Laporan Kromatografi
Laporan Kromatografi Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. ( Imam Haqiqi, Sohibul,2008 ) Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil. ( Anggraeni, Megawati,2009 ) Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa tekhnik kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairanpadatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. ( Anggraeni, Megawati,2009 ) Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning. a. Kromatogram Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan warna yang merupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna. Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis : Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk / tinta ikut naik ke atas. Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan pada sebuah gelas kimia bertutup berisa pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari
pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak dari perbedaan bercak warna. b. Perhitungan nilai Rf Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing. Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan. Pengukuran berlangsung sebagai berikut : Nilai Rf untuk setiap warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini didasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang ditempuh oleh bercak warna masing-masing. Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan. Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut : Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen / jarak yang ditempuh oleh pelarut c. Mengidentifikasi senyawa-senyawa Dimisalkan campuran asam amino yang ingin diketahui senyawanya.Caranya: Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak kecil yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M dan asam amino yang telah diketahui ditandai 1-5. Metode Praktikum Alat dan Bahan : 1. Alat a. Alumunium foil b. Beaker glass c. Kertas saring whatman d. Lidi e. Klip f. Blower 2. Bahan a. Safranin b. Pewarna Makanan c. Methylene Blue d. Minyak Cara kerja : 1. Potong kertas whatman sesuai kebutuhan 2. Garis dengan pensil dengan jarak 2 cm dari sisi bawah kertas 3. beri tanda titik tempat sampel akan diletakkan dengan jarak 1,5-2 cm jarak tiap sampel
4. Letakkan sampel pada tiap titik sebanyak 10 ul menggunakan pipet kapiler 5. Masukkan pelarut dengan ketinggian 1-1.5 cm ke dalam bejana 6. Masukkan kertas whatman yang telah ditetesi sampel 7. Lakukan pengembangan selama 5-10 menit atau sampai eluen atau pelarut hampir mencapai batas ketinggian 2 cm dari batas atas, atau dengan ketinggian secukupnya sesuai keperluan, jika pelarut sampai tengah kertas saring telah menunjukkan pemisahan sudah biasa ditentukan. 8. Sampel dibiarkan dengan angin-angin / dengan blower 9. Berilah tanda batas pelarut bagian atas 10. Lakukan pengamatan, tulis hasil dan pembahasan terhadap senyawa dan komponen pada kromatogram Hasil dan Pembahasan Kromatografi lapis tipis adalah pemisahan zat berdasarkan kepolarannya, prinsipnya ada dua yakni partisi dan absorbsi. Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi pembagian (partition chromatography). Metodenya ada dua fase gerak ( pelarutnya ) dan fase diam ( sampelnya ). Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairanpadatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Pelarut atau fase gerak : Methil asetat : heksan : methanol = 1 : 1 : 1 Methil asetat sifatnya semi polar Heksan sifatnya non polar Methanol sifatnya polar Sampel yang digunakan adalah safranin, pewarna makanan, methylen blue, dan minyak. Setelah pelarut mendekati atas kertas, kertas kemudian diambil dan dikeringkan dengan blower. Kemudian dilihat dengan sinar UV yang berfungsi membedakan zat yang berfluorescent dan tidak / sampel mana yang bercahaya. Bila arna semakin ke atas semakin non polar, semakin ke bawah polar bila benda di tengah-tengah semi polar. Setelah menjadi kristal kemudian dicari Rf ( Retardation Factor ). Rf dari masing-masing sampel adalah safranin ( merah ) = 0,97, pewarna makanan ( orange ) = 0,27, methylen blue ( biru )= 0,73, dan minyak ( bening ) = 0,85. Safranin paling menyala merupakan zat yang paling berfluorescent atau bercahaya. Kromatografi lapis tipis juga bisa dilakukan pada sudstansi yang tidak berwarna : a. Menggunakan pendarflour fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendarflour ketika diberikan sinar ultraviolet ( UV ). Itu berarti jika menyinarkannya dengan sinar UV akan berpendar. Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak ini tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa penyinaran sinar UV pada lempengan akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak seperti bidang kecil yang gelap. Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, dan tandai posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Seketika anda mematikan sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.
