UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS Facultad de Ciencias Básicas e Ingeniería Ingeniería Agroindustrial LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Laboratorio 1. FRACCIONAMIENTO DE TEJIDOS EN SUS PRINCIPALES BIOMOLÉCULAS: CARBOHIDRATOS, LIPIDOS, PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS. Elaborado por Daniel Aguilera 1. OBJETIVOS 1.1. Emplear los métodos de solubilidades diferenciales y de centrifugación para el fraccionamiento de un tejido animal en sus principales constituyentes. 1.2. Comparar 1.2. Comparar diferentes tejidos desde el el punto de vista de sus componentes principales. 2. INTRODUCCIÓN El objetivo del fraccionamiento celular es separar la célula en sus principales componentes y así permitir el estudio de un componente componente sin la interferencia de otras partes. En términos generales generales primero se debe elegir un tejido adecuado según el interés teniendo como criterio la facilidad para su fraccionamiento, la disponibilidad del constituyente de interés y homogeneidad del tipo de célula. Para la presente práctica se obtendrán obtendrán las fracciones de los diferentes diferentes constituyentes constituyentes de un tejido de origen animal en términos de sus biomoléculas, utilizando para ello las técnicas de centrifugación y propiedades de solubilidad diferencial. 2.1. Solubilidad Diferencial Debido a las diferencias que existen en las propiedades químicas entre las biomoléculas de carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos; estas presentaran diferente solubilidad en solventes orgánicos al igual que en ácidos del tipo del tricloroacético según la temperatura. Por lo tanto es posible utilizar tales solubilidades diferenciales para separarlos, una vez los tejidos han sido triturados y roto sus membranas. 2.1.1. Acción del ácido tricloroacético a baja temperatura Sobre carbohidratos: carbohidratos: A baja temperatura los monosacáridos son estables en medio ácido, mientras que al ser tratados en en caliente sufren deshidratación deshidratación produciéndose produciéndose los furfurales. furfurales. En general se puede decir que los carbohidratos son solubles en solución de ácido tricloroacético (ATA) al 10% a temperaturas inferiores a 4 C y no sufren cambios químicos en estas condiciones.
Sobre lípidos: Por lípidos: Por definición, estos compuestos son pocos solubles en soluciones acuosas y no son extraídos si se trata el tejido en soluciones acuosas de ATA. Sobre proteínas: Estas forman Estas forman sales insolubles en ácidos como tricloroacético o perclórico, por lo tanto no son solubles en soluciones soluciones de ATA al 10% en frio.
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Sobre ácidos nucleicos: Al igual que las proteínas, estos ácidos son insolubles en ATA al 10%. Por otra parte el ácido desoxirribonucleico (ADN) está unido a histonas, lo cual lo hace más insoluble en estas condiciones. En resumen, al tratar un tejido previamente triturado con ATA al 10% a 4 C y luego someter a centrifugación la suspensión resultante, en el sobrenadante se obtienen los azúcares, mientras que los lípidos, proteínas y ácidos nucleicos quedan en el residuo.
2.1.2. Acción del etanol-éter-cloroformo (2-2-1 v/v) Si el residuo de la extracción con ácido tricloroacético al 10 %, se trata con solución de etanol-étercloroformo, a la mezcla sólo pasan los lípidos, mientras que las proteínas y los ácidos nucleicos quedan en el residuo. 2.1.3. Acción del cloruro de sodio al 10 % en caliente Si el residuo anterior se suspende en una solución de NaCl al 10% y se calienta en baño de María (92 C) durante 20 minutos, se desnaturalizan las proteínas y los ácidos nucleicos – principalmente el ribonucleico (RNA)- quedan en solución. Por este procedimiento es posible separar entonces las proteínas de los ácidos nucleicos. Si el sobrenadante se le agrega ahora etanol en un volumen igual al doble de la solución original y se enfría en baño de hielo por 10 minutos, se obtiene un precipitado que puede ser separado por centrifugación y el cual contiene los ácidos nucleicos.
3. CONSULTA PREVIA AL LABORATORIO 3.1. ¿Cuál es el fundamento de la centrifugación? Realice una breve explicación de sus principios. 3.2. Consulte los diferentes métodos de ruptura de células 3.3. ¿Por qué se recomienda mantener los tejidos que se fraccionan a bajas temperaturas? 4. REACTIVOS Y MATERIALES Materiales
Reactivos*
ácido tricloácetico al 10% etanol-étercloroformo (2:2:1) etanol al 96% NaCl al 10% hielo arena lavada
Laboratorio
1 mortero de porcelana con mango 2 tubos de centrifuga 1 vasos de precipitado de 50 o 100 mL 2 tubos de ensayo 1 pinza para tubo de ensayo 1 vidrio de reloj 2 pipetas pauster 1 gradilla 4 frascos entre 4 a 7 mL
*Los reactivos deben estar refrigerados
Equipos y/o montajes
Estudiantes
Hígado de pollo u otro tejido Cuchillo o escarpelo Micro espátula o alambre
Centrifuga Baño de maría Balanzas Nevera
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5. PROCEDIMIENTO Cada grupo hará el fraccionamiento químico sobre el tejido según el siguiente protocolo:
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NOTAS: 1. Cada grupo de laboratorio podrá traer hígado de pollo o seleccionar otra fuente y/o tipo de tejido de origen animal para realizar el procedimiento de fraccionamiento. 2. Las diferentes fracciones obtenidas en esta práctica deben guardarse, debidamente rotuladas, para las dos sesión de laboratorio siguientes. 6. CUESTIONARIO PARA EL INFORME1 6.1. ¿Por qué cree usted que se elige un tejido de origen animal y no uno de origen vegetal? 6.2. ¿Qué otros solventes podría utilizar para separar las diferentes biomoléculas? Justifique su respuesta 7. FUENTES BIBLIOGRÁFICAS 7.1. Gerardo Pérez, Yolanda Navarro. Módulo de Bioquímica. Universidad a distancia. Ministerio de Educación Nacional. Bogotá. Unisur. 1992 7.2. Guías del Laboratorio de Principios de Bioquímica de la carrera de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Primer semestre 2011. 7.3. http://course1.winona.edu/lreuter/307/CellFractionation.pdf 26/07/2013
Última fecha de acceso:
7.4. http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/fractionation/fractionation.html Última fecha de acceso: 26/07/2013
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Se entregará un solo informe al finalizar las tres sesiones, el cual debe incluir el cuestionario de cada práctica.
