BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Suatu analisis kimia seperti pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran banyak dilakukan. Sekarang ini deteksi sifat spesifik suatu senyawa menjadi sangat penting, terutama dalam bidang farmasi, kimia, dan klinik, serta bidang lainnya. Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi. Teknik kromatografi adalah metode pemisahan yang digunakan untuk sintesis senyawa murni (atau hampir murni). Pada umumnya sebelum suatu senyawa diidentifikasi dan dapat di ukur kadarnya, perlu di pisahkan dari matriknya. Oleh karena itu, pemisahan merupakan langkah penting dalam analisi kualitatis. Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur. Terdapat banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik yang paling banyak di gunakan. Salah satunya yaitu kromatografi kolom. Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat. Karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa teknik kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang yan g akan dipisahkan. Berdasarkan uraian tersebut, maka pada makalah ini akan dibahas tentang metode kromatografi kolom.
1
B. Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang masalah yang telah dikemukakan. Di bawah ini dirumuskan beberapa masalah yang akan dibahas dalam makalah : 1. Apa yang dimaksud dengan kromatografi kolom? 2. Bagaimana prinsip dari kromatografi kolom? 3. Apa fase gerak dan fase diam kromatografi kolom? 4. Bagaimana proses pemisahan dalam kromatografi kolom? 5. Bagaimana analisis kualititatif dan kuantitatif kromatografi kolom? 6. Apa saja penerapan kromatografi kolom dalam kehidupan?
C. Tujuan 1. Untuk mengetahui pengertian dari kromatografi kolom 2. Untuk mengetahui prinsip dari kromatografi kolom 3. Untuk mengetahui fase diam dan fase gerak dari kromatografi kolom 4. Untuk mengetahui proses pemisahan / mekanisme pemisahan pada kromatografi kolom 5. Untuk mengetahui analisis kualititatif dan kuantitatif kromatografi kolom 6. Untuk mengetahui penerapan kromatografi kolom dalam kehidupan.
2
BAB II
PENGERTIAN DAN PRINSIP KROMATOGRAFI KOLOM
1. Pengertian Kromatografi Kolom Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Atau bisa didefinisikan sebagai proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan absorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan apa yang dihasilkan yang di sebut kromatogram. Pada dasarnya, semua kromatografi menggunakan dua fase yaitu satu fase tetap (stationary) dan yang lain fase bergerak (mobile). Pemisahan-pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari dua fase ini. Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat fase tetap, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang paling awal yang pertama kali di lakukan oleh D.T.Davy yaitu untuk membedakan komposisi minyak bumi. Ditinjau dari mekanismenya kromatografi kolom merupakan kromatografi serapan atau adsorbsi. Kromatografi kolom digolongkan ke dalam kromatografi cair – padat (KCP) kolom terbuka. Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair-padat. Substrat padat (adsorben) bertindak sebagai fase diam yang sifatnya tidak larut dalam fase cair. Fase bergeraknya adalah cairan (pelarut) yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Prinsip yang mendasari kromatografi kolom adsorpsi ialah bahwa komponen – komponen dalam zat contoh yang harus diperiksa mempunyai afinitas yang berbeda-beda terhadap adsorben dalam kolom. Apabila dialirkan cairan ( elutor ) secara kontinyu melalui kolom yang berisi zat contoh yang telah diadsorpsikan oleh penyarat kolom, maka yang pertama – tama dihanyutkan oleh elutor ialah komponen yang paling lemah terikat kepada adsorben. Komponen – komponen lainnya akan dihanyutkan menurut urutan afinitasnya terhadap adsorben, sehingga terjadi pemisahan daripada komponen – komponen tersebut.
3
Keuntungan kromatografi kolom yaitu dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif, digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi. Kerugian dari kromatografi kolom yaitu untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual, sehingga metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama.
2. Prinsip Kromatografi Kolom Kromatografi kolom bertujuan untuk purifikasi dan isolasi komponen dari suatu campurannya. Metode pembuatan kolom terbagi menjadi 2 yaitu untuk metode kering dan metode basah. Pada metode kering, kolom pertama diisi dengan kering fase diam bubuk, diikuti dengan penambahan fase gerak. Sedangkan pada metode basah, sebuah bubur disiapkan dari eluen dengan fase diam bubuk dan kemudian dengan hati-hati dituangkan ke dalam kolom. Lapisan ini biasanya ditutupi dengan lapisan pasir kecil atau dengan kapas atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari kecepatan baru ditambahkan eluen. Eluen perlahan-lahan melewati kolom untuk memajukan bahan organic. Sebagian besar prinsip pemisahan kromatografi kolom didasarkan pada afinitas kepolaran analit dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase diam. Pada sebagian besar kromatografi kolom menggunakan fase diam yang bersifat polar dengan fase gerak yang non-polar dengan begitu waktu retensi akan menjadi lebih singkat. Semakin cepat pergerakan fase gerak akan meminimalkan waktu yang diperlukan untuk bergerak di sepanjang kolom. Laju aliran kolom dapat ditingkatkan dengan memperluas aliran eluent di dalam kolom dengan mengisi fase diam pada bagian bawah atau dikurangi dengan mengontrol keran. Laju aliran yang lebih baik dapat dicapai dengan menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas dengan kompresi (misalnya udara, nitrogen, dan argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom.