b. Menggunakan bercak secara kimia Untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa - senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu. Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan. (Anggraeni, 2009) Kesimpulan dan Saran 1. Kesimpulan Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diketahui bahwa : a. kromatografi lapis tipis adalah pemisahan zat berdasarkan kepolarannya b. Prinsip dari kromatografi adalah partis ( pemisahan zat) dan absorbsi ( penyerapan zat ) c. Metode kromatografi adalah fase gerak / pelarutnya dan fase diam / sampelnya d. Rf dari masing-masing sampel adalah safranin ( merah ) = 0,97, pewarna makanan ( orange ) = 0,27, methylen blue ( biru )= 0,73, dan minyak ( bening ) = 0,85. Safranin paling menyala merupakan zat yang paling berfluorescent atau bercahaya. 2. Saran a. Sebaiknya dilakukan praktikum pada semua jenis kromatografi b. Tidak boleh menggunakan pena untuk memberi tanda titik pada kertas karena akan terbawa keatas tandanya Daftar Pustaka Anggraeni, Megawati. 2009. Kromatografi Lapis Tipis. http://greenhati.blogspot.com/2009/01/kromatografi-lapis-tipis.html. diakses tanggal 03 juni 2011 pukul 14:00 wib Hafni, Aswita. 2010. Kromatografi Kertas. http://mimin-mien.blogspot.com/2010 / 03/kromatografi-kertas.html. diakses tanggal 03 juni 2011 pukul 14:10 Haqiqi, Sohibul Himam. 2008. Kromatografi Lapis Tipis. nadjeeb.files.wordpress .com / 2009/10/kromatografi.pdf Kirimkan Ini lewat EmailBlogThis!Berbagi ke TwitterBerbagi ke Facebook
I.
NOMOR PERCOBAAN : VII
II. NAMA PERCOBAAN
: KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS ASAM AMINO
III. TUJUAN PERCOBAAN : 1. Mengetahui cara pemisahan asam amino dengan Kromatografi Lapis Tipis 2. Mengetahui harga Rf asam amino IV. LANDASAN TEORI
Kromatografi adalah suatu metoda pemisahan campuran senyawa atau komponen tersebut antara dua fasa yaitu a. Fasa diam ( absorben atau lapisan penyerap ) Betindak sebagai pemisah campuran tersebut. Contoh pelarut yang digunakan adalah slika gel, aluminium oksida, selulosa. Namun yang paling banyak digunakan adalah slika gel dan alumunium oksida karena kadar air yang digunakan berpengaruh terhadap daya. b. Fasa gerak ( Eluen ) Bertindak sebagai pembawa campuran tersebut . komponenkomponen campuran akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda akibat hambatan dari fase diam sehingga terjadi pemisahaan. Prinsip KLT adalah untuk menentukan atau memisahkan campuran senyawa menjadi komponen-komponennya secara tepat. Mudah dan cepat berdasarkan perbedaan dari daya serap masing-masing komponen berdasarkan perbedaan distribusi. Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi yang berdasarkan pada perbedaan kecepatan bergerak asam-asam amino tersebut pada pH tertentu. Keuntungan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah noda yang ditimbulkan tidak banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya sedikit saja yang diperlukan, juga tidak memerlukan waktu yang banyak. Kromatografi jenis ini menggunakan alumunium oksida, serbuk selulosa atau silika gel sebagai adsorben yang berupa lapis tipis yang diletakkan di atas selmbar kaca. Seperti halnya kromatografi kertas, larutan yang mengandung beberapa asam amino diteteskan di atas adsorben dan dibiarkan bergerak. Penggunaan fase gerak pada kromatografi lapis tipis biasanya menggunakan pelarut seperti : metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform. Sebagai persiapan untuk menggunakan kromatografi lapis tipis, bubk serbuk fasa diam diratakan terlebih dahulu pada lempeng kaca, ketebalan kaca tergantung pada tujuan pemisahan kromatografi. Untuk tujuan analisis, tebalnya kira0kira 0,25 mm sedangkan untuk praparatif 5 mm. Kecuali dipakai lapisan tipis gel maka setalah bubur merata maka lempeng dikeringkan. Kromatografi lapis tipis (KLT) seperti halnya kromatografi kertas tidak mahal dan sesederhan melakukannya, kromatografi ini memiliki keuntungan kecepatan diatas kromatografi kertas, prosesnya mungkin memerlukan waktu kira-kira setengah jam.
