar kalibrasi 0,5, 1, 5, 10, 15 dan 20 ng / mL
Kalibrasi kurva untuk simvastatin dihasilkan dengan mengukur peak perbandingan luas dari analit dengan standar internal.
PROSEDUR EKSTRAKSI
Sampel plasma manusia (0.2mL) dipindahkan ke dalam tabung tes kaca dan diikuti oleh penambahan 50 uL internal standar (10 ng / mL)
3 mL campuran pelarut etil asetat dan heksana (90: 10%, v / v) ditambahkan ke tabung dan vortex selama 30 detik
sentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 min
Residu kering dilarutkan dengan 100 uL asetonitril dan air (80: 20%, v / v), vortex selama 15 detik dan 20 uL campuran disuntikkan ke dalam kromatografi
fase organik pada bagiatan atas ditransfer ke tabung lain dan diuapkan sampai kering dibawah nitrogen pada 40oC
VALIDASI PENGUJIAN
Koefisien variasi (CV) dan ketepatan kuantifikasi pada satu hari yang sama dinilai menggunakan enam ulangan pada 3, 6 dan 12 ng / mL. Sementara assay antar-hari dievaluasi dengan menggunakan lima ulangan pada konsentrasi yang sama, berulang-ulang selama lima hari yang berbeda.
EFISIENSI EKSTRAKSI
Efisiensi ekstraksi simvastatin berada pada konsentrasi rendah, sedang dan tinggi 3, 6 dan 12 ng / mL, dengan membandingkan daerah puncak dari ekstrak terlarut dibandingkan standar air.
HASIL DAN PEMBAHASAN
KONDISI SPEKTROMETRI MASSA DI LCMS
PEMISAHAN
Kromatogram dari simvastatin di plasma manusia ditunjukkan pada Gambar. 2 dan 3 dengan waktu retensi kurang dari 5 menit berada dicapai untuk kedua simvastatin pada 0,5 dan 12 ng / mL dengan lovastatin standar internal pada 10 ng / mL. Simvastatin dielusi pada 4,1-4,2 min dan standar lovastatin internal pada 3,2-3,3 min.
Hasil untuk kurva kalibrasi (n = 5) menunjukkan linearitas yang baik (r = 0,995) konsentrasi 0,5-20 ng / mL, dengan persamaan y = 0,0873 x + 0,0425 (y = konsentrasi simvastatin dalam ng / mL; x = daerah simvastatin/ daerah lovastatin). Hasil intraday dan interday yang ditunjukkan pada Tabel 1 dan Tabel 2
TABLE 1 INTRA-DAY COEFFICIENT OF VARIATION AND ACCURACY OF MEASUREMENT OF SIMVASTATIN IN HUMAN PLASMA OF INDIVIDUAL SAMPLES (N=6) Spike concentration (ng/mL)
Found concentration (ng/mL)
Coefficient of
3 6 12
3.30 ± 0.33 5.90 ± 0.53 12.00 ± 0.80
9.97 9.00 6.67
The v alu e are m ean ±S.D.
variation (CV) (%)
Accuracy (%) 109.50 97.50 99.90
TABLE 2 INTER-DAY COEFFICIENT OF VA RIATION A ND A CCURA CY OF MEA SUREMENT OF SIMVA STATIN IN HUMA N PLA SMA OF INDIVIDUAL SA MPL ES (N=5)
Spike concentration (ng/mL)
Found concentration (ng/mL)
Coefficient of
3 6 12
3.20 ± 0.30 5.90 ± 0.39 11.90 ± 0.26
9.40 6.50 2.20
The v alue are m ean ±S.D.
variation (CV) (%)
Accuracy (%) 106.70 98.30 99.20
PEMULIHAN
Perolehan kembali analit dari plasma ditentukan dengan mengekstraksi sampel kontrol plasma yang diketahui mengandung sejumlah masingmasing analit, menambahkan standar internal selama ekstraksi, dan membandingkan rasio luas puncak dengan rasio dari analit standar internal non-diekstraksi yang ditambahkan. Pemulihan simvastatin dari plasma manusia kurang lebih adalah 87,50 untuk 97.00% dan digambarkan dalam Tabel 3. TABLE 3 EXTRA CTION EFFICIENCY OF SIMVAS TATIN (N=3)
Sample concentration (ng/mL)
Extracted Concentration Mean ( CV%)
Non-extracted Concentration Mean (CV%)
Recovery %
3 6 12
3.20 (3.1) 5.90 (3.7) 11.90(10)
3.30 (6.2) 6.40 (8.4) 13.60 (2.2)
97.00 92.20 87.50
RE-INJEKSI PROSES VALIDASI
Masing-masing kualitas konsentrasi kontrol untuk proses reinjeksi dihitung untuk menyetujui ketepatan proses re-injeksi. Presisi yang diperoleh dari nilai rata-rata dari masing-masing reinjeksi set tidak melebihi 15% (toleransi sampai 20% pada konsentrasi LOQ). Data re-injeksi proses validasi disajikan pada Tabel 4 TABLE 4 RE-INJECTION PROCESS DATA U SING LC-MS M ETHOD Concentration. Low (3 ng/mL) Medium (6 ng/mL) High (12 ng/mL)
Mean Original value 3.19 6.00 11.97
CV(%) 10.80 7.70 2.50
Mean Re-injection value 3.21 5.99 11.82
CV (%)
Variation (%)
5.00 6.04 4.36
5.80 1.66 1.86