4
BAB III
FASE DIAM DAN FASE GERAK DALAM KROMATOGRAFI KOLOM
Dalam kromatografi terdapat istilah fase diam dan fase gerak. Ditinjau dari pengertian keduanya dimana fase diam (Stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi karena dengan adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen suatu senyawa analit. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porous (berpori) dalam bentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan pada padatan pendukung. Sedangkan fase gerak ( Mobile phase) merupakan pembawa analit, dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak dapat berupa bahan cair dan dapat juga berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa yang mudah menguap (volatile). Pada kromatografi kolom, kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fase gerak) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa gerak) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fase diam). Berdasarkan uraian diatas maka dapat kita simpulkan bahwa fase gerak dalam kromatografi kolom merupakan pelarut sedangkan fase diamnya adalah adsorben.
5
Fase diam: Cair Fase gerak: Cair atau gas (pada kromatografi cair-gas) Dasar pemisahan: Partisi-konsep like dissolves like Untuk kromatografi jenis ini dasarnya adalah senyawa yang memiliki kemiripan sifat fisika kimia dengan fase diam akan tertambat lebih lama pada fase diam – > tR lebih besar Sebagai contoh jika kita ingin memisahkan kafein dan parasetamol pada sampel obat flu dengan fase diam ODS (Oktadesil silika) yang nonpolar, maka parasetamol akan lebih dulu keluar dari kolom atau tR lebih kecil daripada kafein. karena Kafein sifatnya nonpolar dan lebih terlarut pada fase diam, sedangkan parasetamol bisa terlarut sedikit tapi hanya sebentar saja.
6
BAB IV
PROSES PEMISAHAN ATAU MEKANISME PEMISAHAN
A. Penggunaan Kromatografi Kolom 1. Penyiapan Sampel Sampel ditimbang kemudian dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, lalu dituangkan hati-hati diatas packing kolom. Fase gerak dikeluarkan tetes demi tetes, diatur kecepatan menetesnya (tergantung besar-kecilnya kolom) dan dijaga kolom tetap terendam, untuk itu ditambah fase gerak perlahan-lahan dan dijaga tidak merusak packing kolom. Fase gerak yang keluar ditampung sebagai fraksi. Volume fraksi tergantung berat sampel dan pemisahan yang nampak pada kolom saat proses awal elusi ini. Makin kecil volume fraksi, akan diperoleh pemisahan yang lebih baik. Cara meletakkan sampel pada kolom yang lebih
baik
adalah dengan mencampurnya
dengan fase diam. Satu bagian sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, biasanya pelarut yang digunakan adalah pelarut yang digunakan untuk pembuatan ekstrak. Larutan ekstrak ini kemudian dicampur dengan 2,0-3.0 bagian fase diam, dengan hatihati campuran ini dikeringkan didalam rotary evaporator hingga diperoleh serbuk ekstrak kering. Serbuk ini ditaburkan diatas packing kolom dan ditutup dengan selapis pasir. Selanjutnya sampel siap dielusi. 2. Elusi Fase gerak dimasukkan kedalam kolom dengan cara dituangkan sedikit demi sedikit atau dialirkan dari bejana yang diletakkan diatas kolom sehingga fase gerak mengalir dengan sendirinya. Cara yang praktis adalah dengan memasukkan kedalam corong pisah, ujung corong pisah dimasukkan kedalam kolom dan ujung lain tertutup, sedangkan keran terbuka. Fase gerak akan keluar dengan sendirinya sesuai dengan keluarnya fase gerak dari kolom.
B. Penggunaan Kromatografi Kolom Partisi Pada sistem partisi, ialah pemisahan komponen yang didasarkan atas perbedaan polaritas pada fase diam. Sistem ini terjadi pada kromatografi yang menggunakan fase diam dan fase bergeraknya berupa cairan, fase diam dan fase bergeraknya berupa 7
gas, fase diam berupa cairan sedangkan fase bergerak berupa gas, atau fase diam berupa gas sedangkan fase diamnya berupa cairan.