Kromatografi lapis taipis sangat terkenal dan digunakan secara rutin dalam banyak laboratorium. Teknik KLT ini dikembangkan pada tahun 1983 oleh Ismailoff dan Schraibar. Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fasa diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawasenyawa yang terpisahkan. Pemilihan sistem pelarut dan komposisi larutan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan digunakan suatu mikro-syiringe (penyuntik berukuran mikro). Sampel diteteskan pada salah satu bagian tepi pelat kromatografi (sebanyak 0,01 – 10 g zat). Pelarut harus nonpolar dan mudah menguap. Kolom-kolom dalam pelat dapat diciptakan dengan mengerok lapisan vertikal searah gerakan pelarut. Zat-zat berwarna dapat dilihat langsung, tetapi juga dapat digunakan reagen penyemprot untuk melihat suatu bercak suatu zat. Asam kromat seringdigunakan sebagai pelarut organik. Untuk menempatkan posisi suatu zat, reagen dapat juga disemprotkan pada bagian tepi saja. Bagian yang dipeolrh lainnya dapat diperoleh kembali tanpa pengotoran dari reagen dengan pengerokan setelah pemisahan selesai. Kromatografi lapis tipis memiliki keuntungan jika dibandingkan dengan kromatografi kertas, diantaranya : 1. Noda zat yang timbul sesudah kromatografi tidak banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya sedikit saja senyawa yang diperlukan. 2. Tidak memerlukan waktu yang banyak 3. Senyawa-senyawa yang tidak menguap serta terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT 4. Dapat memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut. Banyak senyawa-senyawa baik organik maupun anorganik yang dapat dipisahkan lewat kromatografi lapis tipis. Dengan menggunakan kromatografi lapis tipis maka akan didapatkan pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang lebih tinggi, dan dapat dilaksanakan dengan cepat. Pada KLT terdapat adsorben yang bertindak sebagai fase stationer. Empat macam adsorben yang umum dipakai adalah silica gel (asam silikat), alumina (alumina oxide),
kieselguhr (iatomeous earth), dan selulosa. Dari keempat macam adsroben di atas, yang sering dipakai adalah silika gel. Selain terdapat fasa stationer atau fasa diam, KLT juga memiliki fase gerak(eluen), yaitu pelarut dalam kromatografi lapis tipis. Sistem berair yang digunakan dan contoh pelarut organik dalam seri pelarut miksotrop yang meliputi sifat hidrofob menaik seperti metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, kloroform (kloroform yang distabilkan dengan etanol), ebnzen, sikloheksana, dan eter petroleum. Kromotografi lapisan tipis dikembangkan oleh Egon Stahl dengan menempelkan adsorben pada lempengan gelas, sehingga merupakan lapisan. Komponen yang lebih kuat diserap oleh adsorben akan lebih lambat naiknya dari komponen yang kurang diserap, adsorben akan lebih cepat naiknya ke plat, sehingga pada plat akan terdapat komponenkomponen yang tersusun sepanjang plat. Kondisi optimum suatu pemisah merupakan hasil kesesuaian antara absorben dan eluen. Untuk mengidentifikasi komponen yang satu dengan yang lainnya digunakan faktor refensi (Rf).
Jarak ynag ditempuh komponen dapat diperbesar menggunakan pelarut polar, sebaliknya ukuran identitas bercak dapat untuk mempekirakan kadar dari masing-masing komponen yang terdapat dalam campuran. Untuk zat yang bersifat asam / basa kuat yang tidak dapat dilakukan dengan kromotografi kertas dapat dipisahkan dengan KLT. Pemisahan pada KLT didasarkan pada: - Penyerapan, pembagian, pertukaran ion, dan gabungan dari ketiganya. Faktor-faktor yang mempengaruhi Rf adalah: Adanya ion, Kesamaan larutan lainnya, Adanya kation dlam kosentrasinya. Faktor yang mempengaruhi gerak dan harga Rf: Sifat dari penyerap dan derajat aktivitas, Struktur kimia dari senyawa dipisahkan, Kerapan dari satu pasang penyerap, Pelarut
V. ALAT DAN BAHAN 1. alat :
Bahan
a) pelat kromatografi
silika gel
b) selembar kaca
pelarut etanol
c) penggiling
larutan ninhidrin
d) beker gelas
larutan Kuprinitrat
e) pengaduk magnetik
larutan asam amino (arginin, asam
f)
glutamate,histidin dan alanin)
gelas ukur
g) pipet tetes
aquadest
h) penyemprot i)
penggaris
j)
pensil
VI. PROSEDUR PERCOBAAN Pembuatan lapis tipis. Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbag 25 gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik sampai homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam. Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa. Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5 – 2,0 ug dalam 0,5 ul, diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan jarak kirakira 1 cm antara dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubang-lubang yang kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda. Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering. Ruang Kromatografi. Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen. Cara melakukan elusi. Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering, dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah kromatografi mendaki. Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10 cm.
Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat diambil dan dikeringkan pada suhu kamar. Cara perwarnaan. (a) dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerakj yang dipakai bersifat alkali. Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit. Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose. (b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial). Maka akan terjadi ikatan komplek Cu-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap amonia. Juga plat tidak boleh terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. walau disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifta irreversibel.
VII.
HASIL PENGAMATAN Sampel Arginin Asam Glutamat Histidin Alanin Sampel
VIII.
Jarak 7,8 cm 8,5 cm 3 cm -
Warna Biru Merah Ungu -
REAKSI KIMIA
IX. ANALISA DATA Menghitung harga Rf, yaitu perbandingan antara jarak yang ditempuh asam amino dengan jarak yang ditempauh pelarut dari awal hingga garis akhir. 1. Pada Arginin, 2. Pada Asam Glutamat, 3. Pada Alanin, X. PEMBAHASAN Pada percobaan mengennai kromatografi lapis tipis ini dilakukan untuk mengetahui harga Rf dari beberapa macam asam amino yang diujikan. Asam amino yang diuji dalam
percobaan ini ialah arginin, asam glutamate, histidin dan alanin . keempat asam amino ini mewakili masing-masing dari golongan asam amino Pada percobaan ini kaca yang digunakan harus benar-benar bersih bebas dari lemak oleh karena itu dibersihkan menggunakan deterjen, dan dikeringkan di udara. Fase gerak dan fase diamnya adalah etanol dan silica gel. Pada awalnya dilakukan pembuatan lapisan dari silica gel. pembuatan lapisan tipis dengan menambahkan 25 gr silika gel dengan 50 ml air yang dituangkan kedalam plat kaca. Kami melakukan pengulangan beberapa kali karena lapisan silica gel kami pada awalnya terlalu tebal sehingga mudah hancur dan juga permukaannya bergelombang. Oleh karena itu untuk membuat lapis tipisnya frame pada pinggiran kacanya harus dibuat rata serta pada saat penarikan seilikanya harus dalam satu kali tarikkan agar permukaannya tidak bergelombang. Pada penetesan asam amino perlu dilakukan secara hati-hati agar lapis tipis silika gelnya tidak rusak. Penetesan asam amino yang kami lakukan dengan jarak 1,5 cm dari tepi bawah. Eluen yang akan dijalankan diukur sepanjang 10 cm. Setelah dilakukan penetesan asam amino maka eluen siap dijalankan ( dengan etanol). Eluen pun berjalan tergantung dengan lapis silikan gel yang dibuat. Bila lapisan silika gel yang kita buat terlalu tebal maka eluen pun akan berjalan lambat, dan juga sebaliknya. Oleh karena itu, pembuatan lapisan silikanya diusahakan setipis mungkin dan merata. Dan bila sudah sampai 10 cm, maka eluen yang berjalan dihentikan. Kemudian dikeringkan. Untuk melihat bercak noda dari jarak asam amino dapat disemprotkan dengan larutan ninhidrin agar terbentuk warna. Di sini, ninhidrin berfungsi untuk melacak jalannya asam amino dengan menimbulkan warna merah pada asam amino. Kemudian, plat kacanya harus dikeringkan. Selain itu, warna yang terbentuk tidaklah stabil. Maka perlu adanya penyemprotan larutan lagi dengan larutan Kuprinitrat. Sehingga terbentuklah noda yang berwarna ungu. Hal ini terjadi karena terbentuknya Cu-ninhidrin. Bagus tidak hasilnya sangat dipengaruhi oleh tebal atau tipisnya silika gel yang dibuat. Setelah disemprot, pada silica gel muncul bercak – bercak atau noda. Noda yang dihasilkan untuk argini berwarna biru, asam glutamat merah sedangkan alanin berwarna unguuntuk histidin dan larutan sampel tidak menimbulkan bercak warna sehinggga dapat disimpulkan bahwa larutan sampel adalah histidin. Dari analisa data yang diperoleh, Rf untuk teori dan praktek agak berbeda. Hal ini dapat saja disebabkan oleh :kesalahan pada saat membuat lapisan silika gelnya, kesalahan
pada pembuatan larutan sampel yang digunakan, penetesan sampel pada plat yang tidak merata serta dengan jarak yang terlalu dekat. Dari hasil Rf yang diperoleh tidak sama dengan data Rf pada handbook. Hal ini dapat disebabkan oleh kesalahan pada saat membuat lapisan silika gelnya, membuat sampel larutan, suhu saat kromatografi serta penetesan sampel yang tidak merata serta jaraknya terlalu dekat .