1. Preparasi Bahan Penyangga Untuk bahan penyangga berupa silica gel, bahan penyangga ini harus dicampur dengan fase diam yang akan digunakan dengan perbandingan 0,5-1,0 bagian fase diam dengan 1,0 bagian bahan penyangga. Pencampuran harus baik, misalnya dengan menggunakan mortar atau blender sehmgga akan dihasilkan semacam pasta atau bubur yang tidak terlalu basah tetapi juga tidak kering. Fase diam kemudian ditambahkan berlebihan pada pasta tersebut sehingga terjadi sluri. Setelah itu sluri dimasukkan tabung, sluri diaduk dengan pengaduk berbentuk cakram yang diameternya lebih kecil sedikit daripada diameter tabung. Pada pusat cakram diberi tangkai panjang. Jika cakram dimasukkan ke dalam tabung dan digerakkan berkali-kali sepanjang tabung ke atas dan ke bawah, maka cakram akan dapat bergerak leluasa, dan sluri akan dapat bergerak melalui sela-sela cakram dengan dinding tabung. Gerakan cakram harus perlahan-lahan, dilakukan beberapa kali. Sesudah itu cakram diambil dan kelebihan fase diam dikeluarkan melalui mulut tabung yang terletak di bagian dasar tabung. Untuk kolom selulosa, maka bubuk selulosa direndam ke dalam aseton. Campuran kemudian dituangkan ke dalam tabung. Kelebihan aseton dikeluarkan melalui mulut tabung yang terletak di bagian dasar tabung. Kolom kemudian dicuci dengan fase bergerak sampai terjadi keseimbangan. Kadang-kadang sebelum dicuci dengan fase bergerak, dicuci terlebih dahulu dengan air berlebihan.
2. Teknik Elusi Ada beberapa cara mengelusi sampel. Yang pertama dengan cara bertahap (batch elution atau stepwise elution), yaitu mengelusi kolom dengan suatu jenis pelarut (dapat merupakan campuran dua macam atau lebih pelarut) sampai sejumlah volume eluat tertentu dikumpulkan, kemudian elusi dilanjutkan dengan jenis pelarut lain dengan cara yang sama, demikian seterusnya dengan jenis 8
pelarut yang lain lagi sampai selesai. Keuntungan dengan menggunakan cara ini adalah mudah dilakukan penyeimbangan (conditioning) kolom. Dengan demikian fraksi fraksi yang ingin dipisahkan dapat dielusi dengan sesedikit mungkin eluen. Cara yang kedua adalah mengalirkan eluen secara berterusan (continuous elution). Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan pompa peristaltik atau secara sederhana dengan meletakkan tangki penyedia freservoir) pelarut tepat di atas kolom. Cara yang ketiga adalah mengelusi kolom dengan dua macam atau lebih pelarut sekaligus dengan rasio yang berubah selama elusi. Cara ini lazim disebut sebagai pengelusian bertingkat (gradient elution).
C. Kromatografi Kolom Adsorpsi Berbeda dengan kromatografi partisi, maka dalam kromatografi adsorpsi yang menjadi fase diam adalah berupa padatan yang sekaligus juga berperan sebagai penyangga. Permukaan partikel-partikel penyangga mempunyai sifat aktif yang dapat mengikat komponen-komponen atau molekul-molekul tertentu. Pada kromatografi kolom adsorpsi juga digunakan tabung seperti halnya pada kromatografi kolom partisi dan cara penyiapannya juga tidak berbeda dengan penyiapan kolom partisi. Pada umumnya penyangga merupakan komponen yang mempunyai polaritas tinggi, sehingga penyerapan solut pada permukaan penyangga sangat tergantung pada polaritas solut. Sedangkan eluennya digunakan pelarut yang polaritasnya rendah.
9
BAB V ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF
A. Analisis Kuantitatif Komponen (eluat) yang diperoleh dapat diteruskan untuk ditetapkan kadarnya dengan cara titrasi ataupun spektofotometri.
B. Analisis Kualitatif Pergerakan komponen melalui kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara bahan penyerap, komponen campuran dan eluen. Kesetimbangan dikatakan tetap bila suatu komponen yang satu dengan lainnya bergerak ke bagian bawah kolom dengan waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan dengan terbentuk pita pita (zona-zona) yang setiap zona berisi satu macam komponen (eluat). Setiap zona yang keluar dari kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar dari kolom.
10
BAB VI APLIKASI KROMATOGRAFI KOLOM DALAM KEHIDUPAN
Aplikasi Kromatografi Kolom dalam Kehidupan dapat di jelaskan sebagai berikut: 1. Menganalisa zat pewarna alami dalam tumbuh-tumbuhan. Contohnya mengekstrak daun atau wortel. 2. Dalam bidang bioteknologi, a. Kromatografi kolom mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya penentuan kualitatif maupun kuantitatif senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi objek molekul yang harus di- purified (dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. b. Kromatografi kolom juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting lainnya. Data-data
yang
didapat
menggunakan
kromatografi
kolom
selanjutnya
dapat
meningkatkan mutu produk obat-obatan ,menghasilkan jenis obat baru atau dapat dipakai untuk mengontrol kondisi obat sehingga bisa bertahan lama 3. Dalam bidang clinical (klinik) Kromatografi kolom sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida badan antara lain: a. Air liur Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. b. Air kencing Dari air kencing dapat dideteksi jenis penyakit yang diderita oleh pasien yakni mendeteksi senyawa oksalat. Demikian halnya air liur, air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.
11
DAFTAR PUSTAKA Desti. 2015. Kromatografi Kolom. (online). (http://destirumapea24.blogspot.co.id/2015/03/kromatografi-kolom.html, diakses tanggal 13 Mei 2016). Fessenden. 2003. Kimia Organik. Jakarta: Erlangga. Gandjar, Gholib Ibnu. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Underwood, A.L dan R.A Day. 2001. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam. Jakarta: Erlangga.
12