XI. KESIMPULAN 1. Pada Pembuatan lapis tipis, plat kacanya yang digunakan harus benar-benar terbebas dari lemak, karena bila ada dapat mengganggu jalannya kromatografi. 2. Kromatografi merupakan salah satu cara untuk melakukan pengidentifikasikan suatu asam amino salah satunya kromatografi lapis tipis. 3. Dengan menggunakan silika gel sebagai fase diam serta eluen (fase gerak)nya adalah etanol. 4. Pengidentifikasian asam amino dengan melihat noda atau bintik yang dihasilkan, sehingga kita dapat menghitung Rf dari asam amino dengan cara membandingkan jarak yang ditempuh oleh asam amino dengan jarak yang ditempuh oleh eluen pada plat. 5. Untuk memberikan warna pada noda atau bintik yang dihasilkan kita dapat menggunakan larutan ninhidrin dan larutan kuprinitrat sebagai penstabil warnanya karena terjadi ikatan kompleks Cu- ninhidrin yang berwarna.
XII.
DAFTAR PUSTAKA
Lehninger, 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: ERLANGGA Poedjadi, Anna, 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : UI Khopkar, S.M, 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press
XIV.
JAWABAN PERTANYAAN
1. menganalisa secara kualitatif dengan cara kromatografi lapis tipis satu dimensi. Sautu larutan asam amino yang bersedia. Dan hitung berapa harga Rfnya? Jawab : 25 gram silica gel dalam 50 ml air diaduk sampai homogen, kemudian dituangkan ke atas lempeng kaca yang telah diukur pinggir kanannya 2 cm dan ditempeli dengan plester. Setelah itu larutan silica gel dituangkan dan diratakan. Diamkan selama semalam. Setelah kering silica gel tersebut dikur dari bawah sepanjang 2,5 cm dan diberikan tanda atau garis. Pada garis itu ditotolkan dengan asam amnio, masing-masing adalah alanini, tripthofan, dan arginin. Lalu masukkan plat tersebut ke dalam ruang kromatografi yang telah diisi dengan eluen (etanol 95%). Stelah itu dikeringkan. Kemudian disemprotkan engan ninhidrin dan dikeringkan kemabli selama 30 menit. Kemudian disemprotkan kembali dengan kuprinitrat. Setelah itu diukur jarak asam amino tersebut adalah sebagai berikut serta harga Rf nya : Dari hasil pengamatan diketahui jarak yang ditempuh oleh pelarut untuk plat adalah 10 cm. sedangkan untuk asam amino adalah : Harga Rf = Maka : 1. Pada Arginin, 2. Pada Asam Glutamat, 3. Pada Alanin,
2. Tuliskan reaksi antara ninhidrin dengan asam amino!
3. Sebutkan factor-faktor yang mempengaruhi Rf pada KLT? Jawab : Kepolaran senyawa, jenis pelarut, jarak penetesan, dan fasa diam (adsorbennya).
4. Terangkan bagaimana orang melakukan analisa kuantitatif suatu zat tertentu dengan cara kromatografi lapis tipis? Jawab : Dengan menyemprotkan lempeng dengan asam sulfat 50% atau 25% dalam eetanol kemudian dipanaskan sehingga semua bahan organic akan terbakar dan tampak sebagai nodanoda coklat. Mengamati lempeng dengansinar UV sehingga noda-noda yang menyerap sinar UV atau sebaliknya dengan memancarkannya. Bahan sample ditotolkan pada salah satu sudut lempeng sebagai suatu titik dan pemisahahn dilakukan setelah lempeng kering. Kemudian dipisahkan lagi dengan satu system solven yang lain dengan arah tegak luus dari arah semula.’
5. Terangkan bagaimana cara melakukan kromatografi lapis tipis dua dimensi dan bilakah orang terpaksa melakukan cara itu? Jawab: Dengan mengamati kepekatan warna yang diperoleh. Untuk cara ini, sample diteteskan dipojok kanan bawah dari plat TLC yang berukuran 20 x 20 cm, kira-kira 2 cm dari tepi kanan dan dari bawah. Setelah pengembangan pertama selesai, plat dikeringkan. Untuk mencegah terjadinya kerusakan senyawa yang dipisahkan selama pengeringan sebaiknya dilakukan dengan aliran gas N2. setelah dikeringkan, plat dikembangkan dengan menggunakan system pelarut yang kedua dengan memutar arah plat 90o. menggunakan cara ini mendapatkan hasil pengembangan yang lebih baik dengan penggunaan dua macam system pelarut, dan apabila pengembangan satu dimensi mendapatkan hasil yang kurang sempurna.
Sumber : http://imeldagustia.blogspot.com/2012/05/laporan-kromatografi-lapistipis.html
